技术领域
[0001] 本
发明是属于基因工程领域，涉及到利用重组基因工程技术在毕赤酵母中表达和高效制备ckmb。
背景技术
[0002] 肌酸激酶(creatine kinase，EC2，7，3，2，简称CK)有3种同工酶，分别由B、M亚基两两组合而成：CK-MM、CK-MB、CK-BB。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中。C K-M B免疫化学检测方法的建立具有重要意义。CKMB是临床上诊断急性心肌梗死和推定梗死面积的有效指标物。
[0003] 生化提取CKMB原料来源受到限制。原核表达不能正确折叠，没有糖基化修饰，没有活性；动物细胞表达生产成本太高。
发明内容
[0004] 本发明公开了ckmb在毕赤酵母中的表达和高效制备方法，其特征为，通过在毕赤酵母宿主细胞中进行含m基因和b基因在同一载体中
串联表达的载体和工程菌的构建、
发酵、纯化，制备重组CKmb。本发明制备的CKmb成本低，
质量好，为ckmb在体外诊断
试剂方面的应用提供了原料和质控品。
[0005] m基因和b基因在同一载体中串联表达载体构建过程如
附图图.1所示。 [0006] 以人肌肉cDNA文库为模板pcr得到M基因，编码ckb亚基的基因克隆到 pPICZα上的EcoRI和NotI之间，构建以AXO1为启动子α因子为分泌
信号的重组质粒，命名为pPICZαA-ckb。
[0007] 以人脑cDNA文库为模板pcr得到B基因，编码ckb亚基的基因克隆到pPICZα上的EcoRI和NotI之间，构建以AXO1为启动子α因子为分泌信号的重组质粒，命名为pPICZαA-ckb。
[0008] 以BamH1和Bgl II双切pPICZαA-ckb，凝胶回收表达框，命名为AOX1-ckb；将表达框AOX1-ckb克隆到pPICZαA-ckm的BamH1；筛选ckm和ckb同一方向串联表达的重组质粒，命名为pPICZαA-ckm-ckb；重组质粒pPICZαA-ckm-ckb转化毕赤酵母GS115，用不同浓度G418筛选出不同拷贝重组质粒的毕赤酵母GS115，筛选出表达量最高的一株命名为pPICZαA-ckm-ckb。
[0009] 分离纯化ckmb：浓缩，
硫酸铵分级沉淀，phenyl疏
水层析和Q离子交换，得到高纯度的ckmb。
附图说明
[0010] 图1.m基因和b基因在同一载体中串联表达载体构建过程
具体实施方式
[0012] 通过化学合成所需引物(上游引物：SEQ.ID No.1：5′-GGAATTCATGCATCATCATCATCATCATCCATTCGGTAACACCCAC-3下游引物：：5′-CATGCggccgcCTTCTGGGCGGGGATCAT-3)，以人肌肉cDNA为模板，利用PCR获得ckm基因SEQ.ID No.3。
[0013] 实施例2编码ckb亚基基因的克隆
[0014] 通过化学合成所需引物(上游引物：SEQ.ID No.4：5′-GGAATTCATGCATCATCATCATCATCATCCCTTCTCCAACA GCCAC-3下游引物：SEQ.ID No.5：5′-CATGCggccgcTTTCTGGGCAGGCATGAG)，以人脑cDNA为模板，利用PCR获得ckb基因SEQ.ID No.6。
[0015] 实施例3ckm基因和ckb基因在同一载体中串联表达载体和工程菌的构建以BamH1和Bgl II双切pPICZαA-ckb，凝胶回收表达框，命名为AOX1-ckb；
[0016] 将表达框AOX1-ckb克隆到pPICZαA-ckm的BamH1；
[0017] 筛选ckm和ckb同一方向串联表达的重组质粒，命名为pPICZαA-ckm-ckb； [0018] 重组质粒pPICZαA-ckm-ckb转化毕赤酵母GS115，用不同浓度G418筛选出不同拷贝重组质粒的毕赤酵母GS115，筛选出表达量最高的一株命名为pPICZαA-ckm-ckb。 [0019] 摇瓶中表达量达到5mg/L，上罐发酵表达达到225mg/L。
[0020] 实施例4ckmb分离纯化
[0021] 浓缩，硫酸铵分级沉淀，phenyl疏水层析和Q离子交换，得到高纯度的ckmb。结果SDS-PAGE纯度大于95％
[0022] 实施例5ckmb活性测定
[0023] 利用elisa检测来测定免疫活性。
[0024] 1.包被：用0.05M PH9，
碳酸盐包被缓冲液将
抗体稀释至
蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
[0025] 2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
[0026] 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
[0027] 4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
[0028] 5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
[0029] 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内
颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS
显色剂，于410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
[0030] 结果，本方法制备的ckmb呈阳性。
[0031] 实施例5ckmb在体外诊断试剂方面的应用
[0032] 本发明制备的ckmb免疫小鼠，抗体滴度与天然提取的Ckmb的一样。可用于诊断试剂的质控对照。
