COPD诊断用分子标志物
阅读：465发布：2020-05-11
专利汇可以提供COPD诊断用分子标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了COPD诊断用分子标志物，所述分子标志物为LOC100505635，本发明首次发现了LOC100505635在COPD患者中表达显著上调，提示LOC100505635可作为可能的检测靶标应用于COPD的早期诊断。，下面是COPD诊断用分子标志物专利的具体信息内容。
1.检测血液样本中LOC100505635表达水平的试剂在制备诊断COPD产品中的应用，所述LOC100505635的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测LOC100505635表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR检测LOC100505635表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增LOC100505635的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增LOC100505635的引物序列如SEQ ID NO.2 3所示。
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COPD诊断用分子标志物
技术领域
背景技术
[0002] 慢性阻塞性肺疾病(COPD)，是一种破坏性的肺部疾病，是一组以不完全可逆且进行性发展的气流受限为特征的炎症性疾病，气流受限通常呈进行性发展并与肺对有害颗粒或气体的异常炎症反应有关，通常伴有全身及肺外的不良效应。COPD是影响人类健康的重要公共卫生问题，目前居于全球死因的第四位。COPD的发病率逐年增高，与吸烟和日益严重的环境污染有关，尤其在发展中国家。在我国流行病学调查发现40岁以上的人群，COPD的发病率约8.2％。COPD的发病机制尚未完全明确，吸烟是COPD发生发展中最重要的致病因素，吸烟可以诱导肺内大量炎症细胞聚集，如中性粒细胞，巨噬细胞，树突状细胞，T、B淋巴细胞等，这些炎症细胞与上皮细胞，成纤维细胞，气道平滑肌细胞等在吸烟及有害气体颗粒的刺激下活化，释放出大量细胞因子，炎症趋化因子和蛋白酶，氧化剂，炎症反应及信号级联放大，导致不可控气道炎症，小气道破坏，肺气肿发生。
[0003] 目前COPD的诊断主要依靠肺功能检查、胸部X线检查、胸部CT检查等，但是肺功能检查(肺活量测定法)，是一种费时且昂贵的规程，只能由专科肺内科医师实施。但是上述方法不能有效的和其他疾病诸如哮喘、支气管炎、肺纤维化、结核区分开来。因此寻找COPD特异性的诊断方法对于疾病的预防和治疗具有重要的意义。
[0004] 随着生物技术的发展，人们发现无蛋白编码功能的RNA。，即非编码RNA，在人类疾病中发挥重要作用。目前，研究表明长链非编码RNA(lncRNA)具有复杂的生物学功能，如与细胞代谢、细胞凋亡、细胞周期、细胞黏附运动等有关，并可通过多种途径如调节DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构、作为miRNA的前体、mRNA降解、磷酸化作用、蛋白修饰等发挥功能，正如同内源性miRNA研究已取得重要成果一样，1ncRNA在疾病诊断和治疗领域代表了另一类重要的分子来源，其研究前景巨大。
[0005] 目前针对lncRNA在人类疾病中的研究仍处在起步阶段，lncRNA与COPD的发生和/或发展的机制的关系有待进一步研究，因为lncRNA在COPD的发生机制中的角色尚未阐明，因此探寻lncRNA COPD的分子基础具有重要意义。
发明内容
[0006] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一提供一种COPD诊断用标志物，用于解决现有技术中的问题。
[0007] 本发明的目的之二，提供一种COPD的诊断产品，该产品能够实现COPD的早期诊断，且具有较高的灵敏度和特异性。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 进一步，所述试剂包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测LOC100505635表达水平的试剂。本领域技术人员了解，上述列举的检测方法只是用来对本发明的方案进行说明，而不是限制，本领域技术人员可以采用本领域常用的任何手段来进行基因表达水平的检测，所述手段不是本发明的重要组成部分。
[0011] 进一步，所述用实时定量PCR检测LOC100505635表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增LOC100505635的引物。
[0012] 进一步，所述特异性扩增LOC100505635的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。
[0013] 本发明提供了一种诊断COPD的产品，所述产品包括检测LOC100505635表达水平的试剂，其中所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、制剂。
[0014] 进一步，所述试剂选自：
[0015] 特异性识别LOC100505635的探针；或
[0016] 特异性扩增LOC100505635的引物。
[0017] 进一步，所述特异性扩增LOC100505635的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。
[0018] 本发明提供了一种诊断COPD的试剂盒，所述试剂盒包括测定人血液样本中LOC100505635的表达水平的试剂，其中高于LOC100505635参照水平的LOC100505635水平指示COPD。
[0019] 进一步，所述试剂包括特异性扩增LOC100505635的引物，优选的所述引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。
[0020] 进一步，所述试剂盒还包括包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
[0022] 本发明中的试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。
[0024] 在本发明中，参照样本是自表观健康个体的参照群提供的、用于体外评估目的的生物样本。如本发明所使用的，“参照水平”指在表观健康个体的参照群中建立的值。
[0025] 本领域技术人员知道，在进行测量结果与参照浓度比较时，参照浓度可以使用阴性参照样本、阳性参照样本、或包括一种或超过一种这些类型对照的混合参照样本来测定。阴性参照样本优选会包括来自不吸烟者、没有诊断COPD的的对照吸烟者或其他。阳性参照样本优选会包括来自有诊断COPD的受试者的样本。
[0026] 表述“将测定得到的浓度与参照浓度比较”仅仅用于进一步例示对熟练技术人员显而易见的内容。在对照样本中建立参照浓度。对照样本可以是内部或外部对照样本。在一个实施方案中，使用内部对照样本，即在测试样本中以及在自同一受试者采集的一份或多份其它样本中评估标志物水平以确定所述标志物的水平是否存在任何变化。在另一个实施方案中，使用外部对照样本。对于外部对照样本，将自个体衍生的样本中标志物的存在或量与其在已知患有给定状况或已知有给定状况风险的个体或已知没有给定状况的个体(即“正常个体”)中的存在或量比较。例如，可以将患者样本中的标志物水平与已知与特定COPD过程相关的水平比较。通常，直接或间接地将样本的标志物水平与诊断关联起来，而且例如使用标志物水平来确定个体是否有COPD风险。或者，例如，可以将样本的标志物水平同已知与COPD患者中对治疗的响应、COPD的诊断、选择针对COPD的适宜药物的指导、判断疾病进展风险、或跟踪COPD患者相关的标志物水平比较。根据目的诊断用途，选择适宜的对照样本并在它们中为标志物建立对照或参照值。本领域技术人员知道，在一个实施方案中，自年龄匹配的且没有混淆疾病的参照群体获得此类对照样本。正如本领域技术人员清楚，在对照样本中建立的绝对标志物值会依赖于所使用的测定法。优选使用来自100名表征较好的个体(来自适宜参照群体)的样本来建立对照(参照)值。还优选参照群体可以选择成由20、30、50、200、500或1000名个体组成。健康个体代表用于建立对照值的一种优选参照群体。
[0027] “分子标志物”也称为“生物标志物”，是在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。在本发明中，LOC100505635可以与其他一种或多种COPD的分子标志物组成标志物组应用于COPD的诊断，某些标志物组合在筛选COPD中会是有利的。本领域技术人员知道，有多种方式使用两种或多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。
[0028] 生物标志物可以个别测定，或者同时测定，例如使用芯片琥珀基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的表达水平，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们的组合进行解读。
[0029] 在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选的，在数学上组合LOC100505635和一种或多种其他标志物的测定水平，并将组合值与实际的诊断问题关联起来，可以通过任何适宜的现有技术生物信息学方法将标志物值与LOC100505635的测定组合。
[0030] 优选的，在标志物组合中应用的方法是一种对数函数。优选的，应用此方法的结果是单一值。根据实际的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于COPD的风险或有助于评估COPD患者者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有COPD风险的个体、具有急性或慢性肺部炎症的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。
[0032] “阵列”、“宏阵列”或“微阵列”指有意创建的物质(诸如分子、标志物、开口、微线圈、检测仪和/或传感器)集合，其附着至基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)或在基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)上装配。阵列可用于同时测量大量(例如数十、数千或数百万)反应或组合的水平。阵列也可含有少量物质，例如一个、少数或一打。阵列中的物质可以彼此相同或不同。阵列可以采取多种形式，例如可溶性分子的文库、固定化分子的文库、固定化抗体的文库、拴系至树脂珠、硅片、或其它固体支持物的化合物的文库。阵列可以是宏阵列或微阵列，取决于阵列上的垫的大小。宏阵列一般含有约300微米或更大的垫大小，而且能容易地通过凝胶和印迹扫描仪来成像。微阵列一般会含有小于300微米的垫大小。
[0033] “固体支持物”指不溶性、官能化、聚合材料，可以对其附着或共价结合(常常经由接头)文库成员或试剂，从而固定化或容许它们易于与过量的试剂、可溶性反应副产物、或溶剂分开(通过过滤、离心、清洗等)。
[0034] 在本发明中，“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括(但不限于)：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
[0035] 所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleicacid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nμcleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
[0036] 本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1指定的序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。
[0037] 在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。
[0038] 在本发明中，“LOC100505635”是一种长链非编码RNA，由于它是非蛋白编码的，故不存在蛋白质产物。在人类中，转录该RNA的基因是位于6号染色体的短臂2区2带上，LOC100505635的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0039] 在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0040] 本发明的优点和有益效果：
[0041] 本发明首次发现了LOC100505635在COPD患者中差异表达，通过检测LOC100505635的表达水平可以判断早期COPD患者。
[0043] 图1是利用QPCR检测LOC100505635在COPD患者中的表达情况图。
[0044] 具体的实施方式
[0045] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0046] 实施例QPCR测序验证LOC100505635的差异表达
[0047] 1、对LOC100505635差异表达进行大样本QPCR验证。收集正常人和COPD患者的血液各80例，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0048] 2、RNA样品的制备及质量分析
[0049] 2.1 RNA样品的制备
[0050] (1)每0.25ml液体样本加入0.75ml裂解液RLS，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5～10×106个细胞至少加入0.75ml裂解液RLS。裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3：1；
[0051] (2)在EP管中加入0.75ml裂解液RLS，再加入0.25ml血液样本，用力连续震摇30s，混匀，在15-30℃条件下孵育10min以使核蛋白体完全分解。
[0052] (3)每0.75ml裂解液RLS加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s并室温下放置5min；
[0053] (4)于4℃12000rpm离心10min，把水相转移到新管中；
[0055] (6)12000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管；
[0056] (7)加0.5ml去蛋白液RE，12000rpm离心45s，弃掉废液；
[0057] (8)加入0.5ml漂洗液RW，12000rpm离心45s，弃掉废液；
[0058] (9)重复步骤(8)；
[0059] (10)将吸附柱RA放回孔收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；
[0060] (11)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water，室温放置2min，12000rpm离心1min。
[0061] 2.2 RNA样品的质量分析
[0062] 利用NanoVue Plus仪器对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。
[0063] 3、逆转录：
[0064] (1)逆转录反应
[0065] 采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RTBμffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH2O5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。
[0066] (2)引物设计
[0067] 根据LOC100505635和GAPDH的序列，设计引物，由博迈德公司合成。具体引物序列如下：
[0068] LOC100505635的引物序列为：
[0069] 正向引物：5’-CCTCAGCCCTACCTTCCACT-3’(SEQ ID NO.2)
[0070] 反向引物：5’-GCAGCTCCTCAAGTTCATCCC-3’(SEQ ID NO.3)
[0071] 管家基因GAPDH的引物序列为：
[0072] 正向引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.4)
[0073] 反向引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.5)
[0074] (3)QPCR扩增检验
[0075] 用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
[0076] 采用20μl反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μ△l，5×ROX Reference Dye 2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
[0077] 扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。
[0078] (4)cDNA模板浓度的筛选
[0079] 将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。
[0080] 根据溶解曲线，可以看出，当cDNA的进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。
[0081] (5)样品RealTime PCR检测
[0082] 将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2-ΔΔCT法进行相对定量。
[0083] 4、结果
[0084] 结果如图1所示，与正常人相比，LOC100505635在COPD患者中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0085] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
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