检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的方法
阅读：0发布：2022-02-28
专利汇可以提供检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及检测小RNA或与小RNA相关的 蛋白质 的方法，更具体地涉及利用具有X-Y-Z的结构且由可与待检测的小RNA(small RNA)的全部或一部分 碱 基序列互补结合的碱基序列组成的单核酸来检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的方法。根据本发明，可快速且准确地检测小RNA(small RNA)或与上述小RNA(small RNA)相关的蛋白质，因而可有用地利用于多种 疾病 的诊断及 预后 诊断。，下面是检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的方法专利的具体信息内容。
1.一种检测小RNA的方法，其特征在于，包括：步骤a)，从生物学试样中获得包含待检测的小RNA的RNA；步骤b)，利用包含可与待检测的小RNA的一部分碱基序列互补结合的碱基序列的X-Y-Z结构的单核酸，由所述步骤a)中获得的RNA合成cDNA；步骤c)，扩增所述步骤b)的cDNA；步骤d)，测定通过可切断所述步骤b)的单核酸的Y部位的酶来切断的单核酸片段的量；或者
包括：步骤a-1)，从生物学试样中获得包含待检测的小RNA的RNA；步骤b-1)，由所述步骤a-1)中获得的RNA合成cDNA；步骤c-1)，通过向所述步骤b-1)的cDNA中混合包含可与所述cDNA的一部分碱基序列互补结合的碱基序列且可用作(i)正向引物及探针、(ii)反向引物及探针或者(iii)正向引物和反向引物及探针的单核酸来扩增所述cDNA；以及步骤d-1)，测定通过可切断所述步骤c-1)的单核酸的Y部位的酶来切断的单核酸片段的量；
所述单核酸具有X-Y-Z的结构，单核酸的两个末端或内部附着有一个或其以上的可检测的标记物，并与以实时检测为目的的靶核酸或靶蛋白的特定部位相结合而形成复合体，当Y部位通过特定酶而被切断时，X部位与靶核酸或靶蛋白保持复合体并起到引物作用，Y及Z从所述靶核酸或靶蛋白的特定部位分离，
所述X、Y及Z为由碱基序列组成的DNA或RNA，
当所述X、Y及Z中的任一个为DNA时，另外两个当中的一个以上为RNA。
2.根据权利要求1所述的检测小RNA的方法，其特征在于，
所述X为由1个至60个碱基序列组成的DNA或RNA；
所述Y为由1个至10个碱基序列组成的DNA或RNA；以及
所述Z为由0个至10个碱基序列组成的DNA或RNA，
当所述Z为0时，Y为由3个至10个碱基序列组成的DNA或RNA，
当所述Z为1时，Y为由2个至10个碱基序列组成的DNA或RNA。
3.根据权利要求1所述的检测小RNA的方法，其特征在于，所述可检测的标记物为通过共价键或非共价键与单核酸相结合的荧光物质或由荧光物质和猝灭物质组成的荧光对。
4.根据权利要求1所述的检测小RNA的方法，其特征在于，所述单核酸的X、Y及Z以完全甲基化或部分甲基化的方式合成，以防止非特异性切断。
5.根据权利要求1所述的检测小RNA的方法，其特征在于，所述单核酸的X为由10个至30个碱基序列组成的DNA或RNA，所述Y为由1个至10个碱基序列组成的DNA或RNA，所述Z为由2个至10个碱基序列组成的DNA或RNA。
6.根据权利要求1所述的检测小RNA的方法，其特征在于，当Y部位为DNA时，所述酶使用脱氧核糖核酸酶，具体使用脱氧核糖核酸酶Ⅰ、脱氧核糖核酸酶Ⅱ、S1核酸酶、核酸酶P1、AP核酸内切酶或UvrABSC核酸酶，当X部位为RNA时，所述酶使用核糖核酸酶，具体使用核糖核酸酶Ⅱ、核糖核酸酶Ⅲ、核糖核酸酶Ⅳ、核糖核酸酶H或核糖核酸酶T2。
7.根据权利要求1所述的检测小RNA的方法，其特征在于，在所述步骤c)或步骤c-1)中，对于与所述步骤b)或步骤b-1)中合成的cDNA相结合的单核酸而言，通过用于切断单核酸的Y部位的酶来切断单核酸的Y部位，使Y及Z部位分离且X部位起到引物作用而进行扩增。
8.根据权利要求1所述的检测小RNA的方法，其特征在于，在所述步骤c-1)中，(i)当单核酸用作正向引物及探针时，还包含由可与cDNA的一部分碱基序列互补结合的碱基序列组成的反向引物，(ii)当单核酸用作反向引物及探针时，还包含由可与cDNA的一部分碱基序列互补结合的碱基序列组成的正向引物。
9.一种检测与小RNA相关的蛋白质分子的方法，其特征在于，包括：步骤a)，制备附着有包含与具有X-Y-Z的结构的单核酸互补的碱基序列的核酸的抗体；步骤b)，使从生物学试样中获得的与小RNA相关的蛋白质和所述步骤a)中制备的抗体相结合来形成蛋白质-抗体复合体；步骤c)，使所述复合体与具有X-Y-Z的结构的单核酸进行杂交来形成蛋白质-抗体-探针复合体；以及步骤d)，用切断试剂处理所述蛋白质-抗体-单核酸复合体，从抗体中分离单核酸的片段之后，测定所分离的单核酸片段的量来检测与小RNA相关的蛋白质；
所述单核酸具有X-Y-Z的结构，单核酸的两个末端或内部附着有一个或其以上的可检测的标记物，并与以实时检测为目的的靶核酸或靶蛋白的特定部位相结合而形成复合体，当Y部位通过特定酶而被切断时，X部位与靶核酸或靶蛋白保持复合体并起到引物作用，Y及Z从所述靶核酸或靶蛋白的特定部位分离，
所述X、Y及Z为由碱基序列组成的DNA或RNA，
当所述X、Y及Z中的任一个为DNA时，另外两个当中的一个以上为RNA。
10.根据权利要求9所述的检测与小RNA相关的蛋白质分子的方法，其特征在于，在所述步骤d)中，对于与所述步骤a)中制备的抗体相结合的单核酸而言，通过用于切断Y部位的酶来切断单核酸的Y部位，使Y及Z部位分离且X部位起到引物作用而进行扩增。
检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的方法，更具体地涉及利用具有X-Y-Z的结构且由可与待检测的小RNA(small RNA)的全部或一部分碱基序列互补结合的碱基序列组成的单核酸来检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的方法。
背景技术
[0002] 微RNA(micro RNA，miRNA)为存在于细胞中的小RNA(small RNA)之一，据悉，在细胞的产生和分化及细胞程序性死亡等生物学过程中发挥着非常重要的作用，细胞中特定微RNA的表达程度差异与包括癌症的多种疾病有关。因此，最近特定微RNA的检测已成为科学研究领域中的重要部分。具体而言，对特定微RNA或与此相关的蛋白质进行检测及鉴定，可用作遗传、生物标记物，可利用为表示人的健康状态的指标。通过上述检测及鉴定，可开发简单地利用外周血、激素、脊髓液的试剂盒和可在体外(in vitro)使用的诊断试剂盒。这种试剂盒可适用于痴呆症(阿尔茨海默氏症、帕金森病等)、糖尿病、癌症等的检查。然而，微RNA为约22个核苷酸(nucleotide)，由于非常短，因而难以检验及检测，在用作有效生物标记物的方面受限。
[0003] 通常，微RNA的检验基于核酸扩增方法，作为这种方法的示例，有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)、核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence based amplification；NASBA)等。利用这种核酸扩增反应的现有的检测方法对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言是公知的。这种检测方法通常需要核酸扩增之后可检测所扩增的核酸的如电泳或探针或印迹技术的利用等的劳动密集型处理过程。
[0004] 最广为人知的用于检验微RNA的实时检测通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRCR)等来实现。这些方法基于当不与靶物质杂交时形成荧光消失的二级结构的荧光杂交探针(florescent hybridization probe)，杂交之后通过Taq聚合酶(Taq polymerase)被切断而增加荧光的水解探针(hydrolysis probe)、dsDNA结合剂(dsDNA-binding agents)等。在各个测定时间点，每个扩增产物与探针(probe)杂交而展开，或被切断，因而增加荧光光度。在这种情况下，以相对于一个探针为一个增强子的比率检验出增强子。在所定的循环中，一个增强子表示通过探针的杂交或切断来检测的一个探针(例如，分子信标(molecular beacon)、Taqman探针(Taqman probe)、MGB探针(MGB probe)等)。并且，还已知实时检测方法中利用分子信标(molecular beacon)扩增的同时检测核酸序列依赖性扩增(NASBA)产物的方法。
[0005] 作为这种检测微RNA的具体例，如图1所示，广泛使用利用TaqMan探针(TaqMan probe)和茎环引物(Stem-loop primer)的方法和通过利用聚A加尾(poly-A Tailing)来利用寡聚dT接头引物(oligo-dT Adapter primer)的方法。
[0006] 但是，如上所述的技术具有几个缺点。
[0007] 第一、用于分析微RNA的探针(probe)和引物(primer)不位于靶微RNA，因而上述技术需要寡核苷酸的进一步延伸。图1示出的茎环引物(Stem-loop primer)、寡聚dT接头引物(oligo-dT Adapter primer)等为延伸的寡核苷酸。在这里，关键的问题在于，测定因延伸的寡核苷酸的扩增而导致的荧光的增加，而不是测定完全取决于扩增的微RNA靶标的荧光的增加，这因非特异性扩增及结合而导致不准确的结果。
[0008] 第二、引物(primer)和探针(probe)之间需要规定的隔开距离。例如，就taq-man探针(taq-man probe)和MGB探针(MGB probe)而言，5'末端标记有供体生色团，当DNA聚合酶(DNA polymerase)在使引物(primer)延伸的过程中与探针相遇时，聚合酶(polymerase)的核酸外切酶(exonuclease)活性从5'末端开始依次降解探针(probe)。在这里，引物(primer)和探针(probe)的间隔在最少7～10个核苷酸(nucleotide)的情况下可进行切断(cleavage)。并且，引物(primer)和3'末端的猝灭剂之间的间隔需要最少2～4个核苷酸(nucleotide)。这种限制性事项在短RNA或DNA的分析中起到限制性要素作用。
[0009] 第三、利用核酸序列依赖性扩增(NASBA)的方法需要精确地调节信标(beacon)的熔解温度，因为探针(probe)需形成消耗供体的荧光光度的二级结构。如核酸序列依赖性扩增(NASBA)或滚环扩增(RCA)等，在恒定温度下反应的情况下，这种调节难以适用。并且，需要研究当所述信标(beacon)不与靶标相结合时，保持发夹结构，在与靶标相结合的反应温度下展开。这使探针的研究变得非常困难，并且，在反应温度下信标(beacon)展开时，探针经常释放背景荧光，因此导致与对噪声的信号相关的问题。
[0010] 第四、如微RNA等的小RNA的亚型(isoform)的区分非常难。就微RNA而言，因长度短而仅存在1～3个不同的多个亚型。作为一例，已知如let-7、miR-18、miR-30等的微RNA难以区分相似的多个亚型(isoform)。
[0011] 对此，本发明人研究开发克服如上所述的缺点的同时快速且准确地检测如微RNA、小干扰RNA(siRNA)等的小RNA(small RNA)的方法的过程中，用以韩国专利申请第10-2016-0017359号作为优先权基础的韩国专利申请第10-2017-0020238号中描述的单核酸即能够准确且快速地实时检测核酸或蛋白质的单核酸与小RNA(small RNA)或小RNA(small RNA)的cDNA进行杂交之后，用切断试剂切断核酸内部并测定分离的荧光片段的量，从而确认可从极少量的试样中快速且准确地检测小RNA(small RNA)，并完成了本发明。
发明内容
[0012] 要解决的技术问题
[0013] 本发明的一目的在于，提供检测小RNA的方法。
[0014] 本发明的另一目的在于，提供与实时扩增反应关联而检测与小RNA相关的蛋白质的方法。
[0015] 技术方案
[0016] 作为一方案，本发明提供为了实时检测小RNA(small RNA)或与小RNA(small RNA)相关的蛋白质而用作引物及探针的单核酸。
[0017] 上述单核酸源自以韩国专利申请第10-2016-0017359号作为优先权基础的韩国专利申请第10-2017-0020238号中所描述的单核酸，在本发明中，上述韩国专利申请作为本说明书的一部分包括在其中。
[0018] 具体地，其特征在于，本发明的单核酸具有X-Y-Z的结构，单核酸的两个末端或内部附着有一个或其以上的可检测的标记物。此时附着的可检测的标记物的位置不局限于特定部位，通过特定酶而切断Y部位时，只要是可检测的标记物分离的位置，何处都无妨。
[0019] 并且，其特征在于，上述单核酸与以实时检测为目的的靶小RNA或与靶小RNA相关的靶蛋白的特定部位相结合而形成复合体，通过特定酶而切断Y部位时，Y及Z从靶小RNA或与靶小RNA相关的靶蛋白的特定部位中分离，但X部位不分离，而维持复合体，并使用为用于扩增的引物。
[0020] 上述单核酸在本发明中被命名为“promer”，以下，只要没有额外提及，单核酸作为promer，意味着可同时用作引物(primer)和探针(probe)的单核酸。
[0021] 本发明的单核酸具有X-Y-Z的结构，各个X、Y及Z可具有多种数量的核苷酸(nucleotide)。
[0022] 作为一例，上述X为1至60个，优选为1至30个，还优选为2至30个，更优选为3至30个，更优选为4至30个，更优选为5至30个，更优选为6至30个，更优选为7至30个，更优选为8至30个，更优选为10至30个碱基序列组成的DNA或RNA。X包含超过60个的碱基序列时，实时检测核酸或蛋白质时还可发生非特异性反应。
[0023] 作为一例，上述Y为1至10个，优选为1至9个，还优选为1至8个，更优选为1至7个，更优选为1至6个，更优选为1至5个，更优选为1至4个，更优选为1至3个，更优选为1至2个碱基序列组成的DNA或RNA。并且，就上述Y而言，当Z由0个碱基组成时，由最小3个以上碱基序列组成，优选为3至10个，更优选为3至9个，更优选为3至8个，更优选为3至7个，更优选为3至6个，更优选为3至5个，更优选为3至4个碱基序列组成。并且，就上述Y而言，当Z由1个碱基组成时，由最小2个以上碱基序列组成，优选为2至10个，更优选为2至9个，更优选为2至8个，更优选为2至7个，更优选为2至6个，更优选为2至5个，更优选为2至4个，更优选为2至3个碱基序列组成。组成Y的碱基序列超过上述范围的情况下，实时检测核酸或蛋白质时，发生非特异性反应，还会导致敏感度减少。
[0024] 作为一例，上述Z为0至10个，优选为1至10个，更优选为2至10个碱基序列组成的DNA或RNA。组成Z的碱基序列超过上述范围的情况下，Y被切断(cleavage)之后，与靶核酸或蛋白质相结合的Z不脱离靶核酸或靶蛋白，而保持原样地相结合，由此存在不能检测核酸或蛋白质的问题。
[0025] 此时，上述X、Y及Z中的任一个为DNA时，另外两个当中的一个以上为RNA。优选地，上述X、Y及Z依次为DNA、RNA及DNA或RNA、DNA及RNA。
[0026] 作为一个具体例，当X为DNA时，Y或Z中的任一个为RNA，例如，Y为RNA，Z为DNA，或者Y为DNA，Z为RNA。其中，上述DNA和RNA可以是0个以上，并具有在上述X、Y及Z中定义的数量的DNA和RNA。
[0027] 作为另一具体例，当X为RNA时，Y或Z中的任一个为RNA，例如，Y为RNA，Z为DNA，或者Y为DNA，Z为RNA。其中，上述DNA和RNA可以是0个以上，并具有在上述X、Y及Z中定义的数量的DNA和RNA。
[0028] 作为另一具体例，当Z为0时，X或Y中的任一个为DNA，另外一个为RNA。其中，上述DNA和RNA为1个以上，并具有在上述X及Y中定义的数量的DNA和RNA。
[0029] 并且，上述X、Y及Z可以以完全甲基化或部分甲基化的方式合成，以防止非特异性切断。
[0030] 在本发明中，上述核酸意味着待从试样中实时检测的DNA或RNA。
[0031] 在本发明中，上述可检测的标记物可使用通过共价键或非共价键与单核酸相结合的荧光物质或由荧光物质和猝灭物质组成的荧光对。
[0032] 上述荧光物质并不是必须局限于此，但例如可以是选自由Cy3、Cy5、Cy5.5、Bodipy、亚历克萨488(Alexa 488)、亚历克萨532(Alexa 532)、亚历克萨546(Alexa 546)、亚历克萨568(Alexa 568)、亚历克萨594(Alexa 594)、亚历克萨660(Alexa 660)、罗丹明(Rhodamine)、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、ROX、德克萨斯红(Texas Red)、ORNAge green 488X、ORNAge green 514X、HEX、TET、JOE、Oyster 556、Oyster 645、Bodipy 630/650、Bodipy 650/665、Calfluor ORNAge 546、Calfluor red 610、Quasar 670及生物素组成的组中的任一个。并且，上述猝灭物质并不是必须局限于此，但例如可以是选自由DDQ-1、Dabcyl、Eclipase、6-TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、lowa Black RQ-Sp、QSY-7、QSY-2及MGBNFQ组成的组中的任一个。
[0033] 本发明中可检测的标记物使用荧光对时，荧光物质和猝灭物质的位置可以是位于X或Z的形态或者可位于Y部位，而并不局限于以上任何一个。作为一例，荧光物质可位于X，猝灭物质可位于Y或Z。
[0034] 在小RNA(small RNA)或与小RNA(small RNA)相关的蛋白质的检测中，本发明的单核酸可用作i)用于从小RNA合成cDNA的RT引物；ii)用于扩增从小RNA合成的cDNA的正向引物；iii)用于扩增从小RNA合成的cDNA的反向引物；iv)用于扩增从小RNA合成的cDNA的正向引物及反向引物；或v)实时确认待检测的小RNA或与此相关的蛋白质的探针。
[0035] 在这些一系列的具体方案中，对于本发明的单核酸而言，通过用于切断单核酸的Y部位的酶使单核酸的Y部位被切断之后，Y及Z部位分离且X部位与靶小RNA或与此相关的靶蛋白保持复合体并用作引物，因此可合成及扩增小RNA，由于通过用于切断单核酸的Y部位的酶来仅切断单核酸的Y部分，因此与现有的通过DNA聚合酶降解的探针相比，可更准确地检测待检测的小RNA或与小RNA相关的蛋白质。
[0036] 尤其，在本发明的单核酸中，Y或Z的3'末端与荧光物质或猝灭物质相结合时，若不切断单核酸的Y部位，则可阻断靶核酸或靶蛋白的特定核酸通过聚合酶而扩增，因此可减少因非特异性扩增而导致的错误。
[0037] 因此，当将本发明的单核酸使用于检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质时，与现有技术相比，无需追加的额外过程(例如，制备RT引物的环形态，形成聚A等过程)，并可节减分析时间和费用，与现有方法相比，可更准确且特异性地检测待检测的小RNA或与小RNA相关的蛋白质，因此本发明的单核酸可有用地利用为用于实时检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的试剂盒。
[0038] 当将本发明的单核酸使用为用于检测小RNA或与小RNA相关的蛋白质的试剂盒时，优选地，上述试剂盒除了包含本发明的单核酸以外，还包含可切断单核酸的Y部位的酶。
[0039] 在本发明中，可切断上述单核酸的Y部位的酶，只要是可特异性地切断单核酸的Y部位的酶就使用何种也无妨。例如，当Y部位为DNA时，优选使用脱氧核糖核酸酶(DNA nuclease、DNase)，具体使用脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)、脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)、S1核酸酶、核酸酶P1、AP核酸内切酶或UvrABSC核酸酶等，当Y部位为RNA时，优选使用核糖核酸酶(ribonuclease、RNase)，具体使用核糖核酸酶Ⅱ(RNaseⅡ)、核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)、核糖核酸酶Ⅳ(RNaseⅣ)、核糖核酸酶H(RNaseH)或核糖核酸酶T2(RNase T2)等。
[0040] 当将本发明的单核酸使用为用于检测核酸或蛋白质的试剂盒时，上述试剂盒除了包含本发明的单核酸及可切断单核酸的Y部位的酶以外，还可包含DNA的扩增反应所需的试剂。
[0041] 上述扩增反应所需的试剂，例如，可举出适量的DNA聚合酶(例如，从水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermis flavus)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)中获得的热稳定性DNA聚合酶)、DNA2+
聚合酶辅因子(Mg )、缓冲溶液、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)及水(dH2O)。并且，上述缓冲溶液不局限于此，但是可举出适量的曲拉通X-100(Triton X-100)、二甲基亚砜(dimethylsufoxide，DMSO)、吐温20(Tween20)、诺纳德P40(nonidet P40)、聚乙二醇6000(PEG 6000)、甲酰胺及牛血清白蛋白(BSA)等。
聚合酶辅因子(Mg )、缓冲溶液、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)及水(dH2O)。并且，上述缓冲溶液不局限于此，但是可举出适量的曲拉通X-100(Triton X-100)、二甲基亚砜(dimethylsufoxide，DMSO)、吐温20(Tween20)、诺纳德P40(nonidet P40)、聚乙二醇6000(PEG 6000)、甲酰胺及牛血清白蛋白(BSA)等。
[0042] 作为另一方案，本发明提供检测小RNA(small RNA)的方法。
[0043] 根据各个步骤如下具体说明本发明的检测小RNA的方法。
[0044] 步骤a)，从生物学试样中获得模板核酸。
[0045] 在本发明中，上述模板核酸是指包含待从生物学试样中检测的小RNA(small RNA)的RNA。上述小RNA(small RNA)是在需要维持或调节生物体的生命现象的情况下为了制备用于此的蛋白质或调节蛋白质的生成而表达。
[0046] 上述生物学试样可利用从个体中获得的各种类型的试样，具体地，可利用固体组织试样、液体组织试样、生物液体、支气管抽出物、细胞及细胞片段。作为生物学试样的具体例，有手术过程中从个体摘除的固体组织试样、病理标本、保存的试样或活检标本、组织培养液或源于它们的细胞及由它们的后代制备的切片等，但不限定于此。
[0048] 在本发明中，从试样中提取RNA，可利用本领域公知的多种方法，作为一例，可利用Trizol或曲拉通X-100(Triton X-100)等而实现。
[0049] 步骤b)，从小RNA合成cDNA。
[0050] 具体地，本发明的步骤b)是在上述步骤a)中提取的小RNA中混合额外的RT引物而合成cDNA的步骤。
[0051] 在本发明中，上述RT引物是可与待检测的RNA的一部分碱基序列进行互补结合的核酸。此时，RT引物可以是本领域通常公知的RT引物或本发明的单核酸。
[0052] 在本发明中，其特征在于，作为RT引物使用本发明的单核酸时，上述单核酸由可与待检测的小RNA的一部分碱基序列进行互补结合的碱基序列组成。
[0053] 在本发明中，上述cDNA的合成可通过本领域公知的多种方法来实现，作为一例，将从试样中获得的小RNA作为模板，可由反转录酶和DNA聚合酶来实现。并且，如上所提及的RT引物可以为聚A加尾(polyA tail)之后用追加的核酸延伸的寡聚dT引物(oligo dT primer)或环(roof)状的RT引物。
[0054] 步骤c)，扩增cDNA。
[0055] 具体地，本发明的步骤c)是在上述步骤b)中合成的cDNA中混合本发明的单核酸或包含其的试剂盒和/或具有与上述cDNA互补的碱基序列的正向引物或反向引物，通过延伸反应，扩增cDNA的步骤。
[0056] 包含上述单核酸的试剂盒由本发明的单核酸和可切断上述单核酸的Y部位的酶组成。
[0057] 可切断上述单核酸的Y部位的酶，只要是可特异性地切断单核酸的Y部位就使用何种也无妨。例如，当Y部位为DNA时，优选使用脱氧核糖核酸酶(DNA nuclease，DNase)，具体使用DNaseⅠ、DNaseⅡ、S1核酸酶、核酸酶P1、AP核酸内切酶或UvrABSC核酸酶等，当Y部位为RNA时，优选使用核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)，具体使用RNaseⅡ、RNaseⅢ、RNaseⅣ、RNaseH或RNase T2等。
[0058] 在本发明中，其特征在于，上述单核酸由可与上述步骤b)中合成的cDNA的一部分碱基序列进行互补结合的碱基序列组成，使用为用于扩增cDNA的ⅰ)正向引物及探针，ⅱ)反向引物及探针，或ⅲ)正向引物、反向引物及探针。并且，本发明的上述单核酸具有X-Y-Z的结构，单核酸的两个末端或内部附着有一个或其以上的可检测的标记物，通过特定酶切断Y部位时，Y及Z分离，X不分离并起到引物作用。这种单核酸的结构如上所述。
[0059] 上述可检测的标记物可使用通过共价键或非共价键与单核酸相结合的荧光物质或由荧光物质和猝灭物质组成的荧光对。
[0060] 上述荧光物质并不是必须局限于此，但例如可以是选自由Cy3、Cy5、Cy5.5、Bodipy、亚历克萨488(Alexa 488)、亚历克萨532(Alexa 532)、亚历克萨546(Alexa 546)、亚历克萨568(Alexa 568)、亚历克萨594(Alexa 594)、亚历克萨660(Alexa 660)、罗丹明(Rhodamine)、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、ROX、德克萨斯红(Texas Red)、ORNAge green 488X、ORNAge green 514X、HEX、TET、JOE、Oyster 556、Oyster 645、Bodipy 630/650、Bodipy 650/665、Calfluor ORNAge 546、Calfluor red 610、Quasar 670及生物素组成的组中的任一个。并且，上述猝灭物质并不是必须局限于此，但例如可以是选自由DDQ-1、Dabcyl、Eclipase、6-TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、lowa Black RQ-Sp、QSY-7、QSY-2及MGBNFQ组成的组中的任一个。
[0061] 作为一个具体例，其特征在于，当将本发明的单核酸使用为正向引物及探针或反向引物及探针时，上述单核酸由可与上述步骤b)中合成的cDNA的一部分碱基序列进行互补结合的碱基序列组成。
[0062] 作为另一具体例，当将本发明的单核酸使用为正向引物及探针或反向引物及探针时，除了上述单核酸以外，可使用额外的反向引物或正向引物。此时，上述额外的反向引物或正向引物是可与上述步骤b)中合成的cDNA进行互补结合，由5至30个碱基序列组成的DNA，优选为由10至30个碱基序列组成的DNA。其中，上述反向引物可与上述步骤b)的RT引物相同。
[0063] 作为另一具体例，当将本发明的单核酸使用为正向引物、反向引物及探针时，使用为上述反向引物的单核酸可与上述步骤b)的单核酸相同，附着在单核酸的两个末端或内部的可检测的标记物可与上述步骤b)的单核酸相同或者不同。
[0064] 在本发明中，优选地，cDNA的扩增，通过使用为A)正向引物及探针或反向引物及探针的本发明的单核酸和本领域通常使用的正向引物或反向引物而退火，或者通过使用为B)正向引物、反向引物及探针的本发明的单核酸而退火，并且在实质上不抑制所使用的酶的活性的等温温度下执行。其中，上述等温意味着没有热循环(thermal cycling)，而并不意味着必须是物理上相同的温度。
[0065] 作为一个具体例，本发明中执行扩增反应的等温温度可以为40至80℃，优选为55至75℃，更优选为60至75℃。
[0066] 在本发明中，上述cDNA的扩增反应可通过选自由聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)、滚环扩增(rolling circle amplification)、链置换扩增(stRNAd displacement amplification)及基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence based amplification)组成的组中的一种方法来实现，但并不是必须局限于此。
[0067] 在本发明中，上述cDNA的扩增反应，除了包含本发明的单核酸的试剂盒以外，可包含扩增所需的试剂，例如适量的DNA聚合酶(例如，从水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermis flavus)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)中获得的热稳定性DNA聚合酶)、DNA聚合酶辅因子(Mg2+)、缓冲溶液、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)及水(dH2O)。上述缓冲溶液并不局限于此，但还可使用适量的曲拉通X-100(Triton X-100)、二甲基亚砜(dimethylsufoxide，DMSO)、吐温20(Tween20)、诺纳德P40(nonidet P40)、聚乙二醇6000(PEG 6000)、甲酰胺及牛血清白蛋白(BSA)等来实现。
[0068] 步骤d)，测定通过可切断单核酸的Y部位的酶来切断的单核酸片段的量。
[0069] 在本发明中，测定单核酸片段的量可使用多种检测方法来执行。具体地，根据本发明分离的单核酸的片段优选在实时或者反应结束后测定，可通过荧光光度的变化或化学发光的测定来实现。
[0070] 上述荧光光度的变化或化学发光的测定可利用本领域公知的可检测荧光标记物的所有测定装置，例如，可利用实时聚合酶链式反应机器(real-time PCR machine)、TRIAD多模检测器(TRIAD Multimode Detector)、Wallac/Victor荧光(Wallac/Victor fluorescence)或珀金埃尔默LB50B荧光分光光度计(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer)、LightCycler 96、Applied Biosystems 7500或Biorad CFX96实时PCR热循环仪(Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler)等来实现，但不局限于此。
[0071] 根据本发明切断的单核酸片段的量的测定和检测方法，可根据单核酸或流入到反应液内的标记物或可检测的标记物的种类而不同。
[0072] 例如，在X末端附着荧光供体，而在Z末端附着猝灭剂的单核酸(promer)与靶小RNA或cDNA进行杂交，通过可切断Y部位的酶，使Y及Z部位分离之前，维持附着于X末端的荧光供体的荧光被附着于Z末端的猝灭剂大大减少的状态。但是，通过可切断Y部位的酶，X部位不分离，只有Y及Z部位从靶小RNA或cDNA中分离而分散到反应溶液中时，附着于X末端的荧光供体的荧光不受附着于Z末端的猝灭剂的影响而增加。此时，利用上述设备，通过附着于X末端的荧光供体的荧光释放的增加，可实时检测靶小RNA或cDNA。
[0073] 作为一个具体例，使用与小RNA(small RNA)呈现互补结合的RT引物来合成cDNA之后，根据本发明，将与cDNA呈现互补的结合且附着有FAM的单核酸使用为正向引物或反向引物来扩增cDNA的结果，确认到与使用现有的未附着可检测的标记物的正向引物来扩增的cDNA不同，在cDNA扩增的过程中显示扩增曲线。
[0074] 不同于利用Taqman探针、MGB探针或如Sybr Green等的嵌入型(Intercalator type)的双链DNA结合剂(dsDNA-binding agents)等的现有方法，根据本发明的小RNA(small RNA)的检测方法将具有X-Y-Z的结构的核酸同时用作探针和引物，因此可准确地扩增待检测的小RNA(small RNA)。并且，与扩增模板核酸的同时测定通过DNA聚合酶降解的探针的量的现有技术相比，具有可准确地从极少量的试样中检测小RNA的优点。
[0075] 作为一具体实施形态，利用根据本发明的小RNA(small RNA)的检测方法来分析源自人体的微RNA的结果显示，在微RNA的浓度稀释成1/10000倍的情况下也可准确地分析(参照实施例1及实施例2)。
[0076] 作为另一具体实施形态，利用根据本发明的小RNA(small RNA)的检测方法来实时分析let-7微RNA的结果显示，当存在极少量的let-7微RNA时，可在如1aM浓度下也可稳定且快速准确地分析let-7微RNA(参照实施例3及实施例4)。
[0077] 作为另一方案，本发明提供利用上述核酸来检测与小RNA(small RNA)相关的蛋白质分子的方法。
[0078] 具体地，本发明提供检测与小RNA相关的蛋白质分子的方法，其包括：步骤a)，制备附着有包含与具有X-Y-Z的结构的单核酸互补的碱基序列的核酸的抗体；步骤b)，使从生物学试样中获得的与小RNA相关的蛋白质和上述步骤a)中制备的抗体相结合来形成蛋白质-抗体复合体；步骤c)，使上述复合体与具有X-Y-Z的结构的单核酸进行杂交来形成蛋白质-抗体-单核酸复合体；以及步骤d)，用切断试剂处理上述蛋白质-抗体-单核酸复合体，从抗体中分离单核酸的片段之后，测定所分离的单核酸片段的量来检测与小RNA相关的蛋白质。
[0079] 根据各个步骤如下具体说明本发明的检测与小RNA相关的蛋白质分子的方法。
[0080] 步骤a)，制备附着有包含与具有X-Y-Z的结构的单核酸互补的碱基序列的核酸的抗体。
[0081] 在本发明中，具有上述X-Y-Z的结构的单核酸的结构、特征等如同上述，故而在下文中省略。
[0082] 在本发明中，包含与具有上述X-Y-Z的结构的单核酸互补的序列的核酸，以具有X-Y-Z的结构的核酸的碱基序列作为模板，通过本发明所属技术领域中通常使用的扩增反应来合成。
[0083] 在本发明中，附着有包含与具有上述X-Y-Z的结构的单核酸互补的序列的核酸的抗体具备如下结构，即包含与具有X-Y-Z的结构的单核酸互补的序列的核酸由连接子(linker)连接在抗体的Fc区域而形成的结构。上述连接子通常为由1至10个碱基序列组成的DNA。
[0084] 使包含与具有上述X-Y-Z的结构的单核酸互补的序列的核酸与抗体相连接的方法通常可利用两种方法。第一种方法，使用选自由4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl)Cyclohexane-1-Carboxylate；SMMCC)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(Sulfo Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl)Cyclohexane-1-Carboxylate；Sulfo-SMCC)、n-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯(n-Succinimidyl-3-(2-Pyridylthio)Propionate；
SPDP)、N-琥珀酰亚胺-6-(3'-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)己酸酯(N-Succinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionamido)hexanoate；NHS-Ic-SPDP)或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(SulfoSuccinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionaamido)hexanoate；Sulfo-NHS-Ic-SPDP)等组成的组中的一个试剂，将5'-末端变形为硫醇基(thiol)的DNA连接在抗体的游离氨基基团。上述试剂的隔开距离的间隔基(spacer)的长度与对水的溶解度程度不同。如果需要，则为了追加的操作，可用释放DNA的硫醇化(thiolation)试剂切断连接部位。
SPDP)、N-琥珀酰亚胺-6-(3'-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)己酸酯(N-Succinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionamido)hexanoate；NHS-Ic-SPDP)或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(SulfoSuccinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionaamido)hexanoate；Sulfo-NHS-Ic-SPDP)等组成的组中的一个试剂，将5'-末端变形为硫醇基(thiol)的DNA连接在抗体的游离氨基基团。上述试剂的隔开距离的间隔基(spacer)的长度与对水的溶解度程度不同。如果需要，则为了追加的操作，可用释放DNA的硫醇化(thiolation)试剂切断连接部位。
[0085] 第二种方法，通过作为四聚体(tetrameric)蛋白的链霉亲和素(streptavidin)，提供抗体-DNA之间的连接部位，上述蛋白质与生物素(biotin)充分形成不可逆的结合。抗体的游离氨基基团与生物素-n-羟基琥珀酰亚胺(biotin-n-hydroxysuccinimide)进行反应，由生物素标记。DNA的生物素化可在5'-生物素亚磷酰胺(5'-biotin phosphoramidite)的使用或5'-末端的氨基标记之后，与生物素-n-羟基琥珀酰亚胺进行反应而实现。DNA、链霉亲和素及抗体的结合(conjugate)可将1摩尔当量的抗体添加到DNA-链霉亲和素结合体而制备。
[0086] 根据上述方法，与核酸相结合的抗体在4℃下反应1小时之后，用Superdex 200凝胶柱进行纯化，从而可获得抗体-核酸结合体。
[0087] 根据本发明制备的抗体仅特异性地识别待检测的特定蛋白质的同时可与本发明的单核酸进行杂交，因此可容易使用于检测与小RNA相关的蛋白质分子。
[0088] 步骤b)，使与小RNA(small RNA)相关的蛋白质与上述步骤a)中制备的抗体相结合来形成蛋白质-抗体复合体。
[0089] 在本发明中，与上述小RNA(small RNA)相关的蛋白质可选自由抗体、配体、天然化合物、提取物、合成肽及新候选药物等组成的组中，但不限定于此。
[0090] 在本发明中，与小RNA(small RNA)相关的蛋白质与抗体的结合可通过混合靶蛋白和上述步骤a)中制备的抗体来实现。
[0091] 步骤c)，使蛋白质-抗体复合体与具有X-Y-Z的结构的单核酸进行杂交来形成蛋白质-抗体-单核酸复合体。
[0092] 在本发明中，蛋白质-抗体复合体与单核酸的杂交可通过向蛋白质-抗体复合体中添加单核酸来实现。
[0093] 步骤d)，用切断试剂处理蛋白质-抗体-单核酸复合体，从抗体中分离单核酸片段之后，测定所分离的单核酸片段的量来检测靶蛋白分子。
[0094] 在本发明中，上述切断试剂以酶为介质，只要可仅对上述单核酸的Y部位进行特异性切断，可使用任何切断试剂。例如，可利用选自由脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)、核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)、解旋酶(helicase)、核酸外切酶及核酸内切酶等组成的组中的一种，优选地，可使用核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)。
[0095] 在本发明中，可通过多种检测方法来测定单核酸的量。具体地，根据本发明分离的单核酸的片段优选在实时或者反应结束后测定，可通过荧光光度的变化或化学发光的测定来实现。
[0096] 上述荧光光度的变化或化学发光的测定可利用本发明所属技术领域中公知的可检测荧光标记物的所有测定装置，例如，可利用TRIAD多模检测器(TRIAD Multimode Detector)、Wallac/Victor荧光(Wallac/Victor fluorescence)或珀金埃尔默LB50B荧光分光光度计(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer)等来实现，并不限于此。
[0097] 如上所述的分离的单核酸的量的测定和检测方法可根据单核酸或流入到反应液内的标记物或检测标记物的形态而不同。
[0098] 根据本发明的检测靶蛋白的方法使用包含与具有X-Y-Z的结构的单核酸互补的序列的核酸所结合的抗体和具有X-Y-Z的结构的核酸，从而具有可提高检测待检测的与小RNA(small RNA)相关的蛋白质的速度和准确度的优点。
[0099] 有益效果
[0100] 为了分析现有的小RNA(small RNA)，利用任意延伸的寡核苷酸(oligo)来合成cDNA，并依赖于延伸的寡核苷酸(oligo)来实现检测。但是，根据本发明的具有X-Y-Z的结构的单核酸不依赖于任意延伸的寡核苷酸序列(oligo sequence)而可单纯地在小RNA(small RNA)的序列中进行扩增及检测。这可防止因依赖于任意延伸的序列来检测的方法而导致的错误的扩增及检测。并且，上述单核酸仅通过切断试剂而被切断，因此比现有的通过DNA聚合酶降解的探针可更准确地测定待检测的单核酸的量。
[0101] 因此，本发明的利用具有X-Y-Z的结构的核酸来检测小RNA(small RNA)或与上述小RNA(small RNA)相关的蛋白质的方法可快速且准确地检测小RNA(small RNA)或与上述小RNA(small RNA)相关的蛋白质，因此可有用地利用于多种疾病的诊断及预后诊断。附图说明
[0102] 图1为示出现有的为了检测小RNA而使用的方法中的利用TaqMan探针(TaqMan probe)和茎环引物(Stem-loop primer)的方法和通过利用聚A加尾(poly-A Tailing)来利用寡聚dT接头引物(oligo-dT Adapter primer)的方法的示意图。
[0103] 图2为示出对微RNA进行聚A加尾(poly-(A)tailing)之后利用延伸的寡聚dT引物(oligo dT primer)来合成cDNA，并利用根据本发明的单核酸(promer)来检测小RNA(small RNA)的方法的示意图。
[0104] 图3为示出对微RNA不进行聚A加尾(poly-(A)tailing)而利用RT引物来合成cDNA之后，利用根据本发明的单核酸(promer)来检测微RNA的方法的示意图。
[0105] 图4为利用根据本发明的单核酸(promer)来观察微RNA-21的基因表达与否的图表。
[0106] 图5为利用根据本发明的单核酸(promer)来观察微RNA-155的基因表达与否的图表。
[0107] 图6为利用根据本发明的单核酸(promer)来观察微RNA-21的cDNA稀释成多种不同浓度之后表达与否的图。
[0108] 图7为利用根据本发明的单核酸(promer)来观察微RNA-155的cDNA稀释成多种不同浓度之后表达与否的图。
[0109] 图8为利用根据本发明的单核酸(promer)来观察let-7a微RNA的基因表达与否的图。
[0110] 图9为利用根据本发明的单核酸(promer)来观察let-7d微RNA的基因表达与否的图。
[0111] 图10为利用根据本发明的单核酸(promer)来观察在let-7d 1pM存在之下将let-7a微RNA的cDNA稀释成多种不同浓度之后表达与否的图。
具体实施方式
[0112] 以下，通过实施例等进一步详细说明本发明。这些实施例等仅用于进一步具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例等，这对于本发明所属技术领域中的普通技术人员而言是显而易见的。
[0113] 实施例1：利用根据本发明的单核酸的人体来源微RNA的实时分析
[0114] 为了测定微RNA-21(5'-uag cuu auc aga cug aug uug a)、微RNA-155(5'-uua aug cua auc gug aua ggg gu)的基因表达与否，如下表1所示，将根据本发明的单核酸(promer)和引物(primer)、反转录引物(RT-primer)委托于IDT(Integrated DNA Technologies，美国(USA))来进行制备(参照表1)。在这里，就根据本发明的单核酸(promer)而言，在5'末端附着荧光素琥珀酰亚胺酯(fluorescein succinimidyl ester；FAM)，在3'末端附着3IABkFG，为了区别核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)，在序列前用角注“r”表示。
[0115] [表1]
[0116]
[0117]
[0118] 利用Genolution公司(Genolution Co.，Ltd.)的外泌体微RNA纯化试剂盒(Exosomal miRNA purification Kit)从正常人血液的血清200μL中提取了11.9ng/μL浓度的微RNA。将所提取的分别为1μL、0.1μL及0.01μL的微RNA利用美国Ambion公司的聚A加尾试剂盒(poly-(A)tailing kit)和瑞士罗氏(Roche)公司的Nxtscript RT试剂盒(总共20μL)在45℃温度下，在上述表1的各个RT引物以10μM的浓度存在1μL时，反应30分钟，合成cDNA。
[0119] 上述表1的单核酸及引物分别以10μM的浓度存在0.5μL时，放入上述合成的各个cDNA 1μL、10m单位(unit)的耐热性RNase H、AptaTaq DNA Master(瑞士罗氏(Roche)公司制造)4μL，用三蒸水调节总体积(total volume)成为20μL之后，进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)。在这里，PCR反应条件为在95℃温度下5分钟，在63～64℃温度下60秒钟，在95℃温度下10秒钟，进行45个循环(cycle)。对其的结果示于图4及图
5中。
5中。
[0120] 其结果，确认了使用仅用总微RNA(total miRNA)119pg所合成的cDNA的1/20的5.95pg的极少量的总微RNA也可进行稳定分析。
[0121] 实施例2：利用根据本发明的单核酸的人体来源微RNA的实时分析
[0122] 将从上述实施例1的11.9ng/μL浓度的微RNA 1μL合成的cDNA稀释成1/10倍、1/100倍、1/1000倍、1/10000倍、1/100000倍。
[0123] 上述表1的单核酸及引物分别以10μM的浓度存在0.5μL时，放入上述所稀释的各个cDNA 1μL、10m单位(unit)的耐热性RNase H、AptaTaq DNA Master(瑞士罗氏(Roche)公司制造)4μL，用三蒸水调节总体积(total volume)成为20μL之后，进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)。在这里，PCR反应条件为在95℃温度下5分钟，在63～64℃温度下60秒钟，在95℃温度下10秒钟，进行55个循环。对其的结果示于图6及图7中。
[0124] 其结果，将扩增曲线绘制到稀释至1/1000的cDNA，此后的稀释的cDNA中未出现扩增曲线。这确认到极少量的靶标(target)无非特异性扩增，据此确认到仅利用极少量的微RNA也可进行小于10拷贝(copy)的特定微RNA的分析。
[0125] 实施例3：利用根据本发明的单核酸的let-7微RNA的实时分析
[0126] 已知let-7微RNA在微RNA中存在最多的亚型(isoform)。已知区分这种let-7的亚型(isoform)为相当困难的分析，通常小于1％的特异性的区分尤其困难。如下表2所示，在本实施例中，为了测定其中最难的let-7a(5'-uga ggu agu agg uug uau agu u)和let-7d(5'-aga ggu agu agg uug cau agu u)的基因表达与否，将根据本发明的单核酸和引物(primer)、反转录引物(RT-primer)委托于IDT(Integrated DNA Technologies，美国(USA))进行制备(参照表2)。并且，为了准确的定量，将上述let-7的微RNA委托于IDT来进行制备。在这里，就单核酸而言，在5'末端附着荧光素琥珀酰亚胺酯(fluorescein succinimidyl ester；FAM)，在3'末端附着3IABkFG，为了区别核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)，在序列前用角注“r”表示。
[0127] [表2]
[0128]
[0129] 利用所合成的各个20pM浓度的微RNA 1μL和Ambion公司的聚A加尾试剂盒(poly-(A)tailing kit)和瑞士罗氏(Roche)公司的Nxtscript RT试剂盒(总共20μL)在45℃温度下，在上述表2的各个RT引物(RT primer)以10μM的浓度存在1μL时，反应30分钟，合成了cDNA。
[0130] 将所合成的cDNA从100fM稀释至1aM浓度。
[0131] 上述表2的单核酸及引物分别以10μM的浓度存在0.5μL时，放入上述合成之后稀释的各个cDNA 2μL、10m单位(unit)的耐热性RNase H、AptaTaq DNA Master(瑞士罗氏(Roche)公司制造)4μL，用三蒸水调节总体积(total volume)成为20μL之后，进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)。在这里，PCR反应条件为在95℃温度下5分钟，在63～64℃温度下60秒钟，在95℃温度下10秒钟，进行45个循环。对此结果示于图8及图9中。
[0132] 其结果，确认到仅使用微RNA 1aM浓度的所稀释的cDNA 2μL(约1拷贝)也可进行各个微RNA的分析。
[0133] 实施例4：利用根据本发明的单核酸的let-7微RNA特异性的实时检测[0134] 上述表2的单核酸及引物分别以10μM的浓度存在0.5μL时，上述实施例3中制备的1pM浓度的let-7d cDNA 2μL中各添加以1/10从100fM稀释至1aM浓度的let-7a cDNA 2μL，放入10m单位(unit)的耐热性RNase H、AptaTaq DNA Master(瑞士罗氏(Roche)公司制造)4μL，用三蒸水调节总体积(total volume)成为20μL之后，进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)。在这里，PCR反应条件为在95℃温度下5分钟，在63～64℃温度下60秒钟，在95℃温度下10秒钟，进行45个循环。对其的结果示于图10中。
[0135] 其结果，在1pM浓度的let-7d cDNA 2μL中各添加以1/10从100fM稀释至1aM浓度的let-7a cDNA 2μL的实验组中可稳定地分析从100fM至1fM浓度，但在100aM中确认到图表崩溃。这确认到可将亚型(isoform)的微RNA保持至0.1％特异性并进行分析。
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