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用于治疗和诊断致盲性眼病的方法

阅读：693发布：2021-01-02

专利汇可以提供用于治疗和诊断致盲性眼病的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明部分涉及适用于诊断、治疗或预防致盲性眼病的方法和组合物，包括对这些疾病有效的药物的发现。疾病包括例如年龄相关性黄斑变性和网状假性玻璃疣疾病，并且本发明所述的方法包括例如名为延迟近红外分析(DNIRA)的方法。，下面是用于治疗和诊断致盲性眼病的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于确定候选化合物是否适用于治疗致盲性眼病的方法，其包括：
(a)向动物施用有效量的测试化合物，所述动物的眼睛包含(i)有效于指示致盲性眼病在所述动物中存在的量的荧光化合物以及(ii)有效于诱导眼组织萎缩的量的毒素；
(b)使所述眼睛暴露于具有有效于引起所述荧光化合物发出荧光的波长和强度的光；
(c)将所述眼睛的荧光图案与包含所述荧光化合物和所述毒素但不包含所述测试化合物的动物眼睛的荧光图案相比较；以及
(d)如果步骤(c)的所述比较的结果指示所述测试化合物适用于治疗致盲性眼病，则选择所述测试化合物作为候选化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述致盲性眼病为年龄相关性黄斑变性(AMD)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述致盲性眼病为网状假性玻璃疣(RPD)疾病。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述动物为小鼠、大鼠或斑马鱼。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光化合物吸收波长为约600nm至约900nm的光。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光化合物发射波长为约750nm至约950nm的光。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述荧光化合物为吲哚菁绿(ICG)。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述毒素为碘酸钠。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述萎缩包括视网膜色素上皮(RPE)细胞的坏死。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述坏死作为斑块存在。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光出现在RPE细胞内。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述比较在施用所述测试化合物之后至少约24小时进行。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述比较在施用所述测试化合物之后至少约7天进行。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述比较在施用所述测试化合物之后至少约30天进行。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述将所述眼睛暴露于光包括进行共焦扫描激光眼底镜(cSLO)、眼底自发荧光(FAF)、延迟近红外分析(DNIRA)或光学相干断层成像术(OCT)。
16.如权利要求1所述的方法，其中致盲性眼病的所述存在通过RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块内的FAF图案所指示。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述图案为曲线、带状、网状、椭圆形、圆形、扇形、晕圈以及靶样病灶中的一种或多种。
18.如权利要求1所述的方法，其中致盲性眼病的所述存在通过RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块边界内的FAF图案所指示。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述图案为曲线、带状、网状、椭圆形、圆形、扇形、晕圈以及靶样病灶中的一种或多种。
20.如权利要求1所述的方法，其中致盲性眼病的所述存在通过截面图案或横向图案所指示。
21.如权利要求20所述的方法，其中使用OCT观察所述图案。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述图案为RPE和/或外视网膜损失或者视网膜下空间内发现的隆起、三角形、峰或尖峰。
23.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在施用所述测试化合物之前观察所述眼睛的步骤。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述观察建立所述眼睛的一种或多种施用前的特征。
25.如权利要求1所述的方法，其包括在施用所述测试化合物之前施用所述荧光化合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述方法不包括施用(i)另一个量的所述荧光化合物给所述动物或者(ii)第二种荧光化合物给所述动物。
27.如权利要求1所述的方法，其包括在施用所述测试化合物之前施用所述毒素。
28.如权利要求1所述的方法，其包括在施用所述荧光化合物之前施用所述毒素。
29.如权利要求1所述的方法，其进一步包括施用(i)另一个量的所述毒素给所述动物或者(ii)第二种毒素给所述动物。
30.如权利要求29所述的方法，其进一步包括观察眼组织萎缩斑块或者组织损失斑块的形成、生长或扩大的速率的减小。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述候选化合物适用于治疗、预防致盲性眼病或者减小其发病率。
32.如权利要求1所述的方法，其中确定多种候选化合物。
33.如权利要求32所述的方法，其进一步包括比较所述多种候选化合物在治疗致盲性眼病中的有用性以及基于所述比较选择先导化合物。
34.一种用于治疗或预防干性AMD的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基，以及
R3为H或C1-C6烷基。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述式I化合物为宾达利特。
36.一种用于治疗或预防干性AMD的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。
37.如权利要求34或36所述的方法，其中所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述另外的治疗剂为以下一种或多种：抗血管内皮生长因子(VEGF)剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂、肾素抑制剂、类固醇以及调节自噬的试剂。
39.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD可通过高荧光FAF区域在所述受试者眼内的存在来确定。
40.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD可通过一个或多个异常荧光FAF区域在所述受试者眼内的存在来确定。
41.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD可通过所述受试者眼内的蓝色光谱眼底成像、白光眼底成像、无赤光眼底成像以及OCT中的一种或多种的改变来确定。
42.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD可通过穿过所述受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加来确定。
43.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD可通过穿过所述受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的中间视网膜血管相对于未患病状态的变形来确定。
44.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD可通过穿过所述受试者的RPE的吞噬免疫细胞相对于未患病状态的存在来确定。
45.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD为早期AMD。
46.如权利要求34或36所述的方法，其中所述干性AMD为萎缩性干性AMD。
47.如权利要求34或36所述的方法，其中所述受试者为人。
48.如权利要求34或36所述的方法，其中所述施用以口服或血管内方式实现。
49.如权利要求34或36所述的方法，其中所述施用以眼内或眼表面方式实现。
50.一种治疗RPD疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基，以及
R3为H或C1-C6烷基。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述式I化合物为宾达利特。
52.一种治疗RPD疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。
53.如权利要求50或52所述的方法，其中所述方法包括减少假性玻璃疣在所述受试者体内的量。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述方法包括减少假性玻璃疣在所述受试者眼睛的中心凹区域、中心凹周区域以及近中心凹区域中的任一个区域内的量。
55.如权利要求50或52所述的方法，其中所述方法包括减小进展到后期疾病的速度，其中所述后期疾病为脉络膜新生血管或地图状萎缩。
56.如权利要求50或52所述的方法，其中所述方法包括减小地图状萎缩扩大的速度。
57.如权利要求50或52所述的方法，其中所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述另外的治疗剂为以下一种或多种：抗VEGF剂、ACE抑制剂、PPAR-γ激动剂、肾素抑制剂、类固醇以及调节自噬的试剂。
59.如权利要求50或52所述的方法，其中所述RPD疾病可通过视网膜成像的不同图案的一个或多个区域在受试者眼内的存在来确定，其中所述视网膜成像为白光、无赤光、蓝光、FAF、近红外光(NIR)、红外光(IR)以及DNIRA中的一种或多种。
60.如权利要求50或52所述的方法，其中所述RPD疾病可通过一个或多个异常荧光FAF区域在受试者眼内的存在来确定。
61.如权利要求50或52所述的方法，其中所述RPD疾病可通过穿过所述受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加来确定。
62.如权利要求50或52所述的方法，其中所述RPD疾病可通过穿过所述受试者的RPE的吞噬免疫细胞相对于未患病状态的存在来确定。
63.如权利要求50或52所述的方法，其中所述受试者为人。
64.如权利要求50或52所述的方法，其中所述施用以口服或血管方式实现。
65.如权利要求50或52所述的方法，其中所述施用以眼内或眼表面方式实现。
66.一种用于鉴别患有致盲性眼病并且很可能响应于使用试剂的治疗的受试者的方法，所述方法包括：
确定所述受试者的眼睛穿过所述眼睛的脉络膜与视网膜之间的所述上皮屏障的渗透性相对于未患病状态是否有所增加或者先前已增加，
其中所述渗透性的增加指示所述受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗，并且其中所述试剂为甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或者式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基，以及
R3为H或C1-C6烷基。
67.一种用于鉴别患有致盲性眼病并且很可能响应于使用试剂的治疗的受试者的方法，所述方法包括：
确定所述受试者的眼睛相对于未患病状态是否具有穿过RPE的吞噬免疫细胞的存在，其中所述吞噬免疫细胞的存在指示所述受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗，并且
其中所述试剂为甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或者式I化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基，以及
R3为H或C1-C6烷基。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述式I化合物为宾达利特。
69.如权利要求66或67所述的方法，其中所述致盲性眼病为干性AMD或RPD疾病。
70.如权利要求67所述的方法，其中所述吞噬免疫细胞的存在通过DNIRA测量。
71.一种用于确定受试者的致盲性眼病是否响应于使用抑制所述受试者免疫细胞功能的试剂的治疗的方法，所述方法包括：检测免疫细胞在所述受试者眼内的存在、检测其缺乏或测量其数量，
其中所述受试者眼睛响应于具有约600nm至约900nm波长的光而发出荧光。
72.如权利要求71所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的荧光化合物，其中所述检测或测量在施用所述荧光化合物之后至少一天进行。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述检测或测量在向所述受试者施用有效量的荧光化合物之后至少一天进行。
74.如权利要求71所述的方法，其进一步包括检测或测量所述受试者眼内的FAF的步骤。
75.如权利要求74所述的方法，其进一步包括将FAF图案与免疫细胞在所述受试者眼内的存在、缺乏或数量相关联的步骤。
76.如权利要求71所述的方法，其中所述致盲性眼病为AMD、中心性浆液性视网膜病(CSR)或RPD疾病。
77.如权利要求71所述的方法，其中所述受试者为人。
78.如权利要求71所述的方法，其中所述受试者眼睛发出具有约750nm至约950nm波长的荧光。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中所述荧光化合物为ICG。
80.如权利要求71所述的方法，其中所述检测或测量在施用所述荧光化合物之后约一天进行。
81.如权利要求71所述的方法，其中所述检测或测量在施用所述荧光化合物之后约七天进行。
82.如权利要求71所述的方法，其中所述检测或测量在施用所述荧光化合物之后约三十天进行。
83.如权利要求71所述的方法，其中所述方法不进一步包括施用(a)另一个量的所述荧光化合物或者(b)第二种荧光化合物。
84.如权利要求71所述的方法，其中所述检测或测量包括进行cSLO、FAF、DNIRA或OCT。
85.如权利要求71所述的方法，其中所述免疫细胞为所述受试者的先天性免疫系统的细胞。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述细胞为巨噬细胞或小胶质细胞。

说明书全文

用于治疗和诊断致盲性眼病的方法

[0001] 优先权

[0002] 本申请要求2012年5月1日提交的美国临时申请第61/640,854号、2012年5月2日提交的美国临时申请第61/641,393号、2012年8月24日提交的美国临时申请第61/693,226号以及2013年3月15日提交的美国临时申请第61/792,436号的优先权权益，每一份申请均以引用的方式整体并入本文。
发明领域

[0003] 本发明涉及适用于诊断、治疗或预防致盲性眼病的方法和组合物，包括对这些疾病有效的药物的发现。

[0004] 背景

[0005] 致盲性眼病包括影响视力的多种病症。年龄相关性黄斑变性(AMD)为眼功能障碍(包括失明)的主要原因。一种形式的AMD是也被称为“干性”AMD的非渗出性AMD，它的特征通常在于在视网膜色素上皮细胞(RPE)之内或之外的玻璃疣累积。在晚期干性AMD中，出现RPE和上覆视杆细胞和视锥细胞光感受器的萎缩。第二种形式的AMD是渗出性或“湿性”或“新生血管”AMD，其特征在于脉络膜新血管形成。早期疾病经常为干性AMD，而晚期疾病经常是湿性(新生血管)AMD或干性(萎缩)AMD。

[0006] 玻璃疣为出现在RPE内或RPE外的白色斑点或沉积物。玻璃疣为AMD的限定或病理特征。相比之下，术语“假性玻璃疣”、“玻璃疣样沉积物”或“视网膜下玻璃疣样沉积物”用于描述被认为相对于光进入眼睛的路径在视网膜下空间内位于RPE前面的离散沉积物或微黄色曲线或网状图案。

[0007] 由于成像技术的差异，关于网状假性玻璃膜疣(RPD)的发病率存在争论，其中很多假设它是被低估的。与AMD一样，RPD为与年龄有关的。RPD也与通常由于地图状萎缩或脉络膜新血管形成而导致的视力损失密切相关。然而，与经典的AMD不同，它的特征在于，在包括但不限于以下的多种波长的光中可以看见的交错、曲线或网状图案：白色、蓝色、蓝色自发荧光、无赤光、近红外光或红外光。RPD的定义或病理特征不是玻璃疣而是“假性玻璃疣”、“玻璃疣样沉积物”或“视网膜下玻璃疣样沉积物”，当评价在横向平面(如可使用例如光学相干断层成像术(OCT)光学地进行的)中的或者在摘除术之后的样品中(使用例如具有或不具有免疫组织化学的组织学分析)的外视网膜和RPE，它们表现为位于视网膜下空间内的RPE前面(上面)的基底朝下圆顶、三角形或尖峰样沉积物。与经典AMD不同，RPD可与增加的心血管死亡有关。目前，在不希望受到理论约束的情况下，RPD可被认为是年龄相关性黄斑病变的不同形式而不是AMD的亚型。RPD还可被认为是干性AMD的“弥漫性滴漏”亚型。

[0008] 目前存在缺乏用于有效治疗致盲性眼病如AMD或RPD的药物。因此，仍需要适用于治疗这些疾病和其它致盲性眼病的疗法。此外，需要这些疾病的有效诊断。

[0009] 发明概述

[0010] 因此，一方面，本发明提供一种用于鉴别候选化合物是否适用于治疗致盲性眼病的方法，所述方法包括(a)向动物施用有效量的测试化合物，所述动物的眼睛包括(i)有效于指示致盲性眼病在动物中的存在的量的荧光化合物和(ii)有效于诱导眼组织萎缩的量的毒素；(b)将眼睛暴露于具有有效地引起荧光化合物发荧光的波长和强度的光；(c)将所述眼睛的荧光图案与包含所述荧光化合物和所述毒素而不含所述测试化合物的动物眼睛的荧光图案进行比较；以及(d)如果步骤(c)的比较结果指示测试化合物适用于治疗致盲性眼病，则选择该测试化合物作为候选化合物。

[0011] 在另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防干性AMD的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的式I化合物：

[0012]

[0013] 或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0014] 在另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防干性AMD的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。

[0015] 在另一方面，本发明提供一种治疗RPD疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0016] 在又一方面，本发明提供一种用于治疗RPD疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。

[0017] 在又一个方面，本发明提供一种用于鉴别患有致盲性眼病并且可能响应于使用试剂的治疗的受试者的方法，所述方法包括确定受试者的眼睛穿过在眼睛的脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态是否有所增加(包括暂时性增加)或先前已增加；其中所述渗透性的增加指示所述受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗；并且其中所述试剂选自甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或和式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0018] 在又一方面，本发明提供一种用于鉴别很可能响应于使用试剂的治疗的致盲性眼病受试者的方法，所述方法包括确定受试者的眼睛相对于未患病状态是否具有穿过RPE的吞噬免疫细胞的存在(例如，流入)，其中吞噬免疫细胞的存在指示受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗，并且其中所述试剂选自甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或和式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0019] 在另一方面，本发明提供一种用于确定受试者的致盲性眼病是否响应于使用抑制受试者免疫细胞功能的试剂的治疗的方法，所述方法包括检测免疫细胞在受试者眼睛中的存在、检测其缺乏或测量其数量，其中受试者眼睛响应于具有约600nm至约900nm的波长的光而发出荧光。

[0020] 在以下所附描述中列举了本发明的细节。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但如今描述了说明性的方法和材料。通过描述和通过权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将为显而易见的。在说明书和所附权利要求书中，单数形式还包括复数，除非上下文另外清楚地指出。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。

[0021] 附图简述

[0022] 图1显示在NaIO3注射之后体内眼底自发荧光(FAF)成像确定发展为网状图案的损害的地图状区域。ICG血管造影法确定暂时的脉络膜视网膜渗透性。

[0023] 图1A示出在视神经乳头周围的早期FAF变化的时间进程。高荧光线或边界在NaIO3注射之后2-3天形成。边界可以或可以不完全围绕在视神经乳头周围并且不与它相邻。荧光的花边或网状图案在第3天至第7天之间出现并且位于此线周边。至第7天，此图案为不同的。

[0024] 图1B示出包括视神经乳头和中间-周边视网膜的复合图像并且显示高荧光边界限定未来的花边或网状高荧光的区域。在此实例中，在NaIO3之后第3天看见的边界限定下半视网膜中的岛状物。至第7天，边界不再是可见的，而是出现深的网状图案。注意，在第3天和第7天示出两个不同的岛状物的图像来自不同的动物并且证明观察图案的一致性。小岛状物如这些岛状物在约7％的眼睛中是可见的。

[0025] 图1C显示FAF图案明显不同于在脉络膜的荧光素(左图和中间图分别为内部视网膜和中间视网膜)或者ICG血管造影(右图)上可见的视网膜和脉络膜血管系统图案[0026] 图1D示出在图案进展之前约第2天出现的经上皮的渗透性的暂时性增加并且在ICG血管造影(790nm，染料注射之后约6分钟)期间通过大量冲洗而为明显的。此ICG冲洗在毒素注射之后第1天没有检测到，短暂出现，并且在第3天或第4天的通常测试的下个时间点很少看见。

[0027] 图2示出在大360°环中在NaIO3注射之后的FAF变化的成长。

[0028] 图2A示出涵盖大部分后极并且确定通过周边乳头和周边视网膜边界限定的损害的360°环的大复合FAF图像。在NaIO3之后7天获取的FAF图像确定形成椭圆形、圆形、扇形、莲座形或爪印图案的多个离散且连续的曲线高荧光区域。这些通常在第7天与第14天之间出现。在上部放大图中提供细节。这些复合FAF图案出现在早期的高荧光边界内并且随着时间聚结。

[0029] 图2B示出至第14天大部分动物显示贯穿整个360°环的几乎连续的网状高荧光图案。在中间方框中提供细节。

[0030] 图2C示出至NaIO3暴露之后28天，图案呈现更多颗粒状外观。其中图案不太清楚的小区域被看作较深的灰色区域。

[0031] 图2D示出用于比较的“弥漫性滴漏”FAF图案的临床图像。本发明尤其概括很多包括以下的特性：与周边高荧光有关的网状、小叶或扇形的椭圆的灰色弱荧光。

[0032] 图3显示外视网膜变形的曲线、网状图案在NaIO3注射之后数周内发展。

[0033] 图3A显示此图案与自发荧光细胞的分布相对应。示出在NaIO3注射之前(基线)和在注射之后第4天和第7天获得的切离的视网膜整装(whole mount)的低功率(1x，左列；5x，右列)白光图像。在与基线比较之后3-4天标注精细曲线图案，并且在第7天为清楚的。

[0034] 图3B显示至NaIO3之后第14天，此网状图案为明显的并且与外视网膜的总变形相对应。这在松弛切口位点处可见的截面中表现为凹口或褶皱(在方框中放大)。

[0035] 图3C示出没有细胞染色的488nm通道内的落射荧光显微镜显示处于网状沟内的自发荧光细胞的存在。这使用宽光发射(左列)以及窄激发和发射(右列)二者为明显的并且与FAF成像期间使用的波长相对应。视网膜中的褶皱与至第7天的小荧光点的存在有关。进一步放大清楚地显示其核内具有空隙的小荧光细胞的分布。在全身性荧光素-右旋糖酐注射(如对于血管造影)之后的阳性对照组织证实在没有组织处理或染色的情况下检测切离的视网膜或眼杯中的488nm荧光的能力(类似于用于HRAII成像中的FAF的波长)。基线处的阴性对照显示自发荧光细胞的缺乏。

[0036] 图4示出显示组织学确定的组织发现如何解释NaIO3诱导RPE损失之后的体内成像的原因的解释性图。

[0037] 图4A示出来自患有早期AMD的患者的临床图像并且示出NIR通道内的网状假性玻璃疣和所谓“靶”病灶(顶部图)。紧接着下方为两张示意性重叠图，其首先以黑色粗体强调弱荧光斑点(通常被定义为玻璃疣样沉积物的那些)并且然后使用明亮背景强调插入的明亮信号。底部的两张图像突出显示RPD的多个小靶病灶(在圆圈内)，而最底部示意图示出通过组织的同心褶皱形成的可能的晕圈和靶病灶的存在。

[0038] 图4B示出示意性透视图，它指示三维整装ONL组织学与二维正面(enface)临床FAF图像之间的直接关系。在NaIO3暴露之后第14天，外视网膜显示中间ONL的复合褶皱(在相对低的放大率下[原始40x]示出并且数字地放大)。数字放大显示组织褶皱的同心环。以黑色和白色示出的此相同区域显示这在FAF上可如何表现为具有中心空隙的圆形或椭圆形区域。相反的黑色和白色透视图(“阴性”图像)显示ONL变形的这种布置似乎具有中心明亮的靶标。

[0039] 图4C示出NaIO3注射之后14天大鼠视网膜的OCT图像，清楚地显示通过外视网膜的明亮“尖峰”。在临床上描述这些情况。通过外视网膜的类似组织学切片证明在形成窄细胞列的放大视网膜下空间中具有底层炎症细胞的ONL褶皱。对于体内图像的比较，以黑色和白色描绘这些。在相反的黑色和白色(匹配OCT图像的假阴性图像)中，看见ONL消失而视网膜下密度变亮。

[0040] 图5示出通过有斑点的NIR荧光通过795/810nm cSLO成像检测，但是不能在没有先前的ICG注射的情况下检测，即，此荧光仅可使用适当位置的激发/发射滤光器进行检测，而与染料注射之后的运送时段不一致或在此时段内不一致(即，使用DNIRA方法)。图5A-图5F示出使用以下获得的野生型SD大鼠的代表性正常共焦激光扫描眼底镜(cSLO)和血管造影图像：

[0041] 图5A：无赤光。

[0042] 图5B：红外反射(830nm)。

[0043] 图5C：488/500nm自发荧光(FAF)。

[0044] 图5D：795/810nm NIR荧光。

[0045] 图5E-图5F分别示出使用荧光素右旋糖酐和ICG染料的正常视网膜和脉络膜血管系统。这些图像和类似图像用作所有实验的正常对照。此成像用于在视网膜和RPE层内以及在视网膜和RPE层之间适当地对齐焦点的深度。

[0046] 图5G示出在t＝0时接受单次5mg/kg ICG染料注射的代表性动物体内的延迟近红外分析(DNIRA)的时间进程。在染料注射之前没有看见可检测信号(注意均匀的深色图像，上排)。在血管造影期间(第二排)，可看见视网膜血管，并且背景是不可检测的，注意减小cSLO的增益(灵敏度)以防止在运送阶段期间饱和。在血管造影之后的几天，与基线相比存在(第3-5排)增加的斑点或点状背景荧光。延迟的NIR荧光通过上覆血管阻断并且在视神经乳头处为缺乏的，但是与FAF(图5H)不同，在神经乳头周围形成明亮的弧或环。在以所使用的浓度(5mg/kg)注射之后的28天，信号保持强烈并且分布于整个基底。底排的稍微较深的区段可能反映脉络膜涡静脉的存在。

[0047] 图5H示出，与DNIRA时间进程相反，当在荧光素血管造影之后3天、8天和28天查看时(下排)，488/500nm自发荧光信号恢复到注射前的强度(顶排)。底排的稍微较深区段可能反映脉络膜涡静脉的存在。

[0048] 图6显示NIR荧光信号的强度与使用DNIRA的ICG剂量相关联。

[0049] 图6A示出显示当没有给予ICG染料注射时795/810nm荧光信号缺乏的对照cSLO图像。不接受ICG的对照动物在评价的21天期间维持具有可忽略的信号的相同背景荧光水平。

[0050] 图6B显示使用相同增益，当以0.35mg/kg的低剂量给予时在ICG注射之后48小时延迟的NIR荧光为可容易检测的。然而，随着时间变化，DNIRA显示从注射后48小时到21天逐渐暗淡。

[0051] 图6C显示使用相同增益，5mg/kg ICG血管造影在48小时引起比较低剂量(图6B)更亮(更高强度)的延迟NIR荧光。此荧光基本上持续多至21天没有改变。

[0052] 图6D显示相比之下，830nm NIR反射通道不会显示类似改变。

[0053] 图7显示碘酸钠引起延迟NIR荧光的斑块损失，通过所述荧光清晰查看脉络膜血管

[0054] 图7A示出在ICG和NaIO3注射之后3天进行的DNIRA。看见在清晰限定的后极的斑块或区域内的斑点荧光的损失。这些区域表现为具有明确限定的边界的黑色或弱荧光。

[0055] 图7B显示在这些区域内，如果cSLO的增益(灵敏度)增加，则脉络膜血管为显而易见的。方框(放大)确定在不同于视网膜血管的方向上行进的一些突出的脉络膜血管，所述视网膜血管从视神经(箭头)径向延伸。斑点DNIRA荧光在图像右上方掩盖对脉络膜的查看。

[0056] 图8显示网状FAF图案在体内和切离的视网膜中成熟并且分出与视神经相邻的区域。

[0057] 图8A显示尽管在NaIO3施用第3个月外视网膜显著损失，ONL保持在与视神经乳头(ONH)紧密相邻的区域内。较高放大率(底部)证实光感受器核受到保护并且外视网膜并未投入褶皱中。来自NaIO3注射之后第7天的动物的代表性眼睛的FAF成像证实没有看见网状图案。细虚线(内圆圈)代表ONH的位置，而粗虚线(外圆圈)描绘正常的非网状FAF的近似程度。

[0058] 图8B示出证明在NaIO3施用之后的外视网膜清晰变形的H&E染色。在NaIO3施用之前(BL)，ONL表现为从ONH向视网膜周边延伸的深色线带。至7天，外视网膜投入褶皱中并且ONL大体上保持完整。在放大图的右列看见这种情况。然而，至NaIO3后第14天，ONL显示明显损失的区域，其中内视网膜直接抵靠在RPE的特化基底膜Bruch膜(BM)上。在放大图中看见这种情况(黑色箭头)。

[0059] 图8C示出通过使用核染色TO-PRO-3(仅具有远红外光的羰花青单体核酸染色，Invitrogen)成像的ONL的共焦显微镜图。在基线处，此层为平的，没有区别的性质。随着在NaIO3施用之后时间的增加，ONL逐渐变得越来越错乱。在第3天、第6天和第14天确定线性沟、曲线形状、同心环以及分离的小椭圆形或圆圈。

[0060] 图9显示在早期和晚期疾病中在RPE缺乏下Iba1+细胞形成网状FAF图案。

[0061] 图9A示出较低(顶排)和较高(底排)放大率的体内和离体成像，它展示在早期和晚期疾病进展中的FAF和IHC上看见的网状图像之间的比较。在体内确定的FAF图案通过使用抗-Iba抗体的荧光免疫组织化学进行概括。与在第7天HRAII成像之后立即切离的整装视网膜相比，使用小胶质细胞和巨噬细胞的标志物即针对Iba-1的抗体，看见相同网状图案(顶部)。使用TO-PRO-3的核染色显示似乎在二维中形成曲线、椭圆形或小叶图案的外视网膜层(光感受器层)的紧密堆积的细胞。二者的合并证实发现在核染色之间交+ +错的Iba-1 染色。晚期网状图案的放大证实Iba-1 细胞保持在褶皱的光感受器核之间的沟中(底部)。

[0062] 图9B显示甚至在RPE缺乏下可检测FAF信号。左边：使用RPE65(绿色)染色的后眼杯示出在中央视网膜和中间视网膜内的此单层的损失(保留周边RPE环。其余图像利用两种不同的RPE标签(MiTF；小眼球转录因子)和特征性双核染色，并且证实在中间和中央眼杯的看见具有眼底自发荧光复合图案的区域内的RPE层损失。相比之下，正常或几乎正常的RPE保持在眼杯周边。

[0063] 图9C示出指示RPE细胞在整装视网膜的中心部分中消失的核染色，如通过指示RPE细胞的双核的缺失而为明显的。RPE在周边视网膜组织中仍为可见的。这与基线对照相反，其中RPE细胞存在于中心和周边视网膜组织中。

[0064] 图10示出通过外视网膜的系列共焦显微镜图，它展示具有Iba-1+和CD68+吞噬细胞的对应交错分布的复合3维变形。

[0065] 图10A示出光学切片成从内网织层(IPL)延伸至视网膜下空间的四个层的外视网膜的形态改变。ONL分为内层和外层。红色＝Iba-1、绿色＝CD68、蓝色＝核。与Iba-1细胞主要发现于内视网膜时的基线相比，在NaIO3施用之后第4天，在视网膜层中看见吞噬细胞数目的增加。对于两种细胞标志物，这在抗体阴性对照为缺乏的。

[0066] 图10B显示至NaIO3施用之后的第14天，在ONL中和向内深至OPL中，圆形和椭圆形图案为明显的(通过血管的存在来确定)。在内部ONL中图案为曲线，并且在外部ONL中更是如此，其中紧密褶皱的核层为非常密集的，具有较小的曲线空腔区域。在外部ONL中，+ +在褶皱之间存在大量的桥接。这些核空腔包含Iba-1 和CD68 细胞。

[0067] 图10C示出最外层ONL或扩大的视网膜下空间(通常为假设的空间)内的放大图+ +像，示出在光感受器核之间交错的Iba-1 和CD68 细胞的网状图案。

[0068] 图11示出切离的视网膜整装组织的三维重构，这证实吞噬细胞位于形成网状图案的变形的光感受器层内

[0069] 图11A显示通过外视网膜的共焦Z-系列用于产生ONL和Iba1+细胞的三维重构。+
光感受器核层的核染色(红色)显示它投入褶皱中。与Iba-1 染色(绿色)合并，清楚的是，炎症细胞位于通过视网膜变形限定的褶皱之间或褶皱内。Iba-1阳性细胞的重构单独地证明为网状图案。

[0070] 图11B示出在NaIO3施用之后28天外视网膜的总图像堆叠的区段的Z-系列重构，示出褶皱的复杂性，它在其峰(内部)处更窄，并且在其底部(中间，外部)更宽并且更为交错。对于与截面成像的比较并且为了更好地表示这些发现的3D性质，也示出倾斜透视(中间图)。在正面图像(左图)上的星号位置与倾斜图像中的星号的定位相对应。数字放大(右图)显示为曲线并且在外视网膜中为连续的、但是在内部-ONL中破碎成至少三个+小椭圆形的光感受器层(红色)之间的沟。Iba1 细胞(绿色)主要位于光感受器层内，即在其外部。外视网膜的对照重构既不显示Iba-1阳性细胞，也不显示ONL变形(底排)。
Bitplane 软件(Imaris)用于产生这些图像。

[0071] 图12显示进展性NaIO3诱导的外视网膜变形通过OCT体内成像来确定并且与临床发现相比较(缩写为：NFL＝神经纤维层；GCL＝神经节细胞层；IPL＝内网织层；INL＝内核层；OPL＝外网织层；ONL＝外核层；IS+OS内区段与外区段层；RPE＝视网膜色素上皮；BM＝Bruch膜)。

[0072] 图12A示出体内OCT并且示出发生于下半视网膜而不是上半视网膜的、在NaIO3施用之后前三天观察到的早期改变。基线图像指示在OCT上可见的视网膜层。在第3天视网膜的正面图像示出具有所示上部分和下部分的两个光学切片的位置。上部分与基线相比没有改变。相反之下，下部分显示光感受器内部和外部区段的小波动以及薄RPE层的损失。

[0073] 图12B显示至NaIO3施用之后第14天，外视网膜示出标记的改变，包括形成明亮信号的多个弯曲的褶皱、基底向下的三角形以及偶尔的尖峰，它们位于深色外核层的外部(下部)。

[0074] 图12C显示在啮齿动物视网膜的第14天的图像中指示良好形成的基底向下的三角形。

[0075] 图12D显示患有网状假性玻璃疣的患者的OCT图像，它示出与啮齿动物模型中看到的类似的基底向下的三角形。

[0076] 图13显示视网膜下的改变在Y-轴和Z-轴中体内形成复合3D结构。

[0077] 图13A示出证实视网膜下的改变在Y-轴形成复合3D结构的相邻而连续的OCT图像。小视网膜下圆顶或椎体形状为很多的，并且如中心所示的，还形成与倒置的“Y”或“叉骨”类似的形状。与系列图像的体积重构相比，此图像与通过当正面查看时表现为圆形的结构的光学切片相一致。示出通过圆形结构的系列OCT切片的位置的图像与相邻光学截面中的那些图像相对应。看见这些截面的两个主要视网膜下信号(箭头)挨着圆圈的上限和下限并且在中心进一步间隔。提供尖峰之间的距离。对紧接着圆圈左边的结构的评价显示视网膜下结构为较小环状结构的类似组成。

[0078] 图13B显示通过内部ONL、中间ONL和外部ONL的系列Z切片的部分堆叠的体积重构证实在变形的外视网膜下的不同正面外观的信号。OCT切片通过相同组织平面。(上排)体积重构图像形成于由上排所示的平行绿线限制的三个平面内。通过内部ONL、中间ONL和外部ONL的此部分重构证明三种不同图案。(C.下排)在内部ONL中的点状斑点的规则排列。(C，左下图)在中间ONL中的更曲线的图案。(C，中间图)大部分位于扩大的视网膜下空间内的最外层ONL显示在其之间具有大量桥接的多种复合曲线、环形复合结构。这些图像与3D重构的共焦显微镜发现相关联(C，右下图)

[0079] 图14显示耗竭循环单核细胞并且驻留巨噬细胞的钆改变NaIO3诱导的外视网膜损害的FAF图案。

[0080] 图14A显示与未处理相比(底图)，GAD处理的病灶在第3天(顶部，左图)如何具有不太良好划分的边界并且在第几天(顶部，右图)在代表性损害的岛状物内如何具有远没有良好划分的FAF图案。

[0081] 图14B示出巨噬细胞耗竭如何导致较小的损害区域。左图：FAF图像显示在NaIO3之后7天的小月牙形网状图案和同时的巨噬细胞GAD耗竭。右图：相对于完整的切离的视网膜，损害的区域明显小于通常所看见的区域。

[0082] 图15示出在不希望受到理论约束的情况下，组织学确定的组织发现如何解释在NaIO3诱导的RPE损失之后的体内成像的原因的解释性图。

[0083] 图15A示出来自患有早期AMD的患者的临床图像，它示出NIR通道(顶部)内的网状假性玻璃疣和所谓“靶”病灶。紧接着下方为两张示意性重叠图，其首先以用于强调的黑色显示弱荧光斑点(通常被定义为玻璃疣样沉积物的那些)并且然后使用明亮背景强调插入的明亮信号。底部的两张图像突出显示RPD的多个小靶病灶(圆圈内)，而最底部示意图示出通过组织的同心褶皱形成的可能的晕圈和靶病灶的存在。

[0084] 图15B示出示意性透视图，它表明三维整装ONL组织学和二维正面临床FAF图像之间的直接关系。至NaIO3施用之后第14天，外视网膜显示中间ONL的复合褶皱(在相对低的放大率下[原始40x]示出并且数字地放大)。数字放大显示组织褶皱的同心环。以黑色和白色示出的此相同区域显示这在FAF上可如何表现为具有中心空隙的圆形或椭圆形区域。相反的白色和黑色透视图(即，“阴性”图像)显示ONL变形的此布置似乎具有中心明亮的靶标。

[0085] 图15C示出NaIO3注射之后14天的大鼠视网膜的OCT图像，清楚地示出通过外视网膜的明亮“尖峰”。在临床上描述这些情况。通过外视网膜的类似组织学切片证明在形成窄细胞列的放大视网膜下空间中具有底层炎症细胞的ONL褶皱。对于与体内图像的比较，以黑色和白色描绘这些。在相反的黑色和白色(即，匹配OCT图像的假阴性图像)中，看见ONL消失而视网膜下密度变亮。

[0086] 发明详述

[0087] 本发明部分基于用于检测和/或测量和/或评价受试者和/或动物的致盲性眼病的形态的发现以及此方法在发现和/或评价用于改进致盲性眼病的治疗的候选化合物中的用途。确切地说，本发明尤其提供一种名为延迟近红外分析(DNIRA)的分析方法以及此方法在产生致盲性眼病例如像AMD和/或RPD的模型中的用途。另外，本发明涉及诊断特定形式的致盲性眼病例如像AMD和/或RPD的方法以及用于治疗AMD和/或RPD的方法。

[0088] 一方面，本发明提供一种用于鉴别候选化合物是否适用于治疗致盲性眼病的方法，所述方法包括(a)向动物施用有效量的测试化合物，所述动物的眼睛包括(i)有效于指示致盲性眼病在动物中的存在的量的荧光化合物和(ii)有效于诱导眼组织萎缩的量的毒素；(b)将眼睛暴露于具有有效地引起荧光化合物发荧光的波长和强度的光；(c)将所述眼睛的荧光图案与包含所述荧光化合物和所述毒素而不含所述测试化合物的动物眼睛的荧光图案进行比较；以及(d)如果步骤(c)的比较结果指示测试化合物适用于治疗致盲性眼病，则选择该测试化合物作为候选化合物。

[0089] 在一些实施方案中，致盲性眼病为AMD或RPD疾病。

[0090] 在一些实施方案中，所述动物为小鼠、大鼠或斑马鱼。

[0091] 在其它实施方案中，荧光化合物吸收波长为约600nm至约900nm的光和/或发射波长为约750nm至约950nm的光。在一个特定实施方案中，荧光化合物为ICG。在其它实施方案中，荧光出现在RPE细胞内。

[0092] 在一些实施方案中，所述毒素为碘酸钠。在其它实施方案中，萎缩包括RPE细胞的坏死。在其它实施方案中，所述坏死作为斑块存在。

[0093] 在其它实施方案中，所述比较在施用测试化合物之后至少约24小时或至少约7天或至少约30天或至少60天或至少90天进行。

[0094] 在不同实施方案中，将眼睛暴露于光中包括进行cSLO、FAF、DNIRA或OCT。在不同实施方案中，将眼睛暴露于光中包括白光、蓝光、无赤光、近红外光或红外光。

[0095] 在不同实施方案中，致盲性眼病的存在通过RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块内的FAF图案所指示。在不同实施方案中，致盲性眼病的存在通过在RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块内或附近或与其接近或远离所述斑块或者在所述斑块缺乏下出现的FAF图案所指示。在一些实施方案，所述图案为曲线、带状、网状、椭圆形、圆形、扇形、晕圈以及靶样病灶中的一种或多种。在不同实施方案中，致盲性眼病的存在通过RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块边界内的FAF图案所指示。在一些实施方案，所述图案为曲线、带状、网状、椭圆形、圆形、扇形、晕圈以及靶样病灶中的一种或多种。在不同实施方案中，致盲性眼病的存在通过远离RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块处出现的或者在其缺乏下出现的FAF图案所指示。在一些实施方案，所述图案为曲线、带状、网状、椭圆形、圆形、扇形、晕圈以及靶样病灶中的一种或多种。

[0096] 在不同的其它实施方案中，致盲性眼病的存在通过截面图案或横向图案所指示。在一些实施方案中，使用OCT观察所述图案。在一些实施方案，所述图案为RPE和/或外视网膜损失或者视网膜下空间内发现的隆起、三角形、峰或尖峰。

[0097] 在其它实施方案中，所述方法进一步包括在施用测试化合物之前观察眼睛的步骤。在一些实施方案中，此观察建立眼睛的一个或多个施用前特性。

[0098] 在另一个实施方案中，本文所述的方法包括在施用测试化合物之前施用荧光化合物。在另一个实施方案中，本文所述的方法不包括施用(i)另一个量的荧光化合物给动物或者(ii)第二种荧光化合物给动物。在其它实施方案中，本文所述的方法包括在施用测试化合物之前施用毒素和/或在施用荧光化合物之前施用毒素。

[0099] 在另一个实施方案中，本文所述的方法包括施用(i)另一个量的毒素给动物或者(ii)第二种毒素给动物。在又一个实施方案中，本文所述的方法包括施用(i)另一个量的毒素给动物、(ii)第二种毒素给动物或者(iii)被认为影响毒素作用机制的化合物。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括观察眼组织萎缩斑块或者组织损失斑块的形成、生长或扩大的速度的减小。

[0100] 在一些实施方案中，候选化合物适用于治疗、预防致盲性眼病或者减小其发病率。在其它实施方案中，鉴别多种候选化合物。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括比较多种候选化合物在治疗致盲性眼病中的有用性以及基于所述比较选择先导化合物。

[0101] 在另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防干性AMD的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的式I化合物：

[0102]

[0103] 或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。在一个实施方案中，式I化合物为宾达利特。

[0104] 在另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防干性AMD的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。

[0105] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。在不同实施方案中，所述另外的治疗剂为以下一种或多种：抗血管内皮生长因子(VEGF)剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂或部分激动剂或组合的PPAR-α/γ激动剂、肾素抑制剂、类固醇以及调节自噬的试剂。

[0106] 在一些实施方案中，干性AMD可通过高荧光FAF区域在受试者眼中的存在、和/或一个或多个异常荧光FAF区域在受试者眼中的存在、和/或通过在受试者眼内的蓝色光谱眼底成像、白光眼底成像、无赤光眼底成像以及OCT中的一种或多种的改变、和/或通过穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加(包括暂时性增加)、和/或通过外视网膜的变形、和/或穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的中间视网膜血管相对于未患病状态的变形、和/或通过穿过受试者RPE的吞噬免疫细胞相对于未患病状态的存在来确定。

[0107] 在一些实施方案中，所述干性AMD为早期AMD或萎缩性干性AMD。

[0108] 在其它实施方案中，受试者为人。在其它实施方案中，施用为口服或血管内或眼内或眼周或眼表面实现的。

[0109] 在另一方面，本发明提供一种治疗RPD疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。在一个实施方案中，式I化合物为宾达利特。

[0110] 在又一方面，本发明提供一种用于治疗RPD疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。

[0111] 在一些实施方案中，本文所述的方法包括减少假性玻璃疣在受试者体内的量和/或减少假性玻璃疣在受试者眼内的中心凹区域、中心凹周区域、近中心凹区域(juxtafoveal area)以及中心凹外区域中任一个区域的量。在其它实施方案中，本文所述的方法包括减小进展到晚期疾病的速度，其中晚期疾病为脉络膜新生血管或地图状萎缩中任一种。在一些实施方案中，本文所述的方法包括减小地图状萎缩扩大的速度。

[0112] 在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用另外的治疗剂。在不同实施方案中，所述另外的治疗剂为以下一种或多种：抗VEGF剂、ACE抑制剂、PPAR-γ激动剂或部分激动剂或组合的PPAR-α/γ激动剂、肾素抑制剂、类固醇以及调节自噬的试剂。

[0113] 在其它实施方案中，RPD疾病可通过视网膜成像的不同图案的一个或多个区域在受试者眼内的存在(其中视网膜成像为白光、无赤光、蓝光、FAF、近红外(NIR)、红外(IR)、血管造影以及DNIRA中的一种或多种)和/或一个或多个异常荧光FAF区域在受试者眼内的存在、和/或穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加(包括暂时性增加)、和/或穿过受试者RPE的吞噬免疫细胞相对于未患病状态的存在。

[0114] 在其它实施方案中，受试者为人。在其它实施方案中，施用为口服或血管内或眼内或眼周或眼表面实现的。

[0115] 在其它实施方案中，本发明提供式I化合物甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐单独或与另外的治疗剂组合在制造适用于治疗或预防一种或多种致盲性眼病的药物中的用途。

[0116] 在又一个方面，本发明提供一种用于鉴别患有致盲性眼病并且很可能响应于使用试剂的治疗的受试者的方法，所述方法包括确定受试者的眼睛穿过在眼睛的脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态是否有所增加(包括暂时增加)或先前已增加；其中所述渗透性的增加指示所述受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗；并且其中所述试剂选自甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或和式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0117] 在一个实施方案中，式I化合物为宾达利特。在一些实施方案中，致盲性眼病为干性AMD和RPD疾病中的一种或多种。

[0118] 在又一方面，本发明提供一种用于鉴别很可能响应于使用试剂的治疗的致盲性眼病受试者的方法，所述方法包括确定受试者的眼睛相对于未患病状态是否具有穿过RPE的吞噬免疫细胞(任选地，源于视网膜或源于RPE)的存在，其中吞噬免疫细胞的存在指示受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗；并且其中所述试剂选自甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或和式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0119] 在一个实施方案中，式I化合物为宾达利特。在一些实施方案中，致盲性眼病为干性AMD和RPD疾病中的一种或多种。在其它实施方案中，吞噬免疫细胞通过DNIRA进行测量。

[0120] 在另一方面，本发明提供一种用于确定受试者的致盲性眼病是否响应于使用抑制受试者免疫细胞功能的试剂的治疗的方法，所述方法包括检测免疫细胞在受试者眼睛中的存在、检测其缺乏或测量其数量，其中受试者眼睛响应于具有约600nm至约900nm的波长的光而发出荧光。在一些实施方案中，光具有约400nm至约900nm的波长。

[0121] 在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用有效量的荧光化合物，其中检测或测量在施用所述荧光化合物之后至少一天进行。在一些实施方案中，检测或测量在向受试者施用有效量的荧光化合物之后至少一天进行。

[0122] 在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括检测或测量受试者眼内的FAF的步骤。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括将FAF图案与免疫细胞在受试者眼内的存在、缺乏或数量相关联的步骤。

[0123] 在其它实施方案中，致盲性眼病为AMD、中心性浆液性视网膜病(CSR)或RPD疾病。在一些实施方案中，受试者为人。

[0124] 在不同实施方案中，受试者眼睛发出具有约750nm至约950nm的波长的荧光。在一些实施方案中，所述荧光化合物为ICG。

[0125] 在一些实施方案中，检测或测量在施用荧光化合物之后约一天或约七天或约三十天进行。

[0126] 在一些实施方案中，本文所述的方法不进一步包括施用(a)另一个量的荧光化合物或者(b)第二种荧光化合物。

[0127] 在其它实施方案中，检测或测量包括进行cSLO、FAF、DNIRA或OCT。

[0128] 在一些实施方案中，免疫细胞为受试者先天性免疫系统的细胞和/或巨噬细胞和/或小胶质细胞。

[0129] 定义

[0130] 以下定义与本文所公开的发明组合使用。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。

[0131] 当与化合物和/或候选化合物组合使用时“有效量”为有效于提供致盲性眼病例如像AMD和/或RPD的可测量的治疗、预防或其发病率的减小的量。

[0132] 当与荧光化合物组合使用时“有效量”为允许光学检测的量。

[0133] 当与式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐组合使用时“有效量”为有效于治疗或预防干性AMD和/或RPD疾病(例如，提供可测量的治疗、预防或发病率的减小)的量。

[0134] 当与另外的治疗剂组合使用时“有效量”为有效于单独或与式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐组合来治疗或预防干性AMD和/或RPD疾病(例如，提供可测量的治疗、预防或发病率的减小)的量。“与…组合”包括在相同组合物内施用和通过单独的组合物施用；在后一种情况下，另外的治疗剂在式I化合物试剂、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐发挥其预防或治疗作用的时间期间有效于治疗或预防病状，或者反之亦然。

[0135] 当与毒素例如碘酸钠组合使用时“有效量”为有效于诱导如本文所述的可测量的眼组织萎缩的量。

[0136] 如果试剂提供致盲性眼病的治疗、预防或其发病率的减小，则所述试剂“适用于治疗致盲性眼病”。

[0137] 术语“致盲性眼病”是指多种眼科疾病之一并且包括眼睛和眼附属器的疾病。术语“致盲性眼病”包括例如本文所述的病症(例如，作为非限制实例，AMD和RPD)。

[0138] 术语“新血管形成”是指在异常组织或异常位置中的新血管形成。

[0139] 术语“VEGF”是指诱导血管生成或血管生成过程的血管内皮生长因子，包括但不限于增加的渗透性。如本文所用的术语“VEGF”包括通过例如VEGF-A/VPF基因的可变剪接引起的VEGF的各种亚型(也被称为血管通透因子(VPF)和VEGF-A)，包括VEGF121、VEGF165和VEGF189。此外，如本文所用的术语“VEGF”包括VEGF相关的血管生成因子如PIGF(胎盘生长因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及VEGF-E，它们通过同源VEFG受体(即，VEGFR)起作用以诱导血管生成或血管生成过程。术语“VEGF”包括结合VEGF受体例如VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)或VEGFR-3(FLT-4)的生长因子类别的任何成员。术语“VEGF”可用于指示“VEGF”多肽或“VEGF”编码基因或核酸。

[0140] 术语“抗VEGF剂”是指部分或完全减小或抑制VEGF的活性或产生的试剂。抗VEGF剂可直接或间接诱导或抑制特异性VEGF如VEGF165的活性或产生。此外，“抗VEGF剂”包括作用于VEGF配体或其同源受体以便减少或抑制VEGF有关的受体信号的试剂。“抗VEGF剂”的非限制性实例包括靶向VEGF核酸的反义分子、核酶或RNAi；防止VEGF与其同源受体结合的抗VEGF适体、抗VEGF抗体至VEGF本身或其受体或可溶性VEGF受体诱饵；靶向同源VEGF受体(VEGFR)核酸的反义分子、核酶或RNAi；结合同源VEGFR受体的抗VEGFR适体或抗VEGFR抗体；以及VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。

[0141] 术语“抗-RAS剂”或“抗肾素血管紧张素系统剂”是指部分或完全减小或抑制肾素血管紧张素系统(RAS)分子的活性或产生的试剂。“抗-RAS”或“抗肾素血管紧张素系统”分子的非限制性实例为血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂以及肾素抑制剂中的一种或多种。

[0142] 术语“类固醇”是指属于或涉及以下说明性化合物家族的化合物：皮质类固醇、矿物质类固醇(mineralicosteroid)以及性类固醇(包括例如可能的雄激素或雌激素或抗雄激素或抗雌激素分子)。在这些中包括例如泼尼松龙，强的松、泼尼松、甲基-泼尼松龙、去炎松、氟轻松、醛固酮、螺内酯、达那唑(另外称为OPTINA)以及其它。

[0143] 术语“过氧化物酶体增殖物活化受体γ剂”或“PPAR-γ剂”或“PPARG剂”或“PPAR-γ剂”是指直接或间接作用于过氧化物酶体增殖物活化受体的试剂。这种试剂还影响PPAR-α“PPARA”活性。

[0144] 术语“调节自噬的试剂”是指细胞存活、细胞死亡、存活、自噬、增殖、再生等的调节剂。

[0145] 术语“单核细胞趋化蛋白-1”或“MCP-1”是指在单核细胞募集到损伤和感染位点中起作用的小可诱导基因(SIG)的成员。

[0146] 如本文所用术语“烷基”除非另外定义，否则是指源于从烷烃上去除氢原子的直链或支链饱和基团。代表性直链烷基包括但不限于，-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基以及正己基。代表性支链烷基包括但不限于，异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、新戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基以及1,2-二甲基丙基。

[0147] 如本文所用“一个/一种(a/an)”或“所述”可意指一个或多于一个。此外，当与参考数字指示组合使用时术语“约”意指所述参考数字指示加上或减去该参考数字指示的10％。例如，语言“约50”包括45至55的范围。

[0148] 如本文所提及的，所有组成百分比是按总组合物的重量计的，除非另外指定。如本文所用词语“包括”以及其变型意图为非限制性的，以使得列出的详述条目不排除也适用于此技术的材料、组合物、设备或方法的其它类似条目。类似地，术语“可以”和“可”以及其变型意图为非限制性的，以使得可以或可包括某些元件或特征的实施方案的详述不排除不包含那些元件或特征的本技术的其它实施方案。

[0149] 尽管作为术语如包括、含有或具有的同义词的开放性术语“包含”在本文中用于描述和要求保护本发明，但是本发明或其实施方案可以可选地使用替代性术语如“由…组成”或“主要由…组成”进行描述。

[0150] DNIRA

[0151] 在不同实施方案中，本发明涉及使用本领域已知的各种技术进行的光学成像。例如，此类技术包括但不限于cSLO、FAF、血管造影术、OCT(包括此类的三维重构)。在本发明的不同实施方案中，将眼睛暴露于光中包括进行cSLO、FAF、DNIRA、血管造影或OCT。在不同实施方案中，所述成像为DNIRA。在不同实施方案，可使用任何以上技术的组合。

[0152] 对于DNIRA，适合于荧光检测的化合物(包括近红外染料(NIR)，如ICG)当以无毒剂量给予时可标记RPE并且因此当在此之后的数天或数周使用ICG激发/发射滤光器查看时使得它为可视化的。重要的是，在此之后的数天和数周的此可视化可为未重新施用染料的。因此，在一些方面，DNIRA技术的中心部分处于其时间内。这不同于ICG或其它血管造影染料的目前用途，它们紧接着在注射之后、在运送阶段期间或者在注射之后即时的几分钟至几小时进行查看，以确定染料的血管内定位以及其即时外渗。

[0153] 在一个实施方案中，DNIRA可涉及适合于荧光检测的化合物的施用，作为非限制性实例，在使用引起地图状萎缩扩大的毒素或其它试剂(例如NaIO3)施用之前约一天或多天进行的ICG(以及任选地血管造影术)，并且任选随后在约一天或多天(或约一周或约一月或约三月)施用另一个量NaIO3或引起地图状萎缩扩大的另一种试剂。例如，引起地图状萎缩扩大的其它激发(例如，作为初始或第二次或第三次或第四次施用)可为细胞存活、细胞死亡、存活、自噬、增殖、再生等的调节剂。

[0154] 地图状萎缩的扩大为美国食品和药品管理局(FDA)批准的临床试验设计的主要结果，并且因此本发明使得动物模型内的地图状萎缩的观察、具体地为地图状萎缩的扩大的观察成为可能，因此允许临床前疾病模型与临床试验设计之间的相关性。在本发明之前不能明确确定动物眼内的地图状萎缩或地图状萎缩的扩大已排除临床前研究与临床观察之间的直接相关性。

[0155] 在一些实施方案中，适用于荧光检测的化合物适用于使用不同荧光波长进行成像。在一些实施方案中，这些波长的范围为从可见光到红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光以及近红外光。在一些实施方案中，所述染料为近红外光染料。在一些实施方案中，所述染料为ICG。

[0156] 在一些实施方案中，在施用之后约1天或约2天或约3天或约4天或约5天或约6天或约7天或约10天或约14天或约21天进行DNIRA(和/或观察到延迟的近红外荧光(DNIRF))。在一些实施方案中，在施用之后至少1天或施用之后至少2天或至少3天或至少
4天或至少5天或至少6天或至少7天或至少10天或至少14天或至少21天进行DNIRA。
在其它实施方案中，在施用之后至少约24小时或至少约7天或至少约30天或至少60天或至少90天进行DNIRA。在其它实施方案中，DNIRA在施用之后至少约2个月或约3个月或约4个月或约5个月或最大约6个月进行。在一些实施方案中，DNIRA不在运送阶段(即，染料在流过眼血管并流入眼组织内时的首次通过)期间或在此之后的几分钟进行。

[0157] 在一些实施方案中，使用cSLO实现可视化。在一些实施方案中，使用白光和适当滤光器实现可视化。在一些实施方案中，ICG激发/发射滤光器为795nm(激发)/810nm(发射)滤光器。在一些实施方案中，ICG激发/发射滤光器为约795nm(激发)/约810nm(发射)滤光器。

[0158] RPE为起到眼特化光感受器视杆细胞和视锥细胞的“营养细胞”功能的重要上皮单层。在不希望受到理论约束的情况下，致盲性眼病例如像AMD和RPD与RPE的异常有部分因果关系。

[0159] DNIRA使得可以明确确定动物眼内的体内RPE层。此外，用于检测人眼内的RPE的前沿技术FAF可能由于荧光团如脂褐素的相对缺乏而为无效的或不太有效的。人眼内的FAF成像在刺激/发射滤光器存在下使用非相干光的蓝色光谱或者相干蓝光进行并且可确定缺乏RPE的区域(例如，弱荧光信号)或异常RPE的区域(例如，高荧光信号)。在所述滤光器缺乏下，不能明确确定动物眼内的RPE已排除临床前研究与临床观察之间的直接相关性。

[0160] 因此，在本发明的不同方面，提供使得用于致盲性眼病临床前研究的动物眼内的RPE层可视化的方法DNIRA。

[0161] 此外，如本文所述的DNIRA或其变型允许可视化动物眼内的荧光免疫细胞。在一些实施方案中，DNIRA可任选地不包括毒素施用。

[0162] 此外，如本文所述的DNIRA或其变型允许可视化人受试者眼内的荧光免疫细胞。在具有人受试者的一些实施方案中，DNIRA可以不包括毒素施用。

[0163] 致盲性眼病

[0164] 致盲性眼病是指多种眼科疾病之一并且包括眼睛和眼附属器的疾病。

[0165] 在不同实施方案中，使用DNIRA或本领域已知的技术评价和/或确定致盲性眼病。说明性技术包括：cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维以及正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维以及正面查看)、血管造影术或包括其它荧光波长的其它成像形态。在一些实施方案中，这些波长的范围为从蓝光到红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光、红外光。

[0166] 在不同实施方案中，致盲性眼病通过RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块内的FAF图案评价和/或确定。在一些实施方案，所述图案为曲线、带状、网状、椭圆形、圆形、扇形、晕圈以及靶样病灶中的一种或多种。

[0167] 在不同实施方案中，通过RPE损害或损失或外视网膜损失的斑块边界内的FAF图案评价和/或确定致盲性眼病。在一些实施方案，所述图案为曲线、带状、网状、椭圆形、圆形、扇形、晕圈以及靶样病灶中的一种或多种。

[0168] 在不同的其它实施方案中，致盲性眼病通过截面图案或横向图案评价和/或确定。在一些实施方案中，使用OCT观察所述图案。在一些实施方案，所述图案为RPE和/或外视网膜损失或者视网膜下空间内发现的隆起、三角形、峰或尖峰。

[0169] 在其它实施方案中，致盲性眼病通过高荧光FAF区域在受试者眼内的存在、和/或一个或多个异常荧光FAF区域在受试者眼内的存在、和/或通过受试者眼内的蓝色光谱眼底成像、白光眼底成像、无赤光眼底成像和OCT中的一种或多种的改变、和/或通过穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加(例如，暂时性增加)、和/或通过外视网膜的变形、和/或穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的中间视网膜血管相对于未患病状态的变形、和/或通过穿过受试者RPE的吞噬免疫细胞相对于未患病状态的存在来评价和/或确定。说明性改变包括在两个不同时间点和/或实验或临床条件下在相同或不同受试者和/或动物体内的成像图案的差异。例如，改变可包括相同受试者和/或动物的两个评价之间的成像数据改变和/或第一受试者和/或动物的成像数据与第二受试者和/或动物的成像数据之间的改变。

[0170] 在其它实施方案中，致盲性眼病通过视网膜成像的不同图案的一个或多个区域在受试者眼内的存在(其中视网膜成像为白光、无赤光、蓝光、FAF、近红外(NIR)、红外(IR)、血管造影以及DNIRA中的一种或多种)、和/或一个或多个异常荧光FAF区域在受试者眼内的存在、和/或穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加(例如，暂时性增加)、和/或穿过受试者RPE的吞噬免疫细胞相对于未患病状态的存在来评价和/或确定。

[0171] 在不同实施方案中，致盲性眼病为AMD。AMD在发达国家是失明的主要原因。早期AMD的特征在于疾病的标志玻璃疣的积累，虽然地图状萎缩(GA)和脉络膜新生血管(CNVM)分别为晚期非渗出性(所谓“干性”或萎缩)和渗出性(所谓“湿性”或新生血管)疾病的致盲性并发症。抗VEGF疗法具有湿性AMD的彻底治疗，但是仅代表所有AMD病例的12％-15％。尽管微生物补充可减慢进展速度，对于干性AMD不存在治疗。

[0172] 在不同实施方案中，致盲性眼病为早期非渗出性或“干性”AMD。早期非渗出性或“干性”AMD的特征可在于玻璃疣积累和相关特征如色素沉着改变或RPE剥离。晚期或后期干性AMD的特征可在于RPE和上覆光感受器的斑块萎缩。这些斑块在临床上被可视化为所谓“窗样缺陷”并且被称为“地图状萎缩”的区域。

[0173] 在不同实施方案中，致盲性眼病为湿性AMD。湿性AMD的特征在于在视网膜或RPE下方的新血管的生长，所述视网膜或RPE可流血和渗漏流体，以在大多数情况下导致迅速且通常严重的中心视力损失。此中心视力损失通过损害阅读、开车和识别人脸的能力不利地影响人们每一天的生活。在一些情况下，黄斑变性从干性形式进展到湿性形式。

[0174] 在一个实施方案中，致盲性眼病为渗出性或湿性AMD。在一个实施方案中，致盲性眼病与脉络膜新生血管(CNVM)有关。

[0175] 在一些实施方案中，AMD使用用于空间映射(例如，二维、上面等)内源性、天然或病理出现的眼底荧光团的体内成像方法FAF进行检测或评价。在一些实施方案中，在不希望受到理论约束的情况下，FAF成像允许RPE的体内可视化并且可有助于更好地理解其在脉络膜视网膜病症和视网膜色素上皮病变(epitheliopathy)的病理中的代谢性变化。FAF为本领域已知的(参见，例如，Bellman等Br J Ophthalmol2003 87:1381-1386，该文献的内容以引用的方式并入本文)。

[0176] 在一些实施方案中，AMD和/或RPE损害或损失也可通过其它波长的光(包括白光、蓝光、近红外光、红外光)进行可视化，并且可见为“窗口缺陷”，通过它可查看脉络膜。在一些实施方案中，AMD和/或RPE损害或损失也可通过cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态进行可视化。

[0177] 在一些实施方案中，在晚期干性AMD中，地图状萎缩区域被清楚地可视化为弱荧光区域或深色FAF。在一些实施方案中，这些代表其中失去RPE的区域。

[0178] 在一些实施方案中，干性AMD可通过高荧光FAF区域在受试者眼内的存在来确定。在一些实施方案中，可通过高荧光FAF区域的存在确定的干性AMD为进展性早期或晚期干性AMD。在一些实施方案中，高荧光FAF是指可通过正常密度的脂褐质或脂褐质样材料的增强的可视化或组织脂褐素含量的增加引起的增加的荧光性。脂褐素包括蛋白质的混合物，具有或没有脂质，它的组分在适当波长的蓝光照射下发出荧光。脂褐素样荧光也可出现在此光谱中并且可归因于除脂褐素及其成分之外的分子。

[0179] 脂褐素样荧光可出现在RPE细胞和除RPE细胞例如像免疫系统细胞(例如，吞噬免疫细胞)之外的细胞内。

[0180] 在其它实施方案中，AMD可通过异常FAF图案在受试者眼内的存在来确定。在一些实施方案中，异常荧光FAF是指偏离受试者眼内观察到的正常荧光FAF图案。在正常FAF中，使用cSLO或改进的眼底照相机，视神经乳头由于缺乏RPE(并因此没有脂褐素)而为深色(黑色)的并且血管也为深色的，因为它们阻断来自下方RPE单层的荧光。在中心黄斑区域中，FAF信号通过由黄体色素吸收蓝光来减小。当评价异常荧光的存在时，可考虑正常蓝光FAF的这些特征。

[0181] 在一些实施方案中，与AMD和其它致盲性疾病有关的高荧光FAF可显示二维空间图案，这可为复合的。在一些研究中，高荧光FAF的这些图案与疾病从早期疾病进展到晚期(新生血管或萎缩)疾病的速度相关联。这些图案为本领域理解的(参见，例如，Schmitz-Valc kenberg等Survey of Ophthalmology.2009年1月-2月；54(1):96-117；Bindewald等British Journal of Ophthalmology.2005年7月；89(7):874-8；Holz等Am.J Ophthalmology.2007年3月；143(3):463-72，这些文献的内容在此以引用的方式整体并入本文)。

[0182] 在一些实施方案中，所述干性AMD为早期AMD或萎缩性干性AMD。

[0183] 在一些实施方案中，干性AMD处于其晚期阶段并且其特征可在于高荧光或异常荧光FAF区域在预先存在的地图状萎缩边界和/或邻近区域(在所谓交界区域)中的存在。

[0184] 在一些实施方案中，干性AMD处于其晚期阶段并且其特征可在于在预先存在的地图状萎缩缺乏下高荧光或异常荧光FAF区域的存在。在这些实施方案中，在不希望受到理论约束的情况下，它可预测RPE的进一步损失。

[0185] 在一些实施方案中，早期和晚期干性AMD的特征可在于免疫细胞(例如，吞噬免疫细胞)的存在。免疫细胞的存在由摘除术之后或解剖之后的眼样品推测。如本文所述的，在一些实施方案中，使用DNIRA评估免疫细胞的存在。

[0186] 在一些实施方案中，可使用本文所公开的方法评价、治疗或预防诸如“弥漫性滴漏”的图案。弥漫性滴漏为本领域已知的(参见，例如，Schmitz-Valckenberg等Survey of Ophthalmology.2009年1月-2月；54(1):96-117；Bindewald等British Journal of Ophthalmology.2005年7月；89(7):874-8；Holz 等Am.J Ophthalmology.2007年3 月；143(3):463-72，这些文献的内容在此以引用的方式整体并入本文)。

[0187] 在一些实施方案中，干性AMD可通过穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加(例如，暂时性增加)来确定。这不同于血管(内皮)渗透性。例如，这可使用血管造影术看出。

[0188] 在一些实施方案中，可使用DNIRA、例如使用碘酸钠(NaIO3)确定RPE毒性、RPE损失和干性AMD。类似于地图状萎缩的区域可通过例如组织分析(例如，通过观察RPE细胞标志物如RPE65的损害和/或双核细胞染色的损失)和/或体内使用NaIO3处理的眼睛的DNIRA进行检测。在一些实施方案中，RPE毒性、RPE损失和干性AMD使用在即将发生的组织损失区域和/或其边缘内显示高荧光FAF信号(这可为复合的)的FAF来确定。此复合高荧光FAF信号在NaIO3处理之后几天或几周发展为FAF图案，所述图案可为复合的并且可包括但不限于带状、曲线、鱼形、扇形、交错、分支或网状高荧光。此类图案模拟临床干性AMD中发现的那些图案。此FAF也可为弱荧光。

[0189] 此外，单独使用血管造影或者使用血管造影作为DNIRA(在此之前立即进行或者与此同时进行血管造影术)的一部分，改变的FAF区域的出现可证明穿过脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性的增加(包括暂时性增加)(例如像，通过可在成像之前注射的染料的渗漏观察到的；此类染料包括ICG)。此屏障通常包括内脉络膜、Bruch氏膜、RPE细胞以及可能的与RPE和外限制性膜结合的外部光感受器的构造。在不希望受到理论约束的情况下，此特化的上皮屏障的暂时性损坏可为以下事件顺序的基础：包括外视网膜、光感受器层的折叠、起伏或变形和/或炎症细胞从脉络膜到视网膜下空间内的移动/迁移。然而，在一些实施方案中，此阶段可为暂时性的和已消退的或者在一定程度上为亚临床的。

[0190] 在一些实施方案中，干性AMD可通过穿过受试者视网膜色素上皮(RPE)的免疫细胞(例如，吞噬免疫细胞或先天性免疫细胞)相对于未患病状态的存在(例如，流入)来确定。当炎症细胞从脉络膜移动/迁移到视网膜下空间或者从内视网膜移动/迁移到外视网膜或视网膜下空间时，在摘除的眼睛或切离的组织中此类细胞可通过本领域已知的染色方法确定。在NaIO3模型中，Iba1染色可用于检测免疫系统的活化细胞。此外，这些细胞的存在可通过与例如NaIO3制备物进行比较来确认，其中已进行单核细胞/巨噬细胞耗竭。这种耗竭为本领域已知的并且可使用例如氯化钆(GAD)或氯膦酸盐进行处理来实现。在一些实施方案中，免疫细胞的存在(例如，流入)通过使用DNIRA进行体内测量和/或测定。在本发明之前，此类体内可视化在临床环境中是不可能的。

[0191] 此外，巨噬细胞为可在受试者细胞中鉴别的免疫细胞的实例，它可被分类为以下亚组：经典地(M1)或可选地(M2)活化巨噬细胞(参见，例如，Laskin,Chem Res Toxicol.2009年8月17日；22(8):1376-1385，所述文献的内容在此以引用的方式整体并入本文)。在不希望受到理论约束的情况下，M1巨噬细胞通过标准机制如IFNγ、LPS和TNFα活化，而M2巨噬细胞通过替代机制如IL-4、IL-13、IL-10和TGFβ活化。在不希望受到理论约束的情况下，M1巨噬细胞展示细胞毒性促炎症表型，而M2巨噬细胞抑制免疫反应和炎症反应的一些方面并且参与创伤修复和血管生成。在一些实施方案中，本发明包括抑制、调节或极化M1和M2巨噬细胞中的一种或多种。

[0192] 在一些实施方案中，干性AMD可通过受试者眼内的蓝色光谱眼底成像、白光眼底成像、无赤光眼底成像以及OCT中的一种或多种的改变来确定。在一些实施方案中，干性AMD可通过cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态来确定。说明性改变包括在两个不同时间点和/或实验或临床条件下在相同或不同受试者和/或动物体内的成像图案的差异。例如，改变可包括相同受试者和/或动物的两个评价之间的成像数据改变和/或第一受试者和/或动物的成像数据与第二受试者和/或动物的成像数据之间的改变。

[0193] 在一些实施方案中，所述AMD可通过OCT确定。在一些实施方案中，截面图像示出浅隆起或锥形或尖峰样信号在视网膜下空间内的存在。三维或正面OCT成像揭示带状或曲线、椭圆形、圆形、晕圈或靶样信号。在一些实施方案中，观察到截面图案或横向图案并且所述截面图案或横向图案包括RPE和/或外视网膜损失(萎缩)或视网膜下空间内发现的隆起、三角形、峰或尖峰。在不同实施方案中，这些特性指示AMD。

[0194] 本发明进一步提供用于治疗或预防RPD疾病的方法，所述疾病也被称为，但不限于以下各项：“网状玻璃疣样疾病”、“假网状玻璃疣”和“玻璃疣样黄斑病变”或者“特征在于视网膜下玻璃疣样沉积物的存在的疾病”。

[0195] 在一些实施方案中，所述RPD疾病为其中假玻璃疣样物质减少或去除或者其积累和/或扩大在治疗时有所减慢。在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗RPD疾病的方法，其中在受试者眼内的中心凹区域和/或中心凹周区域和/或近中心凹区域内的假玻璃疣在治疗时减少或去除。

[0196] 在一些实施方案中，本发明进一步提供用于治疗或预防RPD疾病的方法，其中从早期疾病进展到晚期疾病的速度有所减小。晚期疾病可包括例如脉络膜新生血管或地图状萎缩。

[0197] 在一些实施方案中，本发明进一步提供用于治疗或预防RPD疾病的方法，其中地图状萎缩扩大的速度有所减小。

[0198] 在一些实施方案中，所述RPD疾病可通过FAF或包括其它荧光波长的其它成像形态确定。在一些实施方案中，这些波长的范围为从蓝光到红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、近红外光以及红外光。

[0199] 在一些实施方案中，所述RPD疾病可通过高荧光和/或异常荧光FAF区域的存在或者包括其它荧光波长的其它成像形态确定。在一些实施方案中，这些波长的范围为从蓝光到红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、近红外光以及红外光。在一些实施方案，所述RPD疾病可通过使用DNIRA确定。

[0200] 在一些实施方案中，所述RPD疾病可使用白光、蓝光、FAF以及近红外光和红外光中的至少一种或至少两种或至少三种或至少四种来确定。在一个特定实施方案中，所述RPD疾病可通过蓝光确定。

[0201] 在一些实施方案中，所述RPD疾病可通过OCT确定。在一些实施方案中，截面图像示出浅隆起或锥形或尖峰样信号在视网膜下空间内的存在。三维或正面OCT成像揭示带状或曲线、椭圆形、圆形、晕圈或靶样信号。

[0202] 在一些实施方案中，所述RPD可通过穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的增加(例如，暂时性增加)来确定。这不同于血管(内皮)渗透性。例如，使用包括例如RPE毒性的碘酸钠(NaIO3)模型的DNIRA，可以形成可通过例如组织分析(例如，通过观察RPE细胞标志物如RPE65的损失和/或双核细胞染色的损失)检测的RPE损害或损失的地图状区域。此外，NaIO3处理的RPE的FAF成像示出在即将发生的组织损失区域内和/或其边缘处的高荧光FAF信号(这可为复合的)。此高荧光FAF信号在NaIO3处理之后几天或几周发展为FAF图案(这可为复合的)，所述图案可包括但不限于带状、曲线、鱼形、扇形、交错、分支或网状高荧光。此类图案模拟临床RPD中发现的那些图案。

[0203] 此外，在DNIRA、在此之前立即进行或者与此同时进行的血管造影术中，改变的FAF区域的出现证明穿过脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性的增加(包括暂时性增加)(例如，通过可在成像之前注射的染料的渗漏观察到的；此类染料包括ICG)。此屏障通常包括内脉络膜、Bruch氏膜、RPE细胞以及可能的与RPE和外限制性膜结合的外部光感受器的构造。在不希望受到理论约束的情况下，此特化上皮屏障的暂时性损坏可允许以下的事件顺序：包括光感受器层的折叠、起伏或变形。然而，在一些实施方案中，此阶段可为暂时性的和已消退的或者在一定程度上为亚临床的。

[0204] 在一些实施方案中，所述RPD可通过穿过受试者视网膜色素上皮(RPE)的免疫细胞(例如，吞噬免疫细胞)相对于未患病状态的存在(例如，流入)来确定。在一些实施方案中，使用DNIRA检测和/或测量免疫细胞的存在(例如，流入)。当炎症细胞从脉络膜移动/迁移到视网膜下空间或者从内视网膜移动/迁移到外视网膜或视网膜下空间时，可通过染色确定此类细胞，如本领域所已知的。例如，使用NaIO3模型，Iba1染色可用于检测免疫系统的活化巨噬细胞。此外，这些细胞的存在可通过与NaIO3制备物进行比较来确认，其中已进行单核细胞/巨噬细胞耗竭。这种耗竭为本领域已知的并且可使用例如氯化钆(GAD)或氯膦酸盐进行处理来实现。此外，巨噬细胞为在受试者细胞中鉴别的吞噬免疫细胞的实例，它可被分类为以下亚组：经典地(M1)或可选地(M2)活化巨噬细胞(参见，例如，Laskin,Chem Res Toxicol.2009年8月17日；22(8):1376-1385，所述文献的内容在此以引用的方式整体并入本文)。在不希望受到理论约束的情况下，M1巨噬细胞通过标准机制如IFNγ、LPS和TNFα活化，而M2巨噬细胞通过替代机制如IL-4、IL-13、IL-10和TGFβ活化。在不希望受到理论约束的情况下，Ml巨噬细胞展示细胞毒性促炎症表型，而M2巨噬细胞抑制免疫反应和炎症反应的一些方面并且参与创伤修复和血管生成。例如，在一些实施方案中，本发明包括抑制、调节或极化M1和M2巨噬细胞中的一种或多种。

[0205] 在一些实施方案中，RPD疾病可通过受试者眼内的蓝色光谱眼底成像、白光眼底成像、无赤光眼底成像以及OCT中的一种或多种的改变来确定。在一些实施方案中，所述RPD疾病可通过cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态来确定。说明性改变包括在两个不同时间点和/或实验或临床条件下在相同或不同受试者和/或动物体内的成像图案的差异。例如，改变可包括相同受试者和/或动物的两个评价之间的成像数据改变和/或第一受试者和/或动物的成像数据与第二受试者和/或动物的成像数据之间的改变。

[0206] 在另一个实施方案中，致盲性眼病为LORD(晚发作型视网膜变性)或与clqTNF5缺陷或其对应基因突变有关的视网膜变性或者另一种黄斑病，包括但不限于，Stargart病、模式营养不良(pattern dystrophy)以及色素性视网膜炎(RP)和相关疾病。在一个实施方案中，所述黄斑病为遗传性的。

[0207] 在其它实施方案中，致盲性眼病为以下特发性病症：在不希望受到理论约束的情况下，其特征可在于视网膜炎症，其具有或没有伴随的黄斑变性，包括但不限于，白点综合征(例如，匐行性脉络膜视网膜病、匐行性视网膜病、急性后多病灶盾鳞状色素上皮病(APMPPE)、多发性易消散白点综合征(MEWDS)、急性带状潜隐性外视网膜病(AZOOR)、点状内层脉络膜病(PIC)以及弥漫性视网膜下纤维化(DSF))。

[0208] 在其它实施方案中，致盲性眼病为中心性浆液性视网膜病(CSR)。CSR为黄斑层从其支撑组织上流体剥离。CSR的特征通常在于流体渗漏并积累到视网膜下或RPE下空间内。在不希望受到理论约束的情况下，流体的渗漏和积累可由于RPE的小破裂而发生。

[0209] 在一些实施方案中，致盲性眼病中的一种或多种可通过高荧光和/或异常荧光FAF区域的存在或者从350nm至1,000nm的其它波长的光来确定。在一些实施方案中，致盲性眼病中的一种或多种可使用DNIRA确定。

[0210] 在一些实施方案中，致盲性眼病中的一种或多种可通过例如cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态来确定。

[0211] 在一些实施方案中，致盲性眼病可为某一阶段或者进展中。在一些实施方案中，致盲性眼病可为初期、出现、静止、晚期或活性。

[0212] 除治疗预先存在的致盲性眼病之外，本发明包括预防性方法以便防止或减慢这些病症的发作。在预防性应用中，可向易于罹患特定致盲性眼病或者另外处于所述疾病的危险下的受试者施用一种试剂。这种易于罹患可通过例如家族特质、基因检测、危险因素分析、血液或其它细胞毒素或生物标志物水平以及眼部检查来确定，这可包括多模式分析如FAF、蓝光、白光、无赤光、近红外光、红外光、DNIRA等。这种易于罹患还可通过例如经由使用截面、三维和正面查看的OCT进行检测来确定。

[0213] 除已限定治疗的已知致盲性眼病之外，本发明包括使用波长范围为300nm至1,000nm的光进行体内成像的特定图案，所述光包括白光、蓝光、FAF、红外光、近红外光、DNIRA或通过使用截面、三维和正面查看的OCT。在针对体内成像的特定图案的应用中，可向易于罹患特定致盲性疾病或者另外处于所述疾病的危险下的受试者施用一种试剂。此诊断或易于罹患可通过例如眼科检查、家族特质、基因检测、危险因素分析以及血液或其它细胞毒素或生物标志物水平来确定，这可包括多模式分析如FAF、蓝光、白光、无赤光、近红外光、红外光、DNIRA等。这种易于罹患还可通过例如经由使用截面、三维和正面查看的OCT进行检测来确定。

[0214] 本发明的试剂

[0215] 在不同方面，本发明提供候选化合物和/或测试化合物的鉴别和用途。在提供候选化合物和/或测试化合物的鉴别和用途的实施方案中，候选化合物和/或测试化合物可为化学物、分子、化合物、生物物质(例如，抗体或肽)、药物、前体药物、细胞治疗剂、低分子量合成化合物或小分子药物。在一些实施方案中，候选化合物和/或测试化合物选自本领域已知的化合物库。在一些实施方案中，候选化合物适用于治疗致盲性眼病、预防致盲性眼病或者减小致盲性眼病的发病率。

[0216] 在不同方面，本发明提供一种用于治疗或预防干性AMD和/或RPD的方法。在一些实施方案中，式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐也与另外的治疗剂一起施用，所述治疗剂包括例如以下一种或多种：抗VEGF剂、ACE抑制剂、PPAR-γ激动剂或部分激动剂、肾素抑制剂、类固醇以及调节自噬的试剂、以及塞马莫德、MIF抑制剂、CCR2抑制剂、CKR-2B、2-硫代咪唑、CAS 445479-97-0、CCX140、氯膦酸盐、氯膦酸盐-脂质体制剂或氯化钆。

[0217] 在不同方面，本发明提供鉴别很可能响应于使用试剂(“本发明的试剂”)的治疗的致盲性眼病受试者和/或确定受试者的致盲性眼病是否响应于使用试剂的治疗。

[0218] 在一些实施方案中，本发明的试剂为式I化合物：

[0219]

[0220] 或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0221] 在不同实施方案中，R1和R2独立地为氢、甲基或乙基。

[0222] 在一些实施方案中，R1和R2独立地为甲基或乙基。

[0223] 在一些实施方案中，R1和R2为甲基。

[0224] 在一些实施方案中，R3为氢、甲基或乙基。

[0225] 在一些实施方案中，R3为氢。

[0226] 在一些实施方案中，具体地为在R3为氢的情况下，式I化合物为药学上可接受的盐形式。

[0227] 在一些实施方案中，R1和R2为甲基并且R3为氢。在这些实施方案中，式I化合物为2-((1-苄基吲唑-3-基)甲氧基)-2-甲基丙酸，也被称为2-甲基-2-[[1-(苯基甲基)-1H-吲唑-3基]甲氧基]丙酸。这种化合物通常被称为宾达利特并且具有以下结构：

[0228]

[0229] 宾达利特的合成详细描述于美国专利号4,999,367中，所述专利在此以引用的方式整体并入本文。

[0230] 宾达利特为MCP-1产生的体外和体内抑制剂，并且在不希望受到理论约束的情况下，其在动物炎症模型中的有利作用可与此抗MCP-1活性有关(参见，Mirolo等Eur Cytokine New 2008；19:119-122)。宾达利特还已显示选择性抑制MCP-2和MCP-3的产生(参见，Mirolo等Eur Cytokine Netw 2008；19:119-122)。

[0231] 在一些实施方案中，本发明的试剂为甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。甲氨蝶呤具有以下结构：

[0232]

[0233] 甲氨蝶呤也被称为其IUPAC名(2S)-2-[(4-{[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基](甲基)氨基}苯甲酰)氨基]戊二酸；被称为“MTX”并且被称为“氨甲蝶呤”。甲氨蝶呤钠在美国通过处方获得。甲氨蝶呤的合成已描述于美国专利4,080,325，所述专利在此以引用的方式整体并入本文。

[0234] 在另一个实施方案中，本发明的试剂为巨噬细胞极化调节剂。巨噬细胞极化的说明性调节剂包括过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPAR-g)调节剂，包括例如激动剂、部分激动剂、拮抗剂或组合PPAR-γ/α激动剂。

[0235] 在一些实施方案中，PPARγ调节剂为完全激动剂或部分激动剂。在一些实施方案中，PPARγ调节剂为噻唑烷二酮药物类别的成员(TZD或格列酮)。作为非限制性实例，PPARγ调节剂可为以下一种或多种：罗格列酮(AVANDIA)、吡格列酮(ACTOS)、曲格列酮(REZULIN)、萘格列酮(netoglitazone)、来格列酮、环格列酮、罗丹宁。在一些实施方案中，PPARγ调节剂为厄贝沙坦和替米沙坦中的一种或多种。在一些实施方案中，PPARγ调节剂为非类固醇类抗炎药(NSAID，例如像布洛芬)和吲哚类。已知抑制剂包括实验性药物GW-9662。PPARγ调节剂的其它实例描述于WIPO公布号WO/1999/063983、WO/2001/000579、Nat Rev Immunol.2011年10月25日；11(11):750-61或者为使用WO/2002/068386的方法鉴别的药物，这些专利和文献的内容在此以引用的方式整体并入本文。

[0236] 在一些实施方案中，PPARγ调节剂为“双重”或“平衡”或“泛”PPAR调节剂。在一些实施方案中，PPARγ调节剂为结合两种或更多种PPAR亚型的格列扎(glitazar)，例如莫格他唑(Pargluva)和替格列扎(Galida)和阿格列扎。

[0237] 在另一个实施方案中，本发明的试剂为如Bianchi等(1995年3月)Molecular Medicine(Cambridge,Mass.)1(3):254-266所述的塞马莫德(CNI-1493)，所述文献的内容在此以引用的方式整体并入本文。

[0238] 在另一个实施方案中，本发明的试剂为迁移抑制因子(MIF)抑制剂。说明性MIF抑制剂描述于WIPO公布号WO 2003/104203、WO 2007/070961、WO 2009/117706和美国专利号7,732,146和7,632,505以及7,294,7537294753中，这些专利的内容在此以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，MIF抑制剂为(S,R)-3-(4-羟基苯基)-4,5-二氢-5-异噁唑乙酸甲酯(ISO-1)、异噁唑啉、p425(J.Biol.Chem.,287,30653-30663)、环氧基印苦楝二酮(epoxyazadiradione)或维生素E。

[0239] 在另一个实施方案中，本发明的试剂为趋化因子受体2(CCR2)抑制剂，所述抑制剂描述于例如美国专利和专利公布号：US 7,799,824、US 8,067,415、US2007/0197590、US 2006/0069123、US 2006/0058289以及US 2007/0037794中，这些专利的内容在此以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，CCR2)抑制剂为马拉维若(Maraviroc)、cenicriviroc、CD192、CCX872、CCX140、2-((异丙基氨基羰基)氨基)-N-(2-((顺-2-((4-(甲硫基)苯甲酰)氨基)环己基)氨基)-2-氧乙基)-5-(三氟甲基)-苯甲酰胺、维克利诺(vicriviroc)、SCH351125、TAK779、Teijin、RS-504393、化合物
2、化合物14或化合物19(Plos ONE 7(3):e32864)。

[0240] 在不同的特定实施方案中，本发明的试剂为以下一种或多种：CKR-2B、2-硫代咪唑、CCR2拮抗剂(CAS 445479-97-0)以及CCX140。

[0241] 在另一个实施方案中，本发明的试剂为氯膦酸盐。在另一个实施方案中，所述试剂为如Barrera等Arthritis and Rheumatism,2000,43,第1951-1959页所述的氯膦酸盐脂质体制剂，所述文献的内容在此以引用的方式整体并入本文。

[0242] 在又一个实施方案中，本发明的试剂为螯合或未螯合形式的钆，例如氯化钆(GAD)。

[0243] 在不同实施方案中，本发明的试剂为抗VEGF剂。适用于本方法的抗VEGF剂的非限制实例包括雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普(aflibercept)、KH902VEGF受体-Fc、融合蛋白、2C3抗体、ORA102、哌加他尼(pegaptanib)、贝伐西尼(bevasiranib)、SIRNA-027、紫花前胡素、紫花前胡醇、足叶苦素、香胶甾酮、PLG101、类二十烷酸LXA4、PTK787、帕唑帕尼、阿西替尼、CDDO-Me、CDDO-Imm、紫草素、β-羟基异戊酰基紫草素、神经节苷脂GM3、DC101抗体、Mab25抗体、Mab73抗体、4A5抗体、4E10抗体、5F12抗体、VA01抗体、BL2抗体、VEGF相关蛋白、sFLT01、sFLT02、肽B3、TG100801、索拉非尼、G6-31抗体、融合抗体以及结合VEGF表位的抗体。适用于本方法的抗VEGF剂的另外的非限制性实例包括特异性结合以下一种或多种的物质：人血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、人血管内皮生长因子-B(VEGF-B)、人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、人血管内皮生长因子-D(VEGF-D)以及人血管内皮生长因子-E(VEGF-E)、以及结合VEGF表位的抗体。

[0244] 在一个实施方案中，抗VEGF剂为抗体雷珠单抗或其药学上可接受的盐。雷珠单抗为在商标LUCENTIS下商购获得的。在另一个实施方案中，抗VEGF剂为抗体贝伐单抗或其药学上可接受的盐。贝伐单抗为在商标AVASTIN下商购获得的。在另一个实施方案中，抗VEGF剂为阿柏西普或其药学上可接受的盐。阿柏西普为在商标EYLEA下商购获得的。在一个实施方案中，抗VEGF剂为哌加他尼或其药学上可接受的盐。哌加他尼为在商标MACUGEN下商购获得的。在另一个实施方案中，抗VEGF剂为结合VEGF表位、例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E的表位的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，VEGF拮抗剂与VEGF表位结合以使得VEGF和VEGFR的结合受到抑制。在一个实施方案中，所述表位包括显示的VEGF三维结构的部分，以使得所述表位暴露于折叠VEGF分子的表面上。在一个实施方案中，所述表位为来自VEGF的线性氨基酸序列。

[0245] 在不同实施方案中，本发明的试剂为肾素血管紧张素系统(RAS)抑制剂。在一些实施方案中，肾素血管紧张素系统(RAS)抑制剂为血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂和肾素抑制剂中的一种或多种。

[0246] 适用于本发明的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的非限制性实例包括但不限于：阿拉普利、阿曲普利(alatriopril)、阿速普利(altiopri l)钙、血管紧张肽转化酶抑制肽(ancovenin)、苯那普利、盐酸苯那普利、贝那普利拉、benzazepril、苯甲酰卡托普利、卡托普利、半胱氨酸卡托普利、谷胱甘肽卡托普利、西那普利、塞拉普利(ceranopril)、西罗普利、西拉普利、西拉普利拉、converstatin、地拉普利、地拉普利二酸、依拉普利(enalapril)、依那普利拉、依那吉仑、依那普利(ena pril)、环氧卡托普利(epicaptopril)、甲羟米辛(foroxymithine)、福森普利(fosfenopril)、福森普利(fosenopril)、福森普利钠、福辛普利、福辛普利钠、福辛普利拉、福森普利酸、格来普利(glycopril)、血啡肽(he morphin)-4、idapril、咪达普利、吲哚普利、indolaprilat、赖苯普利、赖诺普利、枸杞素(lyciumin)A、枸杞素B、米安普利(mixanpril)、莫昔普利、莫昔普利拉、莫维普利、胞壁色因A、胞壁色因B、胞壁色因C、喷托普利、培哚普利、培哚普利拉、匹伐普利、匹伏普利、喹那普利、喹那普利盐酸盐、喹普利拉、雷米普利、雷米普利拉、螺普利、螺普利盐酸盐、螺普利拉、spiropril、螺普利盐酸盐、替莫普利、替莫普利盐酸盐、替普罗肽、群多普利、群多普利拉、乌替普利、扎普利、扎普利拉、佐芬普利、佐芬普利拉、其药学上可接受的盐，以及其混合物。

[0247] 适用于本发明的血管紧张素受体阻滞剂的非限制性实例包括但不限于：厄贝沙坦(美国专利号5,270,317，所述专利在此以引用的方式整体并入本文)、坎地沙坦(美国专利号5,196,444和5,705,517，所述专利在此以引用的方式整体并入本文)、缬沙坦(美国专利号5,399,578，所述专利在此以引用的方式整体并入本文)以及洛沙坦(美国专利号5,138,069，所述专利在此以引用的方式整体并入本文)。

[0248] 适用于本发明的肾素抑制剂的非限制性实例包括但不限于：阿利吉仑、地替吉仑、依那吉仑，瑞米吉仑、特拉吉仑、环丙吉仑以及占吉仑、其药学上可接受的盐以及其混合物。

[0249] 在不同实施方案中，本发明的试剂为类固醇。在一些实施方案中，类固醇为属于或涉及以下说明性化合物家族的化合物：皮质类固醇、矿物质类固醇以及性类固醇(包括例如可能的雄激素或雌激素或抗雄激素或抗雌激素分子)。在这些中包括(作为非限制性实例)泼尼松龙，强的松、泼尼松、甲基-泼尼松龙、去炎松、氟轻松、醛固酮、螺内酯、达那唑(另外称为OPTINA)以及其它。

[0250] 在不同实施方案中，本发明的试剂为调节自噬、微自噬、线粒体自噬或其它形式的自噬的试剂。在一些实施方案中，候选药物和/或化合物为以下一种或多种：西罗莫司、他克莫司(tacrolimis)、雷帕霉素、依维莫司、巴佛洛霉素、氯喹、羟氯喹、spautin-1、二甲双胍、哌立福辛、白梨芦醇、曲古抑菌素、丙戊酸氯酸、Z-VAD-FMK或本领域已知的其它试剂。在不希望受到理论约束的情况下，调节自噬、微自噬、线粒体自噬或其它形式的自噬的试剂可改变细胞内组分的再循环，例如但不限于细胞器、线粒体、内质网、脂质或其它。在不希望受到理论约束的情况下，此试剂可以或可以不通过微观有关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)起作用。

[0251] 荧光化合物

[0252] 在一些实施方案中，荧光化合物适用于使用不同荧光波长进行成像。在一些实施方案中，这些波长的范围为从可见光到红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光以及近红外光。在一些实施方案中，所述染料为近红外光染料。在一些实施方案中，所述染料为ICG。

[0253] 在一些实施方案中，荧光化合物适用于使用不同荧光波长进行成像。在一些实施方案中，这些波长的范围为从可见光到红外光，例如约390nm至约1mm，包括例如蓝光、白光以及近红外光。在一些实施方案中，吸收为从约390nm至约1mm。在一些实施方案中，发射为从约390nm至约1mm。

[0254] 在一些实施方案中，荧光化合物吸收波长为约600nm至约900nm的光和/或发射波长为约750nm至约950nm的光。

[0255] 在一些实施方案中，所述染料为近红外光染料。在一些实施方案中，所述染料为ICG。在一些实施方案中，ICG激发/发射滤光器为795nm(激发)/810nm(发射)。

[0256] 在一些实施方案中，荧光化合物例如染料(包括ICG)的剂量为荧光化合物的有效量。在不同实施方案中，ICG的剂量为每kg动物约0.1mg至约10mg。在一些实施方案中，剂量为每kg动物约0.1、或约0.3、或约0.5、或约1.0、或约2.0、或约3.0、或约4.0、或约5.0、或约6.0、或约7.0、或约8.0、或约9.0、或约10.0mg。

[0257] 在不同实施方案中，荧光化合物或其代谢物可引起出现于RPE细胞和/或免疫细胞内的荧光。

[0258] 在其它实施方案中，本文所述的方法不包括施用(i)另一个量的荧光化合物给动物或者(ii)第二种荧光化合物给动物。

[0259] 毒素

[0260] 在一些实施方案中，提供一种已知影响眼组织(包括但不限于RPE或视网膜)的毒素。

[0261] 在一些实施方案中，所述毒素为以下一种或多种：铝、氨基苯氧基烷烃(非限制性实例包括但不限于对于大鼠的l,4-双(4-氨基苯氧基)-2-苯基苯)、阳离子两亲性药物/三环抗抑郁剂(非限制性实例包括但不限于胺碘酮、氯阿米替林、氯苯丁胺、氯丙咪嗪、丙咪嗪、伊普吲哚、各种氨基糖苷类以及其它阳离子两亲性化合物)、去铁敏、盐酸dl-(对-三氟甲基苯基)异丙胺、氟化物(例如，氟化钠)、碘酸盐(非限制性实例包括但不限于碘酸钠或碘酸钾)、碘乙酸盐、铅、甲醇和甲酸、4,4'-亚甲基二苯胺、N-甲基-N-亚硝基脲、萘、萘酚、硝基苯胺(N-3-吡啶甲基-N'-对-硝基苯脲/硝基苯胺/pyriminil)、有机磷酸酯(非限制性实例包括但不限于乙拌磷(ethylthiometon)、倍硫磷(fenthion)以及杀螟硫磷(fenitrothion))、草酸盐(非限制性实例包括但不限于草酸二丁酯)、吩噻嗪类(非限制性实例包括但不限于哌啶基氯代吩噻嗪、硫利达嗪(chlorpromazine)以及氯丙嗪)、喹啉(非限制性实例包括但不限于氯喹和羟基氯喹)、链脲霉素、牛磺酸缺乏、尿烷、由金属螯合物引起的锌缺乏以及其衍生物和变体。

[0262] 在一些实施方案中，所述毒素为碘酸盐。在一些实施方案中，所述毒素为碘酸钠或碘酸钾。

[0263] 在一些实施方案中，所述毒素诱导眼组织萎缩。在不同实施方案中，所述萎缩包括坏死和/或细胞凋亡。在不同实施方案中，包括坏死和/或细胞凋亡的所述萎缩为RPE细胞。在一些实施方案中，毒素减少或改进自噬。在一些实施方案，所述毒素诱导地图状萎缩和/或地图状萎缩的扩大。在一些实施方案，毒素诱导以上提到的作用中的一种或多种。

[0264] 在一些实施方案中，毒素施用一次、或两次、或三次。在一些实施方案中，毒素施用一次、或两次、或三次、或四次、或五次。在一些实施方案中，第二、或第三、或第四、或第五次施用是在第一次的约1天、或1周、或1个月内。

[0265] 在一些实施方案中，施用的毒素可为本文所述试剂中的一种或多种。在不同实施方案中，第二、或第三、或第四、或第五次脉冲为自噬、细胞存活、细胞死亡、增殖、再生等的调节剂，如本文所述和本领域已知的。

[0266] 在另一个实施方案中，本文所述的方法包括施用(i)另一个量的第一毒素给动物和/或(ii)第二种毒素给动物。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括观察眼组织萎缩斑块或者组织损失斑块的形成、生长或扩大的速率的减小。

[0267] 在不同实施方案中，毒素的剂量为本领域技术人员已知的。例如，适合的剂量范围可为约0.1mg/kg至约100mg/kg受试者体重，例如，约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、约1.9mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约
50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg体重，包括它们之间的所有值和范围。

[0268] 在一个实施方案中，毒素为NaIO3并且剂量为约50mg/kg体重。在一个实施方案中，毒素为NaIO3并且剂量为约45mg/kg体重。在一个实施方案中，毒素为NaIO3并且剂量为约30mg/kg体重。

[0269] 药学上可接受的盐和赋形剂

[0270] 本文所述的任何试剂可以具有可与无机酸或有机酸反应的足够碱性官能团或可与无机碱或有机碱反应以形成药学上可接受的盐的羧基。药学上可接受的酸加成盐可由药学上可接受的酸形成，如本领域已熟知的。此类盐包括以下列出的药学上可接受的盐：Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977) 和 The Handbook of Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Verlag,Zurich(Switzerland)2002，这些文献在此以引用的方式整体并入本文。

[0271] 药学上可接受的盐包括(作为非限制性实例)硫酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐(glucaronate)、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、双羟萘酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻-乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二羧酸盐，己炔-1,4-二羧酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐以及酒石酸盐。

[0272] 术语“药学上可接受的盐”还指示具有酸性官能团(如羧酸官能团)的本发明的化合物与碱的盐。适合的碱包括但不限于，碱金属如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属如钙和镁的氢氧化物；其它金属如铝和锌的氢氧化物；氨和有机胺，如未取代或羟基取代的单-、二-或三-烷基胺、二环己基胺；三丁胺；吡啶；N-甲基、N-乙胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-OH-低级烷基胺)，如单-、双-或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁胺或者三-(羟甲基)甲胺；N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺，如N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；以及氨基酸，如精氨酸、赖氨酸等。

[0273] 在一些实施方案中，本发明的试剂为药学上可接受的盐的形式。在一些实施方案中，药学上可接受的盐为钠盐。在一些实施方案中，具体地为在式I化合物的R3为氢的情况下，式I化合物为药学上可接受的盐形式。在一些实施方案中，式I化合物为宾达利特的药学上可接受的盐。在一些实施方案中，甲氨蝶呤为药学上可接受的盐形式。在一些实施方案中，甲氨蝶呤的药学上可接受的盐为甲氨蝶呤钠。

[0274] 此外，本文所述的任何试剂可作为包含药学上可接受的载体或媒剂的组合物的组分施用给受试者。此类组合物可任选地包含适合的量的药学上可接受的赋形剂以便提供用于适当施用的形式。

[0275] 药物赋形剂可为液体，如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些油，例如，花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。药物赋形剂可为生理盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等。此外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂以及着色剂。在一个实施方案中，药学上可接受的赋形剂当施用给受试者时为无菌的。当静脉内施用本文所述的任何试剂时，水为有用的赋形剂。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体赋形剂，特别是用于注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、胶态二氧化硅、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。需要时，本文所述的任何试剂也可包含微量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。

[0276] 制剂、施用以及给药

[0277] 本文所述的任何试剂可采用溶液、混悬液、乳液、眼内注射、玻璃体内注射、局部滴眼液、结膜下注射、眼球筋膜囊下注射、经巩膜制剂、片剂、丸剂、小丸、胶囊、包含液体的胶囊、散剂、缓释制剂、栓剂、乳剂、气溶胶、喷雾剂、混悬剂或适用于使用的任何其它形式的形式。在一个实施方案中，所述组合物适用于玻璃体内注射(参见，例如ILUVIEN或类似形式)或输注(参见，例如RETISERT或类似形式)。在一个实施方案中，所述组合物为胶囊形式(参见，例如，美国专利号5,698,155)。适合的药物赋形剂的其它实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro编辑，第19版，1995)，所述文献以引用的方式并入本文。

[0278] 在一个实施方案中，本文所述的任何试剂被配制用于眼部施用，包括例如玻璃体内或眼内施用和/或静脉内施用。通常，用于施用的组合物包含无菌等渗含水缓冲液。在必要时，所述组合物还可包含增溶剂。而且，所述试剂可使用本领域已知的适合媒剂或递送装置递送。本文所列出的组合疗法可在单个递送媒剂或递送装置中共同递送。用于施用的组合物可任选包含局部麻醉剂如利多卡因以在注射位点减轻疼痛。

[0279] 在一个实施方案中，根据常规程序将本文所述的任何试剂配制为适用于眼内施用的组合物。

[0280] 在一个实施方案中，根据常规程序将本文所述的任何试剂配制为适用于向人口服施用的组合物。用于口服递送的组合物可为例如片剂、锭剂、含水或含油混悬剂、颗粒剂、散剂、乳剂、胶囊、糖浆剂或酏剂的形式。口服施用的组合物可包含一种或多种试剂，例如，增甜剂，如果糖、阿斯巴甜或糖精；增味剂，如薄荷、冬青油或樱桃；着色剂；防腐剂，以便提供药学上可接受的可口制剂。此外，其中在片剂或丸剂形式中，可对组合物进行包衣以延迟在胃肠道内的崩解和吸收，从而持续延长的时间段提供持续的作用。在渗透活性驱动的本文所述的任何试剂周围的选择性渗透膜也适用于口服施用的组合物。在这些后面的平台中，来自胶囊周围环境的液体被驱动化合物吸收，所述驱动化合物膨胀以通过孔转移试剂或试剂组合物。这些递送平台可提供基本上零级的递送曲线，这与即释制剂的加标曲线相反。延时材料如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯也可为有用的。口服制剂可包括标准赋形剂，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素以及碳酸镁。在一个实施方案中，所述赋形剂为药用级的。

[0281] 成分是单独或混合在一起以单位剂型(例如作为预混合溶液、干燥冻干粉末或无水浓缩物形式)提供于指示活性剂的量的密闭容器(如安瓿、预填充注射器或药囊)中。在本文所述的任何试剂通过玻璃体内或眼内递送施用的情况下，它可例如使用预填充注射器或注入器进行分配或者分配在用于抽入到适合注射器的安瓿中。在本文所述的任何试剂通过输注施用的情况下，它可例如使用含有无菌药用级的水或生理盐水的输注瓶分配。在本文所述的任何试剂通过注射施用的情况下，可提供注射用无菌水或生理盐水的安瓿以使得在施用前可混合这些成分。

[0282] 本文所述的任何试剂可通过控制释放或持续释放手段或者本领域普通技术人员熟知的递送装置施用。实例包括但不限于美国专利号3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；
5,639,476；5,354,556；以及5,733,556中所述的那些，每份专利以引用的方式整体并入本文。此类剂型可适用于使用例如不同比例的羟丙甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球体或其组合来提供一种或多种活性成分的控制或持续释放，以提供所需的释放曲线。可容易选择本领域技术人员已知的适合的控制或持续释放的制剂(包括本文所述的那些)来与本文所述的试剂的活性成分一起使用。本发明因此提供适用于口服施用的单个单元剂型，例如但不限于适用于控制释放或持续释放的片剂、胶囊、胶囊锭(gelcap)以及囊片(caplet)。

[0283] 活性成分的控制或持续释放可通过不同条件进行刺激，所述条件包括但不限于，pH的改变、温度的改变、通过适当波长的光的刺激、酶的浓度或有效性、水的浓度或有效性或其它生理条件或化合物。

[0284] 可分别根据常规混合、制粒、包衣或聚合方法制备组合物，并且在一个实施方案中，本组合物可包含约0.1％至约99％；并且在另一个实施方案中，包含按重量或体积计约1％至约70％的本文所述的任何试剂。

[0285] 在另一个实施方案中，本文所述的任何试剂当与另一种试剂联合施用时协同地起作用，并且以一些剂量施用，所述剂量低于通常在此类试剂用作单一疗法时采用的剂量。

[0286] 例如，本文所述的任何试剂的剂量以及给药方案可取决于不同参数，包括但不限于，正在治疗的致盲性眼病、受试者总体健康以及施用医师的判断。本文所述的任何试剂可在向有需要的受试者施用另外的治疗剂之前(例如之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、与此同时或者在此之后(例如之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、
3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。在不同实施方案中，本文所述的任何试剂间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔
2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、不超过24小时或不超过48小时施用。在一个实施方案中，包括式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐的本发明的试剂以及一种或多种另外的治疗剂在3小时内施用。在另一个实施方案中，包括式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐的本发明的试剂以及一种或多种另外的治疗剂间隔1分钟至24小时施用。

[0287] 与载体材料混合以产生单个剂型的本文所述的任何试剂的量可根据正在治疗的受试者和施用的具体模式而改变。体外或体内测定可用于帮助确定最佳剂量范围。

[0288] 总之，有用的剂量为本领域技术人员已知的。例如，可参考Physicians,Desk Reference,第66版,PDR Network；2012版(2011年12月27)确定剂量，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。

[0289] 本文所述的任何试剂的剂量可取决于多种因素，包括病状严重性、是否治疗或预防病状以及待治疗的受试者的年龄、体重和健康。另外，关于特定受试者的药物基因组学(基因型对治疗剂的药代动力学、药效动力学或功效曲线的作用)信息可影响所使用的剂量。此外，精确的个人剂量可在某种程度上根据多种因素调节，所述因素包括所施用的特定试剂组合、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速率、所治疗的具体致盲性眼病、病症严重性以及病症解剖学定位。可预期剂量的一些变化。

[0290] 在一些实施方案中，施用为口服或血管内或眼内或眼周或眼表面实现的。

[0291] 当向人眼部施用(例如，玻璃体内的)时，包括例如式I、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐的本发明的试剂和/或另外的治疗剂的量正常为每只眼睛每次施用0.003mg至5.0mg或每只眼睛每次施用0.03mg至3.0mg或每只眼睛每次施用0.1mg至1.0mg。在一个实施方案中，剂量为每只眼睛0.03mg、0.3mg、1.5mg或3.0mg。在另一个实施方案中，剂量为每只眼睛0.5mg。剂量范围可为每只眼睛施用0.01mL至0.2mL或者每只眼睛施用0.03mL至0.15mL或者每只眼睛施用0.05mL至0.10mL。在一个实施方案中，施用为每月400μg化合物，持续至少三个月。

[0292] 通常，当向哺乳动物口服施用时，本文所述的任何试剂的剂量可为0.001mg/kg/天至100mg/kg/天、0.01mg/kg/天至50mg/kg/天或者0.1mg/kg/天至10mg/kg/天。当向人口服施用时，本文所述的任何试剂的剂量正常为每天0.001mg至1000mg、每天1mg至600mg或每天5mg至30mg。在一个实施方案中，口服剂量为每天600mg。在一个实施方案中，口服剂量为每天两次300mg剂量。在另一个实施方案中，口服剂量为每周7.5mg至每周15mg。

[0293] 对于通过胃肠外注射来施用本文所述的任何试剂，剂量正常为每天0.1mg至250mg、每天1mg至20mg或每天3mg至5mg。可每天给予四次注射。通常，当向人口服或胃肠外施用时，本文所述的任何试剂的剂量正常为每天0.1mg至1,500mg、每天0.5mg至10mg或每天0.5mg至5mg。可施用每天高至3000mg的剂量。

[0294] 在一些实施方案中，可能需要向眼睛施用一种或多种本文所述的任何试剂。作为非限制性实例，施用可为眼内、玻璃体内、局部(包括但不限于，滴剂和软膏)、结膜下、眼球筋膜囊下、经巩膜、脉络膜上、视网膜下以及通过离子电渗疗法的。

[0295] 还可使用其它施用途径，例如像：真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、经直肠、经吸入或者局部地，具体地向耳朵、鼻子、眼睛或皮肤施用。

[0296] 施用模式可由从业者判断并且部分取决于医学病状的部位。在大部分情况下，施用引起本文所述的任何试剂释放到血流中。

[0297] 可口服施用本文所述的任何试剂。此类试剂还可通过任何其它常规途径施用，例如通过静脉内输注或快速注射，通过经上皮或粘膜皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可与另外的生物活性剂一起施用。施用可为全身性或局部施用。各种递送系统为已知的，例如脂质体封装、微粒、微型胶囊、胶囊等，并且可用于施用。

[0298] 另外的施用方法包括但不限于，眼内、玻璃体内、眼局部(包括但不限于，滴剂、软膏和插入物)、结膜下、眼球筋膜囊下、脉络膜上、经巩膜、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、经直肠、经吸入或者局部地，具体地向耳朵、鼻子、眼睛或皮肤施用。在一些实施方案中，向眼睛施用多于一种本文所述的任何试剂。作为非限制性实例，施用可为眼内、玻璃体内、局部(包括但不限于，滴剂和软膏)、结膜下、眼球筋膜囊下、经巩膜以及离子电渗疗法。施用模式可由从业者判断并且部分取决于医学病状的部位。在大部分情况下施用引起到血流中的释放。

[0299] 在特定实施方案中，可能希望向需要治疗的区域局部施用。

[0300] 在另一个实施方案中，递送可为囊泡，具体地为脂质体(参见，Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat 等，于 Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer中，Lopez-Berestein和Fidler(编辑),Liss,New York，第353-365页(1989)。在另一个实施方案中，递送可为控制释放系统。在一个实施方案中，可使用缓慢释放眼内装置。在一些实施方案中，此装置由局部递送的易蚀或非易蚀液体、凝胶、聚合物等组成。

[0301] 在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见，Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑 ),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.ScL Rev.MacromoL Chem.23:61；还参见，Levy等，1985,Science 228:190；During等，1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等，1989,J.Neurosurg.71:105)。在另一个实施方案中，控制释放系统可置于待治疗的靶区域例如视网膜附近，因此仅需要一部分全身剂量(参见，例如，Goodson，于Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页(1984))。可使用在Langer,1990,Science 249:1527-1533)的综述中论述的其它控制释放系统。

[0302] 本文所述的任何试剂的施用可独立地为每天一次至四次或者每月一次至四次或者每年一次至六次或者每两年、三年、四年或五年一次。施用可持续一天或一个月、两个月、三个月、六个月、一年、两年、三年的时间并且甚至可持续受试者的一生。在很多情况下将指示慢性的长期施用。所述剂量可作为单次剂量施用或者分为多次剂量。通常，所需剂量应以设定间隔施用延长的时段，通常至少持续几周或几月，尽管可能需要几月或几年或更长的较长施用时段。

[0303] 利用本文所述的任何试剂的给药方案可根据多种因素进行选择，所述因素包括受试者的类型、种族、年龄、体重、性别以及医疗病状；待治疗的病状的严重性；施用途径；受试者肾功能或肝功能；个体的药物基因组学构成；以及采用的本发明的特定化合物。可以单个日剂量施用本文所述的任何试剂或者可以分为每日两次、三次或四次的剂量施用总日剂量。此外，本文所述的任何试剂在整个给药方案内可持续地施用，而不是间歇地施用。

[0304] 治疗方法

[0305] 在不同方面，本发明提供一种用于治疗或预防干性AMD和/或RPD的方法。在这些方面，“本发明的试剂”包括适用于单一疗法和组合疗法(例如，作为另外的治疗剂)二者的化合物。通常，单一疗法包括式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐的使用，而组合疗法包括式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐与另外的治疗剂的组合，所述另外的治疗剂包括以下一种或多种：抗VEGF剂、ACE抑制剂、PPAR-γ激动剂、肾素抑制剂、类固醇、调节自噬PPARγ调节剂的试剂、塞马莫德、MIF抑制剂、CCR2抑制剂、CKR-2B、2-硫代咪唑、CAS 445479-97-0、CCX140、氯膦酸盐、氯膦酸盐-脂质体制剂或氯化钆。

[0306] 本文所公开的任何治疗的评价可包括光学成像，包括(作为非限制性实例)cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态。

[0307] 在一些实施方案中，本文所述的方法包括减少假性玻璃疣在受试者体内的量和/或减少假性玻璃疣在受试者眼内的中心凹区域、中心凹周区域、近中心凹区域以及中心凹外区域中任一个区域的量。在其它实施方案中，本文所述的方法包括减小进展到晚期疾病的速度，其中晚期疾病为脉络膜新生血管或地图样萎缩中任一种。在一些实施方案中，本文所述的方法包括减小地图样萎缩扩大的速度。

[0308] 在一些实施方案中，本文所述的治疗方法包括治疗、预防干性AMD和/或RPD或者减小其发病率。

[0309] 化合物评价方法

[0310] 在一些方面，本发明提供一种用于鉴别候选化合物是否适用于治疗致盲性眼病的方法，所述方法包括(a)向动物施用有效量的测试化合物，所述动物的眼睛包括(i)有效于指示致盲性眼病在动物中的存在的量的荧光化合物和(ii)有效于诱导眼组织萎缩的量的毒素；(b)将眼睛暴露于具有有效地引起荧光化合物发荧光的波长和强度的光；(c)将所述眼睛的荧光图案与包含所述荧光化合物和所述毒素而不含所述测试化合物的动物眼睛的荧光图案进行比较；以及(d)如果步骤(c)的比较结果指示测试化合物适用于治疗致盲性眼病，则选择该测试化合物作为候选化合物。在一些实施方案中，步骤(b)包括将眼睛暴露于具有有效于引起荧光化合物发荧光的波长和强度的光，无论是与荧光化合物的施用同时进行，还是随后施用荧光化合物。

[0311] 在其它实施方案中，比较在施用测试化合物之后至少约24小时或至少约7天或至少约30天或至少60天或至少90天进行。在其它实施方案中，比较在至少约2个月或约3个月或约4个月或约5个月或最大约6个月时进行。在一些实施方案中，所述比较包括在施用有效量的测试化合物之前和之后观察相同动物的眼睛。在一些实施方案中，比较包括在不同条件下(例如，在施用或未施用有效量的测试化合物的情况下)观察不同动物的眼睛。

[0312] 在其它实施方案中，所述方法进一步包括在施用测试化合物之前观察眼睛的步骤。在一些实施方案中，此观察建立眼睛的一种或多种施用前特性。

[0313] 在一些实施方案中，比较和/或观察包括在两种不同条件之间(例如，在施用或不施用有效量的测试化合物的情况下)评价光学成像，所述光学成像包括(作为非限制性实例)cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态。

[0314] 在一些实施方案中，如果化合物提供致盲性眼病的治疗、预防或其发病率的减小，则所述化合物适用于治疗致盲性眼病。

[0315] 在另一个实施方案中，本文所述的方法包括在施用测试化合物之前施用荧光化合物。在另一个实施方案中，本文所述的方法不包括施用(i)另一个量的荧光化合物给动物或者(ii)第二种荧光化合物给动物。

[0316] 在其它实施方案中，本文所述的方法包括在施用测试化合物之前施用毒素和/或在施用荧光化合物之前施用毒素。

[0317] 在其它实施方案中，鉴别多种候选化合物。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括比较多种候选化合物在治疗致盲性眼病中的有用性以及基于所述比较选择先导化合物。在一些实施方案中，先导化合物为多种候选化合物中的优选化合物。

[0318] 在一些实施方案中，比较包括在两种不同条件之间(例如，使用第一候选化合物对比使用第二候选化合物)评价光学成像，所述光学成像包括(作为非限制性实例)cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态。可比较多于两种候选化合物。

[0319] 诊断和预测方法

[0320] 在一些方面，本发明提供一种用于鉴别患有致盲性眼病并且很可能响应于使用试剂的治疗的受试者的方法，所述方法包括确定受试者的眼睛穿过在眼睛的脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态是否有所增加(包括暂时增加)或先前已增加；其中所述渗透性的增加指示所述受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗；并且其中所述试剂选自甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或和式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0321] 在另一方面，本发明提供一种用于鉴别很可能响应于使用试剂的治疗的致盲性眼病受试者的方法，所述方法包括确定受试者的眼睛相对于未患病状态是否具有穿过RPE(和/或从内视网膜)的吞噬免疫细胞的存在(例如，流入)，其中吞噬免疫细胞的存在指示受试者很可能响应于使用所述试剂的治疗，并且其中所述试剂选自甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐或和式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基并且R3为H或C1-C6烷基。

[0322] 在另一方面，本发明提供一种用于确定受试者的致盲性眼病是否响应于使用抑制受试者免疫细胞功能的试剂的治疗的方法，所述方法包括检测免疫细胞在受试者眼睛中的存在、检测其缺乏或测量其数量，其中受试者眼睛响应于具有约600nm至约900nm、或约400nm至约900nm、或约400至约1600nm的波长的光而发出荧光。

[0323] 在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用有效量的荧光化合物，其中检测或测量在施用所述荧光化合物之后至少一天进行。在一些实施方案中，检测或测量在向受试者施用有效量的荧光化合物之后至少一天进行。

[0324] 在一些实施方案中，本文所述的方法包括用于确定受试者的致盲性眼病是否响应于使用抑制受试者免疫细胞功能的试剂的治疗的DNIRA。

[0325] 在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括检测或测量受试者眼内的FAF的步骤。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括将FAF图案与免疫细胞在受试者眼内的存在、缺乏或数量相关联的步骤。在一些实施方案中，本文所述的方法包括FAF与DNIRA数据之间的关联。在一些实施方案中，所述关联为在响应于具有以下波长的光的FAF和受试者眼内荧光中观察到的空间图案：约600nm至约900nm或约400nm至约900nm或约400至约1600nm。

[0326] 在一些实施方案中，高荧光FAF区域或者FAF异常图案可任选地与异常DNIRA区域相一致，所述异常DNIRA区域可为弱荧光或高荧光的。由于异常FAF或高荧光FAF与疾病活动区域相一致并且可预测萎缩区域，在不希望受到理论约束的情况下，在其中DNIRA标记RPE并且在空间上与高荧光FAF或异常FAF相一致的实施方案中，摄取染料(例如，ICG)的吞噬RPE细胞具有异常量的脂褐素或脂褐素样物质。此外，在不希望受到理论约束的情况下，在其中DNIRA标记免疫细胞(例如，吞噬免疫细胞或先天性免疫系统的细胞)并且在空间上与高荧光FAF或异常FAF相一致的实施方案中，摄取染料(例如，ICG)的吞噬免疫细胞具有异常量的脂褐素或脂褐素样物质和/或与具有异常量的脂褐素或脂褐素样物质的细胞相一致。在一些实施方案中，异常FAF与异常DNIRA的共定位可因此确定治疗的细胞靶标。在一些实施方案中，此共定位在疾病的动物模型和人二者中提供靶向免疫细胞以减小、减慢、预防疾病进展的能力。

[0327] 在一些实施方案中，检测或测量在施用荧光化合物之后约一天或约七天或约三十天进行。在其它实施方案中，比较在至少约2个月或约3个月或约4个月或约5个月或最大约6个月进行。在一些实施方案中，比较包括在施用有效量的测试化合物之前和之后观察相同动物的眼睛。在一些实施方案中，比较包括在不同条件下(例如，在施用或未施用有效量的测试化合物的情况下)观察不同动物的眼睛。

[0328] 在一些实施方案中，比较包括在两种不同条件之间(例如，在施用或未施用有效量的测试化合物的情况下)评价光学成像，所述光学成像包括(作为非限制性实例)cSLO、FAF、OCT(包括使用截面、三维和正面查看)、SD-OCT(使用截面、三维和正面查看)或包括其它荧光波长(例如，波长范围为从蓝光至红外光，例如390nm至1mm，包括例如蓝光、白光、无赤光、近红外光或红外光)的其它成像形态。

[0329] 在一些实施方案中，本文所述的方法不进一步包括施用(a)另一个量的荧光化合物或者(b)第二种荧光化合物。

[0330] 受试者和/或动物

[0331] 在一些实施方案中，受试者和/或动物为哺乳动物，例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、羊，或非人灵长类，如猴、猩猩或狒狒。在其它实施方案中，受试者和/或动物为非哺乳动物，例如像，斑马鱼。在一些实施方案中，受试者和/或动物可包括荧光标记的细胞(使用例如GFP)。在一些实施方案中，受试者和/或动物为包含荧光细胞例如像RPE细胞和/或免疫细胞的转基因动物。在一些实施方案中，受试者和/或动物为人。在一些实施方案中，所述人为儿童。在其它实施方案中，所述人为成人。在一些实施方案中，所述人为老人。在其它实施方案中，所述人可被称为患者。

[0332] 在某些实施方案中，人年龄的范围为约0个月至约6个月大、约6至约12个月大、约6至约18个月大、约18至约36个月大、约1至约5岁、约5至约10岁、约10至约15岁、约15至约20岁、约20至约25岁、约25至约30岁、约30至约35岁、约35至约40岁、约40至约45岁、约45至约50岁、约50至约55岁、约55至约60岁、约60至约65岁、约65至约70岁、约70至约75岁、约75至约80岁、约80至约85岁、约85至约90岁、约90至约95岁或约95至约100岁。

[0333] 在其它实施方案中，受试者为非人动物并且因此本发明涉及兽医用途。在一个特定实施方案中，非人动物为家养宠物。在另一个特定实施方案中，非人动物为家禽动物。

[0334] 在不同实施方案中，受试者和/或动物眼睛包含(i)有效于指示致盲性眼病在受试者和/或动物中的存在的量的荧光化合物以及(ii)有效于诱导眼组织萎缩的量的毒素。在一些实施方案中，向受试者和/或动物施用本发明的试剂或者不施用本发明的试剂。

[0335] 在不同实施方案中，评价和/或产生RPE和免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包括受试者和/或动物的先天性免疫系统的细胞。在一些实施方案中，此类细胞包括但不限于巨噬细胞、单核细胞和小胶质细胞。在不同实施方案中，本发明提供检测免疫细胞在受试者和/或动物眼中的存在、检测其缺乏或者测量其数量

[0336] 试剂盒

[0337] 本发明提供可简化本文所述的任何试剂的施用的试剂盒。本发明的示例性试剂盒包括单位剂型的本文所述的任何试剂。在一个实施方案中，单位剂型为容器，例如预填充注射器，它可为无菌的，包含本文所述的任何试剂和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒剂。所述试剂盒可进一步包括指导本文所述的任何试剂的使用的标签或印刷说明书。试剂盒还可包括眼睑窥镜、局部麻醉剂以及用于眼表面的清洁剂。试剂盒还可进一步包括一种或多种本文所述的另外的试剂。

[0338] 在一个实施方案中，试剂盒包括含有有效量的本发明的试剂(包括，例如，式I化合物、甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐)和有效量的另外的治疗剂(如本文所述的那些试剂)的容器。

[0339] 本发明进一步通过以下非限制性实施例进行说明。实施例

[0340] 实施例1：RPE毒素NaIO3的全身注射诱导与AMD和/或RPD的那些图案类似的FAF复合图案

[0341] RPE毒素碘酸钠(NaIO3)在大鼠眼中产生RPE和弱荧光DNIRA的斑块状损失，这与地图状萎缩(GA)相似。此模型不仅发展RPE萎缩，而且它忠实地再生与攻击性临床疾病有关的FAF复合图案，所述疾病最接近于晚期干性AMD、RPD以及弥漫性滴漏形式的干性AMD。

[0342] 材料：ICG(吲哚菁绿(Cardiogreen))、碘酸钠、Harris苏木精以及曙红来自Sigma-Aldrich(Oakville,ON,Canada)。在5％盐酸去氧肾上腺素溶液中的0.8％托品酰胺(Diophenyl-T)来自Sandoz Canada Inc(Boucherville,QC,Canada)，并且GenTeal润滑滴眼液来自Novartis Pharmaceuticals Canada Inc(Dorval,QC,Canada)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的32％多聚甲醛来自Electron Microscopy Sciences(Hatﬁeld,PA)。小鼠抗大鼠CD68抗体来自AbD Serotec(Oxford,UK)，并且小鼠IgG来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)。兔抗-Iba-1来自Wako Pure Chemical Industries Ltd(Osaka,Japan)。Alexa标记的荧光羊抗小鼠二抗同工凝集素IB4缀合物和TO-PRO-3核酸染色来自Invitrogen(Camarillo,CA,USA)。Dako荧光封固培养基来自Dako North America(Burlington,ON,Canada)。

[0343] 动物程序：所有程序均根据加拿大动物照护议会和随附的动物在眼科和视觉研究中使用的ARVO 声明(ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)进行。对于所有实验，将6至10周大的Sprague Dawley(SD)大鼠保持在12小时暗/亮循环下，其中食物和水任意取用。对于评价，用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉大鼠，并且用Diophenyl-T扩张瞳孔。使用GenTeal润滑滴眼液调节眼睛。在单次成像会话之后或在连续成像之后，通过心脏内注射T61(Intervet Canada,Whitby,Canada)人道地处死动物。

[0344] 为每组实验新鲜制备0.9％氯化钠中的碘酸钠(45％溶液)并且注入45mg/kg体重的最终浓度。评价总计192只眼睛。

[0345] 使用可商购获得的共焦激光扫描检眼镜(cSLO,Spectralis,Heide lberg Retinal Angiography,HRA-II；Heidelberg Engineering GmbH,Germany)和眼探测器图像捕获系统版本1.1.10进行眼底成像。对于荧光素血管造影在使用500nm屏障滤光器激发的488nm波长下捕获图像而没有无赤光(RF，绿色为主导)成像的屏障滤光器，对于ICG血管造影则在795/810nm激发/发射，并且对于红外反射成像为830nm激光。

[0346] 为了评价488nm FAF，在荧光素染料缺乏下，进行cSLO成像。在基线或在每次研究期间的任何时间不给予荧光素。在需要同时对血管成像并提供FAF图像分析的界标的情况下，通过尾静脉将ICG以2mg/kg或5mg/kg注入到先前插入的23号尾静脉导管内。在很少明确指示的情况下，如模型的初始特征，静脉内提供荧光素右旋糖酐(200kD)。在动物亚组中进行来自使用荧光素血管造影的这些随后研究的结果并且在FAF分析中不包括所述结果。

[0347] 通常在基线(第0天，即在全身NaIO3注射之前)和在NaIO3的第3或4(3/4)天、在7或8(7/8)天和第13或14(13/14)天获得眼底成像。此外，对于模型的初始特征，在NaIO3之后24小时、在21天至28天以及多至88天(3个月)获取图像。在可能时，按以下顺序获得由至少九张图像组成的复合图像：视神经乳头、右上方、右边、右下方、下方、左下方、左边、左上方以及上方区域。在一些情况下，通常通过按需要相对于cSLO重新比对动物，更多地沿周边获得图像的第二或第三完整环或部分环。相比之下，在其它情况下，其中不能捕获全部的九张图像并且产生部分复合图像。

[0348] 获得高分辨率谱域 OCT 图像 (Envisu R2200VHR Animal SDOIS System,Bioptogen,USA)。以每秒36,000的速率获得扫描，其中在视网膜水平下横向分辨率大约为2.8μm。

[0349] 组织分析：在用Davidson固定剂固定之后，如本领域已知地对石蜡包埋组织进行苏木精和曙红(H&E)组织学分析。使用Nikon Upright E800显微镜观察石蜡包埋的切片。脱蜡和再水化程序之后进行H&E组织处理。

[0350] 对于免疫组织化学，在室温下在TBS中的5％BSA中封闭切片并且使用抗-CD68抗体在4℃下在轻微搅拌下孵育过夜。在冲洗之后，在室温下用二抗将样品孵育2小时并且再次洗涤。对于阴性对照，以与一抗等效的最大分子摩尔浓度使用相同种类的IgG。使用TO-PRO-3复染色核心。

[0351] 共焦和荧光显微镜：使用TCS SL共焦荧光显微镜(Leica Microsystems,GmbH,Wetzlar,Germany)获得图像，并且使用Leica共焦软件捕获和分析图像。也使用直立式落射荧光显微镜(Olympus BX50)在488nm波长的光下查看细胞的自发荧光信号。使用Imaris软件版本7.4.2(Bitplane)进行共焦系列z-部分的3D重构。

[0352] 正常Sprague Dawley大鼠眼睛的FAF和体内血管造影成像产生微弱而均匀的毛玻璃亮光，所述亮光通过封闭RPE荧光并因此出现黑暗的径向布置的视网膜血管中断并且通过视神经乳头(ONH)的中心弱荧光圈中断，其中RPE为缺乏的(图1)。在全身NaIO3注射之后的三天，出现具有高荧光边界的异常荧光或稍微高荧光FAF的单个区域，并且获得离散的岛状物、扇状物或360°环(图1)。岛状物或扇状物一致地位于ONH下方或者在下半视网膜中(图1)。当存在360°环时，它通常包括很多眼底，其中一个边界与ONH相邻、在其周围，并且另一个处于中心视网膜或远视网膜周边。大360°环为最常见的观察到的形状，在用碘酸钠处理的眼睛中102/110(93％)出现(图2)。在所有情况下，岛状物、扇状物或环接近ONH，但不与它相邻(图1至图3)。在超过160只眼睛中证实这些和以下观察。

[0353] 在NaIO3注射之后约4-5天开始，在岛状物、扇状物或环内出现交替的高/弱荧光FAF的标记的网状或曲线图案(图1)。至第7天，此图案为明显的。在小病灶中，它完全填充岛状物或扇状物并且快速出现。在大360°环中，它首先在近端和远端边界为明显的并且持续出现另外几周，由此其曲线部分形成FAF的部分环、椭圆、圆圈、莲座形以及扇形或“爪印”图案(图2)。在一些区域，曲线、圆形或椭圆形合并并且似乎比周围的区域更暗，从而出现为弱荧光FAF的均匀深灰色斑块。随着时间，高荧光网状图案在原位成熟，变成越来越多的颗粒状和越来越不光滑的曲线(图2)。然而，甚至晚至20周(分析的最后时间点)，边界保持其高荧光网状图案并且继续稍微向视网膜周边蠕变。

[0354] 在动物亚组中进行的荧光素血管造影证实，网状图案不与视网膜或脉络膜血管相对应(注意，荧光素-右旋糖酐(488nm染料)不给予经受FAF成像的动物，除非另外指示)(图1)。然而，ICG血管造影揭示在NaIO3之后约两天或三天出现在脉络膜视网膜界面的穿过RPE和BM的渗透性改变，这在空间和时间上与FAF的岛状物、扇状物或环的出现相一致(图1)。此渗透性增加为暂时性的并且至第7天消退，通常评价下一个时间点。视网膜血管不会渗漏。在NaIO3模型中，H&E染色证实流体积累在视网膜下空间内。这也通过超高分辨率OCT进行体内观察。

[0355] 为了确定体内观察到的FAF图案的病理相关性，在白光下在低分辨率下并且通过488nm(用于体内成像的相同波长)的落射荧光显微镜，在没有荧光IHC标记的情况下，查看切离的视网膜整装。根据随后的组织分析，将两台显微镜用于此目的：具有窄激发/发射窗(488/520nm)的落射荧光装置以及具有汞弧灯和长通(而不是带通)滤光器以在用
450-490nm带激发之后提供大于515nm荧光的共焦显微镜的Inverted Leica DM IRE2查看系统。在白光下，整体相当均匀地出现具有一些人工变形的正常大鼠视网膜(图3A)。相比之下，在NaIO3注射之后7天获得的样品中，细微米白色的细网状图案变得清楚的。至第14天，此图案为更清楚的并且看得出与视网膜剪切边最佳示出的小外视网膜褶皱相对应(图
3B)。在488nm荧光下查看的，此相同曲线图案为清楚的。尽管至注射之后第7天为清楚的，增加的自发荧光使得此图案至第14天为更明显的(图3C)。使用较高分辨率落射荧光显微镜，证明此花边曲线图案与自发荧光细胞的空间分布相一致，所述空间分布似乎与外视网膜的沟或褶皱对齐(图3)。

[0356] 图4示出RPD临床特性与NaIO3模型中的组织发现的比较。除罹患RPD的患者的临床OCT成像(显示视网膜下空间内的基底向下的椎体结构)之外，获得彩色和无赤眼底图像(图4)。无赤光图像示出构成RPD的单个假性玻璃疣的小黑点(图4A，顶部图像)。这些使用深灰色覆盖物鉴别。进一步强调，通过圆圈包围的表征RPD的所谓“靶病灶”的存在。这些表现为具有较亮中心的黑点。并行地，在正面和截面中的褶皱外大鼠视网膜的示意图，当错误地着色并提供为黑色和白色图像-“阳性”和“阴性”二者时，似乎与RPD的靶样病灶和晕圈直接相关联。总而言之，这些数据表明，在具有2D正面查看的暗中心的圆圈、晕圈和靶病灶的花边或网状图案内的暗色假性玻璃疣的2D图案与在3D中从体积方面考虑的提高的环和坑相对应。内部假性玻璃疣基质在通过OCT截面表现为锥形或尖峰时由持续性视网膜下炎症带状物组成。在这些结构之间损失的外视网膜表现暗色。这将OCT-定义的假性玻璃疣置于与RPD的黑色斑块相邻。在不希望受到理论约束的情况下，与视网膜的结构畸形的这种相关性进一步解释为何RPD可以几种成像形态可视化并且不限于特定波长如488nm，如果信号为荧光团依赖的，则可单独发生。

[0357] 实施例2：在全身ICG施用之后大鼠眼睛的DNIRA鉴别体内视网膜色素上皮(RPE)层

[0358] 这证明近红外染料ICG可在全身注射之后标记RPE/外视网膜，并因此增强RPE和RPE萎缩的检测。在使用ICG激发/发射滤光器的DNIRA中观察到的改变适用于代替疾病模型中的FAF，以识别RPE/外视网膜损失的区域。

[0359] ICG染料或PBS以0.35mg/kg和5.0mg/kg的剂量全身注射到46只Sprague Dawley大鼠中，并且在注射之前和在此之后第2天、第7天和第21天，使用在适当位置具有795/810nm激发/发射滤光器的共焦扫描激光眼底镜(cSLO)体内评价眼底。进行视网膜电描记法(ERG)以评价可能的毒性。在动物亚组中，注射RPE毒素以诱导RPE损害或损失。

[0360] 确切地说，对于动物研究，根据视力与眼科研究协会(Association for Research in Vision&Ophthalmology)(ARVO)人们在眼科研究中使用动物的指导并且根据St.Michael’s Hospital Animal Care Committee指导处理动物。将6至10周大、重200-300g的46只Sprague Dawley(SD)大鼠保持在12小时暗/亮循环下，其中食物和水任意取用。使用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)的组合麻醉动物，并且使用5％盐酸苯肾上腺素溶液中的0.8％托品酰胺的单个滴眼液扩张瞳孔(Diophenyl-T,Sandoz Canada Inc)。在所有程序期间，将GenTeal润滑滴眼液(Novartis,Canada)重复地应用于角膜表面。

[0361] CSLO：使用可商购获得的 cSLO(Heidelberg RetinalAngiography,HRA-2,Heidelberg Engineering,Germany)获取体内图像。以无赤FAF(488/500nm激发/发射)、NIR通道(830nm)和ICG通道(795/810nm激发/发射)获得图像。

[0362] ICG和荧光素血管造影：在实验之前将ICG染料(Cardiogreen,Sigma，目录号12633)新鲜制备为5.0mg/ml的最终储备浓度。将23-号导管插入尾静脉并且以0.35或
5.0mg/kg的剂量输注ICG染料。在注射之前(基线)、在染料循环期间以及在此之后多至20分钟的不同间隔获取图像。在动物亚组中，通过尾静脉导管注射5.0mg/ml的荧光素-右旋糖酐(200kD)(Sigma，目录号FD2000S)溶液，以获得5.0mg/kg的最终剂量。仅在动物亚组中同时进行ICG和荧光素血管造影，另外不注射荧光素。分别在使用488/500nm和795/810nm的激发和发射滤光器的荧光和ICG通道中获得血管造影图像。对照动物接受PBS。

[0363] DNIRA：在使用ICG血管造影设置(即具有激发/发射滤光器)的ICG注射之后几天和几周获得DNIRA图像，但没有在血管造影之后24小时、48小时、3天、7天、21天和28天再次注射染料。在研究时间进程期间不用再次进行血管造影。

[0364] 毒素施用：在动物亚组(n＝7)中，通过插入尾静脉的23G导管以45mg/kg体重的剂量全身注射RPE毒素NaIO3(Sigma，目录号424064)。在这些动物中，在NaIO3注射之后立即进行0.35mg/kg的ICG血管造影。在ICG和NaIO3注射之后7天进行DNIRA

[0365] 视网膜电描记法(ERG)：使用Espion(DiagnosysLLC,USA)mini-Ganzfeld ERG系统评价接受ICG或PBS的动物。在麻醉之后，在应用GenTeal润滑滴眼液之后，将动物置于2
电静息加热板上并且将金线圈电极置于共焦表面上。在微弱闪光(0.01坎德拉s/m，1.0Hz)
2
短瞄准之后，使用单次明亮闪光(3坎德拉s/m)评价暗视力b-波振幅，我们先前确定持续产生接近于最大b-波振幅的响应。使用Student t-检验比较针对基线的注射后振幅(注射之前)。

[0366] 统计学分析使用ANCOVA回归分析。

[0367] 示出正常Sprague Dawley大鼠眼睛的代表性基线(ICG前)cSLO发现(图5)并且连同PBS-处理的动物(图6A)用作所有实验的正常对照。无赤(即，绿色为主导)成像鉴别视网膜的视神经乳头(ONH)和径向血管(图5A)。低水平的内源性信号也可见于较长波长的NIR通道(830nm)内并且提供与由于较深光渗透而出现的较深脉络膜血管的一些可能的成像相似的ONH和血管图像(图5B)。与人研究一致的，FAF表现为缺乏细节的弱毛玻璃亮光并且通过径向视网膜血管掩盖并且在ONH下为缺乏的(图5C)。然而，这种扩散亮光为非常微弱的。

[0368] 相比之下，对于ICG血管造影，使用适当位置的NIR激发/发射滤光器，在ICG注射之前在眼内没有观察到信号或者观察到可忽略的信号(图5D)。扫描线为清楚的并且血管为几乎不可检测或不可检测的。在超过60只眼睛内观察到这种情况。紧接着在ICG注射之后，在运送阶段期间并且在多至实验端点20分钟之后识别视网膜和脉络膜血管(图5F和图5G的第二图块)。荧光素血管造影还证实正常视网膜血管(图5E)。在野生型SD动物中，使用荧光团没有从血管床中看到渗漏。

[0369] 尽管在ICG血管造影之前的基线图像在NIR刺激下在ICG激发/发射滤光器存在下没有展示信号，在第0天(t＝0)单次注射ICG之后的3天、8天、21天和28天获得的图像证明延迟的和持久的荧光(图5G)。这在使用荧光素-右旋糖酐染料进行血管造影之后进行的类似实验中没有观察到，并且使用适当位置的荧光素血管造影滤光器进行分析(图5H)，其中贯穿整个研究时间进程中相同水平的低注射前荧光为可见的。它在先前ICG注射的缺乏下也没有发生(图6A)。在ICG之后此延迟的NIR荧光的定量分析显示后极中的小斑点的“马赛克”图案，所述图案在正面查看时深至视网膜血管(外部)并且掩盖对脉络膜血管的查看，这表明它位于视网膜与脉络膜之间。所述ONH和乳头周围区域不会发荧光。这些特性与在患者体内以蓝色光谱进行FAF的那些特性相似。确定相同焦平面对于两种荧光技术为最佳的。

[0370] 在ICG注射之后使用DNIRA进行的观察为剂量依赖的(图6)。用于血管造影的初始ICG剂量越高，NIR信号越亮。高剂量5mg/kg需要减少cSLO的增益(灵敏度)以获得适合质量的图像，而低剂量(0.35mg/kg)为不太亮的，并且需要增加增益以获得适合质量的图像。以相同水平的增益获得的比较性图像(图6A、图6B和图6C)证明亮度的剂量依赖性增加。在相同实验中，还确定至第28天，在接受低剂量ICG的动物中斑点图案变暗(图6B)。相比之下，在接受高剂量ICG的动物中，在注射后第3天与第28天之间存在几乎不能感知的差异(图6C)。

[0371] 在没有ICG活化所需要的795/810nm激发/发射滤光器的情况下，830nm的NIR反射成像不会产生使用DNIRA观察的斑点的、剂量依赖和时间依赖的荧光发现。

[0372] 已证明DNIRA鉴别RPE和/或外视网膜复合物，确定DNIRA可用于鉴别RPE的结构异常。DNIRA与RPE毒素NaIO3的全身注射组合使用。NaIO3对RPE细胞有直接毒性的并且导致其损失；在此之后出现上覆光感受器的细胞凋亡。在NaIO3注射之后几天和几周DNIRA鉴别深的弱荧光的地图状(空间)斑块，作为另外的斑点荧光连续背景内的大黑斑块而为明显的。这些弱荧光斑块通过定义的边界限制。此外，随着cSLO的增益增加，通过这些斑块的较亮查看允许脉络膜细节的清晰可视化(图7)。脉络膜血管通过其相对于ONH的复杂性、可变尺寸和非径向图案进行鉴别。相比之下，斑点层掩盖此查看但允许上覆视网膜血管的持续可视化。这些数据与DNIRA检测ICG-标记的RPE/外视网膜层的概念相一致。

[0373] 此外，使用毒性研究证明用于临床前实验的DNIRA的适用性。进行视网膜电描记法，比较针对PBS的高剂量和低剂量全身ICG浓度。这些数据显示与对照动物中记下的改变相比在注射之后的三周内没有b-波振幅的统计学显著改变，并且证明超过使用的剂量范围的DNIRA在脉络膜视网膜疾病的临床前研究中为安全的。虽然高剂量大大超过临床所用的剂量，低剂量以克/体重计与使用传统眼底照相机进行的临床成像的剂量是一致的。

[0374] 实施例3：用于治疗致盲性眼病的化合物的发现

[0375] 已建立模拟致盲性眼病的动物，向这种动物施用测试化合物。

[0376] 使用体内成像(包括荧光检测)确定致盲性眼病的存在。在足以呈现致盲性眼病的特征的时间内或之后，通过观察眼内的荧光确定候选化合物。评价候选化合物减轻或消除如本文所述的致盲性眼病的特征的能力。

[0377] 实施例4：评估化合物对于致盲性眼病的活性

[0378] 已发展模拟致盲性眼病的动物，向这种动物施用候选化合物。

[0379] 使用体内成像(包括荧光检测)确定致盲性眼病的存在。在足以呈现致盲性眼病的特征和候选化合物的活性的时间内或之后，通过观察眼内的荧光评估候选化合物的活性。可评估候选化合物减轻或消除如本文所述的致盲性眼病的特征的能力。

[0380] 实施例5：使用宾达利特治疗干性AMD

[0381] 人受试者，56岁至100岁或更大，罹患干性AMD，如通过以下临床测试中的一种或多种诊断的：临床检查、FAF(任何波长)、近红外和/或红外摄影；荧光血管造影，它允许异常血管过程的鉴别和定位；OCT，它提供光散射介质如人视网膜和脉络膜内的高分辨率、截面或正面图像；以及结构性照明光显微镜，它使用特别指定的高分辨率显微镜设置来分辨小自发荧光结构(脂褐素颗粒)在视网膜色素上皮组织切片内的荧光分布。

[0382] 以每天一次两个300mg口服剂量向受试者施用宾达利特，持续12周。在初始十二周治疗周期之后，评价受试者的临床结果。或者，受试者接受包含宾达利特的媒剂的玻璃体注射，它具有或没有药物递送媒剂。

[0383] 使用本领域熟知的标准视敏度测试确定第一个临床结果。评价受试者从一定距离清楚地看见Snellen视力检查表上的符号和目标的能力。

[0384] 第二个临床结果评估地图状萎缩进展的速度。为了实现此目的，在视网膜成像之前使用1.0％托品酰胺和2.5％苯肾上腺素扩张受试者瞳孔。使用允许同时记录具有两个单独的扫描镜的cSLO和频域光学相干层析成像(SD-OCT)的仪器(例如，Spectralis HRA+OCT；Heidelberg Engineering,Heidelberg,Germany)进行成像，如在Helb等Acta Ophthalmol 2010年12月；88(8):842-9中所述的。采用五种操作模式：白光、无赤光、近红外光、FAF以及OCT。

[0385] 根据标准操作方案获得cSLO图像，所述方案包括获取近红外反射(λ＝815nm)和FAF(λ＝488nm下激发，在500-700nm下发射)图像。使用870nm的照射波长、40,000A-扫描的获取速度以及1.8mm扫描深度进行同时的SD-OCT成像。通过适当中心凹中心或者在RPD情况下接近黄斑的血管弓，对每只眼睛进行两次SD-OCT扫描，一次垂直和一次水平。按需要进行荧光血管造影(λ＝488nm，发射500-700nm，10％荧光素染料)。使用眼底照相机(例如，FF 450Visupac ZK5；Carl Zeiss Meditec AG,Jena,Germany)获得彩色眼底照片。

[0386] 如果有临床结果数据，则所述数据的解释通知进一步治疗的决定。

[0387] 实施例6：使用组合疗法治疗干性AMD

[0388] 人受试者，56岁至100岁或更大，罹患干性AMD，如通过以下临床测试中的一种或多种诊断的：临床检查、白光眼底成像、任何波长的FAF、近红外和/或无赤光摄影、蓝光照明；和/或荧光或ICG血管造影，它允许异常血管过程的鉴别和定位；OCT，它提供光散射介质如人视网膜和脉络膜内的高分辨率、截面、三维或正面图像；以及结构性照明光显微镜，它使用特别指定的高分辨率显微镜或检眼镜设置来分辨小自发荧光结构(脂褐素颗粒、脂褐素样颗粒或其它颗粒)在视网膜色素上皮或其它细胞和细胞层内的荧光分布。

[0389] 以每天一次两个300mg口服剂量向受试者施用宾达利特，持续12周。还每月一次(大约28天)以每只受影响的眼睛0.5mg的剂量向受试者施用雷珠单抗注射。在初始十二周治疗周期之后，评价受试者的临床结果。

[0390] 使用本领域熟知的标准视敏度测试确定第一个临床结果。评价受试者从一定距离清楚地看见Snellen视力检查表上的符号和目标的能力。

[0391] 第二个临床结果评估地图状萎缩进展的速度。为了实现此目的，在视网膜成像之前使用1.0％托品酰胺和2.5％苯肾上腺素或可比较试剂扩张受试者瞳孔。使用允许同时记录cSLO和SD-OCT的仪器(例如，Spectralis HRA+OCT；Heidelberg Engineering,Heidelberg,Germany)进行成像，如在Helb等Acta Ophthalmol 2010年12月；88(8):842-9中所述的。可采用多种操作模式：白光、无赤光、蓝光、近红外光以及OCT。可使用改进的眼底照相机进行类似的分析。

[0392] 根据本领域已知的方案获得cSLO图像，所述方案可包括获取近红外反射(λ＝800-1000nm)和FAF(λ＝280-550nm下激发，在350-700nm下发射)图像。使用例如870nm的照射波长、40,000A-扫描的获取速度以及1.8mm扫描深度进行同时的SD-OCT成像。通过黄斑并且另外或者在RPD的情况下接近黄斑的血管弓，对每只眼睛进行多次SD-OCT扫描。
还可使用其它OCT成像，例如像时间域和扫频域。按需要进行荧光血管造影(λ＝488nm，发射500-700nm，10％荧光素染料)。使用眼底照相机(例如，FF 450Visupac ZK5；Carl Zeiss Meditec AG,Jena,Germany)获得彩色眼底照片。

[0393] 如果有临床结果数据，则所述数据的解释通知进一步治疗的决定。说明性数据分析包括黄斑容积分析和5行光栅。

[0394] 实施例7：响应于试剂的致盲性眼病受试者的检测和/或预测

[0395] 在大鼠眼内使用多模式成像，确定RPE毒素NaIO3的全身注射诱导与患有攻击性形式的干性AMD和/或RPD的患者体内的那些图案类似的FAF复合图案。组织的组织学和荧光显微镜显示FAF的体内图案与募集至RPE损害或损失区域的先天性免疫系统的自发荧光细胞的空间分布相对应。

[0396] 多模式和血管造影体内成像：使用可商购获得的共焦激光扫描检眼镜(cSLO,Spectralis,Heidelberg Retinal Angiography,HRA-II；Heidelberg Engineering GmbH,Germany)和眼探测器图像捕获系统版本1.1.10进行眼底成像。对于荧光素血管造影在使用500nm屏障滤光器激发的488nm波长下捕获图像而没有无赤光(RF，绿色为主导)成像的屏障滤光器，对于ICG血管造影则在795/810nm激发/发射，并且对于红外反射成像为
830nm激光。为了评价488nm FAF，在荧光素染料缺乏下，进行cSLO成像。在其中需要同时对血管成像并提供FAF图像分析的界标的情况下，通过尾静脉将ICG以2mg/kg或5mg/kg注入到先前插入的23号尾静脉导管内。

[0397] 正常Sprague Dawley大鼠眼睛的FAF成像产生通过封闭RPE荧光并因此出现黑暗的径向布置的视网膜血管中断的微弱而均匀的毛玻璃亮光。这种成像的特征还在于视神经乳头(ONH)的中心弱荧光圈，其中RPE为缺乏的。将NaIO3全身注射给予实验小鼠(45％溶液，为每组实验以0.9％氯化钠新鲜制备并且注入45mg/kg体重的最终浓度)。在注射之后的三天，出现具有高荧光边界的异常荧光或稍微高荧光FAF的单个区域，并且获得离散的岛状物、扇状物或360°环的形状。在所有情况下，岛状物、扇状物或环接近ONH，但不与它相邻。在超过160只眼睛中证实这些和以下观察。

[0398] 在NaIO3注射之后约4至5天开始，在岛状物、扇状物或环内出现交替的高/弱荧光FAF的标记的网状或曲线图案。至第7天，此图案为明显的并且持续几周继续出现，由此其曲线部分形成FAF的部分环、椭圆、圆圈、莲座形以及扇形或“爪印”图案。甚至晚至20周，分析的最后时间点，边界保持高荧光网状图案并且继续稍微向视网膜周边蠕变。

[0399] 在动物亚组中进行的荧光血管造影证实网状图案不与视网膜或脉络膜相对应，而ICG血管造影揭示在NaIO3之后约两至三天发生在脉络膜视网膜界面的穿过RPE和BM的渗透性改变，这在空间和时间上与FAF的岛状物、扇状物或环的出现相一致。此渗透性增加为暂时性的并且至第7天消退，通常评价下一个时间点。视网膜血管不会渗漏。石蜡包埋组织和免疫组织化学(IHC)的苏木精和曙红(H&E)组织学分析(为本领域已知的；在用例如Davidson固定剂固定之后进行，并且用Nikon Upright E800显微镜查看石蜡包埋切片)证实流体积累在视网膜下空间内。这也通过超高分辨率OCT进行体内观察(使用Envisu R2200VHR Animal SDOIS系统,Bioptogen,USA系统获得高分辨率160nm谱域OCT图像；以每秒36,000速率使用视网膜水平下约2.8μm的横向分辨率获取扫描)。

[0400] 切离的视网膜和RPE的自发荧光和免疫荧光分析：为了确定体内观察到的FAF图案的病理相关性，在白光下在低分辨率下并且通过488nm(用于体内成像的相同波长)的落射荧光显微镜，在没有荧光IHC标记的情况下，查看切离的视网膜整装。根据随后的组织分析，将两台显微镜用于此目的：具有窄激发/发射窗(488/520nm)的落射荧光装置以及具有汞弧灯和长通(而不是带通)滤光器以在用450-490nm带激发之后提供大于515nm荧光的共焦显微镜的Inverted Leica DM IRE2查看系统。在白光下，整体相当均匀地出现具有一些人工变形的正常大鼠视网膜。相比之下，在NaIO3注射之后7天获得的样品中，细微米白色的细网状图案变得清楚的。至第14天，此图案为更清楚的并且观察到与在视网膜剪切边最佳示出的小外视网膜褶皱相对应。在488nm荧光下查看的，此相同曲线图案为清楚的。使用较高分辨率落射荧光显微镜，证明此花边曲线图案与自发荧光细胞的空间分布相一致，所述空间分布似乎与外视网膜的沟或褶皱对齐。

[0401] 为了确定与FAF网状图案相一致的自发荧光细胞的识别，用先天性免疫系统的标志物对切离的视网膜进行染色，以避免488nm通道。Iba1为泛-小胶质细胞/巨噬细胞标志物，并且在大鼠视网膜中，针对它的抗体识别主要吞噬细胞群。使用此标志物，当在整装+视网膜中、即在z-平面中正面查看时发现Iba1 细胞布置于花边曲线图案中。此外，当与光+
感受器核染色进行比较时，看见此曲线图案插入变形的ONL的褶皱之间。Iba1 细胞的此图案与通过FAF成像体内观察到的高荧光图案相对应并且与切离的视网膜的自发荧光细胞+
的图案相对应。在NaIO3注射之后7天和12周观察到体内FAF和Iba1 染色的对应图案。
重要的是，在NaIO3之后的7天，所有RPE细胞均不在后眼杯中，这证实这些细胞不会是观察到的FAF的原因。另外，通过比较对其中进行单核细胞/巨噬细胞耗竭的制备物的成像来证实作为吞噬细胞的自发荧光细胞的识别。通过用氯化钆(GAD)处理来实现此耗竭。在使用GAD进行处理时，观察到远远没有良好限定的FAF网状图案，包括边界划分的减少。

[0402] 吞噬细胞的这种识别指示干性AMD和/或RPD并且预测响应于试剂的受试者。确切地说，此类巨噬细胞的观察使得受试者将很可能响应于使用试剂的治疗。

[0403] 穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的暂时性增加的确定指示干性AMD和/或RPD并且预测响应于试剂的受试者。确切地说，穿过受试者脉络膜与视网膜之间的上皮屏障的渗透性相对于未患病状态的暂时性增加的观察使得受试者将很可能响应于使用试剂的治疗。

[0404] 切离的视网膜和RPE的延迟近红外分析(DNIRA)：另外，使用延迟近红外分析(DNIRA)进行与正常眼睛相比的异常性质的确定。在使用ICG血管造影设置(即具有激发/发射滤光器)进行染料注射(如ICG注射)之后几天和几周获得DNIRA图像，但没有在血管造影之后24小时、48小时、3天、7天、21天或28天再次注射染料。在研究时间进程期间不用再次进行血管造影。

[0405] 对于毒素施用，通过23G导管以45mg/kg体重的剂量全身注射毒素如NaIO3(Sigma，目录号424064)。紧接着在NaIO3注射之前进行0.35mg/kg的ICG血管造影。
在ICG和NaIO3注射之后7天进行DNIRA。

[0406] 实施例8：在全身ICG施用之后大鼠眼睛的DNIRA标记体内免疫细胞

[0407] 为了确定体内观察到的FAF图案的病理相关性，在白光下在低分辨率下并且通过488nm(用于体内成像的相同波长)的落射荧光显微镜，在没有荧光IHC标记的情况下，查看切离的视网膜整装。根据随后的组织分析，将两台显微镜用于此目的：具有窄激发/发射窗(488/520nm)的落射荧光装置以及具有汞弧灯和长通(而不是带通)滤光器以在用
450-490nm带激发之后提供大于515nm荧光的共焦显微镜的Inverted Leica DM IRE2查看系统。在白光下，整体相当均匀地出现具有一些人工变形的正常大鼠视网膜(图3A)。相比之下，在NaIO3注射之后7天获得的样品中，细微米白色的细网状图案变得清楚的。至第14天，此图案为更清晰的并且看得出与视网膜剪切边最佳示出的小外视网膜褶皱相对应(图
3B)。在488nm荧光下查看的，此相同曲线图案为清楚的。尽管至注射之后第7天为清晰的，增加的自发荧光使得此图案至第14天为更明显的(图3C)。使用较高分辨率落射荧光显微镜，第一时间证明此花边曲线图案与自发荧光细胞的空间分布相一致，所述空间分布似乎与外视网膜的沟或褶皱对齐(图3D)。

[0408] 在不希望受到理论约束的情况下，这表明观察到的FAF体内图案与自发荧光细胞在外视网膜内的分布相对应。这与归因于异常RPE的临床相关FAF图案的普遍理论相反，注意RPE在所使用的分离的视网膜样品中为缺乏的。在不希望受到理论约束的情况下，这还表明在此模型中观察到的FAF二维图案与限制在外视网膜的三维曲线褶皱内的自发荧光细胞的分布相对应。

[0409] 因此，研究外视网膜结构的空间和时间改变和自发荧光细胞类型的确定。

[0410] 由于视神经视网膜的分层性质，我们推断外视网膜变形可容易通过观察正常平面外核层(ONL)(紧密排列的光感受器核的层)的构象改变来评价。因此，紧接着在新鲜切离的整装视网膜的自发荧光分析之后，进行核染色并且通过非488通道中的落射荧光或共焦荧光显微镜来评价组织。还通过对全眼进行H&E来评价截面。

[0411] 在NaIO3施用之前的基线下，使用核染色Topro3的共焦显微镜证实ONL为平的并且没有血管染色(图4C)。在NaIO3施用之后的三天，注意ONL的稍微曲线形沟，伴随着偶尔浅的线性折痕。至第7天，ONL变形为更明显的，产生明显相互连接的系列沟。至第14天，这些改变更为复杂并且具有较高振幅。

[0412] 对使用共焦显微镜获得的图像在90°下进行的视网膜截面H&E组织学分析显示NaIO3诱导的RPE毒性首先导致ONL的小波动，这伴随着视网膜下流体增加，而几乎没有光感受器损失(图4B)。随后，明显的光感受器损失形成较高振幅，其中ONL槽(trough)与Bruch膜(BM)(RPE的基底膜)并列。最后，这些槽的横向扩大导致外视网膜变性的大连续区域，以使得很多内视网膜与BM并列。

[0413] 为了确定与FAF网状图案相一致的自发荧光细胞的识别，用先天性免疫系统的标志物对切离的视网膜进行染色，以避免488nm通道。Iba1为泛-小胶质细胞/巨噬细胞标志物，并且在大鼠视网膜中，针对它的抗体识别主要吞噬细胞群。使用此标志物，当在整装+视网膜中、即在z-平面中正面查看时，显示Iba1 细胞布置于花边曲线图案中(图5)。此外，当与光感受器核染色进行比较时，看见此曲线图案插入变形的ONL的褶皱之间。如图5+
所示的，Iba1 细胞的此图案与通过FAF成像体内观察到的高荧光图案(图1和图2)相对应并且与切离的视网膜的自发荧光细胞的图案(图3)相对应。在NaIO3注射之后7天和12+
周显示体内FAF和Iba1 染色的对应图案(图5A和图5B)。在NaIO3施用之后的7天，所有RPE细胞均不在后眼杯中，这证实这些细胞不会是观察到的FAF的原因(图5C和图5D)。

[0414] Iba1+细胞与外视网膜之间的3维(3D)关系接下来通过从内网织层(INL)经由外网织层(OPL)逐步移动到内ONL、中心ONL和外ONL的整装视网膜(即，在z轴中)的正面系列共焦显微镜来评价。在这三个步骤中，投影(压平)共焦图像(区段)的短堆叠(图+6)。还评价活化的CD68 巨噬细胞的单核细胞系的共同分布。

[0415] 在NaIO3施用之前的基线处，仅在IPL中看见Iba1+细胞。没有识别CD68+细胞+(图6A)。在NaIO3施用之后三至四天，Iba1 细胞数量增加并且在IPL中以及还贯穿外视网膜(包括外-ONL)增加(图6B)。在NaIO3施用之后两周，看见在ONL曲线褶皱之间交错+ +
的Iba1 和CD68 细胞的复合分布。此外，向内远至血管中心视网膜层OPL观察到光感受器核的良好定义的光学切片的异位圆形或椭圆形，从而使得两个正常的单独组织室，即变形的光感受器核层和血管层相接触。在中间ONL中，变形的核层的卵形截面出现为更多曲线+ +
或鱼形的，并且在其中心空隙内发现大的Iba1 和CD68 细胞。在最外面第三个ONL，光学截面保持为曲线的并且与很多桥接区段大部分相邻。视网膜下空间(通常仅为可能的空间)+ +
通过外视网膜变形来扩大并且显示紧接着在Bruch膜内的Iba1 和/或CD68 炎症细胞和光感受器核一起(在其中损失的光感受器外区段通常将驻留的空间内)。

[0416] 对切离的整装视网膜进行共焦扫描显微和三维重构(图7A)。这些数据显示Iba1+细胞形成插入光感受器核之间的网状或花边图案。此外，分为相同的三个平面的z-堆叠的投影(图7B右图)显示内部-ONL的特征在于ONL的圆形或椭圆形截面。相比之下，中心-ONL的特征在于核层的环形弯曲截面，并且外ONL由具有多个桥接元件的较大曲线区段形成。这些层的倾斜体积投影容易示出ONL的所得假蛋箱构造，其中若干锥形峰从其基底处的单个连续褶皱延伸(图7B中间和右图)。在不希望受到理论约束的情况下，这些数据证明大部分炎症细胞并不位于ONL槽内或ONL槽之间，而是见于扩大的视网膜下空间内的ONL峰下(即，在其外部)。

[0417] 在不希望受到理论约束的情况下，这些观察显示在变形的外视网膜下的自发荧光炎症细胞的3维分布解释这些动物中的体内FAF成像的2D图案的原因。

[0418] 为了使切离的组织中所做出的这些观察与体内改变和FAF发现相关联，使用高分辨率OCT进行体内活视网膜的3D体积分析。HR-OCT提供先前仅在摘除术之后的组织学标本内观察到的视网膜非侵袭性体内截面。OCT成像取决于在不同光学密度的层之间的界面中产生的信号并且在正常大鼠视网膜中证实其多层结构。视网膜的三个主要最外层OCT界限为从内部到外部外界膜(ELM)、光感受器内部和外部区段(IS/OS)的连接以及RPE/BM(图8A左图)。在临床上和这些研究中的标准技术任意地设定核层(包括ONL)为黑色(即，信号缺失)。

[0419] 在NaIO3施用之后三天，使用OCT捕获的活视网膜的重构的正面图像证明限制于视神经下区域内的微小改变(图8A，中间图)。与基线和视网膜上层(它在NaIO3施用之后3天大体上看起来正常)(图8A，中间图)相比，下半视网膜的光学截面显示稍微变形的光感受器IS/OS连接和ELM，以使得明亮的(高回声)浅隆起变为可见的(图8A，右图)。此信号见于ONL之外和BM之内。不再存在代表RPE的细黑线。至第14天，这些隆起成长为明显的峰，一部分峰形成明亮的不同三角形或锥形，其基底似乎位于BM上(图8B和图8C)。
其它隆起形成从ELM通过光感受器层延伸到达中心视网膜的离散窄峰。来自患有RPD的人患者的临床OCT图像显示此疾病的病理特征的锥形视网膜下沉积(图8D)。

[0420] 为了测试表征RPD并见于本系统中的明亮隆起、三角形和峰是否与视网膜下空间内观察到的自发荧光吞噬细胞的分布相对应，使用体积强度投影(VIP)。这些由OCT-产生的光学切片组成，以提供评价可在z轴和y轴重构的体内活组织的3维图块的手段。

[0421] 在y轴中的相邻OCT图像的重构显示并肩排列的隆起或三角形形成复合结构，如圆圈、椭圆形、晕圈和靶样病灶。在图9A所示的实施例中，两个视网膜下隆起形成圆圈的“各侧”并且紧挨着其上面和下面并且在中间相隔最大。单个隆起、三角形和峰形成较简单的曲线结构。

[0422] 为了进一步支持此发现，然后分析z-轴的VIP(即，在从内部-ONL至外部-ONL的逐步的短区段内)(图9B)。通过内部-ONL的VIP显示在整个视网膜上规律地间隔的一系列点状斑点。来自中间ONL的VIP显示较不规律地间隔的鱼形或弯曲的短线，其中一些为桥接的。来自外部-ONL的VIP显示具有很多桥连元件的连续曲线区段。这些发现直接与从切离的整装视网膜中产生的3D数据相对应(图6)。

[0423] 此外，为了证实高荧光FAF或异常FAF图案以及高荧光DNIRA与吞噬细胞的分布相关联或共同定位，使用抑制巨噬细胞活性的稀土金属盐氯化钆(GAD或GdCl3)耗竭循环的巨噬细胞/单核细胞群。免疫细胞的GAD耗竭导致NaIO3诱导的FAF和DNIRA图案的深度改变。单核细胞/巨噬细胞群的GAD耗竭导致NaIO3诱导的FAF图案的深度改变。这在损害的地图状区域和其边界内在定性上为明显的(图8)。

[0424] 实施例9：RPD和扩散性滴漏AMD的临床体内成像：

[0425] 在图10中，提供将RPD的临床性质与NaIO3模型中的组织发现直接比较的图像和说明性图。除患有RPD的人患者的临床OCT成像(显示视网膜下空间内的基底向下的椎体结构，图8D)之外，还获得彩色和无赤光眼底图像(图10)。无赤光图像显示构成RPD的单个假性玻璃疣的小黑点(图10A，顶部图像)。这些使用深灰色覆盖物鉴别。这进一步强调，通过圆圈包围的表征RPD的所谓“靶病灶”的存在。这些表现为具有较亮中心的黑点。并行地，提供在正面和截面中的褶皱外大鼠视网膜的示意图，当错误地着色并提供为黑色和白色图像-“阳性”和“阴性”二者时，它与RPD的靶标和晕圈直接相关联。

[0426] 这些数据表明，在具有2D正面查看的暗中心的圆圈、晕圈和靶病灶的花边或网状图案内的暗色假性玻璃疣的2D图案与在3D中在体积方面考虑的提高的环和凹口相对应。

[0427] 等效方案

[0428] 本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文确切描述的特定实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围中。

[0429] 通过引用并入

[0430] 本文引用的所有专利和出版物特此以引用的方式整体并入。

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装拆式光学相干断层扫描装置	2020-05-12	921
处理光学相干断层成像扫描	2020-05-14	387
光学相干断层扫描仪	2020-05-11	344
用于光学相干断层扫描的集成延迟线	2020-05-14	188
用于光学相干断层扫描的方法和系统	2020-05-15	447
光学相干断层扫描系统	2020-05-11	753
补偿光学相干断层成像术扫描	2020-05-12	447
基于光学相干断层扫描冻干显微镜	2020-05-16	933
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用于光学相干断层扫描的系统和方法	2020-05-17	706

用于治疗和诊断致盲性眼病的方法

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