表皮生长因子受体抗体及其用途
阅读：243发布：2023-01-12
专利汇可以提供表皮生长因子受体抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供涉及表皮生长因子受体 抗体 及其用途，该表皮生长因子受体抗体分子的重链 氨 基酸序列如SEQ ID NO:1所示；且其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述抗体在保留其人源化抗体的高靶点亲合 力 、低免疫原性特点的 基础 上，提高于有关受体(Fc RIII、FcRn)的亲合力，明显提升了激活抑癌免疫细胞功能、增强了体内外抗 肿瘤 作用，实验表明体外杀癌细胞活性提高4倍，体内抗癌药效增强60％，并改进了 生物 利用度。预期本发明抗体抗癌疗效将超越针对相同靶点第一、二代抗体(包括许多在研/已进临床试验的生物类似抗体)，有更好的临床应用前景。，下面是表皮生长因子受体抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.表皮生长因子受体抗体分子，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；且其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.表达权利要求1所述的表皮生长因子受体抗体分子的基因核酸序列，该基因核酸序列例如为DNA、mRNA或cDNA。
3.根据权利要求2所述的基因核酸序列，其中：
用于编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的cDNA如SEQ ID NO:4所示；
用于编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的cDNA如SEQ ID NO:5所示。
4.含权利要求2或3所述的基因核酸序列的载体。
5.含权利要求1所述的表皮生长因子受体抗体分子，或权利要求2或3所述的基因核酸序列，或权利要求4所述的载体的宿主细胞。
6.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的表皮生长因子受体抗体分子，或权利要求
2或3所述的基因核酸序列，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的宿主细胞。
7.权利要求1所述的表皮生长因子受体抗体分子，或权利要求2或3所述的基因核酸序列，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的宿主细胞，或权利要求6所述的药物组合物在制备预防和/或治疗包括表皮生长因子和/或表皮生长因子受体相关疾病的药物中的用途；优选地，所述表皮生长因子和/或表皮生长因子受体相关疾病是指由于表皮生长因子高表达/突变和/或表皮生长因子受体高表达/突变而引起的疾病；更优选地，所述由于表皮生长因子高表达/突变和/或表皮生长因子受体高表达/突变而引起的疾病包括恶性肿瘤。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述恶性肿瘤包括脑瘤、非小细胞肺癌、鳞状上皮细胞、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肺癌，皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、前列腺癌、神经胶质瘤及鼻咽癌中的一种或多种。
9.权利要求1所述的表皮生长因子受体抗体分子，或权利要求2或3所述的基因核酸序列，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的宿主细胞，或权利要求6所述的药物组合物在制备检测试剂盒中的用途；
优选地，该检测试剂盒用于检测表皮生长因子和/或表皮生长因子受体，或者用于诊断表皮生长因子和/或表皮生长因子受体相关疾病。
10.检测试剂盒，其含有权利要求1所述的表皮生长因子受体抗体分子，或权利要求2或
3所述的基因核酸序列，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的宿主细胞，或权利要求6所述的药物组合物；优选地，所述检测试剂盒还可包含可检测的标记；或者优选地，所述检测试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述表皮生长因子受体抗体分子；更优选地，所述第二抗体还可包含可检测的标记。
表皮生长因子受体抗体及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及表皮生长因子受体抗体及其用途，属于抗体药物领域。
背景技术
[0002] 现有技术表明抗体药物由于在提高靶点亲合力、降低免疫源性(人源化)等方面的突破已加入抗癌主流治疗，并成为创新药研发热点(Chen DH，Zhang XS.Targeted therapy:resistance and re-sensitization.Chin J Cancer 2015；34:1-6)。
[0003] 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及其有关的信号通路在肿瘤的发病机理起重要作用。EGFR是由1186个氨基酸残基构成，分子量为170kD的一种跨膜糖蛋白。EGFR分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分(Jorissen RN，Walker F，Pouliot N，et al.Epidermal growth factor receptor：mechanisms of activation and signaling.Exp Cell Res 2003；284：31-53)。EGFR与其配体EGF的结合导致EGFR二聚化，激活了受体胞内酪氨酸蛋白激酶的活性，使碳末端特异的酪氨酸残基磷酸化，进而活化调控细胞生长的多条下游信号通路(Ras/MAPK，PI3K/AKT及JAKs/STATs等)。适量的EGFR通过介导这些通路调节部分正常细胞的生物功能；但在病理状况下,有很多实体瘤发现EGFR高表达或/和氨基酸序列突变(如直结肠癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌等)，进而增强肿瘤细胞的生长/侵袭力、促进血管生成、抑制肿瘤细胞的凋亡(Olayioye MA，Neve RM，Lane HA，etal.The EerbB Signaling network：receptor heterodimerzation in development and cancer.The EMBO J2000；19：3159-3167)。由于EGFR突变、失调或过表达于许多上皮恶性肿瘤，并驱动癌症进展细胞/分子机理的各个环节，使EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断和治疗的靶点。
[0004] 针对EGFR的原研抗体药(如爱必妥、帕尼单抗、泰欣生)已成功上市，并显示了对头、颈癌和结肠癌的良好疗效(Zhu Z.Targeted cancer therapies based on antibodies directed against epidermal growth factor receptor:status and perspectives.Acta Pharmacol Sin.2007；28:1476-93)。但临床实践表明这些抗体在应用0.5～1年后出现耐药(Philip PA,Benedetti J,Corless CL,et al.Phase III study comparing gemcitabine plus cetuximab versus gemcitabine in patients with advanced pancreatic adenocarcinoma:Southwest Oncology Group-directed intergroup trial S0205.J Clin Oncol.2010；28:3605-10；Chen DH，Zhang XS.Targeted therapy:resistance and re-sensitization.Chin J Cancer2015；34:1-6)。因此，本领域亟需开发疗效更好的抗体药来满足临床需要。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一在于提供表皮生长因子受体抗体分子。
[0006] 本发明的另一目的在于提供表达前述表皮生长因子受体抗体分子的基因核酸序列。
[0007] 本发明的再一目的在于提供含前述基因核酸序列的载体。
[0008] 本发明的再一目的在于提供含前述抗体分子、基因核酸序列或载体的宿主细胞。
[0009] 本发明的再一目的在于提供含前述抗体分子、基因核酸序列、载体或宿主细胞的药物组合物。
[0010] 本发明的再一目的在于提供前述抗体分子、基因核酸序列、载体、宿主细胞或药物组合物的应用。
[0012] 为实现上述目的，一方面，本发明提供表皮生长因子受体抗体分子，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；且其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0013] 本发明主要是在原研药爱必妥(Erbitux)的基础上，对其重链恒定区进行了多位点优化，实验结果表明由重链氨基酸序列SEQ ID NO:1和轻链氨基酸序列SEQ IDNO:2形成的抗体(以下简称Bio1403)相较于原研药爱必妥(Erbitux)的生物类似抗体Bio1401(其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示)在保留其人源化抗体的高靶点亲合力(爱必妥的KD＝0.2nM)、低免疫原性特点的基础上，提高于有关受体FcRIII、FcRn的亲合力，与FcRIII及FcRn亲合力提高表示强化了自然杀伤细胞的抗癌效应，并改善了该抗体药的生物利用度参数，本发明Bio1403抗体明显提升了激活抑癌免疫细胞功能、增强了体内外抗肿瘤作用，实验表明体外杀癌细胞活性提高4倍(本案图5可体现)，体内抗癌药效增强60％(本案图6可体现)。
[0014] 另一方面，本发明提供表达前述的表皮生长因子受体抗体分子的基因核酸序列，该基因核酸序列例如为DNA、mRNA或cDNA。
[0015] 优选地，用于编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的cDNA如SEQ ID NO:4所示。
[0016] 优选地，用于编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的cDNA如SEQ ID NO:5所示。
[0017] 优选地，用于编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的cDNA如SEQ ID NO:6所示。
[0018] 再一方面，本发明提供含前述基因核酸序列的载体。
[0019] 再一方面，本发明提供含前述的表皮生长因子受体抗体分子，或前述的基因核酸序列，或前述的载体的宿主细胞。
[0020] 再一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有前述的表皮生长因子受体抗体分子，或前述的基因核酸序列，或前述的载体，或前述的宿主细胞。
[0021] 再一方面，本发明提供前述的表皮生长因子受体抗体分子，或前述的基因核酸序列，或前述的载体，或前述的宿主细胞，或前述的药物组合物在制备预防和/或治疗包括表皮生长因子和/或表皮生长因子受体相关疾病的药物中的用途。
[0022] 优选地，所述表皮生长因子和/或表皮生长因子受体相关疾病是指由于表皮生长因子高表达/突变和/或表皮生长因子受体高表达/突变而引起的疾病。
[0023] 更优选地，所述由于表皮生长因子高表达/突变和/或表皮生长因子受体高表达/突变而引起的疾病包括恶性肿瘤。
[0024] 优选地，所述恶性肿瘤包括脑瘤、非小细胞肺癌、鳞状上皮细胞、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肺癌，皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、前列腺癌、神经胶质瘤及鼻咽癌中的一种或多种。
[0025] 再一方面，本发明提供前述的表皮生长因子受体抗体分子，或前述的基因核酸序列，或前述的载体，或前述的宿主细胞，或前述的药物组合物在制备检测试剂盒中的用途。
[0026] 优选地，该检测试剂盒用于检测表皮生长因子和/或表皮生长因子受体，或者用于诊断表皮生长因子和/或表皮生长因子受体相关疾病。
[0027] 再一方面，本发明提供检测试剂盒，其含有前述的表皮生长因子受体抗体分子，或前述的基因核酸序列，或前述的载体，或前述的宿主细胞，或前述的药物组合物。
[0028] 优选地，所述检测试剂盒还可包含可检测的标记；或者优选地，所述检测试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述表皮生长因子受体抗体分子；更优选地，所述第二抗体还可包含可检测的标记。
[0029] 综上可知，本发明主要提供了表皮生长因子受体抗体分子，相应的基因核酸序列、载体、宿主细胞、药物组合物及检测实际盒及其应用，本发明所述抗体在在保留其人源化抗体的高靶点亲合力、低免疫原性特点的基础上，提高于有关受体(Fc RIII、FcRn)的亲合力，明显提升了激活抑癌免疫细胞功能、增强了体内外抗肿瘤作用，实验表明体外杀癌细胞活性提高4倍(本案图5可体现)，体内抗癌药效增强60％(本案图6可体现)。预期本发明抗体抗癌疗效将超越针对相同靶点第一、二代抗体(包括许多在研/已进临床试验的生物类似抗体)，有更好的临床应用前景。附图说明
[0030] 图1为本发明实施例1所得pcDNA3.1/Hygro(+)-mutan1-L质粒。
[0031] 图2为本发明实施例1所得pcDNA3.1-mntant1-H质粒。
[0032] 图3A为本发明实施例1所得Bio1401抗体及爱必妥的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。
[0033] 图3B为本发明实施例1所得Bio1403抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。
[0034] 图4A、图4B为本发明实施例1所得Bio1403抗体在Waters E2695型高效液相色-质谱谱仪上检测结果，其中，图4A为抗体蛋白峰定位，图4B为抗体轻链、重链和总蛋白的理化参数。
[0035] 图5为本发明实施例1抗体依赖的细胞介导的细胞毒性实验结果图。
[0036] 图6为本发明实施例1抗癌动物实验结果图。
具体实施方式
[0037] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0038] 实施例1
[0039] (1)质粒的构建将合成的mutant1-L cDNA(其序列为SEQ ID NO：5)从质粒pBSK-mutant1-L中经HindIII和EcoRI双酶切、琼脂糖电泳分离、胶回收纯化后，粘端连入真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)的CMV启动子下游，构建mutant1-L基因的表达载体pcDNA3.1(+)/Hygro(+)-mutant1-L(如图1所示)，双酶切鉴定后，测序正确。将合成的mutant1-H cDNA(其序列为SEQ ID NO：4)从质粒pBSK-mutant1-H中经HindIII和EcoRI双酶切、琼脂糖电泳分离、胶回收纯化后，粘端连入真核表达载体pcDNA3.1(+)的CMV启动子下游，构建mutant1-H基因的表达载体pcDNA3.1(+)-mutant1-H(如图2所示)，双酶切鉴定后，测序正确。
[0040] (2)转染、培养
[0041] 取质粒1μg(轻链表达载体500ng，重链表达载体500ng)及3μL脂质体2000(Lipofectamine 2000)试剂(Invitrogen公司)分别溶于50μL的无血清OPTI-MEM培养基中，室温放置5min，将以上2种液体混合后室温放置25min；洗去待转染的CHO细胞的培养基，加入新鲜的10％FBS DMEM培养基；将质粒与脂质体2000混合液加入孔中，转染进行24h后，利用含1mg/mL的G418选择培养基继续培养细胞2周。将筛选得到的高表达克隆细胞株用无血清培养基进行扩大培养；离心收取细胞培养上清，用Protein A亲和层析柱纯化目的抗体，具体步骤如下：
[0042] (a)洗柱，10倍柱体积的结合缓冲液洗柱，流速为1ml/min；
[0043] (b)上样，将离心所得样品过柱，流速如前；
[0044] (c)洗涤，2倍柱体积结合缓冲液洗涤，去除杂质；
[0045] (d)洗脱，用适量洗脱缓液(0.1M盐酸甘氨酸，pH＝2.7)以2ml/min流速洗脱结合蛋白；
[0046] (e)收集洗脱样品于预先加入75μL 1M Tris-HCl(pH＝9.0)的1.5ml离心管中；
[0047] (f)EGFR单抗的脱盐：将proteinA纯化过的样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速1ml/min，第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液，即得Bio1403抗体。本发明按基本相同的方法制得Bio1401抗体，不同之处仅是以SEQ ID NO：6替换前述SEQ ID NO：4，其余步骤均相同。
[0048] 利用SDS-PAGE的方法鉴定EGFR单抗抗体的分子量及结构完整性：经过纯化的抗体样品分别在非还原(8％的分离胶)和还原(12％的分离胶)的条件下用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测，并以爱必妥作为对照，检测结果如图3A及图3B所示，图3A中“1”表示爱必妥(Erbitux)，“2”表示Bio1401；图3B中“1”表示Bio1403；图3A及图3B中“M”表示标记；从图3A及图3B中可以看出Bio1401抗体及其轻、重链分子量与爱必妥相同；Bio1403抗体及其轻、重链分子量正确，且无杂蛋白。
[0049] 用50mmol/L的NH4HCO3溶液将待测抗体稀释至0.5mg/mL，加入1M/L的DTT，使DTT的最终浓度为50mM，祸旋震荡，室温静置30min，用0.45μm的滤膜过滤后，待上样。在Waters E2695型高效液相色-质谱谱仪上，利用尺寸排阻层析柱分析EGFR单抗抗体的纯度和聚体产生比例，所得结果如图4A、图4B所示，从图4A～图4B中可看出Bio1403抗体蛋白纯度高，定位明确(图4A)；总抗体及轻、重链分子量正确，相关的理化参数符合理论推算(图4B)。
[0050] (3)抗体亲合力实验
[0051] 利用Biacore4000测定抗体的平衡解离常数(KD)以评估抗体的亲合力。具体实验步骤为：
[0052] 用10mM乙酸钠将EGFR稀释到20ng/mL，包被在Biacore芯片CM5上，利用包被EGFR的芯片捕获2.6μg/mL的突变体抗体(Mutants抗体，即Bio1403及Bio1401)。分别进样不同浓度的FcγRIIIA、FcRn蛋白(0、62.5、125、250、500、1000、和2000nmol/L)进样时间120s，流速30μL/min。利用BIAevaluation软件分析传感图谱，釆用1:1的Langmuir结合模型，对实验结果进行数据拟合，测定抗体的解离和结合常数。计算抗体的平衡解离常数(KD)＝解离常数(Kd)/结合常数(Ka)。所得结果如表1所示
[0053] 表1平衡解离常数(KD)说明抗体亲合力
[0054]结合蛋白 EGFR Fc RIIIA FcRn
-10 -6 -7
Bio1401 2.57e M 2.72e M 3.24e M
Bio1403 2.75e-10M 4.27e-7M 5.26e-8M
-10 -6 -7
Bio1401 2.57e M 2.72e M 3.24e M
Bio1403 2.75e-10M 4.27e-7M 5.26e-8M
[0055] 从表1中可以看出，与EGFR的亲合力，Bio1401抗体与Bio1403抗体基本相当；与Fc RIII或FcRn的亲合力，Bio1403抗体显著大于Bio1401抗体。
[0056] (4)抗体依赖的细胞介导的细胞毒性测试
[0057] 接种100μL 1×104/孔靶细胞(A431)到96孔细胞培养板中。按不同的3:1效靶比加入NK细胞，分别加入不同浓度的抗体溶液，补培养液至200μL，37℃，5％CO2，共培养24h。共培养24小时后，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在只接种A431细胞的培养孔中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％(20μl)。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。1h后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入60μL LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。按如下公式计算细胞毒性：
[0058] 细胞毒性(Cytotoxicity)＝(LGH释放样品(release sample)–SR效应器(effector)-SR(靶标)target)/(MR(靶标)target-SR target(靶标))×100。
[0059] 所得结果如图5所示，从图5中可以看出Bio1403诱导NK细胞杀灭癌细胞的活性(ADCC)明显强于Bio401，有量效关系，当横坐标为4时，Bio1403的最大减退是Bio1401的4倍。
[0060] (5)抗癌动物实验
[0061] 在6～8周龄的雌性裸鼠右背部皮下接种1×106个头颈上皮癌细胞(A431)，在接种细胞后肿瘤体积达到平均120～150mm3左右时，以尾静脉给药方式注射抗体和NK细胞，5mg/kg，并以溶剂作为对照组，每周3次，共2周。每两日使用游标卡尺测量瘤体的长(mm)与宽(mm)，应用公式：瘤体体积＝[长×(宽)2]/2对肿瘤体积进行计算；同时对荷瘤小鼠的体重进行持续监测。以每组肿瘤平均大小对时间进行肿瘤生长曲线的绘制，并绘制荷瘤小鼠的体重对时间的曲线。所得结果如图6所示，从图6中可以看出Bio1403抑制肿瘤生长的药效强于Bio1401，有时效关系，在横坐标为16天时，可看出较Bio1401，Bio1403的体内抗癌药效增强60％。
[0062] 最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。
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