IL-17A/FIL-23双特异性抗体及其应用
阅读：471发布：2021-03-05
专利汇可以提供IL-17A/FIL-23双特异性抗体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用双特异性 抗体 拮抗IL-17A、IL-17F及IL-23的活性，这些双特异性抗体包括对IL-17A及IL-17F具有交叉 反应性 的结合实体以及结合IL-23p19的结合实体。本发明涉及新颖的双特异性抗体形式及其使用方法。，下面是IL-17A/FIL-23双特异性抗体及其应用专利的具体信息内容。
1.一种双特异性抗体，其包含IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体，其中该IL-17A/F结合实体包含两对免疫球蛋白链，每一对具有一条轻链及一条重链，且该IL-23结合实体包含两个Fab片段，它们各自包含轻链及重链的CH1与可变区，且所述IL-23结合实体的各Fab片段与所述IL-17A/F结合实体的各重链的C末端连接，或与所述IL-17A/F结合实体的各轻链及各重链的N末端连接。
2.一种双特异性抗体，其包含IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体，其中该IL-23结合实体包含两对免疫球蛋白链，每一对具有一条轻链及一条重链，且该IL-17A/F结合实体包含两个Fab片段，它们各自包含轻链及重链的CH1与可变区，且所述IL-17A/F结合实体的各Fab片段与所述IL-23结合实体的各重链的C末端连接，或与所述IL-23结合实体的各轻链及各重链的N末端连接。
3.权利要求1或2的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体与该IL-23结合实体通过肽接头连接。
4.权利要求3的双特异性抗体，其中该接头包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
5.一种双特异性抗体，其包含IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体，其中该IL-17A/F结合实体包含轻链及IL-17A/F重链，且该IL-23结合实体包含轻链及IL-23重链。
6.权利要求1、2或5的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体及该IL-23结合实体的各轻链包括这样的可变域，所述可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
CDR2，其具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO:24的序列。
7.权利要求1、2或5的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体及该IL-23结合实体的各轻链包括含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变域。
8.权利要求1、2或5的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体及该IL-23结合实体的各轻链包括含有SEQ ID NO:10之氨基酸序列的恒定域。
9.权利要求1、2或5的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体及该IL-23结合实体的各轻链包括含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变域及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的恒定域。
10.权利要求1或2的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体的各重链包括这样的可变域，所述可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
11.权利要求5的双特异性抗体，其中该IL-17A/F重链包括这样的可变域，所述可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
12.权利要求1或2的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体的各重链包括含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变域。
13.权利要求5的双特异性抗体，其中该IL-17A/F重链包括含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变域。
14.权利要求1的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体的各重链包括含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的恒定域。
15.权利要求2的双特异性抗体，其中该IL-17A/F结合实体的各重链包括含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CH1区。
16.权利要求5的双特异性抗体，其中该IL-17A/F重链包括含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CH1区。
17.权利要求1或2的双特异性抗体，其中该IL-23结合实体的各重链包括这样的可变域，所述可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
18.权利要求5的双特异性抗体，其中该IL-23重链包括这样的可变域，所述可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
及CDR3，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
19.权利要求1或2的双特异性抗体，其中该IL-23结合实体的各重链包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可变域。
20.权利要求5的双特异性抗体，其中该IL-23重链包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可变域。
21.权利要求2的双特异性抗体，其中该IL-23结合实体的各重链包括含有SEQ ID
NO:8的氨基酸序列或SEQ ID NO:8之残基1至326的氨基酸序列的恒定域。
22.权利要求5的双特异性抗体，其中该IL-23重链包括含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或SEQ ID NO:8之残基1至326的氨基酸序列的恒定域。
23.权利要求1的双特异性抗体，其中该IL-23结合实体的各重链包括含有SEQ ID
NO:14的氨基酸序列的CH1区。
24.一种双特异性抗体，其包括成对重链和成对轻链，所述重链各自包含选自由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:84组成之群组的氨基酸序列且所述轻链各自包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；或所述重链各自包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列且所述轻链各自包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
25.权利要求24的双特异性抗体，其包括各自包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的成对轻链。
26.一种双特异性抗体，其包括IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体，其中该IL-17A/F结合实体包括含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的IL-17A/F重链，且该IL-23结合实体包括含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链及含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的IL-23重链。
27.一种双特异性抗体，其包括第一结合实体及第二结合实体，其中该第一结合实体是包括两对免疫球蛋白链的抗体；该第二结合实体是包括重链可变域及轻链可变域的Fv单元；所述第二结合实体的Fv单元定位于所述第一结合实体的抗体的Fab区与铰链区之间；
且所述第二结合实体的Fv单元与所述第一结合实体的抗体的Fab区连接。
28.权利要求27的双特异性抗体，其中该第一结合实体是淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素或白介素受体；且该第二结合实体是淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素或白介素受体。
29.权利要求27的双特异性抗体，其中该第一结合实体是IL-23结合实体且该第二结合实体是IL-17A/F结合实体，或该第一结合实体是IL-17A/F结合实体且该第二结合实体是IL-23结合实体。
30.权利要求29的双特异性抗体，其中所述第二结合实体的Fv单元的重链可变域通过第一肽接头分子与所述第一结合实体的抗体的Fab片段的CH1区连接，且所述第二结合实体的Fv单元的轻链可变域通过第二肽接头与所述第一结合实体的抗体的Fab片段的轻链恒定域连接。
31.权利要求30的双特异性抗体，其中该第一肽接头具有SEQ ID NO:12或SEQ ID
NO:86的氨基酸序列，且该第二肽接头具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
32.权利要求29的双特异性抗体，其中所述第二结合实体的Fv单元具有这样的轻链可变域，所述轻链可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
33.权利要求29的双特异性抗体，其中所述第二结合实体的Fv单元具有包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变域。
34.权利要求29的双特异性抗体，其中该Fv单元是包括如下所述的重链可变域的
IL-23结合实体，该重链可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
35.权利要求29的双特异性抗体，其中该Fv单元是包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变域的IL-23结合实体。
36.权利要求29的双特异性抗体，其中该Fv单元如下所述的重链可变域的IL-17A/F结合实体，该重链可变域含有：CDR1，其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
37.权利要求29的双特异性抗体，其中该Fv单元是包括含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变域的IL-17A/F结合实体。
38.一种双特异性抗体，其包括：各自包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的成对轻链；或各自包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的成对轻链；或各自包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的成对轻链；或各自包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的成对轻链；或各自包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的成对轻链；或各自包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的成对轻链；或各自包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的成对轻链；或各自包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的成对轻链。
39.一种特异性结合IL-17A(SEQ ID NO:2)及IL-17F(SEQ ID NO:4)的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变域及轻链可变域，其中该重链可变域包括SEQ ID NO:13的氨基酸残基且轻链可变域包括SEQ ID NO:9的氨基酸残基。
40.权利要求39的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含人源恒定区。
41.权利要求40的分离的单克隆抗体，其中该重链的同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
42.权利要求41的分离的单克隆抗体，其中该IgG4重链在根据Kabat的241位具有丝氨酸至脯氨酸突变。
43.权利要求39的分离的单克隆抗体，其中该重链包括SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基。
44.权利要求39的分离的单克隆抗体，其中该轻链包括SEQ ID NO:17的氨基酸残基。
45.权利要求39的分离的单克隆抗体，其中该重链包括SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基，且该轻链包括SEQ ID NO:17的氨基酸残基。
46.一种双特异性抗体，其包括权利要求39的抗体。
47.一种特异性结合IL-23p19(SEQ ID NO:6)的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变域及轻链可变域，其中该重链可变域包括SEQ ID NO:7的氨基酸残基，且其中该轻链可变域包括SEQ ID NO:9的氨基酸残基。
48.权利要求47的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含人源恒定区。
49.权利要求48的分离的单克隆抗体，其中该重链的同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
50.权利要求49的分离的单克隆抗体，其中该IgG4重链在根据Kabat的241位具有丝氨酸至脯氨酸突变。
51.权利要求47的分离的单克隆抗体，其中该重链包括SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基。
52.权利要求47的分离的单克隆抗体，其中该轻链包括SEQ ID NO:17的氨基酸残基。
53.权利要求47的分离的单克隆抗体，其中该重链包括SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基，且该轻链包括SEQ ID NO:17的氨基酸残基。
54.一种分离的双特异性抗体，其包括权利要求39的抗体。
55.一种分离的双特异性抗体，其包括第一结合实体及第二结合实体，其中该第一结合实体是包括两对免疫球蛋白链的抗体且该第二结合实体包括单域抗体，其中所述第二结合实体的单域抗体定位于该第一结合实体的Fab片段的CH1区与铰链之间。
56.权利要求55的分离的双特异性抗体，其中该第二结合实体通过接头分子与该第一结合实体连接。
57.权利要求56的分离的双特异性抗体，其中该接头分子是(G4S)2。
58.权利要求56的分离的双特异性抗体，其中该接头分子是SEQ ID NO:86的氨基酸残基。
59.权利要求56的分离的双特异性抗体，其中该第一结合实体是淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素或白介素受体，且该第二结合实体是淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素或白介素受体。
60.一种分离的核酸，其编码如权利要求1、2、5、24、26、27及55中任一项中所述的双特异性抗体的重链或轻链。
61.一种分离的核酸，其编码依照权利要求39或47的抗体的重链或轻链。
62.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求1的双特异性抗体的重链；及
转录终止子。
63.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求1的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
64.一种重组宿主细胞，其包括权利要求62及63的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
65.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求1的双特异性抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求1的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
66.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求1的双特异性抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求1的双特异性抗体的轻链；及
第二转录终止子。
67.一种重组宿主细胞，其包括权利要求65或权利要求66的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
68.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求2的双特异性抗体的重链；及
转录终止子。
69.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求2的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
70.一种重组宿主细胞，其包括权利要求68及69的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
71.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求2的双特异性抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求2的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
72.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求2的双特异性抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求2的双特异性抗体的轻链；及
第二转录终止子。
73.一种重组宿主细胞，其包括权利要求71或72的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
74.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求5的双特异性抗体的重链；及
转录终止子。
75.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求5的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
76.一种重组宿主细胞，其包括权利要求74及75的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
77.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求5的双特异性抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求5的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
78.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求5的双特异性抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求5的双特异性抗体的轻链；及
第二转录终止子。
79.一种重组宿主细胞，其包括权利要求77或权利要求78的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
80.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求24的双特异性抗体的重链；及
转录终止子。
81.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求24的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
82.一种重组宿主细胞，其包括权利要求80及81的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
83.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求24的双特异性抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求24的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
84.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求24的双特异性抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求24的双特异性抗体的轻链；及
第二转录终止子。
85.一种重组宿主细胞，其包括权利要求83或权利要求84的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
86.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求27的双特异性抗体的重链；及
转录终止子。
87.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求27的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
88.一种重组宿主细胞，其包括权利要求86及87的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
89.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求27的双特异性抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求27的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
90.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求27的双特异性抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求27的双特异性抗体的轻链；及
第二转录终止子。
91.一种重组宿主细胞，其包括权利要求89或权利要求90的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
92.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求55的双特异性抗体的重链；及
转录终止子。
93.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求55的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
94.一种重组宿主细胞，其包括权利要求92及93的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
95.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求55的双特异性抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求55的双特异性抗体的轻链；及
转录终止子。
96.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求55的双特异性抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求55的双特异性抗体的轻链；及
第二转录终止子。
97.一种重组宿主细胞，其包括权利要求95或权利要求96的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
98.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求39的抗体的重链；及
转录终止子。
99.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求39的抗体的轻链；及
转录终止子。
100.一种重组宿主细胞，其包括权利要求98及99的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
101.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求39的抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求39的抗体的轻链；及
转录终止子。
102.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求39的抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求39的抗体的轻链；及
第二转录终止子。
103.一种重组宿主细胞，其包括权利要求101或权利要求102的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
104.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求47的抗体的重链；及
转录终止子。
105.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
多核苷酸，其编码权利要求47的抗体的轻链；及
转录终止子。
106.一种重组宿主细胞，其包括权利要求104及105的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
107.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求47的抗体的重链；
第二多核苷酸，其编码权利要求47的抗体的轻链；及
转录终止子。
108.一种表达载体，其包括下列可操作连接的组件：
第一转录启动子；
第一多核苷酸，其编码权利要求47的抗体的重链；及
第一转录终止子；及
第二转录启动子；
第二多核苷酸，其编码权利要求47的抗体的轻链；及
第二转录终止子。
109.一种重组宿主细胞，其包括权利要求107或权利要求108的表达载体，其中该细胞表达所述重链及所述轻链。
110.一种产生权利要求1的双特异性抗体的方法，该方法包括：
培养依照权利要求64或权利要求67的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。171.一种组合物，其包括依照权利要求1、2、5、
24、26、27、37或55的双特异性抗体或依照权利要求39或47的抗体，及医药上可接受的载体。
111.一种产生权利要求2的双特异性抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求70或权利要求73的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。
112.一种产生权利要求5的双特异性抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求76或权利要求79的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。
113.一种产生权利要求24的双特异性抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求82或权利要求85的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。
114.一种产生权利要求27的双特异性抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求88或权利要求91的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。
115.一种产生权利要求55的双特异性抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求94或权利要求97的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。
116.一种产生权利要求39的抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求100或权利要求103的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。
117.一种产生权利要求47的抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求106或权利要求109的细胞；及
分离由该细胞产生的双特异性抗体。
118.权利要求110的方法，其中该细胞是原核细胞。
119.权利要求118的方法，其中该原核细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。
120.权利要求110的方法，其中该细胞为真核细胞。
121.权利要求120的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。
122.权利要求121的方法，其中该哺乳动物细胞选自下组：VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK细胞。
123.权利要求120的方法，其中该真核细胞为酵母细胞。
124.权利要求123的方法，其中该酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
125.权利要求111的方法，其中该细胞为原核细胞。
126.权利要求125的方法，其中该原核细胞为大肠杆菌细胞。
127.权利要求111的方法，其中该细胞为真核细胞。
128.权利要求127的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。
129.权利要求128的方法，其中该哺乳动物细胞选自下组：VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK细胞。
130.权利要求127的方法，其中该真核细胞为酵母细胞。
131.权利要求130的方法，其中该酵母细胞是酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。
132.权利要求111的方法，其中该细胞为原核细胞。
133.权利要求132的方法，其中该原核细胞为大肠杆菌细胞。
134.权利要求111的方法，其中该细胞为真核细胞。
135.权利要求134的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。
136.权利要求135的方法，其中该哺乳动物细胞选自下组：VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK细胞。
137.权利要求134的方法，其中该真核细胞为酵母细胞。
138.权利要求137的方法，其中该酵母细胞为酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。
139.权利要求112的方法，其中该细胞为原核细胞。
140.权利要求139的方法，其中该原核细胞为大肠杆菌细胞。
141.权利要求112的方法，其中该细胞为真核细胞。
142.权利要求141的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。
143.权利要求142的方法，其中该哺乳动物细胞选自下组：VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK细胞。
144.权利要求141的方法，其中该真核细胞为酵母细胞。
145.权利要求144的方法，其中该酵母细胞为酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。
146.权利要求113的方法，其中该细胞为原核细胞。
147.权利要求146的方法，其中该原核细胞为大肠杆菌细胞。
148.权利要求113的方法，其中该细胞为真核细胞。
149.权利要求148的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。
150.权利要求149的方法，其中该哺乳动物细胞选自下组：VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK细胞。
151.权利要求148的方法，其中该真核细胞为酵母细胞。
152.权利要求151的方法，其中该酵母细胞为酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。
153.权利要求114的方法，其中该细胞为原核细胞。
154.权利要求153的方法，其中该原核细胞为大肠杆菌细胞。
155.权利要求114的方法，其中该细胞为真核细胞。
156.权利要求155的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。
157.权利要求156的方法，其中该哺乳动物细胞选自下组：VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK细胞。
158.权利要求155的方法，其中该真核细胞为酵母细胞。
159.权利要求158的方法，其中该酵母细胞为酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。
160.权利要求115的方法，其中该细胞为原核细胞。
161.权利要求160的方法，其中该原核细胞为大肠杆菌细胞。
162.权利要求115的方法，其中该细胞为真核细胞。
163.权利要求162的方法，其中该真核细胞为哺乳动物细胞。
164.权利要求163的方法，其中该哺乳动物细胞选自下组：VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK细胞。
165.权利要求162的方法，其中该真核细胞为酵母细胞。
166.权利要求165的方法，其中该酵母细胞为酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。
167.一种为需要治疗以IL-17A、IL-17F及IL-23中的一或多者的表达升高为特征的疾病的哺乳动物治疗该疾病的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的依照权利要求
1、2、5、24、26、27、37或55的双特异性抗体或依照权利要求39或47的抗体。
168.权利要求167的方法，其中该疾病是多发性硬化(MS)、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)诸如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病、特应性皮炎、接触性皮炎、全身性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及/或进展复发型多发性硬化)、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、舍格伦综合征、银屑病、银屑病性关节炎、成人呼吸道疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤例如特发性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道高反应性、慢性支气管炎、变应性哮喘、湿疹、幽门螺杆菌感染、由腹膜炎症(例如来自感染、损伤等)所致的腹内黏连及/或脓肿、肾病综合征、特发性脱髓鞘多发性神经病变、格-巴二氏综合征、器官同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克-富二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自移植物，诸如血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、移植排斥、链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、牙龈炎/牙周炎、疱疹性基质角膜炎、麸质敏感性肠病再狭窄、川崎病或免疫介导的肾病。
169.一种为需要抑制炎症的哺乳动物抑制炎症的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的依照权利要求1、2、5、24、26、27、37或55的双特异性抗体或依照权利要求39或47的抗体。
170.权利要求169的用途，其中该炎症与选自下组的疾病有关：多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及/或进展复发型多发性硬化)、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)诸如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病、特应性皮炎、接触性皮炎、全身性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、多发性硬化(MS)、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、舍格伦综合征、银屑病、银屑病性关节炎、成人呼吸道疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤例如特发性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道高反应性、慢性支气管炎、变应性哮喘、湿疹、幽门螺杆菌感染、由腹膜炎症(例如来自感染、损伤等)所致的腹内黏连及/或脓肿、肾病综合征、特发性脱髓鞘多发性神经病变、格-巴二氏综合征、器官同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：
血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、移植排斥、链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、牙龈炎/牙周炎、疱疹性基质角膜炎、麸质敏感性肠病再狭窄、川崎病及免疫介导的肾病。
171.一种组合物，其包括依照权利要求1、2、5、24、26、27、37或55的双特异性抗体或依照权利要求39或47的抗体，及医药上可接受的载体。
172.一种为需要治疗以IL-17A、IL-17F及IL-23中的一或多者的表达升高为特征的疾病的哺乳动物治疗该疾病的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求171的组合物。
173.权利要求172的方法，其中该疾病是多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性
硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及/或进展复发型多发性硬化)、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)诸如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病、特应性皮炎、接触性皮炎、全身性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、多发性硬化(MS)、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、舍格伦综合征、银屑病、银屑病性关节炎、成人呼吸道疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤例如特发性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道高反应性、慢性支气管炎、变应性哮喘、湿疹、幽门螺杆菌感染、由腹膜炎症(例如来自感染、损伤等)所致的腹内黏连及/或脓肿、肾病综合征、特发性脱髓鞘多发性神经病变、格-巴二氏综合征、器官同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、移植排斥、链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、牙龈炎/牙周炎、疱疹性基质角膜炎、麸质敏感性肠病再狭窄、川崎病或免疫介导的肾病。
174.一种为需要抑制炎症的哺乳动物抑制炎症的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的依照权利要求171的组合物。
175.权利要求174的用途，其中该炎症与选自下组的疾病有关：多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及/或进展复发型多发性硬化)、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)诸如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病、特应性皮炎、接触性皮炎、全身性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、多发性硬化(MS)、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、舍格伦综合征、银屑病、银屑病性关节炎、成人呼吸道疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤例如特发性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道高反应性、慢性支气管炎、变应性哮喘、湿疹、幽门螺杆菌感染、由腹膜炎症(例如来自感染、损伤等)所致的腹内黏连及/或脓肿、肾病综合征、特发性脱髓鞘多发性神经病变、格-巴二氏综合征、器官同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：
血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、移植排斥、链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、牙龈炎/牙周炎、疱疹性基质角膜炎、麸质敏感性肠病再狭窄、川崎病及免疫介导的肾病。
176.如权利要求1、2和26中任一项中所述的双特异性抗体，其中所述IL-17A/F结合实体结合：
-9 -9
(a)IL-17A同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-10 -10 -10 -11
1×10 M、至少5×10 M、至少8×10 M或至少1×10 M；
-9 -9
(b)IL-17F同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-10 -10 -10 -10 -10 -11
1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M或至少1×10 M；
及/或
-8 -8
(c)IL-17A/F异二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-9 -9 -9 -9 -9 -9
1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M、至少6×10 M、至少-9 -9 -10 -10
7×10 M、至少9×10 M、至少1×10 M或至少5×10 M，且
其中该结合亲和力是通过表面等离子共振，例如Biacore测量的。
177.如权利要求1、2和26中任一项中所述的双特异性抗体，其中所述IL-23结合实-9 -9 -10
体结合IL-23p19，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少-10 -10 -10 -10 -10 -10
2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少
-10 -10 -11
8×10 或至少9×10 、至少1×10 ，其中该结合亲和力是通过等表面等离子共振，例如Biacore测量的。
178.如权利要求1、2和26中任一项中所述的双特异性抗体，其中所述IL-17A/F结合实体结合：
-9 -9
(a)IL-17A同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-10 -10 -10 -11
1×10 M、至少5×10 M、至少8×10 M或至少1×10 M；
-9 -9
(b)IL-17F同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-10 -10 -10 -10 -10 -11
1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M或至少1×10 M；
及/或
-8 -8
(c)IL-17A/F异二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-9 -9 -9 -9 -9 -9
1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M、至少6×10 M、至少-9 -9 -10 -10
7×10 M、至少9×10 M、至少1×10 M或至少5×10 M；且
-9
其中该IL-23结合实体结合IL-23p19，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少
-9 -10 -10 -10 -10 -10
5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 、至少-10 -10 -10 -10 -11
6×10 、至少7×10 、至少8×10 或至少9×10 、至少1×10 ；且
其中该结合亲和力是通过等表面等离子共振，例如Biacore测量的。
179.如权利要求1、2和26中任一项中所述的双特异性抗体，其中所述IL-17A/F结合实体中和或抑制(a)原代人小气道上皮细胞(SAEC)中IL-17A诱导G-CSF，其IC50为0.5pm或更小；(b)原代人小气道上皮细胞(SAEC)中IL-17F诱导G-CSF，其IC50为2.0nM或更小、
1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；
及/或(c)原代人小气道上皮细胞(SAEC)中IL-17A/F诱导G-CSF，其IC50为1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、
0.6nM或更小或0.5nM或更小。
180.如权利要求1、2和26中任一项中所述的双特异性抗体，其中所述IL-17A/F结合实体中和或抑制(a)人原代成纤维细胞(HFFF)中IL-17A诱导IL-6，其IC50为0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)人原代成纤维细胞(HFFF)中IL-17F诱导IL-6，其IC50为
30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)人原代成纤维细胞(HFFF)中IL-17A/F诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小、或9.0nM或更小。
181.如权利要求1、2和26中任一项中所述的双特异性抗体，其中所述IL-23结合实体中和或抑制(a)鼠脾细胞中IL-23诱导IL-17A和IL-17F产生，其IC50为0.5nM或更小、
0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、
0.07nM或更小、或0.06nM或更小。
182.如权利要求1、2和26中任一项中所述的双特异性抗体，其中所述IL-23结合实体中和或抑制活化的原代人T细胞中IL-23诱导STAT3磷酸化，其IC50为0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小、或0.05nM或更小。
183.依照权利要求27的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段结合：
-9 -9
(a)IL-17A同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-10 -10 -10 -11
1×10 M、至少5×10 M、至少8×10 M或至少1×10 M；
-9 -9
(b)IL-17F同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-10 -10 -10 -10 -10 -11
1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M或至少1×10 M；
及/或
-8 -8
(c)IL-17A/F异二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少
-9 -9 -9 -9 -9 -9
1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M、至少6×10 M、至少-9 -9 -10 -10
7×10 M、至少9×10 M、至少1×10 M或至少5×10 M，且
其中该结合亲和力是通过等表面等离子共振，例如Biacore测量的。
184.依照权利要求27的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段中和或抑制(a)原代人小气道上皮细胞(SAEC)中IL-17A诱导G-CSF，其IC50为0.5pm或更小；(b)原代人小气道上皮细胞(SAEC)中IL-17F诱导G-CSF，其IC50为2.0nM或更小、
1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、或1.0nM或更小；
及/或(c)原代人小气道上皮细胞(SAEC)中IL-17A/F在诱导G-CSF，其IC50为1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、或0.5nM或更小。
185.权利要求27的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段中和或抑制(a)IL-17A在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小、或
0.01nM或更小；(b)人原代成纤维细胞(HFFF)中IL-17F诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、
28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、或10nM或更小；及/或(c)人原代成纤维细胞(HFFF)中IL-17A/F诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小、或9.0nM或更小。
186.权利要求47的单克隆抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段结
-9 -9 -10
合IL-23p19，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少-10 -10 -10 -10 -10 -10
2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少
-10 -10 -11
8×10 或至少9×10 、至少1×10 ，其中该结合亲和力是通过等表面等离子共振，例如Biacore测量的。
187.权利要求47的单克隆抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段中和或抑制(a)鼠脾细胞中IL-23诱导IL-17A及IL-17F产生，其IC50为0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、或0.06nM或更小。
188.权利要求47的单克隆抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段中和或抑制活化的原代人T细胞中IL-23诱导STAT3磷酸化，其IC50为0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小、或0.05nM或更小。
189.一种特异性结合IL-23p19的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段结合IL-23p19上的不连续表位，所述不连续表位包括第一表位及第二表位，其中该第一表位由SEQ ID NO:6的氨基酸残基33至59中的至少一个组成，且该第二表位由SEQ ID NO:6的氨基酸残基89至125中的至少一个组成。
190.权利要求189的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段至少结合所述第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54。
191.权利要求189的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段至少结合所述第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基55。
192.权利要求189的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段至少结合所述第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54及55。
193.权利要求189的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段至少结合该第二表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基116。
194.权利要求189的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段至少结合该第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54及55，且至少结合该第二表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基116。
195.权利要求189的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。
196.权利要求189至195中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的
不连续表位是通过蛋白质水解消化法、氢/氘交换质谱及丙氨酸诱变法中的至少一者测定的。
197.权利要求189至195中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的不连续表位是通过蛋白质水解消化法测定的。
198.权利要求189至195中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的不连续表位是通过氢/氘交换质谱或丙氨酸诱变法测定的。
199.权利要求189至195中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的不连续表位是通过丙氨酸诱变法测定的。
200.一种特异性结合IL-23p19的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段结合IL-23p19上的包括第一表位及第二表位的不连续表位，其中该抗体或抗原结合片段至少结合该第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54及55，且至少结合该第二表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基116。
201.权利要求200的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。
202.权利要求200或201的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的不连续表位是通过蛋白质水解消化法、氢/氘交换质谱及丙氨酸诱变法中的至少一者测定的。
203.权利要求200或201的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的不连续表位是通过蛋白质水解消化法测定的。
204.权利要求200或201的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的不连续表位是通过氢/氘交换质谱或丙氨酸诱变法测定的。
205.权利要求200或201的抗体或抗原结合片段，其中所述IL-23p19上的不连续表位是通过丙氨酸诱变法测定的。
206.权利要求196的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。
207.一种分离的IL-17A/F结合实体，其特异性结合IL-17A上的至少包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基108(Tyr)的表位，其中该IL-17A/F结合实体是单克隆抗体或其抗原结合片段。
208.权利要求207的IL-17A/F结合实体，其中所述IL-17A上的表位是通过丙氨酸诱变法测定的。
209.权利要求207的IL-17A/F结合实体，其中所述IL-17A上的表位是通过X射线结
晶学测定的。
210.权利要求207的IL-17A/F结合实体，其中所述IL-17A上的表位是通过丙氨酸诱变法及X射线结晶学测定的。
211.如权利要求207至210中任一项所述的IL-17A/F结合实体，其中该IL-17A表位
是连续或不连续表位。
212.一种分离的IL-17A/F交叉反应性单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段结合IL-17A上的至少包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基108(Tyr)的表位。
213.权利要求212的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述IL-17A上的表位是通过丙氨酸诱变法测定的。
214.权利要求212的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述IL-17A上的表位是通过X射线结晶学测定的。
215.如权利要求212至214中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该
IL-17A表位是连续或不连续表位。
IL-17A/F IL-23双特异性抗体及其应用
[0001] 发明背景
[0002] 细胞因子是介导各种生物效应(包含诱导免疫细胞增殖、发生、分化及/或迁移，以及调控许多细胞类型的生长及分化)的可溶性小蛋白(例如参见Arai等人，Annu.Rev.Biochem.59:783(1990)；Mosmann,Curr.Opin.Immunol.3:311(1991)；Paul 等 人，Cell,76:241(1994))。细胞因子诱导的免疫功能亦可包含炎症性应答，其特征在于免疫细胞的全身性或局部积累。尽管这些免疫反应确实具有宿主保护效应，但在应答涉及过度及/或慢性炎症时，其可产生病理学后果，例如在自身免疫病症(例如多发性硬化)及癌症/肿瘤疾病中(Oppenheim等人编辑，Cytokine Reference,Academic Press,San Diego,CA(2001)；von Andrian等人，New Engl.J.Med.,343:1020(2000)；Davidson等人，New Engl.J.Med.,345:340(2001)；Lu等人，Mol.Cancer Res.,4:221(2006)；Dalgleish等人，Cancer Treat Res.,130:1(2006))。
[0003] IL-17A、IL-17F及IL-23是参与炎症的细胞因子。IL-17A诱导由滑膜成纤维细胞、单核细胞及巨噬细胞产生诸如IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-23等炎症性细胞因子，所有这些因子均促进炎症及Th17发生。IL-17A亦诱导大量趋化因子(包括CXCL-1、CXCL-2、CXCL-5、CXCL-8、CCL-2及CCL-20)，从而引起T细胞、B细胞、单核细胞及嗜中性粒细胞的募集。Lundy,S.K.,Arthritis Res.Ther.,9:202(2007)。IL-17F与IL-17A拥有最大同源性(55％)且亦为促炎症细胞因子。IL-17A及IL-17F皆由Th17细胞产生，而其他IL-17家族成员IL-17B、IL-17C及IL-17D由非T细胞源产生。IL-17A及IL-17F可以IL-17A同二聚体及IL-17F同二聚体或IL-17A/F异二聚体形式存在。Liang,S.C.等人，J.Immunol.,179:7791-7799(2007)。IL-17A在类风湿性关节炎血清及滑液中有所增多，且存在于滑膜的富T细胞区域中。Shahrara,S.,Arthritis Res.Ther.,10:R93(2005)。IL-17A亦可协调骨及软骨损害。对IL-17的有效阻断需要中和IL-17A同二聚体、IL-17F同二聚体及IL-17A/F异二聚体。
[0004] IL-23是一种1型异二聚体，其包括经由二硫化物相连接的19千道尔顿(kilodalton，kD)的四重螺旋核心α亚单位(IL-23p19)及40kD的另一不同β亚 单位(IL-12p40)。IL-23是联系先天性免疫应答分支与适应性免疫应答分支的关键细胞因子；
其应答于抗原攻击而在而早期产生，且对于驱动早期局部免疫应答而言至关重要。另外，IL-23在活化NK细胞、增强T细胞增殖及调控抗体产生中发挥主要作用。IL-23亦调控在针对细胞内病原体的细胞介导的免疫性中较为重要的促炎症性细胞因子(例如IFN-γ)。最新报导指示，在人类中，增加量的IL-23与若干自身免疫疾病(包含类风湿性关节炎(RA)、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn's disease)(CD)、银屑病及多发性硬化(MS))有关。IL-23p19敲除小鼠可抵抗自身免疫脑脊髓炎(EAE)、胶原诱导的关节炎(CIA)及中枢神经系统自身免疫诱导。IL-23对于人类Th17细胞的发生而言并不重要，但似乎为其存活及/或扩增所需。Paradowska-Gorycka,A.,Scandinavian Journal of Immunology,71:134-145(2010)。基因研究揭露，IL-23受体基因与对于若干自身免疫疾病(包括CD、RA及格雷夫斯眼病(Graves'ophthalmopathy))的易感性有关。IL-23-Th17轴对于自身免疫疾病的发生至关重要。Leng等人，Archives of Medical Research,41:221-225(2010)。
其应答于抗原攻击而在而早期产生，且对于驱动早期局部免疫应答而言至关重要。另外，IL-23在活化NK细胞、增强T细胞增殖及调控抗体产生中发挥主要作用。IL-23亦调控在针对细胞内病原体的细胞介导的免疫性中较为重要的促炎症性细胞因子(例如IFN-γ)。最新报导指示，在人类中，增加量的IL-23与若干自身免疫疾病(包含类风湿性关节炎(RA)、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn's disease)(CD)、银屑病及多发性硬化(MS))有关。IL-23p19敲除小鼠可抵抗自身免疫脑脊髓炎(EAE)、胶原诱导的关节炎(CIA)及中枢神经系统自身免疫诱导。IL-23对于人类Th17细胞的发生而言并不重要，但似乎为其存活及/或扩增所需。Paradowska-Gorycka,A.,Scandinavian Journal of Immunology,71:134-145(2010)。基因研究揭露，IL-23受体基因与对于若干自身免疫疾病(包括CD、RA及格雷夫斯眼病(Graves'ophthalmopathy))的易感性有关。IL-23-Th17轴对于自身免疫疾病的发生至关重要。Leng等人，Archives of Medical Research,41:221-225(2010)。
[0005] IL-17A、IL-17F及IL-23p19在介导及促进若干自身免疫疾病中所显示的活性阐释了可拮抗这些靶的分子的临床潜力，也说明了对可拮抗这些靶的分子的需求。如本文所描述的本发明可满足这些及其他需求。
[0007] 图1是全抗体及其模块组分的示意性图解。
[0008] 图2绘示称为biAbFabL的双特异性抗体的模型，其包含全抗体，该全抗体在C末端经由接头附接有该双特异性抗体的第二臂的Fab单元，且利用共同轻链。
[0009] 图3绘示称为taFab的双特异性抗体的模型，其包含全抗体，该全抗体在N末端经由接头附接有该双特异性抗体的第二臂的Fab单元。如同重链部分一样，双特异性抗体的每一条臂具有两条经由接头附接的轻链。
[0010] 图4绘示称为异二聚体Fc的双特异性抗体的模型，其类似于传统抗体，然而，其含有两条经由CH3区中的静电互补性缔合而缔合的不同重链。该异二聚体Fc利用共同轻链。
[0011] 图5绘示称为VCVFc的双特异性抗体的模型，其含有全抗体，该全抗体 的Fab区与铰链之间经由接头插入有该双特异性抗体的第二臂的Fv单元。
[0012] 图6绘示称为VCDFc的双特异性抗体的模型，其含有全抗体，该全抗体的Fab区与铰链之间经由接头插入有该双特异性抗体的第二臂的单域抗体。
[0013] 图7图解说明ELISA结果，其展示与IL-23p19具有强抗体结合且缺乏对IL-12的交叉反应性。
[0015] 图9展示7B7、 (优特克单抗(ustekinumab)，抗IL-23p40抗体)及人类IL-23受体结合各种IL-23p19丙氨酸切削突变体、野生型及经纯化野生型L-23p19(阳性对照)及阴性对照的能力的Biacore结果。7B7mAb结合展示于左侧栏中，展示于中间栏中且hIL-23R-Fc结合展示于右侧栏中。选择使用星号展示的
4种突变体进行放大以证实这些结果。
4种突变体进行放大以证实这些结果。
[0016] 图10展示IL-23p19抗体与IL-23丙氨酸突变体的结合的Biacore动力学分析。
[0017] 图11示意性图解说明用于鉴别及选择7B7抗体(抗IL-23p19)的过程。
[0018] 图12示意性图解说明狨EAE模型中的随时间变化的临床疾病评分。
[0019] 图13示意性图解说明狨EAE模型中的MRI损害评分。
[0020] 图14示意性图解说明狨EAE模型中的MRI视神经评分。
[0021] 图15展示Fab与IL-17A或IL-17F的所有4种结构根据白介素对准的重叠图。
[0022] 图16以图表形式展示IL-17A突变体的细胞功能活性。
[0023] 图17以图表形式展示IL-17F突变体的细胞功能活性。
[0024] 图18是结合BiAb3的9nM IL-17A突变体的示意性重叠图，其显示含有Y108A突变的突变体及其组合具有加速离解速率。
[0025] 图19展示IL-17A突变体与BiAb3的结合的计算能量分析。
[0026] 发明实施方案详述
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体，其包含结合IL-17A及IL-17F的IL-17A/F结合实体、及经由p19结合IL-23的IL-23结合实体。本发明亦包含编码本发明双特异性抗体的重链及轻链的分离核酸以及包括这些核酸的载体、包括这些载体的宿主细胞以及制备及使用双特异性抗体的方法。
[0029] 本发明双特异性抗体可用于抑制促炎症性细胞因子(例如IL-17A、IL-17F及IL-23p19)。这些抗体可用于减少、限制、中和或阻断IL-17A同二聚体、IL-17F同二聚体或IL-17A/F异二聚体的促炎症性效应。同样，这些抗体可用于减少、限制、中和或阻断IL-17A同二聚体、IL-17F同二聚体或IL-17A/F异二聚体的促癌效应。在这些情形下，使用抗体的抗IL-23p19部分来减少、限制、中和或阻断将产生IL-17A及/或IL-17F(包括同二聚体及异二聚体)的新T细胞的产生。本文所描述的双特异性抗体可用于治疗炎症性病症及自身免疫疾病，例如多发性硬化(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、炎性肠病、银屑病、全身性硬化、全身性红斑狼疮、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)及巨细胞动脉炎。本文所描述的双特异性抗体亦可用于治疗癌症(包括血管生成)。举例而言，如本文所描述的双特异性抗体可用于治疗多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病(Sotomayor,E.M.,Blood,116(18):3380-3382(2010))。
[0030] 在下列描述中，广泛使用诸多术语。提供下述定义以便于理解本发明。
[0031] 除非另有所指，否则“一/一个”(a、an)、“该”(the)及“至少一个”(at least one)可互换使用且意指一个或一个以上。
[0032] “抗体”(Ab)及“免疫球蛋白”(Ig)系具有相同结构特性的糖蛋白。尽管抗体可对于特定抗原展现结合特异性，但免疫球蛋白既包含抗体、亦包括含其他缺乏抗原特异性的抗体样分子。举例而言，属于后一种的多肽被淋巴系统以较低浓度产生，而被骨髓瘤以升高的浓度产生。因此，如本文中所使用的，术语“抗体”或“抗体肽”系指完整抗体或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合片段，且包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体及双特异性抗体。在某些实施方案中，抗原结合片段系(例如)通过重组DNA技术产生。在其他实施方案中，抗原结合片段通过完整抗体的酶或化学解离产生。抗原结合片段包括(但不限2 2
于)Fab、Fab′、F(ab)、F(ab′)、Fv及单链抗体。
于)Fab、Fab′、F(ab)、F(ab′)、Fv及单链抗体。
[0033] 本文所用的术语“分离(的)抗体”系指自天然环境的组分中被鉴别出来并分离及/或回收得到的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素及其他蛋白质性溶质或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，需将抗体纯化至(1)如通过Lowry方法所测定，含有大于95重量％的抗体，且最优选含有99重量％以上的抗体，(2)通过使用旋杯式序列分析仪测定，达到足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列残基的程度， 或(3)通过还原或非还原条件下以SDS-PAGE使用考马斯蓝(Coomassie blue)或(更优选)银染色量测达到均质性。由于不会存在至少一种抗体天然环境组分，故分离抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离抗体通常需通过至少一个纯化步骤来制备。
[0034] 术语“激动剂”指任何增加另一分子的活性、活化或功能的化合物，包括蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子或小分子(小于10kD)。
[0035] 术语“拮抗剂”指任何降低另一分子的活性、活化或功能的化合物，包括蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子或小分子(小于10kD)。
[0036] 术语“对某多肽的结合(或结合某多肽)”包括但不限于：本发明的配体多肽与受体的结合；本发明的受体多肽与配体的结合；本发明抗体与抗原或表位的结合；本发明的抗原或表位与抗体的结合；本发明抗体与抗独特型抗体的结合；本发明的抗独特型抗体与配体的结合；本发明的抗独特型抗体与受体的结合；本发明的抗抗独特型抗体与配体、受体或抗体的结合等等。
[0037] “双特异性”或“双功能”抗体是具有两个不同重/轻链对及两个不同结合位点的杂交抗体。双特异性抗体可通过各种方法(包括但不限于杂交瘤融合或连接Fab'片段)产生。例如参见Songsivilai等人，Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。
[0038] 如本文中所使用，术语“表位”包括抗体特异性结合的抗原部分。因此，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任一蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖的侧链)组成，且其通常具有特定三维结构特性及特定电荷特性。更具体而言，如本文所用的术语“IL-17表位”、“IL-23表位”及/或“L-23/p19表位”系指在动物中、优选地在哺乳动物中、最优选在小鼠或人类中具有抗原性或免疫原性活性的相应多肽部分。具有免疫原性活性的表位例如是在动物中诱发抗体反应的IL-17A或IL-17F或IL-23/p19多肽的一部分。具有抗原性活性的表位例如是抗体免疫特异性结合的IL-17A或IL-17F或IL-23/p19多肽的一部分，免疫特异性结合是通过本领域熟知的任何方法(例如免疫测定、蛋白酶消化、结晶学或H/D交换)所确定的。抗原性表位未必具有免疫原性。这些表位可为线性或可为不连续表位。因此，如本文中所使用的，术语“构象表位”指通过抗原的除连续氨基酸系列外的氨基酸之间的空间关系而形成的不连续表位。
[0039] 如本文中所使用的，术语“免疫球蛋白”系指由一种或多种基本上通过免 疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。一种免疫球蛋白形式构成抗体的基础结构单元。此形式系四聚体且由两对相同的免疫球蛋白链组成，每一对免疫球蛋白链具有一条轻链及一条重链。在每一对中，轻链及重链可变区一起负责抗原结合，且恒定区负责抗体效应物功能。
[0040] 全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或约214个氨基酸)是由位于NH2末端的可变区基因(约110个氨基酸)及COOH末端的κ或λ恒定区基因编码的。类似地，全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或约446个氨基酸)是由可变区基因(约116个氨基酸)及其他上述恒定区基因中的一者(约330个氨基酸)编码的。重链可分类为γ、μ、α、δ或ε，且将抗体的同种型分别界定为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、IgM、IgA、IgD及IgE。在轻链及重链内，可变区及恒定区被具有约12个或更多个氨基酸的“J”区所连结，重链还包括一个具有约10个或更多个氨基酸的“D”区。(一般参见Fundamental Immunology，(Paul,W.编辑，第2版，Raven Press,NY(1989))，第7章(用于所有目的，其全部内容以引用方式并入本文中))。
[0041] 免疫球蛋白轻链或重链可变区由中间插有三个超变区的“框架”区组成。因此，术语“超变区”系指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。超变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))及/或来自“超变环”的那些残基(Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))(此两个文献皆以引用方式并入本文中)。“框架区”或“FR”残基是那些除如本文所定义的超变区残基以外的可变域残基。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。因此，“人类框架区”系与天然存在的人类免疫球蛋白的框架区实质上相同(约85％或更高，通常90-95％或更高)的框架区。抗体的框架区系轻链及重链成份的组合框架区，其用于定位及对准CDR。CDR主要负责抗原表位的结合。因此，术语“人源化”免疫球蛋白系指包括人类框架区及一或多个来自非人类(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白称为“供体”，且提供框架的人类免疫球蛋白称为“受体”。恒定区不一定存在，但若其存在，则其必须与人类免疫球蛋白恒定区实质上相同，亦即至少约85-90％、优选地约95％或更高程度地一致。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分(除了可能的CDR)与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分实质上相同。另外，人源框架区 中的一或多个残基可回复突变为亲代序列以保留最佳抗原结合亲和力及特异性。以此方式，来自非人类亲本抗体的某些框架残基保留于人源化抗体中以保留亲本抗体的结合性质同时最小化其免疫原性。
如本文所用的术语“人(源)框架区”包括具有这些回复突变的区。“人源化抗体”是包括人源化轻链及人源化重链免疫球蛋白的抗体。举例而言，人源化抗体并不涵盖如上文所定义的典型嵌合抗体，这是因为，例如，嵌合抗体的整个可变区皆是非人源的。
如本文所用的术语“人(源)框架区”包括具有这些回复突变的区。“人源化抗体”是包括人源化轻链及人源化重链免疫球蛋白的抗体。举例而言，人源化抗体并不涵盖如上文所定义的典型嵌合抗体，这是因为，例如，嵌合抗体的整个可变区皆是非人源的。
[0042] 术语“人源化”免疫球蛋白指包括人源框架区及一或多个来自非人源(例如小鼠、大鼠或兔)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人类免疫球蛋白称为“受体”。恒定区不一定存在，但若其存在，则其必须与人类免疫球蛋白恒定区实质上相同，亦即至少约85-90％、优选约95％或更高程度地相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分(除可能的CDR及框架区中可能的一些回复突变氨基酸残基(例如1-15个残基)外)与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分实质上相同。“人源化抗体”是包括人源化轻链及人源化重链免疫球蛋白的抗体。举例而言，人源化抗体并不涵盖如上文所定义的典型嵌合抗体，这是因为，例如，嵌合抗体的整个可变区皆是非人源的。
[0043] 如本文中所使用，术语“人(源)抗体”包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括自人类免疫球蛋白文库或自一种或多种人类免疫球蛋白的转基因动物分离且并不表达内源性免疫球蛋白的抗体，如(例如)通过Kucherlapati等人在美国专利第5,939,598号中所描述。
[0044] 术语“基因改变的抗体”意指氨基酸序列相对于原始抗体发生了变化的抗体。因重组DNA技术在抗体生成中的相关作用，人们不必局限于在天然抗体中所发现的氨基酸序列；可再设计抗体以获得期望特性。可能的变化是多种多样的，其范围从改变仅一种或一些氨基酸到完全再设计(例如)可变及/或恒定区。一般而言，改变恒定区是为了改善或改变诸如补体结合、与膜的相互作用及其他效应物功能等特性。改变可变区是为了改善抗原结合特性。
[0045] “Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1及可变区构成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
[0046] “Fab′片段”含有一条轻链及一条重链构成，该重链含有的恒定区更多，在CH1与CH2结构域之间，从而可在两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab′)2分子。
[0047] “F(ab′)2片段”含有两条轻链及两条重链，重链含有在CH1及CH2结构域之间的一部分恒定区，从而在两条重链之间形成链间二硫键。
[0048] “Fv片段”含有来自重链及轻链的可变区但缺乏恒定区。
[0049] “单域抗体”系由单一结构域Fv单元(例如VH或VL)组成的抗体片段。如同全抗体一样，其能够选择性结合特异性抗原。单域抗体的分子量仅为12-15kDa，远小于由两条蛋白质重链及两条轻链构成的常见抗体(150-160kDa)，且甚至小于Fab片段(约50kDa，一条轻链及重链的一半)及单链可变片段(约25kDa，两个可变域，一个来自轻链，一个来自重链)。最早的单域抗体系自在骆驼科中发现的重链抗体改造而来。尽管当前关于单域抗体的大部分研究系基于重链可变域，但轻链可变域及衍生自轻链的纳米抗体亦已显示可特异性结合靶表位。
[0050] 本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”或“MAb”或“Mab”或“mab”不限于经由杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”或“mAb”或“MAb”或“Mab”或“mab”系指衍生自单一克隆(包括任一真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，且并不涉及产生它的方法。
[0051] 如本文中所使用，“核酸”或“核酸分子”指多核苷酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)生成的片段、及通过连接、切割、核酸内切酶作用及核酸外切酶作用中的任一者生成的片段。核酸分子可由以下单体构成：天然存在的核苷酸(例如DNA及RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的α-对映异构体形式)或二者的组合。修饰的核苷酸可在糖部分及/或嘧啶或嘌呤碱基部分上有所改变。糖修饰包括(例如)使用卤素、烷基、胺及叠氮基代替一或多个羟基，或可将糖官能化为醚或酯。另外，可使用空间及电子类似结构(例如氮杂糖及碳环糖类似物)代替整个糖部分。碱基部分的修饰的实例包括烷基化嘌呤及嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶或其他熟知的杂环取代基。核酸单体可通过磷酸二酯键或这些链接的类似物连接。磷酸二酯链接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、磷酰胺酯，诸如此类。术语“核酸分子”亦包括所谓的“肽核酸”，其包括附接至聚酰胺主链的天然存在或修饰的核酸碱基。核酸可为单链或双链。
[0052] 术语“核酸分子的互补物”指与参考核苷酸序列相比具有互补的核苷酸序列及相反方向的核酸分子。
[0053] 术语“简并核苷酸序列”表示与编码多肽的参考核酸分子相比包括一或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(亦即各自编码Asp的GAU及GAC三联体)。
[0054] “分离的核酸分子”是并未整合至生物体的基因组DNA中的核酸分子。举例而言，自细胞的基因组DNA分离的编码生长因子的DNA分子就是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一实例是未整合至生物体的基因组中的化学合成的核酸分子。自特定物种分离的核酸分子小于来自该物种的染色体的完整DNA分子。
[0055] “核酸分子构建体”是经由人为干预进行修饰以含有组合且并置于自然界中并不存在的配置中的核酸区段的单链或双链核酸分子。
[0056] “互补DNA(cDNA)”是通过转录酶自mRNA模板形成的单链DNA分子。通常，采用与mRNA部分互补的引物来引发逆转录。本领域技术人员亦使用术语“cDNA”来指代由这样的单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”亦指自RNA模板合成的cDNA分子的克隆。
[0057] “启动子”是引导结构基因的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区中且与结构基因的转录起始位点邻近。在转录引发中发挥作用的启动子内的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee等人，Mol.Endocrinol.,7:551(1993))、环AMP反应元件(CRE)、血清反应元件(SREs；Treisman,Seminars in Cancer Biol.,1:47(1990))、糖皮质激素反应元件(GRE)及用于其他转录因子(例如CRE/ATF(O'Reilly等人，J.Biol.Chem.,267:19938(1992))、AP2(Ye等人，J.Biol.Chem.,269:25728(1994))、SP1、cAMP反应元件结合蛋白(CREB；Loeken,Gene Expr.,3:253(1993))及八聚体因子(一般而言，参见Watson等人编辑，Molecular Biology of the Gene，第4版，The Benjamin/Cummings Publishing公司(1987)及Lemaigre等人，Biochem.J.,303:1(1994)))的结合位点。若启动子为诱导型启动子，则转录速率因应诱导剂而增加。与之相对照的是，若启动子为组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调控。阻遏型启动子也是已知的。
[0058] “调控元件”是调节核心启动子的活性的核苷酸序列。举例而言，调控元件可含有与有助于在特定细胞、组织或细胞器中排他性地或优先转录的细胞因子结合的核苷酸序列。这些类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织 特异性”或“细胞器特异性”方式表达的基因有关。
[0059] “增强子”是可增加转录效率的调控元件类型，不论增强子相对于转录起始位点的距离或方向如何。
[0060] “异源DNA”指并不天然存在于给定宿主细胞内的DNA分子或DNA分子群体。只要宿主DNA与非宿主DNA(亦即外源性DNA)组合，相对于特定宿主细胞而言为异源的DNA分子即可含有衍生自宿主细胞物种的DNA(亦即内源性DNA)。举例而言，这样的DNA分子视为异源DNA分子：其包含非宿主DNA区段以及与之可操作连接的宿主DNA区段，非宿主DNA区段编码多肽，宿主DNA区段包含转录启动子。相反，异源DNA分子可包含内源性基因和与之可操作连接的外源性启动子。另一示例是，若将包含衍生自野生型细胞的基因的DNA分子引入缺乏野生型基因的突变体细胞中，则该DNA分子可视为异源DNA。
[0061] “表达载体”是编码表达于宿主细胞中的基因的核酸分子。通常，表达载体包括转录启动子、基因及转录终止子。基因表达通常置于启动子的控制下，且称此一基因与启动子“可操作连接”。类似地，若调控元件调节核心启动子的活性，则调控元件与核心启动子可操作连接。
[0062] “重组宿主”是含有异源核酸分子(例如克隆载体或表达载体)的细胞。在本发明的上下文中，重组宿主的一个实例是自表达载体产生本发明拮抗剂的细胞。与之相对，这样的拮抗剂可以是由这样的细胞产生的：该细胞是该拮抗剂的“天然来源”，且缺乏表达载体。
[0063] 术语“氨基末端”及“羧基末端”在本文中用于表示多肽内的位置。在上下文容许的情形下，参照多肽的特定序列或部分来使用这些术语，以表示邻近或相对位置。举例而言，位于多肽内某个参考序列的羧基末端的某个序列的位置邻近该参考序列的羧基末端，但不一定位于完整多肽的羧基末端处。
[0064] “融合蛋白”是由包含至少两种基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。举例而言，融合蛋白可包含：IL-17RA多肽的至少一部分，以及与之融合的、结合亲和基质的多肽。这样的融合蛋白提供了一种利用亲和层析来分离大量IL-17A的手段。
[0065] 术语“受体”表示一类细胞相关性蛋白，其结合称为“配体”的生物活性分子。这种相互作用介导配体对于细胞的效应。受体可以是膜结合受体、细胞溶质受体或细胞核受体；可以是单体受体(例如促甲状腺激素受体、β-肾上腺 素能受体)或多聚受体(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体及IL-6受体)。膜结合受体以多结构域结构为特征，其包括胞外配体结合结构域及胞内效应物结构域，且通常涉及信号转导。在某些膜结合受体中，胞外配体结合结构域及胞内效应物结构域位于各别的多肽中，这些多肽组成完整的功能性受体。
[0066] 一般而言，配体与受体的结合使得受体发生构象变化，从而导致效应物结构域与细胞中的其他分子之间发生相互作用，继而引起细胞代谢中的改变。通常与受体-配体相互作用有关的代谢事件包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、环AMP产生增加、细胞钙动员、膜脂质动员、细胞黏附、肌醇脂质水解及磷脂水解。
[0067] 术语“表达”指基因产物的生物合成。举例而言，在结构基因的情形下，表达涉及将结构基因转录成mRNA及将mRNA翻译成一个或多个多肽。
[0068] 术语“互补体/抗互补体对”表示在适当条件下形成非共价缔合的稳定配对的多个不同部分。举例而言，生物素及抗生物素(或链霉抗生物素)是补互补体/抗互补体对的典型成员。其他实例性的互补体/抗互补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义多核苷酸/反义多核苷酸对，诸如此类。在期望互补体/抗互补体对随9 -1
后发生解离的情形下，互补体/抗互补体对优选具有小于10M 的结合亲和力。
后发生解离的情形下，互补体/抗互补体对优选具有小于10M 的结合亲和力。
[0071] 术语“亲和标签”在本文中用于表示这样的多肽区段，其可附接至另一多肽，以帮助另一多肽的纯化或检测，或提供用于将该另一多肽附接至基质的位点。原则上，任何有可用的抗体或其他特异性结合剂的肽或蛋白质皆可用作亲和标签。亲和标签包括多组氨酸序列段、蛋白A(Nilsson等人，EMBO J.,4:1075(1985)；Nilsson等人，Methods Enzymol.,198:3(1991))、谷胱甘肽转移酶(Smith等人，Gene,67:31(1988))、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7952(1985))、物质P(substance P)、 肽 (Hopp等人，Biotechnology,6:1204(1988))、链霉抗生物素结合肽或其他抗原性表位或结合结构域。一般而言，参见Ford等人，Protein Expression and Purification,2:95(1991)。编码亲和标签的DNA分子可购自商业供货商(例如Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
[0072] “IL-17A结合实体”是特异性结合IL-17A的同二聚体形式(IL-17A/IL-17A)及异二聚体形式(IL-17A/IL-17F)的结合实体(例如抗体)。
[0073] “IL-17F结合实体”是特异性结合IL-17F的同二聚体形式(IL-17F/IL-17F)及异二聚体形式(IL-17A/IL-17F)的结合实体(例如抗体)。
[0074] “IL-17A/F结合实体”是通过识别并结合由IL-17A及IL-17F所共享的相同或类似表位(例如连续或不连续表位)而特异性结合IL-17A及IL-17F的结合实体(例如抗体)。IL-17A/F结合实体是结合IL-17A同二聚体、IL-17F同二聚体及IL-17A/IL-17F异二聚体。
[0075] 一个问题是，IL-17A、IL-17F及IL-23p19过度表达于若干炎症性及/或自身免疫病症中，且与其病因及/或持续性有关。本发明的若干实施方案所提供的一种解决方案是通过施用结合每一细胞因子且抑制或减少每一细胞因子(例如同二聚体或异二聚体形式)经由其同源受体进行信号传导的双特异性抗体，来抑制或减少这些细胞因子发生细胞信号传导的能力。
[0076] 另一问题在于在产生双特异性IL-17A/F及IL-23p19双特异性抗体(例如biAb3)时，难以生成对IL-17A具有高亲和力且为IL-17A的有效中和剂(例如IC50)的双特异性抗体。表1中所展示的小鼠亲本抗体(例如嵌合339.15、339.15.3.5、339.15.5.3或339.15.3.6)具有0.30nM的IL-17A/F IC50及0.26nM的IL-17F IC50，但仅具有11nM的IL-17A IC50。需要增强抗体抑制或中和IL-17A的信号传导的能力。如表3中所展示，小鼠亲本嵌合339.15及人源化亲本339.134对IL-17A具有类似结合亲和力。另外，如表8中所展示，人源化亲本339.134抑制IL-17A(IC50为1.3nM)的能力与抑制IL-17A/F(IC50为0.27nM)及IL-17F(IC50为0.24nM)的能力相比，仍显著减少。令人惊讶地是，此问题可通过利用biAb3的IL-23p19抗体的轻链(SEQ ID NO:17)来解决。当将IL-23p19轻链与339.134的人源化重链配对时，所得的单克隆抗体抑制IL-17A信号传导的能力显著增加(参见表9)且其对IL-17A的亲和力显著增加(参见表10)。在当前共享的IL-23p19/IL-17A/F(例如biAb3的)中，可能提供了该亲和力提高以及中和能力的关键残基可能是SEQ ID NO:2的Y108或 Tyr108，如通过实施例9的X射线结晶学及丙氨酸突变体研究所证实的。
[0077] 在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体、抗体及其抗原结合片段。本发明双特异性抗体包括结合IL-17A的IL-17A结合实体及经由p19结合IL-23的IL-23结合实体。在另一方面中，本发明双特异性抗体包括结合IL-17F的IL-17F结合实体、及经由p19结合IL-23的IL-23结合实体。在另一方面中，本发明的双特异性抗体包括结合IL-17A及IL-17F的IL-17A/F结合实体、及经由p19结合IL-23的IL-23结合实体。经由p19结合IL-23的结合实体在下文中称为“结合IL-23的结合实体”或“IL-23结合实体”。人IL-17A的多核苷酸序列展示于SEQ ID NO:1中，且相应多肽序列展示于SEQ ID NO:2中。IL-17A多肽的信号序列为SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-23。因此，SEQ ID NO:2的氨基酸残基24-155构成成熟IL-17A多肽。本文所公开的结合IL-17A的抗体(及其抗原结合片段)及双特异性抗体结合成熟IL-17A多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸残基24-155)。人源IL-17F的多核苷酸序列展示于SEQ ID NO:3中，且相应多肽序列展示于SEQ ID NO:4中。IL-17F多肽的信号序列为SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-30。因此，SEQ ID NO:4的氨基酸残基31-163构成成熟IL-17F多肽。本文所公开的结合IL-17F的抗体(及其抗原结合片段)及双特异性抗体结合成熟IL-17F多肽(SEQ ID NO:4的氨基酸残基31-163)。IL-23的人源p19亚单位的多核苷酸序列展示于SEQ ID NO:5中，且相应多肽序列展示于SEQ ID NO:6中。IL-23p19多肽的信号序列为SEQ ID NO:6的氨基酸残基1-19。因此，SEQ ID NO:6的氨基酸残基20-189构成成熟IL-23p19多肽。本文所公开的结合IL-23p19的抗体(及其抗原结合片段)及双特异性抗体结合成熟IL-23p19多肽(SEQ ID NO:6的氨基酸残基20-189)。
[0078] 在本发明的一个方面中，所述IL-17A/F结合实体包括抗体，亦即两对免疫球蛋白链，每一对具有一条轻链及一条重链，且所述IL-23结合实体包括两个Fab片段，每个片段包括轻链及重链的CH1与可变区，且所述IL-23结合实体的Fab片段(Fab fragments)与所述IL-17A/F结合实体的重链(Fc)的C末端连接。此双特异性抗体形式在本文中称为biAbFabL(参见图2)。在另一实施方案中，构成所述IL-23结合实体中的Fab片段的轻链及重链的CH1及可变区各自分别与所述IL-17A/F结合实体中轻链及重链的N末端连接。此双特异性抗体形式在本文中称为taFab(参见图3)。
[0079] 在本发明的另一方面中，所述IL-23结合实体包含抗体，亦即两对免疫 球蛋白链，每一对均具有一条轻链及一条重链，且所述IL-17A/F结合实体包括两个Fab片段，每个片段包含轻链及重链的CH1与可变区，且所述IL-17A/F结合实体的Fab片段与所述IL-23结合实体的重链(Fc)的C末端连接。此双特异性抗体形式在本文中称为biAbFabL(参见图2)。在另一实施方案中，构成所述IL-17A/F结合实体中Fab片段的轻链及重链的CH1与可变区各自分别与所述IL-23结合实体中轻链s及重链的N末端连接。此双特异性抗体形式在本文中称为taFab(参见图3)。
[0080] 在本发明的另一方面中，所述IL-23结合实体包含轻链及IL-23重链，且IL-17A/F结合实体包含轻链及IL-17A/F重链。此双特异性抗体类似于传统抗体，只是其包含两条经由CH3区中的静电互补性缔合而缔合的不同重链。其利用共同轻链。此双特异性抗体形式在本文中称为异二聚体Fc(参见图4)。
[0081] 在另一实施方案中，本发明提供双特异性抗体，其包括含有抗体(亦即两对免疫球蛋白链，每一对具有一条轻链及一条重链)的第一结合实体及含有Fv单元(亦即来自重链及轻链的可变域)的第二结合实体，且其中包含Fv单元的第二结合实体定位于所述第一结合实体的Fab区与铰链之间，如图5中所展示。所述Fv单元通过接头分子与第一结合实体的Fab区连接。更具体而言，所述Fv单元包括可变轻链结构域，其与所述Fab片段的轻链恒定区连接；及可变重链结构域，其与所述Fab片段的CH1区连接。此双特异性抗体形式在本文中称为VCVFc。VCVFc的第一结合实体及第二结合实体不一定必须共享共同轻链，而biAbFabL的第一结合实体及第二结合实体则必须共享共同轻链。在本发明的此实施方案的一方面中，第一结合实体特异性结合淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或白介素受体，且第二结合实体特异性结合淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或白介素受体。在本发明的此实施方案的另一方面中，第一结合实体是IL-17A/F结合实体且第二结合实体是IL-23结合实体。在本发明的此实施方案的另一方面中，第一结合实体是IL-23结合实体且第二结合实体是IL-17A/F结合实体。
[0082] 在另一实施方案中，本发明提供双特异性抗体，其包括含有抗体(亦即两对免疫球蛋白链，每一对具有一条轻链及一条重链)的第一结合实体及含有单域抗体的第二结合实体。此双特异性抗体形式在本文中称为VCDFc。VCDFc 双特异性抗体的图解说明展示于图6中。包含单域抗体的第二结合实体定位于Fab区，更具体而言Fab片段的CH1区，与第一结合实体的铰链之间。单域抗体通过接头分子(例如但不限于10mer G4S(其由式(G4S)2表示)或SSASTKGPS(SEQ ID NO:86))与第一结合实体的Fab的CH1区连接。在本发明的此实施方案的一方面中，第一结合实体特异性结合淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或白介素受体，且第二结合实体特异性结合淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或白介素受体。在本发明的此实施方案的一方面中，第一结合实体为IL-23结合实体且第二结合实体为IL-17A/F结合实体。在本发明的此实施方案的另一方面中，第一结合实体为IL-17A/F结合实体且第二结合实体为IL-23结合实体。
[0083] 结合实体的氨基酸序列优选地基于针对淋巴细胞抗原、细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、白介素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或白介素受体的人源及/或人源化单克隆抗体的序列。
[0084] 在本发明的前述方面的一实施方案中，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体的轻链各自包含含有CDR1(其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:24的序列)的可变域。在另一实施方案中，IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体的轻链各自包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变域。在另一实施方案中，IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体的轻链各自包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的恒定域。在另一实施方案中，IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体的轻链各自包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变域及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的恒定域。
[0085] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体的重链包括含有CDR1(其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列)的可变域。在另一实施方案中，IL-17A/F结合实体的重链包括含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变域。在另一实施方案中，在IL-17A/F结合实体包含抗体时，重链恒定域包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在另一实施方案中，在IL-17A/F结合实体 包含Fab片段时，重链的CH1区包括SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
[0086] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体包括与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变域。任选地，所有取代、添加或缺失皆在重链可变域的框架区内。任选地，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体包括与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变域，其中该可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列)。任选地，重链可变域包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。任选地，三个IL-17A/F重链可变域CDR包括：CDR1区，其包括与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；CDR2区，其包括与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；及CDR3区，其包括与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。任选地，IL-17A/F重链可变域CDR1具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列；重链可变域CDR2具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列；且重链可变域CDR3具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。IL-17A/F及/或IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的轻链可变域。任选地，所有取代、添加或缺失皆在轻链可变域的框架区内。任选地，双特异性抗体的IL-17A/F及/或IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的轻链可变域，其中该可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列)及CDR3 (其具有具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列)。任选地，轻链可变域包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。任选地，三个IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR包括：CDR1区，其包括与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；CDR2区，其包括与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；及CDR3区，其包括与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。任选地，IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR1具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列；IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR2具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列；且IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR3具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变域。任选地，所有取代、添加或缺失皆在IL-23p19重链可变域的框架区内。任选地，双特异性抗体的IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变域，其中该可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列)。任选地，IL-23p19重链可变域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。任选地，三个IL-23p19重链可变域CDR包括：CDR1区，其包括与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；CDR2区，其包括与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；及CDR3区，其包括与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。任选地，IL-23p19重链可变域CDR1 具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列；重链可变域CDR2具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列；且重链可变域CDR3具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变域，其中该可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列)。任选地，重链可变域包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。任选地，三个IL-17A/F重链可变域CDR包括：CDR1区，其包括与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；CDR2区，其包括与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；及CDR3区，其包括与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。任选地，IL-17A/F重链可变域CDR1具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列；重链可变域CDR2具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列；且重链可变域CDR3具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。IL-17A/F及/或IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的轻链可变域。任选地，所有取代、添加或缺失皆在轻链可变域的框架区内。任选地，双特异性抗体的IL-17A/F及/或IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的轻链可变域，其中该可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列)及CDR3 (其具有具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列)。任选地，轻链可变域包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。任选地，三个IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR包括：CDR1区，其包括与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；CDR2区，其包括与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；及CDR3区，其包括与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。任选地，IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR1具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列；IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR2具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列；且IL-17A/F及/或IL-23p19轻链可变域CDR3具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变域。任选地，所有取代、添加或缺失皆在IL-23p19重链可变域的框架区内。任选地，双特异性抗体的IL-23p19结合实体包括与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变域，其中该可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列)。任选地，IL-23p19重链可变域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。任选地，三个IL-23p19重链可变域CDR包括：CDR1区，其包括与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；CDR2区，其包括与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；及CDR3区，其包括与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。任选地，IL-23p19重链可变域CDR1 具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列；重链可变域CDR2具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列；且重链可变域CDR3具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
[0087] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-23结合实体的重链包括含有CDR1(其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列)的可变域。在另一实施方案中，IL-23结合实体的重链包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可变域。在另一实施方案中，在IL-23结合实体包括抗体时，重链恒定域包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:8的C末端赖氨酸已被切去，且因此重链恒定域包括SEQ ID NO:8的残基1-326的氨基酸序列。在另一实施方案中，在IL-23结合实体包括Fab片段时，重链的CH1区包括SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
[0088] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，在双特异性抗体的IL-23结合实体或IL-17A/F结合实体是Fv单元时，轻链的可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:24的序列)。在另一实施方案中，IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体的轻链各自包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变域。
[0089] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，在双特异性抗体的IL-17A/F结合实体为Fv单元时，重链的可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列)。在另一实施方案中，IL-17A/F结合实体的重链包括含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变域。
[0090] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，在双特异性抗体的IL-23结合实体为Fv单元时，重链的可变域包括CDR1(其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列)。在另一实施方案中，IL-23结合实体的重链包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可变域。
[0091] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-23结合实体的Fab片段与IL-17A/F结合实体的重链(Fc)的C末端连接，或IL-17A/F结合实体的Fab片段与，例如，IL-23结合实体的重链(Fc)的C末端通过接头分 子连接(例如参见图2)。在另一实施方案中，构成IL-23结合实体中的Fab片段之轻链及重链的CH1与可变区各自分别与IL-17A/F结合实体中的轻链及重链之N末端连接，或构成IL-17A/F结合实体中的Fab片段之轻链及重链的CH1与可变区各自分别与IL-23结合实体中的轻链及重链之N末端通过接头分子连接(例如参见图3)。在VCVFc双特异性抗体的另一实施方案中，构成第二结合实体中Fv单元的轻链可变区及重链可变区各自分别与第一结合实体中Fab片段的轻链恒定区及CH1区中的每一者通过接头分子连接(参见图5)。适宜的接头分子是本领域已知的，且包括例如短多肽。适宜的接头可包括含有甘氨酸(其赋予柔性)及丝氨酸或苏氨酸(其赋予溶解性)的短多肽。适宜的接头可包括Gly4Ser1单元。举例而言，接头可为(Gly4Ser1)x，其中x为1、2或3。任选地，接头多肽具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在VCVFc双特异性抗体的另一实施方案中，用于轻链的接头具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列且用于重链的接头具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
[0092] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体包括成对的重链，它们各自包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:84的氨基酸序列，及成对的轻链，它们分别包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，双特异性抗体包括包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的成对轻链。
[0093] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体(例如biAbFabL(参见图2)、taFab(参见图3)、异二聚体Fc(参见图4)、VCVFc(参见图5)或VCDFc(参见图6))的IL-17A/F抗体(或其抗原结合片段)或IL-17A/F结合实体结合(a)IL-17A同二
-9 -9 -10 -10
聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少5×10 M、-10 -11
至少8×10 M或至少至少1×10 M；(b)IL-17F同二聚体，其中结合亲和力(KD1)为至少-9 -9 -10 -10 -10 -10
1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至
-10 -11
少5×10 M或至少1×10 M；及/或(c)IL-17A/F异二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少-8 -8 -9 -9 -9 -9
1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少-9 -9 -9 -9 -10 -10
5×10 M、至少6×10 M、至少7×10 M、至少9×10 M、至少1×10 M或至少5×10 M，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
-9 -9 -10 -10
聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少5×10 M、-10 -11
至少8×10 M或至少至少1×10 M；(b)IL-17F同二聚体，其中结合亲和力(KD1)为至少-9 -9 -10 -10 -10 -10
1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至
-10 -11
少5×10 M或至少1×10 M；及/或(c)IL-17A/F异二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少-8 -8 -9 -9 -9 -9
1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至少4×10 M、至少-9 -9 -9 -9 -10 -10
5×10 M、至少6×10 M、至少7×10 M、至少9×10 M、至少1×10 M或至少5×10 M，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
[0094] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体(例如biAbFabL(参见图2)、taFab(参见图3)、异二聚体Fc(参见图4)、VCVFc(参见图5)或VCDFc(参见图6))的IL-23p19抗体(或其抗原结合片段)或IL-23p19结合实体系结合IL-23p19，其结合亲和-9 -9 -10 -10 -10
力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至-10 -10 -10 -10 -10 -10
少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少8×10 或至少9×10 、至少
-11
1×10 ，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至-10 -10 -10 -10 -10 -10
少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少8×10 或至少9×10 、至少
-11
1×10 ，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
[0095] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体(例如biAbFabL(参见图2)、taFab(参见图3)、异二聚体Fc(参见图4)、VCVFc(参见图5)或VCDFc(参见图6))的-9
IL-17A/F结合实体结合(a)IL-17A同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少-9 -10 -10 -10 -11
5×10 M、至少1×10 M、至少5×10 M、至少8×10 M或至少1×10 M；(b)IL-17F同二
-9 -9 -10 -10
聚体，其中结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、-10 -10 -10 -11
至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M或至少1×10 M；及/或(c)IL-17A/F异二
-8 -8 -9 -9
聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至-9 -9 -9 -9 -9 -9
少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M、至少6×10 M、至少7×10 M、至少9×10 M、至少-10 -10
1×10 M或至少5×10 M；且双特异性抗体的IL-23p19结合实体结合IL-23p19，其结合亲-9 -9 -10 -10 -10
和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至-10 -10 -10 -10 -10 -10
少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少8×10 或至少9×10 、至少
-11
1×10 ，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
IL-17A/F结合实体结合(a)IL-17A同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少-9 -10 -10 -10 -11
5×10 M、至少1×10 M、至少5×10 M、至少8×10 M或至少1×10 M；(b)IL-17F同二
-9 -9 -10 -10
聚体，其中结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、-10 -10 -10 -11
至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M或至少1×10 M；及/或(c)IL-17A/F异二
-8 -8 -9 -9
聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至-9 -9 -9 -9 -9 -9
少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M、至少6×10 M、至少7×10 M、至少9×10 M、至少-10 -10
1×10 M或至少5×10 M；且双特异性抗体的IL-23p19结合实体结合IL-23p19，其结合亲-9 -9 -10 -10 -10
和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少3×10 M、至-10 -10 -10 -10 -10 -10
少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少8×10 或至少9×10 、至少
-11
1×10 ，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
[0096] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-17A/F抗体(或其抗原结合片段)或IL-17A/F结合实体中和或抑制(a)IL-17A在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其IC50为0.5pm或更小；(b)IL-17F在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其IC50为2.0nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其IC50为1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小或0.5nM或更小。
[0097] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-17A/F抗体(或其抗原结合片段)或IL-17A/F结合实体中和或抑制(a)IL-17A在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)IL-17F在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其中IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、
9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。
9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。
[0098] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-23p19抗体(或其抗原结合片段)或IL-23p19结合实体中和或抑制(a)IL-23在鼠脾细胞中诱导的IL-17A及IL-17F产生，其IC50为0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小或0.06nM或更小。
[0099] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体的IL-23p19抗体(或其抗原结合片段)或IL-23p19结合实体中和或抑制IL-23在活化的原代人T细胞中诱导的STAT3磷酸化，其IC50为0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小或0.05nM或更小。
[0100] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体(例如biAbFabL(参见图2)、taFab(参见图3)、异二聚体Fc(参见图4)、VCVFc(参见图5)或VCDFc(参见图6))的-9
IL-17A/F结合实体结合(a)IL-17A同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少-9 -10 -10 -10 -11
5×10 M、至少1×10 M、至少5×10 M、至少8×10 M或至少1×10 M；(b)IL-17F同二
-9 -9 -10 -10
聚体，其结合亲和力 (KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、-10 -10 -10 -11
至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M或至少1×10 M；及/或(c)IL-17A/F异二
-8 -8 -9 -9
聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至-9 -9 -9 -9 -9 -9
少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M、至少6×10 M、至少7×10 M、至少9×10 M、至少-10 -10
1×10 M或至少5×10 M。任选地，双特异性抗体的IL-23p19结合实体结合IL-23p19，-9 -9 -10 -10
其中结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少-10 -10 -10 -10 -10 -10
3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少8×10 或至少
-10 -11
9×10 、至少1×10 ，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
任选地，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体系中和或抑制(a)IL-17A在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其IC50为0.5pm或更小；(b)IL-17F在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其IC50为2.0nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、
1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其中IC50为1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小或0.5nM或更小。任选地，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体中和或抑制(a)IL-17A在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)IL-17F在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、
13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。任选地，双特 异性抗体的IL-23p19结合实体中和或抑制IL-23在活化的原代人T细胞中诱导的STAT3磷酸化，其IC50为0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小或0.05nM或更小。
IL-17A/F结合实体结合(a)IL-17A同二聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少-9 -10 -10 -10 -11
5×10 M、至少1×10 M、至少5×10 M、至少8×10 M或至少1×10 M；(b)IL-17F同二
-9 -9 -10 -10
聚体，其结合亲和力 (KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、-10 -10 -10 -11
至少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M或至少1×10 M；及/或(c)IL-17A/F异二
-8 -8 -9 -9
聚体，其结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至-9 -9 -9 -9 -9 -9
少3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 M、至少6×10 M、至少7×10 M、至少9×10 M、至少-10 -10
1×10 M或至少5×10 M。任选地，双特异性抗体的IL-23p19结合实体结合IL-23p19，-9 -9 -10 -10
其中结合亲和力(KD1)为至少1×10 M、至少5×10 M、至少1×10 M、至少2×10 M、至少-10 -10 -10 -10 -10 -10
3×10 M、至少4×10 M、至少5×10 、至少6×10 、至少7×10 、至少8×10 或至少
-10 -11
9×10 、至少1×10 ，其中结合亲和力是通过表面等离子共振(例如Biacore)测量的。
任选地，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体系中和或抑制(a)IL-17A在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其IC50为0.5pm或更小；(b)IL-17F在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其IC50为2.0nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、
1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在原代人小气道上皮细胞(SAEC)中诱导G-CSF，其中IC50为1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小或0.5nM或更小。任选地，双特异性抗体的IL-17A/F结合实体中和或抑制(a)IL-17A在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)IL-17F在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在人原代成纤维细胞(HFFF)中诱导IL-6，其IC50为30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、
13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。任选地，双特 异性抗体的IL-23p19结合实体中和或抑制IL-23在活化的原代人T细胞中诱导的STAT3磷酸化，其IC50为0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小或0.05nM或更小。
[0101] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，包括成对的重链(它们包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列)及成对的轻链(它们包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列)的双特异性抗体在本文中称为“biAb1”、“bAb1”或“23/17bAb1”。包括成对的重链(它们各自包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列)及成对的轻链(它们各自包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列)的双特异性抗体在本文中称为“biAb2”、“bAb2”或“23/17bAb2”。包括成对的重链(它们各自包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列)及成对的轻链(它们各自包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列)的双特异性抗体在本文中称为“biAb3”、“bAb3”或“23/17bAb3”。包括成对的重链(它们包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列)及成对的轻链(它们包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列)的双特异性抗体在本文中称为“biAb4”、“bAb4”或“23/17bAb4”。
[0102] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体包括各自包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的成对轻链，且在本文中称为“taFab1”。
[0103] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，双特异性抗体包括IL-23重链(其包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列)、IL-17A/F重链(其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列)及成对的轻链(它们各自包含SEQ ID NO:17的序列)，且在本文中称为“hetero1”。在另一实施方案中，双特异性抗体包括IL-23重链(其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列)、IL-17A/F重链(其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列)及一对轻链(其各自包含SEQ ID NO:17的序列)，且在本文中称为“hetero2”。
[0104] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，呈VCVFc形式的双特异性抗体(参见图5)具有各自包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的成对轻链，或各自包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的成对轻链，或各自包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的成对轻链，或各自包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的成对重链 及各自包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的成对轻链，或各自包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的成对轻链，或各自包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的成对轻链，或各自包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的成对轻链，或各自包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的成对重链及各自包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的成对轻链。
[0105] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，特异性结合IL-17A(SEQ ID NO:2)及IL-17F(SEQ ID NO:4)的分离单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变域及轻链可变域，其中重链可变域包括SEQ ID NO:13的氨基酸残基且轻链可变域包括SEQ ID NO:9的氨基酸残基。任选地，单克隆抗体包括人源恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。IgG4人源恒定区可在241位(根据Kabat)具有丝氨酸至脯氨酸的突变。任选地，重链包括SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基。任选地，轻链包括SEQ ID NO:17的氨基酸残基。任选地，重链包括SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基，且轻链包括SEQ ID NO:17的氨基酸残基。任选地，双特异性抗体包括单克隆抗体。
[0106] 重链及轻链恒定区包括IgG1.1(SEQ ID NO:11，其可由SEQ ID NO:82编码)、没有C末端赖氨酸的IgG1.1f(SEQ ID NO:127)、具有C末端赖氨酸的IgG1.1f(SEQ ID NO:128)、人源κ恒定区(SEQ ID NO:10，其可由SEQ ID NO:83编码)或IgG4.1(SEQ ID NO:8)。IgG4重链恒定域可包括野生型IgG4的变体，其在铰链区中具有突变S228P(EU索引编号系统)或S241P(Kabat编号系统)。在小鼠/人源嵌合重链中将241(Kabat)处的丝氨酸改变为脯氨酸(在IgG1及IgG2中的该位置发现)使得产生同源抗体且消除异源性。另外，与原始嵌合IgG4相比，变体IgG4具有显著延长的血清半衰期且展示改良的组织分布。
Angal等人，Molecular Immunology,30(1):105-108(1993)；Schuurman等人，Molecular Immunology,38:1-8(2001)；Lewis等人，Molecular Immunology,46:3488-3494(2009)。
Angal等人，Molecular Immunology,30(1):105-108(1993)；Schuurman等人，Molecular Immunology,38:1-8(2001)；Lewis等人，Molecular Immunology,46:3488-3494(2009)。
[0107] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，特异性结合IL-23p19(SEQ ID NO:6)的分离单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变域及轻链可变域，其中重链可变域包含SEQ ID NO:7的氨基酸残基，且其中轻链可变域包含SEQ ID NO:9的氨基酸残基。任选地，单克隆抗体包含人源恒定区，例如IgG1、 IgG2、IgG3或IgG4。任选地，IgG4人源恒定区在241位(根据Kabat)具有丝氨酸至脯氨酸突变。任选地，重链包含SEQ ID NO:16、18、28、
29或74的氨基酸残基。任选地，轻链包含SEQ ID NO:17的氨基酸残基。任选地，重链包含SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基，且轻链包含SEQ ID NO:17的氨基酸残基。
任选地，双特异性抗体包含单克隆抗体。
29或74的氨基酸残基。任选地，轻链包含SEQ ID NO:17的氨基酸残基。任选地，重链包含SEQ ID NO:16、18、28、29或74的氨基酸残基，且轻链包含SEQ ID NO:17的氨基酸残基。
任选地，双特异性抗体包含单克隆抗体。
[0108] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段特异性结合IL-23p19，其中抗体或抗原结合片段结合IL-23p19上的不连续表位，所述不连续表位包含第一表位及第二表位，其中第一表位由SEQ ID NO:6的氨基酸残基33-59的至少一个氨基酸组成且第二表位由SEQ ID NO:6的氨基酸残基89-125的至少一个氨基酸组成。任选地，抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段至少结合第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54。任选地，抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段至少结合第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基55。任选地，抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段至少结合第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54及55。任选地，抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段至少结合第二表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基116。任选地，抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段至少结合第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54及55，且至少结合第二表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基116。
[0109] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段特异性结合IL-23p19，其中抗体或抗原结合片段结合IL-23p19上的不连续表位，所述不连续表位包括第一表位及第二表位，其中抗体或抗原结合片段至少结合第一表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基54及55，且至少结合第二表位的SEQ ID NO:6的氨基酸残基116。
[0110] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，IL-17A/F结合实体特异性结合IL-17A(IL-17A/IL-17A同二聚体及IL-17A/IL-17F异二聚体)上的至少包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基108(Tyr)的表位，其中IL-17A/F结合实体是单克隆抗体或其抗原结合片段。
任选地，所述的IL-17A上的表位是通过丙氨酸诱变法及/或X射线结晶学确定的。IL-17A/F结合实体所结合的IL-17A表位可以是连续或不连续表位。
任选地，所述的IL-17A上的表位是通过丙氨酸诱变法及/或X射线结晶学确定的。IL-17A/F结合实体所结合的IL-17A表位可以是连续或不连续表位。
[0111] 在本发明的前述方面的另一实施方案中，IL-17A/F交叉反应性单克隆抗体或其抗原结合片段结合IL-17A上的至少包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基 108(Tyr)的表位。任选地，所述IL-17A上的表位是通过丙氨酸诱变法及/或X射线结晶学确定的。IL-17A/F交叉反应性单克隆抗体或其抗原结合片段所结合的IL-17A上的表位可为连续或不连续表位。
[0112] 本发明双特异性抗体可单独使用或以与细胞毒性药剂的免疫偶联物形式使用。在一些实施方案中，所述药剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，所述药剂是放射性同位素，包括但不限于铅-212、铋-212、砹-211、碘-131、钪-47、铼-186、铼-188、钇-90、碘-123、碘-125、溴-77、铟-111及可裂变核素(例如硼-10或锕系元素)。在其他实施方案中，所述药剂是毒素或细胞毒性药物，包括但不限于蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、修饰的假单胞菌肠毒素A(modified Pseudomonas enterotoxin A)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、卡奇霉素(calicheamicin)、阿霉素(adriamycin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、白喉毒素及诸如此类。抗体与这些药剂的偶联方法是文献中已知的，包括直接偶联及间接偶联。
[0113] 可将适宜的可检测分子直接或间接附接于本发明抗体。适宜的可检测分子包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记物、化学发光标记物、磁性粒子及诸如此类。为了间接附接可检测分子或细胞毒性分子，可使可检测分子或细胞毒性分子与互补/抗互补对的一个成员偶联，其中使另一成员结合于结合多肽或抗体部分。为了这些目的，生物素/链霉抗生物素是互补/抗互补对的实例。
[0114] 本发明的双特异性抗体、抗体及抗原结合片段亦包括经修饰的衍生物，例如通过将任意类型的分子共价附接至抗体而修饰的衍生物，其中共价附接不会阻止抗体结合其表位。适宜的衍生物的实例包括但不限于岩藻糖基化抗体、糖基化抗体、乙酰化抗体、聚乙二醇化抗体、磷酸化抗体及酰胺化抗体。本发明的抗体及其衍生物自身可通过已知的保护/封闭基团、蛋白水解切割、连接细胞配体或其他蛋白质等来衍生化。在本发明的一些实施方案中，抗体的至少一条重链是岩藻糖基化的。在一些实施方案中，所述岩藻糖基化是N-连接的。在一些优选实施方案中，抗体的至少一条重链包含岩藻糖基化N-连接寡糖。
[0115] 本发明的双特异性抗体、抗体及抗原结合片段包括具有单一或多个氨基酸取代、缺失、添加或代替，且保留本发明抗体的生物性质(例如阻断IL-17A或IL-17F及/或IL-23与其各别受体的结合，抑制IL-17A或IL-17F及IL-23 的生物活性)的变体。本领域技术人员可产生具有单一或多个氨基酸取代、缺失、添加或代替的变体。这些变体可尤其包括：(a)一或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸取代的变体，(b)多肽添加一或多个氨基酸、或从多肽缺失一或多个氨基酸的变体，(c)一或多个氨基酸包括取代基团的变体，及(d)多肽与另一肽或多肽(例如融合配偶体、蛋白质标签或可赋予多肽有用性质的其他化学部分(例如抗体的表位、多组氨酸序列、生物素部分等等))融合的变体。本发明抗体可包括这样的变体，其中在保守或非保守位置上的来自某个物种的氨基酸残基替换为另一物种的相应残基。在另一实施方案中，非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基取代。获得这些变体的技术，包括遗传(阻抑、缺失、突变等)、化学及酶技术，已为本领域技术人员习知。
[0116] 本发明亦包括编码本发明双特异性抗体的分离核酸，其包括，例如，轻链、轻链可变区、轻链恒定区、重链、重链可变区、重链恒定区、接头及本文所公开双特异性抗体的任一及所有组分及其组合。本发明核酸包括与本发明核酸具有至少80％、更优选至少约90％、更优选至少约95％及最优选至少约98％同源性的核酸。在提及特定序列时，术语“相似性百分比”、“同一性百分比”及“同源性百分比”系如University of Wisconsin 软件程序中所描述来使用。本发明核酸亦包括互补核酸。在一些情况下，序列在对准时完全互补(无错配)。在其他情况下，在序列中可具有高达约20％的错配。在本发明的一些实施方案中，提供编码本发明抗体的重链及轻链二者的核酸。
[0117] 可将本发明核酸克隆至诸如质粒、黏粒、杆粒、噬菌体、人工染色体(BAC、YAC)或病毒等载体中，在该载体中可插入另一遗传序列或元件(DNA或RNA)以使得附接的序列或元件可复制。在一些实施方案中，表达载体含有组成型活性启动子区段(例如但不限于CMV、SV40、延伸因子或LTR序列)或诱导型启动子序列(例如类固醇诱导型pIND载体(Invitrogen))，其中可调控核酸的表达。本发明的表达载体可进一步包括调控序列，例如内部核糖体进入位点。可通过例如转染将表达载体引入细胞中。
[0118] 因此，在另一实施方案中，本发明提供包括下列可操作连接的元件的表达载体：转录启动子；编码本发明双特异性抗体的重链的核酸分子；及转录终止子。在另一实施方案中，本发明提供包括下列可操作连接的元件的表达载体：转录启动子；编码本发明双特异性抗体的轻链的核酸分子；及转录终止子。亦提供包括这些载体且表达重链及轻链的重组宿主细胞。
[0119] 在另一实施方案中，本发明提供包括下列可操作连接的元件的表达载体：转录启动子；编码本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段的重链的第一核酸分子；编码本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段的轻链的第二核酸分子；及转录终止子。在另一实施方案中，本发明提供包括下列可操作连接的元件的表达载体：第一转录启动子；编码本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段的重链的第一核酸分子；第一转录终止子；第二转录启动子；编码本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段的轻链的第二核酸分子；及第二转录终止子。亦提供包括这些载体且表达重链及轻链的重组宿主细胞。
[0120] 可使用含有编码本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段的重链的核酸及编码其轻链的核酸的抗体来产生细胞根据本领域已知的技术来产生双特异性抗体、抗体或抗原结合片段。在一个方面中，本发明提供产生本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段的方法，其包括培养表达重链及轻链的重组宿主细胞、及分离该细胞产生的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段。
[0121] 重组宿主细胞可为原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)或真核细胞(例如哺乳动物细胞或酵母细胞)。酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。哺乳动物细胞包括VERO、HeLa、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster Ovary，CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS-7、MDCK、人胚肾细胞系293、正常犬肾细胞系、正常猫肾细胞系、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、COS细胞及非致瘤性小鼠G8成肌细胞、成纤维细胞系、骨髓瘤细胞系、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK31细胞、小鼠支持细胞、人源子宫颈癌细胞、布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)、人源肺细胞、人源肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5细胞及FS4细胞。本发明的抗体产生细胞亦包括任一已知昆虫表达细胞系，例如草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda cell)。在一优选实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在另一优选实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
[0122] 抗体产生细胞优选地实质上不含IL-17A、IL-17F及IL-23结合竞争剂。在优选的实施方案中，抗体产生细胞包括小于约10重量％、优选地小于约5重量％、更优选地小于约1重量％、更优选地小于约0.5重量％、更优选地小于约0.1重量％及最优选地0重量％的IL-17A、IL-17F或IL-23结合竞争剂。 在一些实施方案中，由抗体产生细胞产生的抗体实质上不含IL-17A、IL-17F及IL-23竞争剂。在优选的实施方案中，由抗体产生细胞产生的抗体包含小于约10重量％、优选地小于约5重量％、更优选地小于约1重量％、更优选地小于约0.5重量％、更优选地小于约0.1重量％及最优选地0重量％的IL-17及IL-23结合竞争剂。
[0123] 抗体纯化方法是本领域已知的。在本发明的一些实施方案中，抗体纯化的方法包括过滤、亲和柱层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析及浓缩。过滤步骤优选地包括超滤，且更优选地是超滤及渗滤。优选地实施过滤至少约5至50次、更优选地10至30次及最优选地14至27次。可使用(例如) 亲和层析(Millipore,Billerica,Mass.)实施亲和柱层析。在一优选实施方案中，亲和层析步骤包括 -vA柱层析。洗脱
物可在溶剂洗涤剂中洗涤。阳离子交换层析可包括，例如，SP-琼脂糖凝胶阳离子交换层析。
阴离子交换层析可包括，例如但不限于，Q-琼脂糖快速流动阴离子交换。阴离子交换步骤优选是非结合性的，由此去除包括DNA及BSA等的污染物。优选地，例如，使用Pall DV 20纳滤器对抗体产物实施纳滤。抗体产物可例如使用超滤及渗滤浓缩。该方法可进一步包括大小排阻层析的步骤以去除聚集物。
物可在溶剂洗涤剂中洗涤。阳离子交换层析可包括，例如，SP-琼脂糖凝胶阳离子交换层析。
阴离子交换层析可包括，例如但不限于，Q-琼脂糖快速流动阴离子交换。阴离子交换步骤优选是非结合性的，由此去除包括DNA及BSA等的污染物。优选地，例如，使用Pall DV 20纳滤器对抗体产物实施纳滤。抗体产物可例如使用超滤及渗滤浓缩。该方法可进一步包括大小排阻层析的步骤以去除聚集物。
[0124] 双特异性抗体、抗体或抗原结合片段亦可通过本领域已知的其他方法，例如通过化学偶合抗体及抗体片段来产生。
[0125] 本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段可用于，例如，抑制促炎症性细胞因子(例如IL-17A、IL-17F及IL-23/p19)。这些抗体可用于减少、限制、中和或阻断IL-17A同二聚体、IL-17F同二聚体及/或IL-17A/F异二聚体的促炎症性效应。同样，这些抗体可用于减少、限制、中和或阻断IL-17A同二聚体、IL-17F同二聚体或IL-17A/F异二聚体的促癌效应。在这些情形下，使用抗体的抗IL-23p19部分来减少、限制、中和或阻断可能产生IL-17A及/或IL-17F(包括同二聚体及异二聚体)的新T细胞的产生。本文所描述的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段可用于治疗炎症性病症及自身免疫疾病，例如多发性硬化(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、囊性纤维化、炎性肠病、银屑病、全身性硬化、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身 性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征(Crow-Fukase syndrome)、高槻病(Takatsuki disease)或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎及多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病。本文所描述的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段亦可用于治疗癌症，包括血管生成。
[0126] 本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段抑制IL-17A及/或IL-17F及IL-23(经由p19亚单位)的活性，且由此抑制新的和已经存在的IL-17A及IL-17F及IL-17产生性T细胞(Th17)的产生、维持及活性。本发明进一步涉及使用本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段来治疗以高水平的IL-17A、IL-17F及/或IL-23的存在为特征的炎症性疾病，且治疗以高水平的IL-17A、IL-17F及/或IL-23的存在为特征的癌症。
[0127] 本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段可阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A、IL-17F(包括同二聚体及异二聚体)及IL-23/p19的活性，由此相对于仅靶向该三种细胞因子中的一者或两者的疗法更为有利。
[0128] 本发明的抗体(例如双特异性抗体)由此可用于：
[0129] (1)在癌症、急性炎症性及慢性炎症性疾病(例如炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(IBS)、囊性纤维化、慢性结肠炎、舍格伦综合征(syndrome)、脾肿大、慢性肾病(CKD)中的炎症、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎及其他与诱导急性期反应有关的疾病)的治疗中阻断、抑制、减少、拮抗或中和经由IL-17A或IL-17F及IL-23进行的信号传导。
[0130] (2)在自身免疫疾病(例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎、舍格伦综合征、IBS及IBD)的治疗中阻断、抑制、减少、拮抗或中和经由IL-17A或IL-17F或IL-23进行的信号传导，以防止或抑制免疫 细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、白细胞)中经由其受体(例如IL-23Rα、IL-12Rβ1、IL-17RA及IL-17RC)进行的信号传导。使用本发明抗体阻断、抑制、减少或拮抗经由IL-23Rα、IL-12Rβ1、IL-17RA及IL-17RC进行的信号传导亦有益于胰脏、肾、脑垂体及神经元细胞的疾病且可用于治疗IDDM、非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、胰脏炎及胰脏癌。
[0131] 举例而言，本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段可用于治疗性处理炎症性疾病，具体而言作为IL-17A、IL-17F及IL-23/p19的拮抗剂，来治疗炎症性疾病，例如多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、炎性肠病(IBD)及癌症。这些拮抗剂能够结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A、IL-17F、其同二聚体及异二聚体及IL-23(经由p19)(个别地或一起)以治疗以下疾病：特应性及接触性皮炎、全身性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、舍格伦综合征、银屑病性关节炎、成人呼吸道疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤(例如特发性肺纤维化)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道高反应性、慢性支气管炎、变应性哮喘、银屑病、湿疹、IBS及炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、由腹膜炎症(例如来自感染、损伤等)所致的腹内黏连及/或脓肿、肾病综合征、囊性纤维化(Tan,H.-L.等人，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,184(2):252-258(2011))、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)(Sotomayor,E.M., Blood,116(18):3380-3382(2010))、器官同种异体移植物排斥、链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈炎/牙周炎、疱疹性基质角膜炎、再狭窄、川崎病(Kawasaki disease)、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)(Wei,L.等人，Cell Reports,2:1151-1158(2012年11月29日)、免疫介导的肾病、肝纤维化(Meng,F.等人，Gastroenterology,143:765-776(2012)、肺纤维化(Meng,F.等人，Gastroenterology,143:765-776(2012)、肝胆管病、心肌炎 (Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7):7473-7478(2012 年 2 月 14 日 )；Valente,A.J.等人，Cellular Signalling,24:560-568(2012))、心 脏纤 维化(Valente,A.J. 等人，Cellular Signalling,24:560-568(2012))、不良心肌重构(Valente,A.J.等人，Cellular Signalling,24:560-568(2012))、动 脉 粥 样 硬 化 (Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7):7473-7478(2012年2月14日)、心脏缺血/再灌注损伤(Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7):7473-7478(2012年2月14日)、心力衰 竭(Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7):7473-7478(2012年2月14日)及以IL-17及/或IL-23表达为特征的癌症/肿瘤疾病(包括但不限于前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌及子宫颈癌及白血病 )(Tartour等 人，Cancer Res.,59:3698(1999)；Kato 等 人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,282:735(2001)；Steiner 等 人，Prostate,56:171(2003)；Langowksi 等 人，Nature，5月10日[电子出版早于印刷出版]，(2006))。
[0132] 举例而言，本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段可用于(例如作为IL-17A、IL-17F及IL-23/p19的拮抗剂)治疗性处理炎症性疾病，尤其是在下列疾病的治疗中：获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其是具有自身免疫组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫阿狄森氏病(autoimmune Addison's disease)、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫内耳病(AIED)、自身免疫淋巴组织增殖性综合征(ALPS)、自身免疫血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病(Behcet's disease)、心肌病症、口炎性腹泻-疱疹样皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、crest综合征、德戈斯氏病(Degos' disease)、幼年型皮肌炎、盘状狼疮(例如儿童盘状红斑狼疮、广泛性盘状红斑狼疮及局部性盘状红斑狼疮)、冻疮样红斑狼疮、红斑狼疮-扁平苔藓重叠综合征、红斑狼疮性脂膜炎、肿胀性红斑狼疮、疣状皮肤红斑狼疮、全身性红斑狼疮、亚急性皮肤红斑狼疮、急性皮肤红斑狼疮、本质性混合冷凝球蛋白血 症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病(Graves' disease)、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病变、胰岛素依赖性糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯提耳病(Still's disease))、幼年型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎(RA)、梅尼埃尔氏病(Meniere's disease)、混合型结缔组织病、多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎及皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、湿疹、银屑病、银屑病性关节炎、雷诺现象(Raynaud's phenomena)、莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)、成人呼吸道疾病(ARD)、风湿热、关节炎、结节病、硬皮病(例如进展性全身性硬化(PSS)，亦称为全身性硬化(SS))、舍格伦综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮(SLE)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、高安动脉炎(Takayasu arteriti)、颞动脉炎炎/巨细胞动脉炎、内毒素血症、败血症或败血性休克、中毒性休克综合征、多器官衰竭、炎症性肺损伤(例如特发性肺纤维化)、结肠炎、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病)、肠易激综合征(IBS)、眼葡萄膜炎、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)、特应性过敏、过敏、哮喘、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道高反应性、变应性哮喘、肾小球肾炎、溶血性贫血、幽门螺杆菌感染、由腹膜炎症(例如来自感染、损伤等)所致的腹内黏连及/或脓肿、肾病综合征、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏综合征、器官同种异体移植物排斥、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性 黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、糖尿病性视网膜病变及呼吸器诱导的肺损伤。
[0133] 因此，在一个方面中，本发明提供在需要该治疗的哺乳动物中抑制一种或多种促炎症性细胞因子(例如IL-17A、IL-17F及IL-23)的方法，其包括向需要该治疗的哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段。在一优选实施方案中，哺乳动物是人。该方法可用来治疗以IL-17A、IL-17F或IL-23的表达升高为特征的病症。双特异性抗体、抗体或抗原结合片段可与另一医药药剂在同一配方中施用或单独施用。
[0134] 在另一实施方案中，本发明提供在有需要的哺乳动物中治疗免疫相关性病症的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的IL-17A/F多肽、其激动剂或其拮抗剂(例如IL-17A/F结合实体，其包括IL-17A/F交叉反应性抗体)。在一个优选方面中，免疫相关性病症选自下组：全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、全身性硬化、特发性炎症性肌病、舍格伦综合征、全身性血管炎、结节病、自身免疫溶血性贫血、自身免疫血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾疾病、中枢及外围神经系统的脱髓鞘疾病(例如多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、特发性脱髓鞘多发性神经病变或格-巴二氏综合征及慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病变)、肝胆管病(例如传染性自身免疫慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎及硬化性胆管炎)、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、麸质敏感性肠病及惠伯尔病(Whipple's disease)、自身免疫或免疫介导的皮肤病(包括大疱性皮肤病、多形性红斑及接触性皮炎)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、银屑病、银屑病性关节炎、变应性疾病(例如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏及荨麻疹)、肺的免疫学疾病(例如嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化及变应性肺炎)、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移 植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、移植相关性疾病(包括移植物排斥及移植物抗宿主病)。
[0135] 在另一实施方案中，本发明提供在需要该治疗的哺乳动物中抑制炎症的方法，其包括向需要该治疗的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段。在一个优选实施方案中，哺乳动物是人。炎症可与选自下组的疾病有关：多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、慢性炎症、舍格伦综合征、自身免疫糖尿病、类风湿性关节炎(RA)及其他关节炎病状、哮喘、全身性硬化、特应性皮炎、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、全身性红斑狼疮(SLE)、德戈斯氏病、幼年型皮肌炎、盘状狼疮(例如儿童盘状红斑狼疮、广泛性盘状红斑狼疮及局部性盘状红斑狼疮)、冻疮样红斑狼疮、红斑狼疮-扁平苔藓重叠综合征、红斑狼疮性脂膜炎、肿胀性红斑狼疮、疣状红斑狼疮皮肤、全身性红斑狼疮、亚急性皮肤红斑狼疮、急性皮肤红斑狼疮、本质性混合冷凝球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植 体：血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)。双特异性抗体、抗体或抗原结合片段可与另一医药药剂(例如抗炎症剂)在同一配方中施用或单独施用。
[0136] 在另一实施方案中，本发明提供一种组合物，其包括如本文所描述的抗体(例如双特异性抗体)及医药上可接受的载体。可根据已知方法来配制包括本发明抗体(例如双特异性抗体)的医药组合物，以制备医药上适用的组合物，其中将治疗性蛋白质与医药上可接受的载体合并于混合物中。若组合物的施用可被接受患者耐受，则可将其称为“医药上可接受的载体”。无菌磷酸盐缓冲生理盐水是医药上可接受的载体的一个实例。本领域技术人员熟知其他适宜载体。例如参见Gennaro编辑，Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing公司(1995)。
[0137] 对于医药应用而言，根据常规方法配制本发明抗体(例如双特异性抗体)以用于非经肠、特定而言静脉内或皮下递送。静脉内施用可通过静脉推注、控制释放(例如使用微型泵或其他适当技术)或通过通常历时一至数小时的输注来进行。一般而言，医药配制剂包括本发明抗体(例如双特异性抗体)与医药上可接受的载体(例如生理盐水、缓冲生理盐水、5％右旋糖水溶液或诸如此类)的组合。配制剂可进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白，以防止小瓶表面上的蛋白质损失等等。在利用这样的组合疗法时，抗体(其包括双特异性抗体)可组合成单一配制剂，或可作为各别的配制剂施用。配制方法在本领域已众所周知，且公开于，例如，Gennaro编辑，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing公司，Easton PA(1990)中，该文献以引用方式并入本文中。治疗剂量通常在0.1-100mg/kg患者体重/天，优选地0.5-20mg/kg/天的范围内，其中确切剂量由临床医师根据接受标准并考虑拟治疗病状的性质及严重程度、患者特征等来确定。本领域技术人员即可决定剂量。更通常而言，在一周或更短时间内、通常在一至三天的时段内施用抗体。通常，所施用抗体的剂量将视诸如以下因素变化：患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况及先前病史。通常，对接受者提供在约1pg/kg至10mg/kg(药剂/患者体重的量)范围内的抗体剂量是理想的，但任选地亦可施用更低或更高的剂量。
[0138] 可经静脉内、经动脉内、经腹膜腔内、经肌内、经皮下、经胸膜内、经 鞘内、通过经由区域性导管灌注或通过直接病变内注射来向个体施用本发明抗体(例如双特异性抗体)。在通过注射来施用治疗性抗体时，可通过连续输注或通过单次或多次推注施用。
[0139] 其他施用途径包括经口、经黏膜、经肺及经皮。经口递送适用于聚酯微球体、玉米醇溶蛋白微球体、类蛋白微球体、聚氰基丙烯酸酯微球体及基于脂质的系统(例如参见DiBase等人，“Oral Delivery of Microencapsulated Proteins“,Sanders等人，编辑，Protein Delivery:Physical Systems，第255-288页，Plenum Press(1997))。鼻内递送的可行性的一个示例是通过该模式施用胰岛素(例如参见Hinchcliffe等人，Adv.Drug Deliv.Rev.,35:199(1999))。可制备包括本发明抗体的干燥或液体粒子，然后借助干燥粉末分散器、液体气溶胶生成器或雾化器来吸入(例如Pettit等人，TIBTECH,16:343(1998)；Patton等人，Adv.Drug Deliv.Rev.,35:235(1999))。此方式可借助 糖尿病管
控系统来阐释，该系统是一种将气溶胶化胰岛素递送至肺中的手持电子吸入器。研究展示，以治疗性浓度藉助低频超声波将大至48,000kDa的蛋白质递送穿过皮肤，这展示经皮施用的可行性(Mitragotri等人，Science,269:850(1995))。具有IL-17及IL-23/p19结合活性的分子的另一种施用方式是使用电穿孔的经真皮递送(Potts等人，Pharm.Biotechnol.,10:213(1997))。
控系统来阐释，该系统是一种将气溶胶化胰岛素递送至肺中的手持电子吸入器。研究展示，以治疗性浓度藉助低频超声波将大至48,000kDa的蛋白质递送穿过皮肤，这展示经皮施用的可行性(Mitragotri等人，Science,269:850(1995))。具有IL-17及IL-23/p19结合活性的分子的另一种施用方式是使用电穿孔的经真皮递送(Potts等人，Pharm.Biotechnol.,10:213(1997))。
[0140] 为了治疗目的，以治疗有效量将包括本发明抗体(例如双特异性抗体)及医药上可接受的载体的组合物施用患者。若施用量是生理学上显著的，则本发明抗体(例如双特异性抗体)及医药上可接受的载体的组合视为以“治疗有效量”施用。若药剂的存在使得接受患者的生理学发生可检测变化，则该药剂是生理学上显著的。举例而言，若用于治疗炎症的药剂的存在缓解炎症性反应，则该药剂是生理学上显著的。有效治疗可以通过各种方式评价。在一个方面中，通过减少炎症来确定有效治疗。在其他实施方案中，有效治疗的标志是炎症的抑制。在其他实施方案中，通过患者的康乐状况改善(包括诸如体重增加、恢复力量、降低疼痛、健壮、及来自患者的身体变好的主观指征等迹象)来度量有效疗法。
[0141] 包括本发明抗体(例如双特异性抗体)的医药组合物可以液体形式、以气溶胶形式或以固体形式提供。液体形式有例如可注射溶液及口服悬浮液。固体形式例如包括胶囊、锭剂及受控释放形式。后一形式的例子有微渗透泵和植入体(Bremer等人，Pharm.Biotechnol.,10:239(1997)；Ranade,“Implants in Drug Delivery”,Ranade等人，编辑，Drug Delivery Systems，第95-123页，CRC Press(1995)；Bremer等人，“Protein Delivery with Infusion Pumps”,Sanders等人，编辑，Protein Delivery:Physical Systems，第239-254页，Plenum Press(1997)；Yewey等人，“Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant”,Sanders 等 人，编 辑，Protein Delivery:Physical Systems，第93-117页，Plenum Press(1997)。
[0142] 脂质体是经静脉内、经腹膜腔内、经鞘内、经肌内、经皮下或经由经口施用、吸入或鼻内施用将治疗性多肽递送至个体的一种手段。脂质体是由一或多个环绕水性隔室的脂质双层组成的微型囊泡(通常参见Bakker-Woudenberg等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.,12( 增 刊 1):S61(1993),Kim,Drugs,46:618(1993)， 及Ranade,“Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers”,Ranade等人，编辑，Drug Delivery Systems，第3-24页，CRC Press(1995))。脂质体的组成类似于细胞膜，因而脂质体可安全施用且能够被生物降解。依制备方法不同，脂质体可为单层或多层，且脂质体的大小可有所变化，直径从0.02μm至大于10μm不等。可将各种药剂包封于脂质体中：疏水性药剂分配于双层中，而亲水性药剂分配于内部水性空间内(例如参见Machy等人，Liposomes in Cell Biology and Pharmacology,John Libbey(1987)，及Ostro等人，American J.Hosp.Pharm.,46:1576(1989))。另外，有可能通过改变脂质体大小、双层数量、脂质组成以及脂质体的电荷及表面特性来控制包封药剂的治疗利用度。
[0143] 脂质体可吸收至几乎任何类型的细胞上且然后缓慢释放所包封药剂。另一选择为，所吸收脂质体可由吞噬性细胞吞噬。在吞噬后脂质体脂质发生溶酶体内降解且释放所包封的药剂(Scherphof等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,446:368(1985))。在静脉内施用之后，小脂质体(0.1μm至1.0μm)通常由主要位于肝及脾中的网状内皮系统细胞吸收，而大于3.0μm的脂质体则沉积于肺中。网状内皮系统细胞对较小脂质体的这种优先摄取的现象已被用于将化学治疗剂递送至巨噬细胞及肝肿瘤。
[0144] 可通过若干方法来回避网状内皮系统，包括使用大剂量的脂质体粒子达到饱和，或通过药理学方式选择性地使巨噬细胞钝化(Claassen等人，Biochim.Biophys.Acta,802:428(1984))。此外，已展示，将糖脂或聚乙二醇衍生的磷脂纳入脂质体膜中会使得网状内皮系统的摄取显著减少(Allen等人，Biochim. Biophys.Acta,1068:133(1991)；Allen等人，Biochim.Biophys.Acta,1150:9(1993))。
[0145] 亦可通过改变磷脂组成通过将受体或配体插入脂质体中来制备脂质体，使其靶向特定细胞或器官。举例而言，使用高含量非离子型表面活性剂制得的脂质体已用于靶向肝(Hayakawa等人，日本专利第04-244,018号；Kato等人，Biol.Pharm.Bull.,16:960(1993))。通过以下方式来制备这些配制剂：在甲醇中混合大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚及乙氧基化氢化蓖麻油(HCO-60)，在真空下浓缩混合物，且然后使用水重构混合物。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与大豆源豆甾醇糖苷混合物(SG)及胆固醇(Ch)的脂质体配制剂也已显示可靶向肝脏(Shimizu等人，Biol.Pharm.Bull.,20:881(1997))。
[0146] 或者，可将各种性靶向配体结合于脂质体表面，例如抗体、抗体片段、碳水化合物、维生素及转运蛋白。举例而言，可使支链型半乳糖脂质衍生物来对脂质体进行修饰以靶向排他性地表达于肝细胞表面上的无唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体(Kato等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrie Syst.,14:287(1997)；Murahashi 等 人，Biol.Pharm.Bull.,20:259(1997))。类似地，Wu等人，Hepatology,27:772(1998)展示使用无唾液酸胎蛋白标记脂质体导致脂质体血浆半衰期缩短且大大增强肝细胞对于去唾液酸胎蛋白标记的脂质体的摄取。另一方面，可通过预注射去唾液酸胎蛋白来抑制包括支链型半乳糖脂质衍生物的脂质体的肝积累(Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.,20:259(1997))。聚乌头酰化人血清白蛋白脂质体提供了另一种将脂质体靶向肝细胞的手段(Kamps等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,94:11681(1997))。另外，Geho等人，美国专利第4,603,044号描述指向肝细胞的脂质体囊泡递送系统，其对于与肝的特化代谢细胞相关的肝胆管受体具有特异性。
[0147] 根据一种更一般化的组织靶向方式，使用对于由靶细胞表达的配体具有特异性的生物素化抗体来预标记靶细胞(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.,32:99(1998))。在对游离抗体进行血浆消除之后，施用偶联链霉抗生物素的脂质体。在另一方式中，将靶向抗体直接附接至脂质体(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.,32:99(1998))。
[0148] 可使用蛋白质微囊化的标准技术将抗体包封于脂质体内(例如参见Anderson等人，Infect.Immun.,31:1099(1981)，Anderson等人，Cancer Res.,50:1853(1990),及Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta,1063:95(1991)，Alving 等人，“Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies”，Gregoriadis编辑，Liposome Technology，第2版，第III卷，第317页，CRC Press(1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.,149:124(1987))。
如上所述，治疗有用的脂质体可含有各种组分。举例而言，脂质体可包括聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta,1150:9(1993))。
如上所述，治疗有用的脂质体可含有各种组分。举例而言，脂质体可包括聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta,1150:9(1993))。
[0149] 已设计可降解聚合物微球体以维持高全身含量的治疗性蛋白。自诸如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚酸酐、聚(原酸酯)、非生物可降解性乙酸乙基乙烯酯聚合物等可降解聚合物来制备微球体，其中将蛋白质俘获于聚合物中(Gombotz等人，Bioconjugate Chem.,6:332(1995)；Ranade,“Role of Polymers in Drug Delivery”，Ranade等人，编辑，Drug Delivery Systems，第51-93页，CRC Press(1995)；Roskos等人，“Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery”，Sanders等人，编辑，Protein Delivery:Physical Systems， 第 45-92 页，Plenum Press(1997)；Bartus 等人，Science,281:1161(1998)；Putney 等 人，Nature Biotechnology,16:153(1998)；Putney,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:548(1998))。 经 聚 乙 二 醇(PEG) 涂 覆 的 纳 米球体亦可提供用于静脉内施用治疗性蛋白的载体(例如参见Gref等人，Pharm.
Biotechnol.,10:167(1996)。
Biotechnol.,10:167(1996)。
[0150] 配制剂亦可视需要含有多于一种用于所治疗特定适应证的活性化合物，优选具有互补活性、且相互间不会产生不利影响者。或者/此外，组合物可包括增强其功能的药剂，例如细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。这些分子适宜地以对预期目的有效的量以组合形式存在。
[0151] 在一个实施方案中，本发明抗体(例如双特异性抗体)在组合疗法中，亦即与其他药剂组合施用，这些其他药剂是，例如，可用于治疗病理学状况或病症(例如自身免疫病症及炎症性疾病)的治疗剂。此背景中的术语“组合”意指实质上同期(substantially contemporaneously)(同时或依序)给予各药剂。若依序给予，则在开始施用第二化合物时，两种化合物中的第一种优选地仍以有效浓度在治疗部位处可检测。
[0152] 举例而言，组合疗法可包括一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)和与之共配制及/或共施用的一种或多种其他治疗剂(例如一种或多种细胞因子及生长因子抑制剂、免疫阻抑剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂及/或细胞毒性剂或细胞生长抑制剂)，如下文中更详细描述的。另外，一种或多种本文所描述抗体(例如双特异性抗体)可与两种或更多种本文所描述治疗剂组合 使用。这些组合疗法可有利地利用较低剂量的所施用治疗剂，由此避免与各种单一疗法有关的可能毒性或并发症。
[0153] 与本发明抗体(例如双特异性抗体)组合使用的优选治疗剂是那些干扰炎症性反应中的不同阶段的药剂。在一个实施方案中，可将一种或多种本文所描述抗体(例如双特异性抗体)与一种或多种其他药剂(例如其他细胞因子或生长因子拮抗剂(例如可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物)；或结合其他靶的抗体或其抗原结合片段(例如结合其他细胞因子或生长因子、其受体或其他细胞表面分子的抗体)；及抗炎症性细胞因子或其激动剂)共配制及/或共施用。可与本文所描述的抗体组合使用的药剂的非限制性实例包括但不限于一种或多种白介素(IL)或其受体的拮抗剂，例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-20、IL-21、IL-22及IL-31的拮抗剂；细胞因子或生长因子或其受体(例如肿瘤坏死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)的拮抗剂。本发明抗体亦可与诸如以下细胞表面分子的抑制剂(例如其抗体)组合：CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如CD20抑制剂利妥昔单抗(rituximab)())、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或其配体(包括CD154(gp39或CD40L))或LFA-1/ICAM-1及VLA-4/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等人，Med.Res.Rev.,22:146-167(2002))。可与一种或多种本文所描述抗体(例如双特异性抗体)组合使用的优选拮抗剂包括IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-15、IL-18、IL-20、IL-22及IL-31的拮抗剂。
[0154] 那些药剂的实例包括IL-12拮抗剂，例如结合IL-12(优选人IL-12)的嵌合、人源化、人源或体外生成的抗体(或其抗原结合片段)，例如WO 00/56772中所公开的抗体；IL-12受体抑制剂，例如人IL-12受体的抗体；及IL-12受体(例如人IL-12受体)的可溶性片段。IL-15拮抗剂的实例包括抗IL-15或其受体的抗体(或其抗原结合片段，例如人IL-15或其受体之嵌合、人源化、人源或体外生成的抗体)、IL-15受体的可溶性片段及IL-15结合蛋白。IL-18拮抗剂的实例包括人IL-18的抗体(例如嵌合、人源化、人源或体外生成的抗体(或其抗原结合片段))、IL-18受体的可溶性片段及IL-18结合蛋白(IL-18BP)。IL-1拮抗剂的实例包括白介素-1-转化酶(ICE)抑制剂(例如Vx740)、IL-1拮抗剂(例如IL-1RA(阿那白滞素(anikinra)， Amgen)、sIL1RII(Immunex))
及抗IL-1受体抗体(或其抗原结合片段)。
及抗IL-1受体抗体(或其抗原结合片段)。
[0155] TNF拮抗剂的实例包括TNF(例如人TNF-α)的嵌合、人源化、人源或体外生成的抗体(或其抗原结合片段)，例如( D2E7，人TNF-α抗体)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNF-α抗体；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNF-α抗体；
Centocor)；抗TNF抗体片段(例如CPD870)；TNF受体(例如p55或p75人
TNF受体或其衍生物)的可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，Immunex)、p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(Lenercept))；酶拮
抗剂，例如TNF-α转化酶(TACE)抑制剂(例如α-磺酰基异羟肟酸衍生物及N-羟基甲酰胺TACE抑制剂GW 3333、-005或-022)；及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白)。优选的TNF拮抗剂是TNF受体(例如p55或p75人源TNF受体或其衍生物)的可溶性片段(例
如75kdTNFR-IgG)及TNF-α转化酶(TACE)抑制剂。
Centocor)；抗TNF抗体片段(例如CPD870)；TNF受体(例如p55或p75人
TNF受体或其衍生物)的可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，Immunex)、p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(Lenercept))；酶拮
抗剂，例如TNF-α转化酶(TACE)抑制剂(例如α-磺酰基异羟肟酸衍生物及N-羟基甲酰胺TACE抑制剂GW 3333、-005或-022)；及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白)。优选的TNF拮抗剂是TNF受体(例如p55或p75人源TNF受体或其衍生物)的可溶性片段(例
如75kdTNFR-IgG)及TNF-α转化酶(TACE)抑制剂。
[0156] 在其他实施方案中，可将一种或多种本文所描述的抗体(例如双特异性抗体)与下列物质中的一或多者组合施用：IL-13拮抗剂，例如可溶性IL-13受体(sIL-13)及/或抗IL-13的抗体；IL-2拮抗剂，例如DAB 486-IL-2及/或DAB389-IL-2(IL-2融合蛋白，Seragen)及/或IL-2R抗体(例如抗Tac(人源化抗IL-2R，Protein Design Labs))。又一组合包括一种或多种本发明的抗体(例如双特异性抗体)、拮抗性小分子及/或抑制性抗体，和与之组合的非清除性(nondepleting)抗CD4抑制剂(DEC-CE9.1/SB 210396；非清除性灵长源化抗CD4抗体；IDEC/SmithKline)的组合。其他优选组合包括共刺激路径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体；以及p-选择素糖蛋白配体(PSGL)、抗炎症性细胞因子，例如IL-4(DNAX/Schering)、IL-10(SCH52000；重组IL-10DNAX/Schering)、IL-13及TGF-β及其激动剂(例如激动剂抗体)。
[0157] 在其他实施方案中，可将一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)与一种或多种抗炎症药、免疫阻抑剂或代谢或酶抑制剂共配制及/或共施用。可与本文所描述抗体组合使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于以下物质中的一或多者：非甾体抗炎药(NSAID)，例如布洛芬(ibuprofen)、替尼达普(tenidap)、萘普生(naproxen)、美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、双氯芬酸(diclofenac)及吲哚美辛(indomethacin)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；皮质类固醇，例如泼尼松龙(prednisolone)；细胞因子阻抑性抗炎药(CSAID)；核苷酸生物合成的抑制剂，例如嘌呤生物合成的抑制剂；叶酸拮抗剂(例如氨 甲蝶呤(methotrexate)(N-[4-[[(2,4-二氨基-6-喋啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；及嘧啶生物合成的抑制剂，例如二氢乳清酸去氢酶(DHODH)抑制剂。优选的用于与一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)组合使用的治疗剂包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制剂(例如来氟米特(leflunomide))及叶酸拮抗剂(例如氨甲蝶呤)。
[0158] 其他抑制剂的实例包括以下物质中的一或多者：皮质类固醇(经口、吸入及局部注射)；免疫阻抑剂，例如环孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)；及mTOR抑制剂，例如西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin)- 或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779)；干扰通过促炎症性细胞因子(诸如TNF-α或IL-1等)进行的信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)及其变体；磷酸二酯酶抑制剂，例如R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂)；磷脂酶抑制剂，例如胞质溶胶磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂(例如三氟甲基酮类似物)；血管内皮细胞生长因子或生长因子受体的抑制剂，例如VEGF抑制剂及/或VEGF-R抑制剂；及血管生成的抑制剂。
用于与本发明抗体组合使用的优选治疗剂是免疫阻抑剂，例如环孢素、他克莫司(FK-506)；
mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779)；COX2抑制剂，例如塞来昔布及其变体；及磷脂酶抑制剂，例如细胞溶质磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂，例如三氟甲基酮类似物。
用于与本发明抗体组合使用的优选治疗剂是免疫阻抑剂，例如环孢素、他克莫司(FK-506)；
mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779)；COX2抑制剂，例如塞来昔布及其变体；及磷脂酶抑制剂，例如细胞溶质磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂，例如三氟甲基酮类似物。
[0159] 可与本发明抗体(例如双特异性抗体)组合的治疗剂的其他实例包括以下物质中的一或多者：6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤(azathioprine)、柳氮磺吡
啶；美色拉嗪(mesalazine)；奥色拉嗪(olsalazine)；氯喹(chloroquine)/羟氯喹(hydroxychloroquine)( )；青霉胺(pencillamine)；金硫苹果酸盐
(aurothiornalate)(肌内及口服)；硫唑嘌呤；秋水仙素(coichicine)；β-2肾上腺素能受体激动剂(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特罗(salmeteral))；
黄嘌 呤(xanthine)(茶碱 (theophylline)、胺 茶碱(aminophylline))；色 甘酸 盐(cromoglycate)；奈多罗米(nedocromil)；酮替芬(ketotifen)；异丙托铵(ipratropium)及氧托溴铵(oxitropium)；麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)；腺苷激动剂；抗凝血剂；补体抑制剂；及肾上腺素能剂。
啶；美色拉嗪(mesalazine)；奥色拉嗪(olsalazine)；氯喹(chloroquine)/羟氯喹(hydroxychloroquine)( )；青霉胺(pencillamine)；金硫苹果酸盐
(aurothiornalate)(肌内及口服)；硫唑嘌呤；秋水仙素(coichicine)；β-2肾上腺素能受体激动剂(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特罗(salmeteral))；
黄嘌 呤(xanthine)(茶碱 (theophylline)、胺 茶碱(aminophylline))；色 甘酸 盐(cromoglycate)；奈多罗米(nedocromil)；酮替芬(ketotifen)；异丙托铵(ipratropium)及氧托溴铵(oxitropium)；麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)；腺苷激动剂；抗凝血剂；补体抑制剂；及肾上腺素能剂。
[0160] 可与本发明抗体(例如双特异性抗体)组合用于治疗或防止关节炎病症(例 如类风湿性关节炎、炎症性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎及银屑病性关节炎)的药剂的非限制性实例包括下列物质中的一或多者：如本文所描述的IL-12拮抗剂；NSAID；CSAID；如本文所描述的TNF(例如TNF-α)拮抗剂；如本文所描述的非清除性抗CD4抗体；如本文所描述的IL-2拮抗剂；抗炎症性细胞因子，例如IL-4、IL-10、IL-13及TGF-α或其激动剂；如本文所描述的IL-1或IL-1受体拮抗剂；如本文所描述的磷酸二酯酶抑制剂；如本文所描述的Cox-2抑制剂；伊洛前列素(iloprost):氨甲蝶呤；沙立度胺(thalidomide)及沙立度胺相关性药物(例如希尔跟(Celgen))；来氟米特；纤维蛋白溶酶原活化抑制剂，例如氨甲环酸；细胞因子抑制剂，例如T-614；前列腺素E1；硫唑嘌呤；白介素-1转化酶(ICE)的抑制剂；zap-70及/或1ck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或1ck的抑制剂)；如本文所描述的血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体的抑制剂；如本文所描述的血管生成的抑制剂；皮质类固醇抗炎药(例如SB203580)；TNF-转化酶抑制剂；IL-11、IL-13、IL-17抑制剂；金；青霉胺(penicillamine)；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；环孢素；全淋巴辐照；抗胸腺细胞球蛋白；CD5-毒素；经口施用的肽及胶原；氯苯扎利二钠(lobenzarit disodium)；细胞因子调控剂(CRA)HP228及HP466(Houghten Pharmaceuticals公司)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals公司)；可溶性补体受体1(TP 10；
T Cell Sciences公司)；泼尼松(prednisone)；奥古蛋白(orgotein)；聚硫酸葡糖胺聚糖；米诺环素(minocycline)( )；抗IL2R抗体；海洋及植物脂质(鱼及植物种
子脂肪酸)；金诺芬(auranofin)；保泰松(phenylbutazone)；甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；氟芬那酸(flufenamic acid)；静脉内免疫球蛋白；齐留通(zileuton)；霉酚酸(mycophenolic acid)(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(盐酸氨普立糖(therafectin))；克拉屈滨(cladribine)(2-氯脱氧腺苷)；
及阿扎立平(azaribine)。优选的组合包括一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)与氨甲蝶呤或来氟米特及(在中度或严重类风湿性关节炎情形下)环孢素的组合。
T Cell Sciences公司)；泼尼松(prednisone)；奥古蛋白(orgotein)；聚硫酸葡糖胺聚糖；米诺环素(minocycline)( )；抗IL2R抗体；海洋及植物脂质(鱼及植物种
子脂肪酸)；金诺芬(auranofin)；保泰松(phenylbutazone)；甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；氟芬那酸(flufenamic acid)；静脉内免疫球蛋白；齐留通(zileuton)；霉酚酸(mycophenolic acid)(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(盐酸氨普立糖(therafectin))；克拉屈滨(cladribine)(2-氯脱氧腺苷)；
及阿扎立平(azaribine)。优选的组合包括一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)与氨甲蝶呤或来氟米特及(在中度或严重类风湿性关节炎情形下)环孢素的组合。
[0161] 与一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)组合用于治疗关节炎病症的抑制剂的优选实例包括TNF拮抗剂(例如结合TNF的嵌合、人源化、人源或体外生成的抗体或其抗原结合片段；TNF受体(例如p55或p75人源TNF受体或其衍生物)的可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG 融合蛋白， )、p55kD TNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂，例如TNF-α转化酶(TACE)抑制剂)；IL-12、IL-15、IL-18、IL-22的拮抗剂；T细胞及B细胞清除剂(例如抗CD4或抗CD22抗体)；小分子抑制剂，例如氨甲蝶呤及来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物，例如CCI-779；cox-2及cPLA2抑制剂；
NSAID；p38抑制剂，TPL-2、Mk-2及NFκB抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择素或PSGL-1抑制剂(例如小分子抑制剂、针对其的抗体，例如P-选择素抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂或ERB-NFκB拮抗剂。可与一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)共施用及/或共配制的最优选的其他治疗剂包括以下物质中的一或多者：TNF受体(例如p55或p75人源TNF受体或其衍生物)的可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，)；氨甲喋呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物(例如CCI-779)。
NSAID；p38抑制剂，TPL-2、Mk-2及NFκB抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择素或PSGL-1抑制剂(例如小分子抑制剂、针对其的抗体，例如P-选择素抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂或ERB-NFκB拮抗剂。可与一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)共施用及/或共配制的最优选的其他治疗剂包括以下物质中的一或多者：TNF受体(例如p55或p75人源TNF受体或其衍生物)的可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，)；氨甲喋呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物(例如CCI-779)。
[0162] 可与一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)组合用于治疗或预防多发性硬化(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)的药剂的非限制性实例包括下列物质：干扰素，例如干扰素-α1a(例如 Biogen)及干扰素-1b( Chiron/Berlex)；共聚物1(Cop-1； TevaPharmaceutical Industries公司)；富马酸二甲酯(例如
BG-12；Biogen)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨；如本文所描述的TNF拮抗剂；皮质类固醇；泼尼松龙；甲基泼尼松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢素；环孢素A、氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；及替扎尼定(tizanidine)。可与本发明抗体组合使用的其他拮抗剂包括其他人细胞因子或生长因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、EL-7、IL-8、IL-12IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF及PDGF)的抗体或拮抗剂。如本文所描述的抗体可与针对细胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配体)的抗体组合。一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)亦可与诸如以下药剂组合：氨甲蝶呤、环孢素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸吗乙酯、来氟米特、NSAID(例如布洛芬)、皮质类固醇(例如泼尼松龙)、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝血剂、补体抑制剂、肾上腺素能剂、如本文所描述的干扰通过促炎症性细胞因子进行的信号传导的药剂、IL-1b转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、PSGL、TACE抑制剂、T细胞信号传导抑制剂(例 如激酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、如本文所描述的可溶性细胞因子受体及其衍生物及抗炎症性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13及TGF)。
BG-12；Biogen)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨；如本文所描述的TNF拮抗剂；皮质类固醇；泼尼松龙；甲基泼尼松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢素；环孢素A、氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；及替扎尼定(tizanidine)。可与本发明抗体组合使用的其他拮抗剂包括其他人细胞因子或生长因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、EL-7、IL-8、IL-12IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF及PDGF)的抗体或拮抗剂。如本文所描述的抗体可与针对细胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配体)的抗体组合。一种或多种本发明抗体(例如双特异性抗体)亦可与诸如以下药剂组合：氨甲蝶呤、环孢素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸吗乙酯、来氟米特、NSAID(例如布洛芬)、皮质类固醇(例如泼尼松龙)、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝血剂、补体抑制剂、肾上腺素能剂、如本文所描述的干扰通过促炎症性细胞因子进行的信号传导的药剂、IL-1b转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、PSGL、TACE抑制剂、T细胞信号传导抑制剂(例 如激酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、如本文所描述的可溶性细胞因子受体及其衍生物及抗炎症性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13及TGF)。
[0163] 可与本发明抗体组合用于多发性硬化(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)的治疗剂的优选实例包括富马酸二甲酯(例如BG-12；Biogen)、干扰素-β(例如IFN-β-1a及IFN-β-1b)；皮质类固醇、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、CD40配体及CD80的抗体、IL-12
拮抗剂。
拮抗剂。
[0164] 可与本发明抗体(例如双特异性抗体)组合用于治疗或预防炎性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)的药剂的非限制性实例包括下列物质：布替耐德(budenoside)；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸酯；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；
甲硝唑(metronidazole)；脂氧合酶抑制剂；美色拉秦(mesalamine)；奥色拉嗪；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体(例如抗IL-6受体抗体及抗IL-6抗体)；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；如本文所描述的TNF拮抗剂；IL-4、IL-10、IL-13及/或TGF.β.细胞因子或其激动剂(例如激动剂抗体)；IL-11；泼尼松龙、地塞米松(dexamethasone)或布地奈德(budesonide)的葡糖苷酸偶联或右旋糖酐偶联前药；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals公司)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences公司)；缓释型美色拉嗪；氨甲喋呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星(ciprofloxacin)；及利多卡因(lignocaine)。
甲硝唑(metronidazole)；脂氧合酶抑制剂；美色拉秦(mesalamine)；奥色拉嗪；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体(例如抗IL-6受体抗体及抗IL-6抗体)；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；如本文所描述的TNF拮抗剂；IL-4、IL-10、IL-13及/或TGF.β.细胞因子或其激动剂(例如激动剂抗体)；IL-11；泼尼松龙、地塞米松(dexamethasone)或布地奈德(budesonide)的葡糖苷酸偶联或右旋糖酐偶联前药；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals公司)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences公司)；缓释型美色拉嗪；氨甲喋呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星(ciprofloxacin)；及利多卡因(lignocaine)。
[0165] 可与本发明抗体(例如双特异性抗体)组合用于治疗或预防银屑病的药剂的非限制性实例包括下列物质：皮质类固醇；维生素D3及其类似物；类视色素(例如阿维A酸胶囊(soriatane))；氨甲喋呤；环孢素、6-硫鸟嘌呤；异维生素a酸(Accutane)；羟脲(hydrea)；羟基脲(hydroxyurea)；柳氮磺吡啶；麦考酚酸吗乙酯；硫唑嘌呤；他克莫司；富马酸酯；生物制剂，例如 瑞体肤(Raptiva)及 优特克单抗(Ustekinmab)及XP-828L；光线疗法；及光化学疗法(例如
组合的补骨脂素与紫外线光线疗法)。
组合的补骨脂素与紫外线光线疗法)。
[0166] 可与本发明抗体(例如双特异性抗体)组合用于治疗或预防炎症性呼吸道/呼吸道疾病(例如慢性阻塞性肺病症、哮喘)的药剂的非限制性实例包括下列物 质：β2-肾上腺素受体激动剂(例如沙丁胺醇(salbutamol)(沙丁胺醇(albuterol)，USAN)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、特布他林、比托特罗(bitolterol))；长效β2-肾上腺素受体激动剂(例如沙美特罗(salmeterol)、福莫特罗(formoterol)、班布特罗(bambuterol))；肾上腺素能激动剂(例如吸入的肾上腺素及麻黄碱锭剂)；抗胆碱能药剂(例如异丙托溴铵(ipratropium bromide))；吸入类固醇与长效支气管扩张剂的组合(例如氟替卡松(fluticasone)/沙美特罗(在美国为 在英国为舒利叠(Seretide)))
或布地奈德/福莫特罗( ))；吸入的糖皮质激素(例如环索奈德
(ciclesonide)、倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德、氟尼缩松(flunisolide)、氟替卡松、莫米松(mometasone)、曲安西龙(triamcinolone))；白三烯修饰剂(例如孟鲁司特(montelukast)、扎鲁斯特(zafirlukast)、普仑司特(pranlukast)及齐留通)；肥大细胞稳定剂(例如色甘酸盐(cromoglicate)(色甘酸钠(cromolyn))及奈多罗米)；抗蕈毒碱剂/抗胆碱能剂(例如异丙托铵、氧托溴铵、噻托溴铵(tiotropium))；甲基黄嘌呤(例如茶碱、胺茶碱)；抗组胺剂；IgE阻断剂(例如奥马珠单抗(Omalizumab))；M3蕈毒碱拮抗剂(抗胆碱能剂)(例如异丙托铵、噻托溴铵)；色酮(例如色甘酸盐、奈多罗米)；黄嘌呤(例如茶碱)；及TNF拮抗剂(例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)及依那西普(etanercept))。
或布地奈德/福莫特罗( ))；吸入的糖皮质激素(例如环索奈德
(ciclesonide)、倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德、氟尼缩松(flunisolide)、氟替卡松、莫米松(mometasone)、曲安西龙(triamcinolone))；白三烯修饰剂(例如孟鲁司特(montelukast)、扎鲁斯特(zafirlukast)、普仑司特(pranlukast)及齐留通)；肥大细胞稳定剂(例如色甘酸盐(cromoglicate)(色甘酸钠(cromolyn))及奈多罗米)；抗蕈毒碱剂/抗胆碱能剂(例如异丙托铵、氧托溴铵、噻托溴铵(tiotropium))；甲基黄嘌呤(例如茶碱、胺茶碱)；抗组胺剂；IgE阻断剂(例如奥马珠单抗(Omalizumab))；M3蕈毒碱拮抗剂(抗胆碱能剂)(例如异丙托铵、噻托溴铵)；色酮(例如色甘酸盐、奈多罗米)；黄嘌呤(例如茶碱)；及TNF拮抗剂(例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)及依那西普(etanercept))。
[0167] 在一个方面中，本发明抗体(例如双特异性抗体)可与一种或多种针对其他参与免疫反应(例如移植排斥)调控的靶物的抗体组合使用。
[0168] 可与本发明抗体(例如双特异性抗体)组合用于治疗或预防免疫反应的药剂的非限制性实例包括下列物质：抵抗其他细胞表面分子(包括但不限于CD25(白介素-2受体-a)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4(CD80(B7.1)，例如CTLA4Ig-阿巴他塞(abatacept)( ))、ICOSL、ICOS及/或CD86(B7.2))的
抗体。在又一实施方案中，将本发明抗体与一种或多种一般免疫阻抑剂(例如环孢素A或FK506)组合使用。
抗体。在又一实施方案中，将本发明抗体与一种或多种一般免疫阻抑剂(例如环孢素A或FK506)组合使用。
[0169] 在其他实施方案中，抗体用作抵抗自身免疫病症、炎症性疾病等的疫苗佐剂。用于治疗这些类型病症的佐剂的组合适于与各种来自涉及自身免疫性的靶定自体抗原(亦即自身抗原，例如髓磷脂碱蛋白)、炎症性自体抗原(例如淀粉样肽蛋白)或移植抗原(例如异体抗原)的抗原组合使用。抗原可包括衍生自蛋白质的肽或多肽以及下列物质中的任一者的片段：糖、蛋白质、多核苷 酸或寡核苷酸、自身抗原、淀粉样肽蛋白、移植抗原、变应原或其他大分子组分。在一些情况下，一种以上抗原包括于抗原性组合物中。
[0170] 举例而言，用于调节脊椎动物宿主中的变应原反应的期望疫苗(其含有本发明的佐剂组合)包括含有变应原或其片段者。这些变应原的实例描述于美国专利第5,830,877号及PCT公开第WO 99/51259号(其全部内容以引用方式并入本文中)，且包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子及药物(例如青霉素(penicillin))。疫苗干扰IgE抗体的产生，IgE抗体的产生是变应性反应的已知病因。在另一实例中，用于预防或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样蛋白沉积为特征的疾病的期望疫苗，其含有本发明的佐剂组合，包括含有淀粉样肽蛋白(APP)部分者。此疾病有不同名称，如阿尔茨海默氏病、淀粉样变性或淀粉样疾病等。因此，本发明疫苗包括本发明的佐剂组合及Aβ肽以及Aβ肽片段及Aβ肽或其片段的抗体。
[0171] 在另一实施方案中，医药组合物可以作为试剂盒形式供应，试剂盒包括装有本发明的抗体、双特异性抗体或抗原结合片段的容器。本发明抗体(例如双特异性抗体)可以用于单一或多个剂量的可注射溶液形式或以将在注射的前重构的无菌粉末形式提供。或者，这样的试剂盒可包括干粉分散器、液体气溶胶生成器或雾化器以用于施用抗体(例如双特异性抗体)。这样的试剂盒可进一步包括关于医药组合物的适应症及用途的书面信息。另外，该信息可包括以下声明：已知对IL-17及IL-23过敏的患者禁忌该抗体组合物。
[0172] 在另一实施方案中，本发明提供制品，其包括：(a)组合物，其包括如本文所描述的抗体、双特异性抗体或抗原结合片段；(b)容器，其含有所述组合物；及(c)附于该容器的标签或包括于该容器中的封装插页，其指示该抗体在治疗免疫相关疾病中的用途。
[0173] 在一方面中，组合物包括其他活性成份，其可以是，例如，另一抗体或抗炎剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。优选地，组合物是无菌的。
[0174] 如本文所描述的抗体、双特异性抗体及抗原结合片段亦可用于制备用于治疗免疫相关性及炎症性疾病的医药及药物，这些免疫相关性及炎症性疾病包括，例如，多发性硬化(MS)(例如复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化及进展复发型多发性硬化)、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病)、特应性皮炎、接触性皮炎、全身性硬化、全身性红斑狼疮(SLE)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA) 相关性血管炎(AAV)、巨细胞动脉炎、多发性硬化(MS)、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、舍格伦综合征、银屑病、银屑病性关节炎、成人呼吸道疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤(例如特发性肺纤维化)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道高反应性、慢性支气管炎、变应性哮喘、湿疹、幽门螺杆菌感染、由腹膜炎症(例如来自感染、损伤等)所致的腹内黏连及/或脓肿、肾病综合征、特发性脱髓鞘多发性神经病变、格-巴二氏综合征、器官同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮肾炎、IgA肾病变、糖尿病性肾病、微小病变型疾病(脂性肾病)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾因性全身性纤维化(NSF)、肾因性纤维化皮肤病、纤维化胆汁郁积性肝炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎(舒尔曼综合征)、硬化性黏液水肿(丘疹性黏蛋白沉积症)、硬皮病、硬化萎缩苔癣、POEMs综合征(克[罗]-富[克斯]二氏综合征、高槻病或PEP综合征)、肾病综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(来自诸如以下移植体：血液、骨髓、肾、胰脏、肝、原位肝、肺、心脏、肠、小肠、大肠、胸腺、异基因干细胞、低强度异基因移植物、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、静脉、动脉、血管、胃及睾丸)、溶骨性疾病(例如多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病)、囊性纤维化、年龄相关性黄斑变性(AMD；例如湿型AMD及干型AMD)、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、心脏缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌炎、心脏纤维化、不良心肌重构、移植排斥、链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、牙龈炎/牙周炎、疱疹性基质角膜炎、麸质敏感性肠病再狭窄、川崎病及免疫介导的肾病。在一个具体方面中，这些医药及药剂包括治疗有效量的本发明的双特异性抗体、抗体或抗原结合片段以及医药上可接受的载体。在一个方面中，混合物是无菌的。
[0175] 本文所引用所有专利、专利申请案及公开案及电子可用材料(例如氨基酸及核苷酸序列提交文件)的全部公开内容皆以引用方式并入本文
中。已仅出于清晰理解的目的给出前述详细说明及实例。不应由此理解不必需的限制。本发明并不限定于所展示及所描述的精确细节，本领域技术人员所显而易见的各种变化将包括于由申请专利范围所界定的本发明内。
中。已仅出于清晰理解的目的给出前述详细说明及实例。不应由此理解不必需的限制。本发明并不限定于所展示及所描述的精确细节，本领域技术人员所显而易见的各种变化将包括于由申请专利范围所界定的本发明内。
[0176] 通过下列非限制性实例进一步阐释本发明。
[0177] 实施例1
[0178] 鼠抗人IL-17A/F双重特异性抗体的人源化
[0179] 杂交瘤克隆的选择及可变区鉴别
[0180] 在Bristol-Myers Squibb下属的ZymoGenetics Inc.使用HEK293瞬时表达系统产生重组人源蛋白IL-17A、IL-17A/F及IL-17F。对BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington,MA)实施免疫，且使用偶联BSA的重组人源IL-17F进行强化，随后使用偶联BSA的重组人源IL-17A进行免疫。对血清中含有最高抗IL-17F及抗IL-17A抗体结合活性的小鼠给予最终一次IL-17F融合前强化。4天后，使脾细胞及淋巴结细胞与Ag8.653骨髓瘤细胞融合以生成产生抗体的杂交瘤。通过基于平板的ELISA对杂交瘤培养上清液筛选IL-17F及IL-17A结合，且基于IL-17A/F细胞的测定法中筛选IL-17F及IL-17A中和。将结合并中和IL-17F及IL-17A的上清液试样的相应杂交瘤细胞克隆，分离出单株杂交瘤339.15.3.5(称为339.15)，其产生所关注的中和性单克隆抗体。使用小鼠单克隆抗体同种型分析试剂盒(Roche,Indianapolis,IN,USA)对杂交瘤339.15进行同种型分析，且使用 RNeasy试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)分离RNA。使
用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech,Mountain View,CA,USA)利用5′RACE技术及针对小鼠恒定区序列设计的基因特异性3′引物来克隆可变区。使用 测序用TA
克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)克隆重链及轻链可变区序列。将基因序列与对自杂交瘤339.15纯化的抗体实施的N末端氨基酸测序结果进行比较来验证该序列。
用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech,Mountain View,CA,USA)利用5′RACE技术及针对小鼠恒定区序列设计的基因特异性3′引物来克隆可变区。使用 测序用TA
克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)克隆重链及轻链可变区序列。将基因序列与对自杂交瘤339.15纯化的抗体实施的N末端氨基酸测序结果进行比较来验证该序列。
[0181] 自339.15.3.5、339.15.5.3及339.15.3.6克隆可变区序列且展示含有完全相同的可变区序列。将来自339.15.3.5的序列用于随后的人源化，于2006年11月7日将339.15.3.6杂交瘤克隆保藏于美国典型组织培养物保藏中心(American Type Tissue Culture Collection)(ATCC,10801University Blvd,Manassas,VA 20110-2209)专利保藏处作为基于布达佩斯条约的原始保藏物，其被给予 专利保藏编号：PTA-7988。杂交瘤克隆339.15.3.6( 专利保藏编号：PTA-7988)及339.15.5.3(ATCC专利保藏编号：PTA-7987)亦公开于，例如，美国专利第7,790,163号、第7,910,703号及第8,333,968号中。
[0182] 嵌合及人源化抗人源IL-17A/F可变区序列的分子建模
[0183] 使用MOE软件组2008版(Chemical Computing Group,Montreal,Canada)构建并察验所有可变区模型。
[0184] 抗人IL-17A/F人源化抗体设计
[0185] 将鼠互补决定区(CDR)移植于人源种系框架序列上。在V-Base(MRC,Center for Protein Engineering,UK)中将这些序列与种系氨基酸序列进行比较。选择一种种系基因VH1-03用于可变重链区。选择若干种种系基因用于可变轻链区：VKVI A26、VKI A20、VKVI A14、VKIII L6及VKI L14。VKVI种系基因家族显示的与鼠序列的同源性最高，然而，作为人抗体库中的代表不足的种系家族，亦考虑具有高同源性的其他种系家族。将由鼠Kabat定义的CDR区移植到由人Kabat定义的重链及轻链的框架区上。
[0186] 人源化抗IL-17A/F抗体的构建、表达及纯化
[0187] 自GeneART公司(GeneART公司，Burlingame,CA,USA)订购人源化可变区序列。利用重叠PCR(Horton等人，Gene,77:61-68(1989))及/或限制性酶克隆至pTT5(HEK293-6E瞬时表达载体)中(NCR Biotechnology Research Institute,Ottawa,ON,CAN)，将人源化及鼠可变区序列融合于人κ恒定区(SEQ ID NO:10)或IgG1.1(SEQ ID NO:11)，IgG1.1是野生型IgG1的具有使得Fcγ受体I结合及固定补体能力减少的突变的效应物负变体(Gross等人，Immunity,15:289-302(2001))。所有构建体均使用mod2610(ATGCGGCGGAGAGGCTGGTCCTGGATCTTCCTGTTTCTGCTGAGCGGAACAGCCGGCGTGCTGAGC,SEQ ID NO:30)信号序列表达，但可使用编码氨基酸序列MRRRGWSWIFLFLLSGTAGVLS(SEQ ID NO:31)的任一核酸序列。利用表达构建体使用聚乙烯亚胺试剂转染HEK293-6E悬浮细胞且在F17培养基(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)中培养并添加5mM L-谷氨酰胺及25μg/mL G418。在24小时之后，添加1/40体积的20％胰蛋白胨NI(Organotechnie SAS,La Courneuve,FR)。在转染后大约120小时时，收获条件化培养基并过0.2μm过滤器。从经过滤的条件化培养基使用Mab Select SuRe亲和层析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)与 200大小排阻层析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)的组合纯化蛋白质。通过UV-A280nm下的吸光度来估计含量，并通过分析型大小排阻高效液相层析、SDS PAGE及Western印迹来评估质量。
[0188] 抗人IL-17A/F人源化组生物测定活性；用于测量NF-κB诱导的人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性的NIH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因测定
[0189] 使用称为KZ170的NF-κB荧光素酶报告基因稳定转染鼠成纤维细胞系(NIH/3T3，编号：CRL-1658)且克隆出来。将NIH/3T3/KZ170克隆I 细胞以10,000个细胞/孔接种于96孔白色不透明实心底部荧光素酶板(Corning Incorporated,Corning,NY)中的平板培养基(DMEM加3％FBS、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺(HyClone Laboratories，South Logan,UT))中且在37℃、5％CO2下培养过夜。次日，在测定培养基(DMEM加
0.5％BSA、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES(HyClone Laboratories，South Logan,UT))中制备重组人源IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,ABristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)的连续稀释物，将连续稀释物添加至含有细胞的板中，并在
37℃、5％CO2下一起温育4小时。另外，使用该测定来测量人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的人IL-17A、IL-17A/F或IL-17F与本文所描述的抗人IL-17A/F抗体的连续稀释液在测定培养基中混合，添加至含有细胞的板中，并在37℃、5％CO2下一起温育4小时。在温育后，去除培养基并裂解细胞，然后根据制造商
3
的说明在Berthold Centro XS亮度计(Berthold Technologies,Wildbad,Germany)上使用闪光底物(Promega公司，Madison,WI)进行读取。平均荧光强度的增加(通过NF-κB荧光素酶报告基因的活化)指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用。平均荧光强度的降低指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每种抗人IL-17A/F抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
0.5％BSA、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES(HyClone Laboratories，South Logan,UT))中制备重组人源IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,ABristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)的连续稀释物，将连续稀释物添加至含有细胞的板中，并在
37℃、5％CO2下一起温育4小时。另外，使用该测定来测量人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的人IL-17A、IL-17A/F或IL-17F与本文所描述的抗人IL-17A/F抗体的连续稀释液在测定培养基中混合，添加至含有细胞的板中，并在37℃、5％CO2下一起温育4小时。在温育后，去除培养基并裂解细胞，然后根据制造商
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的说明在Berthold Centro XS亮度计(Berthold Technologies,Wildbad,Germany)上使用闪光底物(Promega公司，Madison,WI)进行读取。平均荧光强度的增加(通过NF-κB荧光素酶报告基因的活化)指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用。平均荧光强度的降低指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每种抗人IL-17A/F抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
[0190] 抗人IL-17A/F人源化CDR移植及嵌合组生物测定活性；NIH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因分析结果
[0191] IL-17A、IL-17A/F及IL-17F诱导NF-κB荧光素酶报告基因以剂量依赖性方式发生活化，且经测定EC50浓度为0.15nM(对于IL-17A而言)、0.50nM(对于IL-17A/F而言)及0.50nM(对于IL-17F而言)。表1及2呈现本文所描述抗IL-17A/F抗体的实例性IC50数据。
[0192] 表1
[0193]
[0194]
[0195] 抗人IL-17A/F人源化CDR5移植有框架回复突变组生物测定活性表：NIH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因分析结果
[0196] 表2
[0197]
[0198]
[0199] 抗人源IL-17A/F人源化组Biacore活性；通过表面等离子共振(Biacore)测量对人源IL-17A、IL-17A/F及IL-17F的结合亲和力
[0200] 使用表面等离子共振评估人源化抗人IL-17A/F单克隆抗体对人源IL-17A、人源IL-17A/F及人源IL-17F的结合亲和力。
[0201] 通过表面等离子共振测量人源化抗人IL-17A/F抗体与人IL-17A、IL-17A/F及-1 -1IL-17F的相互作用的动力学速率常数及平衡解离常数。缔合速率常数(ka(M s ))是反映-1
抗原-抗体复合物的形成速率的值。解离速率常数(kd(s ))是反映此复合物的稳定性的值。将解离速率常数除以缔合速率常数(kd/ka) 获得平衡解离常数(KD(M))。此值描述相互作用的结合亲和力。具有类似KD的抗体的缔合及解离速率常数可以有很大的变化。因此，测量抗体的ka及kd二者有助于更唯一地描述抗体-抗原相互作用的亲和力。
抗原-抗体复合物的形成速率的值。解离速率常数(kd(s ))是反映此复合物的稳定性的值。将解离速率常数除以缔合速率常数(kd/ka) 获得平衡解离常数(KD(M))。此值描述相互作用的结合亲和力。具有类似KD的抗体的缔合及解离速率常数可以有很大的变化。因此，测量抗体的ka及kd二者有助于更唯一地描述抗体-抗原相互作用的亲和力。
[0202] 在 T100系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上实施结合动力学及亲和力研究。使用 T100控制软件v 2.0对 T100的方法进行
编程。对于这些实验而言，通过山羊抗人源IgG Fc-γ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)或山羊抗小鼠IgG Fc-γ抗体(Jackson ImmunoResearch)将人源化抗人
IL-17A/F抗体捕获于CM4传感器芯片上。在25℃下于10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、
0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH 7.4)中实施与IL-17分子的结合实验。
编程。对于这些实验而言，通过山羊抗人源IgG Fc-γ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)或山羊抗小鼠IgG Fc-γ抗体(Jackson ImmunoResearch)将人源化抗人
IL-17A/F抗体捕获于CM4传感器芯片上。在25℃下于10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、
0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH 7.4)中实施与IL-17分子的结合实验。
[0203] 将捕捉抗体——山羊抗人IgG Fc-γ在10mM乙酸钠(pH 5.0)中稀释至浓度为20μg/mL，且然后使用胺偶合化学(EDC:NHS)以共价方式固定至CM4传感器芯片的所有4个流动槽。在固定化抗体之后，使用1M乙醇胺封闭流动槽上的剩余活性位点。获得大约
5000RU的捕捉抗体密度。以60-150RU的密度将人源化抗人IL-17A/F抗体捕获于CM4芯片的流动槽2、3或4上。以10μL/min的流速将测试抗体捕获至固定化表面上。
仪器测量结合在传感器芯片表面的蛋白质的质量，由此验证每一循环中测试抗体的捕获。制备人IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,属于Bristol-Myers,Squibb，Seattle,WA,USA)的自100nM-0.032nM(1:5连续稀释液)的连续稀释液。将这些连续稀释液注射至表面上，让其与捕获于传感器芯片上的测试抗体特异性结合。以7分钟的缔合时间及15分钟的解离时间重复注射每一浓度的抗原。以50μL/min的流速实施动力学结合研究。在各循环之间，使用20mM盐酸洗涤流动槽以再生表面。此洗涤步骤自固定化的抗体表面去除被捕获的测试抗体及任何结合抗原。随后于下一循环中再次捕获测试抗体。
5000RU的捕捉抗体密度。以60-150RU的密度将人源化抗人IL-17A/F抗体捕获于CM4芯片的流动槽2、3或4上。以10μL/min的流速将测试抗体捕获至固定化表面上。
仪器测量结合在传感器芯片表面的蛋白质的质量，由此验证每一循环中测试抗体的捕获。制备人IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,属于Bristol-Myers,Squibb，Seattle,WA,USA)的自100nM-0.032nM(1:5连续稀释液)的连续稀释液。将这些连续稀释液注射至表面上，让其与捕获于传感器芯片上的测试抗体特异性结合。以7分钟的缔合时间及15分钟的解离时间重复注射每一浓度的抗原。以50μL/min的流速实施动力学结合研究。在各循环之间，使用20mM盐酸洗涤流动槽以再生表面。此洗涤步骤自固定化的抗体表面去除被捕获的测试抗体及任何结合抗原。随后于下一循环中再次捕获测试抗体。
[0204] 使用 T100评估软件(2.0版)汇集数据。通过扣除参考流动槽及空白注射来处理数据。评价基线稳定性，以确保在整个注射序列中再生步骤提供的结合表面是一致的。检查重复进行的注射曲线的再现性。基于二价IL-17分子与二价抗体的结合，确定了二价分析物结合相互作用模型适用于与IL-17分子的相互作用。该二价分析物模型先前描述于West,A.P.等人，Biochemistry，39:9698-9708(2000)；及West，A.P.等人，J.Mol.Biol.，313:385-397 (2001)中。可从通过表面等离子共振测定的速率常数比率(kd1/ka1)计算二价分析物模型的亲和力常数(KD1)。在使用多重Rmax且在将RI设定为零的条件下，将扣除参考后的结合曲线整体拟合至该适当的结合模型。数据与结合模型充分吻合，且
2
实验结合曲线与理论结合曲线之间具有良好一致性。与拟合有关的chi及标准误差较低。
残差并无倾向性。
2
实验结合曲线与理论结合曲线之间具有良好一致性。与拟合有关的chi及标准误差较低。
残差并无倾向性。
[0205] 抗人IL-17A/F人源化组Biacore活性
[0206] 与人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F的结合实验的结果分别展示于表3、4及5中。
[0207] 抗人IL-17A/F人源化抗体对IL-17A的结合亲和力
[0208] 表3
[0209]
[0210] 抗IL-17A/F人源化抗体对IL-17A/F的结合亲和力
[0211] 表4
[0212]
[0213] 抗IL-17A/F人源化抗体对IL-17F的结合亲和力
[0214] 表5
[0215]
[0216]
[0217] 实施例2
[0218] 7B7抗体选择及杂交瘤生成
[0219] 通过表面等离子共振技术(使用Biacore)基于抗体的结合及阻断性质对抗体进行分组的表位划分策略，如图11中所展示。
[0220] 基于抗体的以下能力对抗体进行分组及选择：
[0221] 1.仅特异性结合IL-23的p19亚结构域；
[0222] 2.仅特异性阻断IL-23受体(IL-23R)且并不阻断IL-12受体(IL-12R)；及
[0223] 3.不与任何能够特异性结合IL-23的p40亚结构域的抗体进行竞争。
[0224] 将先前已知对IL-23的p19或p40亚结构域及IL-23R或IL-12R具有选择性的材料(例如抗体)全部选用来包被于 CM5芯片上。包被密度在500-8000共振单位(RU)之间有所变化。将拟划分的抗体在96孔ELISA板中自介于10μg/mL至100μg/mL之间的起始浓度起连续滴定(1:2或1:3)至共8个浓度。向每一孔中添加10nM IL-23抗原。使板上的抗体与抗原形成复合物且在4℃下过夜达到平衡。以20μL/min的流速经两分钟将复合物注射至CM5芯片上。记录两分钟结束时的信号，以结合共振单位(RU)表示。
抗体-抗原复合物能够与包被于芯片上的材料竞争或并不竞争。若抗体与抗原的复合物能够与芯片上的材料进行竞争，则随着抗体浓度增加，结合RU降低，且若其并不竞争，则结合RU有所增加。基于此观察，根据其结合选择性及竞争能力来划分所有抗IL23抗体。
抗体-抗原复合物能够与包被于芯片上的材料竞争或并不竞争。若抗体与抗原的复合物能够与芯片上的材料进行竞争，则随着抗体浓度增加，结合RU降低，且若其并不竞争，则结合RU有所增加。基于此观察，根据其结合选择性及竞争能力来划分所有抗IL23抗体。
[0225] 使用含于RIBI佐剂中的重组人源IL-23-his对来自Medarex集群(Milpitas,CA)的转基因HCo12J/K 小鼠实施免疫。
[0226] 通过一种改良的间接双重ELISA测试来自经免疫小鼠的血清中IL-23特异性抗体的表达。简言之，使用溶于PBS中的2.5μg/ml小鼠抗his蛋白以50μl/孔包被微量滴定板( 96孔平底，编号：9018)，在4℃下温育过夜，且然后使用溶于PBS中的1％BSA封闭。以50μl/孔将2.5μg/ml HuIL-23或HuIL-12添加至板中用于捕获，且在室温下温育一小时。使用PBS Tween洗涤板，且添加血清稀释液并温育1小时。使用PBS-Tween洗涤板，并与偶联HRP的山羊-抗人γ重链(Jackson ImmunoResearch，编号：109-036-098)一起温育1小时。在洗涤3次之后，使用ABTS(Moss，CAT编号：ABTS-1000)底物使板显影，且在415nm下分析OD。分析数据并表示为血清效价，血清效价定义为：导致至少两倍于背景的抗原阳性信号的最高血清稀释度。与小组中的其他小鼠相比，小鼠215094对IL-23具有相对较高效价且对IL-12具有较低的交叉反应性，基于此，选择小鼠215094用于杂交瘤生成(参见表6)。
[0227] 表6.血清效价
[0228]小鼠编号 基因型 Hu IL23-his Hu IL12-his
215088 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215090 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215092 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215094 HCo12:01[J/K] >109,350 12,150
215096 HCo12:01[J/K] >109,350 36,450
215098 HCo12:01[J/K] 36,450 1,350
215089 HCo12:01[J/K] >109,350 1,350
215091 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215093 HCo12:01[J/K] >109,350 4,050
215095 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215097 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215099 HCo12:01[J/K] 12150 12,150
215088 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
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215089 HCo12:01[J/K] >109,350 1,350
215091 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215093 HCo12:01[J/K] >109,350 4,050
215095 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215097 HCo12:01[J/K] >109,350 >109,350
215099 HCo12:01[J/K] 12150 12,150
[0229] 小鼠215094的基因型提供于下表7中。
[0230] 表7.小鼠215094基因型
[0231]小鼠ID 性别 出生日期 基因型
215094 M 10/11/2009 HCo12(15087)+^；JHD++；JKD++；KCo5(9272)+^；
215094 M 10/11/2009 HCo12(15087)+^；JHD++；JKD++；KCo5(9272)+^；
[0233] 对来自所得杂交瘤的条件化培养基，首先在标准自动化测定中筛选人IgGγ/κ的表达，随后通过ELISA筛选IL-23结合，并针对IL-12实施反筛选ELISA，以鉴别如先前所描述的特异性克隆。用于测试的杂交瘤选择准则为：试样的OD在huIL23板上大于1.5、且在huIL12板上小于0.15。
[0234] 融合2378总共生成了827个人源IgG阳性杂交瘤，其中128个具有IL-23特异性。与抗p19及抗p40阳性对照抗体相比，杂交瘤7B7对IL-23具有较强结合且对IL-12并无交叉反应性，基于此，选择杂交瘤7B7用于进一步测试；图7中给出了通过ELISA选择的杂交瘤的实例(包括7B7)。通过ELISA证实了亚克隆7B7.D的同种型4为人源IgG1κ。
[0235] 对来自所有IL-23p-19特异性MAb的杂交瘤条件化培养基，在基于细胞的测定法中筛选IL-23中和活性。Kit225，一种自患有T细胞慢性淋巴细胞白血病的患者确立的人源T细胞系，已展示可应答IL-23而发生剂量依赖性STAT3磷酸化(pSTAT3)。在添加及不添加杂交瘤条件化培养基的条件下，用EC50的人IL-23或对照中和抗p19抗体将细胞刺激15分钟。裂解细胞并通过ELISA(Cell Signaling Technology, 目录编
号：7300)评价IL-23依赖性STAT3磷酸化的抑制，其中O.D.降低指示pSTAT3水平降低。
杂交瘤7B7在Kit225分析中观察到IL-23信号传导的强力中和，如图8中所展示，基于此，选择杂交瘤7B7用于亚克隆及进一步表征。
号：7300)评价IL-23依赖性STAT3磷酸化的抑制，其中O.D.降低指示pSTAT3水平降低。
杂交瘤7B7在Kit225分析中观察到IL-23信号传导的强力中和，如图8中所展示，基于此，选择杂交瘤7B7用于亚克隆及进一步表征。
[0236] 使用与上文所述类似的测定法，显示了7B7亚克隆1413.2378.7B7.D4.H2IL-23的选择性结合及IL-23信号传导的中和，随后对其实施测序(IL-23p197B7重链可变域展示于SEQ ID NO:7中，轻链可变域展示于SEQ ID NO:9中)。
[0237] 实施例3
[0238] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的生成
[0239] 哺乳动物抗人IL-23/IL-17A/F双特异性分子的构建及表达
[0240] 在 GeneART 公 司 (GeneART 公 司，Burlingame,CA,USA) 或 GenScript (GenScript,Piscataway,NJ,USA)合 成部 分 基 因 或完 整 基 因，且经 由 限 制 性酶 克 隆 插 入 pTT5(HEK293-6E 瞬 时 表 达 载 体，NCR Biotechnology Research Institute,Ottawa,ON,Canada)中。以完整构建体形式自GenScript(GenScript,Piscataway,NJ,USA)订购MVC1059(SEQ ID NO:62)及MVC1061(SEQ ID NO:60)。使用mod2610(SEQ ID NO:30)信号序列表达所有构建体。biAbFabL是双特异性抗体，其含有全抗体，全抗体在C末端通过接头(例如10mer G4S)附接有该双特异性抗体的第二臂的Fab单元，且利用共同轻链(参见图2)。taFab是双特异性抗体，其含有全抗体，全抗体在N末端通过接头(例如(Gly4Ser1)x(其中x为1、2或3)及SEQ ID NO:12的接头)附接有该双特异性抗体的第二臂的Fab单元。如同重链部分一样，双特异性抗体的每一臂具有两条经由接头(例如(Gly4Ser1)x(其中x为1、2或3)及SEQ ID NO:12的接头)附接的轻链(参见图3)。异二聚体Fc是类似于传统抗体的双特异性抗体，然而，其含有两条经由CH3区中的静电互补性缔合而缔合的不同重链。异二聚体Fc利用共同轻链(参见图4)。重链及轻链恒定区包括IgG1.1(SEQ ID NO:11，其可由SEQ ID NO:82编码)、没有C末端赖氨酸的IgG1.1f(SEQ ID NO:127)、具有C末端赖氨酸的IgG1.1f(SEQ ID NO:128)、人源κ恒定区(SEQ ID NO:10，其可由SEQ ID NO:83编码)或IgG4.1(SEQ ID NO:8)。IgG4重链恒定域可为野生型IgG4的变体，其在铰链区中具有突变S228P(EU索引编号系统)或S241P(Kabat编号系统)。将小鼠/人源嵌合重链中241(Kabat)处的丝氨酸改变为脯氨酸(出现在IgG1及IgG2中的该位置)产生均一的(homogeneous)抗体且消除异质性(heterogeneity)。另外，与原来的嵌合IgG4相比，变体IgG4具有显著延长的血清半衰期且展示改良的组织分布。Angal等人，Molecular Immunology,30(1):105-108(1993)；Schuurman等人，Molecular Immunology,38:1-8(2001)；Lewis等人，Molecular Immunology,46:3488-3494(2009)。
[0241] 使用1μl酵母DNA制备物及20μl大肠杆菌(E.coli)细胞来转化电转感受态大肠杆菌宿主细胞(DH10B)。以2.0kV、25μF及400欧姆来对细胞实施电脉冲。在电穿孔后，添加600μl SOC(2％ 胰蛋白胨(Difco,Detroit,MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)且将细胞以50μl及550μl等分试样平铺于两个LB AMP板(LB培养液(Lennox)、1.8％ 琼脂
(Difco)、100mg/L氨苄西林(Ampicillin))上。
(Difco)、100mg/L氨苄西林(Ampicillin))上。
[0242] 对来自每一构建体的5个菌落实施序列分析。选择一个含有正确序列的克隆。使用ABI BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems,FosterCity,CA)实施DNA测序。测序反应液使用Edge BioSystems Preforma Centriflex凝胶过滤筒(Gaithersburg,MD)纯化，且在Applied Biosystems 3730DNA分析仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上 运 行 测 序。 使 用 v4.6软 件
(GeneCodes公司，Ann Arbor,MI.)汇总所得序列数据并加以编辑。选择一个含有正确序列的克隆且使用市售试剂盒( 质粒大量提取试剂盒，Qiagen,Valencia,CA)根据
制造商说明书分离大规模质粒DNA。
(GeneCodes公司，Ann Arbor,MI.)汇总所得序列数据并加以编辑。选择一个含有正确序列的克隆且使用市售试剂盒( 质粒大量提取试剂盒，Qiagen,Valencia,CA)根据
制造商说明书分离大规模质粒DNA。
[0243] 利用聚乙烯亚胺试剂，用表达构建体转染HEK293-6E悬浮细胞且在添加5mM L-谷氨酰胺及25μg/mL G418的F17培养基(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)中培养。在24小时之后，添加1/40体积的20％胰蛋白胨NI(Organotechnie SAS,La Courneuve,FR)。
在转染后大约120小时时，收获条件化培养基并过0.2μm过滤器。使用Mab Select SuRe亲和层析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)与 200大小排阻层析
(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)的组合自经过滤的条件化培养基纯化蛋白质。通过UV-A280nm下的吸光度来估计含量，且通过分析型大小排阻高效液相层析、SDS PAGE及Western印迹法来评估质量。
在转染后大约120小时时，收获条件化培养基并过0.2μm过滤器。使用Mab Select SuRe亲和层析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)与 200大小排阻层析
(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)的组合自经过滤的条件化培养基纯化蛋白质。通过UV-A280nm下的吸光度来估计含量，且通过分析型大小排阻高效液相层析、SDS PAGE及Western印迹法来评估质量。
[0244] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体组合物
[0245] 全抗体及其模块化组分绘示于图1中。biAbFabL形式绘示于图2中。taFab形式绘示于图3中。异二聚体Fc形式绘示于图4中。VCVFc形式绘示于图5中。VCDFc形式绘示于图6中。
[0246] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；通过NF-κB诱导测量人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性的IH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因分析
[0247] 用于此分析的材料及方法描述于上文实施例1中。
[0248] 抗人IL-23/IL-17A/F双 特异 性抗体 生物 测定 活性；Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子磷酸-STAT3分析用于测量磷酸-STAT3诱导的人IL-23活性
[0249] 用人IL-23Rα及人IL-12Rβ1稳定转染鼠骨髓源细胞系(Baf3)并进行克隆。使用测定培养基(RPMI 1640以及10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙 酮酸钠(HyClone Laboratories，South Logan,UT)及2μMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))将Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1克隆6细胞洗涤三次，然后以50,000个细胞/孔铺于96孔圆底组织培养板中。在测定培养基中制备重组人IL-23(ZymoGenetics,属于Bristol-Myers Squibb的公司，Seattle WA,USA)的连续稀释液，添加至含有细胞的板中，并在37℃、5％CO2下一起温育15分钟。另外，亦使用该测定法测量IL-23活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的IL-23与本文所描述的抗人IL-23/IL-17A/F抗体的连续稀释液混合且在37℃、5％CO2下于测定培养基中一起温育15分钟，然后添加至细胞中。在预温育后，将处理剂添加至含有细胞的板中并在37℃、5％CO2下一起培养15分钟。在温育后，根据制造商的说明(BIO- 细胞裂解试剂盒，Bio-Rad Laboratories，
Hercules,CA)，使用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞，再置于冰上以终止反应。然后将细胞在
4℃下以2000rpm旋转5分钟，然后倾出培养基。每一孔中加入50μL/孔的裂解缓冲液；将裂解物在冰上吹打5次，然后在300rpm 4℃于平板振荡器上搅动20分钟。在3200rpm及
4℃下将板离心20分钟。收集上清液，转移至新的微量滴定板上，储存于-80℃下。
Hercules,CA)，使用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞，再置于冰上以终止反应。然后将细胞在
4℃下以2000rpm旋转5分钟，然后倾出培养基。每一孔中加入50μL/孔的裂解缓冲液；将裂解物在冰上吹打5次，然后在300rpm 4℃于平板振荡器上搅动20分钟。在3200rpm及
4℃下将板离心20分钟。收集上清液，转移至新的微量滴定板上，储存于-80℃下。
[0250] 根据制造商说明书(BIO- 磷酸 蛋 白 检测 试 剂 盒，Bio-RadLaboratories)，将捕获珠子(BIO- 磷酸-STAT3测定，Bio-Rad Laboratories)与
50μL 1:1稀释裂解物混合且添加至96孔过滤板中。铝箔覆盖的平板在室温及300rpm振荡下温育过夜。将平板转移至微量滴定真空装置中并使用洗涤缓冲液洗涤三次。在添加
25μL/孔检测抗体之后，将箔覆盖的板在室温及300rpm振荡下温育30分钟。将平板过滤并使用洗涤缓冲液洗涤三次。添加链霉抗生物素-PE(50μL/孔)，且将箔覆盖的板在室温及300rpm振荡下温育15分钟。过滤平板且使用珠子再悬浮缓冲液洗涤三次。在最终洗涤之后，将珠子再悬浮于125μL/孔的珠子悬浮缓冲液中，振荡30秒，且根据制造商说明书在阵列式读取仪(BIO- 100，Bio-Rad Laboratories)上进行读取。用分析软件
(BIO- Manager 4.1，Bio-Rad Laboratories)分析数据。存在于裂解物中的磷酸
化STAT3转录因子的水平增加指示IL-23受体-配体相互作用。存在于裂解物中的磷酸化STAT3转录因子的含量降低指示IL-23受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism
4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一抗人IL-23/IL-17A/F抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
50μL 1:1稀释裂解物混合且添加至96孔过滤板中。铝箔覆盖的平板在室温及300rpm振荡下温育过夜。将平板转移至微量滴定真空装置中并使用洗涤缓冲液洗涤三次。在添加
25μL/孔检测抗体之后，将箔覆盖的板在室温及300rpm振荡下温育30分钟。将平板过滤并使用洗涤缓冲液洗涤三次。添加链霉抗生物素-PE(50μL/孔)，且将箔覆盖的板在室温及300rpm振荡下温育15分钟。过滤平板且使用珠子再悬浮缓冲液洗涤三次。在最终洗涤之后，将珠子再悬浮于125μL/孔的珠子悬浮缓冲液中，振荡30秒，且根据制造商说明书在阵列式读取仪(BIO- 100，Bio-Rad Laboratories)上进行读取。用分析软件
(BIO- Manager 4.1，Bio-Rad Laboratories)分析数据。存在于裂解物中的磷酸
化STAT3转录因子的水平增加指示IL-23受体-配体相互作用。存在于裂解物中的磷酸化STAT3转录因子的含量降低指示IL-23受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism
4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一抗人IL-23/IL-17A/F抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
[0251] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；NIH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因测定及Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子磷酸-STAT3测定结果
[0252] 人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以剂量依赖性方式诱导NF-κB荧光素酶报告基因发生活化，其EC50浓度经测定为0.33nM(对于IL-17A而言)、1nM(对于IL-17A/F而言)及1nM(对于IL-17F而言)，且IL-23以剂量依赖性方式诱导STAT3磷酸化，其EC50浓度经测定为0.02nM。抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50数据展示于下表8中。
[0253] 抗人IL-23/17A/F双特异性抗体表
[0254] 表8
[0255]
[0256]
[0257] *SEQ ID NO:17的氨基酸序列可由SEQ ID NO:70的序列编码；SEQ ID NO:28的氨基酸序列可由SEQ ID NO:71的序列编码；SEQ ID NO:18的氨基酸序列可由SEQ ID NO:72的序列编码；SEQ ID NO:29的氨基酸序列可由SEQ ID NO:75的序列编码。
[0258] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；原代人SAEC测定用于测量G-CSF诱导的人IL-17A、IL-17AF及IL-17F活性
[0259] 以8,000个细胞/孔将原代人小气道上皮细胞(SAEC)接种于96孔平底组织培养板(Corning Incorporated,Corning,NY)中的小气道上皮生长培养基(SAGM)(细胞及培养基：Lonza,Walkersville,MD)中且在37℃、5％CO2下温育过夜。次日，在SAGM培养基中制备人IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,属于Bristol-Myers Squibb的公司，Seattle WA,USA)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育24小时。另外，使用该测定法测量IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性的中和。将半数最 大浓度(EC50，50％有效浓度)的IL-17A、IL-17A/F或IL-17F与本文所描述抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的连续稀释液在SAGM培养基中混合，且添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育24小时。在温育之后，离心收集上清液，并在-80℃下冷冻直至准备处理为止。使用市售的基于珠子的人源G-CSF细胞因子ELISA系统，根据制造说明书(Procarta/Affymetrix,Santa Clara,CA)测量上清液中的人G-CSF蛋白质水平。上清液中的人G-CSF水平增加指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用。上清液中的人G-CSF水平降低指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
[0260] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；原代人SAEC测定结果
[0261] 人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以剂量依赖性方式诱导人源G-CSF产生，其EC50浓度经测定为0.03nM(对于IL-17A而言)、3nM(对于IL-17A/F而言)及3nM(对于IL-17F而言)。所测试的双特异性抗体包括23/17bAb1(SEQ ID NO:28及SEQ ID
NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)。亦测试了人源化抗人IL-17A/F抗体
339-134mAb(SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:67)。抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50数据展示于下表9中。此数据指示，抗IL-23/IL-17A/F双特异性抗体以同等效力抑制人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F介导的IL-6产生。
NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)。亦测试了人源化抗人IL-17A/F抗体
339-134mAb(SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:67)。抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50数据展示于下表9中。此数据指示，抗IL-23/IL-17A/F双特异性抗体以同等效力抑制人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F介导的IL-6产生。
[0262] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；原代人成纤维细胞测定用于测量通过IL-6诱导的人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性
[0263] 将原代人成纤维细胞系(HFFF2，目录编号：86031405，Health Protection Agency Culture Collections,Porton Down Salisbury,UK)以5,000个细胞/孔接种于96孔平底板(Corning Incorporated,Corning,NY)中的测定培养基(DMEM加10％FBS及2mM L-谷氨酰胺(HyClone Laboratories，South Logan,UT))中且在37℃、5％CO2下温育过夜。次日，在测定培养基中制备重组人源IL-17A、IL-17AF或IL-17F(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle WA 98117)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育24小时。另外，使用该测定法测量人源IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的人IL-17A、IL-17A/F或 IL-17F与本文所描述的抗人IL-23/IL-17A/F抗体的连续稀释液在测定培养基中混合，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育24小时。在温育之后，离心并收集上清液，并在-80℃下冷冻直至准备处理为止。使用市售的基于珠子的人IL-6细胞因子ELISA系统，根据制造说明书(Bio-Rad Laboratories，Hercules,CA)测量上清液中的人IL-6蛋白质水平。上清液中的人IL-6水平增加指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用。
上清液中的人IL-6水平降低指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一种抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
上清液中的人IL-6水平降低指示人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一种抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
[0264] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；原代人成纤维细胞测定结果[0265] 人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以剂量依赖性方式诱导人IL-6产生，其EC50浓度经测定为0.08nM(对于IL-17A而言)、25nM(对于IL-17AF而言)及25nM(对于IL-17F而言)。所测试的双特异性抗体包括23/17bAb1(SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)。亦测试了人源化抗人IL-17A/F抗体339-134mAb(SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:66)。抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50数据展示于下表9中。这些数据指示，抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体以同等效力抑制人源IL-17A、IL-17A/F、IL-17F介导的IL-6产生。
[0266] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；鼠脾细胞测定用于测量鼠IL-17A及IL-17F诱导的人IL-23活性
[0267] 用采自BALB/c小鼠的完整脾制备鼠脾细胞的单细胞悬浮液。在使用ACK缓冲液(0.010M KHCO3、0.0001M EDTA、0.150M NH4Cl，pH 7.2)实施红血胞裂解之后，洗涤脾细胞且再悬浮于测定培养基(RPMI 1640加10％FBS、非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100单位/mL青/链霉素(HyClone Laboratories，South Logan,UT)、50μM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)及50ng/ml人IL-2(R&D Systems,Minneapolis,MN))中。将脾细胞以500,000个细胞/孔接种于96孔圆底平板中。
在测定培养基中制备重组人IL-23(BDC 50220AN087异二聚体材料)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育24小时。另外，亦 使用该测定法测量人源IL-23活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的人IL-23与本文所描述的抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的连续稀释液混合，在37℃、5％CO2下于测定培养基中一起温育15分钟，然后添加至细胞中。在预温育后，将处理剂加入含有细胞的平板中并在
37℃、5％CO2下一起温育24小时。在温育之后，离心并收集上清液，并在-80℃下冷冻直至准备处理为止。使用市售的基于板的鼠IL-17A及IL-17F ELISA体系(eBiosciences,San Diego,CA)根据制造商说明测量上清液中鼠IL-17A及IL-17F的蛋白质水平。上清液中的鼠IL-17A及IL-17F水平增加指示IL-23受体-配体相互作用。上清液中的鼠IL-17A及IL-17F水平降低指示IL-23受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
在测定培养基中制备重组人IL-23(BDC 50220AN087异二聚体材料)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育24小时。另外，亦 使用该测定法测量人源IL-23活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的人IL-23与本文所描述的抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的连续稀释液混合，在37℃、5％CO2下于测定培养基中一起温育15分钟，然后添加至细胞中。在预温育后，将处理剂加入含有细胞的平板中并在
37℃、5％CO2下一起温育24小时。在温育之后，离心并收集上清液，并在-80℃下冷冻直至准备处理为止。使用市售的基于板的鼠IL-17A及IL-17F ELISA体系(eBiosciences,San Diego,CA)根据制造商说明测量上清液中鼠IL-17A及IL-17F的蛋白质水平。上清液中的鼠IL-17A及IL-17F水平增加指示IL-23受体-配体相互作用。上清液中的鼠IL-17A及IL-17F水平降低指示IL-23受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
[0268] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；鼠脾细胞测定结果
[0269] 人IL-23以剂量依赖性方式诱导鼠IL-17A及IL-17F，EC50浓度经测定为0.01nM。所测试的双特异性抗体包括23/17bAb1(SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)。亦测试了抗人IL-23.6(7B7)mAb(SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:17)。抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50数据展示于下表9中。此数据指示，抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体抑制人IL-23诱导的鼠IL-17A及IL-17F产生。
[0270] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；原代人T细胞磷酸-STAT3测定用于测量磷酸-STAT3诱导的人IL-23活性
[0271] 白细胞分离PBMC：随机选择的正常人供体(ZymoGenetics正常供体池)在FHCRC(Seattle,WA)自愿接受成分采血。将白细胞分离的PBMC以无菌血液收集袋中递送至ZymoGenetics。将细胞倾倒至无菌500mL塑料瓶中，用室温的加有1mM EDTA的PBS(HyClone Laboratories，South Logan,UT)稀释至400mL，并转移至250mL圆锥形管中。以1500rpm将250mL管离心10分钟以使细胞沉淀。然后取出细胞上清液并弃除。然后将细胞离心沉淀合并，悬浮于400mL加有1mM EDTA的PBS中。在50mL圆锥形管(总共16个管)中将细胞悬浮液(25mL/管)叠加于 (20mL/管)上。将管以2000rpm在室温下离心20
分钟。收集含有白细胞及残余血小板的界面层(“血沉棕黄 层”)，汇集且使用加1mM EDTA的PBS重复洗涤，直至去除大部分血小板为止。然后将白细胞悬浮于100mL冰冷的冻存培养基(70％RPMI 1640、20％FCS、10％DMSO(HyClone Laboratories))中，且分装至无菌冷冻小瓶(1mL细胞/小瓶)中。将冷冻小瓶置于-80℃冰柜中保持24小时，然后转移至液氮
10
冰柜中。来自典型成分采血的白细胞产量为0.5-1.0×10 个细胞。以此方式处理的血球分离细胞含有T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞及树突细胞。
分钟。收集含有白细胞及残余血小板的界面层(“血沉棕黄 层”)，汇集且使用加1mM EDTA的PBS重复洗涤，直至去除大部分血小板为止。然后将白细胞悬浮于100mL冰冷的冻存培养基(70％RPMI 1640、20％FCS、10％DMSO(HyClone Laboratories))中，且分装至无菌冷冻小瓶(1mL细胞/小瓶)中。将冷冻小瓶置于-80℃冰柜中保持24小时，然后转移至液氮
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冰柜中。来自典型成分采血的白细胞产量为0.5-1.0×10 个细胞。以此方式处理的血球分离细胞含有T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞及树突细胞。
[0272] 活化T细胞的制备：T细胞必须活化方能表达IL-12受体且对IL-12及IL-23具有反应。将冻存白细胞分离PBMC解冻，转移至无菌50mL圆锥形管中，使用50mL温热的测定培养基(RPMI 1640加上10％FBS(HyCloneLaboratories))洗涤，并在37℃水浴中温育1小时，以回收细胞。然后将细胞离心，且弃除细胞上清液。将细胞沉淀物再悬浮于测定培养7 2
基中，且以2×10个细胞/瓶分布于无菌162cm 组织培养瓶中的90mL含有5μg/mL PHA-M的测定培养基(Roche,Basel,瑞士)中。然后将细胞在37℃下于增湿培养箱中总共培养5天。通过以下方式将细胞“静止”：在第4天下午收获细胞，使用不含PHA的新鲜测定培养基置换培养基，再送回培养箱中历经剩余的5天培养期。
基中，且以2×10个细胞/瓶分布于无菌162cm 组织培养瓶中的90mL含有5μg/mL PHA-M的测定培养基(Roche,Basel,瑞士)中。然后将细胞在37℃下于增湿培养箱中总共培养5天。通过以下方式将细胞“静止”：在第4天下午收获细胞，使用不含PHA的新鲜测定培养基置换培养基，再送回培养箱中历经剩余的5天培养期。
[0273] 磷酸-STAT3测定：在培养的第5天收获活化的人源T细胞且再悬浮于新鲜的测5
定培养基中，并以2×10个细胞/孔铺于U形底96孔板中。在测定培养基中制备重组人源IL-23(BDC 50220AN087异二聚体材料)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在
37℃、5％CO2下一起温育15分钟。另外，亦使用该测定法测量IL-23活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的IL-23与本文所描述的抗人IL-23/IL-17AF抗体的连续稀释液混合，在37℃、5％CO2下于测定培养基中一起温育15分钟，然后添加至细胞中。在预温育后，将处理剂添加至含有细胞的板中，并在37℃、5％CO2下一起温育15分钟。温育后，根据制造商说明书(BIO- 细胞裂解试剂盒，Bio-Rad Laboratories，Hercules,CA)，使用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞且置于冰上以终止反应。然后在4℃下以2000rpm离心沉淀细胞5分钟，然后倾倒出培养基。将50μL/孔裂解缓冲液添加至每一孔中；将裂解物在冰上吹吸5次，然后在300rpm及4℃下于平板振荡器上搅动20分钟。在3200rpm及4℃下将板离心20分钟。收集上清液且转移至新微量滴定板上，储存于-80℃下。
定培养基中，并以2×10个细胞/孔铺于U形底96孔板中。在测定培养基中制备重组人源IL-23(BDC 50220AN087异二聚体材料)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在
37℃、5％CO2下一起温育15分钟。另外，亦使用该测定法测量IL-23活性的中和。将半数最大浓度(EC50，50％有效浓度)的IL-23与本文所描述的抗人IL-23/IL-17AF抗体的连续稀释液混合，在37℃、5％CO2下于测定培养基中一起温育15分钟，然后添加至细胞中。在预温育后，将处理剂添加至含有细胞的板中，并在37℃、5％CO2下一起温育15分钟。温育后，根据制造商说明书(BIO- 细胞裂解试剂盒，Bio-Rad Laboratories，Hercules,CA)，使用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞且置于冰上以终止反应。然后在4℃下以2000rpm离心沉淀细胞5分钟，然后倾倒出培养基。将50μL/孔裂解缓冲液添加至每一孔中；将裂解物在冰上吹吸5次，然后在300rpm及4℃下于平板振荡器上搅动20分钟。在3200rpm及4℃下将板离心20分钟。收集上清液且转移至新微量滴定板上，储存于-80℃下。
[0274] 根据制造商说明书(BIO- 磷酸 蛋 白 检测 试 剂 盒，Bio-RadLaboratories)，将捕获珠子(BIO- 磷酸-STAT3测定，Bio-Rad Laboratories)与
50μL 1:1稀释裂解物混合且添加至96孔过滤板中。将铝箔覆盖的平板在室温及300rpm振荡下温育过夜。将平板转移至微量滴定真空装置中并使用洗涤缓冲液洗涤三次。在添加
25μL/孔检测抗体之后，将箔覆盖的平板在室温、300rpm振荡下温育30分钟。将平板过滤，并使用洗涤缓冲液洗涤三次。添加链霉抗生物素-PE(50μL/孔)，且将箔覆盖的平板在室温、300rpm振荡下温育15分钟。平板过滤后使用珠子再悬浮缓冲液洗涤三次。在最终洗涤之后，将珠子再悬浮于125μL/孔的珠子悬浮缓冲液中，振荡30秒，且根据制造商说明书在数组式读取仪(BIO- 100，Bio-Rad Laboratories)上进行读取。使用分析软件
(BIO- Manager 4.1，Bio-Rad Laboratories)分析数据。存在于裂解物中的磷酸
化STAT3转录因子的水平增加指示IL-23受体-配体相互作用。存在于裂解物中的磷酸化STAT3转录因子的水平降低指示IL-23受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism
4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
50μL 1:1稀释裂解物混合且添加至96孔过滤板中。将铝箔覆盖的平板在室温及300rpm振荡下温育过夜。将平板转移至微量滴定真空装置中并使用洗涤缓冲液洗涤三次。在添加
25μL/孔检测抗体之后，将箔覆盖的平板在室温、300rpm振荡下温育30分钟。将平板过滤，并使用洗涤缓冲液洗涤三次。添加链霉抗生物素-PE(50μL/孔)，且将箔覆盖的平板在室温、300rpm振荡下温育15分钟。平板过滤后使用珠子再悬浮缓冲液洗涤三次。在最终洗涤之后，将珠子再悬浮于125μL/孔的珠子悬浮缓冲液中，振荡30秒，且根据制造商说明书在数组式读取仪(BIO- 100，Bio-Rad Laboratories)上进行读取。使用分析软件
(BIO- Manager 4.1，Bio-Rad Laboratories)分析数据。存在于裂解物中的磷酸
化STAT3转录因子的水平增加指示IL-23受体-配体相互作用。存在于裂解物中的磷酸化STAT3转录因子的水平降低指示IL-23受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism
4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
[0275] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定活性；原代人T细胞磷酸-STAT3测定结果
[0276] 人IL-23以剂量依赖性方式诱导STAT3磷酸化，其EC50浓度经测定为0.02nM。所测试的双特异性抗体包括23/17bAb1(SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)。亦测试了抗人IL-23.6(7B7)mAb(SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:17)。抗人IL-23/IL-17A/F抗体的IC50数据展示于下表9中。
[0277]
[0278]
[0279] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体共结合活性；原代人成纤维细胞测定，用于测量在结合于人IL-23的同时对人IL-17A、IL-7A/F或IL-F的抑制。原代人T细胞磷酸-STAT3测定，用以测量在结合于人IL-17A、IL-7A/F或IL-17F的同时对人IL-23的抑制。
[0280] 在30nM的过量IL-23存在下运行原代人成纤维细胞测定。在30nM的过量IL-17A、IL-17A/F、IL-17F存在运行原代人T细胞磷酸-STAT3测定。
[0281] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体生物测定共结合结果
[0282] 所测试的双特异性抗体包括23/17bAb1(SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、
23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)及23/17taFab1(SEQ ID NO:76及 SEQ ID NO:78)。在人IL-23存在下检验抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体时，其并不干扰对人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F的抑制。在人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F存在下检验抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体时，其并不干扰对人IL-23的抑制。
23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)及23/17taFab1(SEQ ID NO:76及 SEQ ID NO:78)。在人IL-23存在下检验抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体时，其并不干扰对人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F的抑制。在人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F存在下检验抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体时，其并不干扰对人IL-23的抑制。
[0283] 通过表面等离子共振(Biacore)测量抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体对人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F及人源IL-23的结合亲和力
[0284] 使用表面等离子共振评估抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体对人IL-17A、人IL-17A/F、人IL-17F及人IL-23的结合亲和力。
[0285] 通过表面等离子共振测量抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体与人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F及人IL-23的相互作用的动力学速率常数及平衡解离常数。缔合速率常-1 -1 -1数(ka(M s ))是反映抗原-抗体复合物的形成的速率的值。解离速率常数(kd(s ))是反映此复合物的稳定性的值。将解离速率常数除以缔合速率常数(kd/ka)来获得平衡解离常数(KD(M))。此值描述相互作用的结合亲和力。具有类似KD的抗体的缔合及解离速率常数可能变化较大。因此，测量抗体的ka及kd有助于更为独特地描述抗体-抗原相互作用的亲和力。
[0286] 在 T100系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上实施结合动力学及亲和力研究。使用 T100控制软件v 2.0对 T100的方法编
程。对于这些实验而言，借助山羊抗人IgG Fc-γ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)将单克隆及双特异性抗体捕获于CM4传感器芯片上。在25℃下于10mM HEPES、
150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH 7.4)中 实施与人源IL-17分子的结合实验。在25℃下于10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20(Biacore)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH
7.4)中实施与IL-23/IL-12B异二聚体的结合实验。
程。对于这些实验而言，借助山羊抗人IgG Fc-γ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)将单克隆及双特异性抗体捕获于CM4传感器芯片上。在25℃下于10mM HEPES、
150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH 7.4)中 实施与人源IL-17分子的结合实验。在25℃下于10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20(Biacore)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH
7.4)中实施与IL-23/IL-12B异二聚体的结合实验。
[0287] 将捕获抗体山羊抗人IgG Fc-γ在10mM乙酸钠(pH 5.0)中稀释至浓度为20μg/mL，且然后使用胺偶合化学(EDC:NHS)以共价方式固定至CM4传感器芯片的所有4个流动槽。在固定化抗体之后，使用1M乙醇胺封闭流动槽上的剩余活性位点。获得大约5000RU的捕获抗体密度。以介于60-150RU之间的密度将抗人IL-23/IL-17A/F抗体捕获于CM4芯片的流动槽2、3或4上。以10μL/min的流速将测试抗体捕获至固定化表面上。仪器测量结合到传感器芯片表面的蛋白质的质量，且由此验证每一循环中测试抗体的捕获。制备人源重组IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)的自100nM至0.032nM(1:5连续稀释)的连续稀释液，制备人源重组IL-23(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)的自200nM至0.064nM(1:5连续稀释)的连续稀释液。将连续稀释液注射至表面上并让其与捕获于传感器芯片上的测试抗体特异性结合。以7分钟的缔合时间及15分钟的解离时间将每一浓度抗原重复注射。以50μL/min的流速实施动力学结合研究。在各循环之间，使用20mM盐酸洗涤流动槽以再生表面。此洗涤步骤自固定抗体表面去除所捕获的测试抗体及任一结合抗原。随后于下一循环中再次捕获测试抗体。
[0288] 使用 T100评估软件(2.0版)编译数据。通过扣除参考流动槽及空白注射来处理数据。评价基线稳定性，以确保在整个注射序列中再生步骤提供的结合表面是一致的。检查重复的注射曲线的再现性。基于二价IL-17分子与二价抗体的结合，确定了二价分析物结合相互作用模型适用于与IL-17分子的相互作用。基于IL-23/IL-12B异二聚体与二价抗体的结合，确定了1:1结合相互作用模型适用于与IL-23分子的相互作用。
在使用多重Rmax且在将RI设定为零的条件下，将扣除参考的结合曲线整体拟合于适当的结合模型。数据与结合模型充分吻合，且实验与理论结合曲线之间具有良好一致性。与拟
2
合有关的chi及标准误差较低。残差并无倾向性。
在使用多重Rmax且在将RI设定为零的条件下，将扣除参考的结合曲线整体拟合于适当的结合模型。数据与结合模型充分吻合，且实验与理论结合曲线之间具有良好一致性。与拟
2
合有关的chi及标准误差较低。残差并无倾向性。
[0289] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体Biacore活性
[0290] 与人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F的结合实验的结果分别展示于表10、11及12中。与人IL-23/IL-12B异二聚体的结合实验的结果展示于表13中。
[0291] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体对IL-17A的结合亲和力
[0292] 表10
[0293]
[0294] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体对IL-17A/F的结合亲和力
[0295] 表11
[0296]
[0297] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体对IL-17F的结合亲和力
[0298] 表12
[0299]
[0300] 抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体对IL23/IL-12B的结合亲和力
[0301] 表13
[0302]
[0303] 通过表面等离子共振(Biacore)测定IL-17A/F及IL-23与抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的同时共结合
[0304] 通过表面等离子共振评估抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体同时共结合IL-23及IL-17A/F的能力。
[0305] 对于第一定向的共结合实验，使用胺偶合化学(EDC:NHS)将人源IL-17分子以共价固定于CM5传感器芯片的流动槽2-4上。在固定后，使用1M乙醇胺封闭流动槽上的剩余活性位点。将人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)分别固定于流动槽2、3或4上。这些分子的固定水平介于4500-5200RU之间。使用流动槽1作为参考表面。随后将双特异性抗体稀释至25μg/mL或50μg/mL，使其在表面上流动，且捕获于传感器芯片的流动槽2-4上。在捕获双特异性抗体后，将IL-23/IL-12B异二聚体(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)稀释至500nM且使其在表面上流动以显示共结合。以10μL/min的流速、
10分钟的缔合时间及5分钟的解离时间实施结合研究。
10分钟的缔合时间及5分钟的解离时间实施结合研究。
[0306] 对于第二定向的共结合实验，使用胺偶合化学(EDC:NHS)将小鼠抗人IL-12(p40/p70)单克隆抗体(BD Pharmingen,San Jose,CA)以共价方式固定于CM5传感器芯片的流动槽1-4上。在固定后，使用1M乙醇胺封闭流动槽上的剩余活性位点。将人IL-23/IL-12B异二聚体(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)稀释至500nM，并介由IL-12B亚单位捕获于流动槽1-4上。IL-23/IL-12B的捕获水平大约为4000RU。随后将双特异性抗体稀释至25μg/mL或50μg/mL，使其在表面上流动，且介由人源IL-23亚单位捕获于传感器芯片的流动槽2-4上。使用流动槽1作为参考表面。在捕获双特异性抗体后，将人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)稀释至500nM且使其在表面上流动以显示共结合。以10μL/min的流速、10分钟的缔合时间及5分钟的解离时间实施结合研究。
[0307] 所有结合实验在25℃下于10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH7.4)中实施。在各循环之间，使用20mM盐酸洗涤流动槽以再生表面。此洗涤步骤自芯片表面去除被捕获的测试抗体及任何结合抗原。使用 T100评估软件(2.0版)编集数据。通过扣除参考流动槽及空白注射来处理数据。评价基线稳定性，以确保在整个注射序列中再生步骤提供的结合表面是一致的。
[0308] 通过表面等离子共振(Biacore)结果显示的IL-17A/F及IL-23与抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的同时共结合
[0309] 所测试的双特异性抗体包括23/17bAb1(SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、
23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)及23/17taFab1(SEQ ID NO:76及 SEQ ID NO:78)。所有双特异性抗体皆能够同时共结合人IL-23及人IL-17A/F，这显示双特异性抗体的两个臂均具有功能性。
23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)及23/17taFab1(SEQ ID NO:76及 SEQ ID NO:78)。所有双特异性抗体皆能够同时共结合人IL-23及人IL-17A/F，这显示双特异性抗体的两个臂均具有功能性。
[0310] 通过表面等离子共振(Biacore)显示抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IL-17A/F特异性结合
[0311] 提供表面等离子共振评估抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体对人IL-17B、人IL-17C、人IL-17D 及人IL-17E(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的 子公 司，Seattle,WA,USA)的交叉反应性的缺乏。
[0312] 在 T100(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上实施结合研究。使用T100控制软件v 2.0对这些方法进行编程。使用胺偶合化学(EDC:NHS)将
山羊抗人IgG Fc-γ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)共价固定至CM4传感器芯片的流动槽1-3上。随后以大约150RU的密度将经纯化的双特异性抗体捕获于传感器芯片的流动槽2或流动槽3上。使用流动槽1作为参考表面。
山羊抗人IgG Fc-γ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)共价固定至CM4传感器芯片的流动槽1-3上。随后以大约150RU的密度将经纯化的双特异性抗体捕获于传感器芯片的流动槽2或流动槽3上。使用流动槽1作为参考表面。
[0313] 以500nM、100nM、20nM及4nM的浓度将人IL-17B、IL-17C、IL-17D及IL-17E(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)注射于所捕获抗体表面(流动槽2)及参考流动槽(流动槽1)上。作为此组实验的阳性对照，以100nM、20nM、4nM及0.8nM的浓度注射人IL-23(ZymoGenetics,Bristol-Myers Squibb的子公司，Seattle,WA,USA)。以50μL/min的流速、5分钟的缔合时间及5分钟的解离时间实施结合研究。所有结合实验在25℃下于10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白的缓冲液(pH 7.4)中实施。在各循环之间，使用20mM盐酸洗涤流动槽以再生表面。此洗涤步骤自芯片表面去除所捕获测试抗体及任何结合的抗原。使用 T100评估软件(2.0版)编集数据。通过扣除参考流动槽
及空白注射来处理数据。评价基线稳定性，以确保在整个注射序列中再生步骤提供的结合表面是一致的。
及空白注射来处理数据。评价基线稳定性，以确保在整个注射序列中再生步骤提供的结合表面是一致的。
[0314] 通过表面等离子共振(Biacore)结果显示的抗人IL-23/IL-17A/F双特异性抗体的IL-17A/F特异性结合
[0315] 未观察到人源IL-17B、IL-17C、IL-17D或IL17E与双特异性抗体的结合。 所测试的双特异性抗体包括23/17bAb1(SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:17)、23/17bAb2(SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:17)、23/17bAb3(SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:17)、23/17bAb4(SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:17)。与之相对，IL-23阳性对照显示与先前研究一致的剂量依赖性结合。
[0316] 实施例4
[0317] 抗人IL-23/17A/F bAb防止人IL-17A、IL-17F及IL-17AF介导的小鼠中鼠KC(CXCL1)的血清浓度的增加
[0318] IL-17A、IL-17F及IL-17AF能够诱导产生许多下游因子，这些下游因子继而在宿主防御中发挥一定作用，且亦有助于疾病病理学，尤其在以异常高浓度或在慢性病状下产生时。这些下游介导物之一是CXCL1(亦称为GRO-α(在人中)或KC(在小鼠中))，其是一种具有重要嗜中性粒细胞化学吸引剂活性且在炎症中发挥一定作用的趋化因子。评估抗人IL23/17A/F双特异性抗体(bAb)减少小鼠中IL-17A、IL-17F及IL-17AF介导的GRO-α增加的能力，从而展示bAb可在体内环境中有效抵抗IL-17诱导的活性，由此bAb可用于治疗IL-17A、IL-17F或IL-17AF在其中发挥一定作用的人类疾病。然而，由于这些bAb并不与小鼠IL-17A、IL-17F或IL-17AF发生交叉反应，故需要将人(h)IL-17A、IL-17F或IL-17AF递送至小鼠以诱导产生GRO-α(或在小鼠的情形下，诱导产生KC，其是GRO-α的鼠类似物)，然后可在抗人IL23/17A/F bAb存在下中和GRO-α。
[0319] 对于这些实验，使用雌性BALB/c小鼠(7-9周龄)。在18小时时，使小鼠接受腹膜腔内(i.p.)注射的媒剂(PBS)或一剂抗人IL-23/17A/F bAb中之一者(如表14及15中左手侧栏中所展示)。在时间0时，使其接受皮下(s.c.)注射的下列重组人源蛋白中之一者：0.175mg/kg hIL-17A、0.9mg/kg hIL-17F或0.5mg/kg hIL-17AF。使对照小鼠接受皮下注射的媒剂(PBS)代替hIL-17蛋白中之一者。两小时后，在异氟烷气体麻醉下对小鼠经由眼窝后窦抽血，离心血液后收集血清，且然后将血清储存于80℃下，直至使用市售ELISA根据制造商说明书(Quantikine小鼠CXCL1/KC免疫分析，R&D Systems公司，Minneapolis,MN)分析血清KC浓度为止。
[0320] 如表14及15中所展示，使用bAb处理的小鼠展示hIL-17A、hIL-17F或hIL-17AF介导的血清KC(CXCL1)浓度的抑制发生剂量依赖性增加，从而指示bAb可有效减少由这些IL-17配体介导的活性。CXCL1仅是应答于IL-17A、 IL-17F或IL-17AF的生物学读出(biological readout)的一个实例；在IL-17A、IL-17F或IL-17AF发挥一定作用的疾病中，有许多其他重要的下游读出亦发挥一定作用且可用作终点量度。
[0321] 表14.相对于媒剂处理的小鼠的浓度，腹膜腔内bAb对人IL-17A或IL-17F介导鼠KC血清浓度增加的抑制百分比(n＝3-4只/组)
[0322]
[0323] 表15.相对于媒剂处理的小鼠的浓度，腹膜腔内bAb对于人IL-17AF介导鼠KC血清浓度(pg/mL)增加的抑制百分比(n＝4只/组)
[0324]
[0325]
[0326] 实施例5
[0327] 抗人IL-23/17A/F bAb防止小鼠中人源IL-23介导的小鼠IL-17AF及IL-17F的血清浓度增加
[0328] IL-23能够诱导Th17细胞的分化，Th17细胞继而可使得IL-17A、IL-17F及IL-17AF产生。这些细胞因子与诸多疾病有关且可抑制IL-23及IL-17A、IL-17F及IL-17AF的治疗剂可有效治疗这些疾病。评估抗人IL23/17A/F双特异性抗体(bAb)减少小鼠中IL-17A、IL-17F及IL-17AF的IL-23介导的增加的能力，以图展示bAb可在体内环境中有效抵抗IL-23诱导的活性，以及由此bAb可用于治疗IL-23及Th17细胞在其中发挥一定作用的人类疾病。然而，由于这些bAb并不与小鼠IL-23发生交叉反应，故需要将人(h)IL-23递送至小鼠以诱导产生小鼠IL-17F及IL-17AF，然后可在抗人IL23/17A/F bAb存在下中和小鼠IL-17F及IL-17AF。小鼠血清中小鼠IL-17A的浓度过低以致无法精确测量，但预计这些趋势与针对血清IL-17F及IL-17AF所观察的趋势类似。
[0329] 对于这些实验而言，使用雌性C57BL/6小鼠(7-9周龄)。在第1天上午10:30，对小鼠经由腹膜腔内(i.p.)注射5微克小鼠(m)IL-2。在第2天上午8:30，对小鼠腹膜腔内注射的媒剂(PBS)或一剂抗人IL-23/17A/F bAb中之一者(如表16左手侧栏中所展示)。在第2天上午11点，小鼠各自接受5微克mIL-2及10微克hIL-23，且在第2天下午5:20，对小鼠经由腹膜腔内注射mIL-2及hIL-23各10微克。在第3天上午9:30，再对每一小鼠通过腹膜腔内注射5微克mIL-2及10微克hIL-23。在第3天下午4:30，在异氟烷气体麻醉下对小鼠经由眼窝后窦进行抽血，在离心血液后收集血清，将血清储存于-80℃下直至使用特异性测量小鼠IL-17F及IL-17AF的ELISA及luminex测定法来分析这些组分的血清浓度为止。
[0330] 如表16中所展示，使用bAb处理的小鼠展示小鼠IL-17F或IL-AF的hIL-23诱导血清浓度抑制发生剂量依赖性增加，从而指示bAb可有效减少通过hIL-23介导的活性。
[0331] 表16.相对于媒剂处理的小鼠的浓度，腹膜腔内bAb对于人源IL-23介导的小鼠IL-17F或IL-AF血清浓度增加的抑制百分比(n＝3只/组)
[0332]
[0333] 实施例6
[0334] VCVFc双特异性抗体
[0335] 哺乳动物VCVFc双特异性分子的构建及表达
[0336] 在GenScript(GenScript,Piscataway,NJ,USA) 合 成 完 整 基 因，经 限 制性 酶 克 隆 插 入 pTT5(HEK293-6E瞬 时 表 达 载 体，NCR Biotechnology Research Institute,Ottawa,ON,CAN)中。大部分构建体是使用mod2610(SEQ ID NO:30)信号序列表达的。VCVFc是双特异性抗体，其含有的全抗体，所述全抗体的Fab区与铰链之间具有经由接头(例如但不限于10mer G4S(对于任一链而言)或RTVAAPS(SEQ ID NO:85)(对于轻链而言)及SSASTKGPS(SEQ ID NO:86)(对于重链而言))插入的该双特异性抗体的第二臂的Fv单元。VCVFc双特异性抗体的图示见图5。
[0337] 使用聚乙烯亚胺试剂以上述表达构建体转染HEK293-6E悬浮细胞且在添加5mM L-谷氨酰胺及25μg/mL G418的F17培养基(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)中培养。24小时之后，添加1/40体积的20％胰蛋白胨NI(Organotechnie SAS,La Courneuve,FR)。
在转染后大约120小时时，收获条件化培养基并过0.2μm过滤器。使用Mab Select SuRe亲和层析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)与 200大小排阻层析
(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)的组合自经过滤的条件化培养基纯化蛋白质。借助UV-A280nm下的吸光度来估计水平，并通过分析型大小排阻高效液相层析、SDS PAGE及Western印迹法来评估质量。
在转染后大约120小时时，收获条件化培养基并过0.2μm过滤器。使用Mab Select SuRe亲和层析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)与 200大小排阻层析
(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)的组合自经过滤的条件化培养基纯化蛋白质。借助UV-A280nm下的吸光度来估计水平，并通过分析型大小排阻高效液相层析、SDS PAGE及Western印迹法来评估质量。
[0338] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体生物测定活性；NIH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因测定，用于测量由NF-κB诱导的人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性
[0339] 如上文实施例1中描述的那样实施该生物测定。
[0340] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体生物测定活性；Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子磷酸-STAT3测定，用于测量由磷酸-STAT3诱导的人IL-23活性
[0341] 如上文实施例3中所描述的那样实施该生物测定。
[0342] PDGF-C/PDGF-D VCVFc双特异性抗体生物测定活性；正常人肺成纤维细胞(NHLF)增殖测定，用于测量人PDGF-C及PDGF-D的促有丝分裂活性
[0343] 将原代正常人肺成纤维细胞系(NHLF,CC-2512,Lonza,Walkersville,MD)以1,000个细胞/孔接种于生长培养基(FGM-2BulletKit,Lonza,Walkersville,MD)中
且在37℃、5％CO2下温育过夜。次日，去除培养基且在测定培养基(FBM加0.1％BSA，Lonza,Walkersville,MD)中制备重组人源PDGF-C及PDGF-D(ZymoGenetics)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育48小时。另外，使用该测定法测量PDGF-C及PDGF-D活性的中和。将亚最大浓度的PDGF-C或PDGF-D与本文所描述的抗人PDGF-C/D或抗人PDGFRα/βVCVFc抗体的连续稀释液在测定培养基中混合，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育48小时。使用1μCi/孔的胸苷[甲
3
基-H](PerkinElmer,Waltham,MA)对细胞实施脉冲且在37℃、5％CO2下再培养24小时。
3
在温育后，通过测量所掺入的 H-胸苷的量来评价促有丝分裂活性。去除培养基且在37℃下对细胞实施胰蛋白酶处理10分钟，然后收获于FilterMate收获器(Packard Instrument公司，Meriden,CT)上且根据制造说明书在 微板闪烁计数器(Packard
3
Instrument公司， Meriden,CT)上进行读取。H-胸苷掺入的增加指示PDGF-C或PDGF-D
3
受体-配体相互作用。H-胸苷掺入的降低指示PDGF-C或PDGF-D受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一PDGF-C/PDGF-D或PDGFRα/PDGFRβVCVFc双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
且在37℃、5％CO2下温育过夜。次日，去除培养基且在测定培养基(FBM加0.1％BSA，Lonza,Walkersville,MD)中制备重组人源PDGF-C及PDGF-D(ZymoGenetics)的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育48小时。另外，使用该测定法测量PDGF-C及PDGF-D活性的中和。将亚最大浓度的PDGF-C或PDGF-D与本文所描述的抗人PDGF-C/D或抗人PDGFRα/βVCVFc抗体的连续稀释液在测定培养基中混合，添加至含有细胞的平板中，并在37℃、5％CO2下一起温育48小时。使用1μCi/孔的胸苷[甲
3
基-H](PerkinElmer,Waltham,MA)对细胞实施脉冲且在37℃、5％CO2下再培养24小时。
3
在温育后，通过测量所掺入的 H-胸苷的量来评价促有丝分裂活性。去除培养基且在37℃下对细胞实施胰蛋白酶处理10分钟，然后收获于FilterMate收获器(Packard Instrument公司，Meriden,CT)上且根据制造说明书在 微板闪烁计数器(Packard
3
Instrument公司， Meriden,CT)上进行读取。H-胸苷掺入的增加指示PDGF-C或PDGF-D
3
受体-配体相互作用。H-胸苷掺入的降低指示PDGF-C或PDGF-D受体-配体相互作用的中和。使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software公司，San Diego CA)计算每一PDGF-C/PDGF-D或PDGFRα/PDGFRβVCVFc双特异性抗体的IC50(50％抑制浓度)值。
[0344] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体生物测定活性；NIH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因测定及Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子磷酸-STAT3测定结果
[0345] 人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以剂量依赖性方式诱导NF-κB荧光素酶报告基因发生活化，且其EC50浓度经测定为0.15nM(对于IL-17A而言)、0.5nM(对于IL-17A/F而言)及0.5nM(对于IL-17F而言)，IL-23以剂量依赖性方式诱导STAT3磷酸化，其EC50浓度经测定为0.02nM。抗人IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体的IC50数据展示于下表17、18及19中。
[0346] IL-23/17A/F VCVFc双特异性抗体表
[0347] 表17
[0348]
[0349] 表18
[0350]
[0351] 表19
[0352]
[0353]
[0354] PDGF-C/PDGF-D及PDGFRα/PDGFβVCVFc双特异性抗体生物测定活性；正常人肺成纤维细胞(NHLF)增殖测定结果
[0355] PDGF-C及PDGF-D诱导NHLF细胞以剂量依赖性方式发生增殖，亚最大浓度经测定为0.1nM(对于PDGF-C而言)及6nM(对于PDGF-D而言)。表20及表21呈现本文所描述的PDGF-C/PDGF-D或PDGFRα/PDGFRβVCVFc双特异性抗体的IC50数据。
[0356] PDGF-C/PDGF-D VCVFc双特异性抗体表
[0357] 表20
[0358]
[0359]
[0360] PDGFRα/PDGFRβVCVFc双特异性抗体表
[0361] 表21
[0362]
[0363] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体生物测定活性；原代人成纤维细胞测定，用于测量IL-6诱导的人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性
[0364] 如上文实施例3中所描述来实施该生物测定。
[0365] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体生物测定活性；原代人成纤维细胞测定结果[0366] 人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以剂量依赖性方式诱导人IL-6产生，且EC50浓度经测定为0.08nM(对于IL-17A而言)、25nM(对于IL-17A/F而言)及25nM(对于IL-17F而言)。抗人IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体23/17VCV2(SEQ ID NO:91及SEQ ID NO:93)。表22呈现本文所描述IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体的示例性IC50数据。
[0367] 表22
[0368]
[0369] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体共结合活性；原代人成纤维细胞测定，用以测量在结合人IL-23的同时对人IL-17A、IL-7A/F或IL-F的抑制。原代人T细胞磷酸-STAT3测定，用以测量在结合人IL-17A、IL-7A/F或IL-17F的同时对人IL-23的抑制。
[0370] 原代人成纤维细胞测定在30nM的过量IL-23存在下运行。原代人T细胞磷酸-STAT3测定在30nM的过量IL-17A、IL-17A/F及IL-17F存在下运行。
[0371] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体生物测定共结合结果
[0372] 双特异性抗体23/17VCV2(SEQ ID NO:91及SEQ ID NO:93)在人IL-23存在下检验时，并不干扰对人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F的抑制。双特异性抗体23/17VCV2在人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F存在下检验时，并不干扰对人IL-23的抑制。
[0373] 通过表面等离子共振(Biacore)测量IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体对人IL-17A、IL-17A/F、IL-17F及人IL-23的结合亲和力
[0374] 如上文实施例3中所描述来测定结合活性。
[0375] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体Biacore活性
[0376] 与人IL-17A、IL-17A/F及IL-17F的结合实验的结果分别展示于表23、24及25中。与人IL-23/IL-12B异二聚体的结合实验的结果展示于表26中。
[0377] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体对IL-17A的结合亲和力
[0378] 表23
[0379]
[0380] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体对IL-17A/F的结合亲和力
[0381] 表24
[0382]
[0383]
[0384] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体对IL-17F的结合亲和力
[0385] 表25
[0386]
[0387]
[0388] IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体对IL23/IL-12B的结合亲和力
[0389] 表26
[0390]
[0391] 通过表面等离子共振(Biacore)测定的IL-17A/F及IL-23与IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体的同时共结合
[0392] 如上文实施例3中所描述来实施此分析。
[0393] 通过表面等离子共振(Biacore)测定的IL-17A/F及IL-23与IL-23/IL-17A/F VCVFc双特异性抗体的同时共结合结果
[0394] 双特异性抗体23/17VCV2(SEQ ID NO:91及SEQ ID NO:93)能够同时共结合人IL-23及人IL-17A/F，从而显示双特异性抗体的两个臂皆具有功能性。
[0395] 实施例7
[0396] IL-23p19表位定位
[0397] 此实施例7中所描述的分析旨在鉴别IL-23p19上IL-23p19抗体(7B7抗体或Mab、7B7Fab及biAb3，其皆具有如SEQ ID NO:7中所展示的重链可变域及如SEQ ID NO:9中所展示的轻链可变域)所结合的表位残基。Fab 7B7、7B7抗体及biAb3均被用于结合研究中的各个阶段，这是因为就IL-23p19上的表位而言，它们是可互换的。
[0398] 有关表位的蛋白质水解消化及肽数据
[0399] IL-23p19抗体的质谱表位序列分析系基于表位提取及表位切除方法。(Parker等 人，“MALDI/MS-based epitope mapping of antigens bound to immobilized antibodies”,Mol.Biotechnol.,20(1):49-62(2002年1月))。在两种情形下，都以2mg mAb/1ml床体积的平均密度将IL-23p19抗体通过抗体的一级胺直接固定于表面活化的珠子上。在使用或不使用还原及烷基化的条件下生成来自IL-23his标签抗原的肽。通过在37℃下于PBS及4M盐酸胍中与50mM二硫苏糖醇一起温育1小时来还原抗原IL-23。随后使用100mM碘乙酰胺在室温下经30分钟实施烷基化。将经还原及烷基化的IL-23对PBS透析过夜，然后实施片段化。对于表位提取，通过使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、lys-C、arg-C、asp-N及或glu-C等内切蛋白酶以最高2％的酶对抗原比率(w/w)进行蛋白水解消化法来生成抗原肽。在37℃下实施温育，且温育时间介于2小时至过夜之间。将所得的肽与抗体树脂在室温下混合30分钟。然后将此树脂洗涤三次以去除任何非特异性结合的肽。消化、温育及洗涤步骤均在PBS(pH 7)中实施。表位切除遵循相同的方案，只是在酶消化之前将完整抗原与抗体在室温下一起温育30分钟。在两种方法中，洗脱结合于抗体的肽并在ESI-MS上分析。
[0400] 这些数据指示，IL-23p19抗体具有一个不连续表位，其包括IL-23p19中的三个肽区。生成合成肽以进一步检验该三个肽区，且通过ELISA及质谱来测试并分析其结合。基于这些观察，其表明下列肽代表IL-23p19抗体表位的序列：
[0401] 肽1：WQRLLLRFKILR(SEQ ID NO:6的残基156-167)
[0402] 肽2：SAHPLVGHMDLR(SEQ ID NO:6的残基46-57)
[0403] 肽3：IHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLP(SEQ ID NO:6的残基93-117)。
[0404] 通过HDX-MS实施IL-23表位定位
[0405] 氢/氘交换质谱(HDX-MS)方法通过监测主链酰胺氢原子的氘交换速率及程度来探测溶液中的蛋白质构象及构象动力学。HDX水平取决于主链酰胺氢原子的溶剂可及性及蛋白质构象。可通过MS精确测量蛋白质在HDX时的质量增加。在将此技术与酶消化配合时，可解析肽水平上的结构特征，从而有可能区分表面暴露的肽与折叠于内部的肽。通常，实施氘标记及随后的淬灭实验，随后实施在线胃蛋白酶消化、肽分离及MS分析。在通过HDX-MS对IL-23中的BMS-986113进行表位定位之前，实施非氘化实验以生成一系列关于IL-23(4.4mg/mL)及IL-23/BMS-986113(1:1摩尔比率，4.4mg/mL及3.36mg/mL)的常用胃酶解肽，从而达成对于IL-23的97％的序列覆盖率。在此实验中，在标记步骤过程中使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，随后添加淬灭缓冲液(含有1.5M GdnCl及0.5M TCEP的200mM磷酸盐缓冲液，pH 2.5，1:1v/v)。对于表位定位实验而言，将5μL的每一试样(IL-23或IL-23/BMS-986113(1:1摩尔比率))与65μL HDX标记缓冲液(溶于D2O中的10mM磷酸盐缓冲液，pD 7.0)混合以在室温下(约25℃)开始标记反应。反应实施不同时间：20sec、1min、10min、60min及240min。在每一标记反应时段结束时，通过添加淬灭缓冲液(1:1,v/v)来淬灭反应，且将淬灭试样注射至Waters HDX-MS系统中进行分析。在不存在/存在BMS-986113下，监测所观察的共同胃酶解肽的氘摄取量。通过HDX-MS对IL-23中的抗IL-237B7Fab(4.91mg/mL)的表位定位遵循相同方案。
[0406] 抗IL-237B7Fab与IL-23的复合物及biAb3与IL-23的复合物中的表位定位指示，biAb3具有包括IL-23p19中的5个肽区的不连续表位。基于相对氘摄取量，5个肽区可分级如下：1区>2区>3区>4区>5区，其中1区的氘摄取变化最显著，5区的氘摄取变化最不显著。通过HDX-MS针对IL-23p19抗体测定的IL-23p19上的5个肽区确定如下：
[0407] 1区：PDSPVGQL(SEQ ID NO:6的残基117-124)；
[0408] 2区：IFTGEPSLL(SEQ ID NO:6的残基108-116)；
[0409] 3区：KILRSLQAF(SEQ ID NO:6的残基164-172)；
[0410] 4区：QQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMD(SEQ ID NO:6的残基34-55)； 及
[0411] 5区：CLQRIHQGLIFYEKLLG(SEQ ID NO:6的残基89-105)。
[0412] 丙氨酸切削突变体的计算机表位预测及设计
[0413] 丙氨酸切削诱变(alanine shave mutagenesis)是一种用于使同一构建体中的多个残基突变成丙氨酸，以去除结合表位中的氨基酸侧链的策略(Wells,J.A.,“Systemic mutational analyses of protein-protein interfaces”,Enzym.,202:390-411(1991))。将多个关于潜在表位中的残基与7B7Fab及biAb3的关联的信息的来源相结合，产生了区域性丙氨酸切削突变体的目标列表。将HDX(参见此实施例7的上文)及蛋白水解消化法肽定位(参见此实施例7的上文)之间的重叠区中所含的残基定位于IL-23p19结构域的序列上，将三个线性的共同残基区域定为A区、B区及C区。A区对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基33-59。B区对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基89-125。C区对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基144-173。为计算侧链暴露(溶剂可及表面积，SASA)、因此会位于IL-23的p19结构域的蛋白质表面上的残基，使用了一种内部定义的IL-23异二聚体结构。对于IL-23的p19结构域中的每一残基而言，计算可及表面(accessible surface)与该类型氨基酸的标准暴露表面(standard exposed surface for the amino acid type)的比率，且将残基分组成箱(bin)。将诸残基置于如下所述的可及性箱中：<30％、30-40％、40-50％、
50-60％、60-70％、70-80％、>90％暴露。每一氨基酸类型的标准残基可及性是在延长的三肽Gly-X-Gly中计算的。所实施的第二种计算为ODA(最佳对接区域)，其可用于预测可能的蛋白质-蛋白质相互作用表面。该方法鉴定具有最低的对接去溶剂化能量的最佳表面块区(patch)。计算IL-23的p19结构域的ODA，并使用这些结果对用于诱变的残基划分优先顺序。
50-60％、60-70％、70-80％、>90％暴露。每一氨基酸类型的标准残基可及性是在延长的三肽Gly-X-Gly中计算的。所实施的第二种计算为ODA(最佳对接区域)，其可用于预测可能的蛋白质-蛋白质相互作用表面。该方法鉴定具有最低的对接去溶剂化能量的最佳表面块区(patch)。计算IL-23的p19结构域的ODA，并使用这些结果对用于诱变的残基划分优先顺序。
[0414] 基于ODA及SASA计算中的高评分来对该三个区(A、B、C)中的残基划分优先顺序，还基于与非复合IL-23相比的氢-氘交换程度来对这些残基赋予权重(1号肽>2号肽>3号肽>4号肽>5号肽)。将与小鼠不一致的区域克隆为小鼠互换突变体而非丙氨酸切削突变体，小鼠互换突变体在小规模测试中对于结合显示无影响。然后基于将残基定位至IL-23的X射线结晶学结构来将残基组合成非线性表位(M5、M6、M8)，例外是M7，其含有呈延长环的线性残基序列。生成的其他备用突变体(M9、M10、M11)具有主要为线性的残基的亚表位。通过此方法设计的丙氨酸切削突变体展示于下表27中。
[0415] 表27：IL-23p19的丙氨酸切削突变体
[0416]名称 突变区 突变至丙氨酸的IL-23p19(SEQ ID NO:6)残基
M5 A及B H53A、M54A、E112A、L116A及D118A
M6 A及C T42A、W45A、H48A、F163A及Q170A
M7 C W142A、E143A、T144A、Q145A及Q146A
M8 A、B及C H53A、E112A、Q154A及W156A
M9 B L116A、D118A及Q123A
M10 A H53A、M54A、D55A及F163A
M11 C W142A、T144A及Q146A
M5 A及B H53A、M54A、E112A、L116A及D118A
M6 A及C T42A、W45A、H48A、F163A及Q170A
M7 C W142A、E143A、T144A、Q145A及Q146A
M8 A、B及C H53A、E112A、Q154A及W156A
M9 B L116A、D118A及Q123A
M10 A H53A、M54A、D55A及F163A
M11 C W142A、T144A及Q146A
[0417] IL-23表位定位丙氨酸突变体的克隆、表达及纯化
[0418] 通过PCR生成不带标签的野生型IL-23 p40亚单位入门载体构建体，并通过测序证实PCR片段的保真度。通过Gateway LR重组生成瞬时表达构建体且证实序列。通过PCR生成带His标签的野生型IL-23 p19亚单位构建体及所有突变体构建体，并直接克隆至瞬时表达载体中。通过测序证实所有PCR片段的保真度。为生成野生型对照，以4 L规模将不带标签的野生型IL-23 P40亚单位与带His标签的野生型P19亚单位于HEK293-6E细胞中瞬时性共表达，用于纯化IL-23复合物。简言之，使用0.5(p19)/0.5(p40)/1.5(PEI)比6
率的表达质粒/PEI复合物转染1×10个细胞/ml的HEK293-6E细胞。24小时后添加胰蛋白胨N1进料且在转染后120小时时收获细胞。使用0.2μM过滤器过滤条件化培养基。遵循与上述相同的转染方案，将7种带His标签的IL-23 p19突变体构建体与不带标签的野生型IL-23 p40亚单位以30 ml的规模共转染。将条件化培养基转移用于分析，且通过抗His Western印迹法证实所有突变体的表达。基于初步结合结果，选择突变体M5、M7、M9及M10且使用相同转染方案以2 L规模放大。野生型亦放大到2L。收获在2升HEK细胞中放大的野生型及IL-23突变体，浓缩上清液并通过使用10 kDa膜的切向流过滤将缓冲液交换为PBS。然后通过固定镍亲和层析纯化蛋白质。使用40mM咪唑洗脱野生型且然后通过脱盐凝胶过滤层析将缓冲液交换为PBS(5.6mMNa2HPO4、1.1mM KH2PO4、154mM NaCl，pH 7.4)。通过SDS-PAG测得野生型的纯度为>95％。使用40mM咪唑洗涤突变体，随后使用500 mM咪唑洗脱。然后通过透析将洗脱池缓冲液交换为PBS(7mM Na2HPO4、3mM NaH2PO4、 130mM NaCl，pH 7.1)。通过SDS-PAG测得突变体的纯度为>95％。通过基因合成带His标签的IL-23p19的关键残基(通过丙氨酸切削诱变鉴别)的单丙氨酸突变体，然后克隆至瞬时转染载体中。
表达及纯化与丙氨酸切削突变体相似，但M35A除外，其是亲和纯化的。
率的表达质粒/PEI复合物转染1×10个细胞/ml的HEK293-6E细胞。24小时后添加胰蛋白胨N1进料且在转染后120小时时收获细胞。使用0.2μM过滤器过滤条件化培养基。遵循与上述相同的转染方案，将7种带His标签的IL-23 p19突变体构建体与不带标签的野生型IL-23 p40亚单位以30 ml的规模共转染。将条件化培养基转移用于分析，且通过抗His Western印迹法证实所有突变体的表达。基于初步结合结果，选择突变体M5、M7、M9及M10且使用相同转染方案以2 L规模放大。野生型亦放大到2L。收获在2升HEK细胞中放大的野生型及IL-23突变体，浓缩上清液并通过使用10 kDa膜的切向流过滤将缓冲液交换为PBS。然后通过固定镍亲和层析纯化蛋白质。使用40mM咪唑洗脱野生型且然后通过脱盐凝胶过滤层析将缓冲液交换为PBS(5.6mMNa2HPO4、1.1mM KH2PO4、154mM NaCl，pH 7.4)。通过SDS-PAG测得野生型的纯度为>95％。使用40mM咪唑洗涤突变体，随后使用500 mM咪唑洗脱。然后通过透析将洗脱池缓冲液交换为PBS(7mM Na2HPO4、3mM NaH2PO4、 130mM NaCl，pH 7.1)。通过SDS-PAG测得突变体的纯度为>95％。通过基因合成带His标签的IL-23p19的关键残基(通过丙氨酸切削诱变鉴别)的单丙氨酸突变体，然后克隆至瞬时转染载体中。
表达及纯化与丙氨酸切削突变体相似，但M35A除外，其是亲和纯化的。
[0419] IL-23突变体与IL-23p19抗体的Biacore结合分析
[0420] 通过表面等离子共振(SPR,Biacore)在 T100上于PBST(7mMNa2HPO4、3mM NaH2PO4、130mM NaCl、0.05％Tween 20，pH 7.4)于25℃下测量所有七(7)种丙氨酸突变体(参见表27)的30mL小规模表达的结合。通过固定于CM5传感器芯片上2000RU的蛋白质A以约60RU的水平捕获相关抗体及受体。除biAb3外，使用Merck的IL-23p19mAb(7G10)及 (IL-12/IL-23p40mAb)作为用于结构域结合的对
照。此外，使用IL-23的市售受体作为对照：hIL-23R-Fc及hIL-12Rβ1-Fc(皆来自R&D Systems)。将上清液以1:5稀释至PBST中且经3分钟以30μL/min注射至mAb或受体表面，且在一段解离时间之后，使用10mM甘氨酸(pH 2.0)再生。在分析之前自所有特异性结合曲线扣除无任何捕获抗体的蛋白质A的参考表面的结合。图9中所展示的结果展示在注射结束前10秒时的应答。
照。此外，使用IL-23的市售受体作为对照：hIL-23R-Fc及hIL-12Rβ1-Fc(皆来自R&D Systems)。将上清液以1:5稀释至PBST中且经3分钟以30μL/min注射至mAb或受体表面，且在一段解离时间之后，使用10mM甘氨酸(pH 2.0)再生。在分析之前自所有特异性结合曲线扣除无任何捕获抗体的蛋白质A的参考表面的结合。图9中所展示的结果展示在注射结束前10秒时的应答。
[0421] Biacore结果显示，诸IL-23丙氨酸切削突变体维持与p40特异性抗体及p19特异性IL-23受体的结合(M8除外，其可能描述受体结合位点)。亦实施另一IL-23p19mAb与IL-12Rβ1-Fc的结合，且与图9的结果一致。M5突变体展示了7B7Mab结合的明显损失，而M9及M10展示了7B7Mab结合的部分损失(参见图10)。M7未展示任何对于抗体或对照的结合的影响。因此，选择该4种突变体用于放大及纯化：丧失了与23p19抗体(7B7抗体或Mab、7B7Fab及biAb3，其皆具有如SEQ ID NO:7中所展示的重链可变域及如SEQ ID NO:9中所展示的轻链可变域)的结合的三种突变体，和作为对照的M7。
[0422] 经纯化的突变体的Biacore分析所用的测定形式与上清液相同，只是将野生型及突变体IL-23稀释至25nM且以1:2连续滴定至1.5nM。使用经纯化的IL-23突变体获得的所有结果证实了使用表达上清液获得的数据。将数据拟合至1:1Langmuir结合模型以确定图10及表28中所展示的Kd值。对于M5与IL-23p19抗体(7B7抗体或Mab、7B7Fab及biAb3，均具有如SEQ ID NO:7中所展示的重链可变域及如SEQ ID NO:9中所展示的轻链可变域)的结合，观察到1-2RU的扣除参考的结合，用BIAsimulation软件2.1和自M9及M10 的动力学分析测得的平均Rmax对其加以模拟。经估计亲和力为≥330μM，其中Kd为野生型的1/1500，如表28中所展示。
[0423] 表28.IL-23丙氨酸突变体与IL-23p19抗体的结合的Biacore动力学分析
[0424]
[0425] 实施单一丙氨酸突变体的Biacore分析以证实通过M5、M9及M10丙氨酸切削突变体显示的非线性表位。三个线性区A、B及C中的大部分单一丙氨酸突变体展示对7B7mAb或biAb3的结合无变化。14种所测试的IL-23单一丙氨酸突变体中仅三种展示结合亲和力的大于1千卡/摩尔的显著降低。表29展示了丙氨酸切削突变体M5、M9及M10之间重叠的主要残基的亲和力及ΔΔG值，且显示线性区B中的一个主要残基及线性区A中的两个残基对IL-23p19抗体-IL-23复合物的结合能量起主要贡献。
[0426] 表29.IL-23单一丙氨酸突变体与IL-23p19抗体的结合的Biacore动力学分析[0427]
[0428]
[0429] BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子中的IL-23诱导的STAT3磷酸化
[0430] 使用人IL-23Rα及人IL-12Rβ1全长受体稳定转染鼠骨髓源细胞系(BaF3)并进行克隆。通过ELISA监测关于IL-23丙氨酸切削突变体的IL-23诱导STAT3磷酸化。使用测定培养基将BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1(克隆6)细胞洗涤三次，然后以50,000个细胞/孔铺于96孔圆底组织培养板中。BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1细胞以剂量依赖性方式应答IL-23而发生STAT3磷酸化。为评价IL-23信号传导的抗体抑制，将EC50浓度的20pM IL-23与每一种抗体的三倍连续稀释液(自33nM至0.56pM)预混合，且在37℃下于测定培养基中温育15分钟，然后添加至细胞中。在预温育后，一式两份将治疗剂添加至含有细胞的平板中且在37℃下温育15分钟以刺激STAT3的磷酸化。通过添加冰冷的洗涤缓冲液来终止刺激且根据制造商说明书(Bio-Rad Laboratories细胞裂解试剂盒，目录(Tyr705)编号：171-304012)裂解细胞。通过ELISA(Bio-Rad Laboratories磷酸-STAT3 试剂盒，目录编号：171-V22552)根据制造商说明书测定磷酸化STAT3水平。分析数据且使用GraphPad Prism 4软 件计算IC50值。所有IL-23丙氨酸切削突变体及所有IL-23丙氨酸单一突变体均有活性，且与IL-23(不带标签的和带标签的)在诱导BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子中的pSTAT3活性方面效力相等(表30)。biAb3、
(IL-12/IL-23p40mAb)及Merck的IL-23p19抗体(7G10)抑制IL-23丙氨酸切削突变体诱导的pSTAT3的结果展示于表31中。biAb3以相等的效力中和wt IL-23和IL-23M7丙氨酸切削突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，中和M9及M10对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性的效力更小，且并不中和M5对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性。 IL-12p40mAb以同等效力中
和中wt IL-23及所有IL-23丙氨酸切削突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性。中，阳性对照Merck IL-23p19mAb(7G10)以同等效力中和wt IL-23、M7、M9及M10丙氨酸切削突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，且并不中和M5对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性。
(IL-12/IL-23p40mAb)及Merck的IL-23p19抗体(7G10)抑制IL-23丙氨酸切削突变体诱导的pSTAT3的结果展示于表31中。biAb3以相等的效力中和wt IL-23和IL-23M7丙氨酸切削突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，中和M9及M10对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性的效力更小，且并不中和M5对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性。 IL-12p40mAb以同等效力中
和中wt IL-23及所有IL-23丙氨酸切削突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性。中，阳性对照Merck IL-23p19mAb(7G10)以同等效力中和wt IL-23、M7、M9及M10丙氨酸切削突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，且并不中和M5对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性。
[0431] 表30.IL-23丙氨酸切削突变体的EC50值；和BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子中biAb3、 (IL-12/IL-23p40mAb)及Merck的IL-23p19抗体(7G10)抑制IL-23丙氨酸切削突变体诱导pSTAT3的IC50值
[0432]
[0433] 构建单一IL-23p19突变(H53A、M54A及D55A)，且测定7B7、(IL-12/IL-23p40mAb)及Merck的IL-23p19抗体(7G10)(表31)抑制单一IL-23p19突
变多肽诱导BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子中的pSTAT3的IC50值。与wt IL-23相比，7B7mAb以同等效力中和IL-23丙氨酸单一突变体H53A、E112A及D118A对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，以显著减少的效力中和M54A及D55A突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，且并不中和L116A突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性(表31)。与wt IL-23相比，
IL-12p40mAb以同等效力中和所有IL-23丙氨酸单一突变体对 BaF3/huIL-23Rα/
huIL-12Rβ1转染子的生物活性。与wt IL-23相比，Merck IL-23p19mAb以同等效力中和所有IL-23丙氨酸单一突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，除了其并不中和IL-23E112A突变体之外。
变多肽诱导BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子中的pSTAT3的IC50值。与wt IL-23相比，7B7mAb以同等效力中和IL-23丙氨酸单一突变体H53A、E112A及D118A对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，以显著减少的效力中和M54A及D55A突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，且并不中和L116A突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性(表31)。与wt IL-23相比，
IL-12p40mAb以同等效力中和所有IL-23丙氨酸单一突变体对 BaF3/huIL-23Rα/
huIL-12Rβ1转染子的生物活性。与wt IL-23相比，Merck IL-23p19mAb以同等效力中和所有IL-23丙氨酸单一突变体对BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子的生物活性，除了其并不中和IL-23E112A突变体之外。
[0434] 表31：7B7、 (IL-12/IL-23p40mAb) 及Merck 的 IL-23p19 抗 体(7G10)抑制IL-23p19单一突变(H53A、M54A及D55A)诱导BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1转染子中的pSTAT3的IC50值
[0435]
[0436] 综合考虑所有这些结果，IL-23的7B7mAb抑制需要氨基酸残基M54、D55及L116，但无需氨基酸残基H53、E112或D118。 与Merck抗体能够抑制IL-23丙氨酸单一突变体M54A、D55A及L116A且并无活性损失，表明IL-23M54、D55及L116丙氨酸突变体所见的活性损失是7B7mAb及biAb3特异性的。
[0437] IL-23突变体及7B7Fab复合物的寡聚态分析
[0438] 为证实异二聚体IL-23突变体的寡聚态及其与复合7B7Fab的能力，通过分析型大小排阻层析(SEC-MALS)分离来研究这些蛋白质，该分离使用安装有二极管阵列吸光度检测器的 1100系列HPLC，Shodex Protein KW-803柱，缓冲液为含有200mMK2PO4(pH 6.8，含有HCl)、150mM NaCl及0.02％叠氮化钠的缓冲液(0.1um过滤)，流速TM
0.5mL/min。HPLC下游垂直置入Wyatt Technology MINIDAWN 激光散射仪，其
TM
后置入Wyatt T-REX 差式折射仪。在过滤之后，以10.3μM的浓度注射六十
(60)μg每一IL-23试样。为形成复合物，将60μg 7B7Fab(6％摩尔过量)与IL-23蛋白(浓度为10.9μM)预混合且在室温下一起温育3-6小时，然后实施层析分离。在注射之前使用旋转过滤器( MF，0.2μm，Pall公司)去除蛋 白质试样中的微粒。使用
6(Wyatt)及Chemstation(Agilent)分析数据。与野生型类似，所有突变体均大
致为单体。M5突变体在与Fab预温育之后并不展示显著复合物形成，且洗脱位置与单独的M5IL-23洗脱的位置接近，这表明在此实验的10μM浓度范围中形成的复合物很少(即使有的话)。M7发生复合且洗脱情况类似于野生型。M9及M10突变体在这些浓度下形成复合物，但质量略小于野生型且滞留时间略迟于野生型及M7，表明其对7B7的亲和力弱于野生型及M7。14种单一丙氨酸突变体的SEC-MALS分析展示，所有突变体均大致为单体，类似于野生型，且仅L116A突变体展示洗脱时间延迟且预期的复合物质量略微减少，这表明IL-23对7B7Fab的亲和力有所减少。这些结果与这些L116A的Kd的Biacore变化一致。在此测定的条件下，无法解析出D54A与M55A的复合物同Fab的减小的亲和力效应。
0.5mL/min。HPLC下游垂直置入Wyatt Technology MINIDAWN 激光散射仪，其
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后置入Wyatt T-REX 差式折射仪。在过滤之后，以10.3μM的浓度注射六十
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6(Wyatt)及Chemstation(Agilent)分析数据。与野生型类似，所有突变体均大
致为单体。M5突变体在与Fab预温育之后并不展示显著复合物形成，且洗脱位置与单独的M5IL-23洗脱的位置接近，这表明在此实验的10μM浓度范围中形成的复合物很少(即使有的话)。M7发生复合且洗脱情况类似于野生型。M9及M10突变体在这些浓度下形成复合物，但质量略小于野生型且滞留时间略迟于野生型及M7，表明其对7B7的亲和力弱于野生型及M7。14种单一丙氨酸突变体的SEC-MALS分析展示，所有突变体均大致为单体，类似于野生型，且仅L116A突变体展示洗脱时间延迟且预期的复合物质量略微减少，这表明IL-23对7B7Fab的亲和力有所减少。这些结果与这些L116A的Kd的Biacore变化一致。在此测定的条件下，无法解析出D54A与M55A的复合物同Fab的减小的亲和力效应。
[0439] IL-23突变体的差示扫描量热
[0440] 通过差示扫描量热(DSC)测量野生型及突变体IL-23异二聚体的热稳定性特征，差示扫描量热使用 VP-毛细管DSC仪。对溶于PBS(7mMNa2HPO4、3mMNaH2PO4、130mM NaCl，pH 7.1)中的0.7mg/ml蛋白质试样以90o/hr自10-100℃扫描，对所得的温度记录图实施缓冲液空白扣除及拟合程序。每一分子的变性以两个去折叠转变为特征，且每一转变的拟合转变中点(Tm)值与野生型相差1-4℃。结果展示，相对于野生型，丙氨酸切削突变体以及14种单一丙氨酸突变体均未显示显著的热去稳定(thermal destabilization)。
[0441] IL-23突 变体 的 傅立 叶 变 换红 外 光谱 (Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FT-IR)分析
[0442] 使用FT-IR光谱法比较IL-23的丙氨酸切削突变体及野生型的二级结构，光谱法在配备路径长度约7μm的CaF2窗口及632.8nm的Ne-He激光器的Biotools Prota FT-IR-1仪器上进行。以2cm 的分辨率收集数据，使用Prota/Bomem-GRAMS/31AI软件分析。一式二份测量每一试样，且方法变异(method variability)为约3％。使用酰胺I峰计算二级结构水平，因其是结构敏感的。如1637cm-1处的峰(对于α-螺旋而言)及1637cm-1处的峰以及1687cm-1处的凸肩(对于β-片而言)所示，在所有IL-23试样中观察到大致等量的α-螺旋及β-片层。总而言之，丙氨酸切削突变体观察到的FT-IR光谱及所计算出的二级结构结果相比于野生型IL-23并无显著差异。
[0443] IL-23突变体的圆二色性(CD)分析
[0444] 使用CD光谱比较IL-23的丙氨酸切削突变体及野生型的二级结构，CD光谱使用Jasco J-815分光亮度计。在溶于PBS(pH7.1)中的0.25mg/mL IL-23蛋白质浓度下收集光谱，使用1mm路径长度槽、25℃、300-190nm，数据间隔0.1nm、扫描速度50nm/min、带宽1nm、累积2次。总而言之，在使用圆二色性光谱时，观察到丙氨酸切削突变体中的二级结构特征与野生型IL-23相比并无显著差异。
[0445] IL-23突变体的核磁共振(NMR)光谱分析
[0446] 质子NMR是一种高敏感技术，使得人们能够在原子细节上评价构象状态。获取41
种突变体(M5、M7、M9、M10)及野生型IL23蛋白中的每一者的1D H NMR光谱。同时将所有蛋白质针对NMR缓冲液(存于8％D2O/92％H2O中的PBS)透析以消除源自试样制备的潜在
1
差异。此外，通过相对于野生型光谱归一化来校正蛋白质浓度差异对 H信号强度的影响。
所有NMR数据在32℃下于在600MHz下操作的Bruker Avance 3光谱仪上收集。使用针对溶剂及赋形剂抑制优化(使用Watergate、WET及Watergate翻转选择性激发脉冲方案)的标准bruker脉冲序列(ZG)获取1D NMR光谱。对每一光谱的两千零四十八(2048)个扫描实施信号平均化。在傅里叶变换之前应用余弦平方变迹，且使用一阶多项式基线校正来消除基线的出现。对于每一光谱检查各个蛋白质，结果显示突变体蛋白皆适当折叠，其证据是光谱的高场(<0.5ppm)及低场(>6.5ppM)区中的充分分散的共振。高场甲基共振指示完整疏水性核心的存在；低场酰胺质子反映了形成良好的二级结构(α螺旋及β片层)的存在。比较该光谱与野生型IL23光谱显示非常接近的匹配，排除了氨基酸取代在蛋白质结构中诱导的较大的构象变化的存在。此外，NMR结果亦指示，M5的额外活性损失不大可能由于M5中的突变位点处的结构完整性的额外的大破坏。M5比M9接近野生型蛋白得多(通过主成分分析获知)，这表明，M9中缺少的下列M5中的突变：H53A、M54A及E112A，并不导致M5结构发生较大破坏。亦观察到M7及M9，它们是消除芳族残基的突变体，似乎在主成分分析中彼此最为类似。除D118A及M54A外，所有单一突变体似乎皆类似于野生型，然而其他对照显示这些突变体维持类似于野生型的稳定性及活性。
种突变体(M5、M7、M9、M10)及野生型IL23蛋白中的每一者的1D H NMR光谱。同时将所有蛋白质针对NMR缓冲液(存于8％D2O/92％H2O中的PBS)透析以消除源自试样制备的潜在
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差异。此外，通过相对于野生型光谱归一化来校正蛋白质浓度差异对 H信号强度的影响。
所有NMR数据在32℃下于在600MHz下操作的Bruker Avance 3光谱仪上收集。使用针对溶剂及赋形剂抑制优化(使用Watergate、WET及Watergate翻转选择性激发脉冲方案)的标准bruker脉冲序列(ZG)获取1D NMR光谱。对每一光谱的两千零四十八(2048)个扫描实施信号平均化。在傅里叶变换之前应用余弦平方变迹，且使用一阶多项式基线校正来消除基线的出现。对于每一光谱检查各个蛋白质，结果显示突变体蛋白皆适当折叠，其证据是光谱的高场(<0.5ppm)及低场(>6.5ppM)区中的充分分散的共振。高场甲基共振指示完整疏水性核心的存在；低场酰胺质子反映了形成良好的二级结构(α螺旋及β片层)的存在。比较该光谱与野生型IL23光谱显示非常接近的匹配，排除了氨基酸取代在蛋白质结构中诱导的较大的构象变化的存在。此外，NMR结果亦指示，M5的额外活性损失不大可能由于M5中的突变位点处的结构完整性的额外的大破坏。M5比M9接近野生型蛋白得多(通过主成分分析获知)，这表明，M9中缺少的下列M5中的突变：H53A、M54A及E112A，并不导致M5结构发生较大破坏。亦观察到M7及M9，它们是消除芳族残基的突变体，似乎在主成分分析中彼此最为类似。除D118A及M54A外，所有单一突变体似乎皆类似于野生型，然而其他对照显示这些突变体维持类似于野生型的稳定性及活性。
[0447] IL-23表位分析的概述
[0448] 已使用丙氨酸切削及单一诱变的方法来定位hIL-23中的7B7Fab(7B7Fab包含于7B7Fab、7B7抗体及biAb3中)的表位。实施靶向诱变策略使用的 表位信息是通过蛋白水解消化法LCMS分析、肽结合、氢/氘交换质谱、溶剂可及表面积计算及对接算法计算生成的。选定的纯化突变体的小规模筛选(通过SPR)及放大显示了7B7/biAb3与hIL-23的结合的特异性表位。M5突变体展示与7B7/biAb3的结合明显降低，而维持类似于野生型的功能活性、与p40及p19特异性试剂的结合、单体寡聚态、热稳定性及二级结构特征。M5突变体展示与7B7/biAb3的结合的明显损失，而M9及M10(其各自含有两个与M5相同的突变残基)各自展示与7B7/biAb3的结合的部分损失。M5IL-23突变体对7B7/biAb3的亲和力≥300nM，大约为野生型IL-23的1/1,500弱，这显示M5突变体中的残基界定了7B7/biAb3与IL-23的结合的表位。因此，数据提示7B7/biAb3抗体结合IL-23的p19亚单位上的不连续表位。IL-23p19上的此不连续表位包括至少两个表位区(A区(SEQ ID NO:6的氨基酸残基33-59)及B区(SEQ ID NO:6的氨基酸残基89-125))。具体而言，对于IL-23p19的第一表位或A区而言，SEQ ID NO:6的氨基酸残基54(Met)及55(Asp)为7B7/biAb3结合IL-23p19的能力贡献了大量的结合能量。对于IL-23p19的第二表位或B区而言，氨基酸残基116(Leu)是B区内为7B7/biAb3结合IL-23p19的能力贡献能量的主要残基。
[0449] 实施例8
[0450] 狨EAE模型
[0451] 背景及原理
[0452] 多发性硬化(MS)系中枢神经系统(CNS)的慢性自身免疫性、炎症性、神经退化性疾病，其以在脑及脊髓中损失髓磷脂为特征。引发疾病的潜在机制尚未完全理解，但有助于多发性硬化的临床进展的疾病过程为炎症、脱髓鞘及轴突损失或神经退化。巨噬细胞及小神经胶质细胞是CNS的主要免疫细胞。这些细胞以及T细胞、嗜中性粒细胞、星状细胞及小神经胶质细胞能贡献于，例如，多发性硬化的免疫相关性病况。另外，T细胞与若干髓磷脂蛋白(包括髓磷脂碱蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)及活性其他髓磷脂蛋白)的反应性/自身免疫性与多发性硬化的疾病状态及病况的诱导及长期化有关。这种自体反应性T细胞与髓磷脂蛋白的相互作用可导致促炎症性细胞因子(尤其包括TNF-α、IFN-γ及IL-17)的释放。其他后果为：T细胞增殖、B细胞及巨噬细胞活化、趋化因子及黏附分子上调，及血脑屏障破坏。后续的病理是少突胶质细胞及轴突的损失以及脱髓鞘“斑块”的 形成。斑块是由损伤组成的，该损伤中髓磷脂鞘已缺失且脱髓鞘轴突嵌入神经胶质瘢痕组织内。脱髓鞘的发生原因亦可为自体抗体特异性识别髓磷脂抗原并加以调理，随后发生补体及/或活化巨噬细胞介导的破坏。人们认为这种轴突损失及神经退化正是进展性多发性硬化中所见的不可逆神经缺损的主要成因。
[0453] 多发性硬化(MS)根据疾病进展情况分为4类。
[0454] (1)复发缓解型MS(RRMS)。RRMS的特征在于复发(症状骤然发作)随后缓解(恢复期)。症状可自轻度症状至严重症状不等，且复发及缓解可持续数天或数月。80％以上的MS患者始于复发缓解型循环。
[0455] (2)继发进展型MS(SPMS)。SPMS通常发生于复发缓解型MS患者中。在SPMS中，患者复发然后部分恢复，但失能在各次循环之间并不消退。相反，其逐渐恶化直至稳定进展的失能代替循环发作为止。
[0456] (3)原发进展型MS(PPMS)。PPMS自其发作起缓慢且稳定地进展。无缓解期，且症状强度通常并不降低。约15％的MS患者患有PPMS。
[0457] (4)进展复发型MS(PRMS)。在此相对稀有的MS类型中，患者在缓解期内症状稳定恶化并发作。
[0458] Mayo Clinic(互联网地址mayoclinic.org/multiple-sclerosis/types)。
[0459] 人多发性硬化的病程在临床及病理学上有很大的不均一性。大部分症状通常始于18岁至50岁年龄期间，但可始于任何年龄。多发性硬化有多种不同的临床症状，从轻度视觉障碍及头疼，到失明、严重共济失调及瘫痪。大部分患者(大约70-75％)患有复发缓解型多发性硬化，其中疾病症状可在大约数小时至数天内复发，随后恢复慢得多；在不少情况下，缓解期期间不存在症状。复发及缓解的发病率及频率可变化较大，但随着时间进展，恢复期可不完全且缓慢发生。将这些情形中的这种疾病恶化归类为继发进展型多发性硬化，其发生于大约10-15％的多发性硬化患者中。另外10-15％的患者诊断有原发进展型多发性硬化，其中疾病症状及物理障碍在整个疾病过程中以稳定的速率进展。
[0460] IL-23及IL-17皆过度表达于患有多发性硬化的人源的中枢神经系统及经受多发性硬化的动物模型：实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的小鼠中。在通过髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55肽或蛋白脂质肽(PLP)诱导EAE时，在小鼠中观察到过度表达。另外，中和IL-23/p19或IL-17使得可改善小鼠中 的EAE症状(Park等人，Nat Immunol.6:1133(2005)；及Chen等人，J Clin Invest.116:1317(2006))。
[0461] 方法
[0462] 实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)是一种定性清楚且可再现的动物模型，其模仿MS的某些方面的特征。EAE可在啮齿类动物及非人灵长类动物(例如普通狨)中诱导发生。Genain,C.P.及Hauser,S.L.,“Creation of a model for multiple sclerosis in Callithrix jacchus marmosets,”J.Mol.Med.,75:187-197(1997)。在狨EAE中，使用重组人源髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(rHuMOG)对动物实施免疫，诱导发生出一种极其类似于人多发性硬化的疾病。已公开的对该模型的研究采用在完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)中乳化的MOG作为免疫原单次接种。我们早先尝试使用该公开的方法诱导狨中的EAE，结果在MOG注射之后23天至142天期间临床症状发作(数据未展示)。由于认为此时间线对于临床前效力研究而言过长，故采用修改的方案，先使用引发剂量，再进行强化免疫以诱导疾病。我们使用如该研究中所描述的引发/强化方案评估了一种替代双特异性抗体在这种非人灵长类动物EAE模型中的活性，该抗体具有IL-17A/F结合实体及IL-23结合实体。这种替代双特异性抗体是biAbFabL(参见图2)，其与biAb-1、biAb-2、biAb-3及biAb-4具有相同的IL-17A/F结合实体，同时具有biAb-3之IL-23结合实体的替代IL-23结合实体，例如，具有对狨IL-23p19减少的亲和力。因此，在替代双特异性抗体中利用替代性IL-23结合实体。该替代双特异性抗体中所利用的替代性IL-23结合实体与图13及图14中鉴定为“IL-23mAb”的IL-23结合实体相同。
[0463] 为诱 导EAE，将rHuMOG(BlueSky Biotech,Worcester,MA)在 无 菌PBS中 稀释至0.66mg/ml，且然后使用等体积的含有5mg/mL结核分支杆菌(M.tuberculosis)H37RA(Difco编号：231141)的不完全弗氏佐剂(incompleteFreund’s adjuvant)(IFA，Sigma编号：F5506)乳化。将300μL最终CFA/MOG混合物(含有0.33mg/mL MOG及2.5mg/ml H37RA)注射于每只动物的经剃毛的肩部区域上的2个部位(150μl×2个注射位点)。使用CFA/MOG在同一天(第0天)对所有狨实施免疫。
[0464] 在第21天，在动物的经剃毛的腰/髋区域上的2个注射部位处注射IFA/MOG(制备如上所述，但不含H37RA)以强化免疫。引发及强化接种均通 过肌内注射氯胺酮(Ketamine)(15mg/kg)将狨麻醉。
[0465] 将替代IL-23/17AF bAb(IgG4.1k)配制于20mM琥珀酸、150mM精氨酸缓冲液(pH 5.6)中。在使用CFA/MOG实施引发接种的前1天开始投药。给予动物安慰
剂(PBS，经皮下，2×/周)或IL-23/17AF bAb(7mg/kg，经皮下，2×/周)。其他处
理组包括BMS-938790(IL-23阿奈克因(adnectin)；3mg/kg，经皮下，2×/周)、ADX_PRD1651(IL-23/17比奈克因(binectin)，10mg/kg，经皮下，2×/周)及替代IL-23mAb IgG4.1(IL-23.15-g4P，9mg/kg，经皮下，2×/周)。在整个研究期中均于周二及周五给药。
每周一次记录个体体重，且基于个体体重对动物进行投药。对于所有皮下给药，在使用酒精局部擦洗后施用到侧腹区域中。每次剂量施用交替变换给药部位(左侧或右侧)。在研究开始时，处理组由8只动物/组(雄性及雌性混合)组成。在注射药物时，动物是清醒的且被人工束缚。
剂(PBS，经皮下，2×/周)或IL-23/17AF bAb(7mg/kg，经皮下，2×/周)。其他处
理组包括BMS-938790(IL-23阿奈克因(adnectin)；3mg/kg，经皮下，2×/周)、ADX_PRD1651(IL-23/17比奈克因(binectin)，10mg/kg，经皮下，2×/周)及替代IL-23mAb IgG4.1(IL-23.15-g4P，9mg/kg，经皮下，2×/周)。在整个研究期中均于周二及周五给药。
每周一次记录个体体重，且基于个体体重对动物进行投药。对于所有皮下给药，在使用酒精局部擦洗后施用到侧腹区域中。每次剂量施用交替变换给药部位(左侧或右侧)。在研究开始时，处理组由8只动物/组(雄性及雌性混合)组成。在注射药物时，动物是清醒的且被人工束缚。
[0466] 自第12天开始每天对疾病状态进行目测评价。基于两名研究者的一致意见作出评价并加以记录。临床评分基于对如下表32中所描述的已公开的疾病评分的修改。
[0467] 表32-狨EAE临床评分系统
[0468]
[0469] 结果
[0470] 每组中具有EAE疾病的体征/症状的动物数量如下所述：
[0471] 组A(PBS)：7只狨中的5只(71％)在研究期间的某一时间点展示EAE样疾病及/或神经功能障碍。疾病表现由失明及瘫痪组成。
[0472] 组B(IL-23阿奈克因，BMS-938790)：6只狨中的1只(17％)展示EAE样 疾病。疾病表现由进行性失明及瘫痪组成。
[0473] 组C(IL-23/17比奈克因，ADX_PRD1651)：7只狨中的6只(86％)展示EAE样疾病。然而，3只动物仅在一个观察日展示了EAE体征/症状证据。
[0474] 组D(IL-23mAb)：6只狨中的3只(50％)展示EAE样疾病。失明普遍存在。
[0475] 组E(IL-23/17AF bAb)：8只狨中的4只(50％)展示EAE样疾病；该4只动物中的3只仅在一个观察日具有评分为“正”的瞬时症状。疾病主要由轻度症状，如移动缓慢或警觉性减少组成。
[0476] 与组A(PBS)中的疾病发病率相比，每一其他处理组中的疾病发病率的差异并无统计学显著性(p>0.05，费希尔氏确切检验(Fisher’s Exact Test))。
[0477] 在研究中有一小部分动物确实发生了更严重的EAE体征/症状，其中若干狨需要施以安乐死以遵守预定的人道终点。各组中需要安乐死的动物数量如下：组A(2)；组B(1)；组C(1)；组D(0)；组E(0)。
[0478] 在实施安乐死时，将由于遭受EAE症状出于人道原因实施安乐死的动物的临床严重程度评分指定为“4”，将此评分保留于该研究的剩余部分用于计算组平均临床严重程度评分。图12绘示每一处理组在研究过程中的平均临床严重程度评分。组A(PBS)在研究结束时达到大约1.6的峰值评分。所有其他组显示的平均临床评分均较之为低，其中组E(IL-23/17AF bAb)仅显示在很短一段时间(约1周)中有任何EAE疾病体征较为明显。因各组中的动物数量有限且组内动物的EAE疾病评分在动物之间不同，故组A(PBS)与其他处理组之间的差异无一有统计学显著性(曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U Test))。
[0479] 总之，此研究展示，在评估的数种化合物的作用下，狨EAE模型中存在疾病严重程度减轻和疾病发病率减少的趋势。总而言之，使用IL-23/17AF bAb(IgG4.1k)处理的动物似乎结果最有益(图12)，尽管各组间的差异并无统计学显著性。发现使用IL-23/17AF bAb治疗的动物比使用IL-23mAb治疗的动物获得了更好的保护，这表明对IL-23及IL-17AF路径的双重靶定将在对这些细胞因子路径在其中发挥一定作用的人类疾病(包括但不限于多发性硬化)的治疗中产生更大的效能。
[0480] 死后MRI
[0481] 在研究结束时，对仍存活的狨实施解剖(necropsy)。去除颅盖且将脑原位固定于福尔马林(formalin)中保持3周。为评价白质及视神经束中的损伤，实 施了T2W及质子密度MRI扫描，其使用带72mm Quad RF线圈的Bruker Biospec 7T系统，使用下列参数：总扫描时间：约15-20min/试样，收集23个轴向影像，TR/TE＝5000/20ms，切片厚度＝1.2mm，2
FOV＝4cm，矩阵＝256×256，平面内分辨率＝156mm。
FOV＝4cm，矩阵＝256×256，平面内分辨率＝156mm。
[0482] 对扫描进行审阅，且根据3名放射学家在审阅各组动物的所有MRI影像之后的一致意见来实施半定量解释。损伤评分基于覆盖整个脑的白质中的损伤计数。视神经评分是基于反映视神经束及神经中的炎症的信号强度增加和肿胀。
[0483] 总体上，与媒剂组相比，观察到IL-23/17AF bAb组中的损伤负荷显著(p<0.05)减少(图13)。与媒剂相比，IL-23/17AF bAb组中的视神经束评分亦显著较低(图14)。其他处理组与媒剂处理组相比，这两种MRI量度均无显著不同。因此，与临床疾病评分一致，使用IL-23/17AF bAb治疗的动物组同样具有最低的平均MRI值，从而提示，对IL-23及IL-17AF路径的双重靶向将在人体疾病的治疗中得到较大效能。
[0484] 实施例9
[0485] IL-17A及IL-17F表位定位
[0486] 此实施例9中所描述的分析旨在鉴别biAb3的IL-17A/F结合实体(如SEQ ID 13中所展示重链可变域及如SEQ ID NO:9中所展示的轻链可变域)所结合的IL-17A及IL-17F上的表位残基。
[0487] 鉴别biAb3及小鼠亲本抗体(339.15.5.3)间的表位的主要差异的策略利用X射线结晶学、定点诱变、计算机诱变及结合与功能分析来分析突变体。biAb3的IL-17A/F结合实体的重链可变域是克隆339.15.5.3、克隆339.15.3.6或克隆339.15.5.3的重链可变域的人源化形式。biAb3的IL-17A/F结合实体及克隆339.15.5.3、克隆339.15.3.6或克隆339.15.5.3的重链CDR残基相同。然而，两种mAb的重链可变域的框架区有所不同。两种mAb具有不同的轻链，因而IL-17中与每一mAb的轻链接触的残基是此研究的着眼点。
[0488] X射线结晶学
[0489] 实施IL17A Fab复合物及IL17F Fab复合物结晶学测定以确定接触界面残基，用以建立接触表面模型，以供预测表位/互补位残基及确定埋入的表面。亦使用该三维结构以用于基于建模晶体结构复合物进行蛋白质突变体能量计算。
[0490] 克隆每一抗体的Fab且以周质方式表达于大肠杆菌菌株BL21(人源化339-134)或BL21Star(BiAb)中。其纯化皆包括IMAC及随后的SEC。使IL-17A及IL-17F作为包含体表达于大肠杆菌菌株W3110中并重折叠，随后进行多步纯化。
[0491] 使衍生自biAb3的IL-17臂的Fab(SEQ ID NO:13的重链可变域及SEQ ID NO:15的重链CH1结构域；及SEQ ID NO:17的轻链)及衍生自亲本的人源化前导物(人源化抗人IL-17A/F抗体339-134mAb)的Fab(SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:67)与人IL-17A或IL-17F复合。通过SEC监测IL-17A或IL-17F与BiAb3及人源化抗人IL-17A/F抗体339-134mAb的复合物形成。
[0492] 通过大范围筛选随后优化结晶条件来生成4种复合物中的每一种的共晶体。在APS LS-CAT光束线下收集关于每一试样的数据组。
[0493] 表33-X射线结晶学数据组分辨率的汇总.
[0494]
[0495] 通过分子置换测定每一结构，使用CCP4套件中的Phaser MR。自PDB ID 2VXS获得IL-17A搜索模型。自PDB ID 1JPY获取IL-17F搜索模型。对于每一Fab而言，用来自PDB ID 3IDX的人源化Fab缺失超变环生成用于恒定及可变域的搜索模型。在REFMAC5中进行多轮叠代式的精修，并在Coot中手工建模之后，获得了最终模型。此外，在Autobuster中再进行几轮精修及作图，以建立并精修所有较低分辨率结构的模型。数据收集及精修的结晶学统计学展示于表34(人源化亲本Fab结构)及表35(人源化前导Fab结构)。使用已经下载在内部服务器上运行的MolProbity评价每一结构的几何结构。
[0496] 表34-人源化亲本Fab A3052F与IL-17A或IL-17F的复合物的结晶学统计学[0497]
[0498]
[0499]
[0500] 表35-人源化前导Fab A3185F单独或与IL-17A或IL-17F的复合物的结晶学统计学
[0501]
[0502]
[0503] 每一Fab主要通过其重链(亦通过轻链，但较为次要)结合IL-17同二聚体的一个半位点。人源化亲本与人源化前导Fab的结合的差异似乎与人源化前导Fab的较高亲和力一致。
[0504] 总体而言，各个IL-17/BMS Fab复合物展现相同的整体结构，其中一个Fab识别IL-17同二聚体的一个半位点(图15)。因此，结合化学计量学在结晶学上展示为两(2)个Fab对一(1)个IL-17同二聚体(或两(2)个Fab对两(2)个IL-17启动子)。与该白介素的相互作用大部分是由重链形成的，其中超变环3(或互补决定区CDR3)形成抗体-抗原相互作用的核心。此外，重链的CRD2 的诸多残基与白介素发生相互作用。重链的CDR1似乎并不与白介素发生显著的相互作用。对于轻链而言，CDR3参与IL-17的识别。轻链的CDR1亦似乎提供弱的、更长程的结合相互作用。
[0505] 使用晶体结构坐标来定义如先前所描述的接触界面(S.Sheriff.,“Some Methods for Examining the Interaction between Two Molecules”,Immunomethods,3:191-196(1993))，其中最小定义(定义为处于接触中的残基)来源于程
序 CONTACSYM(Sheriff,S.Hendrickson,W.A. 及 Smith,J.L.(1987).Structure
of Myohemerythrin in the Azidomet State at Resolution.J.Mol.
Biol.197,273-296.)。界面的最大定义(定义为至少部分被相互作用埋入的残基)来源于程序MS(Connolly,M.L.(1983).Analytical Molecular Surface Calculation.J.Appl.Crystallogr.16,548-558)。
序 CONTACSYM(Sheriff,S.Hendrickson,W.A. 及 Smith,J.L.(1987).Structure
of Myohemerythrin in the Azidomet State at Resolution.J.Mol.
Biol.197,273-296.)。界面的最大定义(定义为至少部分被相互作用埋入的残基)来源于程序MS(Connolly,M.L.(1983).Analytical Molecular Surface Calculation.J.Appl.Crystallogr.16,548-558)。
[0506] 表36-复合物的接触及埋入界面残基
[0507]
[0508]
[0509] 具有星号(*)的残基在复合物界面处处于接触中。
[0510] 没有星号的残基完全埋入复合物接触界面中。
[0511] Fab与IL-17A(SEQ ID NO:2)的主要相互作用似乎是针对残基L97及来自H109-N111的残基段(图15)。I100、G98、N111、S112、V113及P114在IL-17A与IL-17F之间是保守的(SEQ ID NO:2或IL-17A的氨基酸残基I100、G98、N111、S112、V113及P114对应于SEQ ID NO:4或IL-17F的氨基酸残基I108、G106、N119、S120、V121及P122)。因此，在获得此初始结构之后，预计人源化亲本Fab A3052F将以与就IL-17A所观察到的基本上相同的方式结合IL-17F。然而，在邻近这些残基处，存在若干在IL-17A(SEQ ID NO:2)与IL-17F(SEQ ID NO:4)之间不同的残基，例如IL-17A中的K93(17F中的Q101)、IL-17A中的H95(17F中的N104)、IL-17A中的Y108(17F中的I116)及IL-17A中的H109(17F中的S117)。IL-17A(SEQ ID NO:2)的C末端亦似乎通过残基P149及I150，其对应于IL-17F(SEQ ID NO:4)的残基P157及V158，与Fab发生较弱的相互作用。然而，IL-17A与IL-17F之间的差异预计不会显著改变整体抗体-抗原相互作用。
[0512] 与人源化亲本Fab的 分辨率相比，人源化前导Fab的 分辨 率展现极为类似的重链与白介素之间的相互作用，这与预期的一样，考虑到重链的序列相同。与之相对的是，该两种Fab的轻链完全不同，且如所预计的那样，这些残基以不同的方式与白介素进行配位。biAb Fab在CDR3中少了一个使得环能够伸展到白介素的上方的残基，使得biAb Fab中的G93(SEQ ID NO:9的G93或SEQ ID NO:27的G4)的主链氧能与SEQ ID NO:2(IL-17A)中Y108的主链氮形成直接氢键。而相同的原子(人源化亲本Fab中SEQ ID NO:67的N91的主链氧在亲本Fab中与该位置相距 不能与白介素形成氢键。另外，自WN变为YG使得CDR1的Y33(SEQ ID NO:9的Y33)相对于其在亲和力较低的亲本Fab中的位置接近白介素 由此获得与IL-17A的H109(SEQ ID NO:2)的额外的包装(packing)相互作用。最后，biAb Fab的Y96(SEQ ID NO:9的Y96)可与重链的N106(SEQ ID NO:13的N106)形成氢键，从而帮助其以氢键形式与白介素(IL-17A)的Y108(SEQ ID NO:2的Y108)主链氧对齐。总而言之，biAb Fab的CDR3界面中的这些变化似乎与其较高亲和力一致，且已通过如下文所展示的定点诱变进行了测试。
[0513] 令人遗憾的是，未获得由小鼠亲本Fab与IL-17A或IL-17F组成的复合物的晶体结构。这提示优化这些复合物的相互作用的条件与成功用于使人源化亲本Fab及前导Fab结晶的那些条件不同。
[0514] 除个别残基接触的解释外，可通过计算被IL17/Fab复合物的相互作用区所埋入的总表面积来获得结合白介素的人源化亲本Fab与biAb中的差异的另一量度。此分析使用用于IL-17A Fab复合物(因为它们具有最高的分辨率)的MS算法实施，且应提供最可靠的比较。IL-17F的两种结构超过 并不视为能可靠地用于此分析。亲本Fab在IL-17A上埋入 而biAb Fab埋入 (参见表37)。该表面积差异(
)得到了前导Ab对IL-17A的结合亲和力增加的测量结果的支持。令人感兴趣的是，许多氨基酸中由于延伸的侧链构象所致的表面积小于 (A、N、D、C、G、L、P、S、T、V)，参见Atlas of Protein Side-Chain Interactions V1.Singh及Thornton 1992,6-11)。因此，总的来说，通过此测量可见，前导结构与亲本结构在IL-17A上的结合表位差异可描述为大约一(1)个残基当量。
)得到了前导Ab对IL-17A的结合亲和力增加的测量结果的支持。令人感兴趣的是，许多氨基酸中由于延伸的侧链构象所致的表面积小于 (A、N、D、C、G、L、P、S、T、V)，参见Atlas of Protein Side-Chain Interactions V1.Singh及Thornton 1992,6-11)。因此，总的来说，通过此测量可见，前导结构与亲本结构在IL-17A上的结合表位差异可描述为大约一(1)个残基当量。
[0515] 表37-表面积
[0516]
[0517]
[0518] 计算机表位预测及丙氨酸切削突变体的设计
[0519] 为详细定性IL-17A及IL-17F表位残基对于亲本及前导Fab的结合动力学的不同贡献，选择通过X射线结晶学所鉴别的结合界面中的残基用于定点突变以进一步区分人源亲本mAb及biAb的结合间的差异。
[0520] 采用多种用于选择单一分子上的个别及多个突变的标准来选择一组代表性的且能提供信息的突变体进行测试。使用本文先前所描述的IL-17A/亲本Fab、IL-17F/前导Fab的晶体结构来为要突变的残基的选择提供信息。选择配体-Fab相互作用界面处的残基，同时着重关注与Fab轻链残基接触的残基。亦选择在一种Fab的晶体结构中清晰度差，但在另一种Fab的晶体结构中清晰度不差的区域，因为这可能指示亲本与biAb在复合物内的残基流动性方面的差异。此外，亦选择同源IL-17A/F残基有所不同的残基位置，因为这可能指示对于Fab结合的容变性，或可能对亲本与biAb Fab的不同结合亲和力有贡献。使用提出的突变体对界面进行模拟以探寻与亲本或biAb Fab所成的复合物中的能量差异。将接触残基的簇(丙氨酸切削突变体)组合，生成结合亲和力具有加和性或协同性变化的突变体。生成用于实验分析的每一白介素的突变体展示于表38及39中。
[0521] 表38：IL-17A突变体
[0522]IL17A-WT SEQ ID NO:2的残基24-155
IL17A-M1 N105A、Y108A、H109A
IL17A-M2 L97A、Y108A、N111A
IL17A-M3 K61A
IL17A-M4 K61A、S64A、R69A
IL17A-M5 N105A
IL17A-M6 Y108A
IL17A-M7 H109A
IL17A-M8 V106A、D107A
IL17A-M9 I150A、V151A
IL17A-M1 N105A、Y108A、H109A
IL17A-M2 L97A、Y108A、N111A
IL17A-M3 K61A
IL17A-M4 K61A、S64A、R69A
IL17A-M5 N105A
IL17A-M6 Y108A
IL17A-M7 H109A
IL17A-M8 V106A、D107A
IL17A-M9 I150A、V151A
[0523]IL17A-M10 Y108A、H109A、V151A、H152A
IL17A-M11 Y108A、V151A
IL17A-M12 H109A、I150A、H152A
IL17A-M11 Y108A、V151A
IL17A-M12 H109A、I150A、H152A
[0524] 表39：IL-17F突变体
[0525]IL17F-WT SEQ ID NO:4的残基31-163
IL17F-M1 L105A、I116A、N119A
IL17F-M2 K113A、E114A、I116A
IL17F-M3 S69A、R72A、R77A
IL17F-M4 S69A
IL17F-M5 R72A
IL17F-M6 K113A
IL17F-M7 E114A
IL17F-M8 I116A
IL17F-M9 D115A、S117A
IL17F-M10 V158A、I159A
IL17F-M1 L105A、I116A、N119A
IL17F-M2 K113A、E114A、I116A
IL17F-M3 S69A、R72A、R77A
IL17F-M4 S69A
IL17F-M5 R72A
IL17F-M6 K113A
IL17F-M7 E114A
IL17F-M8 I116A
IL17F-M9 D115A、S117A
IL17F-M10 V158A、I159A
[0526] IL-17A和F表位定位丙氨酸突变体的克隆及表达
[0527] 通过基因合成生成IL-17A及IL-17F的突变体构建体，然后克隆至瞬时转染载体6
中，用于在HEK293-6E细胞中表达。使用表达质粒/PEI复合物转染30mL 1×10个细胞/ml的HEK293-6E细胞培养物，在转染后120小时收获细胞。
中，用于在HEK293-6E细胞中表达。使用表达质粒/PEI复合物转染30mL 1×10个细胞/ml的HEK293-6E细胞培养物，在转染后120小时收获细胞。
[0528] IL-17A和F突变体的Biacore浓度分析
[0529] 借助在抗his Fab Biacore传感器表面上的捕获量来定量HEK捕获上清液中IL-17A及IL-17F的每一种丙氨酸突变体的浓度。亦固定了蛋白质A及huIgG表面作为对照，来评价上清液的非特异性结合(未观察到非特异性结合)。使用介于80ug/mL至0.039ug/mL之间的纯化IL-17A-his或IL-17F-his的标准曲线来定量每一上清液中的浓度。对于自0.3125ug/mL至0.0039ug/mL的数据而言，将校准曲线拟合至线性曲线。上清液以1:20、1:60及1:180的稀释度使用，以便能够在标准曲线的线性范围中进行多次测量。
[0530] IL-17A突变体8具有显著减少的表达(仅为野生型表达水平的约10％)。IL-17F突变体M2、M3、M7及M9具有显著减少的表达。IL-17F的M9突变 体几乎不可检测，而IL-17F M2及M7突变体小于野生型表达水平的5％。
[0531] 表40：HEK上清液中的IL-17A及IL-17F构建体的表达量
[0532]IL-17变体 HEK上清液中的表达量，μg/mL
IL17A-WT 7.2
IL17A-M1 6.3
IL17A-M2 13.0
IL17A-M3 15.3
IL17A-M4 18.6
IL17A-M5 10.3
IL17A-M6 11.7
IL17A-M7 12.4
IL17A-M8 0.6
IL17A-M9 13.6
IL17A-M10 14.8
IL17A-M11 13.2
IL17A-M12 12.1
IL17F-WT 13.6
IL17F-M1 16.2
IL17F-M2 0.3
IL17F-M3 1.4
IL17F-M4 12.2
IL17F-M5 6.8
IL17F-M6 7.1
IL17F-M7 0.3
IL17F-M8 10.3
IL17F-M9 <0.1
IL17F-M10 15.0
IL17A-WT 7.2
IL17A-M1 6.3
IL17A-M2 13.0
IL17A-M3 15.3
IL17A-M4 18.6
IL17A-M5 10.3
IL17A-M6 11.7
IL17A-M7 12.4
IL17A-M8 0.6
IL17A-M9 13.6
IL17A-M10 14.8
IL17A-M11 13.2
IL17A-M12 12.1
IL17F-WT 13.6
IL17F-M1 16.2
IL17F-M2 0.3
IL17F-M3 1.4
IL17F-M4 12.2
IL17F-M5 6.8
IL17F-M6 7.1
IL17F-M7 0.3
IL17F-M8 10.3
IL17F-M9 <0.1
IL17F-M10 15.0
[0533] IL-17生物测定(NIH/3T3/KZ170NF-κB荧光素酶报告基因测定)
[0534] 使用称为KZ170的NF-κB荧光素酶报告基因稳定转染鼠成纤维细胞系(NIH/3T3，ATCC编号：CRL-1658)且克隆出来。将NIH/3T3/KZ170克隆1 细胞以10,000个细胞/孔接种于96孔白色不透明荧光素酶平板中并在37℃下温育过夜。次日，参照Biacore测定的浓度，在测定培养基中制备重组人IL-17A、IL-17F、IL-17A丙氨酸突变体及IL-17F丙氨酸突变体的连续稀释液，添加至含有细胞的平板中，并在37℃下培养4小时。在温育后，去除培养基且裂解细胞，然后根据制造说明书在Berthold Centro XS3亮度计上使用闪光底物进行读取。平均荧光强度的增加(通过NF-κB荧光素酶报告基因的活化)指示IL-17A或IL-17F受体-配体相互作用。使用GraphPad 4软件计算每一种IL-17A及IL-17F丙氨酸突变体的EC50(50％的有效浓度)值。
[0535] 所有IL-17A突变体皆展示了细胞功能活性，尽管有一些突变体相对于野生型失去了数倍的活性(图16)。所有IL-17F突变体(除M3外)皆展示了细胞功能活性，尽管有3种突变体(M2、M5、M10)展示显著减少的活性(图17)。
[0536] IL-17A和F突变体与BiAb3及其他相关抗体的结合的Biacore结合分析
[0537] 用于Biacore结合测定的抗体为biAb3(如SEQ ID NO:7中所展示的重链可变域及如SEQ ID NO:9中所展示的轻链可变域)及小鼠亲本抗体339.15.5.3(其含有与339.15.3.5及339.15.3.6相同的可变区序列)。使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型分析试剂盒(Roche,Indianapolis,IN,USA)的同种型分析显示339.15.5.3抗体为IgG2a/κ，与用于人源化的339.15.3.5一样。在339.15.3.5与339.15.5.3之间并未测得序列或同种型差异。
[0538] 通过表面等离子共振(SPR,Biacore)测量所有12种IL-17A及10种IL-17F丙氨酸突变体的30mL表达体系的上清液及其各自的野生型对照上清液(参见表41及表42)的结合，表面等离子共振在Biacore T100上、HBS-EP(10mMHEPES、3mM EDTA、150mM NaCl、0.05％Tween 20，pH 7.4)中、25℃进行。通过以3000RU固定于CM5传感器芯片上的蛋白质A以约150-250RU的浓度捕获相关抗体及受体。除biAb3及亲本mAb(339.15.3.5)外，使用其他抗IL-17mAb作为用于结构域结合的对照。此外，使用市售的IL-17A受体作为对照：hIL-17RA-Fc(来自R&D Systems)，但并未鉴别出用于此测定的适宜IL-17RC试剂。根据基于抗his定量而确定的浓度，将上清液以9nM浓度稀释至HBS-EP中，再以1:3连续稀释，并以30uL/min注射于mAb或受体表面上保持90秒，且在解离时间之后，使用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生。亦以更高浓度(在400-500nM范围中，在上清液的表达水平)运行IL-17A M2及IL-17FM1，这是由于biAb捕获表面观察到的结合信号没有或极少。在分析之前， 自所有特异性结合曲线扣除无任何捕获抗体的蛋白质A的参考表面的结合。将所有滴定曲线拟合至1:1Langmuir结合模型，确定出如图18及表41及42中所展示的Kd值。
[0539] Biacore结果显示，IL-17A突变体M1、M2、M6、M10及M11展示对BiAb的结合亲和力有所减少，且含有对与亲本抗体相比的结合表位差异起贡献的残基。这些突变体大部分展示与IL-17RA-Fc的结合减少至野生型的1/15-1/3(对于M1而言为1/45)，此可能是由于受体结合位点已发生改变。然而，对于影响BiAb3相互作用的所有突变体而言，细胞效力维持于数倍范围内，从而表明这些受体破坏对于功能而言并不重要。
[0540] IL-17F突变体M1、M2、M7及M8展示对biAb的结合亲和力有所减少，然而这些突变体对于亲本抗体显示的结合亲和力也类似地减少，这指示IL-17F并无IL-17A中亲本抗体与biAb之间的表位变化。该4种突变体在细胞功能测定中维持类似于野生型IL-17F的效力，然而许多其他突变体并不维持类似于野生型IL-17F的效力，这限制了我们对IL-17F诱变的解释。
[0541] 表41：IL-17A丙氨酸突变体与biAb3及小鼠亲本抗体的结合的Biacore动力学分析
[0542]
[0543]
[0544] 表42：IL-17F丙氨酸突变体与biAb3及小鼠亲本抗体的结合的Biacore动力学分析
[0545]
[0546] NM–未测量，因为突变体未以可检测水平表达。
[0547] 计算机上诱变
[0548] 对IL-17A-亲本Fab、IL-17A-前导Fab及IL-17F-前导Fab实施能量分析。因复合物的X射线结构不完整，故使用蛋白质建模来完成结构模型，蛋白质建模使用标准方案(Maestro蛋白质制备向导及Prime侧链建模)构建缺少的氨基酸侧链。然后使用这些结构模型计算野生型蛋白(IL-17A或IL-17F)或突变体IL-17分子与Fab的相互作用能量。相互作用能量是Fab针对IL-17(视为配体)的计算亲和力的量度。为计算突变体蛋白的稳定性及Δ-稳定性，使用软 件MOE(2012.10版，Chemical Computing Group)。使用残基扫描方案来实施计算机定点诱变，以生成突变且计算亲和力及稳定性。
[0549] 图19中展示了计算机预测的结合能量与自IL-17A突变体Biacore亲和力求出的计算ΔΔG值的比较。图19中所标示的IL-17A突变体标记错误。图19中所标示的IL-17A突变体的SEQ ID NO:2编号比其实际应有的编号小1。突变体在表38中标示为。举例而言，图中的N104A、Y107A及H108A应为N105A、Y108A及H109A等等。此比较显示，整个突变体组中的Biacore能量趋势与结合界面的计算机能量预测一致。无法分析小鼠亲本的IL-17A结合，因为该复合物未能结晶且无法生成可接受的模型。生成用于结合BiAb3的IL-17F突变体的结果的尝试产生了不一致的结果，这可能是由于所用的结构分辨率较差且缺少必需的残基信息。
[0550] IL-17A和F表位定位的概述
[0551] 鉴定BiAb3及小鼠亲本(339.15.5.3)的表位间的主要差异的策略利用X射线结晶学、定点诱变、计算机上诱变及结合与功能测定来分析突变体。两种mAb的轻链不同，由此与每一mAb的轻链接触的残基是此研究的着眼点。
[0552] IL-17A诱变得到了一组具有良好表达及合理的细胞效力的突变体。所有含有Y108A的突变体均测量到biAb3结合的ΔΔG发生显著变化，其中Y108A单点突变体测得的变化为0.5千卡/摩尔。在小鼠亲本抗体结合中未观察到这些ΔΔG变化，这指示与小鼠亲本mAb相比，Y108是用于biAb3的IL-17A表位中的新残基。能量数据与晶体结构的界面分析一致，显示此残基与biAb3中不同于小鼠亲本抗体的轻链相互作用，且与小鼠亲本抗体相比biAb3轻链的CDR3差异使得Y108A更为接近biAb3。此处展示的唯一一个影响小鼠亲本抗体结合的IL-17A突变体是与重链残基相互作用的，这表明轻链在小鼠亲本抗体与IL-17A的结合中并不发挥太大作用。
[0553] IL-17F诱变得到一组突变体，它们具有变化更大、且更低的表达水平，且效力有显著损失。针对IL-17F所获得的晶体结构的分辨率亦差于IL-17A结构。此表明IL-17F对诱变的适应性差一些，且可能在本质上更具动态性。然而，与biAb3的结合有所减少的突变体对小鼠亲本mAb的结合亦有所减少。另外，所有这些具有减少的mAb结合的突变体都具有合理的效力，而且表达水平虽然降低但对分析而言是足够的。
[0554] 自上文应了解，尽管本文出于阐释的目的已对本发明具体实施方案予以 描述，但可对其作出各种修改，此并不背离本发明的精神及范围。因此，本发明仅由随附申请专利范围限制。
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