HCMV感染诊断试剂
阅读：969发布：2020-05-11
专利汇可以提供HCMV感染诊断试剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种用于诊断人巨细胞 病毒感染 的 试剂 ，包括：人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物，miRNA?UL112?3p正向PCR扩增引物，以及miRNA?UL112?5p正向PCR扩增引物。本发明所述试剂，采用PCR方法，分别对非 肿瘤 患者(其中HCMV特异性CD8+T淋巴细胞阳性患者57例、HCMV特异性CD8+T淋巴细胞阴性患者35例)、肿瘤化疗患者 外周血单个核细胞 miR?UL112 水 平进行检测，发现各组间miR?UL?112?3p、5p水平均有明显差异，说明miR?UL?112?3p、5p水平对于HCMV潜伏、激发感染一定诊断价值。，下面是HCMV感染诊断试剂专利的具体信息内容。
1.一种用于诊断人巨细胞病毒感染的引物，其特征在于，包括：
人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物，以及miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物；其中，
所述miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物序列为：
5’-AAGTGACGGTGAGATCCAGGCT-3’；
所述miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物序列为：
5’-CCTCCGGATCACATGGTTACTCA-3’；
所述人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物为：
正向引物：5’-ATGGTGGCTACGGTTCAGG-3’；
反向引物：5’-GGCGAAGATGCGGTAGATG-3’。
2.一种用于诊断人巨细胞病毒感染的试剂盒，其特征在于，包括从外周血单个核细胞中提取人巨细胞病毒DNA的试剂，和权利要求1所述的用于诊断人巨细胞病毒感染的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述提取人巨细胞病毒DNA的试剂包括缓冲液、蛋白酶K、无RNA酶的双蒸水。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括miRNA-UL112PCR扩增内参引物序列。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括人巨细胞病毒DNA PCR扩增内参引物序列。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述人巨细胞病毒DNA PCR扩增内参引物序列为：
正向引物：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；
反向引物：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括聚合酶。
HCMV感染诊断试剂
技术领域
背景技术
[0002] 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)属于孢疹病毒科，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，可引起人类巨细胞病毒感染。HCMV在人群中普遍易感，成人对HCMV的感染率高达90％以上，通常无明显症状，潜伏在宿主细胞中，为隐性感染，而在免疫功能低下或缺陷时，如妊娠、多次输血、移植受者(HCMV病毒感染也是器官移植失败的主要原因之一)、艾滋病患者等，常呈激发感染(显性感染)，病毒可侵袭多个器官和系统，引起严重疾病，严重者可致死亡。因此，早期监测HCMV潜伏、激活感染状态，对于免疫功能低下患者至关重要。
[0003] 然而由于HCMV病毒在人体内感染的普遍存在，通常潜伏在宿主细胞中不引起明显症状，给HCMV激活感染的诊断带来很大困难。目前HCMV感染诊断方法主要有：
[0004] 1)分离培养
[0005] 用临床标本进行体外分离培养，是目前诊断HCMV感染最可靠的方法，被认为是检测HCMV感染状态的金标准。该方法将检测标本(血液、尿液、唾液、腹水、脐血、脑脊液、气管灌洗液等)接种于成纤维细胞，出现细胞病变即为阳性。但是由于HCMV病毒体外增殖缓慢，初次分离至少需一个月才能使检测细胞出现病变，实验周期长、易污染，且无法与其他病毒感染区分、对于经药物治疗后的标本病毒分离常为阴性结果，因而临床应用受限，现主要应用于科研。
[0006] 2)病毒抗原学检测
[0007] 目前主要应用的是pp65抗原血症检测法，当HCMV激活感染时，PP65抗原于6～24小时内表达于外周血淋巴细胞、单核细胞、多形核白细胞和血管内皮细胞中，是HCMV活动性感染的早期诊断诊断标志物，但是由于存在假阳性、假阴性结果，该方法目前还存在争议。
[0008] 3)血清学检测抗体
[0009] 特异性抗体检测主要是检测HCMV感染后刺激机体产生的抗巨细胞病毒IgM和IgG抗体。抗HCMV IgG抗体多份血清检测可用于HCMV临床诊断，血清IgG抗体阳性转化表明是原发感染，而连续监测IgG滴度急剧升高表明存在HCMV活动性感染，但是HCMV成人感染率极高，IgG大多数人为阳性，检测意义不大；血清抗HCMV特异性IgM抗体检测，因其抗体存在时间短，诊出阳性率较低，另外Bendiksen等[3]研究发现，IgM水平与病毒复制无关，因此IgM也不能潜伏、激发感染诊断的良好指标。
[0010] 4)核酸杂交、原位杂交检测
[0011] 目前对于HCMV的测序已经完成，大大促进了核酸杂交技术在HCMV诊断中的应用。采用该方法能直接在感染组织中发现包涵体，较传统的免疫组织化学方法更为灵敏、特异。
但是由于方法学上的特殊性，完成全过程受诸多因素的影响，包括：标本处理时间，固定剂的选择，单克隆抗体细胞株的特异性等，另外该方法对镜检人员技术要求较高，方法上难以实现高通量检测，抗污染能力不强，成本过高，目前难以普及。
但是由于方法学上的特殊性，完成全过程受诸多因素的影响，包括：标本处理时间，固定剂的选择，单克隆抗体细胞株的特异性等，另外该方法对镜检人员技术要求较高，方法上难以实现高通量检测，抗污染能力不强，成本过高，目前难以普及。
[0012] 5)PCR方法
[0013] PCR方法检测HCMV，灵敏度为0.15fg，敏感度和特异度较高，可以实现对病毒检测的量化，在检测病毒活动性、评价抗病毒疗效等方面具有重要的意义。
[0014] 从目前PCR检测结果来看，单用一对PCR引物可引起假阴性，主要原因可能是临床标本中HCMV病毒株的不同、或者病毒基因组中极小变异、以及病毒拷贝数太低所致。此外，引物设计序列针对HCMV同一基因的不同部位，PCR结果也有明显差异，方法还需标准化，目前市场上还没有商品化的HCMV的PCR诊断试剂盒。
[0015] 综上所述，目前还没有便捷的、明确的方法明显的区分HCMV的潜伏、激发感染。
发明内容
[0016] 针对目前人巨细胞病毒的潜伏、激发感染检测方法的缺乏，本发明提供了一种用于诊断人巨细胞病毒感染的试剂，通过对外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的miRNA-UL112水平的检测，诊断人巨细胞病毒感染状态。
[0017] 本发明第一个方面是提供一种用于诊断人巨细胞病毒感染的引物，包括：
[0018] 人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物，以及miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物。
[0019] 其中，本发明第一个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物序列为：5’-AAGTGACGGTGAGATCCAGGCT-3’。
[0020] 其中，本发明第一个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物序列为：5’-CCTCCGGATCACATGGTTACTCA-3’。
[0021] 其中，本发明第一个方面的一种优选实施例中，人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物包括：
[0022] 正向引物：5’-ATGGTGGCTACGGTTCAGG-3’；
[0023] 反向引物：5’-GGCGAAGATGCGGTAGATG-3’。
[0024] 本方面第二个方面是提供一种用于诊断人巨细胞病毒感染的试剂盒，包括从外周血单个核细胞中提取人巨细胞病毒DNA的试剂，和用于诊断人巨细胞病毒感染的引物；
[0025] 所述用于诊断人巨细胞病毒感染的引物包括：人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物，以及miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物。
[0026] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述提取人巨细胞病毒DNA的试剂包括缓冲液、蛋白酶K、RNase free ddH2O。
[0027] 其中，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液和/或改良磷酸盐缓冲液。
[0028] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物序列为：5’-AAGTGACGGTGAGATCCAGGCT-3’。
[0029] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物序列为：5’-CCTCCGGATCACATGGTTACTCA-3’。
[0030] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述试剂盒还包括miRNA-UL112PCR扩增内参引物序列。
[0031] 其中，所述miRNA-UL112PCR扩增内参引物序列为Takara公司生产的商品名为CD201-0145的引物序列。
[0032] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物包括：
[0033] 正向引物：5’-ATGGTGGCTACGGTTCAGG-3’；
[0034] 反向引物：5’-GGCGAAGATGCGGTAGATG-3’。
[0035] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述试剂盒还包括人巨细胞病毒DNA PCR扩增内参引物序列。
[0036] 其中，所述人巨细胞病毒DNA PCR扩增内参引物序列优选为：
[0037] 正向引物：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；
[0038] 反向引物：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。
[0039] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述试剂盒还包括聚合酶。
[0040] 本发明第三个方面是提供miR-UL112水平在检测人巨细胞病毒
[0041] 本发明所述引物和试剂盒，采用PCR方法，分别对非肿瘤患者、肿瘤化疗患者外周血单个核细胞miR-UL112水平进行检测，发现两组间miR-UL-112-3p、5p水平均有明显差异，说明miR-UL-112-3p、5p水平对于HCMV潜伏、激发感染一定诊断价值。附图说明
[0042] 图1为miR-UL112-3p、5p ROC曲线图；其中，(a)为非肿瘤患者miR-UL112-3p ROC曲线图；(b)非肿瘤患者miR-UL112-5p ROC曲线图。
具体实施方式
[0043] 一、材料
[0044] 1、标本来源
[0045] 选取2012年3月至2014年3月门诊非肿瘤患者92例，年龄50-70岁，前期应用HCMV PP65合成多肽片段刺激患者外周血单个核细胞，采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、细胞增殖实验等方法检测对HCMV特异性多肽反应的CD8+T淋巴细胞，根据CD8+T淋巴细胞的高低将患者分为两组，其中HCMV特异性CD8+T淋巴细胞高水平组(简称CD8+细胞高水平组)57例，HCMV特异性CD8+T淋巴细胞低水平组(简称CD8+细胞低水平组)35例。另选取肿瘤化疗患者30例，患者年龄52-72岁，常规方法分离外周血单个核细胞，-80℃保存待测。
[0046] 2、仪器试剂
[0047] HCMV-DNA、miR-UL-112-3p、miRNA-112-5p引物由北京天根生化公司设计合成，引物序列见表1。细胞基因组提取试剂盒(DP315)、单个核细胞miRNA提取试剂盒(DP501)、miRNA RT-PCR试剂盒(MP401)均购自天根生化科技(北京)有限公司。DNA RT-PCR(RR420)试剂盒购自Takara Bio INC.(TaKara生物有限公司)。聚合酶链式反应仪购自美国应用生物系统公司)。
[0048] 表1miRNA反转录与定量PCR引物、DNA定量PCR引物
[0049]
[0050] 注：CD201-0145为U6序列产品编号，购自Takara公司，序列未知。
[0051] 二、方法
[0052] 1、HCMV-DNA提取
[0053] 每份标本取2.5×105个外周血单个核细胞，按照细胞基因组DNA提取试剂盒说明书提取病毒HCMV DNA，以DNA-F、DNA-R为引物，HCMV DNA为模板，进行PCR扩增，检测HCMV病毒载量，扩增条件：95℃30s，95℃5s，60℃，30s，95℃15s，60℃60s，95℃15s，40个循环。以β-actin为内参进行相对定量分析。
[0054] 2、miR-UL112水平测定
[0055] 每份标本取2.5×105个外周血淋巴细胞，按照miRNA提取试剂盒说明书提取总miRNA，采用随机引物进行逆转录反应。以miR-112-3p-Forward、miR-UL112-5p-Forward为引物，逆转录产物为模板，进行PCR扩增，反应条件如下：95℃30s，95℃5s，60℃34s，40个循环，以U6为内参进行相对定量分析。
[0056] 三、统计学方法
[0058] 四、结果
[0059] 1、非肿瘤组及肿瘤化疗组HCMV DNA、miR-UL112-3p、miR-UL112-5p水平检测[0060] 肿瘤组HCMV DNA、miR-UL112-3p及miR-UL112-5p水平均明显高于非肿瘤组(P<0.05、P<0.01)，非肿瘤组中CD8+细胞高水平组HCMV DNA、miR-UL112-3p及miR-UL112-5p水+
平均明显高于CD8细胞低水平组(P均<0.01)，见表2.。
平均明显高于CD8细胞低水平组(P均<0.01)，见表2.。
[0061] 表2，肿瘤、非肿瘤组DNA、miR-UL112-3p、miR-UL112-5p水平比较[M(P25-P75)][0062]
[0063] 注：与非肿瘤组比较，*P<0.05；与非肿瘤组比较**P<0.01；与HCMV特异性CD8+T阴性组比较，#P<0.01。
[0064] 3、miR-UL112-3p、miR-UL112-5p水平检测对于HCMV感染诊断价值评估
[0065] miR-UL112-3p、miR-UL112-5p水平对HCMV潜伏感染的诊断价值：根据非肿瘤组miR-UL112-3p、5p水平，绘制ROC曲线，见图1。分别选择1.09、1.52作为诊断的cutoff值，该方法敏感度分别为59.65％、64.91％，特异度为97.1％、97.1％。
[0066] miR-UL112-3p、miR-UL112-5p水平对HCMV激发感染的诊断价值：以非肿瘤组miR-UL112-3p、5p水平 (即5.24、6.63)作为诊断激发感染的标准，肿瘤阳性率分别为50.00％(15/30)、73.33％(22/30)，而非肿瘤组阳性率分别为6.52％(6/92)、5.43％(5/
92)。其中肿瘤组40.00％(12/30)的患者miR-UL112-3p水平，63.33％(19/30)的患者miR-UL112-5p水平升高10倍以上。
92)。其中肿瘤组40.00％(12/30)的患者miR-UL112-3p水平，63.33％(19/30)的患者miR-UL112-5p水平升高10倍以上。
[0067] 在健康成人体内，病毒再激活和HCMV特异CD8+T细胞的抗病毒免疫控制处于一种平衡状态呈潜伏感染，而肿瘤患者因为长期接受放化疗，免疫功能受损，此平衡被打破，HCMV容易被激活呈激发感染。我们收集30例肿瘤化疗患者、92例非肿瘤患外周血，检测单个核细胞DNA、miR-UL-112-3p、5p水平，结果表明肿瘤化疗组肿瘤组HCMV DNA、miR-UL112-3p及miR-UL112-5p水平均明显高于非肿瘤组(P<0.05、P<0.01)，以非肿瘤组miR-UL112-3p、5p水平 (即5.24、6.63)作为诊断激发感染的标准，肿瘤组miR-UL112-3p、5p阳性率分别为50.00％(15/30)、73.33％(22/30)，其中部分患者miR-UL-112大幅度升高(40.00％患者miR-UL-112-3p水平、63.33％患者miR-UL-112-5p水平升高10倍以上)，与文献报道相一致。
因此，miR-UL112-3p、miR-UL112-5p水平对HCMV潜伏激发感染诊断具有一定意义。
因此，miR-UL112-3p、miR-UL112-5p水平对HCMV潜伏激发感染诊断具有一定意义。
[0068] CD8+T淋巴细胞水平可以有效的反映患者HCMV感染状况。在此基础上，我们按照HCMV特异性CD8+T淋巴细胞是否阳性，将非肿瘤患者分为两组，检测淋巴细胞miR-UL112水平，进一步研究该方法对于HCMV潜伏感染诊断价值。miR-UL112-3p对HCMV潜伏感染的阳性诊出率(敏感度)为59.65％，miR-UL112-5p为64.91％，线下区域分别可以达到0.947、0.945，具有良好的诊断效果。
[0069] 综上所述，本发明试剂可以采用RT-PCR方法，分别对非肿瘤患者、肿瘤化疗患者外周血单个核细胞miR-UL112水平进行检测，发现两组间miR-UL-112-3p、5p水平均有明显差异，说明miR-UL-112-3p、5p水平对于HCMV潜伏、激发感染一定诊断价值。
[0070] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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