具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质
阅读：169发布：2023-01-25
专利汇可以提供具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供 稳定性 改善的基于纤连蛋白的 支架 蛋白。本申请还涉及基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂及其用于诊断、研究和 治疗 应用的用途。本申请还涉及包含此类蛋白的细胞、编码此类蛋白或其 片段 的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体。，下面是具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质专利的具体信息内容。
10 10
1.一种包含纤连蛋白III型第10( Fn3)域的多肽，其中所述 Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并且以小于100nM的KD结合靶分子，且其中所述
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Fn3域进一步包含不含有DK序列的C端尾。
2.权利要求1的多肽，其中所述C端尾包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述C端尾还包含半胱氨酸残基。
4.权利要求3的多肽，其中所述C端尾包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
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5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述 Fn3域还包含含有1-10个氨基酸的N端延伸。
6.权利要求5的多肽，其中所述N端延伸包含选自下组的序列：M,MG,G,以及SEQ ID NO:19-21和26-31中的任意者。
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7.权利要求1-6中任一项的多肽，还包含第二 Fn3域，其中所述第二 Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并且以小于100nM的KD结合靶分子，且其
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中所述第二 Fn3域还包含不含有DK序列的C端尾。
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8.权利要求7的多肽，其中所述第二 Fn3域包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾。
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9.权利要求7或8的多肽，其中所述第一 Fn3域和第二 Fn3域结合不同的靶物。
10
10.权利要求7-9中任一项的多肽，其中所述第二 Fn3域还包含含有1-10个氨基酸的N端延伸。
11.权利要求10的多肽，其中所述N端延伸包含选自下组的序列：SEQ ID NO:19-21和
26-31。
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12.权利要求7-11中任一项的多肽，其中所述第一 Fn3域和第二 Fn3域通过包含
1-30个氨基酸的多肽接头连接。
13.权利要求12的多肽，其中所述多肽接头选自下组：基于甘氨酸-丝氨酸的接头，基于甘氨酸-脯氨酸的接头，基于脯氨酸-丙氨酸的接头，以及基于Fn的接头。
14.一种多肽，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
15.一种多肽，其包含具有下列结构的氨基酸序列：
N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,
其中N1和N2为独立地含有0-10个氨基酸的任选的N端延伸；
其中D1和D2独立地选自下组：(i)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95%同
10 10
一性的纤连蛋白III型第10结构域( Fn3)域，其中所述 Fn3域以小于500nM的KD结合
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IGF-IR，和(ii)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域，其中
10
所述 Fn3域以小于500nM的KD结合VEGFR2；
其中L为包含0-30个氨基酸残基的多肽接头；
其中C1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；且
其中C2包含SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列。
16.权利要求15的多肽，其中D1是与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列具有至少95%
10
同一性的 Fn3域，且其中D2是与SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列具有至少95%同一性的
10
Fn3域。
17.权利要求15的多肽，其中D1是与SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列具有至少95%
10
同一性的 Fn3域，且其中D2是与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列具有至少95%同一性的
10
Fn3域。
18.权利要求15-17中任一项的多肽，其中C2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
19.权利要求15-18中任一项的多肽，其中L是选自下组的接头：基于甘氨酸-丝氨酸的接头，基于甘氨酸-脯氨酸的接头，基于脯氨酸-丙氨酸的接头，以及基于Fn的接头。
20.权利要求19的多肽，其中L包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
21.权利要求15-20中任一项的多肽，其中N1包含选自下组的氨基酸序列：M，MG，G，以及SEQ ID NO:19-21和26-31中的任意者。
22.权利要求21的多肽，其中N1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
23.权利要求15-22中任一项的多肽，其中N2包含选自下组的氨基酸序列：M，MG，G，以及SEQ ID NO:19-21和26-31中的任意者。
24.权利要求23的多肽，其中N2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
25.一种多肽，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
26.权利要求1-25中任一项的多肽，其中所述多肽在pH4.0溶液中保存至少4周的过程中具有少于4%的断裂。
27.权利要求1-26中任一项的多肽，其进一步包含选自下组的一种或多种药动学(PK)模块：聚氧化烯模块、人血清白蛋白结合蛋白、唾液酸、人血清白蛋白、转铁蛋白、以及Fc片段。
28.权利要求27的多肽，其中所述PK模块是聚氧化烯模块，且所述聚氧化烯模块是聚乙二醇。
29.一种药物组合物，其包含权利要求1-28中任一项的多肽。
30.权利要求29的药物组合物，其还包含生理学上可接受的担载体。
31.权利要求29或30的药物组合物，其中所述组合物基本上无热原。
32.权利要求29-31中任一项的药物组合物，其中所述组合物的pH为4.0-6.5。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述组合物的pH为4.0-5.5。
34.权利要求29-31中任一项的药物组合物，其中所述组合物的pH为4.0。
35.权利要求29-34中任一项的药物组合物，其中所述多肽的浓度为至少5mg/mL。
36.一种药物配制剂，其包含权利要求1-28中任一项的多肽，其中所述配制剂包含至少5mg/mL的所述多肽，具有4.0的pH，并且适于静脉内施用。
37.权利要求36的药物配制剂，其中所述配制剂在25℃稳定至少4周。
38.权利要求37的药物配制剂，其中所述配制剂具有少于4%的断裂。
39.权利要求37或38的药物配制剂，其中所述配制剂具有少于4%的聚集物。
40.一种治疗受试者中的过度增殖病症的方法，包括对有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求29-39中任一项的组合物。
41.一种核酸，其编码权利要求1-26中任一项的多肽。
42.一种载体，其包含权利要求41的核酸。
43.权利要求42的载体，其中该载体是表达载体。
44.一种宿主细胞，其包含权利要求43的载体。
45.权利要求44的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
46.权利要求45的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2010年5月26日提交的美国临时申请61/348,647和2010年5月26日提交的美国临时申请61/348,663的权益，本文通过提述并入其全部内容。
[0003] 介绍
[0004] 基于纤连蛋白的支架(fibronectin-based scaffolds)是一类能够进化从而结合任何感兴趣的化合物的蛋白质。这些蛋白质一般利用衍生自III型纤连蛋白(Fn3)或Fn3样域，以天然的或工程化抗体(即多克隆、单克隆或单链抗体)特征性的方式发挥功能，并且具有结构上的优势。具体地说，这些抗体模拟物的结构已经被设计以实现最优的折叠、稳定性和溶解性，即使在通常会在抗体中导致结构和功能丧失的条件下也是如此。基于纤TM连蛋白的支架蛋白的一个例子是Adnecins (Adnexus，Bristol-Myers Squibb的全资子公司)。
[0005] 纤连蛋白(fibronectin)是一种在胞外基质的形成以及细胞-细胞相互作用中扮演关键角色的大蛋白；它由三种类型(I、II和III型)的小结构域的多个重复组成(Baron et al.,1991)。Fn3本身是一个大亚家族的范式，该家族包括细胞粘附分子、细胞表面激素和细胞因子受体、分子伴侣、以及糖类结合域等的部分。综述可见Bork&Doolittle,Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Oct1;89(19):8990-4;Bork et al.,J Mol Biol.1994Sep30;242(4):309-20;Campbell&Spitzfaden,Structure.1994May15;2(5):333-7;Harpez&Chothia,J Mol Biol.1994May13;238(4):528-39)。
[0006] 纤连蛋白III型(Fn3)域包括，以从N端到C端的顺序：β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF和FG中的任何和所有可参与结合靶物。BC、DE和FG环都与来自免疫球蛋白的互补决定区(CDR)结构和功能上类似。美国专利7,115,396描述了其中对BC、DE和FG环的改变导致高亲和力的TNFα结合物的Fn3域蛋白。美国申请公开2007/0148126描述了其中对BC、DE和FG环的改变导致高亲和力的VEGFR2结合物的Fn域蛋白。
[0007] 蛋白质药物可能在其生产、纯化、保存和递送中伴随着物理和化学上的不稳定性。这些不稳定性问题可能对蛋白质治疗剂的生物学性质造成不利的影响，从而降低该蛋白质治疗剂的效力。Sola,2009,J.Pharm Sci,98(4):1223-1245。由此，获得稳定性改善(例如断裂和/或聚集减少)的、能够用于治疗和诊断目的的改良的纤连蛋白域支架蛋白是有利的。
[0008] 发明概述
[0009] 本申请的一个方面提供新的基于纤连蛋白的支架蛋白，它们的稳定性增加，包括断裂减少和/或聚集减少。
[0010] 在一些实施方案中，本文中提供的基于纤连蛋白的支架蛋白包含纤连蛋白III型10 10
第10( Fn3)域，其中该 Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并
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且以小于100nM的KD结合靶分子，且其中该 Fn3域还包含C端尾，所述C端尾不含有DK序列。在示例性的实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述C端尾还包含半胱氨酸残基。在其他实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
第10( Fn3)域，其中该 Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并
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且以小于100nM的KD结合靶分子，且其中该 Fn3域还包含C端尾，所述C端尾不含有DK序列。在示例性的实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述C端尾还包含半胱氨酸残基。在其他实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
[0011] 在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白结合不被野生型10Fn3域所结合的靶物。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白不结合EGFR、人血清白蛋白或10
PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，包含单一 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合EGFR、人血清白蛋白或PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合一种或多种下列的靶分子组合：i)EGFR和IGF-IR；ii)EGFR和任何其他靶蛋白；或iii)人血清白蛋白或及任何其他靶蛋白。
PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，包含单一 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合EGFR、人血清白蛋白或PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合一种或多种下列的靶分子组合：i)EGFR和IGF-IR；ii)EGFR和任何其他靶蛋白；或iii)人血清白蛋白或及任何其他靶蛋白。
[0012] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的10Fn3域还包含含有1-10个氨基10
酸的N端延伸。在其他的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的 Fn3域包含选自下组的序列：M、MG、G、以及SEQ ID NO:19-21和26-31中的任一者。
酸的N端延伸。在其他的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的 Fn3域包含选自下组的序列：M、MG、G、以及SEQ ID NO:19-21和26-31中的任一者。
[0013] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白还包含第二10Fn3域，其中所述第二10
Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并且以小于100nM的KD结
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合靶分子，且其中所述第二 Fn3域还包含不含有DK序列的C端尾。在示例性的实施方案
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中，所述第二 Fn3域包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾。在一些实施方案中，
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所述第一和第二 Fn3域结合不同的靶物。在一些实施方案中，所述第二 Fn3域还包含具有1-10个氨基酸的N端延伸。在一些实施方案中，所述N端延伸包含选自下组的序列：M、MG、G、以及SEQ ID NO:19-21和25-31中的任一者。在一些实施方案中，所述第一和第二
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Fn3域通过具有1-30个氨基酸的多肽接头连接。在一些实施方案中，所述多肽接头选自下组：基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头、和基于Fn的接头。
Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并且以小于100nM的KD结
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合靶分子，且其中所述第二 Fn3域还包含不含有DK序列的C端尾。在示例性的实施方案
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中，所述第二 Fn3域包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾。在一些实施方案中，
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所述第一和第二 Fn3域结合不同的靶物。在一些实施方案中，所述第二 Fn3域还包含具有1-10个氨基酸的N端延伸。在一些实施方案中，所述N端延伸包含选自下组的序列：M、MG、G、以及SEQ ID NO:19-21和25-31中的任一者。在一些实施方案中，所述第一和第二
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Fn3域通过具有1-30个氨基酸的多肽接头连接。在一些实施方案中，所述多肽接头选自下组：基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头、和基于Fn的接头。
[0014] 在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含一个或多个包含环AB；环BC；10
环CD；环DE；环EF；和环FG的 Fn3域，并且各自独立地在选自环BC、DE和FG中的至少一个环中具有相对于对应的人10F3域序列发生了改变的氨基酸序列。在某些实施方案中，
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Fn3域包含与SEQ ID NO:1所示的天然存在的人 Fn3域至少50、60、70、或80%相同的氨
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基酸序列。在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个 Fn3域的二聚体。
环CD；环DE；环EF；和环FG的 Fn3域，并且各自独立地在选自环BC、DE和FG中的至少一个环中具有相对于对应的人10F3域序列发生了改变的氨基酸序列。在某些实施方案中，
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Fn3域包含与SEQ ID NO:1所示的天然存在的人 Fn3域至少50、60、70、或80%相同的氨
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基酸序列。在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个 Fn3域的二聚体。
[0015] 在另一个方面，本申请提供新的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体，它们与PCT申请WO 2009/142773中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相比蛋白断裂减少。在一些实施方案中，所述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
[0016] 在另一个方面，本申请提供具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体。在某些实施方案中，N1和N2是任选的N端延伸，独立地包含0-10个氨基酸；D1和D2独立地选自下组：(i)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的纤
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连蛋白III型第10结构域( Fn3)域，其中所述 Fn3域以小于500nM的KD结合IGF-IR，和
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(ii)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域，其中所述 Fn3域以小于500nM的KD结合VEGFR2；L为包含0-30个氨基酸残基的多肽接头；C1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；且C2包含SEQ ID NO:4、5或6所示的氨基酸序列。
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连蛋白III型第10结构域( Fn3)域，其中所述 Fn3域以小于500nM的KD结合IGF-IR，和
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(ii)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域，其中所述 Fn3域以小于500nM的KD结合VEGFR2；L为包含0-30个氨基酸残基的多肽接头；C1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；且C2包含SEQ ID NO:4、5或6所示的氨基酸序列。
[0017] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,其中D1包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95%的同一
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性的 Fn3域，且D2包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域。在其他实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有序列N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，
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其中D1包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域，且D2包
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含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域。
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性的 Fn3域，且D2包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域。在其他实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有序列N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，
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其中D1包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域，且D2包
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含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性的 Fn3域。
[0018] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，其中C2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
[0019] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，其中N1包含选自下组的氨基酸序列：M、MG、G，以及SEQ ID NO:19-21和26-31中的任一者。在示例性的实施方案中，N1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2，其中N2包含选自下组的氨基酸序列：M、MG、G，以及SEQ ID NO:19-21和26-31中的任一者。
在示例性的实施方案中，N2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在示例性的实施方案中，N2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
[0020] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,其中L是选自下组的多肽接头：基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头，以及基于Fn的接头。在其他的实施方案中，L包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
[0021] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白还包含一个或多个药动学(PK)模块，所述模块选自：聚氧化烯模块,人血清白蛋白结合蛋白,唾液酸,人血清白蛋白,转铁蛋白,IgG,IgG结合蛋白,以及Fc片段。在一些实施方案中，PK模块是聚氧化烯模块且所述聚氧化烯模块是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG模块通过Cys或Lys氨基酸共价连接于基于纤连蛋白的支架蛋白。在一些实施方案中，PEG为大约0.5kDa至大约100kDa之间。
[0022] 在一个方面，本申请提供包含基于纤连蛋白的支架蛋白的可药用的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含热原的。在一些实施方案中，所述组合物基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用。组合物可以配制用于例如静脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，所述组合物包含生理学上可接受的担载体。在一些实施方案中，所述组合物的pH是4.0-6.5之间。在一些实施方案中，所述组合物的pH是4.0-5.5之间。在其他的实施方案中，所述组合物的pH是5.5。在其他的实施方案中，所述组合物的pH是
4.0。在一些实施方案中，所述组合物中基于纤连蛋白的支架蛋白的浓度是5mg/ml。
4.0。在一些实施方案中，所述组合物中基于纤连蛋白的支架蛋白的浓度是5mg/ml。
[0023] 在另一个方面，本申请提供包含基于纤连蛋白的支架蛋白的药物配制剂，其中所述配制剂包含至少5mg/ml的基于纤连蛋白的支架蛋白，pH为4.0，并且适合静脉内施用。在一些实施方案中，所述药物配制剂在25℃稳定至少4周。在一些实施方案中，所述药物配制剂具有少于4%的断裂。在一些实施方案中，所述配制剂具有少于4%的聚集物。
[0024] 在另一个方面，本申请提供一种用于治疗受试者中的过度增殖病症的方法，包括对有需要的受试者施用治疗有效量的任何本文所述的组合物。
[0025] 在另一个方面，本申请提供编码如本文所述的基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸。还包括含有此类蛋白的多核苷酸的载体。合适的载体包括，例如，表达载体。本申请的另一个方面提供包含编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸、载体或表达载体的细胞。优选对序列进行优化以最大化在所用的细胞类型中的表达。在一些实施方案中，表达在细菌细胞中进行。在其他的实施方案中，表达在哺乳动物细胞中进行。优选地，表达在大肠杆菌中进行。在一个方面，所述细胞表达基于纤连蛋白的支架蛋白。在一个方面，编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸经过密码子优化以供在选定的细胞类型中表达。还提供了用于产生如本文所述的基于纤连蛋白的支架蛋白的方法，包括培养包含编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸、载体或表达载体的宿主细胞，并从培养物回收所表达的基于纤连蛋白的支架蛋白。
[0027] 图1.显示两种浓度的PEG化V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)的经时的蛋白聚集量的大小排阻高压液相色谱(SE-HPLC)数据。PEG化蛋白以3mg/mL蛋白浓度保存在4℃，10mM琥珀酸，5%山梨醇、pH5.5中12个月。
[0028] 图2.显示两种浓度的PEG化V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)的经时的蛋白断裂的SE-HPLC数据。PEG化蛋白以3mg/mL蛋白浓度保存在4℃，10mM琥珀酸，5%山梨醇、pH5.5中12个月。
[0029] 图3.显示pH对PEG化V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)的经时蛋白聚集的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在含有50mM NaCl、20mM乙酸钠(对于pH4和5)或20mM磷酸钠(对于pH6和7)的制剂中在25℃保存3周。
[0030] 图4.显示pH对PEG化V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)的经时蛋白断裂的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在含有50mM NaCl、20mM乙酸钠(对于pH4和5)或20mM磷酸钠(对于pH6和7)的制剂中在25℃保存3周。
[0031] 图5.显示PEG化的V/I(DK+)分子(SEQ ID NO:22)在10mM乙酸钠、150mM NaCl、pH5.5中25℃保存4周之后的切割位点的反相高压液相色谱(RP-HPLC)谱。如图中所示，蛋白质切割在位置D95,D106,D180和D200的紧邻后方发生，且切割主要在紧邻D95和D200位置之后发生。PEG化蛋白质以5mg/mL蛋白质的浓度在10mM乙酸钠、150mM氯化钠、pH5.5中25℃保存4周。
[0032] 图6.显示pH对PEG化E/I(DK+)(SEQ ID NO:23)的经时蛋白聚集的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在10mM琥珀酸、5%山梨醇、pH4.0、4.5和5.5中于25℃保存4周。
[0033] 图7.显示pH对PEG化E/I(DK+)(SEQ ID NO:23)的经时蛋白断裂的量的影响的SE-HPLC数据。PEG化蛋白在10mM琥珀酸、5%山梨醇、pH4.0、4.5和5.5中于25℃保存4周。
[0034] 图8.显示PEG化的E/I(DK+)(SEQ ID NO:23)在10mM琥珀酸、5%山梨醇、pH4.0中，5mg/mL蛋白浓度25℃保存4周之后的切割位点的RP-HPLC谱。如图中所示，蛋白质切割在紧邻位置D95、D199和D218之后发生。
[0035] 图9.显示pH对多种基于纤连蛋白的支架蛋白构建体的经时蛋白聚集的影响的SE-HPLC数据。在25℃保存4周的期间内，测试多种基于纤连蛋白的支架蛋白在pH5.5或pH4.0的聚集的水平。E/I(DK+)为SEQ ID NO:23；E/I(DK-,无C端)为SEQ ID NO:24；E/I(2DK)为SEQ ID NO:25；且V/I(DK+)为SEQ ID NO:22。
[0036] 图10.显示多种基于纤连蛋白的支架蛋白在不同的pH下25℃保存4周期间内的断裂的量的RP-HPLC数据。含有DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白在pH4.0比在pH5.5更易于断裂。不含有基于纤连蛋白的支架蛋白与含有DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白相比在pH4.0对断裂更有抗性。E/I(DK+)是SEQ ID NO:23；E/I(DK-,无C端)为SEQ ID NO:24；E/I(2DK)为SEQ ID NO:25；且V/I(DK+)为SEQ ID NO:22。
[0037] 图11.LC-MS数据，显示E/I(DK-,无C端)分子(SEQ ID NO:24)中的主要切割位点为D199，而E/I(DK+)分子(SEQ ID NO:23)中的主要切割位点为D218。
[0038] 图12.LC-MS数据，显示E/I(2DK-)分子(SEQ ID NO:25)中的主要切割位点为D199.
[0039] 图13.在25℃保存长达两个月的VI(DK+)(SEQ ID NO:56)和VI(DK-)(SEQ ID NO:57)中观察到的聚集速率，通过SE-HPLC分析评估。
[0040] 图14.在25℃保存长达两个月的VI(DK+)(SEQ ID NO:56)和VI(DK-)(SEQ ID NO:57)中观察到的剪切速率(clip rate)，通过RP-HPLC分析评估。
[0041] 图15.VI(DK+)(SEQ ID NO:56)和VI(DK-)(SEQ ID NO:57)在25℃温育2个月后的RP-HPLC重叠色谱图的剪切区(clip region)。VI(DK+)的总%剪切为16%，而VI(DK-)则为6.9%。
[0042] 详细描述
[0043] 定义
[0044] “多肽”意指任何两个或更多个氨基酸的序列，无论其长度、翻译后修饰或功能。在本文中，”多肽”、”肽”与”蛋白质”可互换使用。多肽可包括天然氨基酸及非天然氨基酸，例如阐述于美国专利第6,559,126号中者，该专利以引用方式并入本文中。多肽亦可以多种标准化学方式中的任一者来修饰(例如，氨基酸可用保护基团修饰；羧基末端氨基酸可变成末端酰胺基；氨基末端残基可用基团修饰以例如增强亲脂性；或多肽可经化学糖基化或以其他方式修饰以增加稳定性或体内半衰期)。多肽的修饰可包括另一结构(例如环状化合物或其他分子)与多肽的附接，亦可包括含有一或多个构型改变(即，R或S；或L或D)的氨基酸的多肽。
[0045] 本文中的”氨基酸序列百分比同一性(%)”定义为：在比对各序列及(若需要)引入缺口以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分的条件下，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以通过本领域现有技术之内的多种方式来达成，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较序列全长范围内达到最大比对所需要的任何算法。不过，为本文中的目的，%氨基酸序列同一性值是如下所述通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc编写，该程序及其用户文档已经提交美国版权局(美国华盛顿，Washington D.C.,20559)，以美国版权注册号TXU510087注册；公众可通过Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif获得该软件。ALIGN-2程序需要编译以供在UNIX操作系统，优选UNIXV4.0D上使用。所有序列比对参数均由ALIGN-2程序确定，且不改变。
[0046] 就本文而言，给定氨基酸序列A对(to)、与(with)或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当理解的是，若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A对B的%氨基酸序列同一性会不等于B对A的%氨基酸序列同一性。
[0047] 术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。以药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞为限，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。
对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(time to disease progression(TTP))和/或测定响应率(response rates(RR))来测量体内功效。
对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(time to disease progression(TTP))和/或测定响应率(response rates(RR))来测量体内功效。
[0048] 氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定义为多肽的血清浓度在体内降低50%(例如由于序列或化合物的降解和/或天然机制对序列或化合物的清除或隔离)所花费的时间。半衰期可以以本身已知的任何方式来测定，例如通过药动学分析。合适的技术对于本领域技术人员会是清楚的，而且例如一般包括下述步骤：对灵长类动物适当施用合适剂量的要处理的氨基酸序列或化合物；以规则时间间隔自所述灵长类动物收集血液样品或其它样品；测定本发明的氨基酸序列或化合物在所述血液样品中的水平或浓度；并从如此获得的数据(图)计算到本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药后的初始水平相比降低50%为止的时间。参考例如标准手册，诸如Kenneth,A等人:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists and以及Peters等人：Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(1996)。还可参考″Pharmacokinetics″,M Gibaldi&D Perron,Marcel Dekker出版，第2修订版(1982)。
[0049] 半衰期可使用诸如t1/2-α、t1/2-β、及曲线下面积(AUC)等参数来表示。在本说明书中，“半衰期的增加”系指这些参数中的任一个中的增加，例如这些参数中的任两个、或实质上全部这三种参数的增加。“半衰期的增加”尤其指t1/2-β的增加，同时有或无t1/2-α及/或AUC或二者的增加。
[0050] 概述
[0051] 本申请描述改良的稳定性增加的基于纤连蛋白的支架蛋白。本申请中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白包含一个或多个经过修饰而结合一种或多种期望靶物的人纤连蛋白III型第10结构域。本申请还描述了改良的稳定性增加的VEGFR2/IGF-IR双特异性基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体，其包含两个人纤连蛋白III型第10结构域，其中一个已经过修饰而特异性结合VEGFR2，另一个已经过修饰而特异性结合IGF-IR。PCT申请WO2009/142773描述了可以共价或非共价连接、并可结合VEGFR2和IGF-IR二者的纤连蛋白支架多聚体。本申请部分地涉及这样一个出人意料的发现，即结合VEGFR2和IGF-IR的双特异性基于纤连蛋白的支架蛋白在特定的天冬氨酸残基处经受高频率的断裂(fragmentation)。具体地，发现后面紧随有赖氨酸残基的天冬氨酸残基与后随有其他氨基酸的天冬氨酸残基相比，对基于纤连蛋白的支架蛋白中的切割更为敏感。本申请还涉及这样的出人意料的发现，即VEGFR2/IGF-IR结合性的基于纤连蛋白的支架蛋白的断裂程度较之近缘的基于纤连蛋白的支架蛋白，即双特异性EGFR/IGF-IR结合性基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体为高，即使这两种类似的蛋白的保存条件相同，且享有的序列同一性百分比高。本申请还演示，对于一种模型式的基于纤连蛋白的支架蛋白，如果去除DK序列，或者对其加以修饰以将天冬氨酸残基替换为不同的氨基酸，例如谷氨酸，可以显著降低其断裂。本申请还提供基于纤连蛋白的支架蛋白的改进的组合物，其在保藏期间具有增加的稳定性。
[0052] 基于纤连蛋白的支架
[0053] Fn3是指来自纤连蛋白的III型结构域。Fn3域是小型、单体、可溶、并且稳定的。它缺乏二硫键，因此在还原条件下稳定。Fn3的总体结构与免疫球蛋白折叠相似。Fn3域以自N端到C端的顺序包括：β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；
环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。七条反向平行的β链排列成两个β片层，这两个片层形成稳定的核心，同时形成两个由连接各β或β样链的环构成的“面”。环AB、CD和EF位于一个面上，而环BC、DE与FG位于相对的面上。AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的任一个或全部都可参与配体结合。至少有15种不同的Fn3模组，虽然模块之间的序列同源性低，但它们之间三级结构具有高度的相似性。
环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。七条反向平行的β链排列成两个β片层，这两个片层形成稳定的核心，同时形成两个由连接各β或β样链的环构成的“面”。环AB、CD和EF位于一个面上，而环BC、DE与FG位于相对的面上。AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的任一个或全部都可参与配体结合。至少有15种不同的Fn3模组，虽然模块之间的序列同源性低，但它们之间三级结构具有高度的相似性。
[0054] AdnectinTM(Adnexus,Bristol-Myers Squibb的一家公司)，是一种基于纤连蛋白10
III型第10结构域,即Fn3的第10个模组，( Fn3)的配体结合性支架蛋白。天然存在的人
10
Fn3的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示： EVVAATPTSLLI
YYRITYGETGGNSPVQEFTV ATISGLKPGVDYTITVYAV
ISINYRT(SEQ ID NO:37)(AB、CD和EF环加有下划线，BC、FG和DE环加粗突出显示)。
III型第10结构域,即Fn3的第10个模组，( Fn3)的配体结合性支架蛋白。天然存在的人
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Fn3的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示： EVVAATPTSLLI
YYRITYGETGGNSPVQEFTV ATISGLKPGVDYTITVYAV
ISINYRT(SEQ ID NO:37)(AB、CD和EF环加有下划线，BC、FG和DE环加粗突出显示)。
[0055] 在SEQ ID NO:37中，AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基60-66，且FG环对应于残基76-87。参见例如Xu et al.,Chemistry&Biology20029:933-942。BC,DE和FG环沿着该分子的一个面排列，而AB、CD和EF沿着该分子的相对面排列。在SEQ ID NO:37中，β链A对应于残基9-14、β链B对应于残基17-20、β链C对应于残基31-38、β链D对应于残基46-50、β链E对应于残基57-59、β链F对应于残基67-75、且β链G对应于残基88-94。所述各链通过相应的环相互连接，例如，链A和链B通过环AB以下述顺序连接：链A、环AB、链B，等等。SEQ ID NO:37的最先8个氨基酸(上文斜体表示的)可以缺失而仍然保持分子的结合活性。在SEQ ID NO:37中涉及疏水核心的形成的残基(“核心氨基酸残基”)包括对应于SEQ ID NO:37的下列氨基酸的氨基酸：L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90和Y92，其中所述核心氨基酸残基由单字母氨基酸编码后随其在SEQ ID NO:37中的位置来表示。参见例如Dickinson et al.,J.Mol.Biol.236:1079-1092(1994)。
[0056] 10Fn3域在结构上和功能上与抗体类似，具体地说与抗体的可变区类似。虽然10Fn3域可以描述为“抗体模拟物”或“抗体样蛋白质”，但它们确实可以提供若干胜过常规抗体的优势。具体地，它们相比于抗体展现更好的折叠性能和热稳定性，而且它们缺少二硫键：已知二硫键在特定条件下可阻碍或阻止正确折叠。
[0057] 10Fn3域的BC、DE、和FG环与来自免疫球蛋白的互补决定区(CDR)类似。这些环10
区中的氨基酸序列变化改变 Fn3的结合特异性。也可以制作在AB、CD和EF环中有修饰
10
的 Fn3域以产生结合期望的靶物的分子。CDR样环外部的蛋白质序列与来自免疫球蛋白
10
的框架区类似，而且在 Fn3的结构构象中发挥作用。以结构构象的改变不破坏配体结合
10 10
为限，Fn3的框架样区的变化是容许的。用于生成 Fn3配体特异性结合物的方法已经记载于PCT公开号WO 00/034787、WO 01/64942、和WO 02/032925(其披露了高亲和力TNFα结合物)、PCT公开号WO 2008/097497(其披露了高亲和力VEGFR2结合物)、和PCT公开号WO 2008/066752(其披露了高亲和力IGFIR结合物)，以及WO 2009/142773(其披露了高
10
亲和力的多价的VEGFR2/IGF-IR结合物)。讨论 Fn3结合物和选择结合物的方法的其它参考文献包括PCT公开号WO 98/056915、WO 02/081497、和WO 2008/031098及美国公开号
2003/186385。
区中的氨基酸序列变化改变 Fn3的结合特异性。也可以制作在AB、CD和EF环中有修饰
10
的 Fn3域以产生结合期望的靶物的分子。CDR样环外部的蛋白质序列与来自免疫球蛋白
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的框架区类似，而且在 Fn3的结构构象中发挥作用。以结构构象的改变不破坏配体结合
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为限，Fn3的框架样区的变化是容许的。用于生成 Fn3配体特异性结合物的方法已经记载于PCT公开号WO 00/034787、WO 01/64942、和WO 02/032925(其披露了高亲和力TNFα结合物)、PCT公开号WO 2008/097497(其披露了高亲和力VEGFR2结合物)、和PCT公开号WO 2008/066752(其披露了高亲和力IGFIR结合物)，以及WO 2009/142773(其披露了高
10
亲和力的多价的VEGFR2/IGF-IR结合物)。讨论 Fn3结合物和选择结合物的方法的其它参考文献包括PCT公开号WO 98/056915、WO 02/081497、和WO 2008/031098及美国公开号
2003/186385。
[0058] 如上文所述，对应于SEQ ID NO:37的残基21-30、51-56及76-87的氨基酸残基分别界定BC、DE及FG环。然而，应了解，为了实现对期望的靶物(例如VEGFR2或IGF-IR)10
具有强亲和力的 Fn3结合域，并非环区域内的每一个残基都需要进行修饰。例如，在一些实施方案中，只有对应于BC环的氨基酸23-29、DE环的氨基酸52-55，以及FG环的氨基酸
10
77-86的残基被修饰以产生高亲和力 Fn3结合物(参见例如具有SEQ ID NO:3的VEGFR2结合核心)。由此，在某些实施方案中，BC环可以由对应于SEQ ID NO:37的残基23-29的氨基酸来界定，DE环可以由对应于SEQ ID NO:37的残基52-55的氨基酸来界定，且FG环可以由对应于SEQ ID NO:37的残基77-86的氨基酸来界定。
具有强亲和力的 Fn3结合域，并非环区域内的每一个残基都需要进行修饰。例如，在一些实施方案中，只有对应于BC环的氨基酸23-29、DE环的氨基酸52-55，以及FG环的氨基酸
10
77-86的残基被修饰以产生高亲和力 Fn3结合物(参见例如具有SEQ ID NO:3的VEGFR2结合核心)。由此，在某些实施方案中，BC环可以由对应于SEQ ID NO:37的残基23-29的氨基酸来界定，DE环可以由对应于SEQ ID NO:37的残基52-55的氨基酸来界定，且FG环可以由对应于SEQ ID NO:37的残基77-86的氨基酸来界定。
[0059] 此外，也可以在环区中进行插入和缺失，同时仍然产生高亲和力10Fn3结合域。例10
如，具有SEQ ID NO:3的VEGFR2结合物的FG环具有与野生型 Fn3域相同长度的FG环，即SEQ ID NO:37的77-86的10个残基被替换成SEQ ID NO:3的69-78的10个残基。相比
10
之下，具有SEQ ID NO:2的IGF-IR结合物的FG环的长度短于野生型 Fn3域的相应FG环，即SEQID NO:37的77-86的10个残基被替换成SEQ ID NO:2的69-74的6个残基。最后，
10
具有SEQ ID NO:39的EGFR结合物的FG环的长度长于野生型 Fn3域的相应FG环，即SEQ ID NO:37的77-86的10个氨基酸残基被替换为SEQ ID NO:39的69-83的15个氨基酸残基。
如，具有SEQ ID NO:3的VEGFR2结合物的FG环具有与野生型 Fn3域相同长度的FG环，即SEQ ID NO:37的77-86的10个残基被替换成SEQ ID NO:3的69-78的10个残基。相比
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之下，具有SEQ ID NO:2的IGF-IR结合物的FG环的长度短于野生型 Fn3域的相应FG环，即SEQID NO:37的77-86的10个残基被替换成SEQ ID NO:2的69-74的6个残基。最后，
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具有SEQ ID NO:39的EGFR结合物的FG环的长度长于野生型 Fn3域的相应FG环，即SEQ ID NO:37的77-86的10个氨基酸残基被替换为SEQ ID NO:39的69-83的15个氨基酸残基。
[0060] 相应地，在一些实施方案中，选自BC、DE和FG中的一个或多个环可以相对于野生10
型人 Fn3在长度上延伸或缩短。在一些实施方案中，所述环的长度可延伸2-25个氨基酸。
10
在一些实施方案中，所述环的长度可缩短1-11个氨基酸。尤其是，Fn3的FG环为12个残基长，而抗体重链中的相应环为4-28个残基不等。因此，为了使抗原结合最优化，可以对
10
Fn3的FG环的全长在长度和序列上加以改变以涵盖4-28个氨基酸的CDR3范围，来获得抗原结合的最大可能的灵活性和亲和力。在一些实施方案中，可以替换整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO:37的氨基酸78-80)中的一个或多个残基以破坏整联蛋白结合。在一个实施方案中，RGD序列被极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以从N端到C端的方向)替换。在另一个实施方案中，RGD序列被替换为SGE。
型人 Fn3在长度上延伸或缩短。在一些实施方案中，所述环的长度可延伸2-25个氨基酸。
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在一些实施方案中，所述环的长度可缩短1-11个氨基酸。尤其是，Fn3的FG环为12个残基长，而抗体重链中的相应环为4-28个残基不等。因此，为了使抗原结合最优化，可以对
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Fn3的FG环的全长在长度和序列上加以改变以涵盖4-28个氨基酸的CDR3范围，来获得抗原结合的最大可能的灵活性和亲和力。在一些实施方案中，可以替换整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO:37的氨基酸78-80)中的一个或多个残基以破坏整联蛋白结合。在一个实施方案中，RGD序列被极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以从N端到C端的方向)替换。在另一个实施方案中，RGD序列被替换为SGE。
[0061] 可以对10Fn3的非配体结合序列，即“10Fn3支架”进行改变，只要10Fn3域保留配体结合功能和/或结构稳定性。在一些实施方案中，Asp 7、Glu 9和Asp 23中的一个或多个被替换为其他氨基酸，例如，非带负电荷的氨基酸残基(如Asn、Lys等)。已有报道，这些10
突变与野生型形式相比具有促进突变体 Fn3在中性pH的更高稳定性的效果(参见PCT公
10
开号WO 02/04523)。已经公开了 Fn3支架中的多种其他有益的或者中性的改变。参见例如，Batori et al.,Protein Eng.200215(12):1015-20；Koide et al.,Biochemistry2001
40(34):10326-33。
突变与野生型形式相比具有促进突变体 Fn3在中性pH的更高稳定性的效果(参见PCT公
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开号WO 02/04523)。已经公开了 Fn3支架中的多种其他有益的或者中性的改变。参见例如，Batori et al.,Protein Eng.200215(12):1015-20；Koide et al.,Biochemistry2001
40(34):10326-33。
[0062] 10Fn3支架可通过一个或多个保守替换来修饰。支架中多达5%、10%、20%或甚至10
30%或更多的氨基酸可以通过保守替换来加以改变而不会实质性地改变 Fn3对配体的亲和力。在某些实施方案中，支架可包含0-15,0-10,0-8,0-6,0-5,0-4,0-3,1-15,1-10,1-8,1-6,1-5,1-4,1-3,2-15,2-10,2-8,2-6,2-5,2-4,5-15,或5-10个保守氨基酸替换。在示
10
例性的实施方案中，支架修饰优选地将 Fn3结合物对配体的结合亲和力降低小于100倍、
10
50倍、25倍、10倍、5倍、或2倍。有可能的是，此类变化会改变 Fn3的体内免疫原性，而且如果免疫原性被降低，则此类变化会是理想的。如本文中所使用的，“保守替代”指物理或功能上与相应的参照残基相似的残基。也就是说，保守替代及其参照残基具有相似的大小、形状、电荷、化学特性，包括形成共价或氢键的能力，等等。优选的保守替代是那些满足Dayhoff等,Atlas of Protein Sequence and Structure5:345-352(1978及增补)中为公认的点突变定义的标准的替代。保守替代的例子是下组内的替代：(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
30%或更多的氨基酸可以通过保守替换来加以改变而不会实质性地改变 Fn3对配体的亲和力。在某些实施方案中，支架可包含0-15,0-10,0-8,0-6,0-5,0-4,0-3,1-15,1-10,1-8,1-6,1-5,1-4,1-3,2-15,2-10,2-8,2-6,2-5,2-4,5-15,或5-10个保守氨基酸替换。在示
10
例性的实施方案中，支架修饰优选地将 Fn3结合物对配体的结合亲和力降低小于100倍、
10
50倍、25倍、10倍、5倍、或2倍。有可能的是，此类变化会改变 Fn3的体内免疫原性，而且如果免疫原性被降低，则此类变化会是理想的。如本文中所使用的，“保守替代”指物理或功能上与相应的参照残基相似的残基。也就是说，保守替代及其参照残基具有相似的大小、形状、电荷、化学特性，包括形成共价或氢键的能力，等等。优选的保守替代是那些满足Dayhoff等,Atlas of Protein Sequence and Structure5:345-352(1978及增补)中为公认的点突变定义的标准的替代。保守替代的例子是下组内的替代：(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
[0063] 在一个方面，本申请提供基于纤连蛋白的支架蛋白,例如包含至少一个10Fn3域并具有缺少DK序列的C端尾的多肽。在示例性的实施方案中，所述基于纤连蛋白的支架蛋白10
包含具有C端尾的 Fn3域，所述C端尾包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。这样的基于纤连蛋白的支架蛋白相对于含有一个或多个DK序列的基于纤连蛋白的支架具有改善的稳定性。
包含具有C端尾的 Fn3域，所述C端尾包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。这样的基于纤连蛋白的支架蛋白相对于含有一个或多个DK序列的基于纤连蛋白的支架具有改善的稳定性。
[0064] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含10Fn3域，所述10Fn3域与具有10
SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人 Fn3域具有至少40%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,或90%的同一性。变化性一般将会发生在一个或多个环中。基于纤连蛋白的支架蛋白中
10
的 Fn3域的每个β或β样链可以包含与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少
80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列、基本上由与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列组成，条件是这样
10
的变化不破坏该多肽在生理条件下的稳定性。在示例性的实施方案中，所述 Fn3域以小于
500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合期望的靶物。在示例性的实施方案中，基
10 10
于纤连蛋白的支架蛋白特异性结合不被野生型 Fn3域，尤其是野生型人 Fn3域所结合的靶物。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人 Fn3域具有至少40%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,或90%的同一性。变化性一般将会发生在一个或多个环中。基于纤连蛋白的支架蛋白中
10
的 Fn3域的每个β或β样链可以包含与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少
80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列、基本上由与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列组成，条件是这样
10
的变化不破坏该多肽在生理条件下的稳定性。在示例性的实施方案中，所述 Fn3域以小于
500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合期望的靶物。在示例性的实施方案中，基
10 10
于纤连蛋白的支架蛋白特异性结合不被野生型 Fn3域，尤其是野生型人 Fn3域所结合的靶物。
[0065] 在一些实施方案中，本公开提供包含10Fn3域的多肽，其中所述10Fn3域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG；并且选自环BC、DE和FG中的至少一个环相对于相应的人10
Fn3域具有经改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述BC和FG环是经过改变的。在
10
一些实施方案中，所述BC、DE、和FG环是经过改变的，即所述 Fn3域包含非天然存在的环。
“经改变的”意指相对于模板序列(即相应人类纤连蛋白结构域)的一处或多处氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、缺失及取代。氨基酸序列的改变可以通过有意的、盲目的或自发的序列变化，通常是核酸编码序列的序列变化来达成，并且可以通过任何技术(例如PCR、易错PCR或化学DNA合成)来进行。
Fn3域具有经改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述BC和FG环是经过改变的。在
10
一些实施方案中，所述BC、DE、和FG环是经过改变的，即所述 Fn3域包含非天然存在的环。
“经改变的”意指相对于模板序列(即相应人类纤连蛋白结构域)的一处或多处氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、缺失及取代。氨基酸序列的改变可以通过有意的、盲目的或自发的序列变化，通常是核酸编码序列的序列变化来达成，并且可以通过任何技术(例如PCR、易错PCR或化学DNA合成)来进行。
[0066] 在一些实施方案中，选自BC、DE及FG的一或多个环的长度可相对于相应人类纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，环的长度可延长2至25个氨基酸。在一些实施方10
案中，环的长度可减少1至11个氨基酸。尤其是，Fn3的FG环是12个残基长，而抗体重
10
链中的相应环的长度在4-28个残基不等。因此，为了优化抗原结合，可改变 Fn3环的长度以及序列来覆盖4-28个残基的CDR3范围，以获得最大可能的抗原结合灵活性及亲和力。
案中，环的长度可减少1至11个氨基酸。尤其是，Fn3的FG环是12个残基长，而抗体重
10
链中的相应环的长度在4-28个残基不等。因此，为了优化抗原结合，可改变 Fn3环的长度以及序列来覆盖4-28个残基的CDR3范围，以获得最大可能的抗原结合灵活性及亲和力。
[0067] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含10Fn3结构域，所述结构域具有与SEQ ID NO:1的非环区至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的氨基酸序列，其中选自BC、DE及FG的至少一个环是经改变的。在一些实施方案中，经改变的BC环具有最多10个氨基酸取代、最多4个氨基酸缺失、最多10个氨基酸插入，或其组合。在一些实施方案中，经改变的DE环具有最多6个氨基酸取代、最多4个氨基酸缺失、最多13个氨基酸插入，或其组合。在一些实施方案中，FG环具有最多12个氨基酸取代、最多11个氨基酸缺失、最多25个氨基酸插入，或其组合。
[0068] 在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含由下面的序列一般性地定义的10
Fn3域：
Fn3域：
[0069] EVVAATPTSLLISW(X)xRYYRITYGETGGNSPVQEFTVP(X)yTATISGLKPGVDYTITVYAVT(X)zPISINYRT (SEQ ID NO:38)
[0070] 在SEQ ID NO:38中，BC环由Xx表示，DE环由Xy表示，且FG环由Xz表示。X代表任何氨基酸，X后面的下标代表氨基酸数目的整数。具体而言，x、y及z可各自独立为2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7个氨基酸的范围内的任何值。在优选的实施方案中，x为7个氨基酸，y为4个氨基酸，且z为6、10或15个氨基酸。β链的序列(加下划线的)在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:38中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个取代、缺失或添加：0至10个、0至8、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个、0至2个或0至1个。在例示性实施方案中，β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:38中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个保守取代：0至10个、0至8个、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个、0至2个或0至1个。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均在核心氨基酸残基以外的残基处发生。以粗体显示的EIEK尾(SEQ ID NO:4)是固定的。在某些实施方案中，环区域紧邻旁侧的氨基酸(例如，没有下划线的残基)可各自独立地被取代或缺失。当取代环紧邻旁侧的残基时，可以将每个残基取代成具有相同氨基酸数的序列，或者取代成更大的氨基酸序列(例如插入0-10、0-8、0-5、0-3、或0-2个氨基酸残基)。没
10
有下划线的残基是环区域的一部分，因此适于加以取代而不会显著地影响 Fn3域的结构。
10
有下划线的残基是环区域的一部分，因此适于加以取代而不会显著地影响 Fn3域的结构。
[0071] 10Fn3域一般起始于SEQ ID NO:37的第1个氨基酸。但是，本发明也涵盖具有氨基酸缺失的域。在一些实施方案中，SEQ ID NO:37的最前8个氨基酸被缺失。对于具有相10
应于SEQ ID NO:37的1-94的氨基酸或SEQ ID NO:37的氨基酸9-94的 Fn3域，其N端或
10
C端也可以添加额外的序列。例如，可以将额外的MG序列置于 Fn3域的N端。M通常将被切除，留下G在N端。在一些实施方案中，N端延伸由选自下组的氨基酸序列组成：M、MG、G、以及SEQ ID NO:19-21中任一个。
应于SEQ ID NO:37的1-94的氨基酸或SEQ ID NO:37的氨基酸9-94的 Fn3域，其N端或
10
C端也可以添加额外的序列。例如，可以将额外的MG序列置于 Fn3域的N端。M通常将被切除，留下G在N端。在一些实施方案中，N端延伸由选自下组的氨基酸序列组成：M、MG、G、以及SEQ ID NO:19-21中任一个。
[0072] 10Fn3域 还可 任 选 地包 含 长 度为 1-20,1-15,1-10,1-8,1-5,1-4,1-3,1-2,或1个氨基酸的N端延伸。示例性的N端延伸包括(由单字母氨基酸编码表示)M,MG,G,MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:19),VSDVPRDL(SEQ ID NO:20), 和 GVSDVPRDL(SEQ ID NO:21)，或SEQ ID NO:19,20或21中任一个的N端截短。其他合适的N端延伸包括例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO:26)、XnDVPRDL(SEQ ID NO:27)、XnVPRDL(SEQ ID NO:28)、XnPRDL(SEQ ID NO:29)、XnRDL(SEQ ID NO:30)、XnDL(SEQ ID NO:31)、或XnL，其中n=0,1或2个氨基酸,
10
其中当n=1时，X为Met或Gly,且当n=2时,X为Met-Gly。当Met-Gly序列被添加到 Fn3域的N端时，M通常会被切去，留下G在N端。
10
其中当n=1时，X为Met或Gly,且当n=2时,X为Met-Gly。当Met-Gly序列被添加到 Fn3域的N端时，M通常会被切去，留下G在N端。
[0073] 本文中提供的基于纤连蛋白的支架蛋白包含这样的10Fn3域，其具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾序列。示例的C端尾包括长度为1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-5个或1-4个氨基酸的多肽。尾序列的具体实例包括，例如，包含下述序列，基本上由下述序列组成，或由下述序列组成的多肽：EIEK(SEQ ID NO:4)、EGSGC(SEQ ID NO:5)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:6)、EIEKPSQ(SEQ ID NO:32)、EIEKP(SEQ ID NO:33)、EIEKPS(SEQ ID NO:34)、或EIEKPC(SEQ ID NO:35)。这样的C端序列在本文中被称为“尾”或“延伸”，在本文中有进一步描述。在示例性的实施方案中，C端尾包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，C端序列缺少DK序列。在示例性的实施方案中，C端尾包括可使得PEG修饰容易的残基，即赖氨酸或半胱氨酸残基。在优选的实施方案中，C端尾缺少DK序列并包含半胱氨酸残基。
[0074] 在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含具有N端延伸和C端尾的10Fn3域。在一些实施方案中，可以将His6-标签置于N端或C端.
[0075] 在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含结合VEGFR2的10Fn3域。在某些实施方案中，所述基于纤连蛋白的支架蛋白以小于500nM的KD结合VEGFR2，且BC环包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列、DE包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列、FG环包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列、并且该蛋白质包含缺少DK序列的C端尾。在示例性的实施方案中，C端尾包含EIEK(SEQ ID NO:4),EGSGC(SEQ ID NO:5),EIEKPCQ(SEQ ID NO:6),EIEKPSQ(SEQ ID NO:32),EIEKP(SEQ ID NO:33),EIEKPS(SEQ ID NO:34),或EIEKPC(SEQ ID NO:35)。在优选的实施方案中，C端尾包含EIEK(SEQ ID NO:4)或EIEKPCQ(SEQ ID NO:6)。
[0076] 在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个或更多个10Fn3域的多10
价蛋白。例如，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白可包含2个，3个或更多个共价缔合的 Fn3
10
域。在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个 Fn3域的二价或二聚体蛋白。在某些实施方案中，多价的基于纤连蛋白的蛋白支架包含结合第一靶分子的第一
10 10
Fn3域，以及结合第二靶分子的第二 Fn3域。所述第一和第二靶分子可为相同的或不同
10
的靶分子。当所述第一和第二靶分子相同时，所述 Fn3域，即结合环，可以是相同的或者不
10
同的。因此，所述第一和第二 Fn3域可以结合相同的靶物，但结合于不同的表位。
价蛋白。例如，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白可包含2个，3个或更多个共价缔合的 Fn3
10
域。在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个 Fn3域的二价或二聚体蛋白。在某些实施方案中，多价的基于纤连蛋白的蛋白支架包含结合第一靶分子的第一
10 10
Fn3域，以及结合第二靶分子的第二 Fn3域。所述第一和第二靶分子可为相同的或不同
10
的靶分子。当所述第一和第二靶分子相同时，所述 Fn3域，即结合环，可以是相同的或者不
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同的。因此，所述第一和第二 Fn3域可以结合相同的靶物，但结合于不同的表位。
[0077] 在示例性的实施方案中，所述多价的基于纤连蛋白的蛋白支架的每个10Fn3域以小于500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合期望的靶物。在示例性的实施方案10
中，所述多价的基于纤连蛋白的蛋白支架的每个 Fn3域特异性地结合这样的靶物，该靶物
10 10
不被野生型 Fn3域，尤其是野生型人 Fn3域所结合。
中，所述多价的基于纤连蛋白的蛋白支架的每个 Fn3域特异性地结合这样的靶物，该靶物
10 10
不被野生型 Fn3域，尤其是野生型人 Fn3域所结合。
[0078] 多价的基于纤连蛋白的支架蛋白中的各个10Fn3域可以通过多肽接头连接。示例性的多肽接头包括具有1-20,1-15,1-10,1-8,1-5,1-4,1-3,或1-2个氨基酸的多肽。合适的多肽接头的具体例子在本文有进一步描述。在某些实施方案中，所述接头可以是如本文所述的C端尾多肽，如本文所述的N端延伸多肽，如下文所述的接头多肽，或者它们的任何组合。
[0079] 对于多价的基于纤连蛋白的支架蛋白，优选的是，任何10Fn3域都不包含含有DK序列的C端尾。在示例性的实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白包含两个或更10
多个 Fn3域，其中每个域均包含不含有DK序列的C端尾。在某些实施方案中，多价的
10
基于纤连蛋白的支架蛋白包含两个或更多个 Fn3域，其中每个域均包含这样的C端尾，其不含有DK序列，并且含有适合添加PEG模块的残基，诸如赖氨酸或半胱氨酸残基。在
10
某些实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白包含两个或更多个 Fn3域，其中每个域包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾。在某些实施方案中，多价的基于纤连
10 10
蛋白的支架蛋白包含两个或更多个 Fn3域，其中N端 Fn3域包含含有SEQ ID NO:4的
10
氨基酸序列的C端尾，而C端 Fn3域包含含有下述氨基酸序列的C端尾：EIEK(SEQ ID NO:4),EGSGC(SEQ ID NO:5),EIEKPCQ(SEQ ID NO:6),EIEKPSQ(SEQ ID NO:32),EIEKP(SEQ ID NO:33),EIEKPS(SEQ ID NO:34)，或EIEKPC(SEQ ID NO:35)。
多个 Fn3域，其中每个域均包含不含有DK序列的C端尾。在某些实施方案中，多价的
10
基于纤连蛋白的支架蛋白包含两个或更多个 Fn3域，其中每个域均包含这样的C端尾，其不含有DK序列，并且含有适合添加PEG模块的残基，诸如赖氨酸或半胱氨酸残基。在
10
某些实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白包含两个或更多个 Fn3域，其中每个域包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾。在某些实施方案中，多价的基于纤连
10 10
蛋白的支架蛋白包含两个或更多个 Fn3域，其中N端 Fn3域包含含有SEQ ID NO:4的
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氨基酸序列的C端尾，而C端 Fn3域包含含有下述氨基酸序列的C端尾：EIEK(SEQ ID NO:4),EGSGC(SEQ ID NO:5),EIEKPCQ(SEQ ID NO:6),EIEKPSQ(SEQ ID NO:32),EIEKP(SEQ ID NO:33),EIEKPS(SEQ ID NO:34)，或EIEKPC(SEQ ID NO:35)。
[0080] 通过改变10Fn3域的环序列，有可能生成结合任何期望的靶物的基于纤连蛋白的支架蛋白。在示例性的实施方案中，本申请提供的具有增加的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白可结合治疗上期望的靶物，例如TNF、VEGFR2、IGF-IR、或EGFR。在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述一种或多种靶物：EGFR、IGF-IR、HSA和PCSK9、或前述10
任一者的片段。在某些实施方案中，包含单个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述一种或多种靶物：EGFR,IGF-IR,HSA和PCSK9，或前述任一者的片段。在某些实施方案中，
10
包含单个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述任何靶物：EGFR,IGF-IR,HSA和
10
PCSK9,或前述任一者的片段。在某些实施方案中，包含两个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述一种或多种靶物：EGFR,IGF-IR,HAS和PCSK9，或前述任一者的片段。在
10
某些实施方案中，包含两个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述一种或多种靶分子组合：i)EGFR与IGF-IR；ii)EGFR与任何其他靶蛋白；或iii)人血清白蛋白与任何其
10
他靶蛋白。在某些实施方案中，包含两个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述任何靶分子组合：i)EGFR与IGF-IR；ii)EGFR与任何其他靶蛋白；或iii)人血清白蛋白与任何其他靶蛋白。
任一者的片段。在某些实施方案中，包含单个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述一种或多种靶物：EGFR,IGF-IR,HSA和PCSK9，或前述任一者的片段。在某些实施方案中，
10
包含单个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述任何靶物：EGFR,IGF-IR,HSA和
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PCSK9,或前述任一者的片段。在某些实施方案中，包含两个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述一种或多种靶物：EGFR,IGF-IR,HAS和PCSK9，或前述任一者的片段。在
10
某些实施方案中，包含两个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述一种或多种靶分子组合：i)EGFR与IGF-IR；ii)EGFR与任何其他靶蛋白；或iii)人血清白蛋白与任何其
10
他靶蛋白。在某些实施方案中，包含两个 Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合下述任何靶分子组合：i)EGFR与IGF-IR；ii)EGFR与任何其他靶蛋白；或iii)人血清白蛋白与任何其他靶蛋白。
[0081] 基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体
[0082] 在某些实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个10Fn3域的二聚体。在一个实施方案中，本申请提供V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体，其包含10
选自下组的第一和第二 Fn3域：(i)包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FG环，以及包含
10 10
SEQ ID NO:4-6中任一个的氨基酸序列的C端尾的 Fn3域，其中该 Fn3域结合IGF-IR；
和(ii)包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的FG环，以及包含SEQ ID NO:4-6中任一个的
10
氨基酸序列的C端尾的 Fn3域，其中该Fn3域结合VEGFR2。在示例性的实施方案中，所述
10
VEGFR2和IGF-IR结合性 Fn3域分别以小于500nM,100nM,1nM,500pM,100pM或更小的KD结合其靶物。
选自下组的第一和第二 Fn3域：(i)包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FG环，以及包含
10 10
SEQ ID NO:4-6中任一个的氨基酸序列的C端尾的 Fn3域，其中该 Fn3域结合IGF-IR；
和(ii)包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的FG环，以及包含SEQ ID NO:4-6中任一个的
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氨基酸序列的C端尾的 Fn3域，其中该Fn3域结合VEGFR2。在示例性的实施方案中，所述
10
VEGFR2和IGF-IR结合性 Fn3域分别以小于500nM,100nM,1nM,500pM,100pM或更小的KD结合其靶物。
[0083] 在某些实施方案中，V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体以自N端到C端的顺序包含IGF-IR结合域和VEGFR2结合域。在示例性的实施方案中，所述基于纤连蛋白的支架10
蛋白二聚体包含：(i)第一 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FG环、和包含SEQ
10 10
ID NO:4的氨基酸序列的C端尾，其中该 Fn3域结合IGF-IR；和(ii)第二 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的FG环、和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的C端尾，其中该
10 10
Fn3域结合VEGFR2。在示例性的实施方案中，所述VEGFR2结合性 Fn3域和IGF-IR结合
10
性 Fn3域分别以小于500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合其靶物。
蛋白二聚体包含：(i)第一 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FG环、和包含SEQ
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ID NO:4的氨基酸序列的C端尾，其中该 Fn3域结合IGF-IR；和(ii)第二 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的FG环、和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的C端尾，其中该
10 10
Fn3域结合VEGFR2。在示例性的实施方案中，所述VEGFR2结合性 Fn3域和IGF-IR结合
10
性 Fn3域分别以小于500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合其靶物。
[0084] 在某些实施方案中，所述V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体以自N端到C端的顺序包含VEGFR2结合域和IGF-IR结合域。在示例性的实施方案中，所述基于纤连蛋白的10
支架蛋白二聚体包含：(i)第一 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的FG环、以及
10 10
包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的C端尾，其中所述 Fn3域结合VEGFR2；和(ii)第二 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FG环、以及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的C
10 10
端尾，其中该 Fn3域结合IGF-IR；并且在示例性的实施方案中，所述VEGFR2结合性 Fn3
10
域和IGF-IR结合性 Fn3域分别以小于500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合其靶物。
支架蛋白二聚体包含：(i)第一 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的FG环、以及
10 10
包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的C端尾，其中所述 Fn3域结合VEGFR2；和(ii)第二 Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环、具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FG环、以及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的C
10 10
端尾，其中该 Fn3域结合IGF-IR；并且在示例性的实施方案中，所述VEGFR2结合性 Fn3
10
域和IGF-IR结合性 Fn3域分别以小于500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合其靶物。
[0085] 在某些实施方案中，所述V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含选自下组的第10
一和第二 Fn3域：(i)包含与SEQ ID NO:2具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由与SEQ ID NO:2具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO:2具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的
10 10
氨基酸序列组成的 Fn3域，其中所述 Fn3域包含具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾、基本上由具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾组成、或由具
10
有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾组成，并且其中该 Fn3域结合IGF-IR；
和(ii)包含与SEQ ID NO:3具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由与SEQ ID NO:3具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列组成、或由与SEQ ID NO:3具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列组成
10 10
的 Fn3域，其中所述 Fn3域包含具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾、基本上由具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾组成、或由具有SEQ ID NO:4-6
10
中任一者的氨基酸序列的C端尾组成，且其中所述 Fn3域结合VEGFR2。在示例性的实施方
10 10
案中，所述VEGFR2结合性 Fn3域和IGF-IR结合性 Fn3域分别以小于500nM、100nM、1nM、
10
500pM、100pM或更小的KD结合其靶物。在示例性的实施方案中，所述第一和第二 Fn3域通过多肽接头相连。在某些实施方案中，所述V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含N端
10 10
VEGFR2结合性 Fn3域和C端IGF-IR结合性 Fn3域。在某些实施方案中，所述V/I基于纤
10 10
连蛋白的支架蛋白二聚体包含N端IGF-IR结合性 Fn3域和C端VEGFR2结合性 Fn3域。
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在某些实施方案中，所述N端 Fn3域包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾，而所
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述C端 Fn3域包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的C端尾。
一和第二 Fn3域：(i)包含与SEQ ID NO:2具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由与SEQ ID NO:2具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO:2具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的
10 10
氨基酸序列组成的 Fn3域，其中所述 Fn3域包含具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾、基本上由具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾组成、或由具
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有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾组成，并且其中该 Fn3域结合IGF-IR；
和(ii)包含与SEQ ID NO:3具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列、基本上由与SEQ ID NO:3具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列组成、或由与SEQ ID NO:3具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%同一性的氨基酸序列组成
10 10
的 Fn3域，其中所述 Fn3域包含具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾、基本上由具有SEQ ID NO:4-6中任一者的氨基酸序列的C端尾组成、或由具有SEQ ID NO:4-6
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中任一者的氨基酸序列的C端尾组成，且其中所述 Fn3域结合VEGFR2。在示例性的实施方
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案中，所述VEGFR2结合性 Fn3域和IGF-IR结合性 Fn3域分别以小于500nM、100nM、1nM、
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500pM、100pM或更小的KD结合其靶物。在示例性的实施方案中，所述第一和第二 Fn3域通过多肽接头相连。在某些实施方案中，所述V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含N端
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VEGFR2结合性 Fn3域和C端IGF-IR结合性 Fn3域。在某些实施方案中，所述V/I基于纤
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连蛋白的支架蛋白二聚体包含N端IGF-IR结合性 Fn3域和C端VEGFR2结合性 Fn3域。
10
在某些实施方案中，所述N端 Fn3域包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的C端尾，而所
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述C端 Fn3域包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的C端尾。
[0086] 在某些实施方案中，V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID NO:48-55中任一者的氨基酸序列。在其他的实施方案中，V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含与SEQ ID NO:48-55中任一者的氨基酸序列具有至少70、75、80、85、90、95、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列。
[0087] 在某些实施方案中，V/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2的多肽，其中N1和N2为任选的N端延伸，独立地包含0-10个氨基酸，其中D1和D2独立地选自下组：(i)与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少
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90%,95%,97%,98%,99%或100%的同一性的纤连蛋白III型第10结构域( Fn3)域，其中所
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述 Fn3域以小于500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合IGF-IR，和(ii)与SEQ
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ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%的同一性的 Fn3域，
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其中所述 Fn3域以小于500nM,100nM,1nM,500pM,100pM的KD结合VEGFR2；其中L为包含0-30个氨基酸残基的多肽接头；其中C1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；且其中C2包含SEQ ID NO:4、5、6中的任一氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:4、5、6中的任一氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:4、5、6中的任一氨基酸序列组成。在某些实施方案中，D1结合VEGFR2且D2结合IGF-IR。在其他的实施方案中，D1结合IGF-IR且D2结合VEGFR2。
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90%,95%,97%,98%,99%或100%的同一性的纤连蛋白III型第10结构域( Fn3)域，其中所
10
述 Fn3域以小于500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更小的KD结合IGF-IR，和(ii)与SEQ
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ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90%,95%,97%,98%,99%或100%的同一性的 Fn3域，
10
其中所述 Fn3域以小于500nM,100nM,1nM,500pM,100pM的KD结合VEGFR2；其中L为包含0-30个氨基酸残基的多肽接头；其中C1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；且其中C2包含SEQ ID NO:4、5、6中的任一氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:4、5、6中的任一氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:4、5、6中的任一氨基酸序列组成。在某些实施方案中，D1结合VEGFR2且D2结合IGF-IR。在其他的实施方案中，D1结合IGF-IR且D2结合VEGFR2。
[0088] 在某些实施方案中，所述D1或D2区是结合VEGFR2的10Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID10
NO:45的氨基酸序列的FG环，其中该 Fn3域以小于100nM的KD结合VEGFR2。
NO:45的氨基酸序列的FG环，其中该 Fn3域以小于100nM的KD结合VEGFR2。
[0090] EVVAATPTSLLISW RYYRITYGETGGNSPVQEFTVPTATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO:3)。
[0091] 在SEQ ID NO:3中，BC、DE和FG环的序列具有以粗体表示的固定序列(例如，具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的FG环)，且其余的加有下划线的序列(例如，7个β链以及AB、CD和EF环的序列)相对于SEQ ID NO:3中所示的相应氨基酸具有0-20个、0-15个、0-10个、0-8个、0-6个、0-5个、0-4个、0-3个、0-2个、或0-1个取代、保守取代、缺失或添加。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均发生在核心氨基酸残基之外的残基处。
[0092] 结合VEGFR2的10Fn3域可任选地连接于长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的N端延伸(N1或N2)。示例性的N端延伸包括(由单字母氨基酸编码表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:19)、VSDVPRDL(SEQ ID NO:20)、和GVSDVPRDL(SEQ ID NO:21)，或者SEQ ID NO:19,20或21中任一个的N端截短物。其他合适的N端延伸包括，例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO:26)、XnDVPRDL(SEQ ID NO:27)、XnVPRDL(SEQ ID NO:28)、XnPRDL(SEQ ID NO:29)、XnRDL(SEQ ID NO:30)、XnDL(SEQ ID NO:31)、或XnL,其中n=0,1或
2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，当n=2时，X为Met-Gly。在优选的实施方案中，N1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，N2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。
2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，当n=2时，X为Met-Gly。在优选的实施方案中，N1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，N2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。
[0093] 结合VEGFR2的10Fn3域可任选地包含C端尾(C1或C2)。要求保护的发明的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的C端尾不含DK序列。示例的C端尾包含长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2,或1个氨基酸的多肽。C端尾的具体实例包括EIEKPSQ(SEQ ID NO:32)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:6)、和EIEK(SEQ ID NO:4)。在其他的实施方案中，合适的C端尾可以是SEQ ID NO:4、6或32的C端截短的片段，包括例如下述氨基酸序列之一(由单字母氨基酸编码表示)：EIE、EIEKP(SEQ ID NO:33)、EIEKPS(SEQ ID NO:34)、或EIEKPC(SEQ ID NO:35)。其他合适的C端尾包括例如ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(SEQ ID NO:36)、或EGSGC(SEQ ID NO:5)。在某些实施方案中，C1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，C2包含SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，C1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；并且C2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
[0094] 在某些实施方案中，结合VEGFR2的10Fn3域包含N端延伸和C端尾二者。在示例性的实施方案中，N1以Gly或Met-Gly起始，C1不包含半胱氨酸残基，N2不以Met开10
始、且C2包含半胱氨酸残基。结合VEGFR2的 Fn3域的具体实例是包含下述的多肽：(i)SEQ ID NO:3中所示出的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少
85%,90%,95%,97%,98%,或99%的同一性的氨基酸序列。
始、且C2包含半胱氨酸残基。结合VEGFR2的 Fn3域的具体实例是包含下述的多肽：(i)SEQ ID NO:3中所示出的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少
85%,90%,95%,97%,98%,或99%的同一性的氨基酸序列。
[0095] 在某些实施方案中，D1或D2区是结合IGF-IR的10Fn3域，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环,具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环，和具有SEQ ID10
NO:42的氨基酸序列的FG环，其中所述 Fn3域结合以小于100nM的KD结合IGF-IR。
NO:42的氨基酸序列的FG环，其中所述 Fn3域结合以小于100nM的KD结合IGF-IR。
[0096] 在某些实施方案中，D1或D2区是由下述氨基酸序列表示的IGF-IR结合物：
[0097] EVVAATPTSLLISW RYYRITYGETGGNSPVQEFTVPTATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO:2)
[0098] 在SEQ ID NO:2中，BC、DE和FG环的序列具有以粗体表示的固定序列(例如，具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FG环)，且其余的加有下划线的序列(例如，7个β链以及AB、CD和EF环的序列)相对于SEQ ID NO:2中所示的相应氨基酸具有0-20个、0-15个、0-10个、0-8个、0-6个、0-5个、0-4个、0-3个、0-2个或0-1个取代、保守取代、缺失或添加。
在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均发生在核心氨基酸残基之外的残基处。
在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均发生在核心氨基酸残基之外的残基处。
[0099] 结合IGF-IR的10Fn3域可任选地与长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的N端延伸(N1或N2)连接。示例性的N端延伸包括(由单字母氨基酸编码表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:19)、VSDVPRDL(SEQ ID NO:20)、和GVSDVPRDL(SEQ ID NO:21)，或者SEQ ID NO:19、20或21中任一个的N端截短物。其他合适的N端延伸包括例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO:26)、XnDVPRDL(SEQ ID NO:27)、XnVPRDL(SEQ ID NO:28)、XnPRDL(SEQ ID NO:29)、XnRDL(SEQ ID NO:30)、XnDL(SEQ ID NO:31)、或XnL,其中n=0,1或
2个氨基酸，其中当n=1时，X是Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly。在优选的实施方案中，N1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，N2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。
2个氨基酸，其中当n=1时，X是Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly。在优选的实施方案中，N1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，N2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。
[0100] 结合IGF-IR的10Fn3域可任选地包含C端尾(C1或C2)。要求保护的发明的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的C端尾不含有DK序列。示例的C端尾包含长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的多肽。C端尾的具体实例包括EIEKPSQ(SEQ ID NO:32),EIEKPCQ(SEQ ID NO:6)和EIEK(SEQ ID NO:4)。在其他的实施方案中，合适的C端尾可以是SEQ ID NO:4、6或32的C端截短的片段，包括例如下述氨基酸序列之一(由单字母氨基酸编码表示)：EIE、EIEKP(SEQ ID NO:33)、EIEKPS(SEQ ID NO:34)、或EIEKPC(SEQ ID NO:35)。其他合适的C端尾包括例如ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(SEQ ID NO:36)、或EGSGC(SEQ ID NO:5)。在某些实施方案中，C1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成.在某些实施方案中，C2包含SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，C1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，且C2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成.
[0101] 在某些实施方案中，结合IGF-IR的10Fn3域包含N端延伸和C端尾二者。在示例性的实施方案中，N1以Gly或Met-Gly起始，C1不包含半胱氨酸残基，N2不以Met起10
始，且C2包含半胱氨酸残基。结合IGF-IR的 Fn3域的具体实例是包含下述的多肽：(i)SEQ ID NO:2中所示出的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少
85%,90%,95%,97%,98%，或99%的同一性的氨基酸序列。
始，且C2包含半胱氨酸残基。结合IGF-IR的 Fn3域的具体实例是包含下述的多肽：(i)SEQ ID NO:2中所示出的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少
85%,90%,95%,97%,98%，或99%的同一性的氨基酸序列。
[0102] L区为多肽接头。示例性的多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多肽。本说明书下文中进一步描述了合适的多肽接头的具体实例。
在某些实施方案中，接头可以是如本文所述的C端尾多肽，如本文所述的N端延伸多肽，或其组合。
在某些实施方案中，接头可以是如本文所述的C端尾多肽，如本文所述的N端延伸多肽，或其组合。
[0103] 在某些实施方案中，N1,N2,L,C1或C2中的一个或多个可包含适合于PEG化的氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸残基。在示例性的实施方案中，C2包含至少一个适合于PEG化的氨基酸，例如半胱氨酸或赖氨酸残基。下文进一步描述了合适的多肽接头的具体例子。具有结构N1-D1-C1-L-N2-D2-C2的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的具体例子是包含下述的多肽：(i)SEQ ID NO:48-55中任一项所列出的序列，或(ii)与SEQ ID NOs:48-55中任一项具有至少85%、90%、95%、97%、98%,或99%同一性的氨基酸序列。
[0104] 在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体将具有结构N1-D1-L-N2-D2,其中D1和D2各自包含具有下述序列的氨基酸序列：
[0105] EVVAATPTSLLISW(X)xRYYRITYGETGGNSPVQEFTVP(X)yTATISGLKPGVDYTITVYAVT(X)zPISINYRT (SEQ ID NO:38)
[0106] 在SEQ ID NO:38中，BC环由Xx表示，DE环由Xy表示，FG环由Xz表示。β链的序列(加下划线的)在所有7个支架区中相对于SEQ ID NO:38中所示的相应氨基酸可具有0-10个、0-8个、0-6个、0-5个、0-4个、0-3个、0-2个、或0-1个取代、缺失或添加。在示例性的实施方案中，β链的序列在所有7个支架区中相对于SEQ ID NO:38中所示的相应氨基酸可具有0-10个、0-8个、0-6个、0-5个、0-4个、0-3个、0-2个、或0-1个保守取代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均发生在核心氨基酸残基之外的残基处。以粗体显示的EIEK尾(SEQ ID NO:4)是固定的。在某些实施方案中，环区的紧邻旁侧的氨基酸(例如，未加下划线的残基)可以各自独立地被取代或缺失。当取代环紧邻旁侧的残基时，可以将每个残基取代成具有相同氨基酸数的序列，或者取代成更大的氨基酸序列(例如插入0-10、0-8、0-5、0-3、或0-2个氨基酸残基)。未加下
10
划线的残基是环区域的一部分，因此适于加以取代而不会显著地影响 Fn3域的结构。
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划线的残基是环区域的一部分，因此适于加以取代而不会显著地影响 Fn3域的结构。
[0107] 在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-L-N2-D2,10
其中D1和D2选自下组：(i)包含SEQ ID NO:38的 Fn3域，其中Xx包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；Xy包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成；且(ii)包
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含SEQ ID NO:38的 Fn3域，其中Xx包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成；Xy包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成.
其中D1和D2选自下组：(i)包含SEQ ID NO:38的 Fn3域，其中Xx包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；Xy包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成；且(ii)包
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含SEQ ID NO:38的 Fn3域，其中Xx包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成；Xy包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成.
[0108] 在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有结构N1-D1-L-N2-D2,其中D1包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列,其中Xx包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；Xy包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，且其中D2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列,其中Xx包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成,Xy包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成。
[0109] 在另一示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有序列N1-D1-L-N2-D2,其中D1包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列,其中Xx包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成；Xy包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成；且其中D2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列,其中Xx包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；Xy包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成；且Xz包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成。
[0110] 在某些实施方案中，具有结构N1-D1-L-N2-D2的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体进一步包含C端尾。在示例性的实施方案中，C端尾包含适于添加PEG模块的残基，例如，赖氨酸或半胱氨酸残基。在优选的实施方案中，C端尾包含序列PCQ。
[0111] 在多种实施方案中，具有结构N1-D1-L-N2-D2的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的L域是多肽接头。示例性的多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多肽。本说明书下文中进一步描述了合适的多肽接头的具体实例。此外，N1和N2是本说明书上文中描述的N端延伸。
[0112] 在优选的实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体在体外和/或体内具有增加的稳定性。在某些实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体在溶液中在储存过程中具有减少的断裂和/或降低的聚集。在某些实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有增加的血清半衰期。
[0113] 在示例性的实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相对于包含DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有减少的断裂。具体地，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相对于在下述任一者中具有一个或多个DK序列的基于纤连蛋10
白的支架蛋白二聚体具有增加的稳定性：C端尾、N端延伸、或两个 Fn3域之间的接头。例如，所述基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体通常比在一个或两个C端尾区域中具有DK序列，
10
例如，包含在第一和/或第二个 Fn3亚单位之后具有SEQ ID NO:46的尾的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体更为稳定。在示例性的实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相对于具有式N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,其中C1和/或C2包含SEQ ID NO:46的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有减少的断裂。断裂可以使用例如RP-HPLC分析来评估，如实施例3中所述。
白的支架蛋白二聚体具有增加的稳定性：C端尾、N端延伸、或两个 Fn3域之间的接头。例如，所述基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体通常比在一个或两个C端尾区域中具有DK序列，
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例如，包含在第一和/或第二个 Fn3亚单位之后具有SEQ ID NO:46的尾的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体更为稳定。在示例性的实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相对于具有式N1-D1-C1-L-N2-D2-C2,其中C1和/或C2包含SEQ ID NO:46的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体具有减少的断裂。断裂可以使用例如RP-HPLC分析来评估，如实施例3中所述。
[0114] 在示例性的实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体在溶液中于pH4.0储存4周时展现少于7%、6%、5%、4%、3.5%、3%、2%或更少的断裂。在某些实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相对于含有一个或多个DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的等同形式展现降低至少25%,30%,40%,50%,60%,70%,75%,80%或更多的断裂水平。
[0115] 在示例性的实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相对于含有一个或多个DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的等同形式展现增加至少10%,20%,25%,30%,40%,50%,60%,70%,80%或更多的血清半衰期。在其他的实施方案中，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体相对于含有一个或多个DK序列的基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的等同形式的血清半衰期展现增加至少2倍、3倍、5倍、10倍或更多的血清半衰期。
[0116] 在某些实施方案中，本申请提供E/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体，其包含一10 10
个结合EGFR的 Fn3域和一个结合IGF-IR的 Fn3域。在某些实施方案中，E/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列。在其他的实施方案中，E/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含与SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列具有至少70,75,80,85,90,95,97,98,99或100%同一性的氨基酸序列。
个结合EGFR的 Fn3域和一个结合IGF-IR的 Fn3域。在某些实施方案中，E/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列。在其他的实施方案中，E/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体包含与SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列具有至少70,75,80,85,90,95,97,98,99或100%同一性的氨基酸序列。
[0117] 多肽接头
[0118] 本申请提供多价的基于纤连蛋白的支架蛋白，其包含至少两个通过多肽接头连接10
的 Fn3域。在一个实施方案中，本申请提供基于纤连蛋白的支架二聚体，其包含通过多肽
10
接头(L)连接的两个 Fn3域。所述多肽包含N端结构域和C端结构域，所述N端结构域包
10 10 10
含第一 Fn3域，所述C端结构域包含第二 Fn3域。所述第一和第二 Fn3域可直接连接或通过多肽接头(L)间接连接。其他接头或间隔物，例如SEQ ID NO:4,6或32,可以导入到
10 10
第一 Fn3域的C端，位于该 Fn3域与所述多肽接头之间。其他接头或间隔物可以导入所
10 10
述第二 Fn3域的N端，位于该 Fn3域与所述多肽接头之间。
的 Fn3域。在一个实施方案中，本申请提供基于纤连蛋白的支架二聚体，其包含通过多肽
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接头(L)连接的两个 Fn3域。所述多肽包含N端结构域和C端结构域，所述N端结构域包
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含第一 Fn3域，所述C端结构域包含第二 Fn3域。所述第一和第二 Fn3域可直接连接或通过多肽接头(L)间接连接。其他接头或间隔物，例如SEQ ID NO:4,6或32,可以导入到
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第一 Fn3域的C端，位于该 Fn3域与所述多肽接头之间。其他接头或间隔物可以导入所
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述第二 Fn3域的N端，位于该 Fn3域与所述多肽接头之间。
[0119] 用于接合10Fn3域的合适接头是这样的接头，它们容许不同的域彼此独立地折叠，形成允许对靶分子的高亲和力结合的三维结构。本申请规定，符合这些要求的合适接头包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头，以及接头SEQ ID NO:7。WO 2009/142773中描述的实施例显示，通过这些接头接合的Fn3域保留它们的靶物结合功能。在一些实施方案中，所述接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基，并且长度可为8-50，10-30，及10-20个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID NO:8-12。在一些实施方案中多肽接头选自SEQ ID NO:8和9。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸残基，并且长度可为3-30、10-30、和3-20个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID NO:13,14和
15。在一些实施方案中，接头是基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨酸残基，并且长度可为3-30、10-30、3-20、和6-18个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID NO:16,17和18。考虑到最优的接头长度和氨基酸组成可以按照本领域公知的方法通过常规实验来确定。在一些实施方案中，多肽接头为SEQ ID NO:7。在示例性的实施方案中，所述接头不含有任何DK序列。
15。在一些实施方案中，接头是基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨酸残基，并且长度可为3-30、10-30、3-20、和6-18个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID NO:16,17和18。考虑到最优的接头长度和氨基酸组成可以按照本领域公知的方法通过常规实验来确定。在一些实施方案中，多肽接头为SEQ ID NO:7。在示例性的实施方案中，所述接头不含有任何DK序列。
[0120] 药动学模块
[0121] 在一个方面，本申请提供进一步包含药动学(PK)模块的基于纤连蛋白的支架蛋白。药动学涵盖化合物的包括例如被受试者吸收、分布、代谢及消除的性质。改善的药动学可以根据认识到的治疗需要来评估。增加生物利用度和/或增加给药之间的时间常常是理想的，这可能通过增加蛋白质在给药后在血清中保持可用的时间来实现。在一些情况中，理想的是改善蛋白质的血清浓度的经时连续性(例如降低蛋白质在施用后不久的血清浓度与下一次施用前不久的血清浓度的差异)。基于纤连蛋白的支架蛋白可以附接于这样的模块，相对于未修饰的多肽，所述模块使多肽在哺乳动物(例如小鼠、大鼠、或人)中的清除率降低大于3倍。改善的药动学的其它量度可以包括血清半衰期，其常常分成α期和β期。这两期或其中任一个可以通过添加合适的模块显著地改善。PK模块是指任何如下所述的蛋白质、肽或模块，当它与生物活性分子融合时，可影响该生物活性分子的药动学性质。
[0122] 倾向于减慢蛋白质自血液的清除的PK模块包括聚氧化烯模块，例如聚乙二醇、糖(例如，唾液酸)，以及耐受良好的蛋白质模块(例如，Fc、Fc片段、转铁蛋白或血清白蛋白)。基于纤连蛋白的支架蛋白可以融合于白蛋白或如美国专利公开20070048282中描述的白蛋白的片段(部分)或变体。在一些实施方案中，PK模块是血清白蛋白结合蛋白，诸如美国专利申请公开序列号2007/0178082和2007/0269422中描述的那些。在一些实施方案中，所述PK模块是血清免疫球蛋白结合蛋白，诸如美国专利申请公开序列号2007/0178082中描述的那些。
[0123] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白可以附接于包含非蛋白聚合物的PK模块。在一些实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇、或聚氧化烯，如美国专利第4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所描述的。在示例性的实施方案中，所述聚合物是PEG模块。
[0124] PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可通过商业途径获得或者可依照本领域众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,卷3,页138-161)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，无论大小或PEG末端的修饰，而且可以由下式来表示：X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH(1)，其中n为20-2300，X为H或末端修饰，例如C1-4烷基。在一个实施方案中，本发明的PEG的一端以氢或甲氧基终止，即X是H或CH（3“甲氧基PEG”）。PEG可进一步包含结合反应所必需的化学基团；其源自分子的化学合成；或者其是为获得分子各部分之间的最佳距离的间隔物。另外，这样的PEG可以由一个或多个连接到一起的PEG侧链组成。具有超过一条PEG链的PEG称作多臂的或分支的PEG。分支的PEG可通过例如聚环氧乙烷加成至各种多元醇（包括甘油、季戊四醇、和山梨醇）来制备。例如，可以自季戊四醇和环氧乙烷制备四臂分支PEG。分支PEG记载于例如欧洲申请公布No.473084A和美国专利No.5,932,462。一种形式的PEG包括两条经某个赖氨酸的伯氨基相连接的PEG侧链(PEG2)(Monfardini,C.等,Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
[0125] PEG对肽或蛋白质的缀合一般包括活化PEG和将活化后的PEG-中间体直接偶联至目标蛋白质/肽或偶联至接头，随后将该接头活化并偶联至目标蛋
白 质 / 肽 ( 参 见 Abuchowski,A. 等 ,J.Biol.Chem.,252,3571(1977) 和 J.Biol.Chem.,252,3582(1977),Zalipsky 等 , 和 Harris 等 , 于 :《Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications》;(J.M.Harris 编 )Plenum Press:New York,1992;第21和22章)。注意，包含PEG分子的基于纤连蛋白的支架蛋白也称作缀合蛋白质，而没有连接PEG分子的蛋白质可称作未缀合的。
白 质 / 肽 ( 参 见 Abuchowski,A. 等 ,J.Biol.Chem.,252,3571(1977) 和 J.Biol.Chem.,252,3582(1977),Zalipsky 等 , 和 Harris 等 , 于 :《Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications》;(J.M.Harris 编 )Plenum Press:New York,1992;第21和22章)。注意，包含PEG分子的基于纤连蛋白的支架蛋白也称作缀合蛋白质，而没有连接PEG分子的蛋白质可称作未缀合的。
[0126] 所利用的PEG的大小取决于数项因素，包括基于纤连蛋白的支架蛋白的预期用途。为了增加在身体、血液、非血液胞外流体或组织中的半衰期，优选较大的PEG。对于体内细胞活性，优选约10-60kDa范围的PEG，以及小于约100kDa、更优选小于约60kDa的PEG，但也可使用大于约100kDa的大小。对于体内成像应用，可使用较小的PEG，一般小于约20kDa，它们增加半衰期没有大PEG那么多，从而容许更快地分布和更短的半衰期。为了缀合至基于纤连蛋白的支架蛋白，可以选择多种分子量形式的PEG，例如从约1,000道尔顿(Da)至100,000Da（n为20-2300）。PEG中重复单元的数目“n”是根据以道尔顿描述的分子量而估算的。优选的是，活化后的接头上的PEG的分子量的总和适合于药物用途。如此，在一个实施方案中，PEG分子的分子量不超过100,000Da。例如，如果三个PEG分子连接于接头，其中每个PEG分子具有相同的分子量12,000Da（每个的n为约270），那么接头上的PEG的总分子量为约36,000Da（总n为约820）。连接于接头的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在接头上的三个分子中，两个PEG分子可以是每个5,000Da（每个n为约110），而一个PEG分子可以是12,000Da（n为约270）。在一些实施方案中，将一个PEG模块缀合于基于纤连蛋白的支架蛋白。在一些实施方案中，PEG模块是约20、30、40、50、60、70、80、或90KDa。在一些实施方案中，PEG模块是约40KDa。
[0127] 在一些实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白含有一个、两个或更多个PEG模块。在一个实施方案中，PEG模块结合于这样的氨基酸残基：其位于蛋白质表面上和/或远离与靶配体接触的表面。在一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白中PEG的联合分子量或总分子量为约3,000Da至60,000Da，或约10,000Da至36,000Da。在一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白中的PEG是基本上线性的直链PEG。
[0128] 本领域技术人员能为PEG选择合适的分子量，例如根据PEG化的的基于纤连蛋白的支架蛋白会如何用于治疗、期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性、免疫原性、和其它考虑。关于PEG及其用于增强蛋白质性能的用途的讨论参见N.V.Katre,Advanced Drug Delivery Reviews10:91-114(1993)。
[0129] 在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白与符合下式的一个聚(乙二醇)基团共价连接：-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR，其中聚(乙二醇)基团的-CO（即羰基）与结合多肽的一个氨基形成酰胺键；R是低级烷基；x是2或3；m是约450至约950；并且选择n和m使得缀合物减去结合多肽的分子量为约10-40kDa。在一个实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的赖氨酸ε-氨基是可利用的（游离的）氨基。
[0130] 在一个具体的实施方案中，使用PEG的碳酸酯来形成PEG-基于纤连蛋白的支架蛋白缀合物。可以在与PEG的反应中使用N,N’-二琥珀酰亚氨基碳酸酯(DSC)来形成有活性的混合PEG-琥珀酰亚氨基碳酸酯，其随后可以与接头的亲核基团或基于纤连蛋白的支架蛋白的氨基起反应(参见美国专利No.5,281,698和美国专利No.5,932,462)。在一种类似类型的反应中，可以使1,1’-(二苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡啶基)碳酸酯与PEG起反应以分别形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美国专利No.5,382,657)。
[0131] 基于纤连蛋白的支架蛋白的PEG化可依照现有技术的方法来实施，例如通过基于纤连蛋白的支架蛋白与亲电子活性PEG的反应(供应商:Shearwater Corp.,USA,万维网上的shearwatercorp.com)。本发明的优选PEG试剂是例如N-羟基琥珀酰亚氨基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯或分支的N-羟基琥珀酰亚胺诸如mPEG2-NHS(Monfardini,C.,等,Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。此类方法可用于对基于纤连蛋白的支架蛋白的赖氨酸的ε-氨基或基于纤连蛋白的支架蛋白的N端氨基的PEG化。
[0132] 在另一个实施方案中，PEG分子可以被偶联于基于纤连蛋白的支架蛋白上的巯基（sulfhydryl）(Sartore,L., 等 ,Appl.Biochem.Biotechnol.,27,45(1991);Morpurgo等,Biocon.Chem.,7,363-368(1996);Goodson等,Bio/Technology(1990)8,343;美国专利No.5,766,897)。美国专利No.6,610,281和5,766,897记载了例示性的可偶联于巯基的反应性PEG种类。
[0133] 在一些实施方案中，PEG化基于纤连蛋白的支架蛋白是通过定点PEG化，特别是通过将PEG缀合至半胱氨酸模块而生成的。在特定的实施方案中，Cys残基可以位于基于纤连蛋白的支架蛋白的N端、或位于其N端和最靠N端的β或β样链之间、或位于其C端、或位于其C端和最靠C端的β或β样链之间。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是二聚体，且Cys残基可以位于基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的任一结合域的N端、或位于其N端和最靠N端的β或β样链之间、或位于其C端、或位于其C端和最靠C端的β或β样链之间。在特定的实施方案中，Cys残基可以位于基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的N端、基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的N端和最靠N端的β或β样链(即基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的N端结合域)之间、或者基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的C端、或者基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的C端和最靠C端的β或β样链(即基于纤连蛋白的支架蛋白二聚体的C端结合域)之间。Cys残基也可以位于其它位置，特别是任何不参与靶物结合的环，或者多价的基于纤连蛋白的支架蛋白的两个结合域之间。PEG模块也可以通过其它化学来连接，包括通过缀合至胺。
[0134] 在某些PEG分子被缀合至基于纤连蛋白的支架蛋白上的半胱氨酸残基的实施方案中，半胱氨酸残基对于基于纤连蛋白的支架蛋白而言是天然的，而在其它实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基通过工程改造被引入基于纤连蛋白的支架蛋白中。可以在基于纤连蛋白的支架蛋白编码序列中引入突变以产生半胱氨酸残基。这可以通过，例如，将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。用于突变成半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其它亲水性残基。优选的是，待突变成半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。根据蛋白质一级序列预测残基的表面可及性的算法在本领域是众所周知的。或者，由于作为基于纤连蛋白的支架蛋白的设计的基础的第10fn3框架的晶体结构已经得以解析并且由此鉴定了表面暴露的残基，可以通过比较基于纤连蛋白的支架蛋白的氨基酸序列来预测表面残基(参见Dickinson等,J.Mol.Biol.236(4):1079-92(1994))。在一个实施方案中，将半胱氨酸残基引入基于纤连蛋白的支架蛋白中的N和/或C端或其附近，或者环区内。半胱氨酸残基的PEG化可以使用例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺、或PEG-正吡啶基二硫化物来实施。
[0135] 在有些实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白包含共价附接于N端氨基酸的α氨基的PEG分子。位点特异性N端还原性氨化记载于Pepinsky等(2001)JPET,297,1059和美国专利No.5,824,784。利用其它可用的亲核氨基用PEG-醛进行蛋白质还原性氨化的用途记载于美国专利No.4,002,531;Wieder等(1979)J.Biol.
Chem.254,12579;和Chamow等(1994)Bioconjugate Chem.5,133。
Chem.254,12579;和Chamow等(1994)Bioconjugate Chem.5,133。
[0136] 在另一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白包含一个或多个共价连接至接头的PEG分子，而该接头连接于基于纤连蛋白的支架蛋白N端氨基酸残基的α氨基。这样的方法披露于美国专利申请公开文本No.2002/0044921和PCT公开文本No.WO94/01451。
[0137] 在一个实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的C端被PEG化。在一个具体的实施方案中，通过引入C端叠氮-甲硫氨酸，随后借助Staudinger反应来缀合甲基-PEG-三芳基膦化合物，来将蛋白质的C端PEG化。这种C端缀合方法记载于Cazalis等,C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity,Bioconjug Chem.2004;15(5):1005-1009。
[0138] 在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白在C端尾区被PEG化，如本文中进一步描述的。示例性的C端尾包括例如具有SEQ ID NO:5、6或35中任一者的多肽。
[0139] 可以使用本领域已知的常规分离和纯化技术来纯化PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白，诸如大小排阻（例如凝胶过滤）和离子交换层析。也可以使用SDS-PAGE来分离产物。可以分离的产物包括单PEG化、二PEG化、三PEG化、多PEG化和未PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白，以及游离PEG。可以通过合并洗脱峰周围的更宽级分(broader fractions)，提高组合物中单PEG的百分比，来控制单PEG缀合物的百分比。约90%的单PEG缀合物代表了产量和活性的优良平衡。如下所述的组合物可能是理想的：其中例如至少92%或至少
96%的缀合物是单PEG种类。在本发明的一个实施方案中，单PEG缀合物的百分比为约90%至96%。
96%的缀合物是单PEG种类。在本发明的一个实施方案中，单PEG缀合物的百分比为约90%至96%。
[0140] 在本发明的一个实施方案中，PEG化基于纤连蛋白的支架蛋白中的PEG在使用羟胺测定（例如450mM羟胺(pH6.5)，室温，8-16小时）时不会从PEG化的氨基酸残基水解下来，因此是稳定的。在一个实施方案中，组合物的超过80%、更优选至少90%、最优选至少95%是稳定的单PEG-基于纤连蛋白的支架蛋白。
[0141] 在另一个实施方案中，PEG化基于纤连蛋白的支架蛋白优选将保留与未修饰蛋白质相关的生物学活性的至少约25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。在一个实施方案中，生物学活性指其结合一个或多个靶分子的能力，以KD、kon或koff来评估。在一个具体的实施方案中，相对于未PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白显示出升高的对一个或多个靶分子的结合。
[0142] 相对于未修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的清除速率，PEG修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的血清清除速率可以降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或甚至90%。相对于未修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期，PEG修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期(t1/2)可以延长。PEG修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期可以相对于未修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期延长至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%、或甚至1000%。在有些实施方案中，蛋白质半衰期是在体外测定的，诸如在缓冲盐水溶液中或在血清中。在其它实施方案中，蛋白质半衰期是体内半衰期，诸如基于纤连蛋白的支架蛋白在动物的血清或其它体液中的半衰期。
90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%、或甚至1000%。在有些实施方案中，蛋白质半衰期是在体外测定的，诸如在缓冲盐水溶液中或在血清中。在其它实施方案中，蛋白质半衰期是体内半衰期，诸如基于纤连蛋白的支架蛋白在动物的血清或其它体液中的半衰期。
[0143] 核酸-蛋白质融合技术
[0144] 在一个方面，本申请提供结合人靶物例如TNF-α、EGFR、VEGFR2、IGF-IR和其它蛋白质的包含纤连蛋白III型结构域的基于纤连蛋白的支架蛋白。一种快速产生并测试具有特定结合特性的Fn3结构域的方式是Adnexus(一家Bristol-Myers Squibb公司)的核TM酸-蛋白质融合物技术。此类体外表达和标记技术，称作PROfusion ，利用核酸-蛋白质融合物（RNA-蛋白质融合物和DNA-蛋白质融合物），可以用来鉴定对于与蛋白质的结合重要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合物技术是一种共价偶联蛋白质与其编码遗传信息的技术。关于RNA-蛋白质融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述参见Szostak等,美国专利No.:6,258,558;6,261,804;6,214,553;6,281,344;6,2
07,446;6,518,018;PCT公开文本号WO00/34784;WO01/64942;WO02/032925;及Roberts和Szostak,Proc Natl.Acad.Sci.94:12297-12302,1997,通过述及收入本文。
07,446;6,518,018;PCT公开文本号WO00/34784;WO01/64942;WO02/032925;及Roberts和Szostak,Proc Natl.Acad.Sci.94:12297-12302,1997,通过述及收入本文。
[0145] 载体和多核苷酸
[0146] 编码本文中所公开的各种基于纤连蛋白的支架蛋白之任一的核酸可以化学合成、酶学合成、或重组合成。可以选择密码子用法以改善在细胞中的表达。此类密码子用法会取决于所选择的细胞类型。已经开发了用于大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞专门的密码子用法模式。参见例如：Mayfield等,Proc Natl Acad Sci U S A.2003Jan 21;100(2):438-42;Sinclair等,Protein Expr Purif.2002Oct;26(1):96-105;Connell ND.,Curr Opin Biotechnol.2001Oct;12(5):446-9;Makrides等,Microbiol Rev.1996Sep;60(3):512-38;及Sharp等,Yeast.1991Oct;7(7):657-78。
[0147] 通 用 核 酸 操 作 技 术 记 载 于 例 如Sambrook等 ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 卷1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第 2 版 ,1989,或 F.Ausubel 等 ,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience:New York,1987)和定期更新，通过述及收入本文。编码多肽的DNA与源自哺乳动物、病毒、或昆虫基因的合适转录或翻译调节元件可操作连接。这样的调节元件包括转录启动子、任选的操纵基因序列（用以控制转录）、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。还加入在宿主中复制的能力（通常由复制起点赋予）和选择基因（用以帮助转化子的识别）。
[0148] 本文所述的基于纤连蛋白的支架蛋白质可以重组生产，不仅是直接的重组生产，还作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是信号序列或其它具有位于成熟蛋白或多肽的N末端的特异性切割位点的多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别和加工（即被信号肽酶切割）的异源信号序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，用原核信号序列取代信号序列，原核信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，可以用例如下述序列取代天然信号序列：酵母转化酶前导序列、α因子前导序列（包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列）、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列、或PCT公开文本No.WO90/13646中记载的信号。在哺乳动物细胞表达中，有哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列（例如单纯疱疹gD信号）可供使用。可以将这样的前体区域的DNA与编码蛋白质的DNA以符合读码框的方式相连接。
[0149] 表达载体和克隆载体都包含使载体能够在选定的一种或多种宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列使载体能够不依赖于宿主染色体DNA而复制，这种序列包括复制起点或自主复制序列。多种细菌、酵母和病毒的此类序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV）可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件（SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子）。
[0150] 表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，的抗性；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0151] 适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等,Nature282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株（例如ATCC No.44076或PEP4-1）提供了选择标志。Jones,Genetics85:12(1977)。于是，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，Leu2缺陷型酵母菌株（ATCC20,622或38,626）被携带Leu2基因的已知质粒所补足。
[0152] 表达载体和克隆载体通常包含被宿主生物体识别的、与编码基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸可操作连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子（诸如tac启动子）。然而，其它已知的细菌启动子是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码基于纤连蛋白的支架蛋白的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
[0153] 真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有真核基因在位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处都具有富AT区。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处还可找到另一种序列，即CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加polyA尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表达载体。
[0154] 适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
[0155] 其它酵母启动子(它们是诱导型启动子，具有通过生长条件控制转录的额外优点)有醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP专利公开文本No.73,657。酵母增强子也可以有利地与酵母启动子一起使用。
[0156] 对于哺乳动物宿主细胞中自载体的转录，可通过例如从病毒（诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如腺病毒2）、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和更优选的猿猴病毒40(SV40)）基因组、异源哺乳动物启动子（例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）、及热休克启动子获得的启动子来控制，条件是这样的启动子与宿主细胞系统相容。
[0157] 方便地以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便地以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes等,Nature297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
[0158] 常常通过在载体中插入增强子序列来增加高等真核细胞对编码基于纤连蛋白的支架蛋白的DNA的转录。现在知道许多来自哺乳动物基因（球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素）的增强子序列。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子（bp100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增强子可以被剪接到载体中位于多肽编码序列的5′或3′方向的位置，但是优选位于启动子的5′方向的位置上。
[0159] 用于真核宿主细胞（例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞）的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端(且偶尔可从3′端)获得。这些区域包含这样核苷酸区段，其被转录为编码多肽的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中披露的表达载体。
[0160] 重组DNA还可包含任何类型的可能对基于纤连蛋白的支架蛋白的纯化有用的蛋白质标签序列。蛋白质标签的例子包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、或GST标签。与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适宜的克隆和表达载体可见于Cloning Vectors:A Laboratory Manual,(Elsevier,New York,1985)，以此通过述及收入其相关公开内容。
[0161] 使用对宿主细胞适宜的方法将表达构建物导入宿主细胞中，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本领域已知多种用于将核酸导入宿主细胞中的方法，包括但不限于电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、或其它物质的转染；微粒轰击；脂质体转染(lipofection)；和感染（其中载体是感染剂）。
[0162] 合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌属(Bacilli spp)。酵母(优选来自酵母属物种，诸如酿酒酵母(S.cerevisiae))也可用于生产多肽。也可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。关于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统的综述见Luckow和Summers,Bio/Technology,6:47,1988。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T、和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白来制备纯化的基于纤连蛋白的支架蛋白。对于许多应用，基于纤连蛋白的支架蛋白的小尺寸会使得大肠杆菌表达成为优选的表达方法。然后从培养液或细胞提取物纯化基于纤连蛋白的支架蛋白。
[0163] 蛋白质生产
[0164] 用本文所述用于生产蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在适当更改的常规营养培养基中进行培养，以诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因。
[0165] 可以在多种培养基中培养用于生产基于纤连蛋白的支架蛋白的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)(Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；美 国 专 利 No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利No.Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、TM
抗生素（诸如GENTAMYCIN 药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件（诸如温度、pH等）是先前表达选用的宿主细胞所用的培养条件，这对于普通技术人员而言是容易想到的。
抗生素（诸如GENTAMYCIN 药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件（诸如温度、pH等）是先前表达选用的宿主细胞所用的培养条件，这对于普通技术人员而言是容易想到的。
[0166] 本文中所公开的基于纤连蛋白的支架蛋白也可以使用无细胞翻译系统来生产。为了该目的，必须修饰编码基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸以容许体外转录产生mRNA，并容许mRNA在所利用的特定无细胞系统（真核型如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统；或原核型如细菌无细胞翻译系统）中进行无细胞翻译。
[0167] 基于纤连蛋白的支架蛋白也可以通过化学合成来生产（例如使用Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,1984,The Pierce Chemical Co.,Rockford,IL中记载的方法)。对基于纤连蛋白的支架蛋白蛋白的修饰也可以通过化学合成来产生。
[0168] 本文中公开的基于纤连蛋白的支架蛋白可以通过蛋白质化学领域普遍知道的蛋白质分离/纯化方法来纯化。非限制性的例子包括抽提、再结晶、盐析（例如用硫酸铵或硫酸钠）、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分配或这些的任意组合。纯化后，可以通过本领域已知的多种技术(包括但不限于过滤和透析)将基于纤连蛋白的支架蛋白更换到不同的缓冲液中和/或浓缩。
[0169] 纯化后的基于纤连蛋白的支架蛋白优选是至少85%纯、更优选至少95%纯、最优选至少98%纯。无论纯度的确切数值如何，基于纤连蛋白的支架蛋白对于用作药品是足够纯的。
[0170] 示例性的用途
[0171] 在一个方面，本申请提供用可检测模块标记的基于纤连蛋白的支架蛋白。该基于纤连蛋白的支架蛋白可用于各种诊断应用。可检测模块可以是任何能够直接或间接产生可检测信号的模块。例如，可检测模块可以是放射性同位素，诸如H3、C14、C13、P32、S35、或I131；荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明、或萤光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
[0172] 任何本领域已知的将蛋白质缀合至可检测模块的方法均可以采用，这样的方法包括Hunter等,Nature144:945(1962);David等,Biochemistry13:1014(1974);Pain等,J.Immunol.Meth.40:219(1981);及Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30:407(1982)所记载的方法。体外方法包括本领域众所周知的缀合化学，包括与蛋白质相容的化学，诸如对特定氨基酸（诸如Cys和Lys）的化学。为了将可检测模块连接至基于纤连蛋白的支架蛋白，使用连接基团或反应性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，而且包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。取决于应用，优选的连接基团是二硫化物基团和硫醚基团。对于不含Cys半胱氨酸的多肽，可以通过工程化在某个位置引入Cys，以便在创建缀合位置的同时容许蛋白质的活性存在。
[0173] 连有可检测模块的基于纤连蛋白的支架蛋白也可用于体内成像。可将多肽与不透射线(radio-opaque)的药剂或放射性同位素连接，施用给受试者（优选进入血流），并测定经标记蛋白质在受试者中的存在和位置。当基于纤连蛋白的支架蛋白结合与癌症有关的靶物时，这种成像技术在例如恶性肿瘤的分期和治疗中是有用的。可以用任何在受试者中可检测（通过核磁共振、放射学、或本领域已知的其它检测手段）的模块来标记蛋白质。
[0175] 基于纤连蛋白的支架蛋白可用于任何已知的测定法，诸如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、和免疫沉淀测定(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,页147-158(CRC Press,Inc.,1987))。
[0176] 在某些方面，本公开内容提供了用于检测样品中的目标分子诸如VEGFR2,IGF-IR或EGFR的方法。该方法可包括使样品接触本文中所描述的基于纤连蛋白的支架蛋白，其中所述接触在容许基于纤连蛋白的支架蛋白-靶物复合物形成的条件下进行，并检测所述复合物，由此检测所述样品中的所述靶物。检测可使用本领域已知的任何技术来进行，如放射线照相术、免疫学测定法、荧光检测、质谱、或表面等离子共振。样品常常会是生物学样品，诸如活检，特别是肿瘤、疑似肿瘤的活检。样品可以来自人或其它哺乳类动物。基于纤连蛋白的支架蛋白可以用标记模块标记，诸如放射性模块、荧光模块、生色模块、化学发光模块、或半抗原模块。基于纤连蛋白的支架蛋白可以固定化在固体支持物上。
[0177] 在一个方面，本申请提供在病症的治疗中有用的基于纤连蛋白的支架蛋白。可以治疗的疾病或病症将由基于纤连蛋白的支架蛋白的结合特异性来决定。本申请还提供用于对受试者施用基于纤连蛋白的支架蛋白的方法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白对于哺乳动物，特别是人而言是药学上可接受的。“药学上可接受的”多肽指对动物施用时没有显著的不利医学后果的多肽。药学上可接受的药10
学可接受的的例子包括缺少整联蛋白结合域(RGD)的 Fn3结构域和基本上不含内毒素或
10
具有很低的内毒素或热原水平的 Fn3结构域。
学可接受的的例子包括缺少整联蛋白结合域(RGD)的 Fn3结构域和基本上不含内毒素或
10
具有很低的内毒素或热原水平的 Fn3结构域。
[0178] 在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白，尤其是结合IGF-IR、VEGFR2和/或EGFR的基于纤连蛋白的支架蛋白，在治疗病症，诸如癌症中有用。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白可用于治疗与IGF-IR、VEGFR2和/或EGFR突变或表达水平相关的癌症。在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的施用治疗受试者中的抗增殖性病症。在一些实施方案中，施用基于纤连蛋白的支架蛋白在体内抑制肿瘤细胞生长。肿瘤细胞可衍生自任何细胞类型，包括但不限于表皮、上皮、内皮、白血病、肉瘤、多发性骨髓瘤、或中胚层细胞。异种移植物肿瘤研究中使用的常用肿瘤细胞系的例子包括A549（非小细胞肺癌）细胞、DU-145（前列腺）细胞、MCF-7（乳腺）细胞、Colo205（结肠）细胞、3T3/IGF-IR（小鼠成纤维细胞）细胞、NCI H441细胞、HEP G2（肝癌）细胞、MDA MB231（乳腺）细胞、HT-29（结肠）细胞、MDA-MB-435s（乳腺）细胞、U266细胞、SH-SY5Y细胞、Sk-Mel-2细胞、NCI-H929、RPM18226、和A431细胞。在一些实施方案中，相对于未处理动物中肿瘤的生长，基于纤连蛋白的支架蛋白抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，相对于未处理动物中肿瘤的生长，基于纤连蛋白的支架蛋白将肿瘤细胞生长抑制50、60、70、80%或更多。在一些实施方案中，对肿瘤细胞生长的抑制是在开始用基于纤连蛋白的支架蛋白处理动物后至少7天或至少14天测量的。在一些实施方案中，与基于纤连蛋白的支架蛋白一起给动物施用另一种抗肿瘤剂。
[0179] 在某些方面，本公开内容提供施用基于纤连蛋白的支架蛋白以治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移的方法，其中肿瘤选自下组：脑瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统肿瘤、胃肿瘤、喉肿瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，不限于这些。
[0180] 在某些方面，本公开内容提供施用基于纤连蛋白的支架蛋白以治疗选自下组的癌性疾病的方法：鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头癌、颈癌、食管癌、妇科癌症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病。
[0181] 在其他的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白结合涉及炎症应答和/或自身免疫病症的靶物，例如肿瘤坏死因子(TNF)α。这样的基于纤连蛋白的支架蛋白可用于治疗自身免疫病症如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、银屑病、以及难治性哮喘。
[0182] 配制剂和施用
[0183] 本发明还提供包含本文中所述的基于纤连蛋白的支架蛋白的药学上可接受的组合物，其中该组合物基本上不含内毒素或热原。
[0184] 通过将具有期望纯度的所描述的蛋白质与任选的生理学可接受的担载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980))混合，以水溶液、冻干或其它干燥配制剂的形式制备包含基于纤连蛋白的支架蛋白的治疗用配制剂。可接受的担载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵(octadecyidimethylbenzyl ammonium chloride)；氯化己烷双胺(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚(catechol)；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子(salt-forming counter-ions)，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，TM TM
诸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。
诸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。
[0185] 本文中的配制剂还可含有多于一种治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的化合物。这样的分子以对预定目的有效的量合适的组合存在。
[0186] 基于纤连蛋白的支架蛋白还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊），在胶状药物投递系统中（例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊），或在粗乳状液中。此类技术披露于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
[0187] 在特定的实施方案中，本申请提供基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定组合物，其具有4.0-6.5的pH。在其他实施方案中，本申请提供基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定组合物，其具有4.0-5.5的pH。在其他实施方案中，本申请提供基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定组合物，其具有5.5的pH。在其他实施方案中，本申请提供基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定组合物，其具有4.0的pH。尤其是，本申请提供基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定组合物，其在溶液中保存的过程中具有降低的断裂和/或低水平的聚集。如示例部分所展示的，本文中描述的基于纤连蛋白的支架蛋白在pH4.0具有增加的稳定性，同时在pH4.0与pH5.5相比展示降低的聚集水平。这样的稳定、可溶的pH为4.0的配制剂特别适合于静脉内施用。在一些实施方案中，这样的稳定配制剂中的蛋白质浓度为至少3mg/mL。在示例性的实施方案中，这样的稳定配制剂中的蛋白质浓度为至少5mg/mL。在某些实施方案中，这样的稳定配制剂中的蛋白质浓度在3-10mg/mL、3-8mg/mL、3-6mg/mL、3-5mg/mL、4-10mg/mL、4-8mg/mL、4-6mg/mL、5-10mg/mL、5-8mg/mL、或5-6mg/mL的范围。在示例性的实施方案中，所述基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂相对于基于纤连蛋白的支架蛋白的pH更高的等价配制剂具有减少的聚集。例如，所述稳定的配制剂在pH4.0溶液中保存4周的过程中，相对于基于纤连蛋白的支架蛋白在pH5.5或更高的pH溶液中保存4周过程中所观察到的聚集水平，可显示至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%或更少的聚集。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂在25℃保存至少4周后具有少于10%、8%、7%、6%、
5%、4%、3%、2%、1%或更少的聚集物。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂在25℃、pH4.0溶液中保存4周时具有少于7%、6%、5%、4%、3.5%、3%、2%或更少的断裂。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂在25℃溶液中保存至少
4周的过程中具有少于5%的断裂和少于5%的聚集。在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂在25℃溶液中保存至少4周的过程中具有少于4%的断裂和少于
4%的聚集。
5%、4%、3%、2%、1%或更少的聚集物。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂在25℃、pH4.0溶液中保存4周时具有少于7%、6%、5%、4%、3.5%、3%、2%或更少的断裂。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂在25℃溶液中保存至少
4周的过程中具有少于5%的断裂和少于5%的聚集。在示例性的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定配制剂在25℃溶液中保存至少4周的过程中具有少于4%的断裂和少于
4%的聚集。
[0188] 用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
[0189] 可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本文所述的基于纤连蛋白的支架蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚TM物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT （由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化蛋白在体内长时间维持时，它们可能因为暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性的损失和可能的免疫原性改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
[0190] 虽然熟练技术人员会理解每种基于纤连蛋白的支架蛋白的剂量会取决于该蛋白的身份，但是优选的剂量范围可以是约10mg/平方米至约2000mg/平方米、更优选约50mg/平方米至约1000mg/平方米。
[0191] 为了治疗性应用，以药学可接受剂量形式将基于纤连蛋白的支架蛋白施用于受试者。它们可以静脉内（作为推注或持续一段时间的连续输注）、肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径施用。蛋白质也可以通过肿瘤内、肿瘤周围、病变内、或病变周围路径施用，以发挥局部以及全身治疗效果。合适的药学可接受担载体、稀释剂、和赋形剂是众所周知的，而且可以由本领域技术人员根据临床情况来决定。合适的担载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括：(1)Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，pH约7.4，含有约1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋白；(2)0.9%盐水(0.9%w/v NaCl)；和(3)5%(w/v)右旋糖。本发明的方法可以在体外、在体内、或回体实施。
[0192] 以治疗应用为目的，可以如上所述地进行基于纤连蛋白的支架蛋白与一种或多种其他治疗剂的施用（无论是共同施用或者是顺序施用）。根据共同施用的具体治疗剂的身份，熟练技术人员会了解适合于共同施用的药学可接受担载体、稀释剂和赋形剂。
[0193] 在以水性剂型而非冻干剂型存在时，基于纤连蛋白的支架蛋白通常将配制成约0.1mg/ml至100mg/ml的浓度，但也容许在这些范围以外广泛变化。就疾病治疗而言，基于纤连蛋白的支架蛋白的适宜剂量将取决于待治疗疾病的类型(如上文所定义的)、疾病的严重程度和进程、施用基于纤连蛋白的支架蛋白是出于预防目的还是治疗目的、先前疗法的过程、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断等。适宜地以一次性治疗或一系列治疗的方式施用基于纤连蛋白的支架蛋白。
[0194] 序列表
[0195] 野生型核心序列
[0196] EVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:1)
[0197] I核心(SEQ ID NO:2)
[0198] EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT
[0199] V核心(SEQ ID NO:3)
[0200] EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
[0201] 短尾(SEQ ID NO:4)
[0202] EIEK
[0203] 修饰的Cys尾(SEQ ID NO:5)
[0204] EGSGC
[0205] Cys尾(SEQ ID NO:6)
[0206] EIEKPCQ
[0207] 基于Fn的接头(SEQ ID NO:7)
[0208] PSTSTST
[0209] GS5接头(SEQ ID NO:8)
[0210] GSGSGSGSGS
[0211] GS10接头(SEQ ID NO:9)
[0212] GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS
[0213] (GGGGS)3(SEQ ID NO:10)
[0214] GGGGS GGGGS GGGGS
[0215] (GGGGS)5(SEQ ID NO:11)
[0216] GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS
[0217] G4SG4SG3SG(SEQ ID NO:12)
[0218] GGGGSGGGGSGGGSG
[0219] GPG(SEQ ID NO:13)
[0220] GPGPGPG(SEQ ID NO:14)
[0221] GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO:15)
[0222] PA3接头(SEQ ID NO:16)
[0223] PAPAPA
[0224] PA6接头(SEQ ID NO:17)
[0225] PAPAPAPAPAPA
[0226] PA9接头(SEQ ID NO:18)
[0227] PAPAPAPAPAPAPAPAPA
[0228] MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:19)
[0229] VSDVPRDL(SEQ ID NO:20)
[0230] GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 21)
[0231] DK+ VEGFR2/IGF-IR结合物(SEQ ID NO: 22)
[0232] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
[0233] DK+ EGFR/IGF-IR结合物(SEQ ID NO: 23)
[0234] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRT
[0235] DK- EGFR/IGF-IR结合物，带GSGC尾(SEQ ID NO: 24)
[0236] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRT
[0237] DK- EGFR/IGF-IR结合物，带EIEKPCQ尾(SEQ ID NO: 25)
[0238] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRT
[0239] XnSDVPRDL,其中n=0,1或2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly(SEQ ID NO:26)
[0240] XnDVPRDL,其中n=0,1或2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly(SEQ ID NO:27)
[0241] XnVPRDL,其中n=0,1或2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly(SEQ ID NO:28)
[0242] XnPRDL,其中n=0,1或2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly(SEQ ID NO:29)
[0243] XnRDL,其中n=0,1或2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly(SEQ ID NO:30)
[0244] XnDL,其中n=0,1或2个氨基酸，其中当n=1时，X为Met或Gly，且当n=2时，X为Met-Gly(SEQ ID NO:31)
[0245] EIEKPSQ(SEQ ID NO:32)
[0246] EIEKP(SEQ ID NO:33)
[0247] EIEKPS(SEQ ID NO:34)
[0248] EIEKPC(SEQ ID NO:35)
[0249] EGSGS(SEQ ID NO:36)
[0250] 野生型纤连蛋白序列
[0251] EVVAATPTSLLI YYRITYGETGGNSPVQEFTVATISGLKPGVDYTITVYAV ISINYRT(SEQ IDNO:37)
[0252] 10Fn3核心，带EIEK尾
[0253] EVVAATPTSLLISW(X)xRYYRITYGETGGNSPVQEFTVP(X)yTATISGLKPGVDYTITVYAVT(X)zPISINYRTEIEK(SEQ ID NO:38)
[0254] E核心(SEQ ID NO:39)
[0255] EVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRT
[0256] IGF-IR BC环(SEQ ID NO:40)
[0257] SARLKVA
[0258] IGF-IR DE环(SEQ ID NO:41)
[0259] KNVY
[0260] IGF-IR FG环(SEQ ID NO:42)
[0261] RFRDYQ
[0262] VEGFR2BC环(SEQ ID NO:43)
[0263] RHPHFPT
[0264] VEGFR2DE环(SEQ ID NO:44)
[0265] LQPP
[0266] VEGFR2FG环(SEQ ID NO:45)
[0267] DGRNGRLLSI
[0268] EIDK(SEQ ID NO:46)
[0269] EIDKPCQ(SEQ ID NO:47)
[0270] I-Fn-V(2DK-)，带Cys尾(SEQ ID NO:48)
[0271] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
[0272] I-Fn-V(2DK-)，带ser尾(SEQ ID NO:49)
[0273] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
[0274] I-GS5-V(2DK-)，带ser或cys尾(SEQ ID NO:50)
[0275] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT ,其中
X=丝氨酸或半胱氨酸
X=丝氨酸或半胱氨酸
[0276] I-GS10-V(2DK-)，带ser或cys尾(SEQ ID NO:51)
[0277] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT ,其中X=丝氨酸或半胱氨酸
[0278] V-Fn-I(2DK-)，带ser尾(SEQ ID NO:52)
[0279] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT
[0280] V-Fn-I(2DK-)，带cys尾(SEQ ID NO:53)
[0281] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT
[0282] V-GS5-I(2DK-)，带ser或cys尾(SEQ ID NO:54)
[0283] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT ,其中
X=丝氨酸或半胱氨酸
X=丝氨酸或半胱氨酸
[0284] V-GS10-I(2DK-)，带ser或cys尾(SEQ ID NO:55)
[0285] MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT ,其中X=丝氨酸或半胱氨酸
[0286] VI(DK+)(SEQ ID NO:56)
[0287] GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
[0288] VI(DK-)(SEQ ID NO:57)
[0289] GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
实施例
实施例
[0290] 下面援引实施例对发明进行说明，这些实施例仅起说明作用，不意在限制本发明。虽然已经就发明的具体实施方案进行了详细说明，但本领域技术人员容易想到可以对本发明进行各种改变和调整而不背离发明的精神和范围。
[0291] 实施例1基于纤连蛋白的支架蛋白
[0292] 生成了多种基于纤连蛋白的支架蛋白，包括VEGFR2/IGF-IR结合物(“V/I结合物”)和EGFR/IGF-IR结合物(“E/I”结合物)。下表描述了本文中说明的构建体以及它们相应的SEQ ID NO。
[0293] 表1各种V/I和E/I结合蛋白的概述
[0294]
[0295] SEQ ID NO:22是首先在WO 2009/142773中记载的V/I(DK+)二价构建体的氨基酸序列。V/I(DK+)包含与IGF-IR和VEGFR2结合的纤连蛋白域。结合IGF-IR的纤连蛋白核心具有SEQ ID NO:2所示的序列，结合VEGFR2的纤连蛋白核心具有SEQ ID NO:3所示的序列。这两个域由衍生自人纤连蛋白中连接第一和第二Fn3域的氨基酸序列的多肽接头(SEQ ID NO:7)连接。V/I(DK+)的I结合亚单位含有C端延伸(C1)，该延伸具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，即含有DK位点。V/I(DK+)的V结合亚单位含有C端延伸(C2)，该延伸具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列，即含有DK位点。
[0296] SEQ ID NO:23是E/I(DK+)二价构建体的氨基酸序列。E/I(DK+)包含与IGF-IR和EGFR结合的纤连蛋白域。结合IGF-IR的纤连蛋白核心具有SEQ ID NO:2所示的序列，结合EGFR2的纤连蛋白核心具有SEQ ID NO:39所示的序列。这两个域由具有SEQ ID NO:9的甘氨酸-丝氨酸多肽接头连接。E/I(DK+)的I结合亚单位含有C端延伸(C1)，该延伸具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，即含有DK位点。E/I(DK+)的V结合亚单位含有C端延伸(C2)，该延伸具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列，即含有DK位点。
[0297] SEQ ID NO:24是E/I(DK-，无C端)二价构建体的氨基酸序列。E/I(DK-，无C端)包含IGF-IR核心(SEQ ID NO:2)和EGFR核心(SEQ ID NO:39)，二者由甘氨酸-丝氨酸接头(SEQ ID NO:9)连接。IGF-IR结合亚单位含有C端延伸(C1)，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，即含有EK位点而不是DK位点。EGRF结合亚单位含有C端延伸(C2)，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，即缺少DK位点。
[0298] SEQ ID NO:25是E/I(2DK-)二价构建体的氨基酸序列。E/I(2DK-)包含IGF-IR核心(SEQ ID NO:2)和EGFR核心(SEQ ID NO:39)，二者由甘氨酸-丝氨酸接头(SEQ ID NO:9)连接。IGF-IR结合亚单位含有C端延伸(C1)，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，即含有EK位点而不是DK位点。EGRF结合亚单位含有C端延伸(C2)，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，即含有EK位点而不是DK位点。
[0299] 实施例2：基于纤连蛋白的支架蛋白的表达和纯化
[0300] E/I分子的表达
[0301] 将E/I二价构建体以可溶形式在大肠杆菌细胞中表达。通过细胞破碎和离心收集包涵体。将E/I蛋白过滤并利用柱色谱加以捕捉。然后将经过纯化的蛋白通过单个半胱氨酸残基上的马来酰亚胺化学与PEG共价连接。然后利用柱色谱将PEG化的产物精细纯化，利用切向流过滤制剂(formulate)。
[0302] V/I分子的表达
[0303] 为了表达V/I二价构建体，将编码构建体的核苷酸序列克隆到可诱导表达载体中并在大肠杆菌细胞中表达成细胞内包涵体。利用从铺板的单菌落培养生成的细胞库小瓶接种摇瓶培养，后者作为大规模发酵罐的接种物。或者，取决于最终的发酵体积，用种子发酵罐来进行接种物培养。大规模发酵包括用于积累生物量的生长阶段(growth phase)，以及用于生成基于纤连蛋白的支架蛋白的生产阶段。对于初级回收(primary recovery)，利用微流化仪从收集的细胞中释放出胞内包涵体，通过离心回收，然后用缓冲液和水洗涤。
[0304] 二价构建体的纯化方法使用基于盐酸胍的包涵体重溶，然后重折叠蛋白质。将经过重折叠的蛋白质过滤并加载到阳离子交换色谱柱上。产物接下来利用疏水相互作用色谱柱纯化，所得的合并洗脱物中加入PEG试剂进行PEG化以产生PEG化的蛋白质。
[0305] 然后在第二个阳离子交换色谱柱上纯化。将洗脱液浓缩到目标蛋白浓度，然后利用超滤/渗滤(diafiltration)更换成所述配制剂缓冲液。将UF/DF产物利用最后的0.22μm滤器过滤。然后将经过过滤的产物装入小瓶产生最终的药物产品。
[0306] 实施例3：蛋白C浓度对V/I蛋白稳定性的影响
[0307] 考察了蛋白浓度对经纯化的V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)的物理稳定性(聚集)和化学稳定性(断裂)的影响。V/I(DK+)蛋白配制在10mM琥珀酸、5%山梨醇，pH5.5中。V/I蛋白浓度为3mg/mL或5mg/mL。将样品保存在4℃12个月时间，在1个月、6周、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月时收集并分析样品。
[0308] 聚集的量的测量是通过经时地评估形成了聚集物的总蛋白(作为“高分子量”(“HMW”)种类测量)的百分比来进行。利用大小排阻高效液相色谱(SE-HPLC)评估HMW水平随时间的变化来确定聚集。使用Superdex20010/300GL柱、流动相0.2M磷酸钾、0.15M氯化钠、0.02%叠氮化钠、pH6.8作为流动相进行SE-HPLC分析。流速为0.5mL/min，
280nm检测。图1描绘了蛋白浓度对V/I蛋白的聚集的经时(0-12个月)影响。在3mg/mL的浓度，V/I(DK+)以0.3%/月的速率聚集。更高的蛋白浓度(5mg/ml)导致更快的聚集速率。
280nm检测。图1描绘了蛋白浓度对V/I蛋白的聚集的经时(0-12个月)影响。在3mg/mL的浓度，V/I(DK+)以0.3%/月的速率聚集。更高的蛋白浓度(5mg/ml)导致更快的聚集速率。
[0309] 断裂的测量是通过经时地评估已断裂，或称被“剪切”的总蛋白的百分比来进行的。利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)确定被切断的蛋白质的水平。RP-HPLC使用Varian PLRP-S柱(4.6*250mm,300 孔径,5μm粒径)来进行。用由水/乙腈/三氟乙酸构成的梯度来实现不同种类的分离。流速为1.0mL/min。以280nm(针对蛋白质相关种类)以及蒸发光散射(ELS，针对PEG相关种类)进行双重检测。图2显示，发现V/I(DK+)的断裂与聚集相比对蛋白质浓度的依赖要低。V/I(DK+)的断裂速率是4℃下～0.1%/月。
[0310] 根据聚集和断裂数据，具有3mg/mL的蛋白质浓度的V/I(DK+)配制剂相比于5mg/mL浓度的配制剂可能是优选的，以最小化聚集并确保1年的足够稳定性。
[0311] 实施例4:pH对V/I蛋白稳定性的影响
[0312] 考察了pH对纯化的V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)的物理和化学稳定性的影响。V/I(DK+)蛋白配制在50mM氯化钠中，缓冲组分为20mM乙酸钠(对于pH4和5)或20mM磷酸钠(对于pH6和7)，并在25℃保存。
[0313] 每周一次收集样品经过4周时间，并如实施例3所述利用SE-HPLC分析进行对聚集的评估。图3描述了pH对V/I(DK+)蛋白的经时(0-4周)聚集的影响。在具有测试的最低pH(pH4.0)的样品中观察到最低的聚集。在具有测试的最高pH(pH7.0)的样品中观察到最高的聚集。
[0314] 每周一次收集样品经过4周时间，并如实施例3所述利用SE-HPLC分析进行对断裂的评估。图4描述了pH对V/I(DK+)蛋白的断裂的经时(0-4周)影响。虽然发现低pH(pH4.0)可防止V/I(DK+)蛋白经时的聚集(图3)，但发现低pH导致V/I(DK+)蛋白的蛋白断裂的增加(图4)。
[0315] 为了鉴定出断裂的V/I(DK+)蛋白中的剪切位点，进行了液相色谱-质谱(LC-MS)。V/I(DK+)蛋白配制在10mM乙酸钠、150mM氯化钠，pH5.5中，蛋白浓度为5mg/mL。根据实施例3中描述的RP-HPLC方法而后偶联至Thermo LTQ离子阱质谱仪(MS)来进行LC-MS。将HPLC洗脱物按1:5分流，将0.2mL/min的液流导入MS中。保持280nm的在线检测。图5描绘了来自这项实验的LC-MS数据，并显示：断裂涉及数个天冬氨酸(D)残基，其中D95和D200是断裂主要发生的位点。需要指出的是虽然整个V/I(DK+)蛋白中有数个D残基(例如D5、D9、D110)，但只有D95和D200残基的后面紧随着赖氨酸残基。″VI des Met″表示作为热应激的结果在PEG缀合物的马来酰亚胺键处发生的切割事件。
[0316] 基于这些实验，通过将所述配制剂的pH确定在5.5，聚集和断裂得到最好的平衡，但是，任何一种降解途径(聚集与断裂)都无法仅依赖该pH水平而消除。
[0317] 实施例5：对E/I蛋白的聚集和断裂的评估
[0318] 为了确认V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)中所观察到的聚集和断裂不稳定问题是其他结构上相关的二价构建体所共有的问题，还评估了E/I(DK+)(SEQ ID NO:23)在几个pH水平上的聚集和断裂性质。
[0319] E/I(DK+)配制在10mM琥珀酸、5%山梨醇中，pH为4.0、4.5或5.5。通过使用30kD MWCO膜进行切向流过滤(TFF)将E/I(DK+)配制成期望的配制剂。交换了至少6个透析体积(dia-volume)的缓冲液以达到最终的配制剂。通过A280验证所得的蛋白的浓度，并利用额外的配制缓冲液将蛋白浓度调整到5mg/mL。将配制好的E/I(DK+)在层流罩中无菌过滤，并装入经灭菌的玻璃小瓶用于稳定性监测。将小瓶加盖卷边，然后置于4℃、25℃和37℃的温控培养箱中。
[0320] 通过进行SE-HPLC分析评估了E/I(DK+)的聚集速率。SE-HPLC使用Shodex KW404-4F HPLC柱(4.6*250mm,300 孔径，5μm粒径)进行，流动相组成为10mM琥珀酸/3%山梨醇/0.4M精氨酸，pH5.5。流速为0.35mL/min，检测在280nm进行。图6显示，与V/I(DK+)相似，在较高pH水平25℃保存的样品的E/I(DK+)的聚集速率高于在较低pH水平25℃保存的样品。对于在37℃接受应激的样品也观察到了相同的数据趋势。
[0321] 还评估了蛋白质浓度对E/I(DK+)的聚集速率的影响。与V/I(DK+)相似，表2显示：较高的E/I(DK+)浓度(7mg/ml)与4周后较高的聚集物形成百分比(较低的单体百分比)相关。表2还显示：通过与蛋白浓度一同降低pH，可以进一步减少聚集的百分比。
[0322] 表2
[0323]
[0324] 通过如实施例3所述实施RP-HPLC分析来评估E/I(DK+)的断裂。图7显示，与V/I(DK+)类似，在较低pH水平25℃保存的样品的E/I(DK+)断裂速率最高，然后是在较高pH水平25℃保存的样品。对于在37℃接受应激的样品也观察到了相同的数据趋势。
[0325] 为了鉴定断裂的E/I(DK+)蛋白中的剪切位点，如实施例4所述进行了LC-MS。E/I(DK+)在10mM琥珀酸，5%山梨醇，pH4.0中配制，蛋白浓度为5mg/mL，保持在25℃以诱导蛋白应激。图8描绘了来自该实验的LC-MS数据，并显示数个天冬氨酸(D)残基参与了断裂，包括D95和D218(V/I(DK+)中的D200的同源位置)。还在D199观察到了断裂。D199位点对这些E/I分子而言是特有的，在V/I分子中未发现，这是因为它位于EGFR结合区域的FG结合环中。
[0326] 实施例6：DK-E/I变体中的聚集和断裂的评估
[0327] 配制了多种E/I结合物(SEQ ID NO:23-25)并在它们相互之间比较在相同条件下(见表1)的物理稳定性(聚集)和化学稳定性(断裂)。基于对在E/I(DK+)中观察到的D95与D218剪切位点的表征(实施例5)，并基于这些DK剪切位点位于在结构上非必不可少的C端尾中的事实，制作了C端尾DK位点缺失或被替代的两种不同的E/I构建体。
[0328] E/I(DK+)分子(SEQ ID NO:23)是对照E/I结合物，其含有这样的C端尾，该C端尾在两个结合域中的每一个之后包含DK位点(D95和D218)。在实施例5中表征了该分子的物理和化学稳定性。E/I(DK-,无C端)分子(SEQ ID NO:24)不含任何DK位点。在这种分子中，第95位的天冬氨酸被突变为谷氨酸，并且EIDKPCQ尾(SEQ ID NO:47)被取代为EGSGC尾(SEQ ID NO:5)。E/I(2DK-)分子(SEQ ID NO:25)也不含有任何DK位点。在这种分子中，第95和218位的天冬氨酸已经被取代为谷氨酸。该研究中包括了V/I(DK+)作为对照。
[0329] 将E/I蛋白(SEQ ID NO:23-25)配制在10mM琥珀酸，5%山梨醇，pH4.0中。此外，将E/I(DK+)(SEQ ID NO:23)和V/I(DK+)(SEQ ID NO:22)配制在10mM琥珀酸、5%山梨醇，pH5.5中。基于预先进行的表面活性剂筛选，发现表面活性剂不是必要的。通过使用30kD MWCO膜进行切向流过滤(TFF)将E/I(DK+)配制成期望的配制剂。交换了至少6个透析体积(dia-volume)的缓冲液以达到最终的配制剂。通过A280验证所得的蛋白的浓度，并利用额外的配制缓冲液将蛋白浓度调整到5mg/mL。将每种配制好的二价构建体在层流罩中无菌过滤，并装入经灭菌的玻璃小瓶用于稳定性监测。将小瓶加盖卷边，然后置于4℃、25℃和37℃的温控培养箱中。
[0330] 通过如权利要求5所述进行SE-HPLC来测定不同E/I分子的聚集速率，该实验的结果示于图9。如预期的那样，对于E/I(DK+)而言，25℃的聚集速率在pH5.5比在pH4.0显著更高。基于图9中所见的斜率，E/I(DK+)在25℃的聚集速率在pH5.5大约比在pH4.0高7倍。对于两种缺少DK位点的E/I分子，聚集速率在pH4.0不受影响。E/I(DK+)与V/I(DK+)在pH5.5展示类似的聚集速率。
[0331] 通过根据实施例3进行RP-HPLC来测定不同E/I分子的断裂速率，且该实验的结果示于图10。就剪切而言，图10显示E/I(DK+)在25℃的剪切速率在pH5.5低于pH4.0。在图10中展示的分子中，E/I(DK+)在pH4.0展现最高的剪切速率，而当配制剂的pH上升到pH5.5时该速率显著变小。然而，如上所述，对于这种分子，pH5.5的聚集速率是最高的。
对于另外两种缺少DK位点的E/I分子，pH4.0的剪切速率与相同pH的E/I(DK+)相比降低了大约3倍。V/I(DK+)在相同的pH(pH5.5)展现比E/I(DK+)更高程度的断裂，这表明，虽然V/I(DK+)和E/I(DK+)分子是相似的，但V/I(DK+)更容易发生断裂。
对于另外两种缺少DK位点的E/I分子，pH4.0的剪切速率与相同pH的E/I(DK+)相比降低了大约3倍。V/I(DK+)在相同的pH(pH5.5)展现比E/I(DK+)更高程度的断裂，这表明，虽然V/I(DK+)和E/I(DK+)分子是相似的，但V/I(DK+)更容易发生断裂。
[0332] 通过如实施例4中所述使用LC-MS进行了E/I(DK-,无C端)剪切位点的表征，与E/I(DK+)的剪切位点比较。将两种不同的E/I结合物分别配制在10mM琥珀酸、5%山梨醇，pH4.0中，蛋白浓度为5mg/mL，并维持在25℃以诱导蛋白应激。图11展示了该实验的LC-MS数据，表明这两种不同的E/I结合物之间的断裂谱不同。E/I(DK+)中的断裂所涉及的主要的天冬氨酸(D)残基为D95、D218和D199。与之相对照的是，E/I(DK-,无C端)中的断裂所涉及的主要的天冬氨酸残基是D199、D82和D193。但是，如下面的表3所示，在4周后，E/I(DK-,无C端)中的剪切总数的百分比与经过该相同时间的E/I(DK+)相比几乎减半(3.8%对7.5%)。这些结果表明E/I(DK-,无C端)的断裂与E/I(DK+)相比有所减少。
[0333] 如实施例4所述使用LC-MS进行了E/I(2DK-)中剪切位点的表征。将E/I(2DK-)配制在10mM琥珀酸、5%山梨醇，pH4.0中，蛋白浓度为5mg/mL，并维持在25℃以诱导蛋白应激。图12描绘了来自该实验的LC-MS数据，表明与E/I(DK-,无C端)相似，E/I(2DK-)中的断裂所涉及的主要天冬氨酸残基为D199,D82和D193。此外，如下面的表3所示，4周之后E/I(2DK-)中剪切总数的百分比与经过相同时间段的E/I(DK+)相比减少过半(3.5%对7.5%)。这些结果表明E/I(2DK-)的断裂相比E/I(DK+)有所减少。
[0334] 表3.多种E/I结合物在25℃保存4周后断裂的量和位置
[0335]
[0336] 如上文讨论的，D199位点位于EGFR结合区域的FG结合环之内。这样，D199很可能对于结合功能而言是必需的，将难以从E/I(2DK-)或E/I(DK-,无C端)中除去。
[0337] 在V/I(DK+)和E/I(DK+)中观察到的天冬氨酸位点处的剪切的确切机理尚不清楚。基于通过NMR方法测得的胰高血糖素中三个天冬氨酸的表观pKa值，Joshi等人(Journal of Pharmaceutical Sciences,94(9),2005)提出了几种天冬氨酸位点处的切割反应的机理。不愿拘于理论，有可能这些提议的机理中的某一些涉及天冬氨酸侧链环化而形成五元环，然后发生对肽酰基的亲核攻击，继而导致肽键被切割。通过将天冬氨酸取代为谷氨酸，有可能由于位阻而使得成环不那么容易发生，从而防止了该位置上的肽键切割。
[0338] 实施例7:DK-V/I变体中聚集和断裂的评估
[0339] 已经比较了两种VEGFR-IGFR(VI)基于纤连蛋白的支架蛋白的稳定性。第一种构建体是VI(DK+)(SEQ ID NO:56)，且第二种构建体VI(DK-)(SEQ ID NO:57)包含SEQ ID NO:56的第94位和199位上的天冬氨酸到谷氨酸的取代。
[0340] 将这两种分子都以3mg/mL蛋白浓度配制在10mM琥珀酸、5%山梨醇，pH4.0、4.5和5.5中。在4℃和25℃进行这些配制剂的有限稳定性达最多两个月时间，其中抽出定期的时间点用以进行SE-HPLC和RP-HPLC分析。此外，对2个月的25℃样品进行LC-MS表征以确定两种蛋白中确切的剪切位点。
[0341] pH对VI基于纤连蛋白的支架蛋白中的聚集速率的影响
[0342] 基于过去的基于纤连蛋白的支架蛋白的经验，已认识到低pH的配制剂可为这些分子提供最好的生物物理稳定性(即较低的聚集)。在本项研究中，两种VI构建体展现出与先前所见的相同的趋势，如图13所示。虽然两种分子之间聚集物的起始水平稍有不同，但对于每个给定的pH，在整个稳定期中观察到的速率是非常相似的，两种分子的聚集速率均显示相同的顺序：pH5.5>>pH4.5>pH4.0。
[0343] pH对VI基于纤连蛋白的支架蛋白中剪切速率的影响
[0344] 基于过去的基于纤连蛋白的支架蛋白的经验，已认识到低pH的配制剂为这些蛋白提供最小的化学稳定性，如果蛋白序列中存在易于被剪切的位点的话。在过去的针对VI(DK+)(SEQ ID NO:56)进行的稳定性研究中，已经鉴定了多个剪切位点，其中D94和D199处的剪切最为严重。在本项研究中，两个VI构建体均展现出与先前所见的相同的趋势，如图14所示，其中就pH对剪切速率的影响而言，VI(DK+)比VI(DK-)更严重。虽然对两种分子而言剪切速率都呈现pH4.0>pH4.5>pH5.5的一般趋势，但VI(DK-)展现其剪切速率的差异在全部三个pH值都要小得多。
[0345] 从图13和14中所示的稳定性数据趋势可见，当所述配制剂的pH从5.5下降到4.0时，VI(DK+)的每周剪切速率增加3.3倍，而对于VI(DK-)分子，该速率增加1.6倍，原因在于两个位置上的主要剪切位点的消除。因此，通过这些氨基酸取代，当使用pH4配制剂时，VI基于纤连蛋白的支架蛋白中的剪切速率在相同的稳定性时间段内降低了大约50%。另一方面，当配制剂的pH从5.5降低到4.0时，VI(DK+)与VI(DK-)的每周聚集速率分别降低了86倍和216倍。因此，pH对VI基于纤连蛋白的支架蛋白中聚集速率的影响比对剪切速率的影响更为剧烈。
[0346] 通过LC-MS鉴定剪切位点
[0347] 通过LC-MS对VI(DK+)和VI(DK-)中观察到的剪切位点进行了结构表征。来自25℃/2-月时间点的剪切区域的重叠RP-HPLC色谱图可见于图15，峰鉴定汇总于表4。
[0348] 表4.借助质谱的峰鉴定的汇总。以红色高亮表示的残基表示原始VI序列中存在的天冬氨酸，它们在VI(DK-)构建体中已被取代为谷氨酸。
[0349]
[0350] 虽然某些剪切在两种分子之间保持相同，但位于D94和D199的主要剪切位点在VI(DK-)中已经被消除，使得在25℃应激2个月后的总剪切水平变为6.9%。另一方面，在VI(DK+)中的总剪切在相同的稳定期内保持高达16.0%。还在VI(DK-)中鉴定了其他低水平的剪切，它们在VI(DK+)中未发现。
[0351] 表5.VI(DK+)和VI(DK-)中剪切速率的比较
[0352]
[0353] VI(DK+)在pH4.0的剪切速率比VI(DK+)在pH4.5和5.5的剪切速率分别快1.6倍和3.3倍。VI(DK-)在pH4.0的剪切速率比VI(DK-)在pH4.5和5.5的剪切速率分别快1.5倍和1.6倍。
[0354] 表6.VI(DK+)和VI(DK-)中聚集速率的比较.
[0355]
[0356] VI(DK+)在pH4.5和5.0的聚集速率比VI(DK+)在pH4.0的聚集速率分别快4.4倍和86倍。VI(DK-)在pH4.5和5.5的聚集速率比VI(DK-)在pH4.0的聚集速率分别快4.0倍和216倍。
[0357] 对于这两种形式的VI基于纤连蛋白的支架蛋白获得的稳定性结果显示了为消除基于纤连蛋白的支架蛋白中的特定化学降解的目的而将成问题的天冬氨酸选择性地取代为谷氨酸的有效性和益处。由于通过该手段消除了主要的化学降解，现在可通过在较低的pH配制来实现基于纤连蛋白的支架蛋白的更好的生物物理学稳定性。目前用VI研究所得的结果，以及先前用EI-双功能基于纤连蛋白的支架蛋白获得的那些结果，显示了消除已知易受剪切的特定天冬氨酸残基的必要性，从而能够利用处于酸性pH的配制剂，以使基于纤连蛋白的支架蛋白的生物物理学稳定性最大化。
[0358] 材料和方法
[0359] 配制：每种分子通过使用30kD MWCO膜进行切向流过滤(TFF)配制成期望的配制剂。交换了至少6个透析体积(dia-volume)的缓冲液以达到最终的配制剂。通过A280验证所得的蛋白的浓度，并利用额外的配制缓冲液将蛋白浓度调整到3mg/mL。
[0360] 填充小瓶和稳定性：将每种配制好的蛋白质在层流罩中无菌过滤，并装到玻璃小瓶中用于稳定性监测。将小瓶加盖卷边，然后置于4℃和25℃的温控培养箱中。
[0361] 分析方法：
[0362] 大小排阻HPLC(SE-HPLC)：使用Shodex KW404-4F HPLC柱(4.6*250mm,300 孔径，5μm粒径)进行，流动相组成为10mM琥珀酸/3%山梨醇/0.4M精氨酸，pH5.5。流速为0.35mL/min，检测在280nm进行。
[0363] 反相HPLC(RP-HPLC)：使用Varian PLRP-S柱(4.6*250mm,300 孔径,5μm粒径)来进行分析。用由水/乙腈/三氟乙酸构成的梯度来实现不同种类的分离。流速为1.0mL/min。以280nm(针对蛋白质相关种类)以及蒸发光散射(ELS，针对PEG相关种类)进行双重检测。
[0364] LC-MS：使用 偶联 到Thermo LTQ离子 阱质 谱仪(MS)的 Jupiter C18 柱(4.6*250mm,300 孔径，5μm粒径)来进行剪切位点的表征。将HPLC洗脱物按1:5分流，将0.2mL/min的液流导入MS中。保持280nm的在线检测。
[0365] 通过提述并入
[0366] 通过提述来个别地并入本文中记载的所有文档和参考文献，包括专利文件和网站，其程度如同本文件完整或部分地记录了它们一样。
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