N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）1，NMT2和蛋氨酸氨肽酶在外周血和外周血单核细胞中过表达是腺瘤性息肉的标志物和结直肠癌的早期发现的标志物
阅读：226发布：2020-06-18
专利汇可以提供N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）1，NMT2和蛋氨酸氨肽酶在外周血和外周血单核细胞中过表达是腺瘤性息肉的标志物和结直肠癌的早期发现的标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了识别NMT1基因，NMT2基因和metAP2基因，mRNA，其中与未患有腺瘤性息肉的患者和健康对照受试者相比，所述NMT1基因，NMT2基因和metAP2基因，mRNA在患有腺瘤性息肉的患者的PBMC中过表达。我们还观察到，与未患有腺瘤性息肉的患者和健康对照受试者相比，NMT2 水 平在患有腺瘤性息肉的患者的PBMC中更高。，下面是N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）1，NMT2和蛋氨酸氨肽酶在外周血和外周血单核细胞中过表达是腺瘤性息肉的标志物和结直肠癌的早期发现的标志物专利的具体信息内容。
1.一种识别息肉摘除的候选人的方法，所述方法包括：
测量取自患者的外周血或外周血单核细胞样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶1，(NMT1)NMT2和/或MetAP2表达水平，其中NMT1，NMT2和/或MetAP2表达水平高于阈值水平表明该患者为息肉摘除的候选人。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，如果所述患者为息肉摘除的候选人，则安排所述患者进行息肉摘除的手术。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过结肠镜检查摘除息肉。
4.一种确定患者是否为息肉摘除候选人的方法，所述方法包括：
测量取自患者的外周血或外周血单核细胞样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶2水平，其中NMT2水平高于阈值水平表明患者患有腺瘤性息肉，并且该患者是腺瘤性息肉摘除的候选人。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，安排所述患者进行息肉摘除的手术。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，通过结肠镜检查摘除息肉。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用至少一种引物测量NMT1，NMT2和metAP2基因水平，所述引物包含NMT1，NMT2和metAP2各自特有的核酸序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用一种探针测量NMT1，NMT2和metAP2基因水平，所述探针包含NMT1，NMT2和metAP2各自特有的核酸序列。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用对NMT2具有特异性的抗体测量NMT水平。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者为人。
11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述患者为人。
N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）1，NMT2和蛋氨酸氨肽酶在外周血
和外周血单核细胞中过表达是腺瘤性息肉的标志物和结直肠
癌的早期发现的标志物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2016年5月3日提交的题为“'N-myristoyltransferase(NMT)1，NMT2 and methionine aminopeptidase 2 overexpression in peripheral blood mononuclear cells is a marker for adenomatous polyps and early detection of colorectal cancer”的美国临时专利申请序列号为62/331,045的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
[0003] 癌症是全球主要的致死原因。结肠癌、直肠癌和阑尾癌统称为结直肠癌(CRC)。CRC 是全球第二或第三致命的癌症，但是如果早期治疗的话，则具有90％的存活率(CancerCare Manitoba,2007；Population screening for colorectal cancer,2006)。然而，全世界每年有超过60万人死于CRC(加拿大癌症协会，2010)。
[0004] CRC由恶变前的腺瘤性息肉引起，腺瘤性息肉可能需要数年才能发展成癌症。饮食和遗传都是CRC的病因。CRC的遗传易感性包括明确的遗传综合征，如家族性腺瘤性息肉病，以及不明确的家族聚集性；30％的CRC病例是家族性的(CancerCare Manitoba,2007； Population screening for colorectal cancer,2006)。CRC以几种形式发生，包括例如腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤和神经内分泌肿瘤。95％的CRC是腺癌。恶性肿瘤是肿瘤从粘膜肌层侵入至粘膜下层。术语“腺”是指腺体，癌是上皮组织的恶性肿瘤(细胞层)。然而，并非所有的息肉都会发展成CRC，绝大多数CRC病例都不是家族性的。这些统计数据凸显了迫切需要在腺瘤性息肉发展为结肠和直肠晚期恶性肿瘤之前在腺瘤性息肉阶段早期发现 CRC的可靠筛查方法，这种需求目前还未得到满足。
[0005] 目前的CRC筛查策略
[0006] 筛查是指在出现症状之前在特定的一群人中找出易于患病的个别人。最常见的CRC筛查试验包括粪便试验、乙状结肠镜检查和结肠镜检查(Screening，2001)(Winawer,et al., 2003)。市场上有几种可用于粪便试验的选择，包括粪便潜血试验10(FOBT)、粪便免疫试验(FIT)和粪便DNA检测。
[0007] FOBT检测粪便中是否存在血液，其中粪便中出现血液可能是由若干原因引起的，不仅限于结直肠癌。因此，该试验是非特定的。在试验之前，必须遵循饮食限制，包括避免食用十字花科蔬菜(甘蓝科)和肉类，因为它们会干扰试验。因此，虽然FOBT成本低，但假阳性率非常高。
[0008] FIT更具体，因为它检测粪便中人体血液的存在；但是，它对温度敏感。
[0009] 粪便DNA检测筛选对癌细胞特异的DNA的存在。
[0010] 上述所有试验是针对粪便进行的，因此由于试验的性质，依从率低。
[0011] 乙状结肠镜检查和结肠镜检查是侵入性和昂贵的手术，手术的结果和风险取决于主治内窥镜医师的专业知识(Baxter and Rabeneck,2009；Singh et al.2010；Singh et al.2009)。乙状结肠镜检查和结肠镜检查在加拿大不是被推荐的基于人群的筛查试验。
[0012] 在加拿大，FOBT是基于人群的筛查工具，用于早期检测和筛查结直肠癌，而不是乙状结肠镜检查和结肠镜检查。由于试验(Moayyedi,2007；Nicholson,et al.,2005)的低灵敏度或侵入性，这些筛查试验的依从性受到限制。
[0013] 例如，在曼尼托巴省，结肠癌筛查基本上没有成功，因为85％的目标患者选择不进行结肠癌筛查。
[0014] 重要的是，这些基于粪便的试验无法确定患有腺瘤性息肉的无症状人群，随着时间的推移，腺瘤性息肉最终可能发展为CRC。因此，需要这样的技术，该技术可以识别在发展为癌症之前具有腺瘤性息肉的那些个体。在腺瘤性息肉发展成CRC之前将其去除可以挽救生命并改善生活质量。
[0015] 广泛可用的生物标记物-癌胚抗原(CEA)具有有限的灵敏度和特异性(Duffy,et al.,2003； Ouyang,et al.,2005)。然而，与粪便检查或内窥镜检查相比，血液检查可能更容易让人接受。价格划算的血液检查可以识别CRC风险高的患者，并提高患者对更强化和侵入性诊断手术的依从性。
[0016] N-豆蔻酰化
[0017] N-豆蔻酰化是14-碳饱和脂肪酸链与蛋白质的N-末端甘氨酸残基的共价连接，所述蛋白质由N-肉豆蔻酰基转移酶(NMT)催化。已经在不同的分类群中观察到蛋白质的豆蔻酰化，这些不同的分类群包括哺乳动物、植物、病毒和真菌的分类群(Farazai,et al.,2001)。在低等真核生物中，单个基因编码被NMT催化。人类等高等真核生物有两个基因被NMT催化 (Giang and Cravatt,1998)。
[0018] N-豆蔻酰化是不可逆的共翻译蛋白质修饰(Towler,et al.,1987)。最近的一些报告提出了这一规则的例外情况，并提供了翻译后豆蔻酰化的证据。例如，促细胞凋亡蛋白BID在凋亡之前被细胞凋亡蛋白酶8切割以显示豆蔻酰化基序。另一种翻译后豆蔻酰化的蛋白质是P21活化蛋白激酶，其参与维持细胞骨架(Zha,et al.,2000；Vilar,et al.,2006)。参与信号级联，细胞转化和肿瘤发生的蛋白质通常是豆蔻酰化的。这些蛋白质包括cAMP-依赖性蛋白激酶的催化亚基(Carr,et al”1982)，钙调神经磷酸酶的p亚基(Aitken,etc.,
1982)，几种 G蛋白的α-亚基(Schultz,et al,1987)，pp60-src的细胞转化形式(Schultz,et al.,1985)，对成熟病毒颗粒的组配、成熟和感染而言很重要的几种酪氨酸激酶和蛋白质，如小鼠白血病病毒Pr65gag前体(Rei,et al.,1986)和脊髓灰质炎病毒5VPO多肽前体(Marc,et al., 1989)。
1982)，几种 G蛋白的α-亚基(Schultz,et al,1987)，pp60-src的细胞转化形式(Schultz,et al.,1985)，对成熟病毒颗粒的组配、成熟和感染而言很重要的几种酪氨酸激酶和蛋白质，如小鼠白血病病毒Pr65gag前体(Rei,et al.,1986)和脊髓灰质炎病毒5VPO多肽前体(Marc,et al., 1989)。
[0019] NMT在CRC中过度表达
[0020] 真核生物NMT是GCN5相关的N-乙酰转移酶(GNAT)蛋白质超家族的成员(Resh, 1999)(Boutin,1997)(Farazai,et al.,2001)。N-乙酰转移酶使用乙酰辅酶A(CoA)将乙酰基从供体转移至受体的伯胺。两种基因在高等真核生物，如牛、人和植物中编码NMT。已经从人肝脏文库克隆了第二种遗传上不同的NMT 2 cDNA(NMT-2)。还分别克隆了两种人 NMT的小鼠同源物(Giang DK et al.,1998,15J Biol Chem.；273：6595-8)。
[0021] 与邻近肿瘤的组织和对照组患者的组织相比，已报道结肠肿瘤组织中的NMT活性升高 (Magnuson,et al.,1995)。最近的研究还表明，结肠癌中NMT1的表达在结肠癌的早期阶段较高，在息肉中也很高(Selvakumar et al.,2006)。然而，在先前的研究中，通过IHC测量NMT活性和在肿瘤组织中的表达倾向于描绘总NMT表达而不仅仅是NMT1表达(King &Sharma,1991)。我们已经证明，与健康对照个体相比，CRC患者的PBMC中NMT2水平升高。
[0022] NMT过度表达
[0023] NMT在结肠肿瘤中的过度表达尚不清楚。然而，NMT过度表达与肿瘤发生过程中细胞快速分裂对癌基因蛋白的豆蔻酰化的需求增加相一致。CRC和免疫系统之间的联系可以通过他们各自的NMT需求来建立。已经发现NMT活性和NMT1表达对于单核细胞谱系的正确发育是必需的，因此NMT活性和NMT1表达可能参与其它白细胞的分化(Shrivastav,et al., 2008)。Shrivastav等人(2007)在CRC患者(n＝18)的CRC外周血中建立了强阳性NMT1 免疫染色。使用针对全长NMT1蛋白产生的多克隆抗体进行免疫染色。
[0024] 使用对NMT1或NMT2特异的抗体，NMT1和NMT2同种型(两种不同基因的产物)在 CRC患者的PBMC中的表达模式显示NMT2蛋白而非NMT1蛋白在CRC10患者的PBMC 中过表达。NMT2蛋白是与NMT1不同的基因的产物。在T细胞从PBMC中进一步分离出后，我们清楚地确定NMT2而非NMT1在CRC患者的T细胞中过表达。
[0025] 蛋氨酸氨肽酶(MetAP)表达：
[0026] 氨肽酶是金属蛋白酶，负责从未被阻断的蛋白质N-末端切除氨基酸。蛋白质合成由起始密码子启动，该起始密码子编码真核生物中的氨基酸蛋氨酸和原核生物中的甲酰蛋氨酸。蛋氨酸氨肽酶(MetAP)是催化去除新合成蛋白质的蛋氨酸的酶。去除蛋氨酸是进一步修饰N- 末端，例如乙酰化和豆蔻酰化之前的必要步骤。人MetAP以两种同种型存在：MetAP1和 MetAP2，它们由不同的基因编码。同种型MetAP2在底物特异性，表达控制方面不同，并且在功能上不是多余的。在各种细胞中，MetAP1是组成型表达的，而MetAP2参与细胞增殖的调节。MetAP1在细胞分裂中起着重要作用。研究表明，MetAP1的抑制导致HeLa和 HT1080细胞的凋亡。
[0027] 研究表明，MetAP2在几种肿瘤的生长中起着重要作用。用反义MetAP2进行处理能够诱导大鼠肝癌细胞凋亡。在恶性间皮瘤、恶性淋巴瘤和食道鳞状细胞癌中发现了更高的 MetAP2水平。据报道，血管生成抑制剂-烟霉醇(Fumagillol)可抑制人神经母细胞瘤中 MetAP2的表达。早些时候，我们证明了结直肠癌患者的PBMC中MetAP2水平较高。使用免疫组织化学和PCR证实了以上这一点。发明内容
[0028] 根据本发明的一个方面，提供了一种识别息肉摘除的候选人的方法，该方法包括：
[0029] 测量取自患者的外周血或外周血单核细胞样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶1，(NMT1) NMT2和/或MetAP2表达水平，其中NMT1，NMT2和/或MetAP2表达水平高于阈值水平，则表明该患者为息肉摘除的候选人。
[0030] 根据本发明的另一个方面，提供了一种判断患者是否为息肉摘除候选人，该方法包括：
[0032] 图1：外周血单核细胞中的NMT2表达。分离PBMC，在载玻片上制备细胞离心涂片并进行免疫组织化学分析，并如本文所述进行H-评分。该图表示健康对照组(n＝19)，非腺瘤性息肉(n＝8)和腺瘤性息肉(n＝19)中NMT2染色的平均H评分。腺瘤性息肉中的NMT2 水平比对照组受试者或患有非腺瘤性息肉的受试者高约3.5倍。
[0033] 图2：通过RT-PCR测定的基因表达：相对于管家基因GAPDH和β-肌动蛋白定量NMT1， NMT2和METAP2基因的表达，其中GAPDH和β-肌动蛋白的表达在实验条件下保持不变。
具体实施方式
[0034] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，但是现在描述的是优选的方法和材料。接下来提及的所有专利公开均通过引用并入本文。
[0035] 之前报道到，由于阳性免疫染色，与在健康对照组的PBMC中相比，NMT1，NMT2和 MetAP2蛋白在结直肠癌患者的PBMC中过表达。尽管通过使用针对全长NMT1蛋白产生的多克隆抗体进行NMT1的检测，所述NMT1蛋白与NMT2具有77％的氨基酸序列同源性。我们还观察到，与健康对照组相比，NMT2和MetAP2的mRNA在CRC患者中更高。
[0036] 腺瘤性息肉在数年内发展为结直肠癌。在腺瘤性息肉发展成癌症之前识别和摘除腺瘤性息肉具有高度相关性。在目前的研究中，发明人证明，与健康个体或患有非腺瘤性息肉的个体相比，患有腺瘤性息肉的患者的PBMC中的NMT1，NMT2和MetAP2表达水平更高。 NMT1，NMT2和MetAP2可以例如通过使用包含NMT1，NMT2和/或MetAP2特有的核酸序列的引物或探针来测量。
[0037] 本发明人还证明，与健康对照个体或患有非腺瘤性息肉的患者相比，患有腺瘤性息肉的患者的外周血或PBMC中的NMT2蛋白水平更高。使用对NMT2特异的抗体证明了这一点。
[0038] 如本领域技术人员所理解的，鉴于CRC的高度影响，迫切需要一种更方便、更准确和更经济有效的筛查试验，其可以对患者进行分类以进行更精密的手术，例如结肠镜检查。这将改善患者的依从性和临床结果，从而对人口健康和医疗保健成本产生重大影响。基于血液的筛查试验是一种有吸引力的替代方案，已经通过前列腺癌和心脏病脂质的筛查试验证明了这一点。
[0039] 此外，检测恶变前息肉的筛查试验提供了一个非常好的机会，通过筛查试验不仅可以早期识别，而且可以实际预防癌症，因为可以对癌前病变的筛查试验为阳性的患者进行后续结肠镜检查，以在息肉发展为癌症之前将其摘除。
[0040] 本发明人使用来自Sigma(加拿大)的经验证的多克隆金标抗体，其对NMT2具有特异性。
[0041] 如本领域技术人员所理解的，可以从为常规血液工作收集的样本的一部分中获得用于这种筛查过程的患者样本。由于筛查的成本相对较低，因此可以筛选任何抽取血样的个体是否存在息肉。这反过来意味着可以摘除更多的癌前息肉，从而减少CRC的发生。
[0042] 进一步腺瘤性息肉筛查方法可以选自进行乙状结肠镜检查和结肠镜检查的个体构成的组。也就是说，如本文所讨论的，可以首先使用本发明的一种方法筛查乙状结肠镜检查或结肠镜检查候选人，以确定是否需要进一步筛查；或者，如本文所讨论的，通过任何方式诊断为患有息肉的个体可以经受本发明的一种方法以确定息肉是否是腺瘤性的。或者，如本文所讨论的，可以立即安排检测到患有息肉的个体进行结肠镜检查以摘除息肉。
[0043] 患者可以是人。
[0044] 患者可能有结直肠癌的家族史，是CRC的高危人群或易于患有CRC，或者患者的年龄大于55岁。
[0045] 样本可以是全血、外周血或外周血单核细胞。
[0046] 如本文所讨论的，NMT1基因，NMT2基因和MetAP2基因在易患CRC患者或CRC患者的PBMC中的过表达的生物学基础必须被更好地表征以用作具有腺瘤性息肉的无症状群体的标记物，所述腺瘤性息肉随后可发展为CRC。
[0047] 如下所述，本文描述的是以下这一发现：NMT1基因、NMT2基因和MetAP2基因、mRNA 或蛋白质在患有腺瘤性息肉的患者的PBMC中过表达。
[0048] 如本文所讨论的，先前发现NMT2在患有CRC的个体的PBMC中升高。然而，NMT1， NMT2和MetAP2在结肠和直肠的早期致癌或癌前病变过程中在PBMC中过表达的这一发现是令人惊讶的，并且这一发现允许识别面临发展CRC风险且应该得到密切监控的个体，而不是对已经患有CRC的个体进行检测。如上所述，CRC是全球第二或第三致命的癌症，但如果早期得到治疗，则具有90％的存活率。
[0049] 如本文所用，“表达”，“过表达”，“水平”或“表达水平”是指转录水平和/或蛋白质水平。
[0050] 如本文所讨论的，测量试剂可以是对NMT1，NMT2和/或MetAP2具有特异性的引物、探针或抗体。
[0051] 根据本发明的一个方面，提供了一种对进一步的结直肠癌(CRC)筛查的候选人进行识别的方法，该方法包括：
[0052] 测量取自患者的样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶1，(NMT1)NMT2和/或MetAP2表达水平，其中NMT1，NMT2和/或MetAP2表达水平高于阈值水平，则表明该患者为进一步CRC 筛查的候选人。
[0053] 根据本发明的另一个方面，提供了一种识别进行息肉摘除的候选人的方法，该方法包括：
[0054] 测量取自患者的外周血或外周血单核细胞样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶1，(NMT1) NMT2和/或MetAP2表达水平，其中NMT1，NMT2和/或MetAP2表达水平高于阈值水平，则表明该患者为息肉摘除的候选人。
[0055] 在一些实施例中，安排患者进行息肉摘除的手术。
[0056] 在一些实施例中，通过结肠镜检查或类似手术摘除息肉。
[0057] 患者可能是需要或希望筛查腺瘤性息肉的患者。如本领域技术人员所理解的，需要或希望筛查腺瘤性息肉的患者可以是超过特定年龄的个体，例如，年龄大于55岁的个体或者可以是具有患CRC或息肉风险的患者。如本文所用，具有患CRC或息肉风险的个体可以指具有 CRC或腺瘤性息肉发展的家族史或个人史或可能导致腺瘤性息肉或CRC的其它适应症的个体，或者由于一个或多个另外的风险因素，例如肥胖、吸烟、低纤维饮食或本领域已知的其它风险因素或其的组合，而有可能具有患CRC或腺瘤性息肉风险的患者。
[0058] 在一些实施例中，患者是具有患息肉风险的个体，息肉例如为腺瘤性息肉。例如，被认为有患腺瘤性息肉风险的个体或患者可能是具有一种或多种另外的风险因素的个体，这些风险因素例如但不限于年龄、CRC家族史、发展为腺瘤性息肉家族史、肥胖、吸烟、低纤维饮食或本领域已知的其它风险因素或其的组合。
[0059] 根据本发明的另一方面，提供了一种测量患者的样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶2(NMT2) 表达的方法，该方法包括：
[0060] 使用测量试剂测量来自患者的样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶2水平，所述测量试剂针对 NMT2的独特或特定区域，以及
[0061] 判断NMT2水平是否高于阈值水平。
[0062] 根据本发明的一个方面，提供了一种确定患者是否为息肉摘除候选人的方法，该方法包括：
[0063] 测量来自患者的样本中的N-肉豆蔻酰基转移酶2水平，其中NMT2水平高于阈值水平表明患者患有腺瘤性息肉，并且该患者是腺瘤性息肉摘除的候选人。
[0064] 在一些实施例中，安排患者进行息肉摘除的手术。
[0065] 在一些实施例中，通过结肠镜检查或类似手续摘除息肉。
[0066] 可选择地，正如本领域技术人员将理解地，可以安排患者进行进一步的腺瘤性息肉筛查和/或腺瘤性息肉摘除。可以通过本领域已知的任何合适的筛查方法进行进一步的腺瘤性息肉筛查和/或腺瘤性息肉摘除，所述合适的筛查方法例如但不限于乙状结肠镜检查和结肠镜检查。
[0067] 优选地，患者或个体是人。
[0068] 样本可以是任何合适的样本，其中从所述合适的样本中可以测得NMT1，NMT2和/或 MetAP2活性。如本领域技术人员所理解的，“阈值”水平是指高于阈值，这自然是取决于测量NMT1，NMT2和/或MetAP2的方法，还取决于用于该测量的样本。通过与已知的阴性对照组和/或已知的阳性对照组相比较，可以确定阈值。如本领域技术人员所熟知的，不是每次试验都需要重复这种对照行为。
[0069] 早先报道到，NMT1，NMT2和MetAP2在CRC患者的PBMC中过表达(Shrivastav,et al.,2007)。酰化蛋白参与了一系列功能，从细胞分裂到细胞凋亡，但是大多数功能不为人们所理解。Shrivastav等人(2007)发现NMT集中在CRC患者和患有结肠癌的小鼠的骨髓细胞(BMC)的细胞核中。在对照组中，NMT则集中在细胞质中。为了探究NMT同种型在 CRC中的作用，Ducker等人(2005)检测了通过使用CRC细胞中的siRNA沉默NMT1和 NMT2的效果。与沉默NMT1(2005)相比，沉默NMT2诱导肿瘤细胞中的细胞死亡多了 2.5倍，这意味着NMT2是更好的治疗靶标。还观察到癌症导致造血干细胞经历凋亡事件 (Deckers,et al.,1973)[0070] 以前我们已经表明，与对照受试者相比，NMT2和MetAP2在CRC患者的PBMC中过表达。然而，没有对患有不同类型的肠胃(Gl)息肉的个体的PBMC中的NMT1，NMT2和 MetAP2表达进行系统评价。在胃肠道中存在不同类型的息肉。
[0071] “息肉”的起源是希腊词“息肉的”，意思是“病态肿块”。息肉是细胞块，其在结肠内壁中形成，且伸入中空血管腔中，例如肠腔或结肠腔中。它们通常来自器官系统，例如胃肠道的粘膜层；然而，一些息肉具有亚粘膜下层病理学，这可能导致粘膜伸入内腔。息肉是上皮的，且组织学上，结肠息肉可分为腺瘤性息肉(也称为肿瘤性息肉)、增生性息肉、错构瘤性息肉或炎性息肉。
[0072] 1)腺瘤性息肉：
[0073] 腺瘤性息肉也称为肿瘤性息肉并且是恶性的。这些息肉是粘液分泌的，因此是腺上皮细胞，因此称为腺瘤。危险因素包括吸烟、肥胖、红肉摄入量高、低纤维和低钙。研究表明，非甾体类抗炎药(NSAIDS)和他汀类药物对息肉有抑制作用。根据生长模式，腺瘤性息肉被分为管状腺瘤、绒毛状腺瘤、管状绒毛状腺瘤或锯齿状腺瘤。
[0074] 术语“异型增生”是指具有受损的细胞内结构的异常腺体性质。在某种程度上，所有腺瘤都表现出异型增生。不同的腺瘤表现出不同程度的异型增生，并且当异型增生变得严重时，致癌性增加并且通常与绒毛组织学和息肉的大小相关。高度异型增生与原位癌相同。
[0075] i)管状腺瘤在外观上是分支的管状腺体，并且是最常见的息肉之一。管状息肉是有蒂的，即，虽然存在不同程度的异型性，但是具有与肿块相连的蒂并且表现出比绒毛状腺瘤更少的“异型性”(非标准细胞类型)。
[0076] ii)绒毛状腺瘤性息肉有指状突起(绒毛)，同时与管状腺瘤性息肉相比，绒毛状腺瘤性息肉并不常见，但可能有严重的异型性。
[0077] iii)管状绒毛状腺瘤性息肉具有管状息肉和绒毛状息肉的特征。
[0078] Iv)在组织学上，锯齿状腺瘤具有锯齿状外观(乳头状内翻入隐窝)。它们是无蒂的，即没有蒂附着在肿块上。锯齿状腺瘤在右侧结肠中更常见并且是恶性的。锯齿状腺瘤可以是无蒂锯齿状腺瘤(SSA)或传统锯齿状腺瘤(TSA)。两种形式的锯齿状息肉都是恶性的。无蒂锯齿状腺瘤具有“倒T型隐窝”或扩张的“L型”基底部。相反，传统锯齿状腺瘤是有蒂的。
[0079] 一般来说，息肉越大，息肉为癌症和侵袭性的可能性就越大。并非所有的腺瘤性息肉都会发展成CRC，但几乎所有的恶性息肉都是腺瘤性的。腺瘤性息肉病包括家族性腺瘤性息肉病、加德纳综合征和Turcot综合征。
[0080] 2)增生性息肉
[0081] 增生性息肉是最常见的息肉类型，其直径小于5mm。被称为微小息肉，它们是无蒂的。增生性息肉通常不表现出异型增生但表现出增生，因此不是恶性的。
[0082] 3)错构瘤性息肉
[0083] 错构瘤性息肉可以在早期作为息肉综合征的一部分偶尔出现，并且不是恶性的，但是高度血管化，因此可以导致出血。这些息肉可以出现在10岁的儿童身上，因此也被称为幼年息肉。息肉综合征包括青少年息肉综合征、黑斑息肉综合征、Cowden综合征和 Ruvelcaba-Myher-Smith综合征。在这种情况下，息肉覆盖结缔组织，结缔组织包括由肥大上皮覆盖的平滑肌、固有层和炎性浸润物。
[0084] 4)炎性息肉
[0085] 炎性息肉通常发生在患有炎症性肠病患者身上，所述炎症性肠病通常为溃疡性结肠炎。病变是假息肉(不是真正的息肉)并且不是恶性的。
[0086] 所有CRC都是从腺瘤性息肉发展而来，但并非所有腺瘤性息肉都会转变为CRC。因此，我们进行了一项系统研究，以确定没有息肉，具有增生性息肉(非腺瘤性息肉)和腺瘤性息肉的个体的PBMC中NMT1，NMT2和MetAP2表达谱的变化。我们观察到这三种蛋白标记物在腺瘤性息肉中过表达，这表明免疫应答细胞(PBMC)感知结肠和直肠中分子水平的致癌变化。这些观察结果进一步表明尽管在结肠和直肠的早期致癌变化期间NMT1和NMT2都在PBMC中过表达，但只有NMT2在CRC患者的PBMC中仍然升高。这也表明NMT2升高在CRC发展中的出现时间要比预想的早得多。
[0087] 患者样本
[0088] 经过温尼伯大学、曼尼托巴大学、健康科学中心的必要的伦理批准及患者的同意后，从曼尼托巴温尼伯健康科学中心获得了患者样本。总共对4名对照受试者和4名CRC患者，以及3名患有异常NMT2表达的患者进行了检查。所有患者均接受了结肠镜检查。多克隆人抗NMT2抗体购自Sigma Canada。这些抗体是针对IHC进行验证的金标抗体。这些抗体对 NMT2具有特异性。
[0089] PBMC分离
[0090] 从CRC患者或对照受试者的样本中分离出PBMC。将血液样本小心地转移到50mL离心管中，并用RPMI 1640培养基以1：1的比例稀释。补充有1％丙酮酸钠，1％左旋谷氨酰胺的RPMI1640用于稀释血液样本。使用填充有4mL Ficoll的15mL离心管。将血液慢慢倒在Ficoll上，以免扰乱Ficoll表面。将血液和Ficoll在室温下以800g离心30分钟。外周血单核细胞(PBMC)漂浮在Ficoll柱的顶部，而红细胞则在其下方沉降。血浆在PBMC层上方沉降。用移液管除去血浆。将PBMC层轻轻吸移到15mL离心管中，弃去其余部分。通过在RPMI 1640中混合细胞并在320g下离心10分钟来洗涤分离的PBMC两次。然后沉淀细胞并将细胞重悬于3ml RPMI中用于计数。使用台盼蓝排除法计数活细胞。基于细胞计数，相应地稀释样本，以进行细胞离心涂片固定。
[0091] RNA分离
[0093] 定量PCR
[0094] 进行两步PCR。从BM细胞中提取的RNA是反向的。使用SYBR绿色混合物进行tqPCR。用于扩增NMT1，NMT2，MetAP2和GAPDH的引物从BioRad中获得。
[0095] 细胞离心涂片器
[0096] 细胞离心涂片器允许使用离心法将细胞固定在载玻片上。使用细胞离心涂片装置(细胞离心涂片室和夹子)将含有悬浮在200μL RPMI1640中的至少100,000个活细胞的样本安装在载玻片上。当进行离心循环时，悬浮液分散到漏斗底部的滤纸上，并通过离心力将细胞固定在载玻片上。
[0097] 使用增强聚合物一步法(EPOS)进行IHC分析
[0098] 一抗(兔抗人)与目标抗原结合。多个二抗(山羊抗兔)与葡聚糖聚合物主链结合并在一抗周围定位。多种辣根过氧化物酶也与葡聚糖主链偶联。当引入色原体3,3'-二氨基联苯胺 (DAB)时，它在靶蛋白附近被氧化以产生深褐色染色(Dako,2011)。
[0099] IHC分析
[0100] 通过标准IHC技术，使用对NMT1或NMT2特异的多克隆抗体定位目标抗原，即NMT1 和NMT2。使用温尼伯，曼尼托巴的癌症护理中心(CancerCare Manitoba,Winnipeg)的自动Ventanna系统对全血涂片、PBMC、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞进行IHC分析。本研究中使用的一抗是：NMT1和NMT2(多克隆兔抗人，1:50稀释)。使用HRP缀合的二抗，其与色原体3,3'-二氨基联苯胺(DAB)反应以产生褐色染色。DAB染色的强度是蛋白存在的量的量度。
[0101] 量化IHC结果
[0102] 基于其IHC评分量化载玻片。IHC评分(H评分)是染色强度(评分值为0-3，其中3 为最高值)和染色细胞百分比的乘积。例如，一个样本中90％的细胞染色呈阳性和染色强度为3，H评分为3*90＝270。H评分范围为0至300。使用双尾T检验进行统计分析。T检验用于确定被比较的两组数据是否是较大父数据集的一部分。如果两组数据属于相同的正态分布数据，则观察到的差异可能是偶然出现。本文中，T检验用于评估来自对照组和CRC组的H评分之间的差异是否是巧合。
[0103] 我们先前已经表明，结肠直肠癌(CRC)患者的PBMC中存在N-肉豆蔻酰基转移酶的过表达。NMT具有两种同种型，并且我们发现与对照受试者相比，NMT2在CRC患者的PBMC 中特异性过表达。大多数CRC来自恶变前的腺瘤性息肉，腺瘤性息肉是结肠或直肠内壁的赘生物。不是所有息肉都会发展成癌症，但是一些息肉可能会在几年内发展成癌症。
[0104] 经过曼尼托巴大学研究伦理委员会的批准，在得到患者的同意后招募患者。从曼尼托巴省健康科学中心接受结肠镜检查的患者中收集外周全血。将血液收集并在零下80℃下储存在 PAXgene Blood RNA Tube(PreAnalytiX/AQIAGEN/BD公司)中并且在PAXgene Blood RNA Tube中运输血液。使用PAXgene Blood RNA试剂盒(Cat No：762162)分离和纯化用于RT-PCR的全血细胞内的RNA。
[0105] RNA分离：根据制造商的说明书，从血液样本中分离出RNA。简而言之，将PAXgene 采血管平衡至室温并将PAXgene全血RNA管在3000-5000g下离心10分钟。除去上清液并涡旋直至沉淀溶解。加入缓冲液1，涡旋溶解产物并将溶解产物收集到微型离心管中。将溶解产物转移至PAXgene粉碎机旋转柱并转移上清液，然后将其与350ul的96％乙醇混合。将样本转移到PAXgene RNA旋转柱中并加入缓冲液3并离心。将DNase添加到PAXgene RNA旋转柱中并孵育。在该步骤之后，将缓冲液BR3和BR4加入到旋转柱中，离心后，将洗脱缓冲液加入到该柱中，收集洗脱液并进行cDNA合成和RT-PCR。如下制备RNA样本用于RT-PCR。根据制造商的说明书，使用总量为20μl的iScript逆转录超混合液对总RNA 进行逆转录，以用于qPCR(Bio-Rad)。使用CRX ConnectTM实时系统Cycler和CFX Manager 3.1软件(Bio-Rad)测量NMT1，NMT2和METAP2的表达。使用1xSsoAdvanced TM Universal SYBE绿色超混合液试剂盒(Bio-Rad)将所有样本一式三份进行扩增。相对于管家基因GAPDH和β-肌动蛋白，定量NMT1，NMT2和METAP2基因的表达，管家基因GAPDH和β-肌动蛋白的表达在实验条件下保持不变。
[0106] 如图2所示，结果显示与对照受试者相比，息肉患者的NMT1，NMT2和METAP2基因表达出现倍数变化。有趣的是，与对照受试者相比，NMT1，NMT2和METAP2在息肉中过表达。以前我们的实验室已经证明NMT2在CRC患者中过表达。然而，该结果表明，在polyp 样本中，与NMT1或NMT2相比，METAP2显著过表达。我们将用大量样本进一步研究这一点以监测NMT1，NMT2和METAP2基因表达。
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