一种检测胎膜早破的试剂盒
阅读：1发布：2020-10-19
专利汇可以提供一种检测胎膜早破的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种检测 试剂 盒 ，具体涉及一种检测胎膜早破的试剂盒。所述试剂盒包括有 硝酸 纤维 素膜以及以下试剂：A、膜封闭液；B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆 抗体 检测液；C、洗涤液；D、辣根过 氧 化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液；E、显色底物二 氨 基联苯胺溶液。本发明试剂盒采用定性检测的方式来检测胎膜早破，其制作成本和使用成本均明显降低；同时，本发明试剂盒相较于定性检测的 免疫层析 试纸 而言，其可以有效提高对胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性，分别可达到99%和96%以上，从而减少误诊的发生率。，下面是一种检测胎膜早破的试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括有硝酸纤维素膜以及以下试剂：
A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05-0.1％的吐温-20以及0.5-1.5％的牛血清白蛋白；
B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.5-2mg/mL、质量分数为0.05-0.08％的吐温-20以及质量分数为0.5-1.5％的牛血清白蛋白；
C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的8-12mmol/L的PBS，其含有质量分数为
0.03-0.05％的吐温-20；
D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5％-1％；
E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.05-0.08％；
F、样本稀释液：所述样本稀释液为pH为7.0-7.4的10mmol/L的PBS，其含有质量分数为1％的牛血清白蛋白以及质量分数为0.05％的叠氮钠。
2.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述A试剂膜封闭液中含有0.05％的吐温-20以及1.5％的牛血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述B试剂检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05％的吐温-20以及质量分数为1.2％的牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括有硝酸纤维素膜以及以下试剂：
A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05％的吐温-20以及1.5％的牛血清白蛋白；
B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05％的吐温-20以及质量分数为1.2％的牛血清白蛋白；
C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的10-12mmol/L的PBS，其含有质量分数为
0.05％的吐温-20；
D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1％；
E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.05％。
一种检测胎膜早破的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测胎膜早破的试剂盒。
背景技术
[0002] 医学上所使用的试剂盒为分析或检测某种参数时所必需试剂的成套组合，如疾病诊断试剂盒、核酸提取回收试剂盒、细菌鉴定试剂盒等。现有试剂盒大多为采用定量的检测方式，相对来说，试剂盒采用定量检测的方式时，其盒内一般包含有检测标准品，同时，检测过程中还会包含对若干标准品的检测，因此采用定量检测的试剂盒一般在成本上偏高，无论是制作成本或是使用成本，但其定量的检测结果较免疫层析试纸的定性检测方式更为准确。
[0003] 胎膜破裂（Rupture of Fetal Membrane，简称ROM）在孕期可能随时发生，在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破（PROM）。足月后（37孕周后）PROM的发生率约为10%，足月前（37孕周前）PROM的发生率为2-3.5%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素，也是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。
[0004] 现有检测胎膜早破的方法中除以往的临床询问病史等方法外，主要以妊娠妇女阴道分泌物中的可溶性细胞间粘附分子-1（简称sICAM-1）为检测指标的检测工具为较新的方法。其中以sICAM-1为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸对于产科病人及时诊断是否发生胎膜早破起到了较好的效果；所述免疫层析试纸的检测线内包被有羊抗人sICAM-1多克隆抗体工作液，质控线内包被有羊抗鼠IgG工作液，胶体金结合物中含有鼠抗人sICAM-1单克隆抗体。
[0005] 现有的以sICAM-1为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸虽然为产科病人提供了便利，但由于其本身仅是一种定性的检测方式，相对于定量检测的方式其在测定结果上存在一定程度的偏差，从而容易造成错判，导致检测结果的灵敏性以及特异性不够理想。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明提供一种检测胎膜早破的试剂盒，该试剂盒采用定性检测的方式来检测胎膜早破，其制作成本和使用成本均明显降低；同时，本发明试剂盒相较于定性检测的免疫层析试纸而言，其可以有效提高对胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性，分别可达到99%和96%以上，从而减少误诊的发生率。
[0009] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1-3mg/mL、质量分数为0.05-0.08%的吐温-20以及质量分数为0.5%-2.0%的牛血清白蛋白；
[0010] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的8-12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.03-0.05%的吐温-20；
[0012] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.03-0.08%。
[0013] 优选的，所述A试剂膜封闭液中含有0.05-0.1%的吐温-20以及0.5-1.5%的牛血清白蛋白。
[0014] 优选的，所述A试剂膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白。
[0015] 优选的，所述B试剂检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.5-2mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为0.5-1.5%的牛血清白蛋白。
[0016] 优选的，所述B试剂检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白。
[0017] 优选的，所述D试剂检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5%-1%。
[0018] 优选的，所述E试剂二氨基联苯胺的浓度为0.05-0.08%。
[0019] 优选的，所述试剂盒包括有硝酸纤维素膜以及以下试剂：
[0020] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0021] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白；
[0022] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的10-12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0023] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；
[0024] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.05%。
[0025] 优选的，前述任一种检测胎膜早破的试剂盒还含有以下试剂：
[0026] F、样本稀释液：所述样本稀释液为pH为7.0-7.4的10mmol/L的PBS，其含有质量分数为1%的牛血清白蛋白以及质量分数为0.05%的叠氮钠。
[0027] 本发明与现有技术相比，其详细说明如下：
[0028] 本发明主要采用的技术方案为：检测胎膜早破的试剂盒，所述试剂盒包括有硝酸纤维素膜以及以下试剂：
[0029] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.03-0.1%的吐温-20以及0.5%-2.0%的牛血清白蛋白；
[0030] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1-3mg/mL、质量分数为0.05-0.08%的吐温-20以及质量分数为0.5%-2.0%的牛血清白蛋白；
[0031] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的8-12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.03-0.05%的吐温-20；
[0032] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.2%-1%；
[0033] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.03-0.08%。
[0034] 首先，细胞间粘附分子（intercellular adhesive molecule1，简称ICAM-1）是一种参与细胞与细胞之间以及细胞与外基质之间相互作用的分子统称，包括有存在于体液中的可溶性细胞间粘附分子（soluble intercellular adhesive molecule1，简称sICAM-1）和存在于细胞表面的膜型细胞间粘附分子（简称膜型ICAM-1）。其中，sICAM-1不仅保留了膜型ICAM-1的生物学特性，其还是膜型ICAM-1在体液中的可溶形式。本发明人经过充分的研究发现，发生胎膜早破的妊娠妇女受羊水中的单核细胞上sICAM-1的表达和中性粒细胞的影响，其阴道分泌物中的sICAM-1含量明显升高，现已有将sICAM-1为目标分子来检测胎膜早破的检测工具，如免疫层析试纸，但在实际应用过程中，该试纸对胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性不够理想，容易产生误诊。
[0035] 本发明所述灵敏性为患病人群中得出阳性检测的样本占病人总数的百分比，特异性为健康人群中得出阴性检测的样本占健康人总数的百分比。影响本发明试剂盒检测结果灵敏性和特异性的因素较多，包括有试剂盒本身中各种试剂成分的选择以及试剂中各种成分的浓度的选择，另外，试剂本身的制作工艺也同样会对检测结果的灵敏性和特异性有一定的影响。
[0036] 本发明人经过充分的研究发现，sICAM-1是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质之一，含量一般为14ng/mL左右；而发生胎膜早破时，羊水中含量较多的sICAM-1则会出现在阴道分泌物中。因此，本发明主要采用以妊娠妇女阴道分泌物中的sICAM-1作为检测目标分子。
[0037] 本发明经过蛋白芯片筛选试验发现，确诊的胎膜早破产妇与确诊的非胎膜早破产妇相比（两组产妇的年龄与妊娠周龄匹配，无基础疾病，无妊娠合并症），其阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度具有明显差异；其中，确诊的胎膜早破产妇阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在2ng/mL以上，而确诊的非胎膜早破产妇阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在1ng/mL以下（详见实施例1）。
[0038] 鉴于上述实验结果，为了提高本发明检测试剂盒对胎膜早破的定性检测结果的灵敏性和特异性，本发明人经过充分的研究，采用以硝酸纤维素膜作为载体来进行定性的分析检测，从而获取更加准确的数据，从而提高胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性；同时，本发明试剂盒并未采用定量检测的方式，由于其没有标准品等试剂，因此本发明试剂盒在制作成本上明显降低，同时其使用成本也明显得到降低。
[0039] 本发明试剂盒的具体使用方式如下：
[0040] 1、获取待检样本；
[0041] 2、将待检样本滴入硝酸纤维素膜上，常温放置风干；
[0042] 3、将步骤2中所得的硝酸纤维素膜置于封闭液中进行非特异性封闭，室温震荡孵育一小时；
[0043] 4、将步骤3中封闭后的硝酸纤维素膜置于鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液中，室温震荡孵育一小时；
[0044] 5、将步骤4所得硝酸纤维素膜用洗涤液进行清洗；
[0045] 6、将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体滴加到步骤5中所得的硝酸纤维素膜上；
[0046] 7、清洗步骤6中所得的硝酸纤维素膜；
[0047] 8、将二氨基联苯胺溶液滴加到步骤7所得硝酸纤维素膜上即可。
[0048] 本发明所述试剂盒为了提高定性检测分析中检测结果的灵敏性和特异性，本发明首先是对步骤3-8中各种试剂的筛选，尤其是对步骤4、6、8中各抗体以及显色底物的筛选，更进一步的为对其中各抗体以及显色底物的组合筛选。本发明人经过大量的研究发现，本发明试剂盒中抗体检测液以及显色底物的组合选择对于胎膜早破的定性检测结果的灵敏性和特异性具有明显更优良的效果。本发明试剂盒中采用鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液以及二氨基联苯胺的组合。
[0049] 本发明还对步骤3-8中的各种试剂的浓度成分进行了筛选，因为本发明中所使用的任一种试剂的浓度大小对于胎膜早破检测结果的灵敏性和特异性均有一定的影响。
[0050] 本发明试剂盒定性检测胎膜早破的基本原理如下：硝酸纤维素膜可与蛋白质分子结合，从而作为蛋白质分子的载体；待检样本中如果含有目标分子即抗原成分（本发明中为妊娠妇女阴道分泌物中的可溶性细胞间粘附分子-1），则硝酸纤维素膜会与该抗原成分结合，从而作为抗原成分的载体；然后采用封闭液来封闭硝酸纤维素膜上没有与抗原成分结合的部分，从而避免非特异性点的干扰；封闭后的硝酸纤维素膜采用特定抗体成分（本发明中为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体）与其上的抗原成分结合，洗涤去除游离的未结合的抗体或抗原成分；然后将酶标记的另一特定抗体成分（本发明中为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体）滴加到前述硝酸纤维素膜上，使得该成分与前述抗体和抗原成分结合；洗涤；最后将显色底物滴加到所得硝酸纤维素膜上，抗原、各抗体以及显色底物会在酶的作用下发生反应，从而膜上发生颜色转变，则可判定检测结果为阳性；若待检样本中没有抗原成分或抗原成分浓度不够，则膜上不会发生颜色转变，则可判定检测结果为阴性。
[0051] 本发明所述A试剂膜封闭液中含有0.03-0.1%的吐温-20以及0.5-2.0%的牛血清白蛋白，该试剂的成分以及适宜浓度均是在多次试验中进行筛选所得。膜封闭液的成分选择以及浓度多少直接决定了本发明试剂盒对胎膜早破检测结果的灵敏性和特异性；灵敏性为病患人群中检测出阳性结果的比例，而特异性为健康人群中检出阴性结果的比例；当膜封闭液的成分或浓度选择不适宜时，其对膜上的非特异性点的封闭则会出现封闭不够或者封闭过量的结果；当出现封闭过量的情况时，其原有待检样本中与膜结合的抗原成分的含量会降低，从而容易导致病患人群检测出阴性结果，导致灵敏性降低；而当出现封闭不够的情况时，其特异性点没有被完全封闭，则特异性点容易与后续抗体结合，从而容易导致健康人群中检测出阳性结果，导致特异性降低；
[0052] 本发明所述B试剂鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1-3mg/mL、质量分数为0.05-0.08%的吐温-20以及质量分数为0.5-2.0%的牛血清白蛋白，该试剂的成分以及适宜浓度均是在多次试验中进行筛选所得，尤其是与A试剂膜封闭液的大量组合方式中筛选所得。
[0053] 本发明所述D试剂检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.2-1%，该试剂的成分以及适宜浓度同样是在多次试验中进行筛选所得。
[0054] 本发明所述E试剂显色底物为质量分数为0.03-0.08%的二氨基联苯胺的溶液，该试剂的成分以及适宜浓度同样是在多次试验中进行筛选所得。
[0055] 前述三种试剂的选择作为一个整体对于本发明所述试剂盒检测胎膜早破的灵敏性和特异性有较大的影响。鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体作为第一抗体与抗原结合，在试验选择的过程中与抗原结合的第一抗体应该具有较好的结合性能，从而才能准确的测定待检样本中是否有目标分子抗原的存在。尤其是该抗体的浓度含量，若浓度偏低，则不能完全与抗原结合，从而导致病患人群中检测出阴性结果；若浓度偏高，容易导致将抗原成分的含量放大，从而导致健康人群中检测出阳性结果。
[0056] 本发明所述D试剂抗体检测液中的酶标记的抗体作为第二抗体成分，其与第一抗体应该具有较好的结合性能；同时，所采用的酶不仅需要对第二抗体能够起到很好的标记作用外，其还需要与后续使用的显色底物有明显的显色反应。同样的道理，显色底物二氨基联苯胺的浓度仍需要适宜，过多或过少对检测结果均有一定的影响。
[0057] 本发明所述C试剂洗涤液为pH为7.2-7.4的8-12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.03-0.05%的吐温-20；洗涤液的成分以及浓度选择不当，会造成部分结合的抗体或抗原脱离硝酸纤维素膜或者造成游离的抗体或抗原为完全清洗掉，因此本发明所述C试剂洗涤液同样是在大量的实验基础上研究所得。
[0058] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用所述A试剂膜封闭液中含有0.05-0.1%的吐温-20以及0.5-1.5%的牛血清白蛋白。
[0059] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用所述A试剂膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白。
[0060] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用所述B试剂检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.5-2mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为0.5-1.5%的牛血清白蛋白。
[0061] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用所述B试剂检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白。
[0062] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用所述D试剂检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5%-1%。
[0063] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用所述E试剂二氨基联苯胺的浓度为0.05-0.08%。
[0064] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用所述试剂盒包括有硝酸纤维素膜以及以下试剂：
[0065] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0066] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白；
[0067] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的10-12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0068] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；
[0069] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.05%。
[0070] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用前述任一种检测胎膜早破的试剂盒还含有以下试剂：
[0072] 图1是胎膜早破组阴道分泌物样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图；
[0073] 图2是健康对照组阴道分泌物样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图；
[0074] 图3是健康妊娠妇女羊水样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图；
具体实施方式
[0076] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0077] 实施例1
[0078] 以四川大学华西第二医院门诊及住院的产妇为实验对象，根据现有检测方法将实验对象分为胎膜早破组、健康对照组和羊水样本组。
[0079] 胎膜早破组：110例胎膜早破妊娠妇女（其中80例足月胎膜早破和30例足月前胎膜早破）；
[0080] 健康对照组：110例分娩前的胎膜完整妊娠妇女；
[0081] 羊水样本组：30例行剖宫产的胎膜完整妊娠妇女。
[0082] 实验对象临床筛选标准：
[0083] 胎膜早破组—（i）临产前观察到羊水漏出；
[0084] （ii）阴道分泌物样本pH试纸检测阳性；
[0085] （iii）羊齿植物叶状结晶检测阳性。
[0086] 健康对照组—（i）临产前未观察到羊水漏出；
[0087] （ii）阴道分泌物样本pH试纸检测阴性；
[0088] （iii）羊齿植物叶状结晶检测阴性。
[0089] 实验对象年龄分布：80例足月胎膜早破平均年龄28岁（年龄范围19-35岁），30例足月前胎膜早破平均年龄31岁（年龄范围19-45岁），健康对照组平均年龄30岁（年龄范围18-43岁）。
[0090] 试验对象来源：以四川大学华西第二医院门诊及住院的产妇为实验对象，收集三组产妇临床发动时的阴道分泌物/宫颈粘液作为待检样本。
[0091] 样本收集方法：妊娠妇女取膀胱截石位（以平仰卧位躺下，双下肢分开屈曲，暴露外阴），窥开阴道后，用一次性无菌棉签伸入阴道后穹窿处，旋转5圈取样。将棉签头插入1mL样本稀释液（磷酸盐缓冲系统）中，旋转5次后，紧贴管壁挤压旋转2次，获得待测样本。
[0092] A、实验方法：细胞因子/趋化因子抗体芯片定性检测
[0093] 实验条件：
[0094] 1)将预先标记有174个细胞因子抗体的膜（RayBiotech，美国）放入检测盒中，然后加入2ml封闭液，室温封闭6小时；
[0095] 2)弃去封闭液，加入1.2ml待检样本1份，4℃过夜孵育；
[0096] 3)弃去样本，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；
[0097] 4)加入1ml生物素偶联的检测抗体，室温孵育2小时；
[0098] 5)弃去抗体，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；
[0100] 7)弃去液体，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；
[0101] 8)在膜上加入化学发光试剂500μl，避光作用2分钟，观察结果。
[0102] 从胎膜早破组、健康对照组和羊水样本组中各收集的待测样本均采用上述实验条件进行检测，所得结果如图1、图2和图3所示。
[0103] 实验结果：图1、图2和图3中的标记1为IGFBP-1的表达信号，标记2为sICAM-1的表达信号，标记3为Axl的表达信号。从图1、图2和图3中可以看出，胎膜早破组的阴道分泌物和羊水样本组中IGFBP-1、sICAM-1、Axl的表达较强，而健康妊娠妇女阴道分泌物样本中上述三者的表达较弱，上述三者中，又以sICAM-1的表达最强。
[0104] B、实验方法：酶联免疫吸附法定量检测
[0105] 实验条件：
[0106] 实验材料：sICAM-1ELISA检测试剂盒（R&D公司）
[0107] 1.试剂的配制
[0108] 洗涤缓冲液（Wash Buffer）
[0109] 底物溶液（Substrate Solution）：使用前，将试剂盒中的显色剂A和显色剂B等量、避光混合15分钟，每个孔需要两种显色剂的混合物200μl。
[0110] sICAM-1标准品：用1ml去离子水将sICAM-1标准品稀释。稀释后的标准品原液浓度为250ng/ml。为确保标准品充分混匀，在进一步稀释前，将标准品放于摇床上轻轻晃动混匀至少15分钟以上。
[0111] 分别将250ng/ml的标准品配置成浓度为50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml的sICAM-1检测标准品；RD5-7校准稀释剂作为空白对照（0ng/ml）
[0112] 2.检测程序
[0113] 向每个微孔中加入100μl sICAM-1Conjugate；标准品、对照物、样本的加入量为100μl，并加入到对应的微孔中。将微孔用试剂盒提供的胶条盖好。将微孔板在室温条件下置于水平摇床上500±50转/分钟培育1.5小时。洗板；每孔加底物溶液（Substrate Solution）200μl，室温条件下，避光、平放培育30分钟；每孔加50μl终止液（Stop Solution）。孔中溶液的颜色将由蓝色变为黄色。如果孔中溶液颜色为绿色或颜色变化不一致，轻轻拍打平板，以确保溶液充分混匀；30分钟内测450nm吸光值。
[0114] 3.制作标准曲线，计算样本含量。
[0115] 4.将计算所得的每个待测样本的含量统计并绘制成图表，所得图表见附图4。
[0116] 实验结果：图4中，AF of control为羊水样本，CVF of PROM为胎膜早破组的阴道分泌物，CVF of control为健康对照组的阴道分泌物。从图4可以看出，sICAM-1在健康妊娠妇女羊水样本中的浓度最高，平均可达到80ng/mL；sICAM-1在胎膜早破组阴道分泌物样本中的浓度90%以上可达到2ng/mL以上；sICAM-1在健康对照组阴道分泌物样本中的浓度90%以上在1ng/mL以下。
[0117] 从实施例1的实验结果可知，发生胎膜早破妊娠妇女的阴道分泌物中主要发生含量变化之一的是可溶性细胞间粘附分子sICAM-1，而sICAM-1主要来自于胎膜破裂的羊水中。
[0118] 以下是以妊娠妇女阴道分泌物中sICAM-1为检测目标分子，并按照一定的制备方法制备所得的试剂盒的对照例，各对照例除硝酸纤维素膜以外，含有的试剂如下：
[0119] 对照例1-现有常规的以sICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒[0120] 该对照例1试剂盒为采用专利申请号为201010189663.4中记载的方法，并且将其中所述的ICAM-1单克隆抗体替换成生物素标记的鼠抗人sICAM-1单克隆抗体和羊抗人sICAM-1单克隆抗体后，从而制备而成的试剂盒，其含有的试剂如下：
[0121] 包被有羊抗人sICAM-1单克隆抗体的多孔板，生物素标记的鼠抗人sICAM-1单克隆抗体检测液，与生物素标记的鼠抗人sICAM-1单克隆抗体结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3’，3’，5，5’-四甲基联苯胺和sICAM-1蛋白标准品。
[0122] 对照例2-现有常规的以sICAM-1为检测指标的胎膜早破免疫层析试纸[0123] 该对照例2免疫层析试纸购自成都创宜生物科技有限公司，其商品名为：育宜康；规格：1人份/盒；药品生产批号为：20120501；
[0124] 对照例3
[0125] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有1%的吐温-20以及3.0%的牛血清白蛋白；
[0126] B、IGFBP-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人IGFBP-1单克隆抗体3.5mg/mL、质量分数为0.2%的吐温-20以及质量分数为2.5%的牛血清白蛋白；
[0127] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.6-7.8的15mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.1%的吐温-20；
[0128] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为2%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3.5；
[0129] E、显色底物四甲基联苯胺溶液：所述溶液中四甲基联苯胺的浓度为0.15%。
[0130] 对照例4
[0131] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.01%的吐温-20以及0.3%的牛血清白蛋白；
[0132] B、Axl单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人Axl单克隆抗体0.5mg/mL、质量分数为0.02%的吐温-20以及质量分数为0.2%的牛血清白蛋白；
[0133] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.0的6mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.01%的吐温-20；
[0134] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:1.5；
[0135] E、显色底物四甲基联苯胺溶液：所述溶液中四甲基联苯胺的浓度为0.01%。
[0136] 对照例5
[0137] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.0%的牛血清白蛋白；
[0138] B、IGFBP-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人IGFBP-1单克隆抗体1.5mg/mL、质量分数为0.08%的吐温-20以及质量分数为1.5%的牛血清白蛋白；
[0139] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的8mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0140] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:2；
[0141] E、显色底物四甲基联苯胺溶液：所述溶液中四甲基联苯胺的浓度为0.05%。
[0142] 对照例6
[0143] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.8%的吐温-20以及2.0%的牛血清白蛋白；
[0144] B、Axl单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人Axl单克隆抗体2.5mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.0%的牛血清白蛋白；
[0145] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的10mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0146] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.8%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0147] E、显色底物四甲基联苯胺溶液：所述溶液中四甲基联苯胺的浓度为0.06%。
[0148] 对照例7
[0149] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.3%的吐温-20以及0.2%的牛血清白蛋白；
[0150] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体3.5mg/mL、质量分数为0.1%的吐温-20以及质量分数为2.5%的牛血清白蛋白；
[0151] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的15mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0152] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3.5；
[0153] E、显色底物四甲基联苯胺溶液：所述溶液中四甲基联苯胺的浓度为0.1%。
[0154] 对照例8
[0155] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.03%的吐温-20以及0.7%的牛血清白蛋白；
[0156] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体0.5mg/mL、质量分数为0.1%的吐温-20以及质量分数为0.3%的牛血清白蛋白；
[0157] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的5mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.1%的吐温-20；
[0158] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.12%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:1.5；
[0159] E、显色底物四甲基联苯胺溶液：所述溶液中四甲基联苯胺的浓度为0.01%。
[0160] 对照例9
[0161] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.3%的吐温-20以及0.2%的牛血清白蛋白；
[0162] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体2.5mg/mL、质量分数为0.1%的吐温-20以及质量分数为2.5%的牛血清白蛋白；
[0163] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的15mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0164] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:2；
[0165] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.1%。
[0166] 对照例10
[0167] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.03%的吐温-20以及0.7%的牛血清白蛋白；
[0168] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体0.5mg/mL、质量分数为0.1%的吐温-20以及质量分数为0.3%的牛血清白蛋白；
[0169] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的5mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.1%的吐温-20；
[0170] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.12%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:1.5；
[0171] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.08%。
[0172] 对照例11
[0173] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.03%的吐温-20以及0.5%的牛血清白蛋白；
[0174] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为0.5%%的牛血清白蛋白；
[0175] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的8mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.03%的吐温-20；
[0176] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.2%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:2；
[0177] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.03%。
[0178] 对照例12
[0179] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.1%的吐温-20以及2.0%的牛血清白蛋白；
[0180] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体3mg/mL、质量分数为0.08%的吐温-20以及质量分数为2.0%的牛血清白蛋白；
[0181] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0182] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0183] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.08%。
[0184] 对照例13
[0185] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05-0.1%的吐温-20以及0.5-1.5%的牛血清白蛋白；
[0186] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体3mg/mL、质量分数为0.08%的吐温-20以及质量分数为2.0%的牛血清白蛋白；
[0187] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0188] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0189] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.08%。
[0190] 对照例14
[0191] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0192] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体3mg/mL、质量分数为0.08%的吐温-20以及质量分数为2.0%的牛血清白蛋白；
[0193] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0194] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0195] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.08%。
[0196] 对照例15
[0197] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0198] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.5-2mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为0.5-1.5%的牛血清白蛋白；
[0199] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0200] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0201] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.08%。
[0202] 对照例16
[0203] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0204] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白；
[0205] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0206] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0207] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.08%。
[0208] 对照例17
[0209] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0210] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白；
[0211] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0212] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0213] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.08%。
[0214] 对照例18
[0215] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0216] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白；
[0217] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0218] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0219] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.05%。
[0220] 对照例19
[0221] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0222] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白；
[0223] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的10mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0224] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0225] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.05%。
[0226] 对照例20
[0227] A、膜封闭液：所述膜封闭液中含有0.05%的吐温-20以及1.5%的牛血清白蛋白；
[0228] B、鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液：所述检测液中含有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体1.7mg/mL、质量分数为0.05%的吐温-20以及质量分数为1.2%的牛血清白蛋白；
[0229] C、洗涤液：所述洗涤液为pH为7.2-7.4的12mmol/L的PBS，其含有质量分数为0.05%的吐温-20；
[0230] D、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体检测液：所述检测液中辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1%；所述辣根过氧化物酶与羊抗鼠IgG多克隆抗体的质量比为1:3；
[0231] E、显色底物二氨基联苯胺溶液：所述溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.05%；
[0232] F、样本稀释液：所述样本稀释液为pH为7.0-7.4的10mmol/L的PBS，其含有质量分数为1%的牛血清白蛋白以及质量分数为0.05%的叠氮钠。
[0233] 上述对照例1-20中各试剂及材料的来源如下：
[0234] 硝酸纤维素膜：购自MILLPORE；
[0235] 鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体、鼠抗人IGFBP-1（胰岛素样生长因子结合蛋白-1）单克隆抗体、鼠抗人Axl（受体酪氨酸激酶）单克隆抗体：购自R&D公司；
[0236] 二氨基联苯胺：购自Sigma公司；
[0237] 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体：购自杭州华安公司；
[0238] 牛血清白蛋白（BSA）：Roche公司。
[0239] 实施例2
[0240] 将不同方法制备而成的对照例1-20试剂盒分别用于检测同样的妊娠妇女阴道分泌物的临床样本，包括有胎膜早破组和健康对照组，其中胎膜早破组为500例，健康对照组为500例，试验对象均采用实施例1的方法进行临床诊断和筛选。
[0241] 样本收集：妊娠妇女取膀胱截石位（以平仰卧位躺下，双下肢分开屈曲，暴露外阴），窥开阴道后，用一次性无菌棉签伸入阴道后穹窿处，旋转5圈取样。将棉签头插入1mL样本稀释液（含有质量分数为15的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的PBS）中，旋转5次后，紧贴管壁挤压旋转2次，获得样本。
[0242] 对照例1-20分别对所收集的1000例样本进行检测，检测步骤如下：
[0243] 1、将待检样本滴入硝酸纤维素膜上，常温放置风干；
[0244] 2、将步骤1中所得的硝酸纤维素膜置于封闭液中进行非特异性封闭，室温震荡孵育一小时；
[0245] 3、将步骤2中封闭后的硝酸纤维素膜置于鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体检测液中，室温震荡孵育一小时；
[0246] 4、将步骤3所得硝酸纤维素膜用洗涤液进行清洗；
[0247] 5、将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体滴加到步骤4中所得的硝酸纤维素膜上；
[0248] 6、清洗步骤5中所得的硝酸纤维素膜；
[0249] 7、将二氨基联苯胺溶液滴加到步骤6所得硝酸纤维素膜上即可。
[0250] 当步骤7中所得的硝酸纤维素膜在5-10min内变为棕黄色则判定结果为阳性，[0251] 若硝酸纤维素膜未变为棕黄色则判定结果为阴性，各对照例所得结果列表如下：
[0252] 表一
[0253]
[0254]
[0255] 上表一中，分别为对照例1-20用于检测相同的已确诊的胎膜早破组和健康对照组的阴道分泌物样本；对照例1为采用已公开的专利文件中以sICAM-1为检测指标的胎膜早破的检测试剂盒，其所含有的试剂为定量检测的方式；该种试剂盒的制作成本一般为2000-3000RMB/个，其使用过程中所消耗的试剂以及仪器等使用成本一般为10-20元；该种试剂盒在检测胎膜早破的检测结果上具有较高的灵敏性和特异性。
[0256] 对照例2为购买自市售的以sICAM-1为检测指标的胎膜早破免疫层析试纸，其制作成本一般为180-220RMB/个；由于免疫层析试纸一般为定性的检测方式，其检测方式限制了其对胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性。
[0257] 对照例3-6为实施例1中以同样可作为检测胎膜早破目标分子的IGFBP-1以及Axl为检测目标分子的与本发明相类似的检测方式；
[0258] 对照例7-8为同样以sICAM-1为检测目标分子，但采用与本发明不同的抗体、酶的组合的类似检测方式；
[0259] 对照例9-10为与本发明最接近的检测方式，但其所使用的各试剂的浓度含量等于本发明方案有区别；对照例9-10中有部分试剂的浓度含量与本发明部分相同，但针对其整体的试剂盒来说，本发明所采用的各试剂的浓度含量需要经过充分试验才可获得。
[0260] 对照例11-20均为本发明方案试剂盒的实施方式；其中，对照例11-12为本发明普遍的实施方式，对照例13-20为进一步优化的实施方式；
[0261] 从表一中可以看出，本发明所述试剂盒的实施方式在检测胎膜早破的检测结果中具有明显更优的灵敏性和特异性，尤其是特异性的提高，相对于现有检测胎膜早破的试剂盒而言；同时，本发明试剂盒采用定性检测的方式，其制作成本和使用成本明显降低，基本可达到50-80RMB/个。
[0262] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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