作为双核酶强效抑制剂的二芳基烷烃
阅读：763发布：2021-03-27
专利汇可以提供作为双核酶强效抑制剂的二芳基烷烃专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 采用将酶抑制试验与化学去重复方法联合的策略以 鉴别 有活性的 植物 提取 物和那些提取物中特异性地抑制双核酶功能的特定化合物——二芳基烷 烃 和/或二芳基烷醇。本发明包括包含一种或更多种抑制特别是酪 氨 酸酶的双核酶并 预防 黑素过度生成的二芳基烷烃和/或二芳基烷醇的组合物。本发明还提供抑制特别是酪氨酸酶的双核酶活性的方法和预防及 治疗 与双核酶功能相关的 疾病 和病症。本发明还包括预防和治疗黑素过度生成和与之相关的 皮肤 疾病和病症的方法。预防和治疗与双核酶功能及黑素过度生成相关的疾病和病症的方法包括向有需要的主体 给药 有效量的包含一种或更多种合成或自一种或更多种植物分离的二芳基烷烃和/或二芳基烷醇以及药物学可接受的载体的组合物。，下面是作为双核酶强效抑制剂的二芳基烷烃专利的具体信息内容。
1.一种抑制双核酶活性的方法，所述方法包括给药有效量的包含一种或更多种二芳基烷烃的组合物。
2.如权利要求1的方法，其中所述二芳基烷烃选自具有以下结构的化合物的组中：
其中
Ar1和Ar2独立地选自由被取代的5或6元芳环或杂芳环组成的组中，其中各6元芳环或杂芳环独立地被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，并且各5元芳环或杂芳环被1-4个R′基团(R′1-R′4)取代，例外的是当Ar1和Ar2均为6元芳环即苯基时，Ar1和Ar2中至少一个被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2个不是H，其中
R′独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，
R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且n＝1至10。
3.如权利要求2的方法，其中n＝2-4。
4.如权利要求1的方法，其中所述二芳基烷烃选自由以下结构通式所代表的化合物的组中：
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，并且其中R1-R5中的至少2个或R′1-R′5中的至少2个不是H；
R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且
n＝1至10。
5.如权利要求4的方法，其中n＝2-4。
6.如权利要求1的方法，其中所述二芳基烷烃选自以下组中：1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟基-5′-甲氧基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，
4′-二羟基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羟基苯基)-丙烷、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(4′-氨基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-苯基-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，
5′-四氢-苯并(b)二oxocin-8′-基)-1-丙醇、3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯
基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-乙醇、1，4-二-(3，4-二羟基苯基)-2，3-二甲基-丁烷、1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(2′，4′-二氯苯基)-1-乙醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1，3-二(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇以及1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇。
7.如权利要求1的方法，其中所述二芳基烷烃通过有机合成获得或自一种或更多种植物分离获得。
8.如权利要求7的方法，其中所述二芳基烷烃分离自选自以下组中的植物部分：茎、茎皮、树干、树皮、桠枝、块茎、根、根皮、嫩芽、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶子及其他气生部分。
9.如权利要求7的方法，其中所述二芳基烷烃分离自选自以下组中的植物科中：菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、桑科和肉豆蔻科。
10.如权利要求7的方法，其中所述二芳基烷烃分离自选自以下组中的植物属中：金合欢属、构树属、山菅属、蜡菊属、Iryanthera、红光树属、山胡椒属、紫檀属、槲寄生属和Xanthocercis。
11.如权利要求1的方法，其中所述双核酶选自以下组中：酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、细胞色素C氧化酶、质子泵血红素-铜氧化酶、双功能一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶、核糖核苷酸还原酶、金属-β-内酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供选择的氧化酶以及细菌磷酸三酯酶。
12.如权利要求11的方法，其中所述双核酶是酪氨酸酶。
13.一种预防和治疗与双核酶有关的疾病和病症的方法，所述方法包括向有需要的主体给药有效量的包含一种或更多种二芳基烷烃的组合物。
14.如权利要求13的方法，其中所述二芳基烷烃选自具有以下结构的化合物的组中：
其中
Ar1和Ar2独立地选自由被取代的5或6元芳环或杂芳环组成的组中，其中各6元芳环或杂芳环独立地被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，并且各5元芳环或杂芳环被1-4个R′基团(R′1-R′4)取代，例外的是当Ar1和Ar2均为6元芳环即苯基时，Ar1和Ar2中至少一个被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2个不是H，其中
R′独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，
R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且n＝1至10。
15.如权利要求14的方法，其中n＝2-4。
16.如权利要求13的方法，其中所述二芳基烷烃选自由以下结构通式所代表的化合物的组中：
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，并且其中R1-R5中的至少2个或R′1-R′5中的至少2个不是H；
R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且
n＝1至10。
17.如权利要求14的方法，其中n＝2-4。
18.如权利要求13的方法，其中所述二芳基烷烃选自以下组中：1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟基-5′-甲氧基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯
基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羟基苯基)-丙烷、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(4′-氨基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-苯基-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，
5′-四氢-苯并(b)二oxocin-8′-基)-1-丙醇、3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯
基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-乙醇、1，4-二-(3，4-二羟基苯基)-2，3-二甲基-丁烷、1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(2′，4′-二氯苯基)-1-乙醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1，3-二(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇以及1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇。
19.如权利要求13的方法，其中所述二芳基烷烃通过有机合成获得或自一种或更多种植物分离获得。
20.如权利要求19的方法，其中所述二芳基烷烃分离自选自以下组中的植物部分：茎、茎皮、树干、树皮、桠枝、块茎、根、根皮、嫩芽、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶子及其他气生部分。
21.如权利要求19的方法，其中所述二芳基烷烃分离自选自以下组中的植物科中：菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、桑科和肉豆蔻科。
22.如权利要求19的方法，其中所述二芳基烷烃分离自选自以下组中的植物属中：
金合欢属、构树属、山菅属、蜡菊属、Iryanthera、红光树属、山胡椒属、紫檀属、槲寄生属和Xanthocercis。
23.如权利要求13的方法，其中所述双核酶选自以下组中：酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、细胞色素C氧化酶、质子泵血红素-铜氧化酶、、双功能的-氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶、核糖核苷酸还原酶、金属-β-内酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供选择的氧化酶以及细菌磷酸三酯酶。
24.如权利要求13的方法，其中所述组合物以选自0.01到200mg/kg主体体重的剂量给药。
25.如权利要求13的方法，其中所述组合物以选自基于治疗制剂总重量的0.001％到
100％的剂量给药。
26.如权利要求13的方法，其中所述组合物以包含0.001重量百分比(wt％)到
99.9wt％的二芳基烷烃或二芳基烷烃在药物学、皮肤学或美容学可接受的载体内的混和物的药物学、皮肤学或美容学制剂给药。
27.如权利要求13的方法，其中所述给药途径选自以下组中：局部、气雾剂、栓剂、皮内、肌内和静脉内给药。
28.如权利要求27的方法，其中使用无粘性纱布、绷带、药签、布拭子、贴剂、面膜、防护剂、清洁剂、牙线材料(dental flossing material)、防腐剂、溶液、乳膏、洗液、软膏剂、凝胶剂或乳剂、液体、牙膏、漱口液、美容糊剂(cosmetic paste)、肥皂或散剂给药所述组合物。
29.如权利要求13的方法，其中所述组合物还包括药物学、皮肤学和美容学适宜局部施用的常规赋形剂和任选的佐剂、和/或载体、和/或常规(regular)或控释载体。
30.如权利要求13的方法，其中所述由双核酶介导的疾病或病症选自以下组中：细菌感染、真菌感染、疟疾传染、病毒感染、一氧化氮生成减少、男性及女性性唤起异常、炎症、氧化应激、药物代谢异常、癌和实体瘤。
31.如权利要求13的方法，其中所述由双核酶介导的疾病或病症选自以下组中：牙周病、口腔癌前期症状、口腔癌、和其他口腔恶性肿瘤、牙龈和牙齿过敏、后遗症、牙髓炎、发炎，由口部假牙物理植入、创伤、损伤、夜磨牙症及其他口内、牙龈或舌上的轻伤所引起的疼痛和炎症，牙菌斑和牙垢、牙齿脱钙、蛋白酶解作用和龋齿(腐蚀)。
32.一种预防和治疗与黑素过度产生或分布不均有关的疾病和病症的方法，所述方法包括向有需要的主体内部或局部给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃。
33.如权利要求32的方法，其中所述与黑素过度产生分布不均有关的疾病和病症选自以下组中：暴露于紫外线导致的皮肤变黑和损伤，晒黑，由皮肤老化、肝病、热灼伤和局部创口导致的色素沉着过度，归因于由真菌、细菌和病毒感染导致的炎症的皮肤色素沉着，白癜风、癌和黑素瘤。
34.一种递送金属离子的方法，所述方法包括向有需要的主体给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃以及要被递送的金属离子。
35.如权利要求34的方法，其中所述金属离子选自以下组中：铜、铁、锌、硼、锂、硒、钙、铬、钼、镁、以及锰。
36.如权利要求34的方法，其中所述金属离子穿过膜或通过皮肤被递送至血流。
37.如权利要求34的方法，其中所述膜是血/脑屏障。
38.如权利要求34的方法，其中给药所述金属以治疗选自以下组中的疾病或病症：贫血及其他铁缺乏、炎症；肥胖和糖尿病、病毒感染、失眠、免疫功能抑制、骨质疏松症、闭经、痛经、癫痫症、高血压、胆固醇血症、冠状和脑血管痉挛、腹泻、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癌、类风湿性关节炎、牙周病、口腔癌前期症状、口腔癌、及其他口腔恶性肿瘤、牙龈和牙齿过敏、后遗症、牙髓炎、发炎、由口部假牙物理植入、创伤、损伤、夜磨牙症及其他口内、牙龈或舌上的微创口所引起的疼痛和炎症、牙菌斑和牙垢、牙齿脱钙、蛋白酶解作用和龋齿(腐蚀)、男性不育症和黄斑变性。
39.选自具有以下通式的化合物组中的二芳基烷烃：
其中
Ar1和Ar2独立地选自由被取代的5或6元芳环或杂芳环组成的组中，其中各6元芳环或杂芳环独立地被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，并且各5元芳环或杂芳环被1-4个R′基团(R′1-R′4)取代，例外的是当Ar1和Ar2均为6元芳环即苯基时，Ar1和Ar2中至少一个被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2个不是H，其中
R′独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，
R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且n＝1至10。
40.如权利要求39的二芳基烷烃，其中n＝2-4。
41.选自具有以下通式结构的化合物组中的二芳基烷烃：
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，并且其中R1-R5中的至少2个或R′1-R′5中的至少2个不是H；
R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且
n＝1至10。
42.如权利要求41的二芳基烷烃，其中n＝2-4。
43.如权利要求41的二芳基烷烃，其中R6和/或R7中至少一个为OH基团。
44.选自以下组中的二芳基烷烃：1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟基-5′-甲氧基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷、
1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羟基苯基)-丙烷、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(4′-氨基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-苯基-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氢-苯并(b)二oxocin-8′-基)-1-丙醇、
3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇、
1-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-2-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-乙醇、1，4-二-(3，4-二羟基苯基)-2，3-二甲基-丁烷、1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，
4-二羟基苯基)-2-(2′，4′-二氯苯基)-1-乙醇、1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1，3-二(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇、1-(2，4，
6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇以及1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇。
45.一种合成二芳基烷烃的方法，所述方法包括还原具有以下通式结构的化合物：
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，并且其中R1-R5中的至少2个或R′1-R′5中的至少2个不是H；
R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中一个或更多个R6和R7一同形成＝O，R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；
并且
n＝1至10。
46.如权利要求41的方法，其中所述二芳基烷烃通过有机合成获得或自一种或更多种植物分离获得。
47.如权利要求41的方法，其中用选自硼氢化物、催化剂存在下的H2、NaH和LiAlH4的还原剂还原被取代的二芳基烷酮获得所述二芳基烷烃。
作为双核酶强效抑制剂的二芳基烷烃
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求于2004年5月28日提交的第60/575,599号、标题为“作为双核酶强效抑制剂的二芳基烷烃”的美国临时申请的利益，该临时申请全文并入此处作为参考。
技术领域
[0004] 本发明大体而言涉及对由双核酶介导的疾病及病症的预防和治疗。具体而言，本发明包括抑制具有双核活性部位的酶的活性的方法。本发明包括包含一种或更多种二芳基烷烃的新型组合物。本发明的二芳基烷烃可从一种或更多种植物来源分离，或者可通过有机合成获得。本发明还包括从天然来源分离这些化合物的方法以及合成这些化合物的方法。在一个具体实施方案中，所述二芳基烷烃是通过合成修饰从植物来源分离的天然存在的化合物得到的。
背景技术
[0005] 对可抑制或预防皮肤色素过度沉着的产品存在很大的需求。皮肤的天然色素黑素是在黑素体内合成的含氮聚合物，黑素体是存在于黑素细胞内的与膜结合的细胞器。黑素产生的浓度因皮肤类型(遗传倾向(genetic disposition))和环境条件而异。黑素细胞是存在于表皮基底膜内的细胞，并且占细胞内容物的5％至10％(每cm2约1200-1500个黑素细胞)。当被如紫外线(UV)的因素刺激时，黑素细胞更快速地分裂，从而产生更大量的黑素。然后黑素在成熟的黑素体内被转运至表皮内的角质形成细胞，于此其显示为棕色肤色。
[0006] 人类皮肤中黑素细胞的数目与肤色无关，大体上相同。肤色主要取决于产生的黑素的数量和类型(黑色的真黑素或黄色到红褐色的褐黑素)。亚洲人和浅肤色人(light-skinned people)的真黑素水平相对深肤色人(dark-skinned people)较低，并且相应地对照射作用的防护较少。具有红发的人特征在于褐黑素沉着，并且几乎没有或完全没有对光的保护。此外，黑素在皮肤中的分布也不同。在浅肤色人中，更多数的色素存在于基底层，然而在深肤色的人中，黑素则是四处扩散，进入角质层。
[0007] 黑素的过度生成可导致肤色、毛发色不同类型的异常以及其他皮肤疾病和病症。与皮肤色素沉着病症有关的症状主要有两种。包括由UV暴露和老化导致的黑素异常增加的皮肤变黑；以及皮肤色素异常分布导致的老年斑、肝斑和药物及伤口/疾病诱导的色素沉着过度(Seiberg等(2000)J.Invest.Dermatol.115：162；Paine等(2001)J.Invest.Dermatol.116：587)。
[0008] 黑素生成(黑素的产生)的调节剂可被设计或选择为以如图1所示的各种途径起作用。参见图1，它们可在黑素合成之前直接起调节黑素体结构和功能的作用、它们可通过抑制如黑素合成涉及的酪氨酸酶的酶的生成或功能起作用、它们可改变真黑素/褐黑素的比例或者它们可通过负责将黑素体从黑素细胞转运到角质形成细胞的制动机构(dampingmechanism)起作用。(Briganti等(2003)Pigment Cell Research16：101-110)。
[0009] 酪氨酸酶是产生黑素的关键酶。它催化三个反应：使酪氨酸羟基化以生成3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)、氧化DOPA生成DOPA醌以及氧化DHI(5，6-二羟基吲哚生成吲哚醌(Hearing等(1991)FASEB 53：515)。已经确定酪氨酸酶的催化活性需要底物和二价金属离子。目前旨在用于美白(lightening)皮肤的抑制黑素合成的方法主要基于能够通过直接与酪氨酸酶本身相互作用或者如通过络合必需的金属离子而间接地抑制酪氨酸酶活性的物质。
[0010] 酪氨酸酶属于3型铜蛋白家族，在它们的活性部位包含两个铜离子。对酪氨酸酶活性部位结构的研究揭示，如图2所示，两个铜离子间距接近，并且各离子通过组氨酸侧链N-ε氮原子与三个组氨酸配位。(Pfiffner和Lerch(1981)Biochem.20：6029；Cuff等(1998)J.Mol.Biol.278：855)。双核铜离子可以三种主要的氧化还原形式存在：Cu′-Cu′2+
还原形式、可逆地结合O2作为过氧化物的Cu″-O2-Cu″形式以及其中Cu 离子通常通过小配体(small ligand)桥联的酶的休眠形式(resting form)。已确定Cu″-O2-Cu″氧化还原态是酪氨酸酶酶活性的关键。这种状态下，酪氨酸酶催化将第二个羟基引入一元酚(如酪氨酸)邻位的反应，该反应是黑素生物合成的关键。
还原形式、可逆地结合O2作为过氧化物的Cu″-O2-Cu″形式以及其中Cu 离子通常通过小配体(small ligand)桥联的酶的休眠形式(resting form)。已确定Cu″-O2-Cu″氧化还原态是酪氨酸酶酶活性的关键。这种状态下，酪氨酸酶催化将第二个羟基引入一元酚(如酪氨酸)邻位的反应，该反应是黑素生物合成的关键。
[0011] 能干扰在酪氨酸酶活性部位一元酚的接近、形成配体或氧化的任何化合物将成为酪氨酸酶的有效的抑制剂，而可能导致黑素生成减少和美白肤色。一般而言，酪氨酸活性部位的铜离子可易于同氧、氮、硫和卤素的孤对电子螯合(Weder等(1999)Inorg.Chem.38：1736)。图3图解了若干已知的酪氨酸抑制剂的结构和作用机制(Briganti等(2003)
PigmentCell Research 16：101-110；Seo等(2003)J.Agric.Food Chem.51：2837)。
PigmentCell Research 16：101-110；Seo等(2003)J.Agric.Food Chem.51：2837)。
[0012] 参考图3可见，具有类似于3，4-二羟苯丙氨酸(DOPA)结构的化合物如氢醌既可抑制酪氨酸酶还是黑素细胞溶解剂(melanocytolyticagents)。(第5,523,077号美国专利)。例如，从常见的熊果、Uvae ursi分离出的熊果苷是天然存在的氢醌的β-吡喃葡萄糖苷，其抑制酪氨酸酶并影响黑素在人类黑素细胞内的合成。(Chakraborty等(1998)PigmentCell Res.11：206；第5,980,904号美国专利)。熊果苷的作用机制包括与L-酪氨酸或L-多巴竞争结合酪氨酸酶的活性部位。其并不抑制蛋白质的表达或合成。(Maeda和Fukuda(1996)J.Pharmacol，Exp.276：765)。合成的熊果苷类化合物同样有力地抑制人的酪氨酸酶。(Sugimoto等(2003)Chem.Pharm.Bull.51：798)。Kinobeon A是从红花(Carthamus tinctoriusL.)的培养细胞中分离的新型二醌类化合物，其具有强于曲酸的酪氨酸酶抑制活性(Kanehira等(2003)Planta Med.69：457)。若长时间或以高浓度施用，氢醌可能有严重的副作用。此外，氢醌可导致永久性色素脱失作用，因此当暴露于UV光下时增加皮肤的光敏感性(photosensitivity)。
[0013] 目前使用的具有较好耐受性的皮肤美白物质是天然来源的物质。例如，曲酸是源于包含某种细菌的糖溶液的天然羟基-γ-吡喃酮。参考图3可见曲酸是被氧化的邻二羟基酚。已知曲酸可与特别是Gu″的金属离子形成强的螯合物。(Gerard和Hugel(1975)Bull.Soc.Chim.Fr.42：2404)。其是强竞争剂，却是酪氨酸酶的缓慢结合抑制剂。(Cabanes等(1994)J.Pharm.Phamacol.46：982)。最近研究表明，曲酸的作用为桥联配体，牢固地与二铜(II)络合物和二铜-二氧加合物结合，从而预防儿茶酚底物与酶结合。(Battaini等(2000)JBIC 5：262)。曲酸及其酯作为皮肤美白剂的应用已申请专利。(参见第4,369,174、4,771060、5,824,327、5,427,775以及4,990,330号美国专利)。
[0014] 类黄酮是另一类已报道为酪氨酸酶抑制剂的天然产物(Shimizu等(2000)Planta Med.66：11；Xie等(2003)Biochem.68：487)。活性酪氨酸酶抑制剂包括黄酮(Likhitwitayawuid等(2000)Planta Med.66：275)、黄酮醇(Kubo和Kinst-Hori(1999)J.Agric.Food Chem.47：4121)、异 戊 二 烯 化(prenylnated) 类 黄 酮(Kuniyoshi等(2002)Planta Med.68：79；Son 等 (2003)Planta Med.69：559；Kim 等 (2003)Biol.Pharm.Bull.26：1348)、 黄 烷 (No 等 (1999)Life Sci.65：PL241；Kim 等 (2004)Biomacromolecules5：474) 以 及 二 氢 查 耳 酮(Shoji等 (1997)Biosci.Biotechnol.Biochem.61：1963)。
[0015] 其他类的酪氨酸酶抑制剂包括酚衍生物(Sakuma等(1999)Arch.Pharm.Res.22：335；Kerry 和 Rice Evans(1999)J.Neurochem.73：247；Battaini 等 (2002)J.Biol.Chem.277：44606)、苯 甲 醛 (Kubo 和 Kinst-Hori(1999Plant Medica 65：19；Chen 等(2003)J.Enzyme Inhib.Med.Chem.18：491；Nihei 等 (2004)Bioorg.Med.Chem.14：681)、苯甲酸衍生物(Curto等(1999)Biochem Pharmacol.57：663；Chen等(2003)J.Protein Chem.22：607；Miyazawa 等 (2003)J.Agric.Food Chem.51：9653；Kubo 等 (2003)Z.Naturforsch[C]58：713)、铜 铁 试 剂(Xie等 (2003)Int.J.Biochem.Cell Biol.35：
1658)、源自甘草(Glycyrrhiza uralensis)根的苯并二吡喃(Yokota等(1998)Pigment Cell Res.11：335)、巯基化合物(Park等(2003)J.Protein Chem.22：613)、萜类(Oh等(2002)Planta Med.68：832)、以 及 oxazolodinethione(Seo等 (1999)Planta Med 65：
683)。最有效的已知天然酪氨酸酶抑制剂是均二苯代乙烯类(IC50＝0.3-5μM)(Shin等(1998)Biochem Biophys.Res.Commun.243：801；Ohguchi 等 (2003)Biosci.Biotechnol.Biochem.67：1587)、均二苯代乙烯苷类(Iida等(1995)PlantaMed.61：425)以及4-取代的间苯二酚(Shimizu等(2000)Planta Med.66：11)。
1658)、源自甘草(Glycyrrhiza uralensis)根的苯并二吡喃(Yokota等(1998)Pigment Cell Res.11：335)、巯基化合物(Park等(2003)J.Protein Chem.22：613)、萜类(Oh等(2002)Planta Med.68：832)、以 及 oxazolodinethione(Seo等 (1999)Planta Med 65：
683)。最有效的已知天然酪氨酸酶抑制剂是均二苯代乙烯类(IC50＝0.3-5μM)(Shin等(1998)Biochem Biophys.Res.Commun.243：801；Ohguchi 等 (2003)Biosci.Biotechnol.Biochem.67：1587)、均二苯代乙烯苷类(Iida等(1995)PlantaMed.61：425)以及4-取代的间苯二酚(Shimizu等(2000)Planta Med.66：11)。
[0016] 对4-取代的间苯二酚的结构/活性研究显示，疏水性且体积较小的取代基如-CH2C6H5和烷基即-CH2CH2CH3具有IC50小于10μM的最大效力(Shimizu等(2000)Planta Med.66：11)。4-取代的间苯二酚的作用机制已被表征为缓慢结合地竞争性抑制DL-β-(3，
4-二羟基苯基)丙氨酸(DL-多巴)的氧化(Jimenez和Garcia-Carmona(1997)J.Agric.
Food Chem.45：2061)，而并没有进一步了解到对双核铜离子的金属螯合效应。
4-二羟基苯基)丙氨酸(DL-多巴)的氧化(Jimenez和Garcia-Carmona(1997)J.Agric.
Food Chem.45：2061)，而并没有进一步了解到对双核铜离子的金属螯合效应。
[0017] 百合科的芦荟是包含许多生物活性物质的复杂植物(Cohen等(1992)WoundHealing/Biochemical and Clinical Aspects，1st ed.W B Saunders，Philadelphia)。在
360种已知的芦荟物种中，大部分土生于非洲。历史上，芦荟产品已经被用于治疗灼伤、疮及其他创口的皮肤学的应用。这些应用已经激发许多鉴别源自芦荟植物的具有临床活性的化合物的研究。(参见，如Grindlay和Reynolds(1986)J.of Ethnopharmacology 16：
117-151；Hart等(1988)J.of Ethnopharmacology 23：61-71)。
360种已知的芦荟物种中，大部分土生于非洲。历史上，芦荟产品已经被用于治疗灼伤、疮及其他创口的皮肤学的应用。这些应用已经激发许多鉴别源自芦荟植物的具有临床活性的化合物的研究。(参见，如Grindlay和Reynolds(1986)J.of Ethnopharmacology 16：
117-151；Hart等(1988)J.of Ethnopharmacology 23：61-71)。
[0018] Yagi等公开一组从芦荟中分离得到的化合物，特别是芦荟苦素和其衍生物″-O-阿魏酰芦荟苦素，它们是酪氨酸酶的有效抑制剂。(Yagi等(1987)Plant
Medica 515-517；Yagi等(1977)Z.Namrforsch 32c：731-734)。芦荟苦素，C-葡糖基化(glucosylated)的5-甲基色酮以剂量依赖性方式抑制人的酪氨酸酶羟化酶活性，IC50为
0.92mM，并且以剂量依赖性方式抑制DOPA氧化酶活性，IC50为0.70mM，与曲酸IC50＝0.41mM和熊果苷IC50＝3.02mM相当。使用B16F1鼠黑素瘤细胞的基于细胞的试验证实了芦荟苦素对酪氨酸酶酶活性及随后黑素形成的抑制。芦荟苦素(IC50＝0.167mM)以剂量依赖性方式抑制黑素的生物合成。(Jones等(2002)Pigment.Cell Res.15：335)。推测芦荟色酮抑制酪氨酸酶的作用机制与铜离子的还原有关。天然的(第6,451,357号美国专利)、半合成的(第5,801256、6,083976号美国专利)以及经芦荟色酮制剂(第6,123,959号美国专利)均已就其美白皮肤的能力申请专利。
Medica 515-517；Yagi等(1977)Z.Namrforsch 32c：731-734)。芦荟苦素，C-葡糖基化(glucosylated)的5-甲基色酮以剂量依赖性方式抑制人的酪氨酸酶羟化酶活性，IC50为
0.92mM，并且以剂量依赖性方式抑制DOPA氧化酶活性，IC50为0.70mM，与曲酸IC50＝0.41mM和熊果苷IC50＝3.02mM相当。使用B16F1鼠黑素瘤细胞的基于细胞的试验证实了芦荟苦素对酪氨酸酶酶活性及随后黑素形成的抑制。芦荟苦素(IC50＝0.167mM)以剂量依赖性方式抑制黑素的生物合成。(Jones等(2002)Pigment.Cell Res.15：335)。推测芦荟色酮抑制酪氨酸酶的作用机制与铜离子的还原有关。天然的(第6,451,357号美国专利)、半合成的(第5,801256、6,083976号美国专利)以及经芦荟色酮制剂(第6,123,959号美国专利)均已就其美白皮肤的能力申请专利。
[0019] 抗坏血酸(合成或源自如柑橘类水果的天然来源的维生素C)及其衍生物也被用于美白皮肤。大多数情况下，将维生素C同曲酸或其它的酪氨酸酶抑制剂配制(第4,919921、6,458,379和5,916,915号美国专利)。其它已报道的皮肤美白化合物包括橄榄植物提取物(第6,682,763号美国专利)、不饱和长链脂肪酸(第6,669,932号美国专利)、姜黄色素(第6,641,845号美国专利)、酶提取物(第6,514,506号美国专利)、拟雌内酯(coumestrol)(第6,503,941号美国专利)、羟基羧酸(第6,417,226、6,365,137、
5,609,875、5,262,153号美国专利)、β-葡聚糖(US#6,251,877)、芦荟色酮(第6,083,976号美国专利)、苯丙氨酸化合物(第5,767,158号美国专利)、芦丁(第5,145,782号美国专利)、escinol(第5,728,683号美国专利)、水杨酸(第5,700,784号美国专利)、血管生成素(第5,698,185号美国专利)、巯基葡聚糖(mercaptodextran)(第6,077,503号美国专利)、鞣花酸(第6,066,312号美国专利)、次膦酸(第6,280,715号美国专利)、含硼化合物(第5,993,835号美国专利)、植物提取物(源自葛根，第6,352,685号美国专利；桑属，第6,197,304、6,066,312、和5,872,254号美国专利；acerola cherry fermentate，第
5,747,006号美国专利；呋喃酮，第5,602,256号美国专利；以及其他，第5,773,014号美国专利)。
5,609,875、5,262,153号美国专利)、β-葡聚糖(US#6,251,877)、芦荟色酮(第6,083,976号美国专利)、苯丙氨酸化合物(第5,767,158号美国专利)、芦丁(第5,145,782号美国专利)、escinol(第5,728,683号美国专利)、水杨酸(第5,700,784号美国专利)、血管生成素(第5,698,185号美国专利)、巯基葡聚糖(mercaptodextran)(第6,077,503号美国专利)、鞣花酸(第6,066,312号美国专利)、次膦酸(第6,280,715号美国专利)、含硼化合物(第5,993,835号美国专利)、植物提取物(源自葛根，第6,352,685号美国专利；桑属，第6,197,304、6,066,312、和5,872,254号美国专利；acerola cherry fermentate，第
5,747,006号美国专利；呋喃酮，第5,602,256号美国专利；以及其他，第5,773,014号美国专利)。
[0020] 二芳基烷烃是一种稀少的天然产物。迄今为止，CD-ROM上的theDictionary of Natural Products(Chapman & Hall/CRC，版本12：2004年1月2日)所列的天然化合物超过179,000种，其中只有82种是二芳基丙烷(n＝3)。构树(Broussonetia papyrifera)是桑科的落叶树，已经仅从这类植物就分离出超过20种二芳基丙烷。(Keto等(1986)Chem.Pharm.Bull.34：2448；Ikuta 等 (1986)Chem.Pharm.Bull.34：1968；Takasugi 等 (1984)Chem.Lett.689；Gonzalez等(1993)Phytochem.32：433)。对构树提取物的在生物鉴定指导下的分级分离得到四种不具有芳香酶抑制活性的二芳基丙烷(Lee等(2001)J.Nat.Prod.64：1286)。然而，从同一植物分离的异戊二烯化二芳基丙烷却显示对若干癌细胞系的细胞毒性(Ko等(1999)J.Nat.Prod.62：164)以及broussonin A显示出抗真菌活性(Lida等(1999)Yakugaku Zasshi.119：964)。
[0021] 还从Iryanthera种(肉豆蔻科)分离出许多二芳基烷烃。(Alvea等(1975)Phytochem.14：2832；de Almeida 等 (1979)Phytochem.18：1015；Braz 等 (1980)Phytochem.19：1195；Diaz等(1986)Phytochem.25：2395)。从Iryanthera lancifolia分离的四种二氢查耳酮显示出抗氧化活性(Silva等(1999)J.Nat.Prod.62：1475)。还从肉豆蔻科的Virola种分离出许多二芳基丙烷。(Braz等(1976)Phytochem.15：567；Hagos等 (1987)Plant Med.53：57；Gonzalez 等 (1993)Phytochem.32：433；Kijjoa 等 (1981)Phytochem.20：1385；Talukdar等(2000)Phytochem.53：155)。
[0022] 其他从天然来源分离的二芳基丙烷包括那些源自花榈木(Pterocarpatsmarsupium)(Fabaceae)(Rao 等 (1984)Phytochem.23：897；Maurya 等 (1985)J.Nat.Prod.48：313)、Lindera umbellate( 樟 科 )(Morimoto 等 (1985)Chem.Pharm.Bull.33：
2281)、Helichrysum mundii( 菊 科 )(Bohlmann 等 (1978)Phytochem.17：1935)、Viscum angulatum(桑寄生科)(Lin等(2002)J.Nat.Prod.65：638)、那些源自Acacia tortilis(豆科)的具有平滑肌松弛作用的(Hagos等(1987)Planta Med.53：27)、
Xanthocercis zambesiaca(豆科)(Bezuidenhout等(1988)Phytochem.27：2329)、和源自Knema glomerata(肉豆蔻科)的细胞毒性化合物(Zeng等(1994)J.Nat.Prod.57：376)。
2281)、Helichrysum mundii( 菊 科 )(Bohlmann 等 (1978)Phytochem.17：1935)、Viscum angulatum(桑寄生科)(Lin等(2002)J.Nat.Prod.65：638)、那些源自Acacia tortilis(豆科)的具有平滑肌松弛作用的(Hagos等(1987)Planta Med.53：27)、
Xanthocercis zambesiaca(豆科)(Bezuidenhout等(1988)Phytochem.27：2329)、和源自Knema glomerata(肉豆蔻科)的细胞毒性化合物(Zeng等(1994)J.Nat.Prod.57：376)。
[0023] 第JP05213729A号日本专利教导将合成的二氢查耳酮作为黑素抑制剂应用以治疗皮肤炎症、色斑、雀斑和阳光晒伤导致的色素沉着。所要求保护的化合物具有下列通式结构：
[0024]
[0025] 其中X选自H、OH或＝O；R是H或Me；以及R1-R5独立地选自H、OR和NH2。因此，所公开的二氢查耳酮包含在一个苯基环上的单个羟基/甲氧基取代基以及在第二个环上1 5
的5个非特定取代基(R-R)。未测定任何所要求保护的组合物的酶抑制作用，而是测定了在UV刺激后经培养的皮肤细胞产生的黑素的量以及动物皮肤的颜色变化。在本发明中，合成了JP05213729A所公开的一种化合物1-(4-羟基苯基)-3-(4′-羟基苯基)-1-丙醇并测定了其抑制酪氨酸酶的能力。该化合物仅显示出对酪氨酸酶的中等抑制作用(IC50＝
305μM，表2)。本发明教导了具有其中两个芳环Ar1或Ar2中的至少一个被1-5个R′基团(R1′-R5′)取代并且其中所述R1′-R5′中的至少两个不是H)的独特的取代模式的新型的二芳基烷烃。这些化合物显示出出人意料的抑制酪氨酸酶活性的能力，比JP05213729所教导的化合物高4-600倍。据信，迄今为止没有任何关于任意的本发明所教导的这些化合物的报道发表。
的5个非特定取代基(R-R)。未测定任何所要求保护的组合物的酶抑制作用，而是测定了在UV刺激后经培养的皮肤细胞产生的黑素的量以及动物皮肤的颜色变化。在本发明中，合成了JP05213729A所公开的一种化合物1-(4-羟基苯基)-3-(4′-羟基苯基)-1-丙醇并测定了其抑制酪氨酸酶的能力。该化合物仅显示出对酪氨酸酶的中等抑制作用(IC50＝
305μM，表2)。本发明教导了具有其中两个芳环Ar1或Ar2中的至少一个被1-5个R′基团(R1′-R5′)取代并且其中所述R1′-R5′中的至少两个不是H)的独特的取代模式的新型的二芳基烷烃。这些化合物显示出出人意料的抑制酪氨酸酶活性的能力，比JP05213729所教导的化合物高4-600倍。据信，迄今为止没有任何关于任意的本发明所教导的这些化合物的报道发表。
发明内容
[0026] 本发明包括抑制本文称之为双核酶的具有双核活性部位的酶的活性的方法，所述方法包括向有需要的主体给药有效量的一种或更多种二芳基烷烃，其中所述二芳基烷烃是合成的和/或从一种或更多种植物分离的。包括在本发明范围内的双核酶的实例包括但不限于酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、细胞色素C氧化酶、质子泵血红素-铜氧化酶、双功能的一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶、核糖核苷酸还原酶、金属-β-内酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供选择的氧化酶以及细菌磷酸三酯酶。在一个具体实施方案中，所述双核酶是酪氨酸酶。
[0027] 本发明还包括预防和治疗与双核酶活性有关的疾病和病症的方法。本发明的预防和治疗方法包括向有需要的主体内部(internally)或局部给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃。根据受抑制的双核酶，二芳基烷烃可用作为抗菌剂、抗真菌剂、抗疟药或抗病毒剂、作为控制男性和女性性唤起(sexual arousal)的手段的一氧化氮生成的调节剂、抗炎药、抗氧化剂、药物代谢的调节剂和癌及实体瘤的生长抑制剂。二芳基烷烃还可用于预防和治疗牙周病、口腔癌前期症状、口腔癌及其他口腔恶性肿瘤、牙龈和牙齿过敏、后遗症(sequelae)、牙髓炎、发炎(irritation)，由口部假牙物理植入、创伤、损伤、夜磨牙症及其他口内、牙龈或舌上的微创口所引起的疼痛和炎症，牙菌斑和牙垢、牙齿脱钙、蛋白酶解作用和龋齿(腐蚀)。
[0028] 本发明还包括预防和治疗与黑素过度产生或分布不均有关的疾病和病症的方法，所述方法包括向有需要的主体内部或局部给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃。与黑素过度产生或分布不均有关的疾病和病症包括但不限于晒黑，由皮肤老化、肝病、热灼伤和局部创口导致的色素沉着过度，归因于由真菌、细菌和病毒感染引起的炎症的皮肤色素沉着、白癜风(vitilago)、癌、黑素瘤以及其他哺乳动物的皮肤疾病。
[0029] 该方法还可用于预防和治疗由于暴露于紫外线(UV)照射、化学试剂、热、风和干燥环境导致的皮肤变黑和损伤。最后，该方法可用于预防和治疗皱纹、皮肤松弛、眼纹和黑眼圈、缓和敏感性皮肤以及预防和治疗皮炎及其他与过敏相关的皮肤疾病。此处所述治疗组分除了可用于预防和治疗上述皮肤疾病和病症外，还可提供一种有效的组合物，其具有可提供肤色改善、弹性增加、衰老减轻和延缓、年轻的外表和纹理改善以及柔韧性、紧绷度(firmness)、光滑和柔度增强的光滑及年轻的皮肤外观的益处。
[0030] 通过与金属离子螯合，二芳基烷烃还可用于递送必需的金属离子至主体的血流、和/或携带金属离子穿过皮肤或血/脑屏障以及其他膜。在该具体实施方案中，所述方法包括向有需要的主体给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃以及要被递送的金属离子。鉴于二芳基烷烃的这种能力，其可用于治疗的疾病和病症包括但不限于：贫血及其他铁缺乏、炎症；肥胖和糖尿病、牙周病、口腔癌前期症状、口腔癌、及其他口腔恶性肿瘤、牙龈和牙齿过敏、后遗症、牙髓炎、发炎，由口部假牙物理植入、创伤、损伤、夜磨牙症及其他口内、牙龈或舌上的微创口所引起的疼痛和炎症，牙菌斑和牙垢、牙齿脱钙、蛋白酶解作用和龋齿(腐蚀)、病毒感染、失眠、免疫功能抑制、骨质疏松症、闭经、痛经、癫痫症、高血压、胆固醇血症(cholesterolemea)、冠状和脑血管痉挛、腹泻、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癌、类风湿性关节炎、男性不育症和黄斑变性。所述金属离子选自包括但不限于以下组中：铜、铬、铁、锌、硼、锂、硒、钙、锰、镁、钼及其他金属离子。
[0031] 在另一个具体实施方案中，二烷基烷烃和二烷基烷醇可用于食品工业以预防水果、蘑菇及其他食品褐变(browning)和变色。
[0032] 本发明还包括包含一种或更多种二芳基烷烃的新型组合物，其中所述二芳基烷烃选自由以下通式结构所代表的化合物的组中：
[0033]
[0034] 其中
[0035] Ar1和Ar2独立地选自由被取代的5或6元芳环或杂芳环组成的组中，其中各6元芳环或杂芳环独立地被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，并且各5元芳环或杂芳环被1-4个R′基团(R′1-R′4)取代，例外的是当Ar1和Ar2均为6元芳环即苯基时，Ar1和Ar2中至少一个被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2个不是H，[0036] 其中
[0037] R′独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，
[0038] R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且n＝1至10。在一个优选的具体实施方案中n＝2-4。
[0039] 在一个具体实施方案中，所述二芳基烷烃选自由以下通式结构所代表的化合物的组中：
[0040]
[0041] 其中
[0042] R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，并且其中R1-R5中的至少2个或R′1-R′5中的至少2个不是H；
[0043] R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且n＝1至10。在一个优选的具体实施方案中n＝2-4。
[0044] 在一个具体实施方案中，本发明的二芳基烷烃分离自选自包括但不限于菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、桑科和肉豆蔻科的植物科中。本发明的二芳基烷烃还可以提取、富集和纯化自包括但不限于金合欢属、构树属、蜡菊属、山菅属、Iryanthera、红光树属、山胡椒属、紫檀属、槲寄生属和Xanthocercis的高等植物属中。二芳基烷烃可存在于植物的不同部分，包括但不限于茎、茎皮、芯材、树干、树干皮、桠枝、块茎、根、根皮、嫩芽、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶子及其他气生部分。在一个优选的具体实施方案中，二芳基烷烃分离自构树属、山菅属和Iryanthera属的一种或更多种植物中。
[0045] 在另一个具体实施方案中，通过合成的方法获得本发明的二芳基烷烃。本发明包括合成二芳基烷烃和二芳基烷醇的方法，所述方法包括还原具有以下通式结构的化合物：
[0046]
[0047] 其中
[0048] R1-R5和R′1-R′5及n如上所定义，并且其中R6和R7一同构成一个或更多个羰基。还原剂可选自任何用于将酮还原为醇的已知还原剂，包括但不限于硼氢化物、催化剂存在下的H2、NaH和LiAIH4。在一个具体实施方案中，还原剂是NaBH4。
[0049] 在另一个具体实施方案中，所述二芳基烷烃是通过合成修饰从植物来源分离的天然存在的化合物得到的。例如，将天然存在的化合物紫铆花素从植物来源分离、脱水并还原，由此得到相应的二芳基烷醇。
[0050] 在另一个具体实施方案中，所述二芳基烷烃是通过两种被适当取代的芳香化合物的反应获得的。从两种被取代的芳香化合物合成这些化合物的可行化学反应包括但不限于被取代的苯甲醛和被取代的苯乙酮之间的羟醛缩合；醛和酮之间的Claisen-Schmidt反应或交叉羟醛缩合；使用一种被取代芳环的有机镁卤化物通过与第二种被取代的芳环分子的羰基的加成反应连接至所述第二种被取代的芳环的Grignard反应；通过分子内异构化发生的Claisen重排，其中具有适当的取代基的酯化的酚异构化而使第二种芳环连接至酚的邻位，随后进行还原反应；以及Suzuki偶联反应，其中将两种被取代的芳环转化成芳基硼酸，然后使用经谨慎选择的钯催化剂通过卤代烷连接。这些反应为本领域技术人员所周知，并且可应用此处公开的用于合成这些化合物的信息确定这些反应的条件。
[0051] 本发明采用将抑制试验和化学去重复方法(chemical dereplicationprocess)相联合的策略以鉴别有活性的植物提取物和特异性地抑制双核酶的那些提取物中的特定化合物。该方法包括结合天然产物的分离、有机合成、分子模型及酶抑制试验以优化结构并最大化药物的效能。该方法记载于2002年6月27日提交的、名为“Method for Generating，Screeningand Dereplicating Natural Product Libraries for the Discovery of TherapeuticAgents”的第10/185,758号美国申请中，该申请全文并入本文以作参考。采用如以下实施例部分所述的酪氨酸酶抑制试验证实该方法的有效性。根据该发明方法评价的二芳基烷烃的纯度在0.01％到100％范围内，取决于用于获得化合物的方法。
[0052] 在一个优选的具体实施方案中，向有需要的主体给药的二芳基烷烃的剂量是有效、无毒性的量，其通常选自基于最终制剂的总重量的0.001％到100％和/或基于主体体重的每千克0.01mg到200mg的范围内。本领域技术人员采用常规临床试验即可确定对于所治疗的特定疾病的最佳剂量。本发明提供用于合成、和/或分离、纯化及配制二芳基烷烃以得到具有所期望的生理学活性的组合物的商业上切实可行的选择。本发明的组合物可通过本领域技术人员所知的任何方法给药。给药方式包括但不限于肠道(口服)给药、非胃肠道(静脉内、皮下和肌内)给药以及局部施用。本发明的治疗方法包括向有需要的患者内部或局部给药治疗有效量的合成和/或从单种植物或多种植物分离的纯的或混和的二芳基烷烃。在一个优选的具体实施方案中，局部给药该组合物。
[0054] 图1图示黑素生成的过程以及各种可能调节该过程的机制。
[0055] 图2图示酪氨酸酶活性部位的结构。如图中所示，两个铜离子间距接近并且分别通过组氨酸侧链的N-ε氮原子与三个组氨酸配位。
[0056] 图3描述已知酪氨酸酶抑制剂的结构、名称、作用机制及其他作用。
[0057] 图4图示包含突出标记的UP288(1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(1)的HTP流分(fraction)的HPLC/UV色谱图。
[0058] 图5描述UP288(1)的化学结构和13C-NMR谱。
[0059] 图6图示UP288和曲酸的酪氨酸酶抑制剂量反应曲线以及IC50值。
[0060] 图7描述在生物鉴定指导(bioassay-guided)下自山菅(P0389)(整株)分离两种活性化合物(UP302a和UP302b)。
[0061] 图8描绘经多柱分离后富集的UP302流分的HPLC/UV色谱图。
[0062] 图9图示UP302a(2)的gHSQC谱，其图解了质子和碳间的连接。
[0063] 图10图示各种抑制剂UP302a和底物L-DOPA浓度下对酪氨酸酶活性的抑制。该动力学研究揭示UP302a是酪氨酸酶的竞争性抑制剂。
[0064] 图11图示曲酸和UP302a(2)对小鼠B16Fl细胞中内源性黑素生成的抑制。以10种不同的浓度一式三份地测试各样品。
[0065] 图12描绘MM2能量最小化后UP302a的三维构象。
[0066] 图13图示配位至Cu″-O2-Cu″氧化态下的两个铜离子时UP302a的三维构象。
[0067] 图14描绘如实施例17所计算的在与以过氧化物形式(Cu″-O2-Cu″)的铜离子螯合时UP302a的相邻原子之间的距离。
具体实施方式
[0068] 本发明大体而言涉及对由双核酶介导的疾病及病症的预防和治疗。具体而言，本发明包括抑制具有双核活性部位的酶的活性的方法。本发明包括包含一种或更多种二芳基烷烃的新的组合物。本发明的二芳基烷烃可从一种或更多种植物来源分离，或者可通过有机合成获得。本发明还包括从植物来源分离这些化合物的方法以及合成这些化合物的方法。在一个具体实施方案中，所述二芳基烷烃是通过合成修饰从植物来源分离的天然存在的化合物得到的。
[0069] 本文使用各种术语提及本发明的各方面。提供以下定义以帮助阐明对本发明各部分的说明。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均为本发明所属领域技术人员通常所理解的意思。
[0070] 应注意的是，此处所使用的术语“a”或者“an”实体是指一种或更多种该实体；例如，“a diarylalkane”是指一种或更多种二芳基烷烃。以此类推，术语“a”或“an”、“一种或更多种”以及“至少一种”在本文中可交换使用。
[0071] 本文所使用的“二芳基烷烃”是具有以下通式结构的特定类型的芳香化合物。本发明还包括包含一种或更多种二芳基烷烃的新组合物，其中所述二芳基烷烃选自由以下通式结构所代表的化合物的组中：
[0072]
[0073] 其中
[0074] Ar1和Ar2独立地选自由被取代的5或6元芳环或杂芳环组成的组中，其中各6元芳环或杂芳环独立地被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，并且各5元芳环或杂芳环被1-4个R′基团(R′1-R′4)取代，例外的是当Ar1和Ar2均为6元芳环即苯基时，Ar1和Ar2中至少一个被1-5个R′基团(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2个不是H，[0075] 其中
[0076] R′独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、和X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，
[0077] R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且n＝1至10。在一个优选的具体实施方案中n＝2-4。
[0078] 在一个具体实施方案中，所述二芳基烷烃和二芳基烷醇选自由以下通式结构所代表的化合物的组中：
[0079]
[0080] 其中
[0081] R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及单糖或包含2-6个单糖的寡糖的糖苷，其中所述单糖独立地选自以下组中：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；其中R是具有1-20个碳原子的烷基且X是选自Cl、Br、F、I的卤素，并且其中R1-R5中的至少2个或R′1-R′5中的至少2个不是H；
[0082] R6和R7独立地选自以下组中：-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20个碳原子的烷基且其中X是选自Cl、Br、F、I的卤素；并且
[0083] n＝1至10。在一个优选的具体实施方案中n＝2-4。
[0084] 本文所使用的“二芳基烷醇”是指在两个芳环间的烷基碳上具有至少一个羟基(R6和/或R7＝-OH)的特定类型的“二芳基烷烃”。
[0085] 本文所使用的“双核酶”是指具有双核活性部位的酶，其实例是如上所述在其活性部位具有两个铜离子的酪氨酸酶。双核酶包括但不限于酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、细胞色素C氧化酶、质子泵血红素-铜氧化酶、双功能的一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶、核糖核苷酸还原酶、金属-β-内酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供选择的氧化酶以及细菌磷酸三酯酶。
[0086] 本文所使用的“治疗”包括阻止、治疗和/或预防。在使用时，治疗是指人类以及其他动物。
[0087] “药物或治疗有效剂量或量”是指足够引起所期望的生物学结果的剂量水平。该结果可能是减轻病征、症状或疾病的本因或者所期望的生物系统其他变化。精确剂量将根据各种因素而变化，包括但不限于对象的年龄和大小、疾病和所实施的治疗。
[0088] “安慰剂”是指使用无活性物质替换足以引起所期望的可减轻病征、症状或疾病本因的生物学结果的药物学有效和治疗有效的剂量。
[0089] “主体”或“患者”或“对象”是需要治疗的有生命的哺乳动物、人或动物。所述“主体”、“患者”或“对象”通常是指根据本发明方法要实施的治疗的接受者。应注意的是，此处所述的发明可用于兽医以及应用于人，并且不应以受限的方式解释术语“主体”。就兽医应用而言，应如下文所述在考虑动物体重的情况下决定剂量范围。
[0090] 本文所使用的“药物学可接受的载体”是指任何不会干扰活性成分生物活性的有效性且对接受给药的主体无毒性的载体。“药物学可接受的载体”的实例包括但不限于任何如盐溶液即林格氏溶液、缓冲盐溶液、水、葡萄糖溶液、血清白蛋白以及其他用于片剂和胶囊剂型的辅料和防腐剂的标准药物载体。
[0091] 本发明包括抑制本文称之为双核酶的具有双核活性部位的酶的活性的方法，所述方法包括向有需要的主体给药有效量的一种或更多种二芳基烷烃，其中所述二芳基烷烃是合成和/或从一种或更多种植物分离的。本发明范围内的双核酶的实例包括但不限于酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、细胞色素C氧化酶、质子泵血红素-铜氧化酶、双功能的一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶、核糖核苷酸还原酶、金属-β-内酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供选择的氧化酶以及细菌磷酸三酯酶。在一个具体实施方案中，所述双核酶是酪氨酸酶。
[0092] 本发明还包括预防和治疗与双核酶活性有关的疾病和病症。本发明的预防和治疗方法包括向有需要的主体内部或局部给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃。根据受抑制的双核酶，所述二芳基烷烃可用作为抗菌剂、抗真菌剂、抗疟药或抗病毒剂、作为控制男性和女性性唤起的手段的氧化氮生成的调节剂、抗炎药、抗氧化剂、药物代谢的调节剂，用于预防和治疗牙周病、口腔癌前期症状、口腔癌及其他口腔恶性肿瘤、牙龈和牙齿过敏、后遗症、牙髓炎、发炎，由口部假牙物理植入、创伤、损伤、夜磨牙症及其他口内、牙龈或舌上的微创口所引起的疼痛和炎症，牙菌斑和牙垢、牙齿脱钙、蛋白酶解作用和龋齿(腐蚀)、和癌及实体瘤的生长抑制剂。
[0093] 本发明还包括预防和治疗与黑素过度产生或分布不均有关的疾病和病症的方法，所述方法包括向有需要的主体内部或局部给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃。与黑素过度产生或分布不均有关的疾病和病症包括但不限于晒黑，由皮肤老化、肝病、热灼伤和局部创口导致的色素沉着过度，归因于由真菌、细菌和病毒感染引起的炎症的皮肤色素沉着，白癜风、癌、黑素瘤以及其他哺乳动物的皮肤疾病。
[0094] 该方法还可用于预防和治疗由于暴露于紫外线(UV)照射、化学试剂、热、风和干燥环境导致的皮肤变黑和损伤。最后，该方法可用于预防和治疗皱纹、皮肤松弛、眼纹和黑眼圈、缓和敏感性皮肤以及预防和治疗皮炎及其他与过敏相关的皮肤疾病。此处所述治疗组分除了可用于预防和治疗上述皮肤疾病和病症外，还可提供一种有效的组合物，其具有可提供肤色改善、弹性增加、衰老减轻和延缓、年轻的外表和纹理改善以及柔韧性、紧绷度、光滑和柔度增强的光滑及年轻的皮肤外观的益处。
[0095] 通过与金属离子螯合，二芳基烷烃还可用于递送必需的金属离子至主体的血流、和/或携带金属离子穿过皮肤或血/脑屏障以及其他膜。在该具体实施方案中，所述方法包括向有需要的主体给药治疗有效量的一种或更多种二芳基烷烃以及要被递送的金属离子。鉴于二芳基烷烃的这种能力，其可用于治疗的疾病和病症包括但不限于：贫血及其他铁缺乏、炎症；肥胖和糖尿病、牙周病、口腔癌前期症状、口腔癌、及其他口腔恶性肿瘤、牙龈和牙齿过敏、后遗症、牙髓炎、发炎，由口部假牙物理植入、创伤、损伤、夜磨牙症及其他口内、牙龈或舌上的微创口所引起的疼痛和炎症，牙菌斑和牙垢、牙齿脱钙、蛋白酶解作用和龋齿(腐蚀)、病毒感染。该金属离子选自包括但不限于以下组中：铜、铁、锌、硒、镁及其他金属离子。
[0096] 在另一个具体实施方案中，所述二烷基烷烃可用于食品工业以预防水果、蘑菇及其他食品褐变和变色。
[0097] 可根据下文所述应用的二芳基烷烃包括上述通式结构所示的化合物。本发明的二芳基烷烃可通过合成方法获得或分离自一种或更多种选自包括但不限于菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、桑科和肉豆蔻科的植物科中。本发明的二芳基烷烃可提取、富集和纯化自包括但不限于金合欢属、构树属、山菅属、蜡菊属、Iryanthera、红光树属、山胡椒属、紫檀属、槲寄生属和Xanthocercis的高等植物属中。所述二芳基烷烃可存在于植物的不同部分中，包括但不限于茎、茎皮、芯材、树干、树干皮、桠枝、块茎、根、根皮、嫩芽、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶子及其他气生部分。在一个优选的具体实施方案中，所述二芳基烷烃分离自构树属、山菅属和Iryanthera属的一种或更多种植物。
[0098] 在另一个具体实施方案中，本发明的二芳基烷烃是通过化学合成的方法获得的。本发明包括合成二芳基烷烃和二芳基烷醇的方法，所述方法包括还原具有以下通式结构的化合物：
[0099]
[0100] 其中
[0101] R1-R5和R′1-R′5及n如上所定义，并且其中R6和R7一同构成一个或更多个羰基。还原剂可选自任何用于将酮还原为醇的已知还原剂，包括但不限于硼氢化物、催化剂存在下的H2、NaH和LiAlH4。在一个具体实施方案中，该还原剂是NaBH4。
[0102] 在另一个具体实施方案中，二芳基烷烃是通过合成修饰从植物来源分离的天然存在的化合物得到的。例如，将天然存在的化合物紫铆花素从植物来源分离、脱水并还原产生相应的二芳基烷醇。
[0103] 在另一个具体实施方案中，所述二芳基烷烃是通过两种被适当取代的芳香化合物的反应获得的。从两种被取代的芳香化合物合成这些化合物的可行化学反应包括但不限于被取代的苯甲醛和被取代的苯乙酮之间的羟醛缩合；醛和酮之间的Claisen-Schmidt反应或交叉羟醛缩合；使用一种被取代芳环的有机镁卤化物通过与第二种被取代的芳环分子的羰基的加成反应连接至所述第二种被取代的芳环的Grignard反应；通过分子内异构化发生的Claisen重排，其中具有适当的取代基的酯化的酚异构化而使第二种芳环连接至酚的邻位，随后进行还原反应；以及Suzuki偶联反应，其中将两种被取代的芳环转化成芳基硼酸，然后使用经谨慎选择的钯催化剂通过卤代烷连接。这些反应为本领域技术人员所周知，并且可应用此处公开的用于合成这些化合物的信息确定这些反应的条件。
[0104] 应注意的是本申请全文中提供了各种引用。所有这些引用分别全文具体地并入此文以做参考。
[0105] 本发明采用将酪氨酸酶抑制试验与化学去重复方法联合的策略以鉴别有活性的植物提取物和特异性地抑制双核酶酪氨酸酶的那些提取物中的特定化合物。如上所述，抑制酪氨酸酶的酶可导致黑素生成减少，从而有效地美白皮肤。如实施例1所述，通过用有机溶剂提取干燥植物粉末形成植物提取物库。如实施例2所述，按照Jones等(2002)Pigment.CellRes.15：335所报道的方法进行酪氨酸酶抑制试验。应用该试验，总共对1144种植物提取物的抑制蘑菇酪氨酸酶活性的能力进行了筛选。该初步的筛选鉴别出20种具有强效酪氨酸酶强抑制活性的植物提取物(1.75％命中率(hit rate))。表1描绘自4种不同属的植物分离的这些提取物中的4种提取物的酪氨酸酶抑制百分比。
[0106] 如实施例3所述，为了从活性植物提取物中有效地鉴别活性化合物，采用了高通量分级分离方法(high throughput fractionation process)。简而言之，采用了高通量纯化(HTP)系统分级分离活性提取物。然后按照如实施例2所述的初步试验测试各流分的抑制酪氨酸酶活性的能力。在应用HPLC与PDA及MS检测器的组合，并结合结构数据库搜索并排除含已知酪氨酸酶抑制剂如多酚以及色酮的流分，从而去重复后，总共选出七种活性提取物进行如实施例4-6所述的在生物鉴定指导下的大规模分离和纯化，小构树(Broussonetia kazinoki Sieb.Et Zucc)(桑科)以及山菅(Dianella ensifolia(L.)DC.)(百合科)用于举例说明。
[0107] 实施例4描述采用实施例1所述通法自小构树(桑科)(整株)提取、分离和纯化新型的二芳基丙烷：1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(UP288)(1)。图4所示含UP288的HTP流分的HPLC/UV色谱图。采用如实施例4所述的联13
合光谱法阐明活性化合物UP288的结构。图5描述UP288的化学结构和 C-NMR谱。图6
图示UP288相对于曲酸的酪氨酸酶抑制剂量反应曲线以及IC50值。该图说明UP288(1)是和曲酸一样强效的IC50＝24M的酪氨酸酶抑制剂。
合光谱法阐明活性化合物UP288的结构。图5描述UP288的化学结构和 C-NMR谱。图6
图示UP288相对于曲酸的酪氨酸酶抑制剂量反应曲线以及IC50值。该图说明UP288(1)是和曲酸一样强效的IC50＝24M的酪氨酸酶抑制剂。
[0108] 如实施例5所述，出人意料地从全然不同的植物科——山菅(百合科)中分离及鉴别出两种相似的二芳基烷烃。图7图示在生物鉴定指导下自山菅(P0389)(整株)中分离这两种活性化合物(UP302a(2)和UP302b(3))。参考图7可见，在收集的共264份样品中仅15份柱流分显示出对酪氨酸酶的强效抑制。对合并的活性流分的HPLC分析(图8)显示，活性化合物是在经高度富集后的最佳集合(pool)中的微量成分。经艰辛的分离及纯化的努力，得到两种新型的活性化合物，如实施例5及图9所示通过NMR及其他光谱方法，该化合物已被充分表征为1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷(UP302a，IC50＝0.24μM)(2)和1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基-3-(2′，5′-二羟基苯基)-丙烷(UP302b，IC50＝1.2μM)(3)。
[0109] 实施例6描述自山菅(DE)(整株)中大规模分离最有效的酪氨酸酶抑制剂UP302a(2)。参考实施例6可知，自4.3kg干燥生物物料(biomass)经硅胶、CG-161以及C-18树脂多柱分级分离后总共获得30mg纯的UP302a(2)。所分离的化合物的结构以及生物学功能已经确认。
[0110] 由于二芳基烷烃/二芳基烷醇的天然丰度低，研发了合成这些生物学活性化合物的方法以作为这类化合物可选择的商业来源。实施例7描述一种通过还原被取代的查耳酮合成二芳基烷烃的通法。以说明为目的，描述了采用硼氢化钠将2，4-二羟基苯基)-3′，4′-二甲氧基苯基查耳酮(4)还原为1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇(5)的方法。然而，如实施例7中所述，已应用该通法合成许多其他二芳基烷烃。所有这些经合成的化合物均显示高至中等的酪氨酸酶抑制活性。就实施例7所述的通法而言，可用于实施该还原反应的任意已知的还原剂包括但不限于其他硼氢化物、催化剂存在下的H2、NaH及LiAlH4。
[0111] 实施例8、9及10中表明，应用如实施例7所述的通用反应已经将若干其他被取代的二芳基丙酮转变为二芳基丙烷和/或二芳基丙醇。实施例11表明了采用分离自天然来源的黄酮苷(flavonoid glycoside)作为原材料合成二芳基丙醇的方法。
[0112] 在另一个具体实施方案中，本发明包括通过两种被适当取代的芳香化合物的反应合成这类化合物的方法。实施例12中采用间苯二酚与3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的反应举例说明了该具体实施方案。从两个被取代的芳香化合物合成这些化合物的可行化学反应包括但不限于被取代的苯甲醛和被取代的苯乙酮之间的羟醛缩合；醛和酮之间的Claisen-Schmidt反应或交叉羟醛缩合；使用一种被取代芳环的有机镁卤化物通过与第二种被取代的芳环分子的羰基的加成反应连接至所述第二种被取代的芳环的Grignard反应；通过分子内异构化发生的Claisen重排，其中具有适当的取代基的酯化的酚异构化而使第二种芳环连接至酚的邻位，随后进行还原反应；以及Suzuki偶联反应，其中将两种被取代的芳环转化成芳基硼酸，然后使用经谨慎选择的钯催化剂通过卤代烷连接。这些反应为本领域技术人员所周知，并且可应用此处公开的用于合成这些化合物的信息确定这些反应的条件。
[0113] 实施例13列出若干根据本发明方法合成的二芳基烷烃和二芳基烷醇的IC50值。采用实施例2所述的通法评价这些化合物。采用动力学软件计算各样品的IC50值以验证所述反应在特定时间和浓度呈线性。应用实施例7-12中所述的方法，总共合成24种化合物，并评价了它们抑制酪氨酸酶的能力。结果如表2所示。根据表2可见，合成二芳基烷醇的IC50与天然存在的二芳基丙烷相近。因此，这两类化合物可以大致相同的程度抑制酪氨酸酶。最具活性的二芳基烷烃和/或二芳基烷醇在两个芳环间有三个碳。采用如实施例17中所述的计算方法，证明该结构特征对于产生平行及重叠(superimposed)的分子内构象而言是必需的。然而，在两个芳环间含二个以及四个碳的二芳基烷醇如1-(2，4-二羟基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇(IC50＝77μM)以及1，4-双-3，4-二羟基苯基)-2，
3-二甲基-丁烷(buthane)(IC50＝700μM)也可显著抑制酪氨酸酶活性。
3-二甲基-丁烷(buthane)(IC50＝700μM)也可显著抑制酪氨酸酶活性。
[0114] 如实施例14所示，应用如实施例2所述方法，采用L-DOPA作为底物评价UP302a(2)对酪氨酸酶的抑制。结果如图10所示。这项研究显示UP302a(2)是具有长效作用的强竞争性抑制剂。有趣地，酪氨酸酶活性在与UP302a温育后几天不会恢复。相反，酪氨酸酶活性在与曲酸温育后仅1小时就完全恢复。由于UP302a芳环上的两个取代基是甲氧基，所以该抑制剂并不易被羟基化和/或氧化。这也许可以同时解释UP302a抑制活性的效力和持续时间。因此，可推断这些化合物将具有长效的作用。
[0115] 如实施例15所述，通过在体外试验中测定对B-16细胞系生成黑素的抑制也证实了所要求保护的组合物的效能。结果如图11所示。UP302a(2)对内源性黑素的减少作用比曲酸几乎高6倍。此外，UP302a对MSH诱导的黑素生成的抑制也显著高于曲酸。如所期待的，UP288(1)在B-16细胞系模型中与曲酸相当。
[0116] 实施例16描述了评定两种二芳基丙烷UP288(1)和UP302a(2)相对于曲酸的细胞毒性的试验。在高于所有3种受试化合物IC50的浓度——250μM下，证实二芳基丙烷具有与曲酸类似的安全特性。
[0117] 实施例17描述了所进行的用以确定活性二芳基烷烃及二芳基烷醇最稳定的3-D构象的分子模型分析。使用Chem3D软件进行分子力学计算。这些计算揭示，最有效的酪氨酸酶抑制剂1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷(UP302a(2)，IC50＝0.24μM)具有如实施例12所示的两个芳环彼此重叠的非常独特的三维构象。该构象的最低总能量是-4.7034KJ/Mol，且两个芳环的间距是 分别如
图14所示，第一个芳环上的酚羟基正好在第二个芳环上的两个甲氧基的上方，与两个氧原子的间距是 和 双核酶酪氨酸酶的活性部位具有螯合至过氧化物氧化态
[Cu″-O2-Gu″]的氧分子的两个铜离子，这是酪氨酸酶催化向单酚(如酪氨酸)芳环邻位引入羟基机制的关键。(Decker等(2000)Angew.Chem.Int.Ed.39：1591)。据报道的原子间距是Cu-Cu Cu-O 以及O-O (Kitajima等(1989)Am.Chem.Soc.111：
8975)。如图13和图14所示，1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)丙烷(UP302a，IC50＝0.24μM)的平行构象可从顶端及底端完美地螯合[Cu″-O2-Cu″]络合物的两个铜离子。抑制剂在活性部位与两个铜离子的双螯合可完全阻断如L-Dopa的底物接近酶，因而有效地抑制蛋白质的功能。使用相同的方法，分析了表2所列的经分离及合成所得的二芳基烷烃和二芳基烷醇。分析结果显示具有扭曲(twisted)或非平行构象的化合物不具有或者仅有弱的抑制酪氨酸酶活性的能力。
图14所示，第一个芳环上的酚羟基正好在第二个芳环上的两个甲氧基的上方，与两个氧原子的间距是 和 双核酶酪氨酸酶的活性部位具有螯合至过氧化物氧化态
[Cu″-O2-Gu″]的氧分子的两个铜离子，这是酪氨酸酶催化向单酚(如酪氨酸)芳环邻位引入羟基机制的关键。(Decker等(2000)Angew.Chem.Int.Ed.39：1591)。据报道的原子间距是Cu-Cu Cu-O 以及O-O (Kitajima等(1989)Am.Chem.Soc.111：
8975)。如图13和图14所示，1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)丙烷(UP302a，IC50＝0.24μM)的平行构象可从顶端及底端完美地螯合[Cu″-O2-Cu″]络合物的两个铜离子。抑制剂在活性部位与两个铜离子的双螯合可完全阻断如L-Dopa的底物接近酶，因而有效地抑制蛋白质的功能。使用相同的方法，分析了表2所列的经分离及合成所得的二芳基烷烃和二芳基烷醇。分析结果显示具有扭曲(twisted)或非平行构象的化合物不具有或者仅有弱的抑制酪氨酸酶活性的能力。
[0118] 从这些研究中可以确定，最有效的二芳基烷烃抑制剂在第一个芳环上有两个至三个取代基并且在第二个芳环上有零至多个取代基。最有利的结构是那些至少有一个芳环在2及4位被取代。通过两个经分离的化合物1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，
5′-四氢化-bezo(b)dioxocin-8-基)-1-丙醇，IC50＝72μM及3-(5′-氯-1′-甲
基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇，IC50＝225μM证实，优选的环是6元芳环和/或杂芳环。
5′-四氢化-bezo(b)dioxocin-8-基)-1-丙醇，IC50＝72μM及3-(5′-氯-1′-甲
基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇，IC50＝225μM证实，优选的环是6元芳环和/或杂芳环。
[0119] 本发明的组合物可通过本领域技术人员所知的任何方法给药。给药方式包括但不限于胃肠道(口服)给药、非胃肠道(静脉内、皮下和肌内)给药以及局部施用。本发明的治疗方法包括向有需要的患者内部或局部给药治疗有效量的二芳基烷烃或者包含一种或更多种二芳基烷烃的混和物。
[0120] 本发明组合物可被配制成药物组合物，其包含如药物学和/或美容学(cosmetically)可接受的赋形剂、佐剂和/或载体的组分。例如，本发明的组合物可在所治疗的主体能耐受的赋形剂内配制。赋形剂是用作如二芳基烷烃或二芳基烷烃混和物的治疗药物的稀释剂或载体(vehicle)的惰性物质。这种赋形剂的实例包括但不限于水、缓冲剂、盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、甘露醇、Hank溶液、防腐剂及其他含水的生理学平衡盐溶液。还可以使用如不挥发性油类、芝麻油、油酸乙酯或三酸甘油酯的非水载体。其他可用的剂型包括包含粘度增强剂如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖的混悬剂。赋形剂还可包含微量的添加剂，如提高等渗性和化学稳定性的物质。缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、组氨酸、柠檬酸盐及甘氨酸或其混和物，而防腐剂的实例包括但不限于EDTA、乙二胺四乙酸二钠、BHA、BHT、维生素C、维生素E、亚硫酸氢钠、SnCl2、硫柳汞、m-或o-甲酚、福尔马林和苯甲醇。标准剂型可为液体或固体，其可被适当液体吸收(taken up)，成为用于给药的混悬剂或溶液。因此，在非液体剂型中，赋形剂可包括葡萄糖、人血清白蛋白、防腐剂等等，在给药前可向其中加入无菌水或者盐水。
[0121] 在本发明一个具体实施方案中，所述组合物还可包含佐剂或载体。佐剂通常是一般可提高主体对特定生物活性剂的生物反应的物质。适宜的佐剂包括但不限于弗氏(Freund)佐剂、其他细菌细胞壁成分，铝、镁、铜、锌、铁、钙及其他金属离子基盐，硅石、多核苷酸、类毒素、血清蛋白、病毒外壳蛋白、其它的细菌衍生制剂、γ干扰素；嵌段共聚物佐剂；如Hunter′s Titermax佐剂(Vaxcel.TM.，Inc.Norcross，Ga.)、Ribi佐剂(可从Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.获得)；以及皂苷和其衍生物，如Quil A(可从Superfos Biosector A/S，丹麦获得)。载体通常是可提高治疗组合物在所治疗的主体内的半衰期的混和物。适宜的载体包括但不限于聚合控释剂型、可生物降解的植入剂、脂质体、细菌、病毒、油、酯和二醇类。
[0122] 在一个具体实施方案中，所述组合物被制备成将本发明组合物缓慢释放到主体内的控释剂型。本文所使用的控释剂型包含在控释载体内的本发明组合物。适宜的控释载体为本领域技术人员所周知。优选的控释剂型是可生物降解的(即可生物侵蚀的(bioerodible))。
[0123] 本发明的治疗剂优选通过任意适宜的方法局部给药，本领域技术人员所周知的局部给药治疗组合物的方法包括但不限于软膏剂、凝胶剂、洗液、或者乳膏基质、或者作为牙膏、漱口液或牙线上涂敷的物质、或者作为乳剂、作为贴剂、敷料(dressing)或面膜、无粘性纱布、绷带、药签(swab)或布拭子(cloth wipe)。实施例18描述活性含量为配方总重量的0.01％及0.1％的纯二芳基烷烃和/或二芳基烷烃混和物的两种乳膏剂型的制剂。这种局部施用可采用局部给药已知的任意标准手段向任何患病区域局部给药。根据给药的方法，治疗组合物可以各种单位剂量形式给药。对于特定的递送模式而言，本发明的治疗组合物可在本发明赋形剂内配制。本发明的治疗试剂可给药于任何主体，优选哺乳动物，以及更优选人类。特定的给药方式将取决于要治疗的病症。
[0124] 在一个具体实施方案中，适宜的软膏剂包含所需浓度——即通常选自基于局部给药制剂总重量的0.001％到100％的范围内的有效、非毒性的量——的单种二芳基烷烃或者两种或更多种二芳基烷烃的混和物，从65到100％(优选75到96％)的白色软石蜡、从0到15％的液体石蜡、以及从0到7％(优选3到7％)的羊毛脂或其衍生物或合成等效物。在另一个具体实施方案中，该软膏剂可包含聚乙烯液体石蜡基质。
[0125] 在一个具体实施方案中，适宜的乳膏剂包含乳化系统以及所需浓度的如上所提供的单种二芳基烷烃或者两种或更多种二芳基烷烃的混和物。所述乳化系统优选包含2到TM10％的聚氧乙烯醇(如可以商品名Cetomacrogol 1000获得的混和物)、从10到25％的十八烷醇、从20到60％的液体石蜡和从10到65％的水；以及一种或更多种防腐剂，如从
0.1到1％的N，N″-亚甲基二[N′-[3-(羟基甲基)-2，5-二氧代-4-咪唑烷基]脲]
(可以商品名Imidurea USNF获得)、从0.1到1％的4-羟基苯甲酸烷基酯(如可从Nipa Laboratories获得的商品名为Nipastat的混和物)、从0.01到0.1％的4-羟基苯甲酸丁酯钠(可从Nipa Laboratories获得，商品名为Nipabutyl sodium)、以及从0.1到2％的苯氧乙醇。
0.1到1％的N，N″-亚甲基二[N′-[3-(羟基甲基)-2，5-二氧代-4-咪唑烷基]脲]
(可以商品名Imidurea USNF获得)、从0.1到1％的4-羟基苯甲酸烷基酯(如可从Nipa Laboratories获得的商品名为Nipastat的混和物)、从0.01到0.1％的4-羟基苯甲酸丁酯钠(可从Nipa Laboratories获得，商品名为Nipabutyl sodium)、以及从0.1到2％的苯氧乙醇。
[0126] 在一个具体实施方案中，适宜的凝胶剂包含半固体系统，其中液相被束缚至高度交联的三维聚合基质内。该液相可包含水、以及所需量的单种二芳基烷烃或者两种或更多种二芳基烷烃的混和物，从0到20％的可与水混溶的添加剂如甘油、聚乙二醇或丙二醇，以及从0.1到10％、优选从0.5到2％的增稠剂，其可为选自包括但不限于黄蓍胶、果胶、角叉菜胶、琼脂和藻酸组中的天然产物或者选自包括但不限于甲基纤维素和羧聚乙烯(卡波普(carbopol))组中的合成或半合成化合物，以及一种或更多种选自包括但不限于如从0.1到2％的4-羟基苯甲酸甲酯(对羟基苯甲酸甲酯)或苯氧乙醇-differential(phenoxyethanol-differential)组中的防腐剂。另一适宜的基质(base)包含所需量的单种二芳基烷烃或二芳基烷烃的混和物、以及70到90％的聚乙二醇(例如含40％聚乙二醇3350及60％聚乙二醇400、依照美国National Formulary(USNF)配制的聚乙二醇软膏剂)、从5到20％的水、从0.02到0.25％的抗氧化剂(例如丁羟甲苯)以及从0.005到0.1％的螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))。
[0127] 如上所应用的术语软石蜡涵盖乳膏剂或软膏剂基质白色软石蜡和黄色软石蜡。术语羊毛脂涵盖原生羊毛脂(native wool fat)和精制羊毛脂。羊毛脂的衍生物特别包括被化学修饰以改变它们的物理或化学性质的羊毛脂，以及羊毛脂的合成等价物，特别包括药物学和美容学领域已知的用作羊毛脂的替代物并且可被称作羊毛脂替代物的合成或半合成的化合物和混和物。
[0128] 一种可使用的适当的羊毛脂合成等价物是可以SoftisanTM的商品名获得的物质，TM其称为Softisan 649 。可从Dynamit Nobel Aktiengesellschaft获得的Softisan 649是天然植物脂肪酸、异硬脂酸以及己二酸的甘油酯；其性质已由H.Hermsdorf在Fette，Seifen，Anstrichmittel，Issue No.84，No.3(1982)，pp.3-6中论述。
[0129] 上文提及的作为适宜的软膏剂或乳膏剂基质成分的其他物质和它们的性质在标准参考资料如药典中论述。Cetomacrogol 1000的化学式为CH3(CH2)m(OCH2CH2)nOH，其中m可为15或17且n可为20到24。丁羟甲苯是2，6-二叔丁基-对甲酚。Nipastat是4-羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的混和物。
[0130] 可通过常规制药技术生产本发明的组合物。因此，例如上述组合物可通过在优选60-70℃的高温下混合软石蜡、若存在的话液体石蜡、以及羊毛脂或其衍生物或合成等价物方便地制备。然后可将该混和物冷却至室温，并且在添加莫匹罗星水合晶体钙盐(hydrated crystalline calcium saltof mupirocin)以及皮质甾类(corticosteroid)和任何其它成分后搅拌以确保充分分散。
[0131] 与给药方式无关，特定剂量根据主体的大概体重计算。涉及上述各种剂型时，确定适宜的治疗剂量所必需的对计算结果的进一步改进由本领域的普通技术人员常规地进行，并且在他们不需过度试验即可执行的任务的范围内，特别是在考虑此处所公开的剂量信息以及试验的情况下。这些剂量可通过应用已建立的确定使用剂量的试验，并结合适当的剂量-反应数据确定。
[0132] 以下实施例仅提供用于说明性目的，而非用于限制本发明的范围。
[0133] 实施例
[0134] 实施例1. 从干的植物制备有机提取物
[0135] 将干的植物材料磨碎至粒径不超过2mm，并转移一部分(60g)至锥形瓶中用600ml的甲醇∶二氯甲烷(1∶1)萃取。将该混和物振摇1小时，过滤，并且再次用甲醇∶二氯甲烷(1∶1)(600ml)萃取该生物物料。合并有机提取物，并在真空下蒸发以提供源自各植物材料的有机提取物。然后将各提取物(约75mg)溶解于1.5ml DMSO中，至浓度为50mg/ml，接着将其置于-70℃冷冻装置中贮存。将该萃取液的等分试样用于如实施例2所述的酪氨酸酶试验。
[0136] 实施例2. 酪氨酸酶抑制试验
[0137] 采用Jones等(2002)Pigment.Cell Res.15：335所报道的方法进行酪氨酸酶抑制试验。使用该方法，在酪氨酸酶的底物L-Dopa转化成多巴色素后在450nm监测吸收。将酪氨酸酶在50mM磷酸钾缓冲液、pH 6.8(试验缓冲液)中配制成2000U/ml，并在使用前以1ml等分试样于-20℃贮存。在试验中使用时，将储备酶溶液解冻并用试验缓冲液稀释至200U/ml。每次试验制备在试验缓冲液中的2mM底物L-DOPA的工作溶液(working solution)。将样品溶于10％的DMSO(0.5ml)，并用试验缓冲液稀释至5ml。该反应混和物由0.050ml 2mM L-DOPA、0.050ml200U/ml蘑菇酪氨酸酶和0.050ml抑制剂组成。用试验缓冲液将反应体积调整至200μl。试验在96孔Falcon 3097平底微量滴定板(BecktonDickinson，NJ)上进行。用WALLAC 1420 Multilable Counter(土尔库，芬兰)测定出现的多巴色素。平均速度由测定450nm处每分钟吸光度(AA450)的变化的线性酶速率确定。通过利用公式(1)比较样品相对于对照的吸光度确定试样对酪氨酸酶的抑制百分比：
[0138] (阴性对照吸收一样品吸收)/阴性对照吸收×100 (1)
[0139] 结果如表1所示
[0140] 表1.四种植物提取物的酪氨酸酶抑制活性
[0141]
[0142] 实施例3.活性植物提取物的HTP分级分离
[0143] 将活性有机提取物(400mg)装至预先填充、正相的快速柱中。(2cmID×8.2cm，10g硅胶)。用Hitachi高通量纯化(HTP)系统采用5mL/min流速下30分钟内(A)50∶50的乙酸乙酯∶己烷及(B)甲醇从100％A到100％B的梯度流动相洗脱该柱。应用宽波段波长UV检测器监测分离，并使用Gilson流分收集器将流分以1.9mL/孔收集至96-深-孔板中。低真空下干燥样品板并离心。使用DMSO(1.5mL)溶解各孔的样品，取一部分(100μL)一式两份用于酪氨酸酶抑制试验。
[0144] 实施例4.自小构树(BK)(整株)中提取、分离及纯化1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(1)
[0145]
[0146] 将小构树(100g整株)磨碎并用800ml的MeOH∶DCM(1∶2)萃取3次。使用硅胶柱，以己烷/乙酸乙酯(50/50)到MeOH的梯度溶剂分级分离干提取物(6g)。收集2套88试管的流分。应用LC/MS/PDA检验各流分，然后基于其组分的相似性将各流分合并。
蒸发该合并的流分以除去溶剂、干燥并且如实施例2所述方法测定他们对酪氨酸酶的抑制活性。结果发现流分(P0346-HTP-F2-P0346-HTP-F4)最具活性，并将这些流分合并且标记为BK-F2--4。蒸发溶剂后，采用水/MeOH梯度以预填充的反相柱(C-18柱)进一步分离BK-F2--4。分离后观察到18个化合物峰。进行14个反相柱并且在每次运行中合并相似的流分。在合并及富集的流分中，被称作UP288的化合物峰显示出强的酪氨酸酶抑制活性(图4)。用制备HPLC分离和纯化后，获得6mg的1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟
1 13
基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(UP288)(1)。使用MS和NMR谱(H、C、HMQC和HMBC)阐明
13
该化合物的结构。图5描述UP288的化学结构和 C-NMR谱。IC50值为24μM的UP288是
活性与曲酸相当的酪氨酸酶抑制剂。图6图示UP288和曲酸的酪氨酸酶抑制剂量反应曲线以及IC50值。
蒸发该合并的流分以除去溶剂、干燥并且如实施例2所述方法测定他们对酪氨酸酶的抑制活性。结果发现流分(P0346-HTP-F2-P0346-HTP-F4)最具活性，并将这些流分合并且标记为BK-F2--4。蒸发溶剂后，采用水/MeOH梯度以预填充的反相柱(C-18柱)进一步分离BK-F2--4。分离后观察到18个化合物峰。进行14个反相柱并且在每次运行中合并相似的流分。在合并及富集的流分中，被称作UP288的化合物峰显示出强的酪氨酸酶抑制活性(图4)。用制备HPLC分离和纯化后，获得6mg的1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟
1 13
基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(UP288)(1)。使用MS和NMR谱(H、C、HMQC和HMBC)阐明
13
该化合物的结构。图5描述UP288的化学结构和 C-NMR谱。IC50值为24μM的UP288是
活性与曲酸相当的酪氨酸酶抑制剂。图6图示UP288和曲酸的酪氨酸酶抑制剂量反应曲线以及IC50值。
[0147] 1-(2-甲氧基-4-羟基苯基)-3-(2′-羟基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(UP288)。收率0.006％(纯度＞96％，HPLC)；UVλMax：281.0nm；MS(超声电离(Super Sound
1
Ionization)、阳离子检测)：m/z 289(M+1，100％)；H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)：δ1.70(2H，m，CH2)，2.46(4H，m，2CH2)，3.68(3H，s，OCH3)，3.73(3H，s，OCH3)，6.26(1H，q，H-5)，6.35(1H，d，H-3)，6.55(1H，q，H-14)，6.65(1H，d，H-13)，6.72(1H，d，H-16)，6.86(1H，d，H-6)，
13
8.69(1H，s，OH)，9.20(1H，s，OH)；C-NMR(100MHz，(CD3)2SO)：δ28.5(C-8)，31.6(C-9)，
34.5(C-10)，55.0(C-7)，55.6(C-17)，98.9(C-3)，106.4(C-5)，112.4(C-16)，115.2(C-13)，
119.7(C-1)，119.8(C-14)，120.3(C-11)，120.4(C-6)，132.9(C-12)，144.6(C-4)，
147.2(C-17)&158.3(C-7)。
1
Ionization)、阳离子检测)：m/z 289(M+1，100％)；H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)：δ1.70(2H，m，CH2)，2.46(4H，m，2CH2)，3.68(3H，s，OCH3)，3.73(3H，s，OCH3)，6.26(1H，q，H-5)，6.35(1H，d，H-3)，6.55(1H，q，H-14)，6.65(1H，d，H-13)，6.72(1H，d，H-16)，6.86(1H，d，H-6)，
13
8.69(1H，s，OH)，9.20(1H，s，OH)；C-NMR(100MHz，(CD3)2SO)：δ28.5(C-8)，31.6(C-9)，
34.5(C-10)，55.0(C-7)，55.6(C-17)，98.9(C-3)，106.4(C-5)，112.4(C-16)，115.2(C-13)，
119.7(C-1)，119.8(C-14)，120.3(C-11)，120.4(C-6)，132.9(C-12)，144.6(C-4)，
147.2(C-17)&158.3(C-7)。
[0148] 实施例5.自山菅(P0389)(整株)提取、分离和纯化1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷(UP302a)(2)及1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羟基苯基)-丙烷(UP302b)(3)
[0149]
[0150] 将山菅(P0389，300g整株)磨碎并用800ml的MeOH∶DCM(1∶2)萃取3次。使用硅胶柱，以己烷/乙酸乙酯(50/50)到MeOH的梯度溶剂分级分离干提取物(5g)。收集2套264试管的流分。应用LC/MS/PDA检验每份流分，然后基于其组分的相似性将流分合并成22流分。(图7)。蒸发该合并的流分以除去溶剂、干燥并且如实施例2所述测定它们的酪氨酸酶抑制活性。结果发现流分P0389-HTP-F12、P0389-HTP-F13及P0389-HTP-F14最具活性，并将这些流分合并且重新标记为DE-F12-14。蒸发溶剂后，采用水/MeOH梯度在预填充反相柱(C-18柱)进一步分离DE-F12--14。分离后观察到两个较大的及十一个较小的化合物峰。由7次额外的RP-柱分离，分离出分别对应于这些峰的化合物。将所有收集的化合物干燥并测试酪氨酸酶抑制活性。十一个较小峰中被分别称为UP302a和UP302b的两个显示出强的酪氨酸酶抑制活性(图8)。分离和纯化后获得两种活性化合物：1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷(UP302a，10mg)(2)及1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羟基苯基)-丙烷(UP302b，6mg)(3)。使用MS和NMR谱(1H、13C、gHSQC和HMBC)阐明这两种化合物的结构。图9所示为UP302a的gHSQC谱。
酪氨酸酶抑制试验显示，UP302a是最有效的抑制剂，其IC50是0.24μM，而UP302b的IC50是
12μM。
酪氨酸酶抑制试验显示，UP302a是最有效的抑制剂，其IC50是0.24μM，而UP302b的IC50是
12μM。
[0151] 1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷(UP302a)(2)。收率0.02％(纯度＞98％，HPLC)；UVλMax：279.8nm；MS(超声电离、阳离子检测)：m/z 303(M+1，100 ％)；1H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)：δ1.70(2H，m，CH2)，2.03(3H，s，CH3)，2.43(2H，m，CH2)，2.49(2H，m，CH2)，3.58(3H，s，OCH3)，3.73(3H，s，OCH3)，6.11(1H，q，H-16)，6.25(1H，d，H-14)，6.65(1H，d，H-5)，6.76(1H，d，H-17)，6.97(1H，d，H-6)，8.93(1H，s，OH)，9.03(1H，s，OH)；13C-NMR(100MHz，(CD3)2SO)：δ28.8(C-9)，29.3(C-11)，
31.1(C-10)，55.3(C-7)，55.9(C-8)，102.4(C-14)，105.8(C-16)，106.1(C-5)，118.4(C-1)，
118.6(C-12)，126.9(C-3)，127.0(C-6)，130.1(C-17)，155.7(C-13)，156.2(C-15)，
156.3(C-4)以及156.8(C-2)。
31.1(C-10)，55.3(C-7)，55.9(C-8)，102.4(C-14)，105.8(C-16)，106.1(C-5)，118.4(C-1)，
118.6(C-12)，126.9(C-3)，127.0(C-6)，130.1(C-17)，155.7(C-13)，156.2(C-15)，
156.3(C-4)以及156.8(C-2)。
[0152] 1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羟基苯基)-丙烷(UP302b)(3)。收率0.01％(纯度＞95％，HPLC)；UVλMax：279.8nm；MS(超声电离、阳离子检测)：1
m/z 303(M+1，100％)；H-NMR(400MHz，(CD3COCD3)：δ1.82(2H，m，CH2)，2.07(3H，s，CH3)，
2.52(2H，m，CH2)，2.56(2H，m，CH2)，3.63(3H，s，OCH3)，3.77(3H，s，OCH3)，6.64(1H，q，H-15)，
6.72(1H，d，H-14)，6.64(1H，d，H-5)，6.70(1H，d，H-17)，7.00(1H，d，H-6)，7.65(1H，s，OH)以及7.69(1H，s，OH)。
m/z 303(M+1，100％)；H-NMR(400MHz，(CD3COCD3)：δ1.82(2H，m，CH2)，2.07(3H，s，CH3)，
2.52(2H，m，CH2)，2.56(2H，m，CH2)，3.63(3H，s，OCH3)，3.77(3H，s，OCH3)，6.64(1H，q，H-15)，
6.72(1H，d，H-14)，6.64(1H，d，H-5)，6.70(1H，d，H-17)，7.00(1H，d，H-6)，7.65(1H，s，OH)以及7.69(1H，s，OH)。
[0153] 实施例6. 从山菅(DE)(整株)大规模分离1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羟基苯基)-丙烷(UP302a)(2)
[0154] 收集、磨碎山菅(4.3kg整株)并使用渗滤式浸出器(percolationextractor)以甲醇为溶剂萃取3次。合并萃取液并蒸发以除去甲醇。然后将粗提物悬浮于水中并用DCM分配。分离各层并蒸干DCM层以提供60g的物质。对两层的LC-MS/PDA分析显示，大部分UP302a存在于DCM层，仅少量存在于水层。用己烷-ETOAC梯度在3个单独的硅胶柱上洗脱分级分离该DCM萃取液。总共获得15个亚流分(sub-fractions)并用HPLC-MS/PDA分析。在流分6到9中发现目标化合物(UP302a)，将它们合并共得到3g富集的UP302a。用水-MeOH梯度在填充CG-161树脂的空心柱(open column)中洗脱对富集的UP302a作进一步分离。对流分15到21的洗脱中共收集到23份含有UP302a的流分。然后合并流分15-21并蒸发溶剂得到700mg的固体，通过C-18柱以制备HPLC进一步纯化得到30mg的UP302a。经NMR、酶抑制试验和LC-MS/PDA证实该经纯化的产品的结构、酪氨酸酶抑制活性和纯度。
[0155] 实施例7. 通过硼氢化钠还原被取代的查耳酮合成二芳基烷烃
[0156] 以下利用2，4-二羟基)-3′，4′-二甲氧基查耳酮(4)举例说明通过用硼氢化钠还原被取代的查耳酮合成二芳基烷烃的通法。
[0157]
[0158] 将2，4-二羟基-3′，4′-二甲氧基查耳酮(4)(40mg)溶于1-丙醇(5m1)，然后加入硼氢化钠(15mg)，使该混和物在室温下反应2小时。反应完成时，加入20％乙酸(0.2m1)，将该混和物于80℃加热5分钟并冷却。然后在预填充的C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脱分离该混和物以提供1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)-1-丙醇(5)。通过MS、UV1
光谱、1D和2DH-NMR证实化合物(5)的结构。
光谱、1D和2DH-NMR证实化合物(5)的结构。
[0159] 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇(5)。收率60％(纯度＞98％，HPLC)；UVλMax：278.5nm；MS(超声电离，阳离子检测)：m/z305(M+1，100％)；1
H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)：δ1.93(2H，m，CH2)，2.60(2H，m，CH2)，4.49(1H，m，CH-OH)，
3.78(3H，s，OCH3)，3.80(3H，s，OCH3)，6.28(1H，q，H-5)，6.31(1H，d，H-3)，6.98(1H，d，H-6)，
6.71(1H，q，H-5′)，6.77(1H，d，H-2′)，6.83(1H，d，H-6′)。
H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)：δ1.93(2H，m，CH2)，2.60(2H，m，CH2)，4.49(1H，m，CH-OH)，
3.78(3H，s，OCH3)，3.80(3H，s，OCH3)，6.28(1H，q，H-5)，6.31(1H，d，H-3)，6.98(1H，d，H-6)，
6.71(1H，q，H-5′)，6.77(1H，d，H-2′)，6.83(1H，d，H-6′)。
[0160] 利用上述通法可将下列化合物还原成其相应的醇：2，4-二羟基-2′-羟基查耳酮、2′-羟基-4′-甲氧基-2，4-二甲氧基-查耳酮、4′-羟基-4-羟基-查耳酮、2′，4′-二羟基-2-羟基-查耳酮、2′，4′-二羟基-3，4-二甲氧基-查耳酮、2′，4′，
6′-三甲氧基-3，4-二甲氧基-查耳酮和2′-羟基-4′-甲氧基-3，4，5-三甲氧基-查耳酮以提供1-(2，4二羟基苯基)-3-(2′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(4-羟基苯基)-3-(4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，
4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇和1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇。
6′-三甲氧基-3，4-二甲氧基-查耳酮和2′-羟基-4′-甲氧基-3，4，5-三甲氧基-查耳酮以提供1-(2，4二羟基苯基)-3-(2′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(4-羟基苯基)-3-(4′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(2′-羟基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，
4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇和1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇。
[0161] 实施例8. 通过硼氧化钠还原被取代的二芳基丙酮合成被取代的二苯基丙醇[0162] 以下利用1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙酮(6)举例说明通过用硼氢化钠还原被取代的二芳基丙酮合成被取代的二苯基丙醇的通法。
[0163]
[0164] 将1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙酮(6)(5mg)溶于1-丙醇(1ml)，然后加入硼氢化钠(2mg)，使该混和物在室温下反应5小时。反应完成时，加入20％乙酸(0.2ml)中和过量的硼氢化钠。然后在预填充的C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脱分离该反应混和物以提供1-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇(7)。
[0165] 按照上述的合成通法还原下列二芳基烷烃化合物：1-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙酮、3-(5′-苄氧基-4′-甲氧基-2′-甲基苯基)-1-(2-羟基-4，5-二甲氧基苯基)-1-丙酮、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，
3′，4′，5′-四氢-bezo(b)dioxocin-8′-基)-1-丙酮以及3-(5′-氯-1′-甲
基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-1-丙烯酮以分别提供1-(2-羟
基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、3-(5′-苄氧
基-4′-甲氧基-2′-甲基苯基)-1-(2-羟基-4，5-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟
基-4-甲氧基-苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氢-bezo(b)dioxocin-8-基)-1-丙烯醇以及3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基-苯
基)-1-丙烯醇。
3′，4′，5′-四氢-bezo(b)dioxocin-8′-基)-1-丙酮以及3-(5′-氯-1′-甲
基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-1-丙烯酮以分别提供1-(2-羟
基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇、3-(5′-苄氧
基-4′-甲氧基-2′-甲基苯基)-1-(2-羟基-4，5-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羟
基-4-甲氧基-苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氢-bezo(b)dioxocin-8-基)-1-丙烯醇以及3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氢-咪唑-2′-基)-1-(2-羟基-4-甲氧基-苯
基)-1-丙烯醇。
[0166] 实施例9. 1，3-双(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇(9)的合成
[0167]
[0168] 将1，3-双(2，4-甲氧基苯基)-丙-1，3-二酮(8)(5mg)溶于1-丙醇(1ml)，然后加入硼氢化钠(3mg)，并使该混和物在室温下反应3小时。反应完成时，加入20％乙酸(0.2ml)中和过量的硼氢化钠。然后在预填充的C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脱分离该混和物以提供1，3-双(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇(9)。
[0169] 实施例10. 从新橙皮苷合成1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇(11)
[0170]
[0171] 新橙皮苷是二氢查耳酮的糖苷。将总重100mg的新橙皮苷悬浮于1NHCl 10ml中并于80℃加热2小时。冷却水解产物(10)并用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。合并乙酸乙酯层，蒸发除去乙酸乙酯并溶解于1-丙醇(5ml)中。向丙醇溶液中加入硼氢化钠(25mg)并在室温下搅拌2小时。反应完成后，在预填充C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脱分离该混和物以提供1-(2，4，6-三羟基苯基)-3-(3′-羟基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇(11)。
[0172] 实施例11. 提取、纯化及结构修饰紫铆苷(Butrin)以合成1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二羟基苯基)-1-丙醇(14)
[0173]
[0174] 紫铆苷是从紫铆(Butea frondosa)干花中用甲醇萃取并经多次反相柱色谱分离纯化的高含量黄烷酮糖苷。在用HCl水解除去糖后生成紫铆黄酮(12)，并通过RP-HTP纯化(整株收率1.5％)。于80℃用10％氢氧化钠处理紫铆黄酮以获得紫铆花素(13)，将其用硼氢化钠还原得到1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′，4′-二羟基苯基)-1-丙醇(14)(IC50＝250nM)。
[0175] 实施例12. 1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′羟基苯基)-1-丙醇(19)的合成
[0176]
[0177] 将间苯二酚(15)、3-甲氧基-4-羟基-肉桂酸(16)及H2SO4(5％)在THF中回流4小时得到7，4′-二羟基-3′-甲氧基黄烷酮(17)(90％收率)。然后将产物7，4′-二羟基-3′-甲氧基黄烷酮(17)用10％氢氧化钠在80℃处理1小时，随后在丙醇中用硼氢化钠还原以提供如LC-MS/PDA检测证实的1-(2，4-二羟基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羟基苯基)-1-丙醇(19)。该粗产物显示出相当强的酪氨酸酶抑制活性。通过HTP对混和物作进一步纯化。
[0178] 实施例13. 测定合成二芳基烷烃抑制酪氨酸酶的IC50
[0179] 使用实施例2所述方法测定合成二芳基烷烃对酪氨酸酶的抑制。采用动力学软件计算各样品的IC50值以验证反应在特定时间和浓度呈线性。应用实施例7-12所述方法，总共合成24种化合物，并评价它们抑制酪氨酸酶的能力。结果如表2所示。
[0180] 表2.合成二芳基烷烃和/或二芳基烷醇的IC50值
[0181]
[0182] 实施例14. 酶抑制动力学
[0183] 应用如实施例2所述方法，以0.75、1.25及2.5mM浓度的L-DOPA为底物评价不同浓度(0、261、522、1044nM)的抑制剂(UP302a)对酪氨酸酶的抑制。如图10所示，发现UP302a是具有强效及长效抑制作用的竞争性抑制剂。酪氨酸酶活性在与UP302a温育后几天不会恢复。相反，酪氨酸酶活性在与曲酸温育后仅1小时就完全恢复。
[0184] 实施例15. 对B-16细胞系黑素生成的抑制
[0185] 采用两个不同的试验评价对黑素生成的抑制。在第一个试验中，评价未经β-MSH诱导的黑素生成的抑制；而在第二个试验中，测定对在细胞培养基中经β-MSH诱导的黑素生成的抑制。简而言之，使B16 F1细胞(ATCC#CRL-622)生长至融合，然后每孔接种40,000个细胞。允许细胞在含5％CO2的湿润环境、37℃下贴壁(attach)整夜。第二天，将抑制剂以0-1000μM浓度范围一式三份加至细胞中并允许温育4天。通过加入在0-1000nM浓度范围内、以10倍增加的浓度的激素确定诱导黑素形成要求的β-MSH的量。一旦适当的β-MSH浓度确定，将细胞如上述所述接种，允许其贴壁整夜，然后与0-1000μM浓度范围内的酪氨酸酶抑制剂共同温育。每个早上目视监测颜色变化。显色后，从各孔中取出200μl细胞上清液并于450nm测定吸光度。结果读数用于测定有和无β-MSH诱导下的细胞试验中黑素形成的IC50。为了对细胞毒性进行初步比较，用250μM经处理的孔进行乳酸脱氢酶+试验(LDH)。LDH是自受损或死亡细胞中泄漏出的代谢酶。该酶在NAD 存在下转化发色团而产生可被分光光度计监测的变色。
[0186] 该试验结果显示，所有经测试的天然抑制剂(UP288、UP302a和UP302b)若不是优于曲酸的话至少也与曲酸相当。在两组条件下的IC50值存在某些差异。曲酸的抑制从内源性试验的IC50170μM到诱导试验中的IC5067μM有所改善。相对于曲酸，在经测试的抑制剂中化合物UP302b是唯一显示在两组条件下IC50增加的，从IC505.2μM增加至IC5034μM。所有经测试的化合物所测定的对酪氨酸酶抑制的IC50相对相同，UP302和UP302b两种化合物例外，相对于内源性试验的28μM和5.2μM以及诱导试验中的40μM和34μM，它们分别具有0.2μM和0.3μM的低IC50。这些差异可能是由于UP302a(2)和UP302b(3)相对于其它的抑制剂降低了对细胞的穿透性。然而，这通过它们对酶的抑制强度得以克服。
[0187] 表3提供了UP288和UP302a抑制剂相对于曲酸的两个试验的结果。
[0188] 实施例16. 细胞毒性试验
[0189] 将经化合物处理的孔用于进行乳酸脱氢酶试验(LDH)。LDH是自受损或死亡的细胞泄露出的代谢酶。该酶在NAD+存在下转化发色团而产生可被分光光度计监测的变色。在250μM浓度下检验细胞毒性。在此浓度下，这些化合物中没有比曲酸显著得多的细胞毒性。然而，应当指出的是仅检测了一个浓度(250μM)的细胞毒性。如表3所示，UP288(1)和UP302a(2)显示出与曲酸相当的中等的细胞毒性。
[0190] 表3.分离获得的化合物在小鼠B16F1细胞中对蘑菇酪氨酸酶
[0191] 和黑素形成的抑制以及细胞毒性的比较
[0192]
[0193] 实施例17. 分子力学(MM2)计算
[0194] 利用Chem3D软件进行分子力学计算，以使能量最低化并确定最稳定的3-D构象。使用以下参数：步距(Step interval)＝2.0fs、构造间隔(frame interval)＝10fs、
10,000步后停止、加热/冷却速率＝1.000Kcal/原子/PS、目标温度＝3000K。性质：π键序及空间能量总结。分析了所有天然及合成化合物以及其他二芳基烷烃和二芳基烷醇的结构。发现分离自山菅(L.)整株的最有效的酪氨酸酶抑制剂1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-2，4-二羟基苯基)-丙烷(UP302a(2)，IC50＝0.24μM)具有两个芳环彼此重叠的非常独特的3维构象。此构象的最小总能量是-4.7034KJ/Mol。两个芳环的间距是 分
别如图12-14所示，第一个芳环的酚羟基正好在第二个芳环两个甲氧基的上方，与两个氧原子的间距是 和 该分子内平行构象允许该化合物从顶端及底端完美地螯合
处于过氧化物形式[Cu″-O2-CuII]时的双核酶的两个铜离子。
10,000步后停止、加热/冷却速率＝1.000Kcal/原子/PS、目标温度＝3000K。性质：π键序及空间能量总结。分析了所有天然及合成化合物以及其他二芳基烷烃和二芳基烷醇的结构。发现分离自山菅(L.)整株的最有效的酪氨酸酶抑制剂1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-2，4-二羟基苯基)-丙烷(UP302a(2)，IC50＝0.24μM)具有两个芳环彼此重叠的非常独特的3维构象。此构象的最小总能量是-4.7034KJ/Mol。两个芳环的间距是 分
别如图12-14所示，第一个芳环的酚羟基正好在第二个芳环两个甲氧基的上方，与两个氧原子的间距是 和 该分子内平行构象允许该化合物从顶端及底端完美地螯合
处于过氧化物形式[Cu″-O2-CuII]时的双核酶的两个铜离子。
[0195] 实施例18. 将二芳基烷烃组合物配制成乳膏剂
[0196] UP302a包含被取代的二芳基丙烷作为主要的活性成分。这些化合物可溶于高极性溶剂，包括但不限于乙醇、丙二醇和乙二醇。它们可与药物学可接受和/或美容学可接受的赋形剂、佐剂和/或载体共同配制。这种赋形剂的实例包括但不限于
[0197] 水、缓冲剂、盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、甘露醇、Hank溶液、防腐剂及其他含水的生理学平衡盐溶液。还可以使用包括但不限于不挥发性油类、芝麻油、油酸乙酯或三酸甘油酯的非水载体。其他可用的剂型包括但不限于包含粘度增强剂的混悬剂，所述粘度增强剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。赋形剂还可包含微量的添加剂或者防腐剂，如改善颜色和化学稳定性的抗氧化剂。UP302还可制备成脂质体剂型以增加其皮肤穿透性或者制备成将活性成分的组合物缓慢释放至主体的控释剂型。
[0198] 优选将UP302a作为软膏剂、凝胶剂、洗液或乳膏基质或者作为乳剂、贴剂、敷料或面膜、无粘性纱布、绷带、药签或布拭子局部给药。这种局部施用可采用局部给药已知的任意标准方法局部地给药于任何患病区域。可向人类和动物给药UP302。
[0199] 根据给药方法及目标适应症，UP302a治疗组合物可以各种单位剂量形式给药。通常建议有效、非毒性的量在基于局部制剂总重量的0.01％到5％的范围内。将两种不同浓度的UP302a(按重量计，0.01％和0.5％)如表4及表5所述配制为乳膏剂。为了制备这些乳膏剂，在室温下将二芳基烷烃溶于水，并在搅拌器中匀化，直至其完全分散在溶液中(大约5分钟)以产生组合物A。室温下且不经搅动或搅拌，通过撤于溶液表面将Ultrez-21卡波姆(carbomer)加入该匀化的溶液中，并允许其完全湿润(不见白色区域)并沉入该溶液中。然后在轻微搅拌下，加热该溶液至40℃，加入甘油并混合该组合物另外的5分钟以提供组合物B。40℃下，将组合物A加至组合物B中并充分混合该组合物直至均质(约5分钟)。将所得的乳液冷却至30℃并在用搅拌棒和/或刮勺搅拌下滴定中和剂调节pH约为5.5(5.3到5.7)。由于中和诱导卡波姆的构象发生变化，该乳状液变得非常粘稠。搅拌时，该乳状液将达到乳膏剂适当的粘稠度。混合该组合物至均匀，将其倒入贮存容器中并于2℃到8℃贮存。
[0200] 表4.0.01％二芳基烷烃乳膏剂组分
[0201]
[0202] 表5.0.1％UP302乳膏剂组分
[0203]
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