抗IGF-I受体抗体
阅读：993发布：2023-03-01
专利汇可以提供抗IGF-I受体抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供抗IGF-I受体 抗体 或其 片段 或它们的衍 生物 ，其与 脊椎动物 的IGF-I受体特异性结合，并具有脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性。，下面是抗IGF-I受体抗体专利的具体信息内容。
1.抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与脊椎动物的IGF-I受体特异性结合，并具有脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性。
2.权利要求1所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性与天然型IGF-I为同等程度以上。
3.权利要求1或2所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性的活体外的EC50值相对于天然型IGF-I为1/20以下。
4.权利要求1 3中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，在~
与培养下的脊椎动物来源细胞接触的情况下，对于与该培养细胞的接触时间的该培养细胞的增殖诱导作用的持续性，与天然型IGF-I相比，得到改善。
5.权利要求2 4中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，天~
然型IGF-I为具有SEQ ID NO: 1所记载的氨基酸序列的人IGF-I。
6.权利要求1 5中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊~
椎动物来源细胞的增殖诱导活性的活体外的EC50值为0.1nmol/L以下。
7.权利要求1 6中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，通~
过对脊椎动物进行肠胃外给予，具有诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的活性。
8.权利要求1 7中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，对~
脊椎动物以1周1次以下的频率进行给予。
9.权利要求1 8中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊~
椎动物为人；或者包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗或鸡的非人动物，而且为表达有人IGF-I受体的非人动物。
10.权利要求1 9中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征~
在于，在诱导脊椎动物来源细胞的增殖的剂量下，不诱导在分化肌细胞中的葡萄糖摄取。
11.权利要求10所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，在显示活体外的脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性的EC50值的100倍以上的剂量下，也不诱导在分化肌细胞中的葡萄糖摄取。
12.权利要求10或11所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊椎动物来源细胞为来源于人或人以外的哺乳动物的成肌细胞。
13.权利要求7 12中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征~
在于，对脊椎动物进行肠胃外给予，在诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的剂量下，不会降低该脊椎动物的血糖值。
14.权利要求13所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，对脊椎动物进行肠胃外给予，在相对于诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的有效剂量为10倍以上的剂量下，该脊椎动物的血糖值也不会变动。
15.权利要求1 14中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与~
IGF-I受体的CR结构域结合。
16.抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与IGF-I受体的CR结构域结合，且抑制IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的结合。
17.权利要求15或16所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，其与含有IGF-I受体的CR结构域的序列中的ProSerGlyPheIleArgAsnX1X2GlnSerMet(X1为Gly或Ser、X2为Ser或Thr)的表位或其附近结合。
18.权利要求17所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，其与含有IGF-I受体的CR结构域的序列中的ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的表位或其附近结合。
19.权利要求1 18中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与人~
或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗或鸡的非人动物的IGF-I受体具有交叉反应性。
20.权利要求1 19中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征~
在于，该抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物的抗原抗体反应具有解离平衡常数(KD)为1×10-8M以下的亲和性强度。
21.权利要求16 20中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，~
该抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物具有1) 4)中的至少一种特征：
~
1) 具有脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性；
2) 通过对脊椎动物进行肠胃外给予，具有诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的活性；
3) 在诱导脊椎动物来源细胞的增殖的剂量下，不诱导在分化肌细胞中的葡萄糖摄取；
4) 对脊椎动物进行肠胃外给予，在诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的剂量下，该脊椎动物的血糖值不会变动。
22.权利要求16 21中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，~
抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物具有1) 4)中的至少一种特征：
~
1) 抑制通过IGF-I的脊椎动物来源细胞的增殖；
2) 通过对脊椎动物进行肠胃外给予，抑制该脊椎动物中的由IGF-I引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖；
3) 在抑制通过IGF-I的脊椎动物来源细胞的增殖的剂量下，不影响在分化肌细胞中的葡萄糖摄取；
4) 对脊椎动物进行肠胃外给予，在抑制该脊椎动物中的由IGF-I引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖的剂量下，该脊椎动物的血糖值不会变动。
23.权利要求1 22中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，~
抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物为Fab、scFv、双抗体或双特异性抗体、或它们的衍生物。
24.权利要求1 23中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其由含~
有下述氨基酸序列的氨基酸序列构成：
作为重链可变区的CDR-1(CDR-H1)序列，SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3中任意1处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-2(CDR-H2)序列，SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 4中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-3(CDR-H3)序列，SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 5中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-1(CDR-L1)序列，SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 6中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-2(CDR-L2)序列，SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 7中任意1处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；和
作为轻链可变区的CDR-3(CDR-L3)序列，SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 8中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。
25.权利要求24所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其进一步含有免疫球蛋白的框架序列。
26.权利要求25所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，免疫球蛋白的框架序列为人或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗、鸡、小鼠或大鼠的非人动物的免疫球蛋白的各类中的框架序列。
27.权利要求1 26中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其由含~
有下述氨基酸序列的氨基酸序列构成：作为重链可变区，SEQ ID NO: 9或与SEQ ID NO: 9具有90%以上同源性的氨基酸序列；和作为轻链可变区，SEQ ID NO: 10或与SEQ ID NO: 10具有90%以上同源性的氨基酸序列。
28.权利要求1 27中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其进一~
步含有：人或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗、鸡、小鼠或大鼠的非人动物的免疫球蛋白的各类中的恒定区。
29.核酸分子，其由编码权利要求1 28中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它~
们的衍生物的多核苷酸序列构成。
30.克隆载体或表达载体，其含有至少一种权利要求29所述的核酸分子。
31.重组体细胞，其是在宿主细胞中导入权利要求30所述的载体而得的重组体细胞。
32.权利要求1 28中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物的制造~
方法，所述方法包括下述的步骤：培养权利要求31所述的重组体细胞，将由前述重组体细胞产生的该抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物进行纯化。
33.药物组合物，其含有：权利要求1 28中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或~
它们的衍生物、权利要求29所述的核酸分子、权利要求30所述的载体、或者权利要求31所述的重组体细胞。
34.权利要求33所述的药物组合物，其进一步含有：权利要求1 28中任一项所述的抗~
IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物、权利要求29所述的核酸分子、权利要求30所述的载体、或者权利要求31所述的重组体细胞以外的活性成分。
35.权利要求34所述的药物组合物，其中，活性成分为选自下述的一种以上：生长激素或其类似物、胰岛素或其类似物、IGF-II或其类似物、抗肌肉生长抑制素抗体、肌肉生长抑制素拮抗剂、抗激活素IIB型受体抗体、激活素IIB受体拮抗剂、可溶性激活素IIB型受体或其类似物、生长素释放肽或其类似物、卵泡抑制素或其类似物、β2激动剂、和选择性雄激素受体调节剂。
36.权利要求34或35所述的药物组合物，其中，活性成分含有选自下述的成分：皮质类固醇、止吐药、盐酸恩丹西酮、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺(metroclopramide)、多潘立酮、氟哌啶醇、赛克利嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、左旋甲丙嗪、托烷司琼、癌症疫苗、GM-CSF抑制剂、GM-CSF DNA疫苗、基于细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白(HSP)疫苗、同种肿瘤疫苗、自身肿瘤疫苗、镇痛药、布洛芬、萘普生、三柳胆镁、盐酸羟考酮、抗血管生成剂、抗血栓剂、抗PD-1抗体、纳武单抗、派姆单抗、抗PD-L1抗体、阿特朱单抗、抗CTLA4抗体、伊匹单抗、抗CD20抗体、利妥昔单抗、抗HER2抗体、曲妥单抗、抗CCR4抗体、莫加珠单抗、抗VEGF抗体、贝伐单抗、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体片段、抗TWEAK抗体、抗TWEAK受体抗体、可溶性TWEAK受体片段、AMG 706、AMG 386、抗增殖剂、法尼基蛋白转移酶抑制剂、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、Kit受体抑制剂、ret受体抑制剂、PDGFR抑制剂、生长激素分泌抑制剂、血管生成素抑制剂、肿瘤浸润巨噬细胞抑制剂、c-fms抑制剂、抗c-fms抗体、CSF-1抑制剂、抗CSF-1抗体、可溶性c-fms片段、培维索孟、吉西他滨、帕尼单抗、伊立替康、和SN-38。
37.用于治疗或预防与IGF-I相关的状态的药物，其含有权利要求1 28所述的抗IGF-I~
受体抗体或其片段或它们的衍生物、权利要求29所述的核酸分子、权利要求30所述的载体、和权利要求31所述的重组体细胞中的任意一种以上。
38.权利要求37所述的药物，其中，与IGF-I相关的状态选自：废用性肌肉萎缩、身材矮小症、糖尿病性肾病、慢性肾功能衰竭、莱伦氏综合征、肝硬化、肝纤维化、老化、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、神经疾病、中风、脊髓损伤、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、骨质疏松症、囊性纤维病、伤口愈合、肌强直性营养不良、艾滋病肌无力症、HIV所伴随的脂肪再分布综合症、烧伤、克罗恩氏病、维尔纳氏综合征、X-连锁联合免疫缺陷病、耳聋、神经性厌食症和早产儿视网膜病、特纳综合征、普拉德-威利综合征、银罗素综合征、特发性矮小、肥胖、多发性硬化症、纤维肌痛症、溃疡性大肠炎、肌肉量低、心肌缺血和骨密度低。
39.权利要求37或38所述的药物，其进行肠胃外给予。
40.权利要求37 39中任一项所述的药物，其为对非人动物进行给予的动物用药物。
~
41.权利要求40所述的药物，其中，该动物用药物以肌肉量和/或体长的增加、生长的促进、乳汁产生量的增加、繁殖的促进、或老化的预防为目的进行给予。
42.权利要求40或41所述的动物用药物，其中，非人动物为豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗、或鸡。
43.权利要求37 42中任一项所述的药物，其用于治疗或预防由IGF-I或IGF-II与IGF-I~
受体的作用引起的疾病。
44.权利要求43所述的药物，其中，由IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的作用引起的疾病为选自下述的疾病：肝癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童期癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺增生症、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯瘤、与转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻、血管活性肠肽瘤、弗纳-莫里森综合征、贝克威思-威德曼综合征、肾癌、肾细胞癌、移行细胞癌、尤文氏肉瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头瘤、巨人症、牛皮癣、动脉粥样硬化症、血管平滑肌再狭窄、不适当的微血管增殖、糖尿病性视网膜病、格雷夫斯病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、慢性甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎以及白塞氏病。
45.培养方法，其是将脊椎动物来源的细胞在活体外进行培养的方法，所述方法包括下述的步骤：在培养的过程中使该脊椎动物来源的细胞与权利要求1 28中任一项所述的抗~
IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物、权利要求29所述的核酸分子、权利要求30所述的载体、和权利要求31所述的重组体细胞的任意一种以上接触。
46.权利要求45所述的培养方法，其中，该接触的步骤以脊椎动物来源的细胞的增殖促进或分化诱导为目的来进行。
47.权利要求45或46所述的培养方法，其中，抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物吸附或固定于固相。
48.基因重组动物，其是在IGF-I受体基因的CR结构域导入有突变的基因重组动物，其特征在于，该IGF-I受体的CR结构域通过基因重组，具有ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的氨基酸序列。
49.基因重组动物，其是导入有异种的IGF-I受体基因的基因重组动物，对于该动物的内在固有的IGF-I受体的氨基酸序列，经导入的IGF-I受体基因所要编码的氨基酸序列的CR结构域中的ProSerGlyPheIleArgAsnX1X2GlnSerMet的部分序列中，X1和/或X2的氨基酸残基与该动物的内在固有的IGF-I受体的氨基酸序列不一致的IGF-I受体基因被导入。
抗IGF-I受体抗体
技术领域
背景技术
[0002] 1.IGF-I
[0003] IGF-I是胰岛素样生长因子(Insulin-Like Growth Factor)，主要由肝脏分泌，通过作用于IGF-I受体，在各种器官中表达种种的生理功能。由此，IGF-I被期待治疗种种的疾病。IGF-I与胰岛素原的氨基酸序列进行比较，具有约40％的高同源性，因此也可与胰岛素受体结合并表现胰岛素样的作用(非专利文献1)。另外，IGF-I受体与胰岛素受体的氨基酸序列进行比较，具有约60％的高同源性，因此两种受体可形成异二聚体(非专利文献1)。需说明的是，胰岛素通过作用于胰岛素受体，表现出强有力的血糖降低作用(降低血糖的作用)，因此作为降血糖药而被用于治疗。
[0004] 2.IGF-I受体
[0005] IGF-I受体由α链和β链构成，并且为跨膜蛋白，其含有L1、CR、L2、Fn1、Fn2和Fn3的6个胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域(非专利文献2)。IGF-I受体的胞内结构域具有酪氨酸激酶。作为胞外结构域的CR(Cysteine-Rich Domain，富含半胱氨酸的结构域)参与IGF-I与IGF-I受体结合时的该受体的构象的变化所伴随的、细胞内的酪氨酸激酶的活化。IGF-I受体形成同源二聚体复合物(同型)，并且当IGF-I结合时，通过活化受体激酶而传递信号。另外，还与胰岛素受体形成异源二聚体复合物(异型)，并且在胰岛素或IGF-I结合时，通过活化受体激酶来传递信号(非专利文献3、4)。
[0006] 3.IGF-I的生理作用
[0007] 已经明确IGF-I具有身高或体重增加等的生长促进作用、和糖代谢促进或血糖降低作用等的胰岛素样代谢作用。作为人重组IGF-I的美卡舍明(Mecasermin)观察到可改善胰岛素受体异常症的高血糖、高胰岛素血症、黑色表皮瘤和多毛的症状。另外，还观察到可改善生长激素抵抗性身材矮小症的生长障碍(非专利文献5)。
[0008] 作为IGF-I的生长促进作用，已知IGF-I使人软骨细胞的DNA合成能力亢进。另外，IGF-I的给予会使下垂体摘除大鼠的体重增加，并且使股骨的骨长度延长(非专利文献5)。
[0009] 4.IGF-I的肌肉量增加作用
[0010] 经由IGF-I的细胞增殖活性的亢进需要IGF-I受体的持续性活化(非专利文献6)。在过度表达有IGF-I受体的动物中，肌肉量增加(非专利文献7)。另外，IGF-I/IGFBP3的持续给予会使股骨近端骨折患者的握力亢进，并且改善无辅助下由坐位站起的能力(非专利文献8)。已知高龄的人和小鼠的肌肉中的IGF-I浓度与幼龄进行比较有所降低(非专利文献9、
10)，在肌组织特异性地强制表达有IGF-I的高龄小鼠中，与野生型小鼠进行比较，肌肉量得到改善(非专利文献11)。
10)，在肌组织特异性地强制表达有IGF-I的高龄小鼠中，与野生型小鼠进行比较，肌肉量得到改善(非专利文献11)。
[0011] 5.使肌肉量增加的现有产品
[0012] 在作为废用性肌肉萎缩症的恶病质的临床试验中，作为生长素释放肽受体激动剂(Ghrelin Receptor Agonist)的阿拉莫林(Anamorelin)增加了除脂肪量(Lean Body Mass，除脂肪体重)。另一方面，作为副作用，观察到恶心和血糖值的上升(非专利文献12)。
[0013] 肌肉生长抑制素是作用于激活素受体II(ActRII)、抑制Akt/mTOR的骨骼肌形成的负调节因子(非专利文献13～15)。作为抗肌肉生长抑制素抗体的LY2495655使实施了全人工股关节置换术的患者和高龄者的肌肉量增加(非专利文献16、17)。
[0014] 另外，作为抗ActRII抗体的Bimagrumab(比玛格鲁单抗)使神经肌肉疾病患者的肌肉量增加(非专利文献18)。然而，目前不存在可促进骨骼肌的形成且可用于治疗的药物。
[0015] 6.促进生长的先行品
[0016] 人重组GH制剂(生长激素制剂)活化GH受体，分泌IGF-I，观察到生长促进效果。另一方面，由于1天1次给予的皮下注射剂，因此观察到由服药依从性(忘记给予等)引起的生长效果降低(非专利文献19)。正在开发一种持续型GH制剂，其改善GH制剂的动力学，且1周1次或2周1次给予。
[0017] 然而，目前不存在可改善服药依从性、且具有生长促进作用的用于治疗的药物。而且，GH制剂对于下述的患者，观察到生长效果的降低，所述患者为对GH受体活化的感受性降低的GH受体异常、或对GH治疗具有抵抗性的患者(非专利文献20)。
[0018] IGF-I是唯一的治疗药，其在GH受体的下游起作用，因此即使对于对GH受体活化的感受性降低的患者也具有生长促进作用。然而，IGF-I制剂是1天2次给予的注射剂，不仅服药依从性差，而且作为副作用还观察到低血糖(非专利文献21)。目前不存在可改善IGF-I的服药依从性和低血糖的用于治疗的药物。
[0019] 7.IGF-I的血糖降低作用
[0020] 作为IGF-I的胰岛素样作用，已知有降血糖的作用。IGF-I在大鼠肌肉来源的细胞中使葡萄糖摄取作用亢进(非专利文献5)。另外，IGF-I的给予会使大鼠的血糖值降低(非专利文献5)。
[0021] 据报道，基于IGF-I的血糖降低作用会引起临床上作为副作用的低血糖(非专利文献21)。而且，IGF-I通过对人进行给予而引起低血糖，因此在治疗开始时，有必要从低剂量(低用量)顺次给予适当量，并观察给予后的包括血糖值等的各种临床所见(非专利文献5)。
[0022] IGF-I经由IGF-I受体的下游信号即Akt磷酸化的亢进表现血糖降低作用。Akt的活性型变体使3T3-L1细胞的葡萄糖摄取亢进(非专利文献22)。另一方面，缺乏Akt2的小鼠，血糖值上升(非专利文献23)。另外，在大鼠肌肉来源的细胞中，Akt抑制剂抑制由胰岛素刺激而引起的葡萄糖摄取(非专利文献24)。而且，已知IGF-I使参与血糖降低作用的胰岛素受体活化。根据这些结果可认为，基于IGF-I的血糖降低作用与Akt的过度活化和胰岛素受体的活化有关。
[0023] 8.IGF-I的短血中半衰期
[0024] IGF-I的血中半衰期短，因此在治疗上需要频繁给予。实际上，作为人重组IGF-I的美卡舍明，其血中半衰期为约11小时至16小时，在身材矮小症的治疗上需要1天1次至2次的给予(非专利文献5)。
[0025] 血中的IGF-I的约70～80％与IGFBP3结合。IGF-I的游离体显示生理活性。与IGFBP3的结合可将IGF-I的血中半衰期维持在约10小时至16小时(非专利文献1)。
[0026] 作为IGF-I与IGFBP3的配合剂即IPLEX，其血中半衰期为约21小时至26小时，与IGF-I进行比较，较长，是可1天1次给予的药剂(非专利文献23)。然而，IPLEX已经退出市场。
[0027] 还尝试了改善IGF-I动力学的PEG化IGF-I的开发，但不存在用于治疗的药剂(专利文献1)。
[0028] 9.IGF-I的作用所期待的治疗效果
[0029] 已知IGF-I作用于多种器官，其生理机能有多种(非专利文献21)。
[0030] 据报道，在中枢神经系统中，IGF-I经由IGF-I受体的活化，具有通过线粒体的保护和抗氧化作用的神经保护作用(非专利文献26、27)。IGF-I促进损伤后的神经突起的形成(非专利文献28)。
[0031] IGF-I是生长促进的主要因子(非专利文献29、30)。实际上，作为人重组IGF-I的美卡舍明，在临床上被用作身材矮小症的治疗药。
[0033] 已知IGF-I也参与肾脏的发育、功能。在肾脏的系膜细胞中，IGF-I对于由糖毒性而引起的氧化应激和细胞凋亡具有保护作用(非专利文献32)。IGF-I被期待作为肾病的治疗药。
[0034] 通过给予IGF-I而期待改善的疾病中包括：身材矮小症、莱伦氏综合征(Laron Syndrome)、肝硬化、肝纤维化、老化、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、神经疾病、中风、脊髓损伤、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、肾病、骨质疏松症、囊性纤维病、伤口愈合、肌强直性营养不良、艾滋病肌无力症、HIV所伴随的脂肪再分布综合症、烧伤、克罗恩氏病(Crohn’s Disease)、维尔纳氏综合征(Werner’s Syndrome)、X-连锁联合免疫缺陷病、耳聋、神经性厌食症和早产儿视网膜病(非专利文献21)。
[0035] IGF-I由于其多样化的生理作用，被期待作为种种的疾病的治疗药。然而，作为副作用的血糖降低作用和因短半衰期的多次给予成为临床上使用的课题。
[0036] 10.IGF-I受体激动剂抗体
[0037] 抗体制剂一般而言半衰期较长，1个月给予1次至2次可显示有效性。虽然报道了IGF-I受体激动剂抗体在活体外(in vitro)的受体活化作用，但没有报道在活体内(in vivo)显示对于IGF-I受体的激动剂活性的抗体(非专利文献33～37)。
[0038] 抗体3B7和抗体2D1在活体外使细胞的DNA合成亢进(非专利文献34)。
[0039] 抗体11A1、11A4、11A11和24-57在活体外使IGF-I受体的酪氨酸的磷酸化亢进(非专利文献35)。
[0040] 抗体16-13、17-69、24-57、24-60、24-31和26-3在活体外显示具有细胞的DNA合成和葡萄糖摄取的亢进作用，这些抗体有可能具有血糖降低作用(非专利文献36，37)。
[0041] 然而，至今还没有报道使用原代培养细胞、特别是人成肌细胞的在活体外显示细胞增殖活性的IGF-I受体激动剂抗体，而且也没有记载在活体内显示肌肉量增加作用的IGF-I受体激动剂抗体。
[0042] 11.IGF-I受体拮抗剂抗体
[0043] 与IGF-I受体结合的抗体，利用抑制IGF-I与IGF-I受体结合的拮抗剂作用，尝试了对恶性肿瘤等治疗的应用。然而，现有的IGF-I受体拮抗剂抗体在单独治疗中不仅高血糖等副作用较多(非专利文献38)，而且通过与其他抗癌剂并用会使高血糖的表现率上升(非专利文献39)，因此认为治疗上的适用受到限制。
[0044] 现有技术文献
[0045] 专利文献
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1925-34页。
1925-34页。
发明内容
[0087] 发明所要解决的课题
[0088] 本发明的目的在于，提供与脊椎动物的IGF-I受体特异性结合的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物。另外，本发明的目的在于，提供经由IGF-I受体、增加肌肉量或生长板软骨的厚度、且不使血糖值降低的抗体。
[0089] 用于解决课题的手段
[0090] 即，本发明涉及以下内容。
[0091] [1]抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与脊椎动物的IGF-I受体特异性结合，且具有脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性。
[0092] [2][1]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性与天然型IGF-I为同等程度以上。
[0093] [3][1]或[2]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性的活体外的EC50值相对于天然型IGF-I为1/20以下。
[0094] [4][1]～[3]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，在与培养下的脊椎动物来源的细胞接触的情况下，对于与该培养细胞的接触时间的该培养细胞的增殖诱导作用的持续性，与天然型IGF-I相比，得到改善。
[0095] [5][2]～[4]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，天然型IGF-I为具有SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列的人IGF-I。
[0096] [6][1]～[5]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性的活体外的EC50值为0.1nmol/L以下。
[0097] [7][1]～[6]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，通过对脊椎动物进行肠胃外给予，具有诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的活性。
[0098] [8][1]～[7]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，对脊椎动物以1周1次以下的频率进行给予。
[0099] [9][1]～[8]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，脊椎动物为人；或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗或鸡的非人动物，而且为表达有人IGF-I受体的非人动物。
[0100] [10][1]～[9]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，在诱导脊椎动物来源细胞的增殖的剂量(用量)下，不诱导在分化肌细胞中的葡萄糖摄取。
[0101] [11][10]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，在显示活体外的脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性的EC50值的100倍以上的剂量下，也不诱导在分化肌细胞中的葡萄糖摄取。
[0103] [13][7]～[12]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，对脊椎动物进行肠胃外给予，在诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的剂量下，不会降低该脊椎动物的血糖值。
[0104] [14][13]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，对脊椎动物进行肠胃外给予，在相对于诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的有效剂量为10倍以上的剂量下，该脊椎动物的血糖值也不会变动。
[0105] [15][1]～[14]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与IGF-I受体的CR结构域结合。
[0106] [16]抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与IGF-I受体的CR结构域结合，且抑制IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的结合。
[0107] [17][15]或[16]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，其与IGF-I受体的CR结构域的序列中的含有ProSerGlyPheIleArgAsnX1X2GlnSerMet(X1为Gly或Ser、X2为Ser或Thr)的表位或其附近结合。
[0108] [18][17]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，其与IGF-I受体的CR结构域的序列中的含有ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的表位或其附近结合。
[0109] [19][1]～[18]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其与人或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗或鸡的非人动物的IGF-I受体具有交叉反应性。
[0110] [20][1]～[19]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，该抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物的抗原抗体反应具有解离平衡常数(KD)为1×10-8M以下的亲和性强度。
[0111] [21][16]～[20]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，该抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物具有1)～4)中的至少一种特征：
[0112] 1)具有脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性；
[0113] 2)通过对脊椎动物进行肠胃外给予，具有诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的活性；
[0114] 3)在诱导脊椎动物来源细胞的增殖的剂量下，不诱导在分化肌细胞中的葡萄糖摄取；
[0115] 4)对脊椎动物进行肠胃外给予，在诱导该脊椎动物的肌肉量和/或体长的增加的剂量下，该脊椎动物的血糖值不会变动。
[0116] [22][16]～[21]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其特征在于，抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物具有1)～4)中的至少一种特征：
[0117] 1)抑制通过IGF-I的脊椎动物来源细胞的增殖；
[0118] 2)通过对脊椎动物进行肠胃外给予，抑制该脊椎动物中的由IGF-I引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖；
[0119] 3)在抑制基于IGF-I的脊椎动物来源细胞的增殖的剂量下，不影响在分化肌细胞中的葡萄糖摄取；
[0120] 4)对脊椎动物进行肠胃外给予，在抑制该脊椎动物中的由IGF-I引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖的剂量下，该脊椎动物的血糖值不会变动。
[0121] [23][1]～[22]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物为Fab、scFv、双抗体或双特异性抗体、或它们的衍生物。
[0122] [24][1]～[23]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其由含有下述氨基酸序列的氨基酸序列构成：
[0123] 作为重链可变区的CDR-1(CDR-H1)序列，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3中任意1处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
[0124] 作为重链可变区的CDR-2(CDR-H2)序列，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
[0125] 作为重链可变区的CDR-3(CDR-H3)序列，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
[0126] 作为轻链可变区的CDR-1(CDR-L1)序列，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；
[0127] 作为轻链可变区的CDR-2(CDR-L2)序列，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7中任意1处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列；和
[0128] 作为轻链可变区的CDR-3(CDR-L3)序列，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。
[0130] [26][25]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其中，免疫球蛋白的框架序列为人或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗、鸡、小鼠或大鼠的非人动物的免疫球蛋白的各类(Each Class)中的框架序列。
[0131] [27][1]～[26]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其由含有下述氨基酸序列的氨基酸序列构成：作为重链可变区，SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9具有90％以上同源性的氨基酸序列；和作为轻链可变区，SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10具有90％以上同源性的氨基酸序列。
[0132] [28][1]～[27]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物，其进一步含有人或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗、鸡、小鼠或大鼠的非人动物的免疫球蛋白的各类(each class)中的恒定区。
[0133] [29]核酸分子，其由编码[1]～[28]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物的多核苷酸序列构成。
[0134] [30]克隆载体或表达载体，其含有至少一种[29]所述的核酸分子。
[0135] [31]重组体细胞，其是在宿主细胞中导入[30]所述的载体而得的重组体细胞。
[0136] [32][1]～[28]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物的制造方法，所述方法包括下述的步骤：培养[31]所述的重组体细胞，将由前述重组体细胞产生的该抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物进行纯化。
[0137] [33]药物组合物，其含有[1]～[28]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物、[29]所述的核酸分子、[30]所述的载体、或者[31]所述的重组体细胞。
[0138] [34][33]所述的药物组合物，其进一步含有[1]～[28]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物、[29]所述的核酸分子、[30]所述的载体、或者[31]所述的重组体细胞以外的活性成分。
[0139] [35][34]所述的药物组合物，其中，活性成分为选自下述的一种以上：生长激素或其类似物、胰岛素或其类似物、IGF-II或其类似物、抗肌肉生长抑制素抗体、肌肉生长抑制素拮抗剂、抗激活素IIB型受体抗体、激活素IIB受体拮抗剂、可溶性激活素IIB型受体或其类似物、生长素释放肽或其类似物、卵泡抑制素或其类似物、β2激动剂、和选择性雄激素受体调节剂。
[0140] [36][34]或[35]所述的药物组合物，其中，活性成分含有选自下述的成分：皮质类固醇、止吐药、盐酸恩丹西酮、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺(Metroclopramide)、多潘立酮、氟哌啶醇、赛克利嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、左旋甲丙嗪、托烷司琼、癌症疫苗、GM-CSF抑制剂、GM-CSF DNA疫苗、基于细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白(HSP)疫苗、同种肿瘤疫苗、自身肿瘤疫苗、镇痛药、布洛芬、萘普生、三柳胆镁、盐酸羟考酮、抗血管生成剂、抗血栓剂、抗PD-1抗体、纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、抗PD-L1抗体、阿特朱单抗(Atezolizumab)、抗CTLA4抗体、伊匹单抗(Ipilimumab)、抗CD20抗体、利妥昔单抗、抗HER2抗体、曲妥单抗(Trastuzumab)、抗CCR4抗体、莫加珠单抗(Mogamulizumab)、抗VEGF抗体、贝伐单抗(Bevacizumab)、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体片段、抗TWEAK抗体、抗TWEAK受体抗体、可溶性TWEAK受体片段、AMG 706、AMG386、抗增殖剂、法尼基蛋白转移酶抑制剂(Farnesyl Protein Transferase Inhibitor)、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、Kit受体抑制剂、ret受体抑制剂、PDGFR抑制剂、生长激素分泌抑制剂、血管生成素抑制剂、肿瘤浸润巨噬细胞抑制剂、c-fms抑制剂、抗c-fms抗体、CSF-1抑制剂、抗CSF-1抗体、可溶性c-fms片段、培维索孟(Pegvisomant)、吉西他滨(Gemcitabine)、帕尼单抗(Panitumumab)、伊立替康(Irinotecan)、和SN-38。
[0141] [37]用于治疗或预防与IGF-I相关的状态的药物，其含有[1]～[28]所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物、[29]所述的核酸分子、[30]所述的载体、和[31]所述的重组体细胞中的任意一种以上。
[0142] [38][37]所述的药物，其中，与IGF-I相关的状态选自：废用性肌肉萎缩、身材矮小症、糖尿病性肾病、慢性肾功能衰竭、莱伦氏综合征、肝硬化、肝纤维化、老化、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、神经疾病、中风、脊髓损伤、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、骨质疏松症、囊性纤维病、伤口愈合、肌强直性营养不良、艾滋病肌无力症、HIV所伴随的脂肪再分布综合症、烧伤、克罗恩氏病、维尔纳氏综合征、X-连锁联合免疫缺陷病、耳聋、神经性厌食症和早产儿视网膜病、特纳综合征(Turner Syndrome)、普拉德-威利综合征(Prader-Willi Syndrome)、银罗素综合征(Silver-Russell Syndrome)、特发性矮小、肥胖、多发性硬化症、纤维肌痛症、溃疡性大肠炎(溃疡性结肠炎)、肌肉量低、心肌缺血、和骨密度低。
[0143] [39][37]或[38]所述的药物，其为肠胃外给予的药物。
[0144] [40][37]～[39]中任一项所述的药物，其为对非人动物进行给予的动物用药物。
[0145] [41][40]所述的药物，其中，该动物用药物以肌肉量和/或体长的增加、生长的促进、乳汁产生量的增加、繁殖的促进、或老化的预防为目的进行给予。
[0146] [42][40]或[41]所述的动物用药物，其中，非人动物为豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗、或鸡。
[0147] [43][37]～[42]中任一项所述的药物，其用于治疗或预防由IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的作用引起的疾病。
[0148] [44][43]所述的药物，其中，由IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的作用引起的疾病为选自下述的疾病：肝癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童期癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺增生症、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌(Cervix Cancer)、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)、与转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻(diarrhea associated with metastatic carcinoid and vasoactive intestinal peptide secreting tumor)、血管活性肠肽瘤(Vipoma)、弗纳-莫里森综合征(Verner-Morrison Syndrome)、贝克威思-威德曼综合征(Beckwith-Wiedemann syndrome)、肾癌、肾细胞癌、移行细胞癌(Transitional Cell Cancer)、尤文氏肉瘤(Ewing’s Sarcoma)、白血病、急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia)、脑肿瘤、胶质母细胞瘤(Glioblastoma)、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑膜瘤(Meningioma)、垂体腺瘤(Pituitary Adenoma)、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(Primitive Neuroectodermal Tumor)、髓母细胞瘤(Medulloblastoma)、星形细胞瘤、少突胶质瘤(Oligodendroglioma)、室管膜瘤(Ependymoma)、脉络丛乳头瘤(Choroid Plexus Papilloma)、巨人症、牛皮癣、动脉粥样硬化症(Atherosclerosis)、血管平滑肌再狭窄(Vascular Smooth Muscle Restenosis)、不适当的微血管增殖(Inappropriate Microvascular Growth)、糖尿病性视网膜病(Diabetic Retinopathy)、格雷夫斯病(Graves’Disease)、多发性硬化症(Multiple Sclerosis)、系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus)、慢性甲状腺炎、重症肌无力(Myasthenia Gravis)、自身免疫性甲状腺炎、以及白塞氏病(Behcet’s Disease)。
[0149] [45]培养方法，其是将脊椎动物来源的细胞在活体外进行培养的方法，所述方法包括下述的步骤：在培养过程中使该脊椎动物来源的细胞与[1]～[28]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物、[29]所述的核酸分子、[30]所述的载体、和[31]所述的重组体细胞的任意一种以上接触。
[0150] [46][45]所述的培养方法，其中，该接触的步骤以脊椎动物来源的细胞的增殖促进或分化诱导为目的来进行。
[0151] [47][45]或[46]所述的培养方法，其中，使抗IGF-I受体抗体或其片段或它们的衍生物吸附或固定于固相。
[0152] [48]基因重组动物，其特征在于，其是在IGF-I受体基因的CR结构域导入有突变的基因重组动物，该IGF-I受体的CR结构域通过基因重组，具有ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的氨基酸序列。
[0153] [49]基因重组动物，其是导入有异种的IGF-I受体基因的基因重组动物，对于该动物的内在固有的IGF-I受体的氨基酸序列，经导入的IGF-I受体基因所要编码氨基酸序列的CR结构域中的ProSerGlyPheIleArgAsnX1X2GlnSerMet的部分序列中，X1和/或X2的氨基酸残基与该动物的内在固有的IGF-I受体的氨基酸序列不一致的IGF-I受体基因被导入。
[0154] 发明效果
[0156] [图1]是表示将IGF-I受体的CR结构域的氨基酸序列(氨基酸序列以单字母记号表示)在小鼠、大鼠、人、豚鼠和兔中进行比较的结果的图。
[0157] [图2]是表示使用IGF11-16推定表位的变体的ELISA的结果的图。
[0158] [图3]是表示去除IGF11-16和IGF-I的药剂后的人成肌细胞的增殖活性的图。
[0159] [图4]是表示将IGF-I和IGF11-16添加到人分化肌细胞时的葡萄糖摄取作用的图。
[0161] [图6]是表示对禁食条件下的豚鼠单次皮下给予IGF-I时的血糖值的经时变化的图。
[0162] [图7]是表示对禁食条件下的豚鼠单次皮下给予IGF11-16时的血糖值的经时变化的图。
[0163] [图8]是表示对禁食条件下的豚鼠单次静脉内给予IGF11-16时的血糖值的经时变化的图。
[0164] [图9]是表示IGF11-16在下垂体摘除豚鼠(HPX)中的生长板软骨厚度的亢进作用的图。
[0165] [图10]是表示IGF11-16在下垂体摘除豚鼠(HPX)中的胫骨长度的亢进作用的图。
[0166] [图11]是表示对禁食条件下的豚鼠单次皮下给予IGF-I时的血中动力学的经时变化的图。
[0167] [图12]是表示对禁食条件下的豚鼠单次皮下给予IGF11-16时的血中动力学的经时变化的图。
具体实施方式
[0168] 以下，根据具体的实施方案对本发明进行说明，但本发明不受这些实施方案的任何限定。需说明的是，在本说明书中引用的包括专利公报、专利申请公开公报、和非专利公报在内的所有文献，对于所有目的而言，其整体均通过引用而并入本说明书中。
[0169] [IGF]
[0170] IGF是指胰岛素样生长因子(Insulin-Like Growth Factor)，存在IGF-I和IGF-II。IGF-I和IGF-II是与后述的IGF-I受体(胰岛素样生长因子-I受体：Insulin-Like Growth Factor-I Receptor)结合、具有在细胞内启动细胞分裂或代谢信号的激动剂活性的生物体内的配体。已知IGF-I和IGF-II还微弱地交叉结合至与IGF-I受体具有结构类似性的胰岛素受体(INSR)。本说明书中，只要涉及生理功能等更为已知的IGF-I，但在进行经由IGF-I受体与配体的结合的作用或疾病等的研究的情况下，可记载含有IGF-I与IGF-II两者的作用。
[0171] IGF-I也称为生长素介质C(Somatomedin C)，是由70个氨基酸构成的单一多肽的激素。人的IGF-I的序列可参考EMBL-EBI的UniProtKB-登录号P50919等而获取，序列表的SEQ ID NO:1表示成熟型IGF-I的氨基酸序列。由该70氨基酸构成的序列在多数种中是保守的。本发明中，在仅记载为“IGF-I”的情况下，除非另有说明，否则是指具有激素活性的IGF-I蛋白。
[0172] IGF-I是在以肝脏细胞为首的生物体内的各种细胞中产生，也存在于血液或其他体液中。因此，天然型的IGF-I可由动物的体液、或者将从动物分离的原代培养细胞或株化细胞等培养而得的培养物中纯化而得到。另外，由于IGF-I是通过生长激素在细胞中诱导产生，因此也可通过从给予了生长激素的动物的体液、或者将从动物分离的原代培养细胞或株化细胞等在生长激素存在下进行培养而得的培养物中纯化IGF-I而得到。另外，作为另外的方法，可使用将编码IGF-I的氨基酸序列的核酸分子插入到表达载体中并导入到大肠杆菌等的原核生物或酵母、昆虫细胞或哺乳类来源的培养细胞等真核细胞的宿主中而得的重组体细胞、或者导入有IGF-I基因的转基因动物或转基因植物等，也可制造IGF-I。而且，人IGF-I也可作为研究用试剂(Enzo Life Sciences,catalog:ADI-908-059-0100,Abnova,catalog:P3452等)、药品(Somazon(注册商标)美卡舍明、INCRELEX(注册商标)等)而获取。所用的IGF-I在活体内和活体外的活性可通过将世界卫生组织的国家生物标准与控制研究所(NIBSC)的NIBSC code：91/554的IGF-I标准物质的活性作为1个国际单位/微克进行比较，来评价该比活性。本发明中的IGF-I被视为与该NIBSC code：91/554的IGF-I具有同等的比活性。
[0173] [IGF-I受体]
[0174] IGF-I受体是指胰岛素样生长因子-I受体(Insulin-Like Growth Factor-I Receptor)。在本说明书中，对于“IGF-I受体”，除非另有说明，否则是指IGF-I受体蛋白。IGF-I受体是由α链和β链构成的2个亚基缔合而成的结构蛋白。在SEQ ID NO:2所示的人IGF-I受体的氨基酸序列中，其氨基酸序列中由第31位至第735位的氨基酸序列构成的部分相当于α链，β链相当于第740位以后的序列。IGF-I受体的α链具有IGF-I的结合部分，β链为跨膜结构，且起到向细胞内传递信号的作用。IGF-I受体的α链被分为L1、CR、L2、FnIII-1和FnIII-2a/ID/FnIII-2b的结构域。在SEQ ID NO:2所示的人IGF-I受体的氨基酸序列中，第
31位至第179位的部分相当于L1结构域、第180位至第328位的部分相当于CR结构域、第329位至第491位的部分相当于L2结构域、第492位至第607位的部分相当于FnIII-1结构域和第
608位至第735位相当于FnIII-2a/ID/FnIII-2b结构域。其中，CR结构域(Cysteine-Rich Domain，富含半胱氨酸的结构域)参与当IGF-I与IGF-I受体结合时的该受体的构象变化所伴随的、β链的细胞内酪氨酸激酶的活化。人的IGF-I受体的氨基酸序列可参见EMBL-EBI的UniProtKB-登录号P08069等，也示于序列表的SEQ ID NO:2中。
31位至第179位的部分相当于L1结构域、第180位至第328位的部分相当于CR结构域、第329位至第491位的部分相当于L2结构域、第492位至第607位的部分相当于FnIII-1结构域和第
608位至第735位相当于FnIII-2a/ID/FnIII-2b结构域。其中，CR结构域(Cysteine-Rich Domain，富含半胱氨酸的结构域)参与当IGF-I与IGF-I受体结合时的该受体的构象变化所伴随的、β链的细胞内酪氨酸激酶的活化。人的IGF-I受体的氨基酸序列可参见EMBL-EBI的UniProtKB-登录号P08069等，也示于序列表的SEQ ID NO:2中。
[0175] 已知IGF-I受体在生物体内的组织或细胞的广范围表达，接受通过IGF-I的细胞增殖的诱导或细胞内信号的活化等的刺激。特别是，成肌细胞能够以细胞增殖活性为指标评价IGF-I经由IGF-I受体的作用。因此，成肌细胞在分析与IGF-I受体结合的抗体的作用方面有用。另外，在将编码人或其他脊椎动物的IGF-I受体的氨基酸序列的核酸分子插入到表达载体、且导入到昆虫细胞或哺乳类来源的培养细胞等真核细胞的宿主而得的重组体细胞中，通过使导入到该细胞膜上的核酸所编码的IGF-I受体表达，能够人工制造表达有人或其他脊椎动物的IGF-I受体的细胞。该IGF-I受体表达细胞可用于抗体的结合性分析或向细胞内传递信号等的研究。
[0176] [抗IGF-I受体抗体]
[0177] 抗体是指通过二硫键相互连接而得的至少含有2个重(H)链和2个轻(L)链的糖蛋白。各自的重链含有重链可变区(简称为VH)和重链恒定区，重链恒定区含有3个结构域CH1、CH2和CH3。各自的轻链含有轻链可变区(简称为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区含有1个结构域CL。轻链的恒定区中存在被称为λ链和κ链的2种类。重链的恒定区中存在γ链、μ链、α链、δ链和ε链，由于该重链的不同，存在分别被称为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的抗体同种型(Isotype)。VH和VL区还被称为框架区(FR)，被细分为更保守的4个区(FR-1、FR-2、FR-3、FR-4)和被称为互补性决定区(CDR)的超可变性的3个区(CDR-1、CDR-2、CDR-3)。VH含有自氨基末端至羧基末端以FR-1、CDR-1(CDR-H1)、FR-2、CDR-2(CDR-H2)、FR-3、CDR-3(CDR-H3)、FR-4的顺序排列的3个CDR和4个FR。VL含有自氨基末端至羧基末端以FR-1、CDR-1(CDR-L1)、FR-
2、CDR-2(CDR-L2)、FR-3、CDR-3(CDR-L3)、FR-4的顺序排列的3个CDR和4个FR。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
2、CDR-2(CDR-L2)、FR-3、CDR-3(CDR-L3)、FR-4的顺序排列的3个CDR和4个FR。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0178] 本发明中的抗体可以是抗体的片段和/或衍生物。作为抗体的片段，可举出F(ab’)2、Fab、Fv等。作为抗体的衍生物，可举出：将氨基酸突变人工导入到恒定区部分而得的抗体、改变恒定区的结构域的构成而得的抗体、每个分子具有2个以上的Fc的形的抗体、仅由重链或仅由轻链构成的抗体、糖链修饰抗体、双特异性抗体、抗体或抗体的片段化合物或与抗体以外的蛋白结合的抗体缀合物、抗体酶、纳米抗体、串联scFv、双特异性串联scFv、双抗体(Diabody)、VHH等。需说明的是，本发明中，在仅称为“抗体”的情况下，只要没有另外明确记载，则也包括抗体的片段和/或衍生物。
[0179] 另外，经典而言，单克隆抗体是指从来源于单一的抗体产生细胞的克隆得到的抗体分子，但也指含有由特定的氨基酸序列构成的VH与VL的组合的单一种类的抗体分子。单克隆抗体也可得到具有编码该抗体蛋白质的氨基酸的基因序列的核酸分子，也可使用这样的核酸分子通过基因工程来制作抗体。另外，使用H链、L链、它们的可变区或CDR序列等的基因信息，进行用于提高抗体的结合性或特异性的修饰等、或由小鼠等动物的抗体修饰成人源化抗体，由此制作适合用于治疗剂的结构的抗体，这对于在该领域的本领域技术人员而言是熟知的技术。另外，通过使用导入有人抗体基因的非人-转基因动物作为致敏抗原的动物，也可获取人源化的单克隆抗体。除此之外，作为无需对动物进行致敏的方法，本领域技术人员还可适当进行下述的技术：使用表达人抗体的抗原结合区或其一部分的噬菌体文库(人抗体噬菌体展示)，获取与对应的抗原特异性结合的抗体或由特定的氨基酸序列构成的噬菌体克隆，由该信息制作人抗体的技术(例如，参见Taketo Tanaka等、Keio J.Med.、60卷、37-46页的评论等)。另外，在设计给予人以外的动物的抗体的情况下，与人源化的技术同样，使用适当CDR或可变区的氨基酸序列信息，本领域技术人员可进行设计。
[0180] 本发明中，“抗原抗体反应”是指，抗体以平衡解离常数(KD)1×10-8M以下的亲和性与IGF-I受体结合。本发明的抗体优选以通常1×10-8M以下、其中1×10-9M以下、进一步1×-1010 M以下的KD与IGF-I受体结合。
[0181] 抗体的特异性是指抗体对某种抗原引起高的抗原抗体反应。特别是，在本发明中，IGF-I受体特异性抗体是指，在与表达有IGF-I受体的细胞显著地显示抗原抗体反应的浓度下，抗原抗体对与IGF-I受体的初级结构(氨基酸序列)和高级结构具有高类似性的INSR的反应性，为对Mock细胞的反应性的1.5倍以下的情况。
[0182] 关于抗原抗体反应的测定，本领域技术人员可适当选择进行在固相或液相的系统中的结合测定。作为这样的方法，可举出：酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)、酶免疫测定法(enzyme immunoassay：EIA)、表面等离子体共振法(surface plasmon resonance：SPR)、荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer：FRET)、发光共振能量转移法(luminescence resonance energy transfer：LRET)等，但不限于这些。另外，当测定这样的抗原抗体结合时，还可将抗体和/或抗原用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素等进行标记，使用适合于该标记物质的物理和/或化学特性的测定方法来检测抗原抗体反应。
[0183] 本发明中的抗IGF-I受体抗体含有激动剂抗体和拮抗剂抗体的两者。本发明的IGF-I受体激动剂抗体在单独作用的情况下，具有成肌细胞的增殖活性的亢进作用。本发明的IGF-I受体拮抗剂抗体在与IGF-I同时作用的情况下，具有通过IGF-I的成肌细胞的增殖活性的抑制作用。
[0184] 本发明中的与IGF-I受体的特异性结构域强力结合的IGF-I受体激动剂抗体在活体外具有成肌细胞的增殖活性的亢进作用。
[0185] 另外，本发明的IGF-I受体激动剂抗体在使成肌细胞的增殖活性亢进的作用浓度、更优选比作用浓度高10倍的浓度、进一步优选高100倍的浓度下，不具有在活体外的分化肌细胞的葡萄糖摄取亢进作用。
[0186] 显示IGF-I的肌肉量增加作用的剂量具有显著的血糖降低作用，但本发明的IGF-I受体激动剂抗体即使在显示肌肉量增加作用的剂量、更优选比该剂量高10倍以上的剂量下，也不具有血糖降低作用。
[0187] 而且，对豚鼠单次给予IGF-I受体激动剂抗体，与持续给予IGF-I时的肌肉量增加作用，具有同等程度的活体内活性。另外，本发明的IGF-I受体激动剂抗体的血中半衰期长，通过对动物进行单次给予显示肌肉量增加作用。
[0188] 根据上述得知，本发明的IGF-I受体激动剂抗体具有成为在IGF-I被期待的废用性肌肉萎缩和身材矮小症等的IGF-I受体相关的种种疾病的治疗药或预防药的可能性，且克服作为IGF-I的问题点的血糖降低作用，可延长血中半衰期。
[0189] 本发明的IGF-I受体拮抗剂抗体抑制IGF-I与IGF-I受体结合。作为本发明的IGF-I受体拮抗剂抗体的一个方案，该抗体活化IGF-I受体，但抑制通过IGF-I对IGF-I受体的作用。该情况下，该抗体具有抵消IGF-I的额外的激动剂活性的作用、例如抵消IGF-I对成肌细胞的增殖诱导活性的作用。另外，作为本发明的IGF-I受体拮抗剂抗体的另一方案，是与IGF-I受体结合但不活化IGF-I受体的抗体。作为不引起通过这样的IGF-I受体的交联的活化的拮抗剂抗体的实例，有Fab，scFv等的抗原结合性为1价的抗体、具有如双特异性抗体的2价的结合部位但仅其单侧的结合部位与IGF-I受体的特异性结构域结合的抗体或用接头等使2价的结合部位的距离变化而得的抗体等，但不限于这些。在本发明的IGF-I受体拮抗剂抗体中，与IGF-I受体结合但不具有激动剂活性的抗体，通过测定抗体与IGF-I受体的抗原抗体反应的方法可确认具有与IGF-I受体的结合性，通过在成肌细胞等细胞中的细胞增殖试验可确认不具有细胞增殖的诱导活性。另外，该IGF-I受体拮抗剂抗体对于在活体外的分化肌细胞的葡萄糖摄取或在活体内的血糖值没有影响。因此，本发明的IGF-I受体拮抗剂抗体作为不显示高血糖等副作用的抗IGF-I受体抗体，具有成为乳癌、大肠癌(结肠癌)、肉瘤、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨髓瘤等的恶性肿瘤等的治疗药或预防药的可能性。
[0190] [抗IGF-I受体抗体的结合]
[0191] 本发明的抗IGF-I受体抗体将IGF-I受体的CR结构域作为表位。另一方面，IGF-I受体激动剂抗体对于与IGF-I受体的初级结构(氨基酸序列)和高级结构具有高类似性的INSR不具有结合性。
[0192] 本发明的抗IGF-I受体抗体被认为：通过与IGF-I受体的CR结构域结合，使IGF-I受体形成二聚体的同型受体、或者IGF-I受体与INSR形成二聚体的异型受体活化。
[0193] [抗IGF-I受体抗体的序列]
[0194] 本发明的抗IGF-I受体抗体只要与脊椎动物的IGF-I受体特异性结合、且具有细胞增殖的诱导活性，则对序列没有特别限定。
[0195] 然而，作为各CDR序列，优选具有特定的氨基酸序列。具体而言如下所示。需说明的是，本发明中氨基酸序列的“同一性(Identity)”是指，一致的氨基酸残基的比例，同源性(Similarity)是指，一致或类似的氨基酸残基的比例。同源性和同一性可通过例如BLAST法(NCBI的PBLAST的默认条件)进行确定。
[0197] 1)具有脂族侧链的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸残基；
[0198] 2)具有脂族羟基侧链的氨基酸残基：丝氨酸和苏氨酸残基；
[0199] 3)具有含酰胺侧链的氨基酸残基：天冬酰胺和谷氨酰胺残基；
[0200] 4)具有芳族侧链的氨基酸残基：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基；
[0201] 5)具有碱性侧链的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基；
[0202] 6)具有酸性侧链的氨基酸残基：天冬氨酸和谷氨酸残基；
[0203] 7)具有含硫侧链的氨基酸残基：半胱氨酸和甲硫氨酸残基。
[0204] 本发明中，作为重链可变区的CDR-1(CDR-H1)序列，优选SEQ ID NO:3(SerTyrTrpMetHis)或SEQ ID NO:3中任意1处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。另外，作为CDR-H1序列，优选与SEQ ID NO:3具有80％以上同源性。需说明的是，本发明中，在某种氨基酸序列中的任一氨基酸残基(以下“第1的氨基酸残基”)被其他氨基酸残基(以下“第2的氨基酸残基”)取代的情况下，更优选取代前的第1的氨基酸残基与取代后的第2的氨基酸残基为结构和/或性质相互类似的氨基酸残基。
[0205] 作为重链可变区的CDR-2(CDR-H2)序列，优选SEQ ID NO:4(GluThrAsnProSerAsnSerValThrAsnTyrAsnGluLysPheLysSer)或SEQ ID NO:4中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。另外，作为CDR-H2序列，优选与SEQ ID NO:4具有82％以上、其中88％以上、进一步94％以上的同源性。
[0206] 作为重链可变区的CDR-3(CDR-H3)序列，优选SEQ ID NO:5(GlyArgGlyArgGlyPheAlaTyr)或SEQ ID NO:5中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。另外，作为CDR-H3序列，优选与SEQ ID NO:5具有75％以上、更优选87％以上的同源性。
[0207] 作为轻链可变区的CDR-1(CDR-L1)序列，优选SEQ ID NO:6(ArgAlaSerGlnAsnIleAsnPheTrpLeuSer)或SEQ ID NO:6中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。另外，作为CDR-L1序列，优选与SEQ ID NO:6具有81％以上的同源性、其中90％以上的同源性。
[0208] 作为轻链可变区的CDR-2(CDR-L2)序列，优选SEQ ID NO:7(LysAlaSerAsnLeuHisThr)或SEQ ID NO:7中任意1处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。另外，作为CDR-L2序列，优选与SEQ ID NO:7具有85％以上的同源性。
[0209] 作为轻链可变区的CDR-3(CDR-L3)序列，优选SEQ ID NO:8(LeuGlnGlyGlnSerTyrProTyrThr)或SEQ ID NO:8中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列。另外，作为CDR-L3序列，优选与SEQ ID NO:8具有77％以上、更优选88％以上的同源性。
[0210] 特别是，本发明的抗IGF-I受体抗体优选具有以下的CDR序列的组合。
[0211] 作为CDR-H1序列的序列3的氨基酸序列；
[0212] 作为CDR-H2序列的序列4的氨基酸序列；
[0213] 作为CDR-H3序列的序列5的氨基酸序列；
[0214] 作为CDR-L1序列的序列6的氨基酸序列；
[0215] 作为CDR-L2序列的序列7的氨基酸序列；和
[0216] 作为CDR-L3序列的序列8的氨基酸序列。
[0217] 需说明的是，作为鉴定抗体中的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、或CDR-L3的各序列的方法，例如可举出：Kabat法(Kabat等人、The Journal of Immunology、1991、147卷、No.5、1709-1719页)或Chothia法(Al-Lazikani等人、Journal of Molecular Biology、1997、273卷、No.4、927-948页)。这些方法对于该领域的本领域技术人员而言为技术常识，例如也可从Dr.Andrew C.R.Martin‘s Group的因特网主页(http：//www.bioinf.org.uk/abs/)获知概述。
[0218] 本发明的抗体即免疫球蛋白的框架序列优选为脊椎动物的免疫球蛋白的各类中的框架序列。特别优选为人或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗、鸡、小鼠或大鼠的非人动物的免疫球蛋白的各类中的框架序列。
[0219] 本发明的抗IGF-I受体抗体作为重链可变区和轻链可变区，优选具有特定的氨基酸序列。具体而言如以下所示。
[0220] 作为重链可变区，优选SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:9中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9具有90％以上同源性的氨基酸序列。作为轻链可变区，优选SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10中任意1处或2处的氨基酸残基经取代、缺失、或插入而得的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:10具有90％以上同源性的氨基酸序列。特别是，本发明的抗IGF-I受体抗体优选IGF11-16。即，优选含有作为重链可变区的SEQ ID NO:9与作为轻链可变区的SEQ ID NO:10的组合序列。
[0221] 通过将人抗体的重链和轻链的各框架区和/或各恒定区的氨基酸序列与以上的重链和轻链的各CDR和/或各链可变区的氨基酸序列适当组合，本领域技术人员可设计本发明的人源化抗IGF-I受体抗体。人源化抗体的重链和轻链的各框架区和/或各恒定区的氨基酸序列可选自例如人的IgG、IgA、IgM、IgE、IgD的各类或其变体。
[0222] 在本发明的抗IGF-I受体抗体为IGF-I受体激动剂抗体的情况下，优选本发明的抗体或其抗原结合片段为人IgG类或其变体，优选为人IgG4亚类、人IgG1亚类或其变体。在一个实例中，稳定化IgG4恒定区通过Kabat系统在铰链区的位置241处含有脯氨酸。该位置通过EU编号方式(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,DIANE Publishing,1992、Edelman等人、Proc.Natl.Acad.Sci USA、63、78-85、1969)，对应于铰链区的位置228。在人IgG4中，该残基通常为丝氨酸，可通过丝氨酸取代成脯氨酸而诱导稳定化。在一个实例中，可通过将N297A突变插入到IgG1的恒定区以尽可能地抑制对Fc受体的结合和/或固定补体的能力。
[0223] [竞争结合]
[0224] 本发明的抗IGF-I受体抗体与对于IGF-I受体进行竞争结合的抗体也包括在本发明的范围内。本发明中“竞争结合”是指，当多种的单克隆抗体与抗原共存时，一种抗体与抗原的结合被另一种抗体与抗原的结合所抑制的现象。一般而言，对于一定量(浓度)的单克隆抗体，在将另外的单克隆抗体的量(浓度)改变并加入的情况下，可通过测定前者的一定量的单克隆抗体与抗原的结合量所降低的添加量(浓度)来测定。该抑制的程度可用称为IC50或Ki的值表示。与本发明的抗IGF-I受体抗体竞争结合的单克隆抗体是指，当使用本发明的抗IGF-I受体抗体、例如使用IGF11-16抗体在10nM下检测抗原抗体结合时，IC50通常为1000nM以下、其中为100nM以下、进一步为10nM以下的抗体。在进行竞争结合测定的情况下，将所用的抗体用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素等进行标记，使用适合于该标记物质的物理和/或化学特性的测定方法进行检测，由此也可进行该测定。
[0225] [交叉反应]
[0226] 本发明的抗IGF-I受体抗体优选对于其他脊椎动物的IGF-I受体具有交叉反应。交叉反应表示抗体与不同于该抗体进行抗原抗体反应的IGF-I受体的动物种(例如人)的其他动物种的抗原的结合性。优选与该抗体进行抗原抗体反应的IGF-I受体的动物种以外的人或包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、绵羊、狗或鸡的非人动物的IGF-I受体具有交叉反应性。在实施例7中，作为抗IGF-I受体抗体的IGF11-16抗体显示出与人IGF-I受体的CR结构域中的ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的序列进行结合。对于猴(食蟹猴)、兔、豚鼠、牛、绵羊、马和狗的IGF-I受体的相同的部分，该ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的序列被保守，与这些物种之间的IGF-I受体具有结合交叉性。另外，在小鼠和大鼠中，该相同部分的氨基酸序列成为ProSerGlyPheIleArgAsnSerThrGlnSerMet，通过获取与该部分结合的抗IGF-I受体抗体，与小鼠或大鼠等的IGF-I受体结合，可获取与IGF11-16具有同样的性状或功能的抗体。
[0227] 另外，使用不与本发明的抗IGF-I受体抗体进行交叉反应的动物种，使该细胞或动物通过基因工程进行修饰，由此也可制作表达本发明的抗IGF-I受体抗体进行交叉反应的IGF-I受体的细胞或动物。
[0228] [脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性、肌肉量和/或体长的增加的诱导活性][0229] 本发明的一个方案中的抗IGF-I受体抗体具有脊椎动物来源细胞的增殖诱导活性。IGF-I受体激动剂抗体的存在尽管已经是已知的，但没有报道在原代培养细胞、其中的成肌细胞中显示细胞的增殖诱导活性的抗体。而且，在活体外，也没有报道在低于IGF-I的EC50值的剂量下也具有细胞的增殖诱导活性的抗体。本发明中的脊椎动物来源的细胞是指，优选为来源于哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或魚类的细胞，更优选为来源于哺乳类或鸟类的细胞，更进一步优选为来源于人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、马或狗的细胞。在来源于这些物种的细胞中，如果是表达IGF-I受体并为本发明的抗IGF-I受体抗体与该IGF-I受体进行交叉反应的细胞，则能够通过本发明的抗IGF-I受体抗体诱导细胞增殖。另外，经修饰以表达与本发明的抗IGF-I受体抗体具有交叉反应性的物种的IGF-I受体的细胞或动物、或来源于该修饰动物的细胞也包括在本发明的脊椎动物来源的细胞中。
[0230] 作为用于研究脊椎动物来源细胞的活体外的增殖诱导活性的细胞，可使用原代培养细胞、株化细胞或这些细胞的转化体细胞等。原代培养细胞是指，从生物的器官或组织分离而得的细胞，通常是指能够以某种程度的继代数进行继代培养的细胞。脊椎动物来源的原代培养细胞可通过基于酶处理、物理方法的分散或外植体法(Explant Method)等的方法从脊椎动物的器官或组织而得到。另外，也可使用由脊椎动物所得的器官或组织、或它们的片段。作为调制这些该原代细胞的器官或组织，可优选举出：甲状腺、甲状旁腺或肾上腺等内分泌组织，阑尾、扁桃体、淋巴结或脾脏等免疫组织，气管或肺等呼吸器官，胃、十二指肠、小肠或大肠等消化器官，肾脏或膀胱等泌尿器官，输精管、睾丸或前列腺等雄性生殖器官，乳房或卵管等雌性生殖器官，心肌或骨骼肌等的肌组织等，更优选为肝脏、肾脏或消化器官或肌组织等，更进一步优选为肌组织。作为用于研究本发明中的抗IGF-I受体抗体的增殖诱导活性所用的该原代培养细胞，可使用表达IGF-I受体、并通过与该IGF-I受体结合的IGF-I而诱导增殖的细胞。作为其代表，可使用从肌组织分离而得的原代培养细胞即骨骼肌成肌细胞等。人或动物来源的原代培养细胞也可获取并使用分让(分譲)或市售的原代培养细胞，人原代培养细胞例如可从ATCC(注册商标)、ECACC、Lonza、Gibco(注册商标)、Cell Applications、ScienCell research laboratories、PromoCell等的机关或公司获取。
[0231] 株化细胞是指，来源于生物的细胞被永久化、且在保持一定性质的同时能够半永久性增殖的培养细胞。株化细胞中存在非肿瘤来源的细胞和肿瘤来源的细胞。作为用于研究通过本发明的抗IGF-I受体抗体的增殖诱导活性的脊椎动物来源的株化细胞，可使用表达IGF-I受体、并通过与该IGF-I受体结合的IGF-I而诱导增殖的细胞。作为表达IGF-I受体、并通过IGF-I诱导细胞增殖的株化细胞，例如有人神经母细胞瘤SH-SY5Y、人表皮角化细胞系HaCaT、人肺胞基底上皮腺癌细胞系A549、人结肠腺癌细胞系Caco-2、人肝癌来源的细胞系HepG2、人宫颈癌细胞系Hela、人宫颈癌细胞系SiHa、人乳腺癌细胞系MCF7、人多能胚胎癌NTERA-2或人骨肉瘤细胞系U-2-OS等，但不限于这些。
[0232] 另外，作为研究通过本发明的抗IGF-I受体抗体的增殖诱导的细胞，还可举出原代培养细胞或株化细胞的转化体细胞。作为这样的转化细胞，可举出：由原代培养细胞制作的iPS细胞或由该iPS细胞分化诱导的细胞或组织等。另外，作为其他转化细胞，在原代培养细胞或株化细胞中导入基因，使其一过性或持续性表达的细胞也包括在该转化细胞中。作为导入到该细胞并表达的基因，也可含有人或其他物种的IGF-I受体的基因。
[0233] 作为研究脊椎动物来源的细胞中的通过本发明的抗IGF-I受体抗体的细胞增殖诱导的方法，可举出细胞数测量、DNA合成量的测定、代谢酶活性的变化量的测定等。细胞数测量的方法有使用血细胞计数板的方法或使用库尔特计数器等的细胞数测量装置的方法，作为测定DNA合成量的方法，有通过摄取[3H]-胸苷或5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的测定方法，作为观察代谢酶活性的变化量的方法，有MTT法、XTT法或WST法等，但本领域技术人员还可适当实施其他的方法等。细胞增殖诱导活性可通过使本发明的抗IGF-I受体抗体与用于试验的培养细胞反应的情况下的细胞增殖比不使该抗体反应的情况下的细胞增殖上升来判定。在该情况下，作为该诱导活性的对照，若在同等条件下进行使作为原本IGF-I受体的配体的IGF-I反应的测定，则对于该活性的评价是方便的。
[0234] 当本发明的抗IGF-I受体抗体和IGF-I在变化各自的浓度与进行试验的培养细胞反应时，显示最大增殖活性的50％时的浓度以EC50值的形式表示。在使用人骨骼肌成肌细胞评价增殖活性的情况下，优选本发明的抗IGF-I受体抗体的细胞增殖诱导活性与IGF-I为同等的EC50值，更优选本发明的抗IGF-I受体抗体的EC50值为IGF-I的1/10以下，进一步优选为1/20以下，更进一步优选本发明的抗IGF-I受体抗体的EC50值为IGF-I的1/50以下。另外，在使用人骨骼肌成肌细胞评价增殖活性的情况下，本发明的抗IGF-I受体抗体的EC50值优选为
0.5nmol/L以下，更优选为0.3nmol/L以下，进一步优选为0.1nmol/L以下。
0.5nmol/L以下，更优选为0.3nmol/L以下，进一步优选为0.1nmol/L以下。
[0235] 作为研究脊椎动物来源细胞的活体内的增殖诱导活性的方法，可如下进行研究：通过对该脊椎动物肠胃外给予本发明的抗IGF-I受体抗体，测量所给予的个体整体、或所给予的个体中的器官或组织的重量、大小、细胞数等的变化；或者使用移植了该脊椎动物细胞的动物，在接受该移植的个体中测量含有该移植的脊椎动物细胞的移植片的重量、大小、细胞数等的变化。在个体整体的测量中，可使用体重、体长、四肢周长等的测定、或通过阻抗法的体组成测定、肌酸酐、身高系数等。对于个体中的器官或组织、或移植片的测量，在人以外的动物中，直接回收目标的器官、组织或移植片，进行重量、大小或所含的细胞数的计算等。
另外，作为非侵入性地测量个体的器官、组织或移植片的方法，可使用X射线摄影图像或通过CT、MRI的图像分析、使用通过同位素或荧光物质的示踪剂的造影法等。在成为对象的组织为骨骼肌的情况下，肌力的变化等成为指标。此外，本领域技术人员可通过适当使用其他的方法，来研究本发明的抗IGF-I受体抗体对于脊椎动物来源细胞的活体内的增殖诱导活性的作用。为了研究本发明的抗IGF-I受体抗体的活体内的细胞增殖诱导活性，可在给予本发明的抗IGF-I受体抗体的个体、与给予本发明的抗IGF-I受体抗体以外的抗体或另外的对照物质的个体之间，通过比较进行如上方法等中的测量等的结果来评价。
另外，作为非侵入性地测量个体的器官、组织或移植片的方法，可使用X射线摄影图像或通过CT、MRI的图像分析、使用通过同位素或荧光物质的示踪剂的造影法等。在成为对象的组织为骨骼肌的情况下，肌力的变化等成为指标。此外，本领域技术人员可通过适当使用其他的方法，来研究本发明的抗IGF-I受体抗体对于脊椎动物来源细胞的活体内的增殖诱导活性的作用。为了研究本发明的抗IGF-I受体抗体的活体内的细胞增殖诱导活性，可在给予本发明的抗IGF-I受体抗体的个体、与给予本发明的抗IGF-I受体抗体以外的抗体或另外的对照物质的个体之间，通过比较进行如上方法等中的测量等的结果来评价。
[0236] 本发明的抗IGF-I受体抗体具有如下特征：对于与细胞接触的时间，因增殖诱导的作用相对于天然型IGF-I较长，因此持续性得到改善。在实施例12的活体外的细胞增殖诱导活性中，在天然型IGF-I与细胞接触后，若用不含IGF-I的培养基洗涤，则细胞增殖诱导活性消失，相对于此，作为本发明的抗IGF-I受体抗体的IGF11-16抗体在与细胞接触后，即使在用不含IGF11-16抗体的培养基洗涤的情况下，细胞的增殖诱导活性也持续。另外，在实施例16中，比较IGF-I与作为本发明的抗IGF-I受体抗体的IGF11-16抗体的血中动力学，天然型IGF-I在给予动物后24小时为止约50％以上自血中消失，相对于此，IGF11-16抗体在给予动物后48小时后仍在血中存在60％以上，因此显示出经过长期间仍存在于血中。根据这些可知，本发明的抗IGF-I受体抗体在活体外和活体内显示出较长的细胞增殖诱导效果。
[0237] 另外，作为本发明的抗IGF-I受体抗体在活体内的效果，可举出肌肉量和/或体长的增加效果。IGF-I在骨骼肌中除了对上述的成肌细胞的增殖或分化起作用以外，还具有加粗肌纤维的作用，作为这样的综合性作用，认为具有增加肌肉量的效果。本发明的抗IGF-I受体抗体通过与IGF-I同样地对动物进行给予还具有增加该动物的肌肉量的效果。作为IGF-I受体激动剂抗体的作用，本发明的抗IGF-I受体抗体首次显示出在活体内具有肌肉的增加作用。
[0238] 作为测量通过本发明的抗IGF-I受体抗体的肌肉量的增加效果的方法，在个体整体的测量中，使用体重、体长、四肢周长等的测定、或通过阻抗法的体组成测定、肌酸酐、身高系数等，另外，使用通过CT、MRI的图像分析、使用通过同位素或荧光物质的示踪剂的造影法等的方法，此外肌力的变化等也成为指标。另外，在人以外的动物中，也可直接采集肌肉并测量其重量或大小的方法等。肌肉量的增加效果可通过比较给予本发明的抗IGF-I受体抗体的个体与未给予该抗体的个体中的肌肉量的增加、或通过进行一个个体中给予本发明的抗IGF-I受体抗体之前与给予之后的肌肉量的比较来评价。关于肌肉量的增加效果，如果给予本发明的抗IGF-I受体抗体观察到肌肉量的增加之差，则可知该效果，但通过在给予本发明的抗IGF-I受体抗体的个体与未给予的个体、或者给予本发明的抗IGF-I受体抗体之前与之后，观察到优选103％以上、更优选104％以上的肌肉量之差，可判断通过给予本发明的抗IGF-I受体抗体的效果。IGF-I也参与骨的生长，并且还具有增加体长(人的情况下为身高)的作用。因此，本发明的抗IGF-I受体抗体通过对动物进行给予也具有增加体长的效果。通过本发明的抗IGF-I受体抗体的体长增加的效果可通过测定个体的体重、体长、四肢周长等进行测量。
[0239] [对于脊椎动物来源细胞中的葡萄糖摄取和/或动物中的血糖值的作用]
[0240] 本发明的一个方案中的抗IGF-I受体抗体具有下述特征：对于在脊椎动物来源的分化肌细胞中的葡萄糖摄取到细胞内的作用和/或在脊椎动物中的血糖值不产生影响。已知IGF-I作为IGF-I受体的激动剂作用的一部分，其引起向细胞中摄取葡萄糖的上升作用或血糖值的降低作用，但出乎意料的是，在作为IGF-I受体激动剂抗体发挥功能的本发明的抗IGF-I受体抗体中，显示下述的性状：即使在细胞中的增殖诱导活性的活体外的EC50值的100倍以上的剂量下，也不诱导在分化肌细胞中的葡萄糖摄取，并且在对动物进行肠胃外给予的情况下，即使在诱导肌肉量的增加的有效剂量的甚至10倍以上，血糖值也不会产生变动。另外，作为IGF-I受体拮抗剂抗体的性状，对于在脊椎动物来源细胞的分化肌细胞中的葡萄糖摄取和/或在脊椎动物中的血糖值不产生影响的特征，在避免将以往的IGF-I受体拮抗剂抗体用于人的治疗时的未充分的课题即高血糖等方面也是有利的效果。本发明中的脊椎动物来源细胞是指，优选为来源于哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或魚类的细胞，更优选为来源于哺乳类或鸟类的细胞，更进一步优选为来源于人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、马或狗的细胞。另外，本发明的脊椎动物来源细胞还包括经修饰以表达与本发明的抗IGF-I受体抗体具有交叉反应性的脊椎动物物种来源的IGF-I受体或者导入突变以具有结合性的IGF-I受体而得的细胞或来源于动物、或者该修饰动物的细胞。
[0241] 作为用于研究本发明中的抗IGF-I受体抗体对于脊椎动物来源细胞的活体外的葡萄糖摄取到细胞内不产生影响的特征的细胞，可使用原代培养细胞、株化细胞或这些细胞的转化体细胞等。原代培养细胞是指，从生物的器官或组织分离的细胞，且通常是指能够以某种程度的继代数进行继代培养的细胞。脊椎动物来源的原代培养细胞可通过酶处理、物理方法的分散或外植体法(Explant Method)等的方法从脊椎动物的器官或组织而得到。作为调制该原代细胞的器官或组织，可优选举出：甲状腺、甲状旁腺或肾上腺等内分泌组织，阑尾、扁桃体、淋巴结或脾脏等免疫组织，气管或肺等呼吸器官，胃、十二指肠、小肠或大肠等的消化器官，肾脏或膀胱等泌尿器官，输精管、睾丸或前列腺等雄性生殖器官，乳房或卵管等雌性生殖器官，心肌或骨骼肌等的肌组织等，更优选为肝脏、肾脏或消化器官或肌组织等，更进一步优选为肌组织。
[0242] 作为用于研究本发明中的抗IGF-I受体抗体对于葡萄糖摄取到细胞内不产生影响的特征所使用的该原代培养细胞，可使用表达IGF-I受体、并通过与该IGF-I受体结合的IGF-I诱导葡萄糖摄取到细胞内的细胞。作为其代表，可举出：使从肌组织分离的原代培养细胞即骨骼肌成肌细胞分化而得的分化肌细胞。
[0243] 本发明的分化肌细胞是指经分化的肌细胞、也包括分化没有完全结束的细胞。需说明的是，本发明中的“分化肌细胞”在简易上将分化开始约6天后的细胞称为分化肌细胞。人或动物来源的原代培养细胞可获取并使用分让(分譲)或市售的原代培养细胞，人原代培养细胞可从例如ATCC(注册商标)、ECACC、Lonza、Gibco(注册商标)、Cell Applications、ScienCell research laboratories、PromoCell等的机构或公司获取。
[0244] 株化细胞是指，来源于生物的细胞被永久化、且在保持一定性质的同时能够半永久性增殖的培养细胞。株化细胞中存在非肿瘤来源的细胞和肿瘤来源的细胞。作为用于研究本发明的抗IGF-I受体抗体对于葡萄糖摄取到细胞内所带来的影响的脊椎动物来源的株化细胞，可使用表达IGF-I受体、并通过与该IGF-I受体结合的IGF-I诱导葡萄糖摄取到细胞内的细胞。作为表达IGF-I受体、并通过IGF-I诱导葡萄糖摄取到细胞内的细胞，例如有骨骼肌细胞、脂肪细胞、表皮角化细胞等，但不限于这些。
[0245] 另外，作为研究本发明的抗IGF-I受体抗体对于向细胞内的葡萄糖摄取所带来的影响的细胞，还可举出原代培养细胞或株化细胞的转化体细胞。作为这样的转化细胞，可举出由原代培养细胞制作的iPS细胞或由该iPS细胞分化诱导的细胞等。另外，作为其他转化细胞，在原代培养细胞或株化细胞中导入基因，使其一过性或持续性表达的细胞也含有在该转化细胞中，作为导入到该细胞而表达的基因，也含有人或其他物种的IGF-I受体的基因。
[0246] 作为研究本发明的抗IGF-I受体抗体对于脊椎动物来源的细胞中的葡萄糖摄取所带来的影响的方法，可举出：细胞内葡萄糖浓度的测定、葡萄糖类似物示踪剂物质的细胞内摄取量的测定、葡萄糖转运蛋白的变化的测定等。葡萄糖浓度的测定方法有酶法等的吸光度测定法，作为测定葡萄糖类似物示踪剂物质的细胞内摄取量的方法，有[3H]-2’-脱氧葡萄糖的摄取量的测定，作为观察葡萄糖转运蛋白的变化的方法，有细胞免疫染色法、蛋白质印迹法等，但本领域技术人员也可适当实施其他的方法等。对于葡萄糖摄取到细胞内所带来的影响，可通过使本发明的抗IGF-I受体抗体与用于试验的培养细胞反应的情况的向细胞内的葡萄糖摄取、与使该抗体不与用于试验的培养细胞反应的情况为同等程度来判定。在该情况下，作为该诱导活性的对照，若在同等条件下进行使作为原本IGF-I受体的配体的IGF-I反应的测定，则对于该活性的评价是方便的。
[0247] 当使本发明的抗IGF-I受体抗体和IGF-I在变化各自浓度的情况下与进行试验的培养细胞反应时，以无治疗组的向细胞内的葡萄糖摄取设为100％的情况下的葡萄糖摄取量形式来表示。在使用人分化肌细胞评价葡萄糖摄取量的情况下，优选本发明的抗IGF-I受体抗体的葡萄糖摄取量为同一浓度的IGF-I的葡萄糖摄取量以下、更优选本发明的抗IGF-I受体抗体的葡萄糖摄取量为无治疗组的110％以下、进一步优选本发明的抗IGF-I受体抗体的葡萄糖摄取量与无治疗组为同等的100％。另外，在使用人分化肌细胞评价葡萄糖摄取量的情况下，添加有100nmol/L本发明的抗IGF-I受体抗体的情况下的葡萄糖摄取量优选为110％以下、更优选为105％以下、进一步优选为95～100％。
[0248] 作为研究脊椎动物来源细胞的活体内的葡萄糖摄取的方法，对该脊椎动物肠胃外给予本发明的抗IGF-I受体抗体，测量所给予的个体的器官或组织中的葡萄糖含量等的变化，由此可进行研究。在个体整体的测量中，可使用血糖值等的测定、或以糖化蛋白质为指标的血红蛋白A1C等。在个体的器官或组织中的葡萄糖摄取量等的测定中，在人以外的动物中，直接回收目标的器官或组织，进行葡萄糖含量或示踪剂的计算等。另外，作为非侵入性地测定个体的器官或组织中的葡萄糖摄取的方法，可使用X射线摄影图像或通过CT、MRI的图像分析、使用通过同位素过荧光物质的示踪剂的造影法等。在成为对象的组织为骨骼肌的情况下，葡萄糖钳夹(Glucose Clamp)等也成为指标。此外，本领域技术人员通过适当使用其他的方法，可研究本发明的抗IGF-I受体抗体对于脊椎动物来源细胞的活体内的葡萄糖摄取所带来的影响。
[0249] 另外，本发明的抗IGF-I受体抗体的特征在于，在对脊椎动物进行肠胃外给予的情况下，对于诱导该脊椎动物的肌肉量增加的有效剂量，即使在同一剂量、优选为10倍以上的剂量下，该脊椎动物的血糖值也不会变动。作为用于研究本发明的抗IGF-I受体抗体在脊椎动物中的血糖值变化的动物，优选为哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或魚类所属的动物，更优选为哺乳类或鸟类所属的动物，更进一步优选为、人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、马或狗。另外，经修饰以表达与本发明的抗IGF-I受体抗体具有交叉反应性的物种的IGF-I受体的动物也包括在用于研究本发明的抗IGF-I受体抗体在脊椎动物中的血糖值变化的动物中。关于血糖值的测定，作为观察血液的方法，使用比色法或电极法等，在用于检测的酶中，有葡萄糖氧化酶法(GOD法)、葡萄糖脱氢酶法(GDH法)等，作为非观察血液的方法，有光学测定法等，但本领域技术人员也可适当选择其他的方法。关于血糖值，在人的情况下，空腹时血糖值的正常范围为100mg/dL～109mg/dL。关于因药剂给予而引起的血糖值的有害现象(有害现象通用术语标准v4.0)，血糖值低于77mg/dL-55mg/dL的范围的值的情况被定义为低血糖，高于109mg/dL-160mg/dL的范围的值的情况被定义为高血糖。药剂给予对于血糖值未带来影响是指，药剂给予后的血糖值为大于55mg/dL且低于160mg/dL的范围内、更优选为大于77mg/dL且低于109mg/dL的范围内。然而，血糖值会根据所给予的动物而使正常值或其变动幅度不同，而且即使是人，在给予时的血糖值也不一定在正常值的范围，因此本发明中使脊椎动物的血糖值不变动是指，给予本发明的抗IGF-I受体抗体的脊椎动物的血糖值优选为
30％以内、更优选为20％以内、更进一步优选为10％以内的变化。
30％以内、更优选为20％以内、更进一步优选为10％以内的变化。
[0250] [抗IGF-I受体抗体的制法]
[0251] 本发明中的抗体可使用本领域技术人员所熟知的技术方法而得到。本发明中的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体(Milstein等、Nature(England)、1983年10月6日发行、305卷5934号、537～540页)。例如，将SEQ ID NO:2的IGF-I受体的肽作为抗原对哺乳动物进行致敏，由该动物的血清等可回收多克隆抗体。另外，在将肽用作抗原的情况下，可使用以与BSA或KLH等载体蛋白或聚赖氨酸等结合的形态的抗原。另外，作为用作抗原的肽的具体例，可使用作为SEQ ID NO:2的部分序列的ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet，但不限于此。该发明中的单克隆抗体可通过由抗原致敏的哺乳动物取出免疫细胞，与骨髓瘤细胞等进行细胞融合，将所得的杂交瘤克隆，从其培养物中进行回收。作为这样的单克隆抗体的获取方法，记载于实施例1中，作为由此所得的单克隆抗体，可举出：具有SEQ ID NO:9的VH氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VL氨基酸序列的单克隆抗体(IGF11-16)，但不限于这些。
[0252] 所得的单克隆抗体也可得到具有编码该抗体的蛋白质的氨基酸序列的基因序列的核酸分子，也可使用这样的核酸分子通过基因工程来制作抗体。该领域的本领域技术人员所熟知的技术是：使用该抗体的基因信息、例如H链、L链、它们的可变区或CDR序列等信息，进行用于提高抗体的结合性或特异性的修饰等、或通过由小鼠等动物的抗体修饰成人源化抗体，来制作适合用于治疗剂的结构的抗体。另外，通过使用导入有人抗体基因的非人-转基因动物作为致敏抗原的动物，也可获取人源化的单克隆抗体。除此之外，作为不需要对动物致敏的方法，使用表达人抗体的可变区或其一部分的噬菌体文库(人抗体噬菌体展示)，获取与对应的抗原特异性结合的抗体或由特定的氨基酸序列构成的噬菌体克隆，根据该信息制作人抗体，该技术也可由本领域技术人员适当地进行(例如，参见Taketo Tanaka等、Keio J.Med.、60卷、37-46页的评论等)。
[0253] 另外，作为制造前述单克隆抗体的方法，可培养产生各自希望获取的抗体的杂交瘤，用常规方法从所得的培养上清中纯化抗体而获取。另外，作为其他的制造方法，也可从产生希望获取的抗体的杂交瘤或人抗体噬菌体展示中所得的噬菌体克隆等中获取编码抗体的基因，更详细而言，获取编码免疫球蛋白的重链和/或轻链的基因，制作用于表达该基因的载体，导入到宿主细胞(哺乳类细胞、昆虫细胞、微生物等)中，产生该抗体。此时，对于编码免疫球蛋白的重链和/或轻链的基因，实施用于导入所期望性状的基因修饰，并且使用免疫球蛋白的重链和/或轻链的可变区或CDR区的结构信息，制作人源化抗体、抗体嵌合蛋白、低分子抗体或支架抗体，这是本领域技术人员通过使用已知的技术而可以实施的。另外，为了提高抗体的性能或避免副作用，也可通过本领域技术人员所熟知的技术适当进行：对抗体的恒定区的结构加入修饰、或在糖链部分进行修饰。
[0254] 本发明的抗IGF-I受体抗体可使用本领域技术人员所熟知的技术方法而得到。具体而言，本发明的抗IGF-I受体抗体通常为单克隆抗体(Milstein等人、Nature、1983、305卷、No.5934、537-540页)，所述单克隆抗体例如可通过以下的方法进行制作。
[0255] 例如，制作编码本发明的抗IGF-I受体抗体的免疫球蛋白的重链和/或轻链的氨基酸序列的核酸分子。在此，将所述核酸分子导入到各种的载体或质粒中，由此也可制作含有该核酸分子的载体或质粒。接着，用前述的核酸分子、载体、或质粒转化宿主细胞。作为宿主细胞，例如可举出：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、或植物细胞等真核细胞、或细菌细胞。接下来，将该转化的宿主细胞在用于产生本发明的抗IGF-I受体抗体的适当条件下进行培养。在此，根据需要，可从宿主细胞中分离所得的本发明的抗IGF-I受体抗体。用于这些程序的各种方法均为本领域技术人员所熟知。
[0256] 另外，作为对动物致敏的方法，使用导入有人抗体基因的非人-转基因动物作为致敏抗原的动物，使IGF-I受体和/或其部分肽等致敏，取出免疫细胞，与骨髓瘤细胞等进行细胞融合，对由此所得的杂交瘤进行克隆，通过常规方法从所得的培养上清中纯化并回收抗体，由此而得到。作为这样的单克隆抗体的获取方法，例如记载于国际公开第2013/180238号中。
[0257] 除此之外，也可使用表达所期望的人源化抗体的可变区或其一部分的噬菌体文库(人抗体噬菌体展示)，获取与对应的抗原特异性结合的抗体或由特定的氨基酸序列构成的噬菌体克隆，根据该信息制作人源化抗体的技术(例如，参见Taketo Tanaka等人、The Keio Journal of Medicine、60卷、37-46页的评论等)。
[0258] 在此，对于编码免疫球蛋白的重链和/或轻链的基因，进行用于导入所期望性状的基因修饰，或者使用免疫球蛋白的重链和/或轻链的可变区或CDR区的结构信息，由此制作抗体嵌合蛋白、低分子抗体、支架抗体等，这是本领域技术人员使用已知的技术可以实施的。另外，为了提高抗体的性能或避免副作用，也可通过本领域技术人员所熟知的技术适当进行：对抗体的恒定区的结构加入修饰、或在糖链部分进行修饰。
[0259] [含有抗IGF-I受体抗体的药物]
[0260] 本发明的抗IGF-I受体抗体可用作与IGF-I相关的状态或由与IGF-I受体的作用引起的疾病的治疗药或预防药。具体而言，作为与IGF-I相关的状态或成为IGF-I受体激动剂抗体的治疗或预防的对象的疾病，可举出：废用性肌肉萎缩、身材矮小症、肝硬化、肝纤维化、糖尿病性肾病、慢性肾功能衰竭、莱伦氏综合征、老化、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、骨质疏松症、囊性纤维病、肌强直性营养不良、艾滋病肌无力症、HIV所伴随的脂肪再分布综合症、克罗恩氏病、维尔纳氏综合征、X-连锁联合免疫缺陷病、耳聋、神经性厌食症和早产儿视网膜病、特纳综合征、普拉德-威利综合征、银罗素综合征、特发性矮小、肥胖、多发性硬化症、溃疡性大肠炎、肌肉量低、心肌缺血、骨密度低，作为成为IGF-I受体拮抗剂抗体的治疗或预防的对象疾病，可举出：神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童期癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺增生症、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯瘤、转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻、血管活性肠肽瘤、弗纳-莫里森综合征、贝克威思-威德曼综合征、肾癌、肾细胞癌、移行细胞癌、尤文氏肉瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头瘤、巨人症、牛皮癣、动脉粥样硬化症、血管平滑肌再狭窄、不适当的微血管增殖、糖尿病性视网膜病、格雷夫斯病、系统性红斑狼疮、慢性甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎和白塞氏病。特别优选本发明的抗IGF-I受体抗体作为废用性肌肉萎缩和/或身材矮小症的治疗药或预防药的使用。另外，本发明的抗IGF-I受体抗体的优点在于，通过给予不会产生血糖值的变动。
[0261] 含有本发明的抗IGF-I受体抗体的药物，能够以药物组合物的形态制成制剂，所述药物组合物除了含有本发明的抗IGF-I受体抗体之外还含有药学上可接受的载体和/或其他添加剂。使用药学上可接受的载体和/或其他添加剂的制剂，例如可通过University of the Sciences in Philadelphia、“Remington：The Science and Practice of Pharmacy、20th EDITION”，Lippincott Williams&Wilkins、2000中所记载的方法进行实施。作为这样的治疗剂或预防剂的一个形态，以通过溶解、悬浮、或者乳化于无菌的水性液或油性液中而调制的液剂或冻干剂的形式提供。这样的作为稀释剂的溶剂或溶解液，作为水性液可举出注射用蒸馏水、生理盐水等，除此之外，在添加渗透压调节剂(例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)的情况下，有时还可并用适当的助溶剂，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油
50)等。另外，作为溶剂或溶解液有时也使用油性液，作为该油性液的实例可举出芝麻油、大豆油等，作为助溶剂有时也并用苯甲酸苄酯、苄醇等。在这样的制剂中，有时可适当含有缓冲剂(例如，磷酸盐类缓冲剂、乙酸盐类缓冲剂)、止痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如，抗坏血酸、异抗坏血酸和它们的盐等)、着色剂(例如，铜叶绿素、β-胡萝卜素、红色2号、蓝色1号等)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、苯酚、苄索氯铵、苯扎氯铵等)、增稠剂(例如，羟丙基纤维素、羧甲基纤维素和它们的盐等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇等)、矫味剂(例如，薄荷醇、柑橘香料等)的添加剂。作为其它形态，还可举出用于粘膜适用的治疗剂或预防剂，在该制剂中，以赋予粘膜吸附性、滞留性等为主要目的，作为添加剂，可使用粘合剂、粘合增强剂、粘稠剂、粘稠化剂等(例如，粘蛋白、琼脂、明胶、果胶、角叉菜胶、藻酸钠、刺槐豆胶、黄原胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、壳聚糖、支链淀粉、蜡质淀粉、硫糖铝、纤维素及其衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物、或其盐、聚甘油脂肪酸酯等)。然而，供于生物体的治疗剂或预防剂的形态和溶剂或添加剂不限于这些，本领域技术人员可适当选择。
50)等。另外，作为溶剂或溶解液有时也使用油性液，作为该油性液的实例可举出芝麻油、大豆油等，作为助溶剂有时也并用苯甲酸苄酯、苄醇等。在这样的制剂中，有时可适当含有缓冲剂(例如，磷酸盐类缓冲剂、乙酸盐类缓冲剂)、止痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如，抗坏血酸、异抗坏血酸和它们的盐等)、着色剂(例如，铜叶绿素、β-胡萝卜素、红色2号、蓝色1号等)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、苯酚、苄索氯铵、苯扎氯铵等)、增稠剂(例如，羟丙基纤维素、羧甲基纤维素和它们的盐等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇等)、矫味剂(例如，薄荷醇、柑橘香料等)的添加剂。作为其它形态，还可举出用于粘膜适用的治疗剂或预防剂，在该制剂中，以赋予粘膜吸附性、滞留性等为主要目的，作为添加剂，可使用粘合剂、粘合增强剂、粘稠剂、粘稠化剂等(例如，粘蛋白、琼脂、明胶、果胶、角叉菜胶、藻酸钠、刺槐豆胶、黄原胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、壳聚糖、支链淀粉、蜡质淀粉、硫糖铝、纤维素及其衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物、或其盐、聚甘油脂肪酸酯等)。然而，供于生物体的治疗剂或预防剂的形态和溶剂或添加剂不限于这些，本领域技术人员可适当选择。
[0262] 含有本发明的抗IGF-I受体抗体的药物，除了含有本发明的抗IGF-I受体抗体之外还可含有现有的其他药物(活性成分)。另外，也可将含有本发明的抗IGF-I受体抗体的药物与现有的其他药物组合而成为套组(kit)的形态。作为与IGF-I受体激动剂抗体组合的活性成分，可举出：生长激素或其类似物、胰岛素或其类似物、IGF-II或其类似物、抗肌肉生长抑制素抗体、肌肉生长抑制素拮抗剂、抗激活素IIB型受体抗体、激活素IIB受体拮抗剂、可溶性激活素IIB型受体或其类似物、生长素释放肽或其类似物、卵泡抑制素或其类似物、β2激动剂和选择性雄激素受体调节剂。另外，作为与IGF-I受体拮抗剂抗体组合的活性成分，可举出：皮质类固醇、止吐药、盐酸恩丹西酮、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺(Metroclopramide)、多潘立酮、氟哌啶醇、赛克利嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、左旋甲丙嗪、托烷司琼、癌症疫苗、GM-CSF抑制剂、GM-CSF DNA疫苗、基于细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白(HSP)疫苗、同种肿瘤疫苗、自身肿瘤疫苗、镇痛药、布洛芬、萘普生、三柳胆镁、盐酸羟考酮、抗血管生成剂、抗血栓剂、抗PD-1抗体、纳武单抗、派姆单抗、抗PD-L1抗体、阿特朱单抗、抗CTLA4抗体、伊匹单抗、抗CD20抗体、利妥昔单抗、抗HER2抗体、曲妥单抗、抗CCR4抗体、莫加珠单抗、抗VEGF抗体、贝伐单抗、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体片段、抗TWEAK抗体、抗TWEAK受体抗体、可溶性TWEAK受体片段、AMG 706、AMG 386、抗增殖剂、法尼基蛋白转移酶抑制剂、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、Kit受体抑制剂、ret受体抑制剂、PDGFR抑制剂、生长激素分泌抑制剂、血管生成素抑制剂、肿瘤浸润巨噬细胞抑制剂、c-fms抑制剂、抗c-fms抗体、CSF-1抑制剂、抗CSF-1抗体、可溶性c-fms片段、培维索孟、吉西他滨、帕尼单抗、伊立替康和SN-38。作为所掺混的抗IGF-I受体抗体以外的药物的剂量，能够以通常治疗所用的剂量进行，但根据情形也可增减。
[0263] 本发明中的治疗剂或预防剂以改善症状为目的可进行肠胃外给予。在肠胃外给予的情况下，例如可制成经鼻剂，可选择液剂、悬浮剂、固体制剂等。另外，作为其他的肠胃外给予的形态，可制成注射剂，作为注射剂，可选择皮下注射剂、静脉注射剂、点滴注射剂、肌肉注射剂、脑室内注射剂或腹腔内注射剂等。另外，作为其他的用于肠胃外给予的制剂，还可举出：坐剂、舌下剂、经皮剂、经鼻剂以外的经粘膜给予剂等。而且，以含有或涂布在支架或血管内栓塞剂中的方式，还可以进行血管内局部给予。
[0264] 本发明中的治疗剂或预防剂的给予量根据患者的年龄、性别、体重、症状、治疗效果、给予方法、处理时间、或该药物组合物所含的活性成分的种类等而不同，通常每个成人的1次量为主剂0.1mg～1g的范围、优选为0.5mg～300mg的范围，可1周～4周给予1次、或1个月～2个月给予1次。因此，可优选以1周1次以下的频率进行给予。然而，由于给予量和给予次数根据种种条件而变动，所以也有比前述给予量和次数少的量和次数即充分的情况，还有需要超过前述范围的给予量和给予次数的情况。
[0265] [在人以外的动物中的用途]
[0266] 本发明的一个方案中的抗IGF-I受体抗体可用于人以外的动物中的畜产用途或兽医学的用途中。作为可将本发明的抗IGF-I受体抗体在畜产用途或兽医学的用途中使用的动物，优选为人以外的哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或魚类所属的动物，更优选为人以外的哺乳类或鸟类所属的动物，更进一步优选为选自猴、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、马或狗的动物。现在，牛生长激素或猪生长激素被用于增加牛的乳汁产生量或促进子猪的生长，但这些作用被认为是通过生长激素诱导表达的IGF-I的作用所致(h.Jiang与X.Ge、Journal of Animal Science、92卷、21-29页、2014)。因此，本发明的抗IGF-I受体抗体通过利用该激动剂作用，同样地可用于动物的乳汁产生的亢进、或者促进胎儿或出生后的动物的生长等。此外，作为可使用本发明的抗IGF-I受体抗体的用途的实例，可举出：对于动物中的肌肉量的增量或增加肌肉重量与脂肪重量之比、摄取饲料对体组织的效率变换、繁殖效率增加或增强用于物种保守的生殖能力、对动物的外伤或消耗性疾病的消耗症状的治疗等，但不限于这些。另外，本发明的抗IGF-I受体抗体，通过利用作为其它方案的拮抗剂作用，还可用于动物的恶性肿瘤的治疗、繁殖频率的控制、个体生长的控制或其他用途中。在使用本发明中的抗IGF-I受体抗体的情况下，可配合所要给予的动物而修饰抗体的框架或恒定区的氨基酸序列进而使免疫原性降低等，也可在本领域技术人员适当修饰其结构后使用。
[0267] [使用抗IGF-I受体抗体的细胞培养方法]
[0268] 在用于在活体外维持、增殖和/或分化脊椎动物来源细胞的细胞培养技术中，大多使用IGF-I或其衍生物，作为用于细胞培养用的试剂而市售。IGF-I由于稳定性的问题等，在长期的培养中，随着时间的经过，效果可能减弱，为了进行稳定的细胞培养，需要适当调节浓度等的对应。另外，由于IGF-I诱导向细胞中的葡萄糖摄取，因此随着细胞内葡萄糖浓度的上升，可能会诱导细胞的代谢或特性的变化，或者培养基中的葡萄糖浓度减少而使培养环境发生变化。本发明的抗IGF-I受体抗体具有以下特征：与IGF-I进行比较，稳定性高，与细胞接触后诱导细胞增殖的时间长，在比IGF-I低的浓度下显示细胞增殖诱导活性，且不诱导向细胞内的葡萄糖摄取。本发明的抗IGF-I受体抗体除了可在细胞培养中适量添加到其培养基而使用之外，还可吸附或固定于进行培养的容器的固相上而使用，由此可减少使用量，或者可对附着于固相的细胞有效地进行细胞增殖诱导。本发明中的脊椎动物来源的细胞是指，优选为来源于哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或魚类的细胞，更优选为来源于哺乳类或鸟类的细胞，进一步更优选为来源于人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、马或狗的细胞。另外，作为该细胞，可使用原代培养细胞、株化细胞或这些细胞的转化体细胞、来源于基因重组动物的细胞等。而且，作为使用本发明的抗IGF-I受体抗体的培养的对象，也包括来源于脊椎动物或其基因修饰动物的器官或组织等。本发明的抗IGF-I受体抗体可在用于使用细胞的物质生产的培养、或使用细胞本身的细胞医疗/再生医疗的培养步骤中使用。
[0269] 实施例
[0270] [实施例1]小鼠单克隆抗体的制作
[0271] 小鼠单克隆抗体可通过Kohler等人(Nature 256：495-497、1975)的杂交瘤法进行制作。IGF-I受体激动剂抗体是使用表达有人IGF-I受体的细胞对小鼠进行免疫、并使用标准的杂交瘤技术进行制作。所有动物实验均按照设施的规定进行实施。使用通过融合从小鼠采集的脾脏来源的细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(P3U1)的标准方法进行实施。使用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基选择杂交瘤。使用杂交瘤的培养液，实施通过使用表达有IGF-I受体的细胞的Cell ELISA的结合性评价、和通过PathHunter(注册商标)的IGF-I受体的细胞内酪氨酸激酶的活化评价，选择含有阳性杂交瘤的孔。通过有限稀释法对该孔中所含的杂交瘤进行单克隆化。将该单克隆化的阳性杂交瘤进行无血清培养，使用蛋白A柱(Ab-Capcher、Protenova)从培养液中纯化单克隆抗体。使用该单克隆抗体，通过人成肌细胞增殖活性评价，而发现作为IGF-I受体激动剂抗体的IGF11-16。
[0272] [实施例2]抗体同种型的确定
[0273] 为了确定IGF-I受体激动剂抗体的抗体同种型，使用对抗体同种型特异性的抗体，实施ELISA。将用PBS进行2000倍稀释的抗小鼠IgG抗体(TAGO、6150)，以50μL/孔添加到96孔板(Nunc、MaxiSorp)中，并在4℃下静置一夜。将96孔板取代成3％BSA/PBS，将所得者用于ELISA。将IGF-I受体激动剂抗体以30μL/孔添加到固定有抗小鼠IgG抗体的96孔板中，并在室温下反应1.5小时。用洗涤液洗涤后，将对小鼠IgG的各种同种型特异性反应的抗体、抗小鼠IgG1抗体-ALP缀合物(SBA、1070-04)、抗小鼠IgG2a抗体-ALP缀合物(SBA、1080-04)、抗小鼠IgG2b抗体-ALP缀合物(SBA、1090-04)和抗小鼠IgG3抗体-ALP缀合物(SBA、1100-04)以30μL/孔进行添加，并在室温下反应1小时。以100μL/孔添加底物(PNPP)，并在室温下反应45分钟，计算吸光度405-550nm。将吸光度405-550nm的值作为结合活性进行评价。
[0274] 由于IGF11-16对抗小鼠IgG1抗体显示反应性，因此抗体的同种型为IgG1。
[0275] [实施例3]抗体序列的确定
[0276] 为了确定IGF-I受体激动剂抗体的轻链和重链的基因序列，实施SMARTer(注册商标)RACE法。由产生抗体的杂交瘤来源的RNA，将含有起始和终止密码子的抗体的重链和轻链的基因片段通过SMARTer(注册商标)RACE法获取，确定该碱基序列。以杂交瘤来源的Total RNA为模板，使用SMARTer(注册商标)RACE 5’/3’Kit(634859、Clontech)，合成第一链cDNA后，通过PCR反应使cDNA扩增。以该cDNA为模板，使用试剂盒所附带的针对通用序列的引物、和分别对抗体的重链和轻链特异性的引物进行PCR反应。小鼠抗体的轻链(kappa)参见Accession number BC080787、小鼠抗体的IgG1参见LT160966来设计引物。针对小鼠抗体的轻链的引物的碱基序列设计为ggtgaagttgatgtcttgtgagtgg、针对小鼠抗体的重链的引物的碱基序列设计为gctcttctcagtatggtggttgtgc，分别用于实验。所得的PCR产物作为5’RACE PCR产物用于TA克隆。
[0277] 在TA克隆中，将5‘RACE PCR产物进行电泳，使用QIAEX II Gel Extraction Kit(20021、Qiagen)纯化含有目标分子量的cDNA。纯化后的cDNA使用TaKaRa-Taq(R001A、Takara)在72℃下反应5分钟，由此使腺嘌呤添加到5’和3’末端。使用TOPO(注册商标)TA克隆(注册商标)试剂盒(450641、Thermo fisher)，按照附属的方案，将该cDNA克隆到Topoisomerase I-activated pCR(注册商标)II-TOPO(注册商标)vector(以下，TOPO vector)。将克隆了目标cDNA的TOPO vector转化到大肠杆菌TOP10，用含有50μg/mL卡那霉素的琼脂培养基进行培养。对于向TOPO vector的目标cDNA的插入，通过菌落PCR进行确认。鉴定经克隆的cDNA的碱基序列。同样地鉴定3’RACE PCR产物的碱基序列，确定抗体的基因的全长序列。IGF11-16的轻链的全长基因序列见SEQ ID NO:27、全长氨基酸序列见SEQ ID NO:28、IGF11-16的重链的全长基因序列见SEQ ID NO:29、全长氨基酸序列见SEQ ID NO:
30。另外，IGF11-16的CDR-H1见SEQ ID NO:3、CDR-H2见SEQ ID NO:4、CDR-H3见SEQ ID NO:
5、CDR-L1见SEQ ID NO:6、CDR-L2见SEQ ID NO:7、CDR-L3见SEQ ID NO:8、重链可变区见SEQ ID NO:9、轻链可变区见SEQ ID NO:10。
30。另外，IGF11-16的CDR-H1见SEQ ID NO:3、CDR-H2见SEQ ID NO:4、CDR-H3见SEQ ID NO:
5、CDR-L1见SEQ ID NO:6、CDR-L2见SEQ ID NO:7、CDR-L3见SEQ ID NO:8、重链可变区见SEQ ID NO:9、轻链可变区见SEQ ID NO:10。
[0278] [实施例4]对于IGF-I受体的结合活性(ELISA)
[0279] 为了研究人(SEQ ID NO:2、NP_000866)、豚鼠(SEQ ID NO:11、XP_003475316)、食蟹猴(SEQ ID NO:12、NP_001248281)、兔(SEQ ID NO:13、XP_017193273)、大鼠(SEQ ID NO:14、NP_494694)和小鼠(SEQ ID NO:15、NP_034643)的IGF-I受体激动剂抗体对于IGF-I受体的结合活性，使用表达有各种IGF-I受体的细胞而实施Cell ELISA。
[0280] 通过脂质转染法将插入有人(SEQ ID NO:16)、豚鼠(SEQ ID NO:17)、食蟹猴(SEQ ID NO:18)、兔(SEQ ID NO:19)、大鼠(SEQ ID NO:20)和小鼠(SEQ ID NO:21)的IGF-I受体基因的pEF1表达载体(Thermofisher)导入到P3U1细胞中。在脂质转染后将经一夜以上培养5
的P3U1细胞以0.8×10cells/孔添加到96孔板(聚-D-赖氨酸包被)中，使用10％缓冲福尔马林(Mildform(注册商标)10NM、Wako)进行固定。将用含有3％BSA的磷酸缓冲液封闭的样品用于ELISA。
的P3U1细胞以0.8×10cells/孔添加到96孔板(聚-D-赖氨酸包被)中，使用10％缓冲福尔马林(Mildform(注册商标)10NM、Wako)进行固定。将用含有3％BSA的磷酸缓冲液封闭的样品用于ELISA。
[0281] ELISA是将30μL的用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成10nM的IGF11-16抗体溶液添加到各孔中，在室温下反应约1小时30分钟。用洗涤液洗涤2次。将30μL的用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成各浓度的抗小鼠IgG抗体HRP缀合物溶液添加到各孔中，在室温下反应约1小时。用洗涤液洗涤2次。将50μL的底物(TMB)添加到各孔中，开始反应。在约20分后将50μL的0.5M硫酸添加到各孔中，测定450和550nm的吸光度，计算吸光度450-550nm。对于导入有不含IGF-I受体基因的载体的细胞(Mock细胞、SEQ ID NO:22)，将其吸光度450-550nm的值设为1，计算结合活性(表1)。
[0282] [表1]
[0283] 物种 小鼠 大鼠 豚鼠 兔 食蟹猴 人结合活性 0.9 1.0 5.3 5.4 5.4 5.4
[0284] IGF11-16在表达有人、豚鼠、食蟹猴和兔的IGF-I受体的细胞中，与Mock细胞进行比较，结合活性上升5倍以上。另一方面，IGF11-16对于表达有大鼠和小鼠的IGF-I受体的细胞的结合活性，与Mock细胞为同等程度，并未上升。根据这些显示出：IGF11-16与人、豚鼠、食蟹猴和兔的IGF-I受体结合，但不与大鼠和小鼠的IGF-I受体结合。
[0285] [实施例5]对于胰岛素受体的结合活性(ELISA)
[0286] 为了研究IGF-I受体激动剂抗体对于胰岛素受体的结合活性，使用表达有人胰岛素受体的细胞，实施Cell ELISA。
[0287] 通过脂质转染法将插入有人的胰岛素受体基因的pEF1表达载体(Thermofisher)导入到HEK293T细胞中。将脂质转染后的HEK293T细胞以0.8×105cells/孔(约180μL/孔)添加到96孔板(聚-D-赖氨酸包被)中，使用10％缓冲福尔马林(Mildform(注册商标)10NM、Wako)进行固定。将用含有3％BSA的磷酸缓冲液封闭的样品用于ELISA。
[0288] ELISA是将30μL的用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成各浓度的抗体溶液添加到各孔中，在室温下反应约1小时。用洗涤液(含有Tween的Tris缓冲液)洗涤2次。将30μL的用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成各浓度的抗小鼠IgG抗体ALP缀合物溶液添加到各孔中，在室温下反应约1小时。用洗涤液洗涤2次。将100μL的底物(PNPP)添加到各孔中，开始反应。
在约30分后测定405和550nm的吸光度，计算吸光度405-550nm。对于导入有不含IGF-I受体的基因和胰岛素受体的基因的载体的细胞(Mock细胞、SEQ ID NO:22)，将其吸光度405-
550nm的值设为1，计算结合活性(表2)。
在约30分后测定405和550nm的吸光度，计算吸光度405-550nm。对于导入有不含IGF-I受体的基因和胰岛素受体的基因的载体的细胞(Mock细胞、SEQ ID NO:22)，将其吸光度405-
550nm的值设为1，计算结合活性(表2)。
[0289] [表2]
[0290]IGF11-16 人IGF-I受体 人胰岛素受体
0.5nM 2.9 1.1
5nM 3.7 1.4
0.5nM 2.9 1.1
5nM 3.7 1.4
[0291] 在将表达有人IGF-I受体的细胞固定的ELISA中，与Mock细胞进行比较，IGF11-16的0.5nM和5nM使吸光度405-550nm上升至约3倍以上。另一方面，在将表达有人胰岛素受体的细胞固定化的ELISA中，IGF11-16的0.5nM和5nM未使吸光度405-550nm上升1.5倍以上。由此得知，与胰岛素受体进行比较，IGF11-16与IGF-I受体更牢固结合。
[0292] [实施例6]IGF-I受体的结合部位的分析(ELISA)
[0293] 为了鉴定IGF-I受体激动剂抗体与IGF-I受体的表位，对于将IGF-I受体的各种结构域取代成与IGF-I受体具有类似结构的胰岛素受体的结构域而得的变体的IGF-I受体激动剂抗体的结合性进行测定。
[0294] 制作出将人IGF-I受体(NP_000866)的胞外结构域用胰岛素受体的胞外结构域取代而得的取代体、或将人胰岛素受体(NP_000199)的胞外结构域用IGF-I受体的胞外结构域取代而得的以下4种取代体。
[0295] (取代体1)将人胰岛素受体的L1结构域至L2结构域取代成人IGF-I受体的L1结构域至L2结构域而得的取代体、hIGFIR[L1-L2]/hINSR；
[0296] (取代体2)将人IGF-I受体的L1结构域至L2结构域取代成人胰岛素受体的L1结构域至L2结构域而得的取代体、hINSR[L1-L2]/hIGFIR；
[0297] (取代体3)将人IGF-I受体的L1结构域取代成人胰岛素受体的L1结构域而得的取代体、hINSR[L1]/hIGFIR；
[0298] (取代体4)将人IGF-I受体的L2结构域取代成人胰岛素受体的L2结构域而得的取代体、hINSR[L2]/hIGFIR。
[0299] 通过脂质转染法将插入有上述4种的人IGF-I受体的取代体的基因的pEF1表达载体(Thermofisher)导入到P3U1细胞中。(取代体1)的hIGFIR[L1-L2]/hINSR的基因见SEQ ID NO:23、(取代体2)的hINSR[L1-L2]/hIGFIR的基因见SEQ ID NO:24、(取代体3)的hINSR[L1]/hIGFIR的基因见SEQ ID NO:25、(取代体4)的hINSR[L2]/hIGFIR的基因见SEQ ID NO:26。在脂质转染后将经一夜以上培养的P3U1细胞以0.8×105cells/孔添加到96孔板(聚-D-赖氨酸包被)中，使用10％缓冲福尔马林(Mildform(注册商标)10NM、Wako)进行固定。将用含有3％BSA的磷酸缓冲液封闭的样品用于ELISA。
[0300] ELISA是将30μL的用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成10nM的抗体溶液添加到各孔中，在室温下反应约1小时30分钟。用洗涤液洗涤2次。将30μL的用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成5nM的抗小鼠IgG抗体HRP缀合物溶液添加到各孔中，在室温下反应约1小时。用洗涤液洗涤2次。将50μL的底物(TMB)添加到各孔中，开始反应。在约20分钟后添加50μL的
0.5M硫酸，停止反应，测定450和550nm的吸光度，计算吸光度450-550nm。对于导入有不含各取代体的基因的载体的细胞(Mock细胞)，将其吸光度450-550nm的值设为1，计算结合活性(表3)。
0.5M硫酸，停止反应，测定450和550nm的吸光度，计算吸光度450-550nm。对于导入有不含各取代体的基因的载体的细胞(Mock细胞)，将其吸光度450-550nm的值设为1，计算结合活性(表3)。
[0301] [表3]
[0302]取代体 IGF11-16
hIGFIR[L1-L2]/hINSR 5.5
hINSR[L1-L2]/hIGFIR 1.5
hINSR[L1]/hIGFIR 5.7
hINSR[L2]/hIGFIR 5.6
hIGFIR[L1-L2]/hINSR 5.5
hINSR[L1-L2]/hIGFIR 1.5
hINSR[L1]/hIGFIR 5.7
hINSR[L2]/hIGFIR 5.6
[0303] 在将表达有hIGFIR[L1-L2]/hINSR、hINSR[L1]/hIGFIR和hINSR[L2]/hIGFIR的细胞固定的ELISA中，IGF11-16使吸光度450-550nm相对于Mock细胞上升5倍以上。另一方面，IGF11-16对于表达有hINSR[L1-L2]/hIGFIR的细胞的结合活性较弱。由此显示出：IGFI1-16与IGF-I受体的CR结构域结合。
[0304] [实施例7]IGF11-16的表位的确定
[0305] 为了由作为IGF11-16的表位的CR结构域进一步鉴定详细的表位，由IGF11-16与IGF-I受体的结合性的物种差异推定结合序列。图1中示出各自物种中的IGF-I受体的CR结构域的氨基酸序列。
[0306] IGF11-16与人、豚鼠和兔的IGF-I受体结合，但不与小鼠和大鼠的IGF-I受体结合。由此得知，在IGF-I受体的CR结构域的氨基酸序列中，将与人、豚鼠和兔共通的与小鼠和大鼠不同的氨基酸序列推定为IGF11-16的表位。
[0307] 为了确定IGF11-16与IGF-I受体的CR结构域的哪个部位的氨基酸结合，通过ELISA测定与CR结构域的各种氨基酸取代体的结合性。
[0308] 在CR结构域中，使用表达使推定与IGF11-16结合的氨基酸序列突变而得的IGF-I受体的细胞，实施Cell ELISA。
[0309] CR结构域的各种氨基酸取代体使用以下的3种。另外，作为阳性对照使用将野生型的人IGF-I受体插入到pEF1表达载体(Thermofisher)而得者、作为阴性对照使用将野生型的大鼠IGF-I受体插入到pEF1表达载体(Thermofisher)而得者。各种IGF-I受体的表达量以FLAG M2抗体与附加于IGF-I受体的胞内结构域的FLAG标签(AspTyrLysAspAspAspAspLys)的反应性为指标。
[0310] (CR结构域的取代体1)人IGF-I受体(NP_000866、SEQ ID NO:2)的氨基酸序列、第245位和第247位的天冬氨酸和丙氨酸分别被天冬酰胺和苏氨酸取代。
[0311] (CR结构域的取代体2)人IGF-I受体(NP_000866、SEQ ID NO:2)的氨基酸序列、第294位的谷氨酸被天冬氨酸取代。
[0312] (CR结构域的取代体3)人IGF-I受体(NP_000866、SEQ ID NO:2)的氨基酸序列、第315位和第316位的甘氨酸和丝氨酸分别被丝氨酸和苏氨酸取代。
[0313] 将HEK293T细胞以9×106cells/孔接种于被聚-D-赖氨酸包被的10cm培养皿中。在第二天将各质粒DNA通过脂质转染法导入到细胞中。在该第二天使用0.25％胰蛋白酶/EDTA剥离HEK293T细胞，用培养液进行悬浮。将HEK293T细胞以0.8×105cells/孔添加到96孔板(聚-D-赖氨酸包被)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一夜。自96孔板去除培养基，使用10％缓冲福尔马林(Mildform(注册商标)10NM、Wako)进行固定，将取代封闭缓冲液(3％BSA/PBS/叠氮化钠)的样品用于ELISA。
[0314] ELISA是将用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成1nM的IGF11-16抗体或FLAG M2抗体溶液添加到各孔中，在室温下反应约1小时。用洗涤液洗涤2次。将50μL的用0.1％脱脂牛奶/3％BSA/PBS调制成各浓度的抗小鼠IgG抗体HRP缀合物溶液添加到各孔中，在室温中反应约1小时。用洗涤液洗涤2次。将100μL的底物(TMB)添加到各孔中，开始反应。在约30分钟后添加100μL的0.5M硫酸，停止反应，测定450nm的吸光度。将吸光度450nm的值作为结合活性进行评价。
[0315] 结果见图2。确认到：FLAG M2抗体与表达有CR结构域的各取代体的细胞的反应性是同等的，CR结构域的各取代体的表达量为几乎相同水平。IGF11-16对于在CR结构域未导入突变的野生型的人IGF-I受体，使吸光度450nm的值上升至2以上，显示出结合活性的亢进。对于CR结构域的取代体1和2，IGF11-16使吸光度450nm的值上升至2以上，显示出结合活性的亢进。另一方面，CR结构域的取代体3的吸光度450nm的值为约1，与作为阴性对照的大鼠IGF-I受体的吸光度为同等程度，未确认到结合性。根据这些显示出：IGF11-16对于IGF-I受体的CR结构域的结合活性以IGF-I受体的第315位和第316位的氨基酸为重要。
[0316] 根据以上的结果，IGF11-16与人IGF-I受体的结合部位被推定为第315位和第316位的Gly(甘氨酸)和Ser(丝氨酸)的附近。通常，抗体的识别序列为8个氨基酸残基(6个至10个残基的平均值)和由IGF11-16的交叉反应性(与大鼠的IGF-I受体无结合性、与兔和人的IGF-I受体具有结合性)认为IGF11-16与人IGF-I受体的结合部位的推定序列为ProSerGlyPheIleArgAsnGly*Ser*GlnSerMet(Gly*Ser*表示第315位和第316位的氨基酸序列)。
[0317] [实施例8]通过表面等离子体共振法进行的对于IGF-I受体的结合亲和性[0318] 为了研究药剂对于IGF-I受体的结合特性(结合速率和解离速率)，通过表面等离子体共振(SPR)法进行测定。
[0319] 使用Amine Coupling Kit(BR-1000-50、GE)和His Capture Kit(28-9950-56、GE)将抗His单克隆抗体固定在传感器芯片CM3(GE)上。固定条件为在NHS/EDC 7分钟、50μg/mL抗His单克隆抗体3分钟、Ethanolamin 7分钟、Target：≥3000RU下实施。分析物使用各浓度的药剂。配体使用重组人IGF-I受体组氨酸标签(305-GR-050、R&D SYSTEMS、以下IGF-IR-His)。阴性对照使用Purified Mouse IgG2a、κ、Isotype Ctrl、Clone：MG2a-53(401502、BioLegend、以下ctrl IgG2a)。
[0320] 将固定有抗His单克隆抗体的传感器芯片CM3设置于Biacore T200，将反应温度设定为36℃，将运行缓冲液(HBS-EP+、BR-1006-69、GE)以流速30μL/分钟流动。将配体的结合量设定成约100RU，将IGF-IR-His以0.5～2×10-8mol/L进行添加，以补充抗His单克隆抗体。使10nmol/L的Ctrl IgG2a反应1分钟，将HBS-EP+以流速30μL/分钟流动10分钟以上。将分析物和HBS-EP+分别添加到流动池(1和2)和流动池(3和4)使之反应。
[0321] 反应条件设定成结合时间为600秒和解离时间(Dissociation Time)为600秒。反应结束后，用再生用缓冲液1(0.2％SDS)、再生用缓冲液2(100mmol/L Tris-HCl(pH8.5)、1mol/L NaCl、15mmol/L MgCl2)和再生用缓冲液3(10mmol/L甘氨酸-HCl(pH1.5))，分别以流速30μL/分钟洗涤1分钟。使用Biacore T200Evaluation Software(ver2.0)，以1：
1Binding的模型进行分析，计算解离速率常数(ka、1/Ms)、结合速率常数(kd、1/s)和解离常数(KD、M)。结果见表4。
1Binding的模型进行分析，计算解离速率常数(ka、1/Ms)、结合速率常数(kd、1/s)和解离常数(KD、M)。结果见表4。
[0322] [表4]
[0323]
[0324]
[0325] *：为低于测定仪器的测定下限的值。
[0326] IGF11-16对人IGF-I受体的ka为IGF-I的约1/5，且结合速率慢。另一方面，IGF11-16对人IGF-I受体的kd为低于测定仪器的测定下限的值，且为低于IGF-I的1/1000的值，因此显示出解离速率非常慢，且IGF11-16若与IGF-I受体结合则难以解离。IGF11-16对人IGF-I受体的KD，为低于IGF-I的1/50的值，且显示出强的结合强度。显示出：IGF11-16与IGF-I进行比较，对于IGF-I受体具有强的结合活性。
[0327] [实施例9]PathHunter(注册商标)的IGF-I受体或者胰岛素受体的活化作用[0328] 为了检测IGF-I受体激动剂抗体对IGF-I受体的活化作用，使用PathHunter(注册商标)IGF1R Functional Assay(DiscoverX)，测定IGF-I受体的下游信号的活化。
[0329] 使用使具有与IGF-I受体和IGF-I受体的细胞内的酪氨酸激酶结合的SH2结构域的衔接蛋白SHC1-Enzyme Acceptor(EA)融合蛋白强制表达在细胞内的细胞系。为了检测IGF-I受体激动剂抗体对胰岛素受体的活化作用，使用PathHunter(注册商标)INSR Functional Assay(DiscoverX)，测定胰岛素受体的下游信号的活化。使用使具有与胰岛素受体和胰岛素受体的细胞内的酪氨酸激酶结合的SH2结构域的衔接蛋白PLCG1-EA融合蛋白强制表达在细胞内的细胞系。这些细胞系通过与IGF-I受体或者胰岛素受体的配体结合而引起受体的二聚体化，接着使受体磷酸化，由此募集具有SH2结构域的衔接蛋白，形成受体信号传递复合物，促进空间上相邻的酪氨酸激酶与EA的结合，重构活性型β-半乳糖苷酶。通过测定基于该β-半乳糖苷酶活性的水解了的底物的化学发光信号的水平，可鉴定药剂对受体型酪氨酸激酶的作用。
[0330] 将表达有IGF-I受体或者胰岛素受体的细胞以90μL/孔(2×104cells/孔或者5×103cells/孔)接种于经聚-D-赖氨酸包被或者胶原蛋白-I包被的96孔板(Black/clear或者White/clear)中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。第二天将各浓度的药剂以10μL/孔进行添加，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。该第二天采集30μL的培养上清，添加15μL的底物溶液，使之反应60分钟，利用光度计(Tristar、Bertold)测定发光信号。将仅用溶剂治疗的组的活性设为100％，计算IGF-I受体的活化。结果见表5。
[0331] [表5]
[0332]
[0333] 将仅用溶剂治疗的组的活性设为100％，计算胰岛素受体的活化。结果见表6。
[0334] [表6]
[0335]
[0336] 使用表达有IGF-I受体的细胞系，测定药剂的IGF-I受体的活化。在表达有IGF-I受体的细胞系中，IGF-I和IGF11-16与对照进行比较，显示出IGF-I受体的活化作用。
[0337] 使用表达有胰岛素受体的细胞系，测定药剂的胰岛素受体的活化。在表达有胰岛素受体的细胞系中，显示出胰岛素对胰岛素受体的活化作用。另外，IGF-I以浓度依赖性地活化胰岛素受体，在50nM下显示出显著的活化作用。另一方面，IGF11-16未活化胰岛素受体。
[0338] 已知IGF-I对胰岛素受体也显示反应性。另外，还已知胰岛素受体的活化会引起血糖降低作用。IGF11-16对IGF-I受体特异性作用，显示出不具有经由胰岛素受体的血糖降低作用。
[0339] [实施例10]人成肌细胞中的细胞增殖活性
[0340] 为了研究IGF-I受体激动剂抗体对人成肌细胞的增殖活性，将药剂添加到人成肌细胞中，测定4天后的细胞内的ATP量。
[0341] 将正常人骨骼肌成肌细胞(Human Skeletal Muscle Myoblast Cells、HSMM、3
Lonza)使用在SkBM-2(Lonza、CC-3246)中含有1％BSA的培养基，以0.1mL/孔(2×10cells/孔)接种于96孔板(Collagen type I coated)中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。在细胞接种的第二天以25μL/孔添加各种药剂，在37℃、5％CO2的条件下进行4天培养。作为细胞增殖的指标，将细胞内的ATP量使用CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)进行测定。将经4天培养的96孔板去除上清，使培养液达到50μL/孔，在室温下静置30分钟以上。以50μL/孔添加CellTiter-Glo(注册商标)试剂使之反应
10分钟以上后，利用光度计(Tristar、Bertold)测定发光信号。将仅添加溶剂的组的活性设为100％进行计算。结果见表7。
Lonza)使用在SkBM-2(Lonza、CC-3246)中含有1％BSA的培养基，以0.1mL/孔(2×10cells/孔)接种于96孔板(Collagen type I coated)中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。在细胞接种的第二天以25μL/孔添加各种药剂，在37℃、5％CO2的条件下进行4天培养。作为细胞增殖的指标，将细胞内的ATP量使用CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)进行测定。将经4天培养的96孔板去除上清，使培养液达到50μL/孔，在室温下静置30分钟以上。以50μL/孔添加CellTiter-Glo(注册商标)试剂使之反应
10分钟以上后，利用光度计(Tristar、Bertold)测定发光信号。将仅添加溶剂的组的活性设为100％进行计算。结果见表7。
[0342] [表7]
[0343]
[0344]
[0345] *：溶剂对照1和2含有与抗体16-13和26-3的、0.005nM和0.5nM相同量的叠氮化钠。
[0346] 与对照抗体(FLAG M2、Sigma Aldrich)进行比较，IGF-I和IGF11-16使细胞增殖活性亢进。
[0347] 0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50和500nM的IGF11-16使人成肌细胞的增殖活性以浓度依赖性地亢进。IGF11-16和IGF-I的成肌细胞增殖活性的EC50分别为0.004nM和0.61nM，IGF11-16显示出100倍以上强的活性。
[0348] 非专利文献35中所记载的16-13抗体和26-3抗体，与溶剂对照(含有叠氮化钠)进行比较，未确认到显著的细胞增殖活性，与IGF11-16的活性进行比较，较弱。
[0349] [实施例11]豚鼠成肌细胞中的细胞增殖活性
[0350] 将豚鼠成肌细胞(Cell Applications)使用在SkBM-2(Lonza、CC-3246)中含有1％BSA的培养基，以0.1mL/孔(4×103cells/孔)接种于96孔板(Collagen type I coated)中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。在细胞接种的第二天以25μL/孔添加各种药剂，在37℃、5％CO2的条件下进行4天培养。作为细胞增殖的指标，将细胞内的ATP量使用CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)进行测定。将经4天培养的96孔板去除上清，使培养液达到50μL/孔，在室温下静置30分以上。以50μL/孔添加CellTiter-Glo(注册商标)试剂使之反应10分以上后，利用光度计(Tristar、Bertold)测定发光信号。
[0351] 0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50和500nM的IGF11-16使豚鼠成肌细胞的增殖活性以浓度依赖性地亢进。IGF11-16和IGF-I的EC50分别为0.004nM和0.76nM，IGF11-16显示出100倍以上强的活性。
[0352] [实施例12]与IGF-I的作用持续性的活体外比较
[0353] 为了比较IGF11-16与IGF-I的作用持续性，在添加IGF11-16或IGF-I的18小时后交换培养基，在去除IGF11-16和IGF-I的条件下测定人成肌细胞的增殖活性。
[0354] 将正常人骨骼肌成肌细胞(Human Skeletal Muscle Myoblast Cells、HSMM、Lonza)使用在SkBM-2(Lonza、CC-3246)中含有1％BSA的培养基，以0.1mL/孔(2×103cells/孔)接种于96孔板(Collagen type I coated)中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。在细胞接种的第二天以25μL/孔添加IGF11-16或IGF-I，在添加18小时后，与未加入IGF11-16或IGF-I的培养基或者含有它们的培养基进行交换。在37℃、5％CO2的条件下进行4天培养。作为细胞增殖的指标，将细胞内的ATP量使用CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)进行测定。将经4天培养的96孔板去除上清，使培养液达到50μL/孔，在室温下静置30分钟以上。以50μL/孔添加CellTiter-Glo(注册商标)试剂使之反应10分以上后，利用光度计(Tristar、Bertold)测定发光信号。将相对于仅添加溶剂的对照组的比例(对照组、0％)作为细胞增殖活性进行计算。结果见图3。
[0355] 在将IGF-I的1nM和5nM经4天添加的组中，使细胞增殖活性分别上升至39％和75％。将IGF-I的1nM和5nM经18小时添加并冲洗的组的细胞增殖活性分别为8％和10％，与经4天添加的组进行比较的活性，为低于1/5，显示出显著的降低作用。
[0356] 在将IGF11-16的0.5nM经4天添加的组中，使细胞增殖活性上升至49％。将IGF11-16的0.5nM经18小时添加并冲洗的组的细胞增殖活性为30％，与经4天添加的组进行比较的活性，保持60％以上。
[0357] 若比较在药剂添加后经冲洗的IGF11-16的0.5nM治疗组与IGF-I的1nM和5nM治疗组的细胞增殖活性，则在统计学上IGF11-16显示出显著强的活性。根据这些显示出：IGF11-16即使在药剂的冲洗后也维持人成肌细胞的增殖活性，与IGF-I进行比较，具有强力的作用。IGF11-16即使在冲洗后也维持细胞增殖活性，因此与IGF-I的作用不同，IGF11-16与IGF-I受体强力地结合，显示出具有IGF-I受体的持续性活化作用。
[0358] [实施例13]人分化肌细胞中的葡萄糖摄取
[0359] 为了研究IGF11-16的葡萄糖摄取作用，使用人分化肌细胞，测定经放射标记的3H-2-脱氧葡萄糖的摄取量，与IGF-I的作用进行比较。
[0360] 将正常人骨骼肌成肌细胞(Human Skeletal Muscle Myoblast Cells、HSMM、Lonza)以0.5mL/孔(2×104cells/孔)接种于24孔板(Costar、3526)中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。使细胞达到汇合的状态来交换培养基(在SkBM-2(Lonza、CC-3246)中添加FBS(Lonza、CC-4423W)、L-谷氨酰胺(Lonza、CC-4422W)、地塞米松(Lonza、CC-4421W)、rhEGF(Lonza、CC-4420W)和GA-1000(Lonza、CC-4419W))。将成为汇合的HSMM细胞交换成0.5mL/孔的分化用的培养基(在DMEM/F12(1：1)(Gibco、11320)中含有2％马血清(Sigma、H1270)、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素(Gibco、15070-063))，在37℃、5％CO2下进行培养，以开始进行对肌细胞的分化。将从分化开始至约6天后的细胞作为人分化肌细胞，用于葡萄糖摄取的实验。
[0361] 将人分化肌细胞交换成0.5mL/孔的饥饿(Starvation)用的培养基(在含有1g/L葡萄糖的DMEM(Gibco、11885)中含有0.1％BSA不含脂肪酸(生化学工业、82-002-5)、50U/mL青霉素、50ug/mL链霉素(Gibco、15070-063))，在37℃、5％CO2下培养一夜。第二天交换成0.5mL/孔的饥饿用的培养基，在37℃、5％CO2下培养2小时。对孔以1mL/孔的PBS进行洗涤后，添加0.5mL/孔的含有各种药剂的治疗培养基，在37℃、5％CO2下培养2小时。治疗培养基为使用葡萄糖摄取用的缓冲液(以注射用水溶解至20mmol/L HEPES(DOJINDO、342-01375)、
150mmol/L NaCl(SIGMA、S5150)、5mmol/L KCl(Wako、163-03545)、5mmol/L MgSO4(Wako、
131-00405)、1.2mmol/L KH2PO4(Wako、169-04245)、25mmol/L CaCl2(Fluka、21114)和
2mmol/L丙酮酸(Wako、190-14881)，用NaOH将pH调节成7.4)，调制成最终浓度0.1mmol/L葡萄糖、0.1％BSA、3H-2-脱氧葡萄糖(1uCi/mL)、各浓度的人重组IGF-I或IGF-I受体激动剂抗体。在孔中添加1mL/孔的经冷却的PBS，进行3次洗涤，由此使葡萄糖摄取结束。在孔中添加
0.25mL/孔的1N NaOH，将细胞溶解。将细胞溶解液全量添加到预先添加有3mL的液体闪烁器ULTIMA GOLD(PerkinElmer Japan)的小瓶中进行搅拌。利用液体闪烁计数器测定3分钟的
3H的放射活性(DPM)。将无治疗组(对照组)的葡萄糖摄取量(DPM)的平均值设为100％，计算治疗组的葡萄糖摄取率。结果见图4。
150mmol/L NaCl(SIGMA、S5150)、5mmol/L KCl(Wako、163-03545)、5mmol/L MgSO4(Wako、
131-00405)、1.2mmol/L KH2PO4(Wako、169-04245)、25mmol/L CaCl2(Fluka、21114)和
2mmol/L丙酮酸(Wako、190-14881)，用NaOH将pH调节成7.4)，调制成最终浓度0.1mmol/L葡萄糖、0.1％BSA、3H-2-脱氧葡萄糖(1uCi/mL)、各浓度的人重组IGF-I或IGF-I受体激动剂抗体。在孔中添加1mL/孔的经冷却的PBS，进行3次洗涤，由此使葡萄糖摄取结束。在孔中添加
0.25mL/孔的1N NaOH，将细胞溶解。将细胞溶解液全量添加到预先添加有3mL的液体闪烁器ULTIMA GOLD(PerkinElmer Japan)的小瓶中进行搅拌。利用液体闪烁计数器测定3分钟的
3H的放射活性(DPM)。将无治疗组(对照组)的葡萄糖摄取量(DPM)的平均值设为100％，计算治疗组的葡萄糖摄取率。结果见图4。
[0362] IGF-I的0.8、4、20和100nM为浓度依赖性、且显著地使葡萄糖摄取亢进。另一方面，IGF11-16为直至100nM未显示出显著的作用。根据这些认为：IGF11-16在人分化肌细胞中的葡萄糖摄取作用极弱。
[0363] [实施例14]活体内药效(豚鼠中的肌肉量增加作用)
[0364] 为了确认IGF-I受体激动剂抗体在活体内的药效，对豚鼠单次给予IGF11-16，测定2周后的肌肉量，与经持续给予IGF-I时的作用进行比较。肌肉量增加作用是指使豚鼠的肌肉重量与对照组相比增加5％以上。
[0365] 将IGF11-16(0.03、0.1或0.3mg/kg)对于正常豚鼠的皮下或者静脉内进行单次给予。作为阳性对照，将人重组IGF-I(美卡舍明)使用渗透泵(Alzette)埋入皮下，以达到1mg/kg/日进行持续给予。药剂给予的2周后，使豚鼠在麻醉下放血致死，测定趾长伸肌的重量。结果见图5。
[0366] 将IGF11-16的0.03、0.1和0.3mg/kg进行静脉内给予的组(iv)，与仅用溶剂进行治疗的对照组进行比较，剂量依赖性、且显著地使肌肉量增加。另外，将IGF11-16的0.3mg/kg进行皮下给予的组(sc)，与对照组进行比较，也显示出显著的肌肉量的增加。
[0367] IGF11-16的0.03至0.3mg/kg的单次给予组的肌肉增加量，与将人重组IGF-I以1mg/kg/日进行持续给予的组(infusion)，为同等程度。由此显示出：IGF11-16通过对静脉内或者皮下的单次给予，在活体内也具有药效。
[0368] IGF11-16通过单次给予，显示出与IGF-I的持续给予具有同等的药效。临床上的IGF-I(美卡舍明)的用法剂量为1天1次至2次。另一方面，在活体内IGF11-16以2周1次的给予与IGF-I的持续给予显示同等的有效性，因此与IGF-I进行比较显示出持续性优异。
[0369] [实施例15]活体内血糖降低作用(豚鼠中的血糖降低作用)
[0370] 为了确认IGF-I受体激动剂抗体在活体内有无血糖降低作用，对于豚鼠单次给予IGF11-16，经时性地测定血糖值，与IGF-I的单次给予时的血糖降低作用进行比较。血糖降低作用是指使血糖值降低至50mg/dL以下或引起低血糖症状的作用。
[0371] 将IGF-I对于豚鼠进行单次皮下给予，研究血糖降低作用。使豚鼠禁食12小时，将人重组IGF-I(美卡舍明)以0.3、1、3和10mg/kg进行单次皮下给予。使豚鼠禁食直至给予后24小时。在给予前(0小时)、给予1、2、4、8、10和24小时后对清醒状态的豚鼠进行采血，使用葡萄糖测试传感器(Glu Test Sensor)(三和化学研究所)测定血糖值。结果见图6。
[0372] IGF-I自0.3mg/kg显示显著的血糖降低作用，在1mg/kg以上观察到低血糖症状，在3mg/kg以上观察到死亡例。
[0373] 将IGF11-16对于豚鼠进行单次皮下给予，研究血糖降低作用。使豚鼠禁食12小时，将IGF11-16以10、30和100mg/kg进行单次皮下给予。使豚鼠禁食直至给予后24小时。在给予前(0小时)、给予2、4、8、10和24小时后对清醒状态的豚鼠进行采血，使用葡萄糖测试传感器(三和化学研究所)测定血糖值。结果见图7。
[0374] IGF11-16与仅给予溶剂的对照组进行比较，即使在100mg/kg给予组，也未观察到血糖值的显著差异。由此显示出：IGF11-16的皮下给予不具有血糖降低作用，不影响血糖值。
[0375] 将IGF11-16对于豚鼠进行单次静脉内给予，研究血糖降低作用。使豚鼠禁食12小时，将IGF11-16以0.1、1.5、6和20mg/kg进行静脉内给予。使豚鼠禁食直至给予后24小时。在给予前(0小时)、给予0.5、1、2、4、8和24小时后对清醒状态的豚鼠进行采血，使用葡萄糖测试传感器(三和化学研究所)测定血糖值。结果见图8。
[0376] IGF11-16与仅给予溶剂的对照组进行比较，即使在20mg/kg给予组，也未观察到血糖值的显著差异。由此显示出：IGF11-16即使进行静脉内给予，也不具有血糖降低作用，不影响血糖值。
[0377] IGF11-16在皮下和静脉内的任一给予法中，均不具有如IGF-I的显著的血糖降低作用，不影响血糖值，因此显示出：作为克服IGF-I的副作用即低血糖的药剂的可能性。
[0378] [实施例16]活体内药效(豚鼠中的生长促进效果)
[0379] 为了确认IGF-I受体激动剂抗体在活体内对于骨的药效，将IGF-I进行持续给予，以及与将生长激素(GH)经1天1次反复给予时的作用进行比较。对于摘除下垂体的豚鼠单次给予IGF11-16，以生长促进效果作为指标，测定2周后的胫骨的长度和生长板软骨的厚度。将IGF11-16(0.3mg/kg和1mg/kg)对于下垂体摘除豚鼠进行单次皮下给予。作为比较对照，将人重组IGF-I(美卡舍明)使用渗透泵(Alzette)埋入皮下，以达到1mg/kg/日进行持续给予。另外，作为另外的比较对照，将人重组GH(Genevtropin(注册商标))以1mg/kg的剂量1天
1次进行反复皮下给予。药剂给予的2周后，使豚鼠在麻醉下放血致死，测定胫骨近端的生长板软骨的厚度和胫骨的长度。结果见图9和图10。
1次进行反复皮下给予。药剂给予的2周后，使豚鼠在麻醉下放血致死，测定胫骨近端的生长板软骨的厚度和胫骨的长度。结果见图9和图10。
[0380] 将IGF11-16的0.3mg/kg和1mg/kg进行皮下给予的组(IGF11-16)，与仅用溶剂对于下垂体摘除豚鼠治疗的对照组(vehicle)进行比较，观察到剂量依赖性、且显著地使生长板软骨的厚度和胫骨的长度延伸的生长促进效果。
[0381] IGF11-16的0.3mg/kg的单次给予组的生长促进效果，与将人重组IGF-I以1mg/kg/日进行持续给予的组(IGF-I)，为同等程度。另外，IGF11-16的1mg/kg的单次给予组的生长促进效果，与将人重组GH以1mg/kg/日进行反复给予的组(GH)，为同等程度。由此显示出：IGF11-16通过单次给予，与IGF-I的持续给予和GH的1天1次的反复给予具有同等的药效。临床上的人重组IGF-I(美卡舍明)和人重组GH(Genevtropin(注册商标))的用法剂量，分别为
1天1次至2次的皮下注射和每周6次至7次的皮下注射。另一方面，在活体内IGF11-16与以2周1次的给予的IGF-I的持续给予和GH的1天1次反复给予显示出同等的有效性，因此与IGF-I和GH进行比较，显示出持续性优异。
1天1次至2次的皮下注射和每周6次至7次的皮下注射。另一方面，在活体内IGF11-16与以2周1次的给予的IGF-I的持续给予和GH的1天1次反复给予显示出同等的有效性，因此与IGF-I和GH进行比较，显示出持续性优异。
[0382] [实施例17]IGF-I与IGF11-16的血中动力学
[0383] IGF-I的血中动力学
[0384] 使豚鼠禁食12小时，将人重组IGF-I以0.3、1、3和10mg/kg进行皮下给予。使豚鼠禁食直至给予后24小时。在给予前(0小时)、给予1、2、4、8、10和24小时后对清醒状态的豚鼠进行采血，利用ELISA(DG100、R&D)测定血浆中的人IGF-I浓度。结果见图11。
[0385] 血浆中的IGF-I浓度依赖于给予剂量而上升，给予24小时后的血浆中的IGF-I浓度降低至峰值时的约50％以下。0.3mg/kg给予组的给予24小时后的IGF-I浓度为测定下限以下。另外，10mg/kg给予组在给予4小时以后由于低血糖而死亡，因此未能采集血浆。
[0386] IGF11-16的血中动力学
[0387] 使豚鼠禁食12小时，将IGF-I受体激动剂抗体以0.3、1、3、10、30和100mg/kg进行皮下给予。使豚鼠禁食直至给予后24小时，在24小时后重新喂食。在给予前(0小时)、给予2、4、8、10、24、48和72小时后对清醒状态的豚鼠进行采血，利用ELISA测定血浆中的IGF11-16浓度。结果见图12。
[0388] 血浆中的IGF11-16浓度依赖于给予剂量而上升，在给予48小时以后，血浆中的IGF11-16浓度与给予24小时后进行比较，也维持约50％以上。显示出：与IGF-I进行比较，IGF11-16的血中动力学持续性优异。
[0389] 工业实用性
[0390] 本发明可提供与脊椎动物的IGF-I受体特异性结合、通过IGF-I受体、增加肌肉量或生长板软骨的厚度、且不使血糖值降低的抗体，因此可用于与抗IGF-I受体抗体相关的疾病的治疗、预防或诊断。
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