技术领域
[0001] 本
发明涉及医药技术和
口腔护理技术领域,具体而言,本发明涉及一种具有防治多种口腔
疾病作用的蜚蠊有效部位及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 蜚蠊(Periplaneta americana)属昆虫纲,蜚蠊目,蜚蠊科,俗称蟑螂。它在地球上已经生存了4亿年,是世界上生命
力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。蜚蠊一直被人类视为
害虫,但它面对人类的各种杀灭手段却能顽强繁衍至今,其体内无疑具有最优秀的
生物活性物质和特殊生理机制。
[0003] 近年来,随着我国对传统中医药资源研究开发的重视,科学工作者对这一资源丰富的昆虫进行了应用方面的研究开发,取得了可喜的成就,并以蜚蠊药材为原料,先后研发的新药有:“康复新液”、“肝隆胶囊”、“心脉隆注射液”,其中“肝隆胶囊”和“心脉隆注射液”为国家级二类新药(中药)。“康复新液”用于
治疗口腔溃疡、十二指肠溃疡、烧伤、烫伤、褥疮、
肺结核
辅助治疗等,为国家中药保护品种、国家医保乙类药物;“肝隆胶囊”用于治疗慢性乙型
肝炎,肝硬化及乙肝病毒携带等肝脏疾病,总有效率达84.2%以上;“心脉隆注射液”主治慢性充血性心力衰竭,慢性肺原性心脏病,对继发性肺心病、心肌病的心衰治疗效果特别明显。
[0004] 近年来的研究表明,蜚蠊含有生物活性肽、糖肽和多元醇类化合物,其中蜚蠊肽具有拟表皮细胞生长因子(EGF)及
碱性
成纤维细胞生长因子(bFGF)的作用,能促进口腔上皮细胞生长、抗菌消炎、
止血消肿、营养
牙龈等作用;糖肽类成分具有活化非特异性细胞免疫功能,增强巨噬细胞和自然细胞对病原物质的直接吞噬作用,分泌类白细胞介素、干扰素白三烯等物质,消除
炎症水肿;多元醇具有清除自由基,促进细胞生长的作用。为明确蜚蠊药材中具有抗菌消炎、止血消肿、促进血管增生、组织修复作用的活性部位,进一步弄清其中起主要作用的物质
基础,
发明人对其展开了详细的药学工艺研究。发明者采用不同浓度的醇提,提取方法采用工业生产常用的冷浸或热提两种方法,精制过程选用价格较低、易于反复再生利用的
活性炭对蜚蠊提取物进行研究,并结合体内外实验进行活性追踪,得到具有抗菌消炎、止血消肿、促进血管增生、组织修复作用的活性部位。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种适合于工业化生产的、能有效解决口腔溃疡、
牙周炎、
牙龈萎缩等多种口腔疾病的蜚蠊有效部位。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种具有
预防和治疗口腔溃疡、
牙龈炎、牙周炎、牙龈萎缩等多种口腔疾病作用的蜚蠊有效部位的制备方法。
[0007] 本发明的再一目的是提供一种含有蜚蠊有效部位的药物、药物组合或口腔护理产品。
[0008] 本发明提供一种蜚蠊有效部位的制备方法,包括以下步骤:
[0009] 将养殖时间在5个月以上的成虫用50-60℃的热水烫死,经60~70℃烘干后,
粉碎至10-30目,置提取罐中,加3~7倍量浓度为60~95%的醇水混合
溶剂,搅匀,采用回流提取或冷浸提取,将提取液用孔径为200~500目的
滤布过滤,收集滤液,经50-80℃减压浓缩,至浸膏无醇味,此时相对
密度为1.1-1.3,即得蜚蠊醇提取物。
[0010] 在油水分离装置中加入浸膏和浸膏体积2-5倍量的60-75℃热水,顺一个方向缓慢搅拌,搅拌速度20-40转/分钟,搅拌时间20-30分钟,同时加热至65-75℃,保温1小时,静置冷却6-12小时,待油水分离后放出水层,过滤,收集滤液,即得蜚蠊
脱脂提取液。
[0011] 将上述蜚蠊脱脂提取液上活性炭柱,
吸附2-3小时,用50-95%的醇水混合溶剂洗脱,收集洗脱液。
[0012] 将上述洗脱液过滤,滤液在50-80℃减压浓缩,浓缩至相对密度为1.10-1.30,即得蜚蠊有效部位提取物。
[0013] 所述提取方法。回流提取:提取三次,第一次3~5小时,第二、三次2~4小时,回流
温度控制在70~80℃。冷浸提取:提取三次,每次浸泡72小时以上,其间每间隔6~12小时搅拌一次。
[0014] 所述醇水混合溶剂中,醇包括甲醇、
乙醇、乙二醇或者它们的混合物。
[0015] 所述活性炭为
木质颗粒状活性炭,活性炭的用量为脱脂提取液体积的2-5倍量。
[0016] 本发明还提供一种能解决口腔溃疡、牙周炎、牙龈萎缩等多种口腔疾病,用于制备治疗和预防口腔疾病药物的的蜚蠊有效部位,总肽含量以小
牛血清
白蛋白计,采用Folin-酚法测定,不得少于100.0mg/g。
[0017] 本发明还提供一种蜚蠊有效部位作为制备治疗和预防口腔疾病药物的应用。
[0018] 所述蜚蠊有效部位为上述蜚蠊有效部位。。
[0019] 所述药物包括药物、药物组合和口腔护理产品。
[0020] 所述口腔疾病包括口腔溃疡、牙龈炎、牙周炎和牙龈萎缩。
[0021] 所述药物、药物组合和护理用品包括加入药剂学允许的各种辅料制成的片剂、膜剂、搽剂、
软膏剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂和含漱剂。
[0022] 所述片剂包括口含片、泡腾片和口腔贴片。
[0023] 本发明的有益效果:蜚蠊资源丰富,目前已完全实现人工饲养,全国每年产量达600多吨。蜚蠊系列药品的研发是
云南省重点培育的五大系列“云药”特色产品之一,该项研究成果得到的天然产物,将为研发安全、有效、资源丰富、具有防治和治疗口腔溃疡、牙龈炎、牙周炎、牙龈萎缩等多种口腔疾病的新药和日用口腔护理产品奠定基础,使这一资源丰富的药用昆虫更好地为人类服务。
具体
实施例[0024] 下文详细描述本发明的实施例。应当注意的是,下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的,它们可以被相互组合和相互结合从而达到更好的技术效果。
[0025] 实施例一:蜚蠊促口腔组织修复和营养牙龈活性提取物的制备方法
[0026] 1提取:选取养殖时间为5个月以上的蜚蠊成虫,用50~60℃的热水烫死后60~70℃烘干。将蜚蠊干燥成虫粉碎至10~30目,置浸泡罐中,加5倍量体积分数为60~95%的乙醇回流提取,提取
温度控制在70~80℃,第一次提取3小时,第二、三次提取2小时,然后将提取液用孔径为200~500目的滤布过滤,收集滤液。
[0027] 2浓缩:将上述滤液减压浓缩,温度为50~70℃,浓缩至浸膏无醇味,此时相对密度为1.05~1.20,即得蜚蠊醇提物。
[0028] 3脱脂:在油水分离装置中加入流浸膏和浸膏体积量的3倍量60~75℃的热水,顺着一个方向缓慢搅拌,搅拌速度为30~50转/分钟,同时加热至65~75℃,保温1小时,静置冷却12小时,待油脂分离后放出水层,用200~500目滤布过滤,收集滤液,滤液减压浓缩,温度为55~65℃,浓缩至相对密度为1.1~1.3,即得蜚蠊脱脂提取物。
[0029] 4精制:将蜚蠊脱脂提取液上活性炭柱,并吸附2~3小时,用60%的乙醇洗脱,收集洗脱液,过滤,滤液减压浓缩,温度为60℃,浓缩至相对密度为1.10~1.30,即得本发明的蜚蠊提取物。
[0030] 活性炭为木质颗粒状活性炭,活性炭的用量为脱脂提取液的2倍量体积。
[0031] 5测定:浸膏中总肽的测定,采用Folin-酚法测定蜚蠊提取物中的总肽含量,本品含总肽以
小牛血清白蛋白计,不得少于100.0mg/g。
[0032] 5.1对照品溶液的配制小牛血清白蛋白对照品0.2g,精密称定,置100ml量瓶中,加水至刻度,摇匀。精密量取10ml,置于100ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得(每1ml含小牛血清白蛋白200μg)。
[0033] 5.2标准曲线制备精密量取对照品溶液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml于10ml量瓶中,加蒸馏水补齐至1.00ml。每管各加碱性
铜试剂(含0.5mol/L NaOH、
10%Na2CO3、0.1%NaKC4H4O6和0.05%CuSO4)1.0ml,混匀。35℃加热反应10min,冷却;再依次快速加入Folin-酚试剂4.0ml,混匀,55℃加热反应15min,冷却,加水定容,以对照品溶液0.00μg/ml浓度为空白,照紫外-可见分光光度法在760nm
波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线。
[0034] 5.3测定法取本品1.0g,精密称定,加适量蒸馏水超声溶解,用水定容至100ml,得供试品溶液。精密移取供试品溶液1.0ml,照标准曲线的制备项下的方法制备,依法测定吸光度,并用标准曲线计算出供试品溶液中总肽的含量。
[0035] 实施例二:蜚蠊促口腔组织修复和营养牙龈活性提取物的制备方法
[0036] 1提取:选取养殖时间为5个月以上的蜚蠊成虫,用50~60℃的热水烫死后60~70℃烘干。将蜚蠊干燥成虫粉碎至10~30目,置浸泡罐中,加3~5倍量60~95%的乙醇冷浸提取三次,每次浸泡时间为72小时以上,其间每间隔6~12小时搅拌一次,用孔径为200~500目的滤布过滤,合并滤液。
[0037] 2浓缩:将上述滤液减压浓缩,温度为50~70℃,浓缩至浸膏无醇味,此时相对密度为1.05~1.20,即得蜚蠊醇提物。
[0038] 3脱脂:在油水分离装置中加入流浸膏和浸膏体积量的3倍量60~75℃的热水,顺着一个方向缓慢搅拌,搅拌速度为30~50转/分钟,同时加热至65~75℃,保温1小时,静置冷却12小时,待油脂分离后放出水层,用200~500目滤布过滤,收集滤液,滤液减压浓缩,温度为50~70℃,浓缩至相对密度为1.10~1.30,得蜚蠊脱脂提取物。
[0039] 4精制:将蜚蠊脱脂提取液上活性炭柱,并吸附2~3小时,用60%的乙醇洗脱,收集洗脱液,过滤,滤液减压浓缩,温度为50~70℃,浓缩至相对密度为1.10~1.30,即得本发明的蜚蠊提取物。
[0040] 活性炭为木质颗粒状活性炭,活性炭的用量为脱脂提取液的2倍量体积。
[0041] 5测定:浸膏中总肽的测定,采用Folin-酚法测定蜚蠊提取物中的总肽含量,本品含总肽以小牛血清白蛋白计,不得少于100.0mg/g。
[0042] 5.1对照品溶液的配制小牛血清白蛋白对照品0.2g,精密称定,置100ml量瓶中,加水至刻度,摇匀。精密量取10ml,置于100ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得(每1ml含小牛血清白蛋白200μg)。
[0043] 5.2标准曲线制备精密量取对照品溶液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml于10ml量瓶中,加蒸馏水补齐至1.00ml。每管各加碱性铜试剂(含0.5mol/L NaOH、
10%Na2CO3、0.1%NaKC4H4O6和0.05%CuSO4)1.0ml,混匀。35℃加热反应10min,冷却;
再依次快速加入Folin-酚试剂4.0ml,混匀,55℃加热反应15min,冷却,加水定容,以对照品溶液0.00μg/ml浓度为空白,照紫外-可见分光光度法在760nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线。
[0044] 5.3测定法取本品1.0g,精密称定,加适量蒸馏水超声溶解,用水定容至100ml,得供试品溶液。精密移取供试品溶液1.0ml,照标准曲线的制备项下的方法制备,依法测定吸光度,并用标准曲线计算出供试品溶液中总肽的含量。
[0045] 实施例三:蜚蠊促口腔组织修复和营养牙龈活性提取物的小鼠急性毒性实验[0046] 清洁级健康昆明种小鼠,雌雄各半,于实验前一周一次性购进,体重25~30g,将140只小鼠随机分为7组,即空白对照组、正常对照组、药物组(300mg/Kg、600mg/Kg、1200mg/Kg、2400mg/Kg、5000mg/Kg),每组20只。空白对照组、正常对照组按体
质量0.2ml/10g灌胃0.9%生理盐水,药物组份别给予300mg/Kg、600mg/Kg、1200mg/Kg、2400mg/Kg、5000mg/Kg的药物混悬液,每日灌胃一次,
给药后间隔2小时进食,连续给药14天,求出受试小鼠的半数致死量LD50。
[0047] 小鼠经灌胃给药后连续观察14天未见死亡,而且生长良好,小鼠精神状态、行为活动、外观
颜色、饮食、大小便均正常,体重均有增加。处死后肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等内脏器官均无异常变化,并取肝脏组织进行病理切片,Masson
染色,在电镜
显微镜下观察各组肝组织的病理变化,各组
肝细胞大小均匀,均无变性、
坏死,肝小叶结构存在,中央静脉周围肝细胞索排列整齐的,汇管区清晰可辩,表明提取物无毒
副作用。受试小鼠LD50大于5000mg/Kg,表明受试小鼠无严重中毒的危险性,提取物无毒。测试结果见表1。
[0048] 表1蜚蠊促口腔组织修复和营养牙龈活性提取物的急性毒性实验结果
[0049]
[0050]
[0051] 实施例四:用活性
碳纯化得到的蜚蠊提取物对口腔溃疡的修复作用实验
[0052] 1、供试品溶液的配制:将用活性碳纯化得到的蜚蠊提取物用灭菌注射用水配制成200mg/ml,备用。
[0053] 2、动物实验:将普通饲养的家兔随机分为治疗组、对照组和空白组,每组8只。使用苯巴比妥钠麻醉,取
瓶口直径为1cm的容量瓶1个,内置30mL体积比为30%的
冰醋酸,瓶口以脱脂
棉堵塞,以冰醋酸润湿脱脂棉后在家兔右侧靠口
角黏膜处烧灼1分钟,生理盐水冲洗5分钟,24小时形成溃疡,形成溃疡后,每日8:00、12:00、16:00时将家兔麻醉,空白组不做治疗,治疗组使用1配制的供试品溶液,对照组使用西瓜霜喷剂,
疗程为5天,每日测量家兔溃疡面最大直径并记录。
[0054] 3、疗效判定:溃疡基本消失为治愈;溃疡最大直径缩小初始值的1/2及以上为有效;溃疡最大直径缩小初始值的1/2以下为无效。病理:疗程结束后,处死家兔,取其两侧黏膜组织进行病理学对比观察。
[0055] 4、结果分析:组疗效比较治疗至第2天时,治疗组疗效优于对照组及空白组;治疗至第5天时,治疗组及对照组疗效差异显著,且均优于空白组(P<0.05),见表2。
[0056] 表2对口腔溃疡的治疗效果比较(n=8)
[0057]
[0058]
[0059] 结论:动物实验数据表明,治疗组疗效明显优于对照组。
[0060] 实施例五:用活性碳纯化得到的蜚蠊提取物对牙周炎的治疗作用实验
[0061] 牙周炎是指发生在
牙齿支持组织的慢性感染性疾病,可引起牙周支持组织炎症、牙周袋形成、进行性附着丧失和
牙槽骨吸收,最终导致牙松动和被拔除,是我国成年人牙齿丧失的首要原因。
[0062] 1、供试品溶液的配制:将用活性碳纯化得到的蜚蠊提取物用灭菌注射用水配制成200mg/ml,备用。
[0063] 2、动物实验:将清洁级雄性SD大鼠24只,3月龄,体重180g±20g,实验中将大鼠按体重平均分为3组:正常对照组(A):不造模,不给药(8只);空白对照组(B):结扎+生理盐水灌胃组(8只);实验组(C):结扎+蜚蠊提取物灌胃组(8只);对B组及C组大鼠经1%戊巴比妥纳(4ml/kg)
腹腔注射麻醉后,随机选取一侧上下颌的第一磨牙采用用3.0丝线于实验牙
牙颈部龈缘水平结扎,并沿根尖方向压入
龈沟内,结扎后次日开始给药,蜚蠊提取物以组给药剂量为100mg/kg,连续给药6周后处死各组大鼠,取材。
[0064] 3、疗效判定:大鼠处死后分别分离双侧下颌骨,截取磨牙段,4%中性甲
醛固定,EDTA脱
钙,梯度酒精脱水,
石蜡包埋。取第一、第二磨牙近远中向切片,常规HE染色,光镜观察。A组牙龈上皮及沟内上皮规则、完整,无牙周袋形成,牙槽嵴顶未见明显吸收,牙槽嵴顶及根分叉区牙槽骨高度无明显变化。B组及C组大鼠牙间
乳头上皮均出现溃疡,坏死、上皮钉突增生,但B组炎症细胞侵润更为明显。B组及C组大鼠牙槽嵴顶均可观察到不同程度的骨吸收,高度降低,但B组根分叉区骨吸收量(179.67+16.12)明显多于C组牙槽骨吸收量(123.12+5.32),高于A组(119.34+6.24)吸收量。
[0065] 4、结果分析:研究结果显示蜚蠊提取物治疗组
牙周组织炎症反应明显轻于对照组,且牙槽骨吸收量明显少于对照组,表明蜚蠊提取物可抑制实验性牙周炎牙槽骨的吸收。
[0066] 通过上述实验,可以看出本发明对于蜚蠊有效部位的提取制备简便易行,提取制