大豆猝死综合症病菌实时荧光PCR检测方法和试剂盒
阅读：445发布：2023-01-31
专利汇可以提供大豆猝死综合症病菌实时荧光PCR检测方法和试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 建立了检测大豆猝死综合症病菌实时 荧光 PCR方法和 试剂 盒 ，优化反应条件，经特异性、灵敏度试验，表明该方法特异性强，灵敏度高，适于北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌的快速诊断和口岸检疫。，下面是大豆猝死综合症病菌实时荧光PCR检测方法和试剂盒专利的具体信息内容。
1.大豆猝死综合症(Sudden death syndrome，SDS)病菌的实时荧光PCR检测方法，所述大豆猝死综合症病菌为北美大豆猝死综合症病菌或南美大豆猝死综合症病菌，所述方法包括利用特异性引物对及其对应的探针，以真菌DNA为模板进行实时荧光PCR反应，其特征在于：
所述引物对为能够扩增出大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA片段的引物对；
所述对应的探针为与大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA位于该引物对之间的序列相同或互补，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；
所述引物对包括下述引物对1和引物对2中的至少一组，
引物对1为特异性检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FV-F为Seq ID No.1所示序列，下游引物FV-R为Seq ID No.2所示序列，
Seq ID No.1：5’—GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG—3’
Seq ID No.2：5’—ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA—3’
引物对2为特异性检测南美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FT-F为Seq ID No.3所示序列，下游引物FT-R为Seq ID No.4所示序列，
Seq ID No.3：5’—CCAGTGGTGCGGAAGGTA—3’
Seq ID No.4：5’—GACGGCGATTCCAACAGTAG—3’
所述引物对1对应的探针FV-P为Seq ID No.5所示的序列,
Seq ID No.5：5’—TCCCACTAAATCTGGT—3’
所述引物对2对应的探针FT-P为Seq ID No.6所示的序列,
Seq ID No.6：5’—ACCCTAGAGCTCGTCTT—3’。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
所述荧光报告基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、NED、TET、ROX或CY5；
所述荧光淬灭基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。
3.大豆猝死综合症(Sudden death syndrome，SDS)病菌的检测试剂盒，所述大豆猝死综合症病菌为北美大豆猝死综合症病菌或南美大豆猝死综合症病菌，其特征在于：所述试剂盒含有能扩增出大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA片段的引物对；
所述检测试剂盒用于实时荧光PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；
所述引物对包括下述引物对1和引物对2中的至少一组，
引物对1为特异性检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FV-F为Seq ID No.1所示序列，下游引物FV-R为Seq ID No.2所示序列，
Seq ID No.1：5’—GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG—3’
Seq ID No.2：5’—ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA—3’
引物对2为特异性检测南美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FT-F为Seq ID No.3所示序列，下游引物FT-R为Seq ID No.4所示序列，
Seq ID No.3：5’—CCAGTGGTGCGGAAGGTA—3’
Seq ID No.4：5’—GACGGCGATTCCAACAGTAG—3’
所述引物对1对应的探针FV-P为Seq ID No.5所示的序列,
Seq ID No.5：5’—TCCCACTAAATCTGGT—3’
所述引物对2对应的探针FT-P为Seq ID No.6所示的序列,
Seq ID No.6：5’—ACCCTAGAGCTCGTCTT—3’。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：
所述荧光报告基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、NED、TET、ROX或CY5；
所述荧光淬灭基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。
大豆猝死综合症病菌实时荧光PCR检测方法和试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 大豆(Glycine max)是我国重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要来源，在我国国民经济中占有重要地位。目前我国大豆产量居世界第四位，但仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增，各种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。其中本发明涉及的两种大豆真菌病害目前严重影响大豆生产及贸易，具有经济重要性和检疫重要性。
[0003] 大豆猝死综合症(Sudden death syndrome，简称SDS)是由镰刀菌引起的土传病害。1971年Walters在美国阿肯色州首次发现该病害，直到1982年才由Hirrel命名为Fusarium solani，1997年确定为Fusarium solani f.sp.glycme，2002年F.solani被确定为复合种，2003年Takayuki和O’Donnell等学者根据SDS病菌的形态特征和IGS区域内的分子系统发育特征，将SDS病菌分成了两个种：北美SDS(Fusarium virguliforme)和南美SDS(Fusarium tucumaniae)。SDS的危害性极大，在适宜发病的环境条件下，幼苗发育不正常，甚至叶片组织和整个植株迅速死亡，危害较轻的植株虽能结荚，但豆粒小，没有生命力，种子坚硬，严重影响大豆的产量和质量。在美国SDS发病重的田块大豆产量损失高达80％，一般田块损失5％～15％。美国南部1988～1994年每年因此病损失大豆28万吨，
1994年阿根廷损失达13.4万吨。除了大豆外，绿豆、青豆、菜豆、豇豆也可被侵染。SDS主要分布在美国、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、玻利维亚、乌拉圭和日本，中国尚未有发现此病的报道。
1994年阿根廷损失达13.4万吨。除了大豆外，绿豆、青豆、菜豆、豇豆也可被侵染。SDS主要分布在美国、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、玻利维亚、乌拉圭和日本，中国尚未有发现此病的报道。
[0004] 实时荧光PCR技术在病原菌的检测中的应用，使快速准确的检测病原菌成为可能。目前对于北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌检测的主要是形态学分类鉴定方法。而利用实时荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高和检测时间短的优点。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种特异性强、灵敏度高和检测时间短的大豆猝死综合症(Sudden death syndrome，SDS)病菌检测方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种大豆猝死综合症(Sudden deathsyndrome，SDS)病菌的检测试剂盒。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008] 本发明公开了一种大豆猝死综合症(Sudden death syndrome，SDS)病菌的实时荧光PCR检测方法，所述大豆猝死综合症病菌包括北美大豆猝死综合症病菌或南美大豆猝死综合症病菌，所述方法包括利用特异性引物对及其对应的探针，以真菌DNA为模板进行实时荧光PCR反应，
[0009] 所述引物对为能够特异性扩增出大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA片段的引物对，且引物长度为28士10nt；
[0010] 所述对应的探针为与大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA位于该引物对之间的序列相同或互补、且长度为28士10nt的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
[0011] 在本发明优选的实施方式中，所述引物对包括下述引物对1和引物对2中的至少一组，
[0012] 引物对1为特异性检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FV-F含有Seq ID No.1所示序列，下游引物FV-R含有Seq ID No.2所示序列，
[0013] Seq ID No.1：5’-GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG-3’
[0014] Seq ID No.2：5’-ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA-3’
[0015] 引物对2为特异性检测南美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FT-F含有Seq ID No.3所示序列，下游引物FT-R含有Seq ID No.4所示序列，
[0016] Seq ID No.3：5’-CCAGTGGTGCGGAAGGTA-3’
[0017] Seq ID No.4：5’-GACGGCGATTCCAACAGTAG-3’。
[0018] 所述引物对1对应的探针FV-P含有Seq ID No.5所示的序列，
[0019] Seq ID No.5：5’-TCCCACTAAATCTGGT-3’
[0020] 所述引物对2对应的探针FT-P含有Seq ID No.6所示的序列，
[0021] Seq ID No.6：5’-ACCCTAGAGCTCGTCTT-3’。
[0022] 所述荧光报告基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、NED、TET、ROX或CY5；
[0023] 所述荧光淬灭基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。其中，MAR、JUP、URA、NEP、PLU由于具有相互淬灭的特性，因此可以同时标记在探针的5’端和3’端，既作为荧光报告基团也作为荧光淬灭基团。
[0025] 本发明还公开了一种大豆猝死综合症(Sudden death syndrome，SDS)病菌的检测试剂盒，所述大豆猝死综合症病菌包括北美大豆猝死综合症病菌或南美大豆猝死综合症病菌，所述试剂盒含有能特异性扩增出大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA片段的引物对；且引物长度为28士10nt。
[0026] 优选的，所述检测试剂盒用于实时荧光PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区的DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为28士10nt的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
[0027] 在本发明具体的实施方式中，所述引物对包括下述引物对1和引物对2中的至少一组，
[0028] 引物对1为特异性检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FV-F含有Seq ID No.1所示序列，下游引物FV-R含有Seq ID No.2所示序列，
[0029] Seq ID No.1：5’-GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG-3’
[0030] Seq ID No.2：5’-ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA-3’
[0031] 引物对2为特异性检测南美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FT-F含有Seq ID No.3所示序列，下游引物FT-R含有Seq ID No.4所示序列，
[0032] Seq ID No.3：5’-CCAGTGGTGCGGAAGGTA-3’
[0033] Seq ID No.4：5’-GACGGCGATTCCAACAGTAG-3’。
[0034] 所述引物对1对应的探针FV-P含有Seq ID No.5所示的序列，
[0035] Seq ID No.5：5’-TCCCACTAAATCTGGT-3’
[0036] 所述引物对2对应的探针FT-P含有Seq ID No.6所示的序列，
[0037] Seq ID No.6：5’-ACCCTAGAGCTCGTCTT-3’。
[0038] 由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
[0039] 本发明的检测方法和检测试剂盒可以用于大豆猝死综合症病菌特别是北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌的定性、定量PCR检测及分析，可以成功的将北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌与近似种区别开。本发明的检测试剂盒及检测方法具有特异性强、灵敏度高和检测时间短的特点，特别适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。附图说明
[0040] 图1为特异性检测实验结果图；
[0041] 图2为灵敏度检测实验结果图。
具体实施方式
[0042] 本发明公开了大豆猝死综合症病菌中的北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌实时荧光PCR检测方法。
[0043] 该方法的建立，首先是利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，获得北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌及其近似种的基因组DNA序列，再经过大量分析比对后最终选择核糖体IGS区作为备选基因。所述的北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌IGS序列，指的是北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌核糖体intergenicspacer region DNA序列，其在北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和高拷贝数的特点。它们在Genbank中的序列号分别为AY220212(北美)和AY220196，AY220201(南美2个)。
[0044] 本发明针对北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌IGS序列，分别设计了特异性实时荧光PCR引物以及对应的探针。其中所述的特异性实时荧光PCR引物，指的是长度为28士10nt的寡核苷酸链，其与北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌的核糖体IGS区序列完全相同或者互补。所述的特异性实时荧光PCR探针，指的是长度为28士10nt的寡核苷酸链，其与北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌的IGS区序列完全相同或者互补。5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭荧光基团。
[0045] 具体的，本发明公开了优选的引物对及其对应的探针分别如下：
[0046] 引物对1为特异性检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FV-F含有Seq ID No.1所示序列，下游引物FV-R含有Seq ID No.2所示序列，
[0047] Seq ID No.1：5’-GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG-3’
[0048] Seq ID No.2：5’-ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA-3’
[0049] 引物对2为特异性检测南美大豆猝死综合症病菌的引物对，其上游引物FT-F含有Seq ID No.3所示序列，下游引物FT-R含有Seq ID No.4所示序列，
[0050] Seq ID No.3：5’-CCAGTGGTGCGGAAGGTA-3’
[0051] Seq ID No.4：5’-GACGGCGATTCCAACAGTAG-3’。
[0052] 所述引物对1对应的探针FV-P含有Seq ID No.5所示的序列，
[0053] Seq ID No.5：5’-TCCCACTAAATCTGGT-3’
[0054] 所述引物对2对应的探针FT-P含有Seq ID No.6所示的序列，
[0055] Seq ID No.6：5’-ACCCTAGAGCTCGTCTT-3’。
[0056] 其中，探针5’端标记的报告荧光基团可以是：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、NED、TET、ROX或CY5；
[0057] 3’端标记的淬灭荧光基团可以是：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。其中，MAR、JUP、URA、NEP、PLU由于具有相互淬灭的特性，因此可以同时标记在探针的5’端和3’端，既作为荧光报告基团也作为荧光淬灭基团。
[0058] 下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。
[0059] 实施例1
[0060] 一、实验试剂
[0061] Universal Real-time PCR Master Mix购自ABI公司，DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit购自QIAGEN公司。
[0062] 引物及探针由上海超世生物科技有限公司合成。
[0063] 二、实验仪器
[0064] ABI 7700实时荧光PCR仪。
[0065] 三、实验方法和过程
[0066] (1)引物及探针的设计
[0067] 分别先对北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌及其近似种和相关种的基因组序列信息进行比对、分析找出各检测靶标序列独有的、稳定的特异性碱基位点，设计出备选引物和探针见表1；
[0068] 表1供试引物及探针
[0069]编号 序列(5’→3’) Seq ID NO.
FV-F 5′-GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG-3′ 1
FV-R 5′-ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA-3′ 2
FV-P 5′-MAR-TCCCACTAAATCTGGT-MAR-3′ 5
FT-F 5′-CCAGTGGTGCGGAAGGTA-3′ 3
FT-R 5′-GACGGCGATTCCAACAGTAG-3′ 4
FT-P 5′-JUP-ACCCTAGAGCTCGTCTT-JUP-3′ 6
FV-F 5′-GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG-3′ 1
FV-R 5′-ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA-3′ 2
FV-P 5′-MAR-TCCCACTAAATCTGGT-MAR-3′ 5
FT-F 5′-CCAGTGGTGCGGAAGGTA-3′ 3
FT-R 5′-GACGGCGATTCCAACAGTAG-3′ 4
FT-P 5′-JUP-ACCCTAGAGCTCGTCTT-JUP-3′ 6
[0070] 其中FV-F、FV-R、FV-P分别为针对北美大豆猝死综合症病菌核糖体IGS区的上游引物、下游引物及对应的探针；
[0071] FT-F、FT-R、FT-P分别为针对南美大豆猝死综合症病菌核糖体IGS区的上游引物、下游引物及对应的探针。
[0072] (2)基因组DNA的获得
[0073] 提取北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌及其近似种和相关种的DNA。本实施例测试共计85个分离株，其中包括不同途径分离得到的北美大豆猝死综合症病菌(F.virguliforme)8株，和不同途径分离得到的南美大豆猝死综合症病菌(F.tucumaniae)3株。85个分离株的具体情况列于下表2。
[0074] 基因组DNA的提取方法如下：从PDA培养基上刮起少许培养物，置于已灭菌的研钵中，液氮冷却培养物，用研磨杵将培养物研磨成粉状物，立即转移至1.5ml的离心管中。采用QIAGEN公司的植物DNA提取试剂盒提取，加入65℃预热的提取400μL Buffer AP1，
4μL RNaseA(100mg/mL)，充分混匀，置于水浴锅65℃温浴15min，每隔5min振荡一次，加入130μL AP2，混匀后，冰浴5分钟，13000rpm离心1min；吸取上清，转移至Shredder柱中，13000rpm离心1min；吸取上清至新的2mL离心管中，加入1.5倍体积的AP3，混匀，转移至Spin柱中，13000rpm离心1min；弃废液，加入500μL漂洗液AW，13000rpm离心1min；弃废液，加入500μL漂洗液AW，13000rpm离心1min；加入预热的50μL洗脱液AE，65℃温浴
2min，13000rpm离心1min，-20℃保存备用。
4μL RNaseA(100mg/mL)，充分混匀，置于水浴锅65℃温浴15min，每隔5min振荡一次，加入130μL AP2，混匀后，冰浴5分钟，13000rpm离心1min；吸取上清，转移至Shredder柱中，13000rpm离心1min；吸取上清至新的2mL离心管中，加入1.5倍体积的AP3，混匀，转移至Spin柱中，13000rpm离心1min；弃废液，加入500μL漂洗液AW，13000rpm离心1min；弃废液，加入500μL漂洗液AW，13000rpm离心1min；加入预热的50μL洗脱液AE，65℃温浴
2min，13000rpm离心1min，-20℃保存备用。
[0075] 上述提取得到的各菌株基因组DNA分别作为后文特异性检测的模板。
[0076] 表2特异性测试的供试菌株
[0077]菌种 中文名 分离编号
F.virguliforme 北美大豆猝死综合症病菌 arg1.1
北美大豆猝死综合症病菌 arg1.7
北美大豆猝死综合症病菌 171
北美大豆猝死综合症病菌 mont
北美大豆猝死综合症病菌 1-1-2
北美大豆猝死综合症病菌 2-1
北美大豆猝死综合症病菌 22825
北美大豆猝死综合症病菌 22490
F.tucumaniae 南美大豆猝死综合症病菌 31100
南美大豆猝死综合症病菌 31778
南美大豆猝死综合症病菌 31781
F.brasiliense 巴西大豆猝死综合症病菌 31762
巴西大豆猝死综合症病菌 22743
F.cuneirostrum 楔钩型大豆猝死综合症病菌 31104
F.phaseoli 尖孢镰刀菌菜豆专化型 22411
F acuminatum 锐顶镰孢菌 06021
F.annulatum 06023
F.avenaceum 06025
F.acenaceum var.herbarum 06027
F.chlamydosporum 厚垣镰孢 06029
F.culmorum 黄色镰刀菌 06030
F.virguliforme 北美大豆猝死综合症病菌 arg1.1
北美大豆猝死综合症病菌 arg1.7
北美大豆猝死综合症病菌 171
北美大豆猝死综合症病菌 mont
北美大豆猝死综合症病菌 1-1-2
北美大豆猝死综合症病菌 2-1
北美大豆猝死综合症病菌 22825
北美大豆猝死综合症病菌 22490
F.tucumaniae 南美大豆猝死综合症病菌 31100
南美大豆猝死综合症病菌 31778
南美大豆猝死综合症病菌 31781
F.brasiliense 巴西大豆猝死综合症病菌 31762
巴西大豆猝死综合症病菌 22743
F.cuneirostrum 楔钩型大豆猝死综合症病菌 31104
F.phaseoli 尖孢镰刀菌菜豆专化型 22411
F acuminatum 锐顶镰孢菌 06021
F.annulatum 06023
F.avenaceum 06025
F.acenaceum var.herbarum 06027
F.chlamydosporum 厚垣镰孢 06029
F.culmorum 黄色镰刀菌 06030
[0078]F.dimerum 单隔镰刀菌 06032
F.dlaminii 06033
F.equiseti 木贼镰刀菌 06034
F.fujikuroi 06038
F graminearnm 禾谷镰刀菌 06039
F lactis 乳酸镰刀菌 06041
F lateritium 06043
F moniliforme var.intermedium 串珠镰孢 06044
F napiforme 06047
F neoceras 06048
F nygamai 06051
F oxysporum 尖孢镰刀菌 06053
F poae 早熟禾镰刀菌 06054
F proliferatum 06055
F proliferatum var.minus 06056
F redolens 芳香镰孢 06057
F reticulatum 莲腐败病菌 06058
F sambucinum 接骨木镰孢 06060
F semitectum 半裸镰刀病菌 06062
F solani 06063
F tricinctum 三线镰孢 06068
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10901
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10902
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10903
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10904
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10905
F subglutinans 亚粘团镰孢霉 SZCIQPQL10906
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10907
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10908
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10909
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10910
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10911
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10912
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10913
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10914
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10915
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10916
F solani SZCIQPQL10917
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10918
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10919
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10920
Phytophthora bochmemae SZF45
Phytophthora capsici 辣椒疫霉 SZF44
Phytophthora citricola 柑橘生疫霉 SZCIQPQL10183
Phytophthora erythoseptia SZF48
Phytophthora megasperma 大熊疫霉 SZF47
F.dlaminii 06033
F.equiseti 木贼镰刀菌 06034
F.fujikuroi 06038
F graminearnm 禾谷镰刀菌 06039
F lactis 乳酸镰刀菌 06041
F lateritium 06043
F moniliforme var.intermedium 串珠镰孢 06044
F napiforme 06047
F neoceras 06048
F nygamai 06051
F oxysporum 尖孢镰刀菌 06053
F poae 早熟禾镰刀菌 06054
F proliferatum 06055
F proliferatum var.minus 06056
F redolens 芳香镰孢 06057
F reticulatum 莲腐败病菌 06058
F sambucinum 接骨木镰孢 06060
F semitectum 半裸镰刀病菌 06062
F solani 06063
F tricinctum 三线镰孢 06068
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10901
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10902
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10903
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10904
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10905
F subglutinans 亚粘团镰孢霉 SZCIQPQL10906
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10907
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10908
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10909
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10910
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10911
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10912
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10913
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10914
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10915
F.oxysporum f.sp.cubense race 4 香蕉枯萎病菌4号小种 SZCIQPQL10916
F solani SZCIQPQL10917
F oxysporum 尖刀镰孢菌 SZCIQPQL10918
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10919
F.oxysporum f.sp.cubense race 1 香蕉枯萎病菌1号小种 SZCIQPQL10920
Phytophthora bochmemae SZF45
Phytophthora capsici 辣椒疫霉 SZF44
Phytophthora citricola 柑橘生疫霉 SZCIQPQL10183
Phytophthora erythoseptia SZF48
Phytophthora megasperma 大熊疫霉 SZF47
[0079]Phytophthora palmivora 棕榈疫霉 SZCIQPQL10184
Phytophthora parasitica 寄生疫霉 SZF34
Phytophthora sojae 大豆疫病菌 SZF7
Phytophthora sinensis 中国疫霉 SZF46
Phytophthora syringae 丁香疫霉 SZF54
Pythium acanthophorn PY2
Pythium inflatum 肿囊腐霉 PY1
Pythium paroecandrum 侧雄腐霉 SZF39
D.phaseolorum var.caulivora 大豆北方茎溃疡病菌 ATCC28464
D.phaseolorum var.meridionalis 大豆南方茎溃疡病菌 ATCC200236
D.phaseolorum var.sojae 大豆茎黑点病菌 ATCC12049
Phomopsis crustosa SZCIQPQL10174
Phomopsis longicolla 大豆拟茎点种腐病菌 ATCC60325
Phomopsis lixivia SZCIQPQL10124
Phomopsis mahoniae 杜鹃生拟茎点霉 SZCIQPQL10156
Phomopsis obscurans SZCIQPQL10165
Phomopsis perniciosa SZCIQPQL10149
Phomopsis philodendri 蔓绿绒拟茎点霉 SZCIQPQL10084
Phytophthora parasitica 寄生疫霉 SZF34
Phytophthora sojae 大豆疫病菌 SZF7
Phytophthora sinensis 中国疫霉 SZF46
Phytophthora syringae 丁香疫霉 SZF54
Pythium acanthophorn PY2
Pythium inflatum 肿囊腐霉 PY1
Pythium paroecandrum 侧雄腐霉 SZF39
D.phaseolorum var.caulivora 大豆北方茎溃疡病菌 ATCC28464
D.phaseolorum var.meridionalis 大豆南方茎溃疡病菌 ATCC200236
D.phaseolorum var.sojae 大豆茎黑点病菌 ATCC12049
Phomopsis crustosa SZCIQPQL10174
Phomopsis longicolla 大豆拟茎点种腐病菌 ATCC60325
Phomopsis lixivia SZCIQPQL10124
Phomopsis mahoniae 杜鹃生拟茎点霉 SZCIQPQL10156
Phomopsis obscurans SZCIQPQL10165
Phomopsis perniciosa SZCIQPQL10149
Phomopsis philodendri 蔓绿绒拟茎点霉 SZCIQPQL10084
[0080] (3)对反应条件进行优化
[0081] 对反应的退火温度从60℃-63℃之间进行变化，根据信号强度和变化趋势选择合适的反应条件；结果表明退火温度在60℃-63℃之间均能获得符合条件的Ct图，但根据图像结果更优选退火温度为63℃。
[0082] 本实施例中优选反应体系和反应条件如下表3、4所示。
[0083] 表3实时荧光PCR反应体系
[0084]
[0085] 表4实时荧光PCR检测反应条件
[0086]
[0087] (4)特异性测试
[0088] 以北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌DNA分别为阳性对照，其近似种菌株的DNA为阴性对照(见表2)，采用特异性引物对及其对应探针(见表1)，对供试菌株进行特异性检测。总体系为10μL，5μL2×Universal Real-time Master Mix，1μL10μmol/L引物探针混合液，1μL模板，补水至10μL，混匀，瞬离。空白对照以无菌水代替DNA模板。置于ABI 7700实时荧光PCR仪中，反应条件为94℃预变性10min，94℃变性
15sec，63℃退火60sec，40次循环。
15sec，63℃退火60sec，40次循环。
[0089] 结果表明这两套引物探针具有很好的特异性，非目标菌株及空白对照均无扩增信号，见图1A和B。其中图1A为用FV-F/R引物和FV-P探针进行检测的实验结果图，图中仅8株北美大豆猝死综合症病菌出现了阳性扩增信号；其中图1B为用FT-F/R引物和FT-P探针进行检测的实验结果图，图中仅3株南美大豆猝死综合症病菌出现了阳性扩增信号。
[0090] (5)灵敏度测试。
[0091] 对北美大豆猝死综合症病菌和南美大豆猝死综合症病菌DNA(将北美猝死综合症菌株(MONT)及南美(31100)作为代表)分别进行十倍梯度稀释浓度从1ng/μL至1fg/-1 -6μL(10 至10 )，采用特异性引物对及其对应的探针(见表2)进行实时荧光PCR检测。总体系为10μL，5μL 2×UniversalReal-time Master Mix，1μL 10μmol/L引物探针混合液，1μL模板，补水至10μL，混匀，瞬离。空白对照以无菌水代替DNA模板。置于ABI 7700实时荧光PCR仪中，反应条件为94℃预变性10min，94℃变性15sec，63℃退火60sec，40次循环，每个反应重复2次。建立标准曲线。
[0092] 结果见图2A、B。其中图2A为北美大豆猝死综合症病菌灵敏度检测结果图，B为南美大豆猝死综合症病菌灵敏度检测结果图。结果表明最低检测值均为10fg。根据Ct值计算得出的标准曲线公式为北美猝死综合症菌株y＝-3.557x+15.804，相关系数为0.997。南美猝死综合症菌株的标准曲线公式为y＝-3.067x+16.758，相关系数为0.955。
[0093] 实施例2
[0094] 一种的检测试剂盒，用于北美大豆猝死综合症病菌实时荧光PCR检测。所述试剂盒含有以下引物和探针：
[0095]引物 序列5’--3’ Seq ID No.
上游引物F 5′-GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG-3′ 1
下游引物R 5′-ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA-3′ 2
探针 5′-MAR-TCCCACTAAATCTGGT-MAR-3′ 5
上游引物F 5′-GGTGCAGGGTAGGTCAGATTTG-3′ 1
下游引物R 5′-ACCATCCGTCTGGGAATTTTAACTA-3′ 2
探针 5′-MAR-TCCCACTAAATCTGGT-MAR-3′ 5
[0097] 实施例3
[0098] 一种的检测试剂盒，用于南美大豆猝死综合症病菌实时荧光PCR检测。所述试剂盒含有以下引物和探针：
[0099]引物 序列5’--3’ Seq ID No.
上游引物F 5′-CCAGTGGTGCGGAAGGTA-3′ 3
下游引物R 5′-GACGGCGATTCCAACAGTAG-3′ 4
探针 5′-JUP-ACCCTAGAGCTCGTCTT-JUP-3′ 6
上游引物F 5′-CCAGTGGTGCGGAAGGTA-3′ 3
下游引物R 5′-GACGGCGATTCCAACAGTAG-3′ 4
探针 5′-JUP-ACCCTAGAGCTCGTCTT-JUP-3′ 6
[0100] 所述试剂盒还包括使用说明书。
[0101] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
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