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用于预防治疗组织损伤相关疾病和病症的组织保护肽和肽类似物

阅读:566发布:2021-05-17

专利汇可以提供用于预防治疗组织损伤相关疾病和病症的组织保护肽和肽类似物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了具有组织保护活性但具有极少或不具有潜在的不希望的造血作用的肽和肽类似物。所述肽和肽类似物可用于 预防 和 治疗 各种组织损伤相关 疾病 和病症。,下面是用于预防治疗组织损伤相关疾病和病症的组织保护肽和肽类似物专利的具体信息内容。

1.分离的肽,其包含:
(i)10到28个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性
且其包含结构式(II):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(SEQ ID NO:25)
其中:
X1是Ser(S);
X2是Arg(R);
X3是Val(V);
X4是Leu(L);
X5是Glu(E);
X6是Arg(R);
X7是Tyr(Y);
X8是Leu(L);
X9是Leu(L);
X10是Glu(E);
X11是Ala(A);
X12是带正电荷的基酸;
X13是带负电荷的氨基酸;
X14是Ala(A);
X15是Glu(E);
X16是Asn(N);
X17是Ile(I);
X18是Thr(T);
X19是Thr(T);
X20是Gly(G);
X21是Cys(C);
X22是Ala(A);
X23是Glu(E);
X24是His(H);或
(ii)结构式(II)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24中的至少一个且最多14个残基被删除;或(iii)结构式(II)的改变形式或其删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24中的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
2.如权利要求1所述的分离的肽,其中所述肽具有氨基酸序列:
肽I SRVLERYLLEAKEAENITTGCAEH(SEQ ID NO:26)。
3.分离的肽,包含:
(i)10到28个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性
且其包含结构式(III):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(SEQ ID NO:27)
其中:
X1是Pro(P)、Lys(K)或Ser(S);
X2是Pro(P)、Glu(E)或Gln(Q);
X3是Arg(R)、Ala(A)或Pro(P);
X4是Leu(L)、Glu(E)或Trp(W);
X5是Ile(I)、Asn(N)或Glu(E);
X6是Cys(C)、Ile(I)或Pro(P);
X7是Asp(D)、Thr(T)、Leu(L)或Ala(A);
X8是Ser(S)、Thr(T)、Gln(Q)或Asp(D);
X9是Arg(R)、Gly(G)或Leu(L);
X10是Val(V)、Cys(C)、His(H)或Glu(E);
X11是Leu(L)、Ala(A)、Val(V);
X12是带负电荷的氨基酸;
X13是带正电荷的氨基酸;
X14是Tyr(Y)、Cys(C)、Ala(A)或Ile(I);
X15是Leu(L)、Ser(S)、Val(V)或Gly(G);
X16是Leu(L)、Ser(S)或Ala(A);
X17是Glu(E)、Asn(N)或Gly(G);
X18是Ala(A)、Glu(E)或Leu(L);
X19是Lys(K)、Asn(N)或Arg(R);
X20是Glu(E)、Ile(I)或Ser(S);
X21是Ala(A)、Thr(T)或Leu(L);
X22是Glu(E)、Val(V)或Thr(T);
X23是Asn(N)、Pro(P)或Thr(T);
X24是Ile(I)、Asp(D)或Leu(L);或
(ii)结构式(III)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24中的至少一个且最多14个残基被删除;或(iii)结构式(III)的改变形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24中的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
4.如权利要求3所述的分离的肽,其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列:
肽J PPRLICDSRVLERYLLEAKEAENI (SEQ ID NO:28);
肽K KEAENITTGCAEHCSLNENITVPD (SEQ ID NO:29);
肽L SQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTL (SEQ ID NO:30);和
肽H ADRELEKIGA (SEQ ID NO:18)。
5.分离的肽,包含:
(i)10到28个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性
且其包含结构式(IV):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25(SEQ ID NO:31)
其中:
X1是His(H);
X2是Cys(C);
X3是Ser(S);
X4是Leu(L);
X5是Ala(A)或Asn(N);
X6是Pro(P)或Glu(E);
X7是Pro(P)或Asn(N);
X8是Arg(R)或Ile(I);
X9是Leu(L)或Thr(T);
X10是Ile(I)或Val(V);
X11是Cys(C)或Pro(P);
X12是带负电荷的氨基酸;
X13是极性氨基酸;
X14是带正电荷的氨基酸;
X15是Val(V);
X16是Leu(L)或Asn(N);
X17是Glu(E)或Phe(F);
X18是Arg(R)或Tyr(Y);
X19是Tyr(Y)或Ala(A);
X20是Leu(L)或Trp(W);
X21是Leu(L)或Lys(K);
X22是Glu(E)或Arg(R);
X23是Ala(A)或Met(M);
X24是Lys(K)或Glu(E);
X25是Glu(E)或Val(V);或
(ii)结构式(IV)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24和X25中的至少一个且最多15个残基被删除;或(iii)结构式(IV)的改变形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24和X25中的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
6.如权利要求5所述的分离的肽,其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列:
肽M APPRLICDSRVLERYLLEAKE (SEQ ID NO:32);和
肽N HCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEV (SEQ ID NO:33)。
7.分离的肽,包含:
(i)10到28个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性
且其包含结构式(I):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-(Z)n-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X
24(SEQ ID NO:15)
其中:n是1-4;
X1是Cys(C)或Pro(P);
X2是Asp(D)或Pro(P);
X3是Ser(S)或Arg(R);
X4是Arg(R)或Leu(L);
X5是Val(V)或Ile(I);
X6是Leu(L)或Cys(C);
X7是Glu(E)或Asp(D);
X8是Arg(R)或Ser(S);
X9是Tyr(Y)或Arg(R);
X10是Leu(L)或Val(V);
X11是Leu(L)或Ala(A);
X12是带负电荷的氨基酸;
每个Z独立地是任意氨基酸;
X13是带负电荷的氨基酸;
X14是Ala(A)或Leu(L);
X15是Glu(E)或Lys(K);
X16是Asn(N)、Glu(E)或Lys(K);
X17是Ile(I)或Ala(A);
X18是Thr(T)、Glu(E)或Gly(G);
X19是Thr(T)、Asn(N)或Ala(A);
X20是Gly(G)或Ile(I);
X21是Cys(C)或Thr(T);
X22是Ala(A)或Thr(T);
X23是Glu(E)或Gly(G);
X24是His(H)或Cys(C);或
(ii)结构式(I)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、(Z)n、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24中的至少一个且最多18个残基被删除;

(iii)结构式(I)的改变形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、(Z)n、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24中的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
8.如权利要求7所述的分离的肽,其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列:
肽F CDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEH (SEQ ID NO:16);
肽G PPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGC (SEQ ID NO:17);和
肽H ADRELEKIGA (SEQ ID NO:18)。
9.分离的肽,包含:
(i)9到29个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性且
其包含结构式(VII):
X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO:184)
其中:
X1是Leu(L)、Ile(I)、Gly(G)、Val(V)、Phe(F)、Pro(P)或Ala(A);
X2是带正电荷的氨基酸;
X3是带负电荷的氨基酸;
X4是Phe(F)、Gly(G)、Val(V)、Leu(L)、Ala(A)或Tyr(Y);或
(ii)结构式(VI)的删除形式,其中残基X1、X2、X3和X4中的至少一个且最多两个残基
被删除;或
(iii)结构式(VI)的改变形式,其中残基X1、X2、X3和X4中的至少一个且最多两个残基
被另一个残基保守取代。
10.如权利要求9所述的分离的肽,其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列:
肽EL IITFESFKENLKDFLLVIPFDCWE (SEQ ID NO:185);
肽EM TAAPTRHPIHIKDGDWNEFRRKLT (SEQ ID NO:186);
肽EN VDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCQL (SEQ ID NO:187);
肽EO SGKDVFQKQGQSVQ (SEQ ID NO:188);
肽EP QELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGI (SEQ ID NO:189);
肽EQ WSELTAEQELQRVAREVH (SEQ ID NO:190);
肽ER GASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGR (SEQ ID NO:191);
肽ES GICRNRVTNNVKDVTKLVANLPKD (SEQ ID NO:192);
肽ET FRIFNRSIDAFKDFVVASEETSDCV (SEQ ID NO:193);
肽EU VIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSC (SEQ ID NO:194);
肽EV THFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTF (SEQ ID NO:195);
肽EW PGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQM (SEQ ID NO:196);
肽EX LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE (SEQ ID NO:197);
肽EY QDPYVKEAENLKKYFNAG (SEQ ID NO:198);
肽EZ VTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPA (SEQ ID NO:199);
肽FA PGGAARCQVTLRDLFDRAVVLSHY (SEQ ID NO:200);
肽FB WGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLE (SEQ ID NO:201);
肽FC DMTTHLILRSFKEFLQS SLRALRQ (SEQ ID NO:202);
肽FD GPVPPSTALRELIEELVNITQN (SEQ ID NO:203);
肽FE KDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:204);
肽FF RDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFRE (SEQ ID NO:205);
肽FG LDQIPGYLNRIHELLNGTRGLFPG (SEQ ID NO:206);
肽FH SPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPV (SEQ ID NO:207);和
肽FI YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRV (SEQ ID NO:208)。
11.分离的肽,包含:
(i)9到29个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性且
其包含结构式(VIII):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(SEQ ID NO:209)
其中:
X1是Ala(A)、Thr(T)、Ser(S)、Tyr(Y)、Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)或Glu(E);
X2是任意氨基酸;
X3是Ser(S)、Gln(Q)、Asp(D)、Leu(L)、Glu(E)、Cys(C)、Asn(N)、Arg(R)或Ala(A);
X4是Pro(P)、Gly(G)、Gln(Q)、Leu(L)、Thr(T)、Asn(N)、Ser(S)、Phe(F)或Ile(I);
X5是任意氨基酸;
X6是Pro(P)、Ser(S)、Cys(C)、Val(V)、Lys(K)、Thr(T)、Leu(L)、Ile(I)或Gln(Q);
X7是任意氨基酸;
X8是Thr(T)、Pro(P)、Leu(L)、Arg(R)、Gly(G)、Tyr(Y)、Gln(Q)、Glu(E)、Ile(I)或
Ala(A);
X9是任意氨基酸;
X10是Pro(P)、Asn(N)、Glu(E)、Asp(D)、Thr(T)、Leu(L)、Ile(I)、Gln(Q)、Phe(F)或
Trp(W);
X11是Trp(W)、Leu(L)、Ala(A)、Met(M)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)或Tyr(Y);
X12是带负电荷的氨基酸;
X13是带正电荷的氨基酸;
X14是Val(V)、Leu(L)、Ala(A)或Phe(F);
X15是任意氨基酸;
X16是任意氨基酸;
X17是任意氨基酸;
X18是任意氨基酸;
X19是任意氨基酸;
X20是任意氨基酸;
X21是Arg(R)、Asp(D)、Tyr(Y)、Val(V)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Ser(S)或Thr(T);
X22是任意氨基酸;
X23是任意氨基酸;
X24是Leu(L)、Pro(P)、Phe(F)、Arg(R)、Tyr(Y)、Cys(C)、Gly(G)、Val(V)或Lys(K);或(ii)结构式(VIII)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24中的至少一个且最多15个残基被删除;或(iii)结构式(VIII)的改变形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
12.如权利要求11所述的分离的肽,其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列:
肽FJ ARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLL (SEQ ID NO:210);
肽FK ITFEKLVIP (SEQ ID NO:211);
肽FL TAQGEPFPNNLDKLCGPNVTDFPP (SEQ ID NO:212);
肽FM STDQWSELTEAERLQENLQAYRTF (SEQ ID NO:213);
肽FN YGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCR (SEQ ID NO:214);
肽FO LESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKY (SEQ ID NO:215);
肽FP VQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNY (SEQ ID NO:216);
肽FQ ISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVEC (SEQ ID NO:217);
肽FR SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNG (SEQ ID NO:218);
肽FS FNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNV (SEQ ID NO:219);
肽FT ARCQVTLRDLFDRAVVLSHYIHNL (SEQ ID NO:220);
肽FU LDRVYNEEKRYTH (SEQ ID NO:221);
肽FV EANQSTLENFLERLKTIMREKYSK (SEQ ID NO:222);
肽FW LERSGLNIEDLEKLQMARPNILGL (SEQ ID NO:223);
肽FX LWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQG (SEQ ID NO:224);
肽FY TVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKC (SEQ ID NO:225);
肽FZ LHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS (SEQ ID NO:226);和
肽GA LQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEP (SEQ ID NO:227)。
13.分离的肽,包含:
(i)9到29个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性且
其包含结构式(IX):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25(SEQ ID NO:228)
其中:
X1是Cys(C)、Glu(E)、Tyr(Y)或Ala(A);
X2是Ser(S)、Leu(L)或Glu(E);
X3是Arg(R)、Met(M)、Gln(Q)或Asn(N);
X4是Ser(S)、Ile(I)或Leu(L);
X5是Ile(I)、Leu(L)或Lys(K);
X6是Trp(W)、Leu(L)或Lys(K);
X7是Leu(L)、Glu(E)、Phe(F)或Tyr(Y);
X8是Ala(A)、Tyr(Y)、Asn(N)或Phe(F);
X9是Arg(R)、Lys(K)、Pro(P)或Asn(N);
X10是Lys(K)、Ile(I)、Leu(L)或Ala(A);
X11是Ile(I)、Pro(P)、Val(V)或Gly(G);
X12是带正电荷的氨基酸;
X13是极性氨基酸;
X14是带负电荷的氨基酸;
X15是Leu(L)、Ala(A)、Gly(G)或Val(V);
X16是Thr(T)、Asp(D)、Ile(I)或Ala(A);
X17是Ala(A)、Gly(G)、Cys(C)或Asp(D);
X18是Leu(L)、Met(M)、Arg(R)或Asn(N);
X19是Thr(T)、Pro(P)、Asn(N)或Gly(G);
X20是Glu(E)、Ile(I)、Arg(R)或Thr(T);
X21是Ser(S)、Asn(N)、Val(V)或Leu(L);
X22是Tyr(Y)、Val(V)、Thr(T)、Phe(F);
X23是Val(V)、Gly(G)、Asn(N)或Leu(L);
X24是Lys(K)、Asp(D)、Asn(N)或Gly(G);
X25是His(H)、Gly(G)、Val(V)或Ile(I);或
(ii)结构式(IX)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24和X25中的至少一个且最多16个残基被删除;或(iii)结构式(IX)的改变形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24和X25中的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
14.如权利要求13所述的分离的肽,其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列:
肽GB CSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKH (SEQ ID NO:229);
肽GC ELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDG (SEQ ID NO:230);
肽GD YLQLLLFNPLVKTEGICRNRVTNNV (SEQ ID NO:231);和
肽GE AENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGI (SEQ ID NO:232)。
15.分离的肽,包含:
(i)9到29个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性且
其包含结构式(X):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25(SEQ ID NO:233)
其中:
X1是Leu(L);
X2是Gly(G);
X3是Cys(C);
X4是Val(V);
X5是Leu(L);
X6是His(H);
X7是Arg(R);
X8是Leu(L);
X9是Ala(A);
X10是Asp(D);
X11是Leu(L);
X12是带负电荷的氨基酸;
X13是极性氨基酸;
X14是带正电荷的氨基酸;
X15是Leu(L);
X16是Pro(P);
X17是Lys(K);
X18是Ala(A);
X19是Gln(Q);
X20是Asp(D);
X21是Leu(L);
X22是Glu(E);
X23是Arg(R);
X24是Ser(S);
X25是Gly(G);和
(ii)结构式(X)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24和X25中的至少一个且最多16个残基被删除;或(iii)结构式(X)的改变形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24和X25中的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
16.如权利要求15所述的分离的肽,其中该肽具有氨基酸序列:
肽GF LGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERSG (SEQ ID NO:234)。
17.分离的肽,包含:
(i)9到29个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性且
其包含结构式(V):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQ ID NO:119)其中:
X1是Trp(W)、Val(V)、Ala(A)、Ile(I)、Pro(P)、Leu(L)、Ser(S)、Asp(D)或Thr(T);
X2是任意氨基酸;
X3是任意氨基酸;
X4是任意氨基酸;
X5是任意氨基酸;
X6是任意氨基酸;
X7是任意氨基酸;
X8是Ile(I)、Phe(F)、Leu(L)、Val(V)、Pro(P)、Tyr(Y)或Gly(G);
X9是带负电荷的氨基酸;
X10是带负电荷的氨基酸;
X11是Ile(I)、Leu(L)、Ala(A)、Gly(G)、Phe(F)、Val(V)或Pro(P);
X12是Ile(I)、Met(M)、Tyr(Y)、Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Lys(K)、Leu(L)、Glu(E)或
Asp(D);
X13是任意氨基酸;
X14是His(H)、Leu(L)、Pro(P)、Thr(T)、Arg(R)、Cys(C)、Ile(I)、Tyr(Y)、Gln(Q)或
Ala(A);
X15是Leu(L)、Lys(K)、Thr(T)、Val(V)、Phe(F)、Ala(A)或Gln(Q);
X16是Lys(K)、Glu(E)、Met(M)、Gly(G)、Asn(N)、Gln(Q)、Thr(T)或Val(V);
X17是任意氨基酸;
X18是Pro(P)、Lys(K)、Arg(R)、Ile(I)、Asn(N)、Ser(S)、Gln(Q)或Phe(F);
X19是Pro(P)、Ile(I)、Tyr(Y)、Leu(L)、Phe(F)、Ser(S)、Ala(A)、Asp(D)、Asn(N)或
Lys(K);或
(ii)结构式(V)的删除形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18和X19中的至少一个且最多10个残基被删除;或
(iii)结构式(V)的改变形式,其中残基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18和X19中的至少一个且最多八个残基被另一个残基保守取代。
18.如权利要求17所述的分离的肽,其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列:
肽CA KTSWVNCSNMIDEIITHLKQPPLP (SEQ ID NO:124);
肽CB LLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPR (SEQ ID NO:125);
肽CC HQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSF (SEQ ID NO:126);
肽CD DSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLED (SEQ ID NO:127);
肽CE EEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQ (SEQ ID NO:128);
肽CF SNVDKETGEDG (SEQ ID NO:129);
肽CG YSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSK (SEQ ID NO:130);
肽CH FKSPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDA (SEQ ID NO:131);
肽CI LDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALS (SEQ ID NO:132);
肽CJ QALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPD (SEQ ID NO:133);
肽CK LQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFH (SEQ ID NO:134);
肽CL AQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNI (SEQ ID NO:135);
肽CM VPPSTALRELIEELVNITQNQKAP (SEQ ID NO:136);
肽CN IFLDQNMLAVIDELMQALNFNSET (SEQ ID NO:137);
肽CO NSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLC (SEQ ID NO:138);
肽CP FMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTM (SEQ ID NO:137);和
肽CQ CLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKED (SEQ ID NO:136)。
19.分离的肽,包含:
(i)9到29个残基的肽或肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性且
其包含结构式(VI):
X1-X2-(Z)n-X3-X4(SEQ ID NO:137)
其中:n是1-5;
X1是Phe(F)、Val(V)、Ala(A)、Gly(G)、Pro(P)、Leu(L)、Tyr(Y)、Ile(I)、Cys(C)或
Met(M);
X2是带负电荷的氨基酸;
每个Z独立地是任意氨基酸;
X3是带负电荷的氨基酸;
X4是Pro(P)、Met(M)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)、Gly(G)、Leu(L)、Ala(A)、Tyr(Y)或
Trp(W);或
(ii)结构式(VI)的删除形式,其中残基X1、X2、(Z)n、X3和X4中的至少一个且最多两个
残基被删除;或
(iii)结构式(VI)的改变形式,其中残基X1、X2、(Z)n、X3和X4中的至少一个且最多八
个被另一个残基保守取代。
20.如权利要求19所述的分离的肽,其中所述肽具有选自如下的氨基酸序列:
肽CR NETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELY (SEQ ID NO:138);
肽CS NLKDFLLVIPFDCWEPVQE (SEQ ID NO:139);
肽CT RDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQ (SEQ ID NO:140);
肽CU RLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEP(SEQ ID NO:141);
肽CV LPLLDFNNLNGEDQDILMENNLRRPN (SEQ ID NO:142);
肽CW PTRHPIHIKDGDWNEFRRKLTFYLKT (SEQ ID NO:143);
肽CX HVGHVDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCGL (SEQ ID NO:144);
肽CY KHQGLNKNINLDSADGMPVASTDQWS (SEQ ID NO:145);
肽CZ WSELTAEQELQRVAREVH (SEQ ID NO:146);
肽DA LRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQK (SEQ ID NO:147);
肽DB LVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGR (SEQ ID NO:148);
肽DC SNVDKETGEDG (SEQ ID NO:149);
肽DD QEERRRVNGFLDYLQEFLGVMNTEWII (SEQ ID NO:150);
肽DE EEFFRIFNRSIDAFKDFVVASETSDCV (SEQ ID NO:151);
肽DF SRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSC (SEQ ID NO:152);
肽DG YSTVSGDWQLDL (SEQ ID NO:153);
肽DH QFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLG (SEQ ID NO:154);
肽DI QFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGEN (SEQ ID NO:155);
肽DJ KATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA (SEQ ID NO:156);
肽DK SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGLNNY (SEQ ID NO:157);
肽DL FKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKK (SEQ ID NO:158);
肽DM VEIEEQTKRLLEGMELIVSQVHPETK (SEQ ID NO:159);
肽DN GMELIVSQVHPETKENEIYPVWSGLPSL (SEQ ID NO:160);
肽DO PEAIVEERELSQV (SEQ ID NO:161);
肽DP HKCDITLQEIIKTLNSLTEQ (SEQ ID NO:162);
肽DQ AENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEET (SEQ ID NO:163);
肽DR TCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFE (SEQ ID NO:164);
肽DS VPPGEDSKDVAAPHRQPLTS (SEQ ID NO:165);
肽DT RKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPK (SEQ ID NO:166);
肽DU LVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEE (SEQ ID NO:167);
肽DV TCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEE (SEQ ID NO:168);
肽DW IQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKL (SEQ ID NO:169);
肽DX RNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQP (SEQ ID NO:170);
肽DY PLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQ (SEQ ID NO:171);
肽DZ DFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEG (SEQ ID NO:172);
肽EA LEWKTQTDGLEGAAGQ (SEQ ID NO:173);
肽EB TVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQP (SEQ ID NO:174);
肽EC LEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEA (SEQ ID NO:175);
肽ED NSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCIL (SEQ ID NO:176);
肽EE EDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSR (SEQ ID NO:177);
肽EF TTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFC (SEQ ID NO:178);
肽EG AWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPH (SEQ ID NO:179);
肽EH LVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCD (SEQ ID NO:180);
肽EI LQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPD (SEQ ID NO:181);
肽EJ NHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLH (SEQ ID NO:182);和
肽EK LEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKED (SEQ ID NO:183)。
21.分离的肽,其由以下序列组成:
肽IH UEQLERALNSS (SEQ ID NO282)。
22.如权利要求1-20中任一项所述的分离的肽,其中结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、
(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)或(X)的氨基酸序列在1型细胞因子的一级序列中发现。
23.如权利要求22所述的分离的肽,其中所述1型细胞因子是促红细胞生成素、粒
细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介
素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-13、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、生长激素、干细胞因子、瘦素、干扰素γ、催乳素、制瘤素M、血小板生成素、Flt 3配体、白细胞介素-12α亚基、白细胞介素-23亚基p19、或干扰素β。
24.药物组合物,包含如权利要求1-21中任一项所述的分离的肽和药学上可接受的载
体。
25.如权利要求24所述的药物组合物,其中所述组合物配制成供口服、鼻内、经眼、吸
入、经皮、直肠、舌下或肠胃外施用。
26.如权利要求24所述的药物组合物,其中所述组合物被配制为灌液溶液。
27.治疗患有组织损伤相关疾病的个体的方法,该方法包括向该个体施用有效量的如
权利要求1-21中任一项所述的分离的肽或如权利要求24-26中任一项所述的药物组合物
的步骤。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述组织损伤相关疾病是由癌症、缺血性、创伤
性、毒性或炎症性损伤引起的。
29.如权利要求27所述的方法,其中所述组织损伤相关疾病是心血管疾病、心疾病、
呼吸道疾病、肾脏疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病、骨疾病、皮肤疾病、胃肠道疾病、内分泌异常、代谢异常、认知功能障碍、或者中枢或外周神经系统的疾病或病症。
30.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽由不超过30个氨基酸的序列
组成,且包含氨基酸基序:
(a)H1-N1-(X)n-N2-H2,其中n是0-5;(SEQ ID NO:5)
(b)H1-N1-(X)n-N2-L1,其中n是0-5;(SEQ ID NO:12)或
(c)L1-N1-(X)n-N2-H1,其中n是0-5;(SEQ ID NO:13)
且其中H1和H2是疏氨基酸,N1和N2是带负电荷的氨基酸,X是任意氨基酸,且L1是
极性氨基酸;
且其中所述肽具有细胞保护活性。
31.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽由不超过30个氨基酸的序列
组成,且包含氨基酸基序:
(a)H1-N1-(L)n-P1-H2,其中n是0-1;(SEQ ID NO:23)或
(b)H1-P1-(L)n-N1-H2,其中n是0-1;(SEQ ID NO:24)
且其中H1和H2是疏水氨基酸,N1是带负电荷的氨基酸,L1是极性氨基酸,且P1是带正
电荷的氨基酸;
且其中所述肽具有细胞保护活性。
32.如权利要求31所述的方法,其中所述分离的肽是:
肽D(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE,SEQ ID NO:14),
肽A(NITVPDTKVNFYAWKRMEVG,SEQ ID NO:2),
肽B(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV,SEQ ID NO:3),
肽C(GCAEHC SLNENITVPDTKVN,SEQ ID NO:4),
肽E(RYLLUNITTGC,SEQ ID NO:15),
肽IC(QEQLERALNSS,SEQ ID NO:281),
肽IS(CSLNENIQEQLERALNSS,SEQ ID NO:296),
肽IQ(QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR,SEQ ID NO:294),
肽BV(WEHVNAIQEARRLL,SEQ ID NO:114),或
肽BX(KIRSDLTALTESYVKH,SEQ ID NO:116)。
33.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
(i)与SEQ ID NO:1的任何与所述肽具有相同氨基酸残基数目的部分具有低于90%序
列同一性的氨基酸序列;以及
(ii)氨基酸基序:
(a)H1-N1-(X)n-N2-H2,其中n是0-5;(SEQ ID NO:5)
(b)H1-N1-(X)n-N2-L1,其中n是0-5;(SEQ ID NO:12)或
(c)L1-N1-(X)n-N2-H1,其中n是0-5;(SEQ ID NO:13)
且其中H1和H2是疏水氨基酸,N1和N2是带负电荷的氨基酸,X是任意氨基酸,且L1是
极性氨基酸;
且其中所述肽具有细胞保护活性。
34.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
(i)与SEQ ID NO:1的任何与所述肽具有相同氨基酸残基数目的部分具有低于90%序
列同一性的氨基酸序列;以及
(ii)氨基酸基序:
(a)H1-N1-(L)n-P1-H2,其中n是0-1;(SEQ ID NO:23)或
(b)H1-P1-(L)n-N1-H2,其中n是0-1;(SEQ ID NO:24)
且其中H1和H2是疏水氨基酸,N1是带负电荷的氨基酸,L1是极性氨基酸,且P1是带正
电荷的氨基酸;
且其中所述肽具有细胞保护活性。
35.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,该肽的序列不超过30个氨基酸,且
包含氨基酸基序:
(a)H1N1N2H2;
(b)H1N1N2L,;或
(C)L1N1N2H1,
所述基序作为所述肽的三级结构的结果形成使得N1和N2的羰基之间的距离是约3
到约5 其中H1和H2是疏水氨基酸,N1和N2是带负电荷的氨基酸,且L1是极性氨基酸;
而且其中所述肽具有细胞保护活性。
36.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽由不超过30个氨基酸的序列
组成且包含氨基酸基序:
(a)H1N1(L)nP1H2,其中n是0-1;或
(b)H1P1(L)nN1H2,其中n是0-1;
所述基序作为所述肽的三级结构的结果形成使得N1和P1的羰基碳之间的距离是约3
到约5 其中H1和H2是疏水氨基酸,N1是带负电荷的氨基酸,L1是极性氨基酸,且P1是带
正电荷的氨基酸;
且其中所述肽具有细胞保护活性。
37.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
(i)与SEQ ID NO:1的任何与所述肽具有相同氨基酸残基数目的部分具有低于90%序
列同一性的氨基酸序列;以及
(ii)氨基酸基序:
(a)H1N1N2H2;
(b)H1N1N2L1;或
(c)L1N1N2H1,
所述基序作为所述肽的三级结构的结果形成使得N1和N2的羰基碳之间的距离是约3
到约5 其中H1和H2是疏水氨基酸,N1和N2是带负电荷的氨基酸,且L1是极性氨基酸;
且其中所述肽具有细胞保护活性。
38.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包含对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
(i)与SEQ ID NO:1的任何与所述肽具有相同氨基酸残基数目的部分具有低于90%的
序列同一性的氨基酸序列;和
(ii)氨基酸基序:
(a)H1N1(L)nP1H2,其中n是0-1;或
(b)H1P1(L)nN1H2,其中n是0-1;
所述基序作为所述肽的三级结构的结果形成使得N1和P1的羰基碳之间的距离在约3
和约5 之间,其中H1和H2是疏水氨基酸,N1是带负电荷的氨基酸,L1是极性氨基酸,且P1
是带正电荷的氨基酸;
且其中所述肽具有细胞保护活性。
39.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO:34)
其中X1是带电荷的氨基酸残基,X6是疏水氨基酸残基或A,且X2、X3、X4和X5是任意氨
基酸残基。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述分离的肽是:
肽O DSRVLERYLLEAKE (SEQ ID NO:41);
肽P NENITVPDTKVNFYAWKR (SEQ ID NO:42);
肽Q QLHVDKAVSGLRSLTTLLRA (SEQ ID NO:43);
肽R RVYSNFLRGKLKLYTGEA (SEQ ID NO:44);
肽GG DLRVLSKLLRDSHV (SEQ ID NO:235);
肽GH PTPVLLPAVDFSLGEWKTQM (SEQ ID NO:236);
肽GI TAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFL (SEQ ID NO:237);
肽GJ PNRTSGLLETNFTAS (SEQ ID NO:238);
肽GK PSTQPWEHVNAIQEARR (SEQ ID NO:239);
肽GL NETVEVISE (SEQ ID NO:240);
肽GM QTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTM (SEQ ID NO:241);
肽GN KDFLLVIPFDCWEPVQE (SEQ ID NO:242);
肽GO CSRSIWLARKIRSD (SEQ ID NO:243);
肽GP NKNINLDSADGMPVASTD (SEQ ID NO:244);
肽GQ LLQVAAFAYQIEELMILLEYK (SEQ ID NO:245);
肽GR ELSQWTVRSIHDLRFISS (SEQ ID NO:246);
肽GS SERIDKQIRYILDGIS (SEQ ID NO:247);
肽GT AENNLNLPKMAEKD (SEQ ID NO:248);
肽GU EEQARAVQMSTKVLIQ (SEQ ID NO:249)
肽GV RSFKEFLQSSLR (SEQ ID NO:250);
肽GW SCNMIDEIITHLKQ (SEQ ID NO:251);
肽GX ENNLRRPNLEAFNRAVKS (SEQ ID NO:252);
肽GY HIKDGDWNEFRRKLTFYLKT (SEQ ID NO:253);
肽GZ SSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQ (SEQ ID NO:254);
肽HA QQIFNLFTTKDSSAAWDE (SEQ ID NO:255);
肽HB LMNADSILAVKKYFRRITLY (SEQ ID NO:256);
肽HC MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLN (SEQ ID NO:257);
肽HD DRMNFDIPEEIKQLQQFQK (SEQ ID NO:258);
肽HE KLEKEDFTRGKLMSSLHLKR (SEQ ID NO:259);
肽HF FINRLTGYLRN (SEQ ID NO:260);
肽HG CYCQDPYVKEAENLKKYFNA (SEQ ID NO:261);
肽HH ADNGTLFLGILKNWKEESDR (SEQ ID NO:262);
肽HI NSNKKKRDDFEKLTNYSVTD (SEQ ID NO:263);
肽HJ ELSPAAKTGKR (SEQ ID NO:264);
肽HK SLIIGFAAGALYWKKRQPSL (SEQ ID NO:265);
肽HL RNRVTNNVKDVTKLV (SEQ ID NO:266);
肽HM DKLVNIVDDLVECVKE (SEQ ID NO:267);
肽HN SETSDCWSSTLSPEKDSRV (SEQ ID NO:268);
肽HO DELINIIDGVLRDDDKNND (SEQ ID NO:269);
肽HP GLDKNTVHDQEHIMEHLEGV (SEQ ID NO:270);或
肽HQ QLHYFKMHDYDGNNLL (SEQ ID NO:271)。
41.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
A(X)nN(X)oN(X)pB(X)qC,(SEQ ID NO:47)
其中N是Asp(N),A是Leu(L)或Ile(I),X独立地是任意氨基酸,n是2-3,o是0-1,
p是1-7,B是一个或多个带电荷的氨基酸(Asp(D)、Lys(K)、Glu(E)、或Arg(R)),q是4-7,且C是一个或多个疏水氨基酸(Ala(A)、Leu(L)、Ile(I)或Val(V)),其中C距离第二个天
冬酰胺残基6-10个氨基酸。
42.如权利要求41所述的方法,其中所述分离的肽是:
肽U AEHCSLNENITVPDTKU (SEQ ID NO:48);
肽HR CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL (SEQ ID NO:45);
肽HS YVKHQGLNKNINLDSVDGVP (SEQ ID NO:46);
肽HT EALAENNLNLPKMAG (SEQ ID NO:272),
肽HU LQMILNGLNNYKNPKLT (SEQ ID NO:273),
肽HV ILMENNLRRPNL (SEQ ID NO:274),
肽HW FYLRNNQLVAGTL (SEQ ID NO:275),
肽HX YTAQGEPFPNNVELKLCAP (SEQ ID NO:276);
肽HY FNKIEINNKLEFESA (SEQ ID NO:277),或
肽HZ RPNILGLRNNIYCMAQLL (SEQ ID NO:278)。
43.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
X3-X4-X5-G-P-X6-T-W-X7-X8(SEQ ID NO:49)
其中X3可以是C、E、A、α-氨基-γ-溴丁酸、或Hoc,其中Hoc是同型半胱氨酸;
X4可以是R、H、Y、L或W,或X4是键;
X5可以是M、F或I;
X6独立地是20个基因编码的L-氨基酸或立体异构D-氨基酸中的一个;
X7可以是D、E、I、L或V;
且X8可以是C、K、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc,其中Hoc是同型半胱氨酸,条件是X3
或X8是C或Hoc。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述分离的肽是:
肽S GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG (SEQ ID NO:57);
肽T GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:58);
肽U GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID NO:59);
肽V VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:60);
肽W GGVYACRMGPITWVCSPLGG (SEQ ID NO:61);
肽X VGNYMAHMGPITWVCRPGG (SEQ ID NO:62);
肽Y GGTYSCHFGPLTWVCKPQ (SEQ ID NO:63);
肽Z GGLYACHMGPMTWVCQPLRG (SEQ ID NO:64);
肽AA TIAQYICYMGPETWECRPSPKA (SEQ ID NO:65);
肽AB YSCHFGPLTWVCK (SEQ ID NO:66);
肽AC YCHFGPLTWVC (SEQ ID NO:67);
肽AD SCHFGPLTWVCK (SEQ ID NO:68);
肽AE GGTASCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:69);
肽AF GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:70);
肽AG GGTYSCFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:71);
肽AH TYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:72);
肽AI TYSCHFGPLTWVCKPQ (SEQ ID NO:73);
肽AJ YSCHFGPLTWVCKP (SEQ ID NO:74);
肽AK YSCHFGPLTWVC (SEQ ID NO:75);
肽AL YSCHFGALTWVCK (SEQ ID NO:76);
肽AM GGCRIGPITWVCGG (SEQ ID NO:77);
肽AN HFGPLTWV (SEQ ID NO:78);
肽AO GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:79);
肽AP GGTF SCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:80);
肽AQ GGTYSCHFGALTWVCKPQGG (SEQ ID NO:81);
肽AR GGTYSCHFGPATWVCKPQGG (SEQ ID NO:82);
肽AS GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG (SEQ ID NO:83);
肽AT GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG (SEQ ID NO:84);
肽AU GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG (SEQ ID NO:85);
肽AV GGTYSCHFGPLTWVCKAQGG (SEQ ID NO:86);
肽AW GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:87);
肽AX GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:88);
肽AY GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=对-NH2-Phe)(SEQ ID NO:89);
肽AZ GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=对-F-Phe)(SEQ ID NO:90);
肽BA GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=对-I-Phe)(SEQ ID NO:91);
肽BB GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=3,5-二溴-Tyr)(SEQ ID NO:92);
肽BC Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:93);
肽BD GGLYACHMGPMTWVCQPLGG (SEQ ID NO:94);
肽BE LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD (SEQ ID NO:95);或
肽BF GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG (SEQ ID NO:96)。
45.在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症、肿瘤病症、炎症或毒性剂暴露的
方法,该方法包括对所述个体施用有效量的分离的肽,所述肽包含:
XAEHYS(SEQ ID NO:101),
其中X是包含巯基的第一个氨基酸残基;
且Y是包含巯基的第二个氨基酸残基,且其中第一个氨基酸残基的巯基位于与第二个
氨基酸残基的巯基的合适距离处从而与所述肽序列内的所述第二个氨基酸残基的巯基形
成二硫键。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述分离的肽是:
肽BK TTGCAEHCSLNENITVPDTK (SEQ ID NO:102);
肽BL CAEHCSLNENITVPDTKV (SEQ ID NO:103);
肽BM CAEHCS (SEQ ID NO:104);
肽BN GCAEHCSL (SEQ ID NO:105);
肽BO GCAEHCSLNENITVPDTKV (SEQ ID NO:106);
肽BP CAEHCSLNENITVP (SEQ ID NO:107);
肽BQ TTGCAEHC SLNENITVPDTKV (SEQ ID NO:108);
肽BR TTGCAEHCSLNENITVP (SEQ ID NO:109);或
肽BS CAEHCSLNKNINLDSVDGVP (SEQ ID NO:110)。
47.如权利要求28和30-46所述的方法,其中所述组织损伤相关疾病是癌症。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述癌症是浸润性乳腺癌、浸润前乳腺癌、炎症
性乳腺癌、帕哲氏病、转移性乳腺癌、复发性乳腺癌、阑尾癌、胆管癌、肝外胆管癌、结肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌、肾上腺癌、膀胱癌、肾癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、尿路癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌、卵巢癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌、眼癌、头颈部癌、颌癌、喉癌、咽癌、口腔癌、鼻腔癌、唾液腺癌、窦癌、咽喉癌、甲状腺癌、舌癌、扁桃体癌、霍奇金氏病、白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、b-细胞淋巴瘤、淋巴结癌、骨癌、骨肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肉瘤、Ewing’s肉瘤、Kaposi’s肉瘤、脑癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、脑垂体癌、脊髓癌、肺癌、腺癌、燕麦细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌或间皮瘤。
49.如权利要求28和30-46中所述的方法,其中所述组织损伤相关疾病是炎症。
50.如权利要求49所述的方法,其中所述炎症是阑尾炎,睑缘炎,支气管炎,滑囊炎,
子宫颈炎,胆管炎,胆囊炎,绒毛膜羊膜炎,结膜炎,膀胱炎,泪腺炎,皮炎,心内膜炎,子宫内膜炎,上髁炎,附睾炎,纤维组织炎,胃炎,牙龈炎,舌炎,化脓性汗腺炎,虹膜炎,喉炎,乳腺炎,心肌炎,肌炎,肾炎,脐炎,卵巢炎,睾丸炎,骨炎,炎,腮腺炎,心包炎,腹膜炎,咽炎,胸膜炎,静脉炎,局限性肺炎(肺炎),前列腺炎,肾盂肾炎,鼻炎,输卵管炎,鼻窦炎,口腔炎,滑膜炎,扁桃体炎,葡萄膜炎,尿道炎,阴道炎,外阴炎,哮喘,全身性红斑狼疮,重症肌无炎,血管炎,慢性支气管炎,胰腺炎,骨髓炎,类湿性关节炎,皮癣关节炎,肾小球性肾炎,视神经炎,颞动脉炎,脑炎,脑膜炎,横贯性脊髓炎,皮肌炎,多发性肌炎,坏死性筋膜炎,肝炎,坏死性小肠结肠炎,盆腔炎,炎症性肠炎,溃疡性结肠炎,节段性肠炎,回肠炎,小肠炎,直肠炎,血管炎,血管狭窄,再狭窄,低血压,1型糖尿病,川崎病,Decum’s病,慢性阻塞性肺病,牛皮癣,动脉粥样硬化,硬皮病,干燥综合征,混合性结缔组织病,酒糟鼻,胃溃疡,十二指肠溃疡,阿尔茨海默氏病,成人发作型Still病,急性视网膜色素上皮炎,Tietze’s综合征,Bechcet’s病,白点综合征,急性后部多灶性鳞状色素上皮病变,匍行性脉络膜炎,枪弹样脉络膜视网膜病变,伴有全葡萄膜炎的多灶性脉络膜炎,弥漫性视网膜下纤维化
综合征,点状内部脉络膜病变,多发性一过性白点综合征,弥漫性单侧亚急性视神经视网膜炎,环状肉芽肿,肠易激综合征,肠胃炎,Grave’s病,多发性硬化,Dupuytren’s挛缩症,移植物排斥疾病,同种异体移植排斥,移植物抗宿主病,皮肤移植物排斥,固体器官移植排斥,骨髓移植排斥,炎症性皮肤病,病毒性皮肤病例如源自人乳头瘤病毒、HIV或RLV感染
的病,细菌性、真菌性和/或其它寄生性皮肤病,皮肤红斑狼疮,高IgG4疾病,过敏,过敏性疾病,钝性创伤导致的炎症,挫伤导致的炎症,过敏导致的炎症,风湿性疾病,儿童关节炎,类风湿性关节炎,Churg-Strauss综合征,纤维肌痛,巨细胞(颞)动脉炎,痛风,过敏性紫癜,过敏性血管炎,强直性脊柱炎,囊炎,风湿热,风湿性心脏病,全身性红斑狼疮,风湿性多肌痛,骨关节炎,结节性多动脉炎,Reiter’s综合征,运动相关损伤,跑步膝,网球肘,冻结肩,跟腱炎,足底筋膜炎,滑囊炎,Osgood-Schlatter病,重复受压损伤,累积性创伤疾病,局限性肌张力障碍,腕管综合征,交叉综合征,反射性交感神经营养不良综合征,狭窄性腱鞘炎,De Quervain’s综合征,扳机指/扳机拇指,胸出口综合征,腱炎,腱鞘炎,桡管综合征,Raynaud’s病,腱鞘囊肿,gamer’s拇指,Wii-itis,感染导致的炎症。
51.如权利要求28和30-46所述的方法,其中所述组织损伤相关疾病由暴露于毒性剂
引起。
52.如权利要求51所述的方法,其中所述毒性剂是生物制剂、化学药剂或辐射剂。
53.如权利要求27和30-46所述的方法,其中所述个体是哺乳动物
54.如权利要求53所述的方法,其中所述哺乳动物是人。
55.保护、维持或增强从哺乳动物分离的应答细胞、组织或器官的活力的方法,该方法
包括将该细胞、组织或器官暴露于如权利要求24、25或26所述的药物组合物。
56.分离的核酸,所述核酸包含编码如权利要求1-21中任一项所述的分离的肽的核苷
酸序列。
57.表达载体,其包含如权利要求56所述的核酸。
58.宿主细胞,其包含如权利要求57所述的表达载体。
59.重组制备分离的肽的方法,该方法包括从如权利要求58所述的宿主细胞分离所述
肽的步骤。
60.如权利要求1-21所述的分离的肽,其中所述两亲性肽螺旋包含氨基酸序列
ALSILVLLQAGS(SEQ ID NO:283);VALLPCPPCRA(SEQ ID NO:284);NAIIKNAYKKG(SEQ ID NO:
285);GSWQRSLQDTE(SEQ ID NO:286);GGSAARPAPP(SEQ ID NO:287);NALAENDTPYY(SEQ ID NO:288);GALAEAYPSKP(SEQ ID NO:289);GCSSQHWSYGL(SEQ ID NO:290);VMIVMLAICFL(SEQ ID NO:291);LRRYINMLTRP(SEQ ID NO:292);或LALSILVLYQA(SEQ ID NO:293)。

说明书全文

用于预防治疗组织损伤相关疾病和病症的组织保护肽和

肽类似物

[0001] 本申请对2008年1月22日提交的美国临时申请号61/062,012,2008年1月22日提交的61/062,022;2008年1月22日提交的61/062,045;2008年7月3日提交的
61/133,912;和2008年12月30日提交的61/203,890主张优先权,所述申请的内容通过参考被完整并入本文。
[0002] 1.引言
[0003] 本发明提供了用于预防或治疗组织损伤相关疾病或病症和/或其损伤、效应或症状(包括但不限于癌症、炎症和暴露于毒性剂)的组织保护肽和肽类似物。特别地,本发明提供了与I型细胞因子受体配体的片段具有一致序列的组织保护肽和肽类似物,其具有很少或不具有全长配体的可能不希望的造血效应。
[0004] 这些肽还包括设计用于模拟组织保护受体配体(例如EPO)内关键基酸残基的空间位置的片段、嵌合体和肽。本发明进一步提供了使用这些肽调节由组织损伤相关疾病或病症导致的个体应答和/或症状的方法和用途,以治疗、预防或改善该疾病或病症。
[0005] 另外,本发明提供了用于在有此需要的个体中治疗组织损伤相关疾病或病症或其损伤、效应或症状(包括但不限于癌症、炎症和暴露于毒性剂)的药物组合物,其包含肽和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0006] 2.发明背景
[0007] 组织损伤可因为缺血性、创伤性、毒性或炎症性损伤造成的组织的实质性损失而引起,其中组织内的细胞通过凋亡或坏死而被破坏。组织损伤可发生在许多急性和慢性疾病和状况中。发生组织损伤的程度被许多因素调节,包括疾病或伤害的类型、疾病或伤害相关炎症或创伤的平或严重程度、组织损伤的位置、和组织的血管充足性。
[0008] 最近的证据提出,1型细胞因子家族成员——通常与维持血细胞比率相关的促红细胞生成素(EPO)可能也通过与其受体EPOR的相互作用在减轻组织损伤中发挥重要作用(Brines等,2004,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101(41):14907-12)。尽管假设EPO可能提供补偿性应答,所述能够改善缺的细胞环境并调节由代谢应激造成的程序性细胞死亡,基础的分子机制尚待清楚的理解。
[0009] 基于该观察,研究者已经探索了EPO在各种适应症中的用途。例如,基于观察到用于在肿瘤患者中治疗贫血的EPO不仅改善了贫血还改善了肿瘤患者的健康状况,研究者已经探索EPO作为癌症的潜在疗法的用途。(参见美国专利号6,579,525和Blau C.A.,2007,Stem Cells 25(8):2094-7)。Haran-Ghera等的美国专利号6,579,525涉及将重组EPO用于治疗多发性骨髓瘤的用途并假设EPO诱发对肿瘤的免疫应答。另外,美国专利申请号11/093,177(公开号US 2005/0267027)公开了EPO通过降低肿瘤中的HIF-1α和/或
VEGF的表达来抑制肿瘤中的血管生成的用途。
[0010] 但是,由于其红细胞生成效应,作为潜在的组织保护剂的EPO存在严重的问题。尤其对于长期给药(例如在诸如癌症和炎症的适应症中所预见的),频繁使用治疗剂量的EPO可能显著地增加个体的血细胞比率,这可能导致高血压癫痫和血管栓塞。
[0011] 此外,对于癌症,还没有认识到EPO作为治疗剂的潜能。已经确定,数种类型的癌症(例如乳腺癌)表达而且倾向于过度表达促红细胞生成素受体。这导致了这样的担忧:将EPO治疗性地用于治疗癌症会导致肿瘤的进一步生长,而非导致肿瘤发展的衰退(参见Blau,2007,同上,和美国专利申请号10/432,899,作为US 2005/0260580公开)。随着EPO在各种癌症适应症中的数次试验由于肿瘤生长导致死亡率升高(Blau)而被停止,这一担忧已经在临床被证实(Blau)。鉴于这些不良的临床结果,FDA已经在已批准的EPO产品上附上了一个黑框,警告不得将它们用于未经批准的癌症适应症。
[0012] 另外,成熟人体的EPO蛋白是165个氨基酸的蛋白,经质谱测量具有约30.4kDa的分子量。重组的蛋白可以通过高度规范的、昂贵的且劳动强度大的工艺在中国仓鼠卵巢细胞中生产。此外,EPO必须在严格条件下贮存以维持其活性。考虑到这些限制,EPO不是解决公共紧急事件(例如,毒性剂(例如辐射或化学药剂)的释放,无论由于工业事故还是恐怖主义行动或战争)的理想候选物,公共紧急事件需要快速大量生产治疗剂以供广泛分发。
[0013] 因此,对具有很少或不具有潜在有害效应且可以被公众方便获得的组织保护治疗存在需要。
[0014] 3.概述
[0015] 本发明提供了分离的肽和肽类似物,其在应答细胞、组织或器官中具有组织保护活性。在某些实施方案中,肽和肽类似物具有很少或不具有可能不被期望的造血效应。特别地,本发明提供了与EPO和I型细胞因子受体配体的一部分具有一致序列的组织保护肽和肽类似物。在某些实施方案中,分离的肽或肽类似物包含9到29个残基的氨基酸序列,其特征在于核心结构基序选自:(1)两个带负电荷的氨基酸和(2)一个带正电荷的氨基酸和一个带负电荷的氨基酸。核心带电荷的氨基酸如下所述通过7到27个氨基酸侧翼连接。在某些实施方案中,核心带电荷的氨基酸直接彼此相邻。在某些实施方案中,带电荷的氨基酸被1到5个氨基酸或被单个极性氨基酸分开。
[0016] 在某些方面,本发明提供了分离的肽和肽类似物,其具有至少一种组织保护活性。示范性的组织保护活性包括但不限于保护、维持、增强和恢复应答的哺乳动物细胞、组织或器官的功能或活。因此,一方面,本发明提供了本发明的分离的肽和肽类似物在制备用于保护、维持、增强或恢复应答的哺乳动物细胞及其相关的细胞、组织和器官的功能或活力的药物组合物中的用途。在相关的实施方案中,将组合物施用给有此需要的个体。
[0017] 在其它方面,本发明的分离的肽和肽类似物也具有很少的或不具有红细胞生成活性,例如它们不会显著地增加个体的血红蛋白或血细胞比率,或更一般地,具有很少的或不具有造血活性,例如它们不会显著地增加血细胞成分例如红系、淋巴样和髓细胞。在具体实施方案中,分离的肽和肽类似物具有很少的或不具有选自以下的活性:血管活性作用(例如血管收缩)、过度活化的血小板、促凝血活性、和刺激血小板或红细胞生成依赖性细胞的增殖或产生(参见Coleman等,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:5965-5970)。
[0018] 本发明也提供了药物组合物,其包含这些组织保护肽和肽类似物、和药学上可接受的载体赋形剂或稀释剂,以及制备这些组合物的方法和它们在治疗组织损伤相关疾病和病症中的用途。在其它方面,本发明提供了使用本文描述的分离的肽或肽类似物制备药物组合物的方法,该药物组合物用于在有此需要的个体中针对应答性组织损伤进行保护或预防,恢复或复原应答组织或应答组织功能。在一具体方面,应答哺乳动物细胞及其相关的细胞、组织或器官凭借紧密的内皮细胞屏障位于血管远端。在另一具体方面,细胞、组织、器官或其它身体部分(例如准备用于移植的那些)是从哺乳动物身体分离的。在本发明的某些方面,可兴奋组织是中枢神经系统组织、外周神经系统组织、心脏组织或视网膜组织。在另一方面,应答细胞或其相关细胞、组织或器官不是可兴奋细胞、组织或器官,它们也不主要地包含可兴奋细胞或组织。
[0019] 在另一实施方案中,本发明涉及通过施用有效量的肽在有此需要的患者中预防、治疗、改善或控制炎症、癌症或肿瘤病症、或对毒性剂的暴露的方法上。
[0020] 在某些实施方案中,本发明涉及调节癌症介质、毒性剂的身体应答的介质和炎症介质的活性的方法。特别地,本发明涉及调节炎症介质的活性。优选地,本发明的肽能够调节一种或多种炎症介质的效应。
[0021] 在另一个实施方案中,本发明涉及抑制细胞生长的方法,该方法包括将需要抑制生长的细胞与有效量的肽接触
[0022] 在另一个实施方案中,本发明涉及引起癌症或肿瘤细胞死亡的方法,该方法包括将癌症或肿瘤细胞与有效量的肽接触。
[0023] 在另一个实施方案中,本发明涉及抑制血管生成癌或肿瘤细胞、或减少引起有丝分裂或血管新生的分子的生成的方法。
[0024] 在另一个实施方案中,本发明涉及治疗或预防化疗或放疗相关副作用的方法,该方法包括对需要此类治疗或预防的患者施用有效量的肽。化疗或放疗相关副作用包括恶病质、低血球计数、恶心、腹泻、口腔损害和脱发。
[0025] 在另一个实施方案中,本发明涉及在患者中治疗或预防癌症或肿瘤疾病的方法,该方法包括将癌症或肿瘤细胞与有效量的肽接触。
[0026] 在另一个实施方案中,本发明涉及在患者中治疗或预防癌症或肿瘤疾病的方法,该方法包括对需要此类治疗或预防的患者施用有效量的肽。
[0027] 在某些实施方案中,本发明涉及肽在制备用于在有此需要的个体中预防、治疗、改善或控制癌症或肿瘤病症的药物组合物中的用途。
[0028] 在另一个实施方案中,本发明涉及治疗或预防炎症或炎性状况相关的症状的方法。在进一步的实施方案中,本发明涉及在有此需要的患者中治疗或预防炎症或炎性状况的方法。通过本方法可治疗的炎性状况包括过敏和过敏性疾病、湿性疾病、和运动相关损伤。
[0029] 在另一个实施方案中,本发明涉及在需要治疗的人中治疗、预防、改善或控制暴露于毒性剂后的效应的方法。考虑的毒性剂包括生物、化学和放射性制剂。
[0030] 在某些实施方案中,本发明还涉及用于向有此需要的个体施用的药物组合物,其包含前述的分离的肽。在依照该实施方案的具体方面,本发明的药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。这些药物组合物可以经配制供口服、鼻内、经眼、吸入、经皮、直肠、舌下、阴道、或肠胃外施用,或配制成灌流溶液形式用于维持离体细胞、组织或器官的活力。在本发明的相关实施方案中,个体是哺乳动物,优选地是人。
[0031] 参考以下说明和所附的权利要求,将可以更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点。
[0032] 4.缩写和术语
[0033] 4.1缩写
[0034] 本文使用的对基因编码的L-对映异构氨基酸的缩写是常规的,且如下所示:
[0035] 氨基酸 单字母符号 常用缩写
[0036] 丙氨酸 A Ala
[0037] 精氨酸 R Arg
[0038] 天冬酰胺 N Asn
[0039] 天冬氨酸 D Asp
[0040] 半胱氨酸 C Cys
[0041] 谷氨酰胺 Q Gln
[0042] 谷氨酸 E Glu
[0043] 甘氨酸 G Gly
[0044] 组氨酸 H His
[0045] 异亮氨酸 I Ile
[0046] 亮氨酸 L Leu
[0047] 赖氨酸 K Lys
[0048] 甲硫氨酸 M Met
[0049] 苯丙氨酸 F Phe
[0050] 脯氨酸 P Pro
[0051] 丝氨酸 S Ser
[0052] 苏氨酸 T Thr
[0053] 色氨酸 W Trp
[0054] 酪氨酸 Y Tyr
[0055] 缬氨酸 V Val
[0056] 焦谷氨酸 U pGlu(Glp)
[0057] 4.2术语
[0058] 除非另外定义,本文使用的所有科技术语具有本发明所属领域技术人员一般理解的含义。除非另外指定,本文使用的以下术语具有属于它们的含义。
[0059] (i)本文使用的术语“约”或“大约”,当与数字联合使用时,指在所涉及的数字的1、5、10、15或20%范围内的任何数字。
[0060] (ii)在本发明的方法的上下文中,术语“联合施用”指在疾病、病症或状况发作之前、同时、和/或之后施用化合物。
[0061] (iii)术语“过敏原”指能够产生即时型超敏应答(过敏)的抗原物质。常见过敏原包括但不限于细菌、病毒、动物寄生物、昆虫和昆虫螫刺、化学物质(胶乳)、灰尘、尘螨、霉菌、动物皮屑、药物(例如抗生素、血清、磺胺药、抗惊厥剂、胰岛素制剂、局部麻醉剂、碘酒、和阿司匹林)、食物(例如奶、巧克力、草莓、蛋、大豆、果仁、鱼、贝类、小麦)、香料、植物、花粉、和烟。
[0062] (iv)术语“过敏性疾病”指由过敏引起或与其相关的状况或疾病。过敏性疾病包括但不限于哮喘、过敏性病、鼻炎、鼻窦炎、特应性湿疹、接触性皮炎、过敏性结膜炎(间歇性和持续性)、春季结膜炎(枯草热)、特应性膜结膜炎、巨乳突状结膜炎、风疹(荨麻疹)、血管性水肿、过敏性肺炎、嗜酸性支气管炎、血管炎、过敏性血管炎、抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的血管炎、Wegner′s肉芽肿病、变应性肉芽肿性血管炎、显微镜下多血管炎、颞动脉炎、乳糜泻、肥大细胞增多症、和过敏反应。
[0063] (v)术语“过敏症状”或“过敏反应”指身体对过敏原的应答。过敏反应可以局限在一个区域(与过敏原接触的皮肤)或遍布全身。过敏反应可以包括但不限于皮疹、发痒、荨麻疹、肿胀、呼吸困难、哮喘、血管性水肿、吞咽困难、鼻塞、流鼻涕、呼吸短促、恶心、胃痉挛、腹部疼痛、呕吐和/或低血压。
[0064] (vi)术语“过敏”指由于暴露于特定抗原(过敏原)导致对随后的暴露发生有害的免疫反应而诱发的过敏性状况。
[0065] (vii)术语“氨基酸”或对具体氨基酸的任何提及,意味着包括天然存在的能生成蛋白(proteogenic)的氨基酸和非天然存在的氨基酸例如氨基酸类似物。本领域技术人员将知道,除非另外具体指明,该定义包括天然存在的能生成蛋白的(L)-氨基酸、其光学(D)-异构体、化学修饰的氨基酸包括氨基酸类似物例如青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)、天然存在的不能生成蛋白的氨基酸例如正亮氨酸、和具有本领域已知的氨基酸特征性性质的化学合成的氨基酸。另外,术语“氨基酸等同物”指与天然存在的氨基酸的结构不同的化合物,但其基本上具有氨基酸的结构,由此它们可以在肽内被取代,且尽管发生取代,肽仍保持其生物活性。因此,例如,氨基酸等同物可以包括具有侧链修饰或取代的氨基酸,而且也包括相关的有机酸、酰胺等。术语“氨基酸”意在包括氨基酸等同物。术语“残基”指氨基酸和氨基酸等同物两者。如本领域惯常已知的,氨基酸也可以归入以下各组:(1)酸性的=Asp、Glu;(2)性的=Lys、Arg、His;(3)非极性(疏水的)=Cys、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp、Gly、Tyr;和(4)不带电且极性的=Asn、Gln、Ser、Thr。非极性可以细分成:强疏水的=Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe;和适度疏水的=Gly、Pro、Cys、Tyr、Trp。作为替代方式,所有氨基酸可以分组为(1)酸性的=Asp、Glu;(2)碱性的=Lys、Arg、His、(3)脂肪族的=Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr,其中Ser和Thr任选地可被单独分组为脂肪族-羟基的;(4)芳香族的=Phe、Tyr、Trp;(5)酰胺=Asp、Glu;和(6)含硫的=Cys和Met。(参见,例如,Biochemistry,第4版,L.Stryer编,WH Freeman and Co.,1995,其通过参考被完整并入本文)。
[0066] (viii)本文使用的术语“生物制剂”指活着的生物体或源自它们的材料(例如细菌、病毒、真菌和毒素),所述生物体或材料在人、动物或植物中引起疾病或对其造成伤害,或引起材料变质。这些生物制剂在自然界中普遍存在,且可被设计或优化用于战争或恐怖主义(生物恐怖主义)。这些生物制剂可以由朊病毒、病毒、微生物(细菌和真菌)、和一些单细胞和多细胞的真核生物(即寄生虫)组成。特别地,生物制剂(在可行时,通过其通用名、生物学名称和NATO标准参考字母代码识别)可以包括但不限于真菌制剂(球孢子菌病(Coccidioides mycosis)、OC、Coccidioides posadasil、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)),细菌制剂(炭疽(皮肤、吸入、胃肠道)(炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、N和TR)、鼠疫(腺鼠疫、肺鼠疫)(鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、LE)、野兔热(土拉弗氏菌(Francisella tularensis)、UL(schu S4)、TT(湿型)、ZZ(干型)和SR和JT(425))、霍乱(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、HO)、牛布鲁氏菌病(AB)、猪布鲁氏菌病(US和NX)、山羊布鲁氏菌病(AM和BX)、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、他布鲁氏菌(Brucella melitenis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、细菌性痢疾(志贺氏菌病、弯曲菌病、沙氏菌病)(Y)、鼻疽(鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、LA)、类鼻疽(类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、HI)、白喉(白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、DK)、李斯特菌病(单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、TQ))、衣原体剂(鹦鹉病“鹦鹉热”(鹦鹉热衣原体(Chlamydophilia psittici)、SI)、立克次体剂(落矶山斑疹热(立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、RI和UY)、Q热(贝氏柯克斯体(Coxiella burnetti)、OU、MN(湿型)、和NT(干型))、人斑疹伤寒(普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、YE)、鼠斑疹伤寒(斑疹伤寒立克次体(Rickettsiatyphi)、AV))、病毒制剂(黄热病(黄病毒科虫媒病毒(Arbovirus flavivirdae)、OJ、UT和LU)、裂谷热(RVF白蛉热病毒属布尼病毒科(Phelbovirusbunyaviridae)、FA)、甲病毒(例如:东方马脑炎(ZX)、西方马脑炎、委内瑞拉马脑炎(NU、TD和FX))、天花(ZL)、日本乙型脑炎(AN)、猕猴疱疹病毒1(乙型疱疹病毒)、克里米亚-刚果出血热病毒、病毒性出血热(丝状病毒科(Filoviridae)(埃博拉和马尔堡病毒)和沙粒病毒科(Arenaviridae)(拉沙和马丘波))、猴痘病毒、重构的1918流感病毒、南美出血热病毒(Flexal、瓜纳里托(Guanarito)、鸠宁(Junin)、马丘波(Machupo)、Sabia)、蜱媒脑膜脑炎(TEBV)病毒(中欧蜱媒脑炎、远东蜱媒脑炎、Kyasanur森林病、鄂木斯克出血热、俄罗斯春夏病毒)、亨得拉病毒、尼帕病毒、汉坦病毒(朝鲜出血热)、非洲马瘟病毒、优化猪瘟病毒、赤羽病病毒、禽流感病毒、蓝舌病毒、骆驼痘病毒、古典猪瘟病毒疫病毒、山羊痘病毒、结节性皮肤病病毒、恶性卡他热病毒(狷羚疱疹病毒1型)、Menangle病毒、新城疫病毒、小反刍兽疫病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、绵羊痘病毒、猪水疱病病毒、水疱性口炎病毒)、毒素(肉毒杆菌毒素(梭菌,X和XR)、蓖麻毒素(蓖麻(Ricinus communis),W和WA)、葡萄球菌肠毒素B(UC和PG)、石房蛤毒素(麻痹性贝毒)(TZ和SS)、河豚毒素(PP)、芋螺毒素、产气荚膜梭菌ε毒素、tricothecene真菌毒素(T-2毒素)、志贺毒素)、和simuants(molasisresidium(MR)、球芽孢杆菌(Bacillus globigii)(BG、BS和U)、沙雷菌(Serratiamarescens)(SM和P)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)突变体C-2(AF)、大肠杆菌(EC)、Bacillus thursidius(BT)、草生欧文氏菌(EH)、荧光微粒(FP))、黑麦麦角病、麻风、狂犬病、肠伤寒、产气荚膜梭菌(气性坏疽)、黄曲霉毒素、鼠伤寒沙门氏菌、肠毒素、阿根廷出血热、耐多药肺结核(MTB)、玻利维亚出血热、嗜肺性军团菌、海生毒素、脚气、疟疾、糙皮病、登革热、sclerotium rolfoil、神经营养性脑炎、志贺氏菌(Y)、SEB(UC)、和真菌毒素、蛇形菌素、反刍动物考德里氏体(Cowdria ruminantium)、山羊支原体(Mycoplasma capricolum)M.F38/山羊丝状支原体(M.Mycoides Capri)、丝状支原体(Mycoplasma mycoides)丝状、相思豆毒素。生物制剂可以靶向人(例如天花、埃博拉病毒、重构的1918流感病毒、蓖麻毒素等)、动物例如家畜(例如非洲马瘟病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病等)或两者(东方马脑炎病毒等)。此外,考虑到它们可能被重新工程化以产生更强致命性从而被用作生物武器,即使非致命性生物制剂也可能具有威胁。因此,即使造成普通感冒的病毒也可能具有风险。
[0067] (ix)本文使用的术语“癌症”指任何呈现如下恶性性质的异常生长:(1)不受正常限制地生长和分裂的能力,(2)入侵并破坏邻近组织的能力,以及(3)在一些例子中,扩散到身体中其它部位的能力。癌症包括中枢神经系统、外周神经系统、胃肠道/消化系统、泌尿生殖器系统、妇科、头颈部、血液/血、肌肉骨骼/软组织、呼吸道、和乳房的癌症或肿瘤病症。癌症或肿瘤病症的进一步例子包括但不限于脑(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤)、脊髓、脑垂体、乳房(浸润性、侵袭前、炎性癌症、帕哲氏病、转移性和复发性乳腺癌)、血(霍奇金氏病、白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤)、淋巴结癌、肺(腺癌、燕麦细胞、非小细胞、小细胞、鳞状细胞、间皮瘤)、皮肤(黑色素瘤、基底细胞、鳞状细胞、Kapsosis肉瘤)、骨癌(Ewings肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤)、头颈部(喉、咽(鼻腔&窦腔)、和食道癌)、口腔(颌、唾液腺、咽喉、甲状腺、舌、和扁桃体癌)、眼、妇科(子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢、子宫、阴道、和外阴)、泌尿生殖系统(膀胱、肾、阴茎、前列腺、睾丸、和尿路癌)、肾上腺(皮质腺瘤、皮质癌、嗜铬细胞瘤)和胃肠道(阑尾、胆管(肝外胆管)结肠、胆囊、胃、肠、结肠、肝、胰腺、直肠、和胃癌)的癌症或肿瘤病症,以及下面列举的癌症或肿瘤病症:(关于这些病症的综述,参见Fishman等,1985,Medicine,第2版,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia):白血病:急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、髓单核细胞性白血病、单核细胞性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病;真性红细胞增多症;胃癌;淋巴瘤(恶性和非恶性):霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、Waldenstrom’s巨球蛋白血症、重链病;
固体肿瘤肉瘤和癌:纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、恶性血管内皮细胞瘤、内皮肉瘤、淋巴管恶性肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing′s肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突状癌、乳突状腺癌(囊腺癌)、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、子宫颈腺癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺腺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、恶性神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、多形性星形细胞胶质瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、或成视网膜细胞瘤。
[0068] (x)本文使用的术语“化学药剂”指对人或动物造成严重死亡或伤害的化学物质。当化学药剂已经优化到通过武器或散布装置投递的程度时,该药剂是化学武器。一般而言,用作武器的化学药剂可以根据其作用方法分类,例如:血液试剂、糜烂剂、神经试剂、肺部试剂、和失能剂。可行时,以下各种化学药剂通过其NATO标准参考字母代码识别。
[0069] (xi)“血液试剂”指阻止细胞使用氧气的化学药剂。该类中的化学药剂包括但不限于胂(亚当氏毒气(二苯胺氯胂)、Clark I(二苯氯胂)、Clark II(二苯氰胂))和氰化物(氯化氰(CK)、氰化氢(AC)等)化合物。胂化合物引起血管内溶血,导致肾衰竭。氰化物化合物阻止细胞使用氧气,然后细胞被迫采用缺氧呼吸,产生过量乳酸,导致代谢酸中毒。血液试剂的受害者可能呈现的症状包括但不限于头痛、眩晕、恶心、呕吐、粘膜刺激、呼吸困难、意识障碍、昏迷、惊厥、过速-和过缓-心律异常、低血压、心血管性虚脱、和acyanosis。
[0070] (A)“神经试剂”指使乙酰胆碱酯酶失活的化学药剂。神经递质乙酰胆碱在受害者的突触中累积,导致毒蕈碱和烟碱效应。该类中的化合物包括但不限于环沙林(甲氟膦酸环己酯,GF)、沙林(甲氟膦酸异丙酯,GB)、硫代沙林、索曼(甲氟磷酸叔己酯,GC)、塔崩(N,N-二甲氨基氰磷酸乙酯,GA)、VX(O-乙基-[s]-[2-二异丙基氨乙基-甲基硫代膦酸酯)、VR(N,N-二乙基-2-(甲基-(2-甲基丙氧基)磷酰基)硫基乙胺)、VE(O-乙基-S-[2-(二乙基氨基)乙基]硫代膦酸酯)、VG(O,O-二乙基-S-[2-(二乙基氨基)乙基]硫代磷酸酯)、VM(O-乙基-S-[2-(二乙基氨基)乙基]甲基硫代膦酸酯)、乙基沙林(乙氟膦酸异丙酯,GE)、EDMP(乙基-2-二异丙基氨基乙基甲基膦酸酯)、DF(甲基膦酰二氟)、诺维乔克(Novichok)剂、GV(P-[2-(二甲基氨基)乙基]-N,N-二甲基膦酰胺氟)、Gd42、Gd83、Tammelin酯、氟磷酸胆碱、磷酸硫代胆酸酯(phosphothiocholates)、DFP、和杀虫剂(吩噻嗪、有机磷酸酯(dichorous、马拉硫磷、对硫磷、倍硫磷、美沙、对硝苯磷酯、毒死蜱、内吸磷、焦磷酸、TOCP))。神经试剂的受害者可能呈现的症状包括但不限于心动过缓、瞳孔缩小、唾液分泌过多、呕吐、腹泻、无意识的排尿、肌肉颤抖、初始去极化的弛缓性麻痹、棘波放电和惊厥、中间综合征、神经毒性酯酶抑制、和有机磷酸酯诱发的延迟的神经病变。
[0071] (B)“糜烂剂”指是成酸化合物的试剂,其损伤受害者的皮肤和呼吸系统,导致灼烧和呼吸问题。该类中的化学药剂包括但不限于硫芥子气(1,2双(2-氯乙硫基)乙烷(倍半芥子气,Q)、1,3双(2-氯乙硫基)-正丙烷、1,4-双(2-氯乙硫基)-正丁烷、1,5-双(2-氯乙硫基)-正戊烷、2-氯乙基氯甲基硫化物、双(2-氯乙基)硫化物(HD)、双(2-氯乙硫基)甲烷、双(2-氯乙基硫甲基)醚、双(2-氯乙基硫乙基)醚、二-2’-氯乙基硫化物、及其组合(HT、HL、HQ))、氮芥(双(2-氯乙基)乙胺(HN1)、双(2-氯乙基)甲胺(HN2)、三(2-氯乙基)胺(HN3)、2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺-N-氧化物盐酸盐、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、乌拉莫司汀、美法仑)、路易式毒气(2-氯乙烯基二氯胂、双(2-氯乙烯基)氯胂、三(2-氯乙烯基)胂、二氯(2-氯乙烯基)胂)、乙基二氯胂、甲基二氯肿、苯基二氯胂、和光气肟(二氯甲肟)。糜烂剂的受害者可能呈现的症状包括但不限于红斑、水肿、坏死和水疱、黑皮病、气管支气管炎、支气管痉挛、支气管阻塞、出血性肺水肿、呼吸衰竭、细菌性肺炎、眼红斑、流泪、眼部不适、眼中严重疼痛、眼睑痉挛、虹膜炎、失明、恶心、呕吐、骨髓抑制、路易式毒气休克、肝坏死、和低灌注继发的肾衰竭。
[0072] (D)“肺部试剂”指与糜烂剂相似但对呼吸系统具有更显著作用并导致呼吸系统充水和受害者窒息的试剂。该类中的化学药剂包括但不限于亚当氏毒气、丙烯醛、双(氯甲基)醚、氯气、三氯硝基甲烷、diphosphogene、氯磺酸甲酯、氯化、氯化氢、氮氧化物、和光气。肺部试剂的受害者可能呈现的症状包括但不限于灼烧感(眼、鼻咽、口咽)、大量流泪、鼻溢、嘶哑咳嗽、呼吸困难、吞咽痛、结膜炎、角膜损伤、鼻-口咽损伤/水肿、声门结构的炎症引起的呼吸窘迫、分泌、和/或喉痉挛、急性呼吸道综合征、和反应性气道功能障碍综合征。
[0073] (E)“失能剂”指不太致命且主要通过生理或精神作用或两者使个体丧失能力的试剂。常见的一类失能剂是催泪剂,刺激眼睛引发流泪、疼痛、和甚至暂时失明的化学药剂。催泪剂包括但不限于a-氯甲苯、苄基溴、溴丙酮(BA)、溴苄基氰(CA)、溴甲基乙基酮、辣椒素(OC)、氯乙酰苯(CN)、氯甲酸氯甲酯、二苯氧氮平类(CR)、碘乙酸乙酯、邻氯苯亚甲基丙二腈(CS)、氯甲酸三氯甲酯、和甲苄基溴。其它的失能剂包括但不限于二苯羟乙酸-3-喹咛环酯(幻觉剂;BZ)、氢氰酸(麻痹剂)、二苯氯胂(催嚏剂;DA)、二苯氰胂(DC)、KOLOKOL-1(芬太尼衍生物)、曼陀罗、Hellborne、颠茄、天仙子(Hyoscyamus falezlez)、吲哚(麦角酸二乙基酰胺(LSD-25))、大麻衍生物(DMHP)、苯丙胺类、可卡因、咖啡因、尼古丁、士的宁、环戊并四唑、巴比妥酸盐(美索比妥)、阿片类物质、抗精神病剂(氟哌啶醇)、苯二氮类、芬太尼同类物、二甲-4-羟色胺磷酸、伊菠加因、去氢骆驼蓬碱、摇头丸、PCP、阿托品、东莨菪碱、奥昔布宁、ditropan、抗胆碱能的抗组胺剂、贝那替秦、和镇静剂。
[0074] 许多以上提到的化学物质具有除武器用途之外的用途,还可在制造业内使用。因此,这些化学试剂在制造中或从化学工厂意外或有意地释放将对工厂的雇员以及住在这些工厂附近的人群造成风险。有毒的工业制造化学物质的例子包括但不限于氨、胂、三氯化、三氟化硼、二硫化、氯、乙硼烷、环氧乙烷、氟、甲醛、溴化氢、氯化氢、氰化氢、氟化氢硫化氢硝酸、光气、三氯化磷、二氧化硫、硫酸、六氟化钨、丙酮氰醇、丙烯醛、丙烯腈、烯丙醇、烯丙胺、氯碳酸烯丙酯、三溴化硼、一氧化碳、羰基硫、氯丙酮、氯乙酰基腈、氯磺酸、二酮、1,2-二甲基肼、二溴乙烷、硒化氢、甲烷磺酰氯、溴甲烷、氯甲酸甲酯、甲基氯烷、甲基肼、异氰酸甲酯、甲硫醇、二氧化氮、磷化氢、三氯氧磷、五氟化磷、六氟化硒、四氟化硅、stiloine、三氧化硫、硫酰氯、硫酰氟、六氟化碲、正辛硫醇、四氯化、三氯乙酰氯、三氟乙酰氯、异硫氰酸烯丙酯、三氯化砷、溴、氯化溴、五氟化溴、三氟化溴、羰基氟、五氟化氯、三氟化氯、氯乙醛、氯乙酰氯、巴豆醛、氯化氰、硫酸二甲酯、二苯基甲烷-4,4′-二异氰酸酯、氯甲酸乙酯、氯硫代甲酸乙酯、乙基硫代膦酰二氯、乙基二氯磷酸、乙撑亚胺、六氯代环戊二烯、碘化氢、五羰基、氯甲酸异丁酯、氯甲酸异丙酯、异氰酸异丙酯、氯甲酸正丁酯、异氰酸正丁酯、一氧化氮、氯甲酸正丙酯、对硫磷、全氯甲硫醇、异氰酸仲丁酯、异氰酸叔丁酯、四乙基铅、焦磷酸四乙酯、四甲基铅、甲苯2,4-二异氰酸酯、和甲苯2,6-二异氰酸酯。
[0075] (xi)本文使用的“有效量”包括肽的量,该量足以调节任何组织损伤相关疾病或病症,或其损伤、效应或症状;优选地,足以抑制、压制或缓解对组织损伤相关疾病或病症的身体应答的有害效应,包括但不限于对癌症、炎症或暴露于毒性剂的身体应答。另外,“有效量”包括肽的量,该量足以减轻、改善、减少或预防任何组织损伤相关疾病或病症,或在受组织损伤相关疾病或病症折磨的患者中提供治疗益处。
[0076] (xii)本文使用的“红细胞生成活性”指个体中血红蛋白或血细胞比率水平的任何显著增加。“很少或没有红细胞生成活性”指依照本领域认可的标准,个体血红蛋白或血细胞比率增加的水平是不足以在个体中引起有害效应的增加。“显著增加的红细胞生成活性”指依照本领域认可的标准,个体血红蛋白或血细胞比率水平与对照相比的差异是显著的,其可增加高血压、癫痫和血管栓塞等的可能性。
[0077] (xiii)“可兴奋组织”指包含可兴奋细胞的组织。可兴奋细胞是对电刺激活跃应答且具有跨细胞膜的电荷差的细胞。可兴奋细胞一般能够经受动作电位。这样的细胞典型地表达通道,例如电压门控、配体门控、和胁迫通道,这些通道允许离子流(、钠、、氯等)穿过膜。可兴奋组织包括神经组织、肌肉组织和腺体组织。可兴奋组织包括但不限于神经组织例如外周神经系统(耳朵和视网膜)和中枢神经系统(大脑和脊髓)的组织;心血管组织例如心脏和相关神经的细胞;以及腺体组织例如胰腺,其中T型钙通道以及细胞-细胞缝隙连接参与胰岛素分泌。可兴奋组织的示范列表包括器官和组织,其包括神经、骨骼肌、平滑肌、心肌、子宫、中枢神经系统、脊髓、脑、视网膜、嗅觉系统、听觉系统等。
[0078] (xiv)术语“造血活性”指血细胞成分例如红系、淋巴和髓细胞的任何显著增加。进一步地,造血活性指分离的肽或肽类似物是否具有选自以下的活性:血管活性作用(例如血管收缩)、过度活化的血小板、促凝血活性、和刺激血小板或促红细胞生成素依赖性细胞的增殖或产生。
[0079] (xv)本文使用的术语“宿主细胞”指用核酸分子转染的特定个体细胞以及这些细胞的后代或潜在后代。由于在随后的传代或在核酸分子向宿主细胞基因组的整合中可能发生的突变或环境影响,这些细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲代细胞不完全相同。
[0080] (xvi)本文使用的术语“炎症性状况”指具有炎症性成分的各种疾病或创伤,无论是机械或化学诱发的。其包括在一个或多个器官或组织中产生炎症的状况,包括但不限于大脑、脊髓、结缔组织、心脏、肺、肾、尿路、胰腺、眼和前列腺。这些状况的非限制性例子包括但不限于阑尾炎、睑缘炎、支气管炎、滑囊炎、子宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、绒毛膜羊膜炎、结膜炎、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、心内膜炎、子宫内膜炎、上髁炎、附睾炎、纤维组织炎、胃炎、牙龈炎、舌炎、化脓性汗腺炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、心肌炎、肌炎、肾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、局限性肺炎(肺炎)、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、扁桃体炎、葡萄膜炎、尿道炎、阴道炎、外阴炎、哮喘、全身性红斑狼疮、重症肌无力、炎、血管炎、慢性支气管炎、胰腺炎、骨髓炎、关节炎(类风湿性和牛皮癣性)、肾小球性肾炎、视神经炎、颞动脉炎、脑炎、脑膜炎、横贯性脊髓炎、皮肌炎、多发性肌炎、坏死性筋膜炎、肝炎、坏死性小肠结肠炎、盆腔炎、炎症性肠炎(溃疡性结肠炎、节段性肠炎、回肠炎、和小肠炎)、直肠炎、血管炎、血管狭窄、再狭窄、低血压、1型糖尿病、川崎病、Decum’s病、慢性阻塞性肺病、牛皮癣、动脉粥样硬化、硬皮病、干燥综合征、混合性结缔组织病、酒糟鼻、胃溃疡、十二指肠溃疡、阿尔茨海默氏病、成人发作型Still病、急性视网膜色素上皮炎、Tietze’s综合征、Bechcet’s病、白点综合征(急性后部多灶性鳞状色素上皮病变、匍行性脉络膜炎、枪弹样脉络膜视网膜病变、伴有全葡萄膜炎的多灶性脉络膜炎、弥漫性视网膜下纤维化综合征、点状内部脉络膜病变、多发性一过性白点综合征、和弥漫性单侧亚急性视神经视网膜炎)、环状肉芽肿、肠易激综合征、肠胃炎、Grave’s病、多发性硬化、Dupuytren’s挛缩症、移植物排斥疾病(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病,例如皮肤移植物排斥、固体器官移植排斥、骨髓移植排斥)、炎症性皮肤病、病毒性皮肤病(例如源自人乳头瘤病毒、HIV或RLV感染的皮肤病)、细菌性/真菌性和/或其它寄生虫性皮肤病、皮肤红斑狼疮、和高IgG4疾病。进一步的“炎症性状况”可以指缺血性或非缺血性状况导致的炎症,包括但不限于钝性创伤、挫伤、过敏和过敏性疾病、风湿性疾病(儿童关节炎、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、纤维肌痛、巨细胞(颞)动脉炎、痛风、过敏性紫癜、过敏性血管炎、强直性脊柱炎、囊炎、风湿热、风湿性心脏病、全身性红斑狼疮、风湿性多肌痛、骨关节炎(手、髋、膝等)、结节性多动脉炎、Reiter’s综合征)、运动相关的损伤(跑步膝、网球肘、冻结肩、跟腱炎、足底筋膜炎、滑囊炎、Osgood-Schlatter病)、重复受压损伤(累积性创伤疾病、局限性肌张力障碍、腕管综合征、交叉综合征、反射性交感神经营养不良综合征、狭窄性腱鞘炎(De Quervain’s综合征、扳机指/扳机拇指)、胸出口综合征、腱炎、腱鞘炎、桡管综合征、Raynaud’s病、腱鞘囊肿、gamer’s拇指、Wii-itis等)、感染(包括病毒性、真菌性和细菌性感染)。“炎症性状况”可以是急性或慢性的。
[0081] (xvii)“分离的”或“纯化的”肽基本不包含从中获得所述肽的细胞或组织源的细胞材料或其它污染蛋白;或当化学合成时基本不含化学前体或其它化学物质。语言“基本不含细胞原料”包括肽制剂,其中该肽与从中分离或重组生成该肽的细胞的细胞组分相分离。因此,基本不含细胞材料的肽包括肽制剂,其具有少于约30%、20%、10%或5%(按干重计算)的异源蛋白(本文中也称作“污染蛋白”)。当重组制备肽时,该肽制剂也优选地基本不含培养基,即培养基具有少于约20%、10%或5%的蛋白质制剂体积。当通过化学合成制备肽时,该肽制剂优选地基本不含化学前体或其它化学物质,即它与蛋白合成中涉及的化学前体或其它化学物质分离。因此,这些肽制剂除目标肽之外含有低于约30%、20%、10%、
5%(按干重计算)的化学前体或化合物。在优选实施方案中,本发明的肽是分离的或纯化的。
[0082] (xviii)“分离的”核酸分子是与该核酸分子天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。此外,“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)在通过重组技术制备时基本不含其它细胞材料或培养基,或在化学合成时基本不含化学前体或其它化学物质。在具体实施方案中,编码本发明的肽的核酸分子是分离的或纯化的。
[0083] (xix)本文使用的术语“控制”包括提供一种或多种患者从肽获得的有益副作用,所述副作用在一个实施方案中不能逆转组织损伤相关疾病或病症的损伤、效应或症状。在某些实施方案中,向患者施用肽来“控制”组织损伤相关疾病或病症的症状,以防止症状的进展或恶化。
[0084] (xx)术语“调节”等指化合物增加或降低对组织损伤相关疾病或病症的身体应答的介质的功能和/或表达的能力,包括转录调节活性和/或蛋白结合。本文描述的调节包括直接或间接地抑制、拮抗、部分拮抗、活化、激动或部分激动与介质相关的功能或特征,和/或上调或下调介质的表达。在一个优选的实施方案中,调节是直接的,且更优选地,调节通过介质的抑制剂或拮抗剂发生,该抑制剂或拮抗剂是与介质结合,部分或全部地阻断刺激,降低、预防、抑制、延迟活化,灭活,脱敏,或下调信号转导的化合物。可用于本发明的方法的特定肽的抑制介质功能的能力可以在生化测试(例如结合试验)、基于细胞的测试(例如瞬时转染测试)、或体内测试(例如神经损伤、癌症、炎症、或化学或辐射损伤的动物模型,例如大鼠或小鼠模型)中证明。
[0085] (xxi)本文使用的有关肽内的结构的术语“基序”指肽链的氨基酸序列内的一组连续的氨基酸,和/或所述肽的二级和/或三级结构内的一组线性或空间邻近的氨基酸。因为基序可能全部或部分地因为蛋白折叠而形成,在描述的基序中邻近的氨基酸,可能在肽的线性氨基酸序列内被0个、1个或更多、5个或更多、10个或更多、15个或更多、或20个或更多的氨基酸分开。
[0086] (xxii)本文使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用,而且最广义地指受约束的(即具有一些结构元件,例如存在启动β转角或β折叠的氨基酸,或例如,通过存在的二硫键连接的Cys残基而环化)或不受约束的(例如线性)氨基酸序列。在某些实施方案中,本发明的肽由少于30个氨基酸组成。然而,在阅读了本公开内容后,技术人员将认识到,不是特定肽的长度而是其与组织保护受体复合物结合和/或与本文描述的肽竞争结合的能力可区分出可用于本发明的方法的肽。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”也指包含氨基酸等同物或其它非氨基酸基团而仍保留肽或蛋白的期望功能活性的化合物。肽等同物可以通过用相关的有机酸(例如PABA)、氨基酸等同物等来替代一个或多个氨基酸,或通过侧链或官能团的取代或修饰而与常规的肽区别开来。
[0087] (xxiii)术语“预防组织损伤相关疾病或病症的损伤、效应或症状”指延迟此类损伤、效应或症状的发作,阻碍其发展,阻碍其出现,防止、抑制或消除其出现,或降低其发生率。使用术语“预防”并不意味着施用了预防性治疗的患者群体中的所有患者将不再受到预防所针对的组织损伤相关疾病或病症的影响或不再对其产生应答症状,而是患者群体在该疾病或病症的损伤、效应或症状方面呈现减轻。例如,许多流感疫苗在施用了该疫苗的人群中并非100%有效地预防流感。本领域技术人员可以容易地识别预防性治疗将使其受益的患者和情形,例如但不限于将要参与可能将其暴露于各种毒性剂或创伤的活动的个体(例如参与军事行动的士兵、化学或食品加工工人、应急人员或第一响应者等)、或可能暴露于毒性剂的个体(例如住在化学、核、或制造设备附近的个体,或者处于军事或恐怖分子袭击威胁下的个体)。
[0088] (xxiv)本文使用的“预防有效量”指肽的量,其足以引起对组织损伤相关疾病或病症导致的损伤、效应或症状的预防。预防有效量可以指肽的量,其足以预防组织损伤相关疾病或病症导致的损伤、效应或症状。此外,关于另一种预防剂的预防有效量指与肽组合的该预防剂的量,该量在组织损伤相关疾病或病症导致的损伤、效应或症状的预防中提供预防益处。当与肽的量相连使用时,术语“预防有效量”可以包含改善全面预防或增强另一种预防剂的预防功效或提供与其协同作用的量。
[0089] (xxv)术语“肿瘤”指缺乏癌性肿瘤的恶性性质的异常生长,而且一般是良性和非进行性肿瘤。肿瘤包括但不限于胎、子宫肌瘤、甲状腺腺瘤、肾上腺皮质腺瘤、垂体腺瘤、和畸胎瘤。
[0090] (xxvi)本文使用的术语“辐射剂”指任何可以杀死或损伤个体而且可以用来引起城市或国家的破坏的放射性材料。对辐射剂的暴露可能通过使用武器(核弹(裂变、聚变、中子、加强裂变、或盐弹)、包含贫的炮弹)、恐怖分子装置(“脏弹”)、或者由于核武器爆137 60 241
炸或核电站故障而导致的放射尘而发生。放射性制剂可以包括但不限于 Cs、Co、 Am、
252 192 238 90 226 91 92 95 99 106 131 132 139 140 141 144 233
Cf、 Ir、 Pu、Sr、 Ra、Sr、Sr、Zr、Mo、Ru、 Sb、 Te、 Te、Ba、 La、 Ce、 U、
235 238 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245U、 U、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、 P、
246 247 131
P、 P、和 I。暴露于放射性制剂可以导致癌变,不育,白内障形成,放射性皮炎,β烧伤,γ烧伤,细胞丧失(特别是骨髓、消化道细胞),对造血、胃肠道、中枢神经、心血管、皮肤和/或生殖系统的损伤,急性辐射综合征,慢性辐射综合征,和皮肤辐射综合征。急性辐射综合征一般由短时间内发生的对个体身体的大剂量辐射所引起。该综合征具有可预期的进程,首先恶心,随后呕吐、一般疾病和疲劳、免疫系统压抑、毛发脱落、无法控制的出血(口、皮下、肾)、大量腹泻、谵妄、昏迷和死亡。皮肤辐射综合征是急性辐射综合征的一个亚类,指对皮肤的辐射效应,其包括但不限于炎症、红斑、干性或湿性脱屑、毛发脱落、起疱、变红、溃疡、皮脂腺和汗腺损伤、萎缩、纤维化、减轻或加重的皮肤色素沉着、和坏死。
[0091] (xxvii)本文使用的术语“个体”、“患者”和“受害者”可互换使用。本文使用的术语“个体”指动物,优选地指哺乳动物,包括非灵长目动物(例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如猴、猿或人),且更优选地指人。
[0092] (xxviii)本文使用的术语“肿瘤或癌症相关综合征”指肿瘤通过“占位效应”(肿瘤引起的对重要器官的压迫)或“功能性肿瘤”(受肿瘤影响的器官过度产生激素)直接作用导致的综合征。这样的综合征包括但不限于Beckwith-Wiedmann综合征、SBLA综合征、Li-Fraumeni综合征、家族性腺瘤性息肉病综合征(Gardner综合征)、遗传性非息肉结肠直肠癌、Turcot综合征、Cowden综合征、Carney Triad综合征、多发性内分泌腺瘤综合征(Wermer(MEN-1)、Sipple(MEN-2a、MEN-2b)、Von Hipple-Lindau综合征、库欣综合征、爱迪生综合征、Verner Morrison综合征、Zollinger-Ellison综合征、WDHA综合征、胰性霍乱、Isaac’s综合征、波纹肌肉综合征、僵人综合征、副肿瘤共济失调、Yo综合征、Tr综合征、Hu综合征、CV-2综合征、CRMP-5综合征、斜视眼阵挛/肌阵挛、Ma综合征、Morvan’s纤维性舞蹈症、Bannayan-Riley-Runalcaba综合征、皮肤粘膜色素沉着肠道息肉综合征、Muir-Torre综合征、先天性巨结肠、Lynch综合征、Lambert-Eaton Myastenic综合征、重症肌无力、神经性肌强直、副肿瘤小脑变性、副肿瘤性边缘叶脑炎、急性热性嗜中性皮肤病、Birt-Hogg-Dube综合征、痣样基底细胞癌综合征、广义基底样毛囊综合征、错构瘤综合征、Bazex综合征、Brooke Spiegler综合征、家族性圆柱瘤、多发性家族性毛发上皮瘤、雄激素阻断综合征、治疗相关的骨髓增生异常综合征、嗜睡综合征、海湾战争综合征、和生长抑制素瘤综合征。
[0093] (xxvix)本文使用的术语“组织保护活性”或“组织保护”指抑制或延迟细胞、组织或器官的损伤或死亡的作用。除非另外指明,细胞、组织或器官的损伤或死亡的“延迟”是相对于缺乏本发明的肽的对照条件进行评估的。组织保护活性是对表达组织保护受体复合物的组织、细胞和/或器官(分别为应答组织细胞和/或器官)特异性的,例如但不限于中枢神经系统的组织。在具体实施方案中,应答细胞不是红细胞祖细胞。
[0094] (xxx)本文使用的术语“组织保护受体复合物”指包含至少一个促红细胞生成素受体亚基和至少一个β共同受体亚基的复合物。组织保护受体复合物可以包含多个促红细胞生成素受体亚基和/或β共同受体亚基,以及其它类型的受体或蛋白。参见WO2004/096148,其通过参考被完整并入本文。
[0095] (xxxi)本文使用的术语“毒性剂”指以上提到的生物、化学和辐射剂。
[0096] (xxxii)为了测定两段氨基酸序列的同一性百分比,序列被比对以实现最佳比较目的。然后比较相应氨基酸位置上的氨基酸残基。当第一段序列中的一个位置被与第二段序列中相应位置相同的氨基酸残基占据时,两个分子在该位置是相同的。两段序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即,%同一性=相同的重叠位置数目×100/位置总数)。在一个实施方案中,两段序列是相同长度的。在一个代替的实施方案中,序列具有不同长度,并且因此同一性百分比指较短序列与较长序列的一部分相比,其中所述部分的长度与所述较短序列相同。
[0097] (xxxiii)本文使用的术语“治疗”包括消除、减少、控制或限制组织损伤相关疾病或病症或其损伤、效应或症状所导致的损伤、效应或症状。
[0098] 5.附图简要描述
[0099] 图1是关于在EPO或肽ID(SEQ ID NO:282)存在下UT-7EPO细胞增殖的图。如图中所示,EPO引起UT-7EPO细胞的增殖,但是肽ID在所有剂量都不导致细胞增殖,证明肽ID不是红细胞生成的。
[0100] 图2是显示28天时间内每日两次静脉内施用肽ID的Sprague Dawley大鼠中的血红蛋白浓度的图。如图中所示,没有接受肽的大鼠的血红蛋白浓度与接受了肽ID的大鼠是一样的,因此证明肽ID是非红细胞生成的。
[0101] 图3是说明从28天时间内每日两次静脉内施用各种剂量肽ID的新西兰白兔取得的血样中(a)血红蛋白浓度、(b)血细胞比率、和(c)血小板计数的一系列柱状图。如图中所示,所有剂量的肽ID的施用对动物的血红蛋白浓度、血细胞比率、或血小板计数都没有任何影响。
[0102] 图4是显示红藻氨酸作用下的运动神经元的相对存活率的柱状图。如图中所示,用肽B(SEQ ID NO:3)或EPO预处理的细胞呈现了改善的存活率。
[0103] 图5是说明脑中动脉闭塞并用盐水、肽ID或肽IX(SEQ ID NO:299)治疗后大鼠进行足失误测试的De Ryck分值的图。如图中所示,与盐水治疗的大鼠(20.2±0.8足失误)和肽IX治疗的大鼠(20.1±2.1足失误)比较,肽ID显著地改善了大鼠在足失误法中的表现(11.2±1.1足失误)。
[0104] 图6是涉及小鼠血清中肌酐(图A)、尿素(图B)、和天冬氨酸转氨酶(AST)(图C)浓度的一系列图,所述小鼠已进行了30分钟的双侧肾缺血,接着进行了24小时的再灌注,并接受了对照(PBS)、在再灌注的1分钟接受了1μg/kg肽ID、在再灌注的30分钟接受了1μg/kg肽ID、在再灌注的6小时接受了1μg/kg肽ID、或在再灌注的6小时接受了10μg/kg肽ID。如各图中所示,在再灌注的6小时接受1μg/kg肽ID或在再灌注的6小时接受
10μg/kg肽ID引起这些肾功能障碍的生化标记的降低。
[0105] 图7是涉及小鼠血清中肌酐(图A)、尿素(图B)、和天冬氨酸转氨酶(AST)(图C)浓度的一系列图,所述小鼠已进行30分钟的双侧肾缺血,接着是24小时的再灌注,并在再灌注的1分钟、6小时和12小时接受了多剂量的对照(PBS)、0.1μg/kg肽ID、1μg/kg肽ID、或10μg/kg肽ID。如各图中所示,1μg/kg肽ID或10μg/kg肽ID引起这些肾功能障碍的生化标记的降低。
[0106] 图8是显示了每日皮下接受肽ID(24nmol/kg体重)的大鼠在全层穿刺活检伤口测试中在治疗期间伤口面积缩小的图。如图中所示,接受肽ID的大鼠的伤口愈合得更快。
[0107] 图9是显示了对成年Wistar大鼠进行的新对象识别测试结果的柱状图,所述大鼠在不同时间点接受了盐水、阳性对照加兰他敏(3mg/kg体重)、或肽ID(24nmol/kg体重)。如图中所示,加兰他敏和肽ID增强了大鼠对新对象的识别。
[0108] 图10是比较用顺铂、顺铂和肽IC(SEQ ID NO:281)、或对照(PBS)治疗的大鼠产生尿的体积的图。该图说明,用顺铂和肽IC处理的大鼠的尿体积与对照组(PBS)基本类似。因此该图证明了,在顺铂诱发肾病的大鼠模型中,在5周时间内以0.4μg/kg的剂量每周三次施用肽IC保护被治疗的大鼠免遭顺铂引起的肾损伤。
[0109] 图11是在用顺铂、顺铂和肽IC或对照(PBS)治疗的大鼠中,比较大鼠从热板收回爪子所用时间的图。该图说明,用顺铂和肽IC治疗的大鼠从热板收回它们的爪子所花费的时间与对照组(PBS)基本类似。因此,该图证明了在顺铂诱发神经病变的大鼠模型中,在5周时间内以0.4μg/kg的剂量每周施用三次肽IC保护被治疗的大鼠免遭顺铂引起的外周神经病变。
[0110] 图12是依照Lampson L.A.等,193,Cancer Res.53(1):176-82的方法植入到大鼠大脑中的皮层肿瘤在25天后的相对体积比较图。该图显示盐水治疗的大鼠中肿瘤相对2
体积增加了稍大于0.4cm,但是植入后用肽ID治疗的大鼠显示肿瘤相对体积无增加。
[0111] 图13是依照Lampson L.A.等,193,Cancer Res.53(1):176-82的方法植入到大鼠大脑中的皮层肿瘤在25天后的相对体积比较图。该图显示,在植入后两星期开始盐水治2
疗的大鼠中肿瘤的相对体积增大了约300mm,而用肽ID和肽IW(半衰期延长的肽,SEQ ID NO:298)在植入后两星期开始的治疗均减小了肿瘤的大小。在两星期施用肽IW导致的肿瘤大小降低等同于用肽ID立即治疗所达到的降低水平。
[0112] 图14是在用盐水每日治疗、肽ID或肽IW延迟两星期后治疗的大鼠中皮层肿瘤大小的比较。照片上变暗的面积说明了肿瘤的存在。对比照片清晰地证明,两星期后施用肽IW导致与肿瘤植入后立即施用肽ID类似的肿瘤大小的降低。
[0113] 图15是皮内注射了组胺二磷酸盐的Sprague Dawley大鼠的耳朵中耳朵厚度的差异。大鼠用肽ID静脉内或盐水治疗。与用盐水治疗的大鼠的耳朵相比,用肽ID治疗的大鼠的耳朵呈现了更低的对组胺激发产生的炎症应答。
[0114] 图16是证明在用盐水预处理的大鼠和用肽ID预处理的大鼠中响应皮内施用的组胺而产生的大鼠腹部风团(荨麻疹)面积的差异的图。该图说明肽ID在组胺注射后的抗炎症作用长达24小时。
[0115] 图17是证明在用EPO治疗的大鼠和用盐水治疗的大鼠之间响应组胺激发而产生的风团(荨麻疹)面积的差异的图。十五(15)分钟后,用EPO治疗的大鼠中的风团面积小于用盐水治疗的大鼠。
[0116] 图18是在用组胺激发并使用盐水、肽IY(SEQ ID NO:299)、肽ID和肽IW治疗的大鼠中比较风团(荨麻疹)大小(损害面积)差异的图。用肽ID或肽IW治疗的动物呈现的2 2
损害面积(分别为约0.35cm 和0.3cm)几乎是用盐水和肽IY治疗的动物的损害面积(约
2
0.6cm)的一半。
[0117] 图19是在用组胺激发并使用盐水、肽JA(SEQ ID NO:301)、肽IW、肽IZ(SEQ ID NO:300)和肽ID治疗的大鼠中比较风团(荨麻疹)大小(损害面积)差异的图。与盐水2
和肽JA治疗的动物(均为约0.6cm)比较,用肽IW、IZ或ID治疗的动物呈现了较小的损
2 2 2
害面积(分别为0.3cm、0.35 和0.4cm)。
[0118] 图20是比较大鼠的伤口(溃疡)大小(面积)差异的图,所述大鼠经历压迫性溃疡并使用盐水、肽ID给药两次、肽ID每日给药或EPO每日施用来治疗。该图证明了肽ID和EPO治疗的大鼠比盐水治疗的大鼠呈现更好的伤口愈合。用肽ID每日治疗的动物具有最小的伤口大小。
[0119] 图21显示了用796cGy(A)或831cGy(B)辐射然后在辐射后用肽ID每日皮下治疗29天或用PBS皮下29天的小鼠的Kaplan Meier存活曲线。在两个辐射剂量,肽ID都显著增加了在第30天小鼠的总生存时间(796cGy在第30天45%存活,831cGy在第30天20%存活)。
[0120] 图22是显示小鼠存活率的图,所述小鼠接受了15Gy的部分身体辐射,然后在第1天和此后每天用肽ID治疗,或在第一天和此后每天用PBS治疗。如图所示,与接受PBS的小鼠比较,接受肽ID的小鼠中存活到第20天的小鼠数量明显更多(6只肽治疗的小鼠:1只PBS治疗的小鼠)。
[0121] 6.发明详细描述
[0122] 6.1分离的多肽
[0123] 本发明提供了调节对组织损伤相关疾病或病症的身体应答的效应的方法。此外,本发明提供了通过施用源自促红细胞生成素或另一种1型细胞因子的肽,在受组织损伤相关疾病或病症折磨的患者中预防、治疗、改善或控制损伤、效应或症状的方法。优选地,在本方法中使用的肽是组织保护、神经保护、神经突生长、或抗凋亡的。
[0124] 数种源自1型细胞因子例如EPO的肽已经在本领域公开,例如:(a)和(b)Brines等的PCT/US2006/031061,作为WO 2007/019545公开;和美国专利申请:2008年1月22日提交的系列号为61/062,012的“Tissue Protective Peptidesand Peptide Analogs for Preventing and Treating Diseases and DisordersAssociated with Tissue Damage(用于预防和治疗组织损伤相关疾病和病症的组织保护肽和肽类似物)”;2008年1月22日提交的系列号为61/062,022的“EPO-derived Tissue Protective Peptides and Peptide Analogs for Preventing andTreating Disorders Associated with Tissue Damage(用于预防和治疗组织损伤相关病症的自EPO衍生的组织保护肽和肽类似物)”;和2008年7月3日提交的系列号为61/133,912的“Method of Treating Inflammation or InflammatoryConditions and Symptoms Thereofwith Peptides(用肽治疗炎症或炎症性状况及其症状的方法)”(“Brines”)中;(c)Bock等的PCT申请号DK2006/000246,作为WO 2006/119767和WO 2007/071248公开(“Bock”)中;(d)O’Brien等的美国专利 号 5,571,787、5,700,909、5,696,080、5,714,459、6,590,074、6,559,124、6,271,196、
6,268,347、和6,849,602(“O’Brien”)中;(e)Smith-Swintowsky等的 美国 专利 号
7,259,146和美国公开号20030130197(“Smith-Swintowsky”)中,和(f)Yuan等的PCT/IB2006/003581,作为WO/2007/052154公开(“Yuan”)中,这些发明分别被完整并入本文。
[0125] 为了讨论以上基序的目的,接受Cheetham等,1998,Nat.Struct.Biol.5;861-866(其通过参考被完整并入本文)所描述的且具有SEQ ID NO:1(也可从国家生物技术信息中心蛋白数据库中获得存放的数据,录入条目为“1BUY”)的EPO三维结构。
[0126] 如上所述,可用于调节对组织损伤相关疾病或病症的身体应答和/或可用于在患有组织损伤相关疾病或病症的个体中预防、治疗、改善和控制损伤、效应或症状的肽在一个实施方案中具有基于EPO氨基酸序列片段的基序,其源自EPO蛋白的三维结构,且更具体地,源自EPO朝向背离配体结合位点的区域和/或EPOR同型二聚体的内部部分。这些片段源自以下EPO结构:(1)环AB和螺旋B的N-末端部分(肽A:NITVPDTKVNFYAWKRMEVG,SEQ IDNO:2,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸38-57);(2)螺旋B的C-末端部分(肽B:QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV,SEQ ID NO:3,对应于SEQ IDNO:1的氨基酸58-82),和(3)A-B环的一部分,由小半胱氨酸环和β-折叠组成(肽C:GCAEHCSLNENITVPDTKVN,SEQ ID NO:4,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸28-47)。
[0127] 具体地,这些基序可以是:
[0128] (a)结构基序A
[0129] 在该结构基序中,可用于预防、治疗、改善或控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的肽具有两个带负电荷的氨基酸,其可以被多达5个氨基酸分开,侧翼连接疏水氨基酸。结构上,这可以表示为H1-N1-(X)n-N2-H2,其中n是0-5,SEQ ID NO:5;或者表示为:
[0130] (a1)HNNH,SEQ ID NO:6;
[0131] (a2)HNXNH,SEQ ID NO:7;
[0132] (a3)HNXXNH,SEQ ID NO:8;
[0133] (a4)HNXXXNH,SEQ ID NO:9;
[0134] (a5)HNXXXXNH,SEQ ID NO:10;或
[0135] (a6)HNXXXXXNH,SEQ ID NO:11,
[0136] 其中H代表疏水氨基酸(例如适度疏水的氨基酸:Gly(G)、Pro(P)、Cys(C)、Tyr(Y)和Trp(W),而且优选地为高度疏水的氨基酸:Ala(A)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Leu(L)、Phe(F)),N代表带负电荷的氨基酸例如Glu(E)或Asp(D),而且X代表任意氨基酸,尽管优选地为亲水的氨基酸。
[0137] 公开了该结构基序的变体,结构上表示为H1-N1-(X)n-N2-L1,其中n是0-5,SEQ ID NO:12;或L1-N1-(X)n-N2-H1,其中n是0-5,SEQ ID NO:13,其中侧翼连接的疏水氨基酸中的一个被极性氨基酸例如Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)或Gln(Q)代替。
[0138] 该基序的例子是:
[0139] 肽D APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE (SEQ ID NO:14);
[0140] 肽A NITVPDTKVNFYAWKRMEVG (SEQ ID NO:2);和
[0141] 肽B QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV (SEQ ID NO:3)。
[0142] 在结构基序A的具体实施方案中,可用于预防、治疗、改善、控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的一类分离的肽和肽类似物可具有结构式I(SEQ ID NO:15):
[0143] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-(Z)n-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24
[0144] 其中:
[0145] X1是Cys(C)或Pro(P);
[0146] X2是Asp(D)或Pro(P);
[0147] X3是Ser(S)或Arg(R);
[0148] X4是Arg(R)或Leu(L);
[0149] X5是Val(V)或Ile(I);
[0150] X6是Leu(L)或Cys(C);
[0151] X7是Glu(E)或Asp(D);
[0152] X8是Arg(R)或Ser(S);
[0153] X9是Tyr(Y)或Arg(R);
[0154] X10是Leu(L)或Val(V);
[0155] X11是Leu(L)或Ala(A);
[0156] X12是带负电荷的氨基酸;
[0157] (Z)n是氨基酸,其中n是1-5;
[0158] X13是带负电荷的氨基酸;
[0159] X14是Ala(A)或Leu(L);
[0160] X15是Glu(E)或Lys(K);
[0161] X16是Asn(N)、Glu(E)或Lys(K);
[0162] X17是Ile(I)或Ala(A);
[0163] X18是Thr(T)、Glu(E)或Gly(G);
[0164] X19是Thr(T)、Asn(N)或Ala(A);
[0165] X20是Gly(G)或Ile(I);
[0166] X21是Cys(C)或Thr(T);
[0167] X22是Ala(A)或Thr(T);
[0168] X23是Glu(E)或Gly(G);
[0169] X24是His(H)或Cys(C)。
[0170] 在某些实 施方案中,分 离的式I的肽 和肽类似物 可不包括肽 D,APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE(SEQ ID NO:14);肽A,NITVPDTKVNFYAWKRMEVG(SEQ ID NO:2);
肽B,QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV(SEQ ID NO:3);肽C,GCAEHCSLNENITVPDTKVN(SEQ ID NO:4);或肽E,RYLLEAKEAENITTGC(SEQ ID NO:15)。
[0171] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可包含少于24个氨基酸残基。实际上,包含少到23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式I的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式I的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0172] 由于猜测分离的结构式I的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括极性的、负电性的和正电性的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X11、X12、X13和X14没有被删除。
[0173] 分离的式I的肽和肽类似物也可以在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物可包含多达25、26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式I的肽类似物的组织保护特性。
[0174] 式I的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式I的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0175] 在具体实施方案中,分离的肽和肽类似物由以下氨基酸序列组成:
[0176] 肽F CDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEH (SEQ ID NO:16);
[0177] 肽G PPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGC (SEQ ID NO:17);和
[0178] 肽H ADRELEKIGA (SEQ ID NO:18)。
[0179] (b)结构基序B
[0180] 在该结构基序中,肽具有一个带正电的氨基酸,其与一个带负电的氨基酸相邻,且该两个带电荷氨基酸均侧翼连接单个疏水氨基酸。结构上这可以表示为:
[0181] (b1)HNPH,SEQ ID NO:19;或
[0182] (b2)HPNH,SEQ ID NO:20,
[0183] 其中P代表带正电荷的氨基酸,例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸,且N代表带负电荷的氨基酸,谷氨酸或天冬氨酸。
[0184] 在该特定基序的变体中,带负电的和带正电的氨基酸可以被极性氨基酸分开,例如,
[0185] (b3)HNLPH,SEQ ID NO:21;
[0186] (b4)HPLNH,SEQ ID NO:22,
[0187] 其中L代表极性氨基酸,例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。或者,以上结构基序可以表示为:H1-N1-(L)n-P1-H2,其中n是0-1,SEQ ID NO:23;或H1-P1-(L)n-N1-H2,其中n是0-1,SEQ ID NO:24。该基序的例子是肽C(GCAEHCSLNENITVPDTKVN,SEQ ID NO:4)。
[0188] 在某些实施方案中,下面式II-IV中公开的结构基序B的具体实施方案的分离的肽和肽类似物可不包括肽D,APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE(SEQID NO:14);肽A,NITVPDTKVNFYAWKRMEVG(SEQ ID NO:2);肽B,QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV(SEQ ID NO:3);
肽C,GCAEHCSLNENITVPDTKVN(SEQ ID NO:4);或肽E,RYLLEAKEAENITTGC(SEQ ID NO:15)。
[0189] 在结构基序B的具体实施方案中,可用于预防、治疗、改善、控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的一类分离的肽和肽类似物可包含10到28个连续的氨基酸残基,其具有结构式II(SEQ ID NO:25):
[0190] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24
[0191] 其中:
[0192] X1是Ser(S);
[0193] X2是Arg(R);
[0194] X3是Val(V);
[0195] X4是Leu(L);
[0196] X5是Glu(E);
[0197] X6是Arg(R);
[0198] X7是Tyr(Y);
[0199] X8是Leu(L);
[0200] X9是Leu(L);
[0201] X10是Glu(E);
[0202] X11是Ala(A);
[0203] X12是带正电荷的氨基酸;
[0204] X13是带负电荷的氨基酸;
[0205] X14是Ala(A);
[0206] X15是Glu(E);
[0207] X16是Asn(N);
[0208] X17是Ile(I);
[0209] X18是Thr(T);
[0210] X19是Thr(T);
[0211] X20是Gly(G);
[0212] X21是Cys(C);
[0213] X22是Ala(A);
[0214] X23是Glu(E);
[0215] X24是His(H)。
[0216] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可以包含少于24个氨基酸残基。实际上,包含少到23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式II的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式II的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0217] 由于猜测分离的结构式II的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X11、X12、X13和X14没有被删除。
[0218] 分离的式II的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物可包含多达25、26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式II的肽类似物的组织保护特性。
[0219] 式II的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式II的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0220] 在具体实施方案中,分离的肽或肽类似物由以下氨基酸序列组成:
[0221] 肽I SRVLERYLLEAKEAENITTGCAEH (SEQ ID NO:26)。
[0222] 在结构基序B的进一步的实施方案中,可用于预防、治疗、改善、控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的一类分离的肽和肽类似物具有结构式III(SEQ ID NO:27):
[0223] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24
[0224] 其中:
[0225] X1是Pro(P)、Lys(K)或Ser(S);
[0226] X2是Pro(P)、Glu(E)或Gln(Q);
[0227] X3是Arg(R)、Ala(A)或Pro(P);
[0228] X4是Leu(L)、Glu(E)或Trp(W);
[0229] X5是Ile(I)、Asn(N)或Glu(E);
[0230] X6是Cys(C)、Ile(I)或Pro(P);
[0231] X7是Asp(D)、Thr(T)、Leu(L)或Ala(A);
[0232] X8是Ser(S)、Thr(T)、Gln(Q)或Asp(D);
[0233] X9是Arg(R)、Gly(G)或Leu(L);
[0234] X10是Val(V)、Cys(C)、His(H)或Glu(E);
[0235] X11是Leu(L)、Ala(A)、Val(V);
[0236] X12是带负电荷的氨基酸;
[0237] X13是带正电荷的氨基酸;
[0238] X14是Tyr(Y)、Cys(C)、Ala(A)或Ile(I);
[0239] X15是Leu(L)、Ser(S)、Val(V)或Gly(G);
[0240] X16是Leu(L)、Ser(S)或Ala(A);
[0241] X17是Glu(E)、Asn(N)或Gly(G);
[0242] X18是Ala(A)、Glu(E)或Leu(L);
[0243] X19是Lys(K)、Asn(N)或Arg(R);
[0244] X20是Glu(E)、Ile(I)或Ser(S);
[0245] X21是Ala(A)、Thr(T)或Leu(L);
[0246] X22是Glu(E)、Val(V)或Thr(T);
[0247] X23是Asn(N)、Pro(P)或Thr(T);
[0248] X24是Ile(I)、Asp(D)或Leu(L)。
[0249] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可包含少于24个氨基酸残基。实际上,包含少到23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式III的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式III的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0250] 由于猜测分离的结构式III的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X11、X12、X13和X14没有被删除。
[0251] 分离的式III的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物可包含多达25、26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式III的肽类似物的组织保护特性。
[0252] 式III的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式III的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0253] 在具体实施方案中,分离的肽和肽类似物选自如下定义的肽:
[0254] 肽J PPRLICDSRVLERYLLEAKEAENI (SEQ ID NO:28);
[0255] 肽K KEAENITTGCAEHCSLNENITVPD (SEQ ID NO:29);
[0256] 肽L SQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTL (SEQ ID NO:30);和
[0257] 肽H ADRELEKIGA (SEQ ID NO:18)。
[0258] 在结构基序B的另一实施方案中,可用于预防、治疗、改善、控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的一类分离的肽和肽类似物具有结构式IV(SEQ ID NO:31):
[0259] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25
[0260] 其中:
[0261] X1是His(H);
[0262] X2是Cys(C);
[0263] X3是Ser(S);
[0264] X4是Leu(L);
[0265] X5是Ala(A)或Asn(N);
[0266] X6是Pro(P)或Glu(E);
[0267] X7是Pro(P)或Asn(N);
[0268] X8是Arg(R)或Ile(I);
[0269] X9是Leu(L)或Thr(T);
[0270] X10是Ile(I)或Val(V);
[0271] X11是Cys(C)或Pro(P);
[0272] X12是带负电荷的氨基酸;
[0273] X13是极性氨基酸;
[0274] X14是带正电荷的氨基酸;
[0275] X15是Val(V);
[0276] X16是Leu(L)或Asn(N);
[0277] X17是Glu(E)或Phe(F);
[0278] X18是Arg(R)或Tyr(Y);
[0279] X19是Tyr(Y)或Ala(A);
[0280] X20是Leu(L)或Trp(W);
[0281] X21是Leu(L)或Lys(K);
[0282] X22是Glu(E)或Arg(R);
[0283] X23是Ala(A)或Met(M);
[0284] X24是Lys(K)或Glu(E);
[0285] X25是Glu(E)或Val(V)。
[0286] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可包含少于25个氨基酸残基。实际上,包含少至24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式IV的截短或内部删除形式基本上保持了结构式IV的分离的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0287] 由于猜测分离的结构式IV的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括极性的、带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X11、X12、X13、X14和X15没有被删除。
[0288] 分离的式IV的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物可包含多达26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式IV的肽类似物的组织保护特性。
[0289] 式IV的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式IV的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0290] 在具体实施方案中,分离的肽和肽类似物选自如下定义的肽:
[0291] 肽M APPRLICDSRVLERYLLEAKE (SEQ ID NO:32);和
[0292] 肽N HCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEV (SEQ ID NO:33)。
[0293] 本领域普通技术人员将认识到,以上指明的结构基序A和B对本发明是重要的。因此本领域普通技术人员将认识到,分离的肽可能与具有SEQ IDNO:1的成熟人EPO的氨基酸序列的任何部分具有低于90%、低于85%、低于80%、低于75%、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%、低于50%、低于45%、低于40%、低于35%、低于30%或低于20%的序列同一性,其中EPO的所述部分与所述肽包含相同数目的氨基酸残基。
[0294] 申请人进一步提议,结构基序A和B的组织保护活性归因于基序生成的合适的、空间上紧凑的电荷构型。这些电荷的邻近可通过肽键合而形成的线性结构而发生,即该结构可通过多肽链中的连续氨基酸形成;或者,邻近也可以通过由蛋白质的二级和/或三级结构(即三维结构)造成的EPO分子(或其它相关的1型细胞因子分子)的不同部分之间的空间关系而发生。不希望受限于任何特定的理论,申请人相信,一般而言,这一需求规定了组织保护肽将具有特定的三级结构(例如螺旋或折叠),该结构提供了所要求的带电荷的氨基酸对(即两个带负电荷的氨基酸和/或带正电荷的和带负电荷的氨基酸)的空间位置。简单的例外是线性肽,其中氨基酸对直接彼此相邻,由肽骨架提供需要的刚度。因此,结构基序A被包含在氨基酸残基线性序列,例如,H1-N1-N1-H2(SEQ ID NO:5)中,或包含在氨基酸残基线性序列中,其中N1和N2被1、2、3、4、5、6或更多个间隔残基分开,例如,H-N-X-X-X-X-X-N-H(SEQ ID NO:10)。
[0295] 不希望受限于任何特别的理论,申请人相信,为了组织保护,肽中的带电荷的氨基酸对必须被空间定向,使得氨甲酰基碳相距约3埃 至约5 优选地相距约4 到约5 且更加优选地相距约4.4 到约4.8 这可以用各种方式实现,例如,通过在简单的
线性肽中邻近的带电荷的氨基酸实现,或者,对于可形成α螺旋的肽,用间隔氨基酸残基将带电荷的氨基酸分开。要注意的是,当肽处于特定微环境(例如处于细胞外-细胞表面膜界面)中时,也可以获得三级结构(例如两亲性肽中的α螺旋)(参见,Segrest,1990,Proteins8:103-117,其通过参考被完整并入本文)。
[0296] 此外,对于包含带电荷的氨基酸对因而使带电荷的侧链(带正电荷和负电荷的,或两个带负电荷的)在空间上限制在彼此相距约6.5 到约9 的范围内的肽,预测其具有组织保护活性。在α螺旋中,这可以通过将带电荷的氨基酸对用一个或两个氨基酸分开来实现,这将使得电荷差不多在螺旋的同一侧,且具有所要求的约6.5 到约9 的分离。本领域技术人员可以为肽设计三级结构,这通常是获得带电荷的氨基酸的合适三维位点以及设计小分子以模仿肽内电荷分离所必需的。
[0297] 任意两个氨基酸的氨甲酰基碳之间或任意两个氨基酸的侧链之间的空间距离,可以通过任何本领域已知的或本文描述的方法推导。例如,当已知蛋白的三维结构时,在所述蛋白的感兴趣的一部分内,两条侧链的电荷分离或两个氨甲酰基碳之间的空间距离可以基于公开的或本领域接受的所述感兴趣的部分中氨基酸残基的三维坐标来计算。当蛋白的三维结构未知且因此感兴趣的部分未知时,或当基于本发明的教导构建三维结构未知的全合成肽时,所述肽内两条侧链的电荷分离或两个氨甲酰基碳之间的空间距离可以使用本领域已知的蛋白建模软件预测的三维结构来估计。此类软件的非限制性例子是TMChemical Computing Group(Quebec,Canada)的MOE 和Accelrys(SanDiego,California)的Modeler。类似地,可从上述公司得到的这些预测软件也是本领域已知用于小分子设计的,且因此,本领域普通技术人员基于本发明的教导将能够制造仿效公开的结构基序的小分子。
[0298] c.结构基序C
[0299] 本发明的可用于预防、治疗、改善和控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的肽所呈现的另一种结构基序是:
[0300] X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO:34)
[0301] 其中X1是带电荷的氨基酸残基,X6是疏水氨基酸残基或A,且X2、X3、X4和X5是任意氨基酸残基。
[0302] 除了在基序的X1位置存在带电荷的残基(优选地为带负电荷的残基)和在X6位置存在疏水氨基酸残基(优选地为Leu(L)、Val(V)或Tyr(Y))以外,序列可以进一步包含i)在X2位置的Ser(S)和/或ii)在基序的X2位置的疏水残基和/或在X3位置的疏水残基。这些优选的基序的例子可以是序列(i)R-S-X3-X4-X5-L(SEQ ID NO:35),和(ii)R-V-X3-X4-X5-A(SEQ ID NO:36),R-V-L-X4-X5-Y(SEQ ID NO:37)、K-A-V-X4-X5-L(SEQ ID NO:
38)、R-X2-L-X4-X5-L(SEQ ID NO:39)、或R-S-L-X4-X5-L(SEQ ID NO:40)。但是,Ser(S)或Thr(T)在一些情况下优选地在X4位置,独立于在X2和/或X3位置存在的疏水残基。
[0303] 呈现结构基序C的一组可用于预防、治疗、改善或控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的肽是:
[0304] 肽O DSRVLERYLLEAKE (SEQ ID NO:41);
[0305] 肽P NENITVPDTKVNFYAWKR (SEQ ID NO:42);
[0306] 肽Q QLHVDKAVSGLRSLTTLLRA (SEQ ID NO:43);和
[0307] 肽R RVYSNFLRGKLKLYTGEA (SEQ ID NO:44)。
[0308] d.结构基序D
[0309] 可用于预防、治疗、改善或控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的肽的进一步的基序基于在若干神经营养和造血细胞因子中发现的神经营养肽共有序列,这些细胞因子会刺激神经突起生长并模拟鞘脂激活蛋白原的活性。该共有序列源自以下比较:将源自鞘脂激活蛋白C的具有SEQ ID NO:45(CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL)的氨基酸序列的活性22残基肽和具有SEQ ID NO:46(YVKHQGLNKNINLDSVDGVP)的氨基酸序列的20残基CNTF肽与各种显示与EPO具有序列相似性的细胞因子和生长因子比较。
[0310] 该共有序列是:
[0311] A(X)nN(X)oN(X)pB(X)qC,(SEQ ID NO:47)
[0312] 其中N是Asp(N),A是Leu(L)或Ile(I),X独立地是任意氨基酸,n是2-3,o是0-1,p是1-7,B是一个或多个带电荷的氨基酸(Asp(D)、Lys(K)、Glu(E)或Arg(R)),q是
4-7,且C是一个或多个疏水氨基酸(Ala(A)、Leu(L)、Ile(I)或Val(V)),其中C距第二个天冬酰胺残基6-10个氨基酸。呈现结构基序D的肽的例子是肽U:AEHCSLNENITVPDTKU(SEQ ID NO:48),源自EPO AB-环。根据结构基序D的进一步的序列是LIRX1NNX2TX3X4X3X1X1,其中X1是任意氨基酸,X2是任意氨基酸但不是Leu(L)或Arg(R),X3是带电荷的氨基酸,且X4当存在时是带电荷的氨基酸。
[0313] e.结构基序E
[0314] 此外,根据本发明,包含如下核心氨基酸序列的肽可用于预防、治疗、改善或控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状:X3-X4-X5-G-P-X6-T-W-X7-X8(SEQ ID NO:49),其中X3可以是Cys(C)、Glu(E)、Ala(A)、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc,其中Hoc是同型半胱氨酸;X4可以是Arg(R)、His(H)、Tyr(Y)、Leu(L)或Trp(W),或X4是键;X5可以是Met(M)、Phe(F)或Ile(I);X6独立地是20个基因编码的L-氨基酸或立体异构D-氨基酸中的任意一个;X7可以是Asp(D)、Glu(E)、Ile(I)、Leu(L)或Val(V);且X8可以是Cys(C)、Lys(K)、Ala(A)、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc,其中Hoc是同型半胱氨酸,条件是X3或X8是Cys(C)或Hoc。在基序的变体中,二聚体或多聚体的单体肽单元包含核心序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQ ID NO:50),其中X1、X2、X6、X9、X10和X11独立地选自20个基因编码的L-氨基酸;X3可以是Cys(C)、Glu(E)、Ala(A)、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc,其中Hoc是同型半胱氨酸;X4可以是Arg(R)、His(H)、Tyr(Y)、Leu(L)或Trp(W),或X4是键;X5可以是Met(M)、Phe(F)或Ile(I);X7可以是Asp(D)、Glu(E)、Ile(I)、Leu(L)或Val(V);且X8可以是Cys(C)、Lys(K)、Ala(A)、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc,其中Hoc是同型半胱氨酸。更加优选地,X3或X8是Cys(C)或Hoc。公开了基序的进一步的变体,其中二聚体或多聚体的单体肽单元包含氨基酸核心序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQ ID NO:51),其中X2和X6各自独立地是20个基因编码的L-氨基酸中的任意一个;X3是Cys(C);且X2是Cys(C)。公开了基序的另一变体,其中二聚体的单体肽单元包含氨基酸核心序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11(SEQ ID NO:52),其中X1、X2、X6、X9、X10和X11各自独立地选自20个基因编码的L-氨基酸。特别地,X3可以是Cys(C)、Glu(E)、Ala(A);X4可以是Arg(R)、His(H)或Tyr(Y),或X4是键;
X5可以是Met(M)、Phe(F)或Ile(I);X7可以是Asp(D)或Val(V);而且X8可以是Cys(C)、Lys(K)或Ala(A)。在基序的另一变体中,X3和X8都是Cys(C),且因此,二聚体的单体肽单元包含氨基酸核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO:53)。基序也可以是氨基酸核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO:54),其中X4可以是Arg(R)或His(H);
X5可以是Phe(F)或Met(M);X6可以是Ile(I)、Leu(L)、Thr(T)、Met(M)或Val(V);X7是Asp(D)或Val(V);X9可以是Gly(G)、Lys(K)、Leu(L)、Gln(Q)、Arg(R)、Ser(S)或Thr(T);
且X10可以是Ala(A)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)或Tyr(Y)。或基序可以包含氨基酸核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO:55),其中X1可以是Asp(D)、Glu(E)、Leu(L)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)或Val(V);X2可以是Ala(A)、His(H)、Lys(K)、Leu(L)、Met(M)、Ser(S)或Thr(T);X4是Arg(R)或His(H);X9可以是Lys(K)、Arg(R)、Ser(S)或Thr(T);
且X10是Pro(P)。或者,基序将包含氨基酸核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO:
56),其中X1可以是Asp(D)、Glu(E)、Leu(L)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)或Val(V);X2可以是Ala(A)、His(H)、Lys(K)、Leu(L)、Met(M)、Ser(S)或Thr(T);X4是Arg(R)或His(H);X9可以是Lys(K)、Arg(R)、Ser(S)或Thr(T);且X10是Pro(P)。
[0315] 可用于预防、治疗、改善和控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的根据结构基序E的特定的肽是:
[0316] 肽S GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG (SEQ ID NO:57)
[0317] 肽T GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:58)
[0318] 肽U GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID NO:59)
[0319] 肽V VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:60)
[0320] 肽W GGVYACRMGPITWVCSPLGG (SEQ ID NO:61)
[0321] 肽X VGNYMAHMGPITWVCRPGG (SEQ ID NO:62)
[0322] 肽Y GGTYSCHFGPLTWVCKPQ (SEQ ID NO:63)
[0323] 肽Z GGLYACHMGPMTWVCQPLRG (SEQ ID NO:64)
[0324] 肽AA TIAQYICYMGPETWECRPSPKA (SEQ ID NO:65)
[0325] 肽AB YSCHFGPLTWVCK (SEQ ID NO:66)
[0326] 肽AC YCHFGPLTWVC (SEQ ID NO:67)
[0327] 肽AD SCHFGPLTWVCK (SEQ ID NO:68)
[0328] 肽AE GGTASCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:69)
[0329] 肽AF GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:70)
[0330] 肽AG GGTYSCFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:71)
[0331] 肽AH TYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:72)
[0332] 肽AI TYSCHFGPLTWVCKPQ (SEQ ID NO:73)
[0333] 肽AJ YSCHFGPLTWVCKP (SEQ ID NO:74)
[0334] 肽AK YSCHFGPLTWVC (SEQ ID NO:75)
[0335] 肽AL YSCHFGALTWVCK (SEQ ID NO:76)
[0336] 肽AM GGCRIGPITWVCGG (SEQ ID NO:77)
[0337] 肽AN HFGPLTWV (SEQ ID NO:78)
[0338] 肽AO GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:79)
[0339] 肽AP GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:80)
[0340] 肽AQ GGTYSCHFGALTWVCKPQGG (SEQ ID NO:81)
[0341] 肽AR GGTYSCHFGPATWVCKPQGG (SEQ ID NO:82)
[0342] 肽AS GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG (SEQ ID NO:83)
[0343] 肽AT GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG (SEQ ID NO:84)
[0344] 肽AU GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG (SEQ ID NO:85)
[0345] 肽AV GGTYSCHFGPLTWVCKAQGG (SEQ ID NO:86)
[0346] 肽AW GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:87)
[0347] 肽AX GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:88)
[0348] 肽AY GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=对-NH2-Phe)(SEQ IDNO:89)
[0349] 肽AZ GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=对-F-Phe)(SEQ ID NO:90)
[0350] 肽BA GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=对-I-Phe)(SEQ ID NO:91)
[0351] 肽BB GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG;(X=3,5-二溴-Tyr)(SEQ IDNO:92)
[0352] 肽BC Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:93)
[0353] 肽BD GGLYACHMGPMTWVCQPLGG (SEQ ID NO:94)
[0354] 肽BE LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD (SEQ ID NO:95);和
[0355] 肽BF GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG (SEQ ID NO:96)。
[0356] f.结构基序F
[0357] 本发明还涵盖了源自EPO的AB环的进一步的肽。该AB环肽可以通过向该肽的氨基酸序列的N-末端或C-末端的至少一端上化学添加小双环分子来进一步稳定。
[0358] 可用于预防、治疗、改善和控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的根据结构基序F的特定的肽是:
[0359] 肽BG D-生物素-AEHCSLNENITVPDTKV (SEQ ID NO:97);
[0360] 肽BH D-生物素-AEHCSLNENITVP (SEQ ID NO:98);
[0361] 肽BI AEHCSLNENITVPDTKK-生物素 (SEQ ID NO:99);和
[0362] 肽BJ AEHCSLNENITVP-D-生物素 (SEQ ID NO:100)。
[0363] 此外,肽可以通过在沿着肽序列的第一氨基酸残基的巯基和第二氨基酸残基的巯基之间形成的二硫键而稳定。肽的具体实施方案具有至少6个氨基酸,其具有肽序列XAEHYS(SEQ ID NO:101),其中X是包含巯基的第一氨基酸残基,Y是包含巯基的第二氨基酸残基,且其中第一氨基酸残基的巯基与第二氨基酸残基的巯基之间具有合适的距离,从而与肽序列内的第二个氨基酸残基的巯基形成二硫键,由此稳定肽(式I)。
[0364] 可用于预防、治疗、改善和控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的根据结构基序F、式I的特定的肽是:
[0365] 肽BK TTGCAEHCSLNENITVPDTK (SEQ ID NO:102);
[0366] 肽BL CAEHCSLNENITVPDTKV (SEQ ID NO:103);
[0367] 肽BM CAEHCS (SEQ ID NO:104);
[0368] 肽BN GCAEHCSL (SEQ ID NO:105);
[0369] 肽BO GCAEHCSLNENITVPDTKV (SEQ ID NO:106);
[0370] 肽BP CAEHCSLNENITVP (SEQ ID NO:107);
[0371] 肽BQ TTGCAEHCSLNENITVPDTKV (SEQ ID NO:108);
[0372] 肽BR TTGCAEHCSLNENITVP (SEQ ID NO:109);和
[0373] 肽BS CAEHCSLNKNINLDSVDGVP (SEQ ID NO:110)。
[0374] 在另一实施方案中,由二硫键-稳定的分离的源自EPO的肽通过向该肽的氨基酸序列的N-末端或C-末端的至少一端上化学添加小双环分子以进一步稳定。
[0375] 肽也可以呈现出以下至少7个氨基酸的基序,其具有肽序列XAEHYS(SEQ ID NO:111),其中X是包含巯基的第一氨基酸残基,Y是包含巯基的第二氨基酸残基,且其中第一氨基酸残基的巯基与第二氨基酸残基的巯基之间具有合适的距离,从而与肽序列内的第二氨基酸残基的巯基形成二硫键,由此稳定肽(式II)。
[0376] 可用于预防、治疗、改善和控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的根据结构基序F、式II的特定的肽是:
[0377] 肽BT AEHCSLMENNLRRPNL (SEQ ID NO:112);和
[0378] 肽BU D-生物素-AEHCSLMENNLRRPNL (SEQ ID NO:113)。
[0379] G.其它源自EPO的EPO肽。
[0380] 除了上述EPO肽和源自EPO的基序以外,在以下文献中公开的EPO肽、片段和模拟物也可用于调节本发明的疾病或病症的身体应答的效应的方法中:美国专利
号 5,106,954、5,952,293、6,004,758、6,346,390、6,932,968、5,835,382、7,037,902、
7,084,245和7,272,508;美国专利申请号20050191301;WO2005/021579;Skelton等,“Amino Acid Determinants of Beta-hairpinConfirmation in Erythropoietin Receptor Agonist Peptides Derived From A PhageDisplay Library”,Journal of Molecular Biology,第316卷,第8期,2002,1111-1125 页;Livnah 等,Functional Mimcry of a Protein Hormone by a PeptideAgonist:the EPO Receptor Complex at Science
26,1996年7月,第273卷,编号5274,464-471页;Johnson和Joliffe,“Erythropoietin Mimetic Peptidesand the Future”,Nephrol.Dial.Transplant(2000)15:1274-1277,Wrighton 等,(1996)Science 273:458-463;Johnson 等,(1998)Biochemistry,37:
3699-3710。
[0381] 6.21型细胞因子片段
[0382] 以上基序不仅可用于识别源自EPO的肽或EPO激动剂片段,还可以用来识别1型细胞因子片段,该1型细胞因子片段也呈现出抑制或延迟组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的能力且因此在预防、治疗、改善或维持组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状方面是治疗有效的。1型细胞因子家族包括但不限于白细胞介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10或IL-11、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、瘦素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、血小板生成素(TPO)、生长激素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和催乳素。
[0383] 对EPO二级结构的考量为通过氨基酸的空间排列来制备候选肽提供了指导,该氨基酸源自位于其它1型细胞因子受体配体,例如GM-CSF和IL-3等的同源二级结构内的同源氨基酸(Kannan,2000,Neuroimmunomod.8:132-141,其通过参考被完整并入本文),其中,有些已经显示具有出强大的神经营养和神经保护活性,申请人相信,该活性在很大程度上是由于刺激了组织保护受体。例如,考虑这些I型细胞因子的螺旋B:血小板生成素(TPO;蛋白数据库(PDB)登录号1V7M)中的同源氨基酸包含D62、G65、T68、L69、E72、A76和Q80,其中这些氨基酸在线性排列中是空间上彼此邻近的;白血病抑制因子(LIF;PDB登录号1EMR)中的同源氨基酸包含E61、R64、Y68、S72、N75和D79;睫状神经营养因子(CNTF;PDB登录号
1CNT)中的同源氨基酸包含E71、E75。这些都是上述的结构基序A的例子,其中带下划线的氨基酸是带负电荷的。
[0384] 在下面作为式V-VI公开的结构基序A的某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可不包括肽BV,WEHVNAIQEARRLL(SEQ ID NO:114);肽BW,LSKLLRDSHVLH(SEQ ID NO:115);肽BX,KIRSDLTALTESYVKH(SEQID NO:116);肽BY,GTEKAKLVELYRIVVYL(SEQ ID NO:117);或肽BZ,SIMIDEIIHHLKRPPNPL(SEQ ID NO:118)。
[0385] 在结构基序A的实施方案中,源自1型细胞因子的肽和肽类似物具有结构式(V)(SEQ ID NO:119):
[0386] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19[0387] 其中:
[0388] X1是Trp(W)、Val(V)、Ala(A)、Ile(I)、Pro(P)、Leu(L)、Ser(S)、Asp(D)或Thr(T);
[0389] X2是任意氨基酸;
[0390] X3是任意氨基酸;
[0391] X4是任意氨基酸;
[0392] X5是任意氨基酸;
[0393] X6是任意氨基酸;
[0394] X7是任意氨基酸;
[0395] X8是Ile(I)、Phe(F)、Leu(L)、Val(V)、Pro(P)、Tyr(Y)或Gly(G);
[0396] X9是带负电荷的氨基酸;
[0397] X10是带负电荷的氨基酸;
[0398] X11是Ile(I)、Leu(L)、Ala(A)、Gly(G)、Phe(F)、Val(V)或Pro(P);
[0399] X12是Ile(I)、Met(M)、Tyr(Y)、Ser(S)、Val(V)、Phe(F)、Lys(K)、Leu(L)、Glu(E)或Asp(D);
[0400] X13是任意氨基酸;
[0401] X14是His(H)、Leu(L)、Pro(P)、Thr(T)、Arg(R)、Cys(C)、Ile(I)、Tyr(Y)、Gln(Q)或Ala(A);
[0402] X15是Leu(L)、Lys(K)、Thr(T)、Val(V)、Phe(F)、Ala(A)或Gln(Q);
[0403] X16是Lys(K)、Glu(E)、Met(M)、Gly(G)、Asn(N)、Gln(Q)、Thr(T)或Val(V);
[0404] X17是任意氨基酸;
[0405] X18是Pro(P)、Lys(K)、Arg(R)、Ile(I)、Asn(N)、Ser(S)、Gln(Q)或Phe(F);
[0406] X19是Pro(P)、Ile(I)、Tyr(Y)、Leu(L)、Phe(F)、Ser(S)、Ala(A)、Asp(D)、Asn(N)或Lys(K)。
[0407] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可以包含少于19个氨基酸残基。实际上,包含少到18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式V的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式V的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0408] 由于猜测分离的式(V)的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型在组织保护活性上具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括极性的、带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X8、X9、X10和X11没有被删除。
[0409] 分离的式V的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物包含多达20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式V的肽类似物的组织保护特性。
[0410] 式V的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式V的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0411] 在具体实施方案中,式V的分离的肽和肽类似物选自以下定义的肽:
[0412] 肽CA KTSWVNCSNMIDEIITHLKQPPLP (SEQ ID NO:120);
[0413] 肽CB LLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPR (SEQ ID NO:121);
[0414] 肽CC HQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSF (SEQ ID NO:122);
[0415] 肽CD DSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLED (SEQ ID NO:123);
[0416] 肽CE EEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQ (SEQ ID NO:124);
[0417] 肽CF SNVDKETGEDG (SEQ ID NO:125);
[0418] 肽CG YSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSK (SEQ ID NO:126);
[0419] 肽CH FKSPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDA (SEQ ID NO:127);
[0420] 肽CI LDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALS (SEQ ID NO:128);
[0421] 肽CJ QALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPD (SEQ ID NO:129);
[0422] 肽CK LQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFH (SEQ ID NO:130);
[0423] 肽CL AQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNI (SEQ ID NO:131);
[0424] 肽CM VPPSTALRELIEELVNITQNQKAP (SEQ ID NO:132);
[0425] 肽CN IFLDQNMLAVIDELMQALNFNSET (SEQ ID NO:133);
[0426] 肽CO NSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLC (SEQ ID NO:134);
[0427] 肽CP FMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTM (SEQ ID NO:135);和
[0428] 肽CQ CLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKED (SEQ ID NO:136)。
[0429] 在结构基序A的另一实施方案中,基于1型细胞因子且可用于本发明的方法的分离的肽和肽类似物具有结构式VI(SEQ ID NO:137):
[0430] X1-X2-(Z)n-X3-X4
[0431] 其中:
[0432] X1是Phe(F)、Val(V)、Ala(A)、Gly(G)、Pro(P)、Leu(L)、Tyr(Y)、Ile(I)、Cys(C)或Met(M);
[0433] X2是带负电荷的氨基酸;
[0434] (Z)n是一个氨基酸,其中n是1-5;
[0435] X3是带负电荷的氨基酸;
[0436] X4是Pro(P)、Met(M)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)、Gly(G)、Leu(L)、Ala(A)、Tyr(Y)、和Trp(W)。
[0437] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可以包含少于9个氨基酸残基。实际上,包含少到8、7、6或甚至5个氨基酸残基的结构式VI的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式VI的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0438] 由于猜测分离的式VI的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X1、X2、X3和X4没有被删除。
[0439] 分离的式VI的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物包含多达10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式VI的肽类似物的组织保护特性。
[0440] 式VI的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式VI的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达五个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0441] 在具体实施方案中,式VI的分离的肽和肽类似物选自如下定义的肽:
[0442] 肽CR NETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELY (SEQ ID NO:138);
[0443] 肽CS NLKDFLLVIPFDCWEPVQE (SEQ ID NO:139);
[0444] 肽CT RDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQ (SEQ ID NO:140);
[0445] 肽CU RLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEP (SEQ ID NO:141);
[0446] 肽CV LPLLDFNNLNGEDQDILMENNLRRPN (SEQ ID NO:142);
[0447] 肽CW PTRHPIHIKDGDWNEFRRKLTFYLKT (SEQ ID NO:143);
[0448] 肽CX HVGHVDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCGL (SEQ ID NO:144);
[0449] 肽CY KHQGLNKNINLDSADGMPVASTDQWS (SEQ ID NO:145);
[0450] 肽CZ WSELTAEQELQRVAREVH (SEQ ID NO:146);
[0451] 肽DA LRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQK (SEQ ID NO:147);
[0452] 肽DB LVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGR (SEQ ID NO:148);
[0453] 肽DC SNVDKETGEDG (SEQ ID NO:149);
[0454] 肽DD QEERRRVNGFLDYLQEFLGVMNTEWII (SEQ ID NO:150);
[0455] 肽DE EEFFRIFNRSIDAFKDFVVASETSDCV (SEQ ID NO:151);
[0456] 肽DF SRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSC (SEQ ID NO:152);
[0457] 肽DG YSTVSGDWQLDL (SEQ ID NO:153);
[0458] 肽DH QFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLG (SEQ ID NO:154);
[0459] 肽DI QFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGEN (SEQ ID NO:155);
[0460] 肽DJ KATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA (SEQ ID NO:156);
[0461] 肽DK SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGLNNY (SEQ ID NO:157);
[0462] 肽DL FKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKK (SEQ ID NO:158);
[0463] 肽DM VEIEEQTKRLLEGMELIVSQVHPETK (SEQ ID NO:159);
[0464] 肽DN GMELIVSQVHPETKENEIYPVWSGLPSL (SEQ ID NO:160);
[0465] 肽DO PEAIVEERELSQV (SEQ ID NO:161);
[0466] 肽DP HKCDITLQEIIKTLNSLTEQ (SEQ ID NO:162);
[0467] 肽DQ AENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEET (SEQ ID NO:163);
[0468] 肽DR TCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFE (SEQ ID NO:164);
[0469] 肽DS VPPGEDSKDVAAPHRQPLTS (SEQ ID NO:165);
[0470] 肽DT RKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPK (SEQ ID NO:166);
[0471] 肽DU LVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEE (SEQ ID NO:167);
[0472] 肽DV TCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEE (SEQ ID NO:168);
[0473] 肽DW IQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKL (SEQ ID NO:169);
[0474] 肽DX RNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQP (SEQ ID NO:170);
[0475] 肽DY PLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQ (SEQ ID NO:171);
[0476] 肽DZ DFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEG (SEQ ID NO:172);
[0477] 肽EA LEWKTQTDGLEGAAGQ (SEQ ID NO:173);
[0478] 肽EB TVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQP (SEQ ID NO:174);
[0479] 肽EC LEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEA (SEQ ID NO:175);
[0480] 肽ED NSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCIL (SEQ ID NO:176);
[0481] 肽EE EDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSR (SEQ ID NO:177);
[0482] 肽EF TTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFC (SEQ ID NO:178);
[0483] 肽EG AWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPH (SEQ ID NO:179);
[0484] 肽EH LVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCD (SEQ ID NO:180);
[0485] 肽EI LQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPD (SEQ ID NO:181);
[0486] 肽EJ NHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLH (SEQ ID NO:182);和
[0487] 肽EK LEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKED(SEQ ID NO:183)。
[0488] 可用于本发明的治疗方法、示例了本文上述结构基序B且在PCT/US2006/031061内公开的源自1型细胞因子的组织保护肽的进一步例子包括但不限于GM-CSF螺旋A片段,肽BV:WEHVNAIQEARRLL(SEQ IDNO:114);TPO螺旋A片段,肽BW:LSKLLRDSHVLH(SEQ ID NO:115);TPO螺旋B片段:E56、K59;CNTF螺旋A片段,肽BX:KIRSDLTALTE SYVKH(SEQ ID NO:
116);CNTF螺旋B片段:R89、E92。LIF螺旋B片段,肽BY:GTEKAKLVELYRIVVYL(SEQ ID NO:
117);和白细胞介素3(IL-3)螺旋A片段,肽BZ:SIMIDEIIHHLKRPPNPL(SEQ ID NO:118)。
[0489] 在下面作为式VII-X公开的结构基序B的某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可不包括肽BV,WEHVNAIQEARRLL(SEQ ID NO:114);肽BW,LSKLLRDSHVLH(SEQ ID NO:115);肽BX,KIRSDLTALTESYVKH(SEQID NO:116);肽BY,GTEKAKLVELYRIVVYL(SEQ ID NO:117);或肽BZ,SIMIDEIIHHLKRPPNPL(SEQ ID NO:118)。
[0490] 可用于预防、治疗、改善和控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的方法的进一步呈现结构基序B的源自1型细胞因子的肽是呈现结构式VII的肽:(SEQ ID NO:184)
[0491] X1-X2-X3-X4
[0492] 其中:
[0493] X1是Leu(L)、Ile(I)、Gly(G)、Val(V)、Phe(F)、Pro(P)或Ala(A);
[0494] X2是带正电荷的氨基酸;
[0495] X3是带负电荷的氨基酸;
[0496] X4是Phe(F)、Gly(G)、Val(V)、Leu(L)、Ala(A)或Tyr(Y);
[0497] 在本发明的一个实施方案中,I型细胞因子源的肽具有结构式VII(a):
[0498] (SEQ ID NO:302):
[0499] X1-X2-X3-X4-X5-X6
[0500] 其中:
[0501] X1是Leu(L)、Ile(I)、Gly(G)、Val(V)、Phe(F)、Pro(P)或Ala(A);
[0502] X2是带正电荷的氨基酸;
[0503] X3是带负电荷的氨基酸;
[0504] X4是Phe(F)、Gly(G)、Val(V)、Leu(L)、Ala(A)或Tyr(Y);
[0505] X5是Arg(R)、Asp(D)、Glu(E)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Phe(F)、Val(V)或Tyr(Y);
[0506] X6是His(H)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、Ser(S)、Leu(L)、Trp(W)或Phe(F)。
[0507] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可以包含少于5个或甚至4个氨基酸残基。实际上,包含少到6个或甚至5个氨基酸残基的结构式VII或VIIa的截短或内部删除形式基本上保持了分离的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0508] 由于猜测分离的式VII或VIIa的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X1、X2、X3和X4没有被删除。
[0509] 分离的式VII或VIIa的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物包含多达7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式VII或VIIa的肽类似物的组织保护特性。
[0510] 式VII或VIIa的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式VII的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达两个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。
[0511] 在具体实施方案中,分离的式VII或式VIIa的肽和肽类似物选自如下定义的肽:
[0512] 肽EL IITFESFKENLKDFLLVIPFDCWE (SEQ ID NO:185);
[0513] 肽EM TAAPTRHPIHIKDGDWNEFRRKLT (SEQ ID NO:186);
[0514] 肽EN VDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCQL (SEQ ID NO:187);
[0515] 肽EO SGKDVFQKQGQSVQ (SEQ ID NO:188);
[0516] 肽EP QELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGI (SEQ ID NO:189);
[0517] 肽EQ WSELTAEQELQRVAREVH (SEQ ID NO:190);
[0518] 肽ER GASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGR (SEQ ID NO:191);
[0519] 肽ES GICRNRVTNNVKDVTKLVANLPKD (SEQ ID NO:192);
[0520] 肽ET FRIFNRSIDAFKDFVVASEETSDCV (SEQ ID NO:193);
[0521] 肽EU VIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSC (SEQ ID NO:194);
[0522] 肽EV THFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTF (SEQ ID NO:195);
[0523] 肽EW PGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQM (SEQ ID NO:196);
[0524] 肽EX LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE (SEQ ID NO:197);
[0525] 肽EY QDPYVKEAENLKKYFNAG (SEQ ID NO:198);
[0526] 肽EZ VTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPA (SEQ ID NO:199);
[0527] 肽FA PGGAARCQVTLRDLFDRAVVLSHY (SEQ ID NO:200);
[0528] 肽FB WGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLE (SEQ ID NO:201);
[0529] 肽FC DMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQ (SEQ ID NO:202);
[0530] 肽FD GPVPPSTALRELIEELVNITQN (SEQ ID NO:203);
[0531] 肽FE KDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:204);
[0532] 肽FF RDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFRE (SEQ ID NO:205);
[0533] 肽FG LDQIPGYLNRIHELLNGTRGLFPG (SEQ ID NO:206);
[0534] 肽FH SPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPV (SEQ ID NO:207);和
[0535] 肽FI YYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRV (SEQ ID NO:208)。
[0536] 在可用于预防、治疗、改善或控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的肽的另一实施方案中,源自1型细胞因子并呈现结构基序B的分离的肽或肽类似物具有结构式(VIII)(SEQ ID NO:209):
[0537] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24
[0538] 其中:
[0539] X1是Ala(A)、Thr(T)、Ser(S)、Tyr(Y)、Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)或Glu(E);
[0540] X2是任意氨基酸;
[0541] X3是Ser(S)、Gln(Q)、Asp(D)、Leu(L)、Glu(E)、Cys(C)、Asn(N)、Arg(R)或Ala(A);
[0542] X4是Pro(P)、Gly(G)、Gln(Q)、Leu(L)、Thr(T)、Asn(N)、Ser(S)、Phe(F)或Ile(I);
[0543] X5是任意氨基酸;
[0544] X6是Pro(P)、Ser(S)、Cys(C)、Val(V)、Lys(K)、Thr(T)、Leu(L)、Ile(I)或Gln(Q);
[0545] X7是任意氨基酸;
[0546] X8是Thr(T)、Pro(P)、Leu(L)、Arg(R)、Gly(G)、Tyr(Y)、Gln(Q)、Glu(E)、Ile(I)或Ala(A);
[0547] X9是任意氨基酸;
[0548] X10是Pro(P)、Asn(N)、Glu(E)、Asp(D)、Thr(T)、Leu(L)、Ile(I)、Gln(Q)、Phe(F)或Trp(W);
[0549] X11是Trp(W)、Leu(L)、Ala(A)、Met(M)、Val(V)、Ile(I)、Phe(F)或Tyr(Y);
[0550] X12是带负电荷的氨基酸;
[0551] X13是带正电荷的氨基酸;
[0552] X14是Val(V)、Leu(L)或Ala(A);
[0553] X15是任意氨基酸;
[0554] X16是任意氨基酸;
[0555] X17是任意氨基酸;
[0556] X18是任意氨基酸;
[0557] X19是任意氨基酸;
[0558] X20是任意氨基酸;
[0559] X21Arg(R)、Asp(D)、Tyr(Y)、Val(V)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Ser(S)或Thr(T);
[0560] X22是任意氨基酸;
[0561] X23是任意氨基酸;
[0562] X24是Leu(L)、Pro(P)、Phe(F)、Arg(R)、Tyr(Y)、Cys(C)、Gly(G)、Val(V)或Lys(K)。
[0563] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可以包含少于24个氨基酸残基。事实上,包含少到23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式VIII的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式VIII的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0564] 由于猜测分离的式VIII的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型在组织保护活性方面具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X11、X12、X13和X14没有被删除。
[0565] 分离的式VIII的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物包含多达25、26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式VIII的肽类似物的组织保护特性。
[0566] 式VIII的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式VIII的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0567] 在具体实施方案中,分离的式VIII的肽和肽类似物选自以下定义的肽:
[0568] 肽FJ ARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLL (SEQ ID NO:210);
[0569] 肽FK ITFEKLVIP (SEQ ID NO:211);
[0570] 肽FL TAQGEPFPNNLDKLCGPNVTDFPP (SEQ ID NO:212);
[0571] 肽FM STDQWSELTEAERLQENLQAYRTF (SEQ ID NO:213);
[0572] 肽FN YGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCR (SEQ ID NO:214);
[0573] 肽FO LESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKY (SEQ ID NO:215);
[0574] 肽FP VQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNY (SEQ ID NO:216);
[0575] 肽FQ ISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVEC (SEQ ID NO:217);
[0576] 肽FR SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNG (SEQ ID NO:218);
[0577] 肽FS FNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNV (SEQ ID NO:219);
[0578] 肽FT ARCQVTLRDLFDRAVVLSHYIHNL (SEQ ID NO:220);
[0579] 肽FU LDRVYNEEKRYTH (SEQ ID NO:221);
[0580] 肽FV EANQSTLENFLERLKTIMREKYSK (SEQ ID NO:222);
[0581] 肽FW LERSGLNIEDLEKLQMARPNILGL (SEQ ID NO:223);
[0582] 肽FX LWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQG (SEQ ID NO:224);
[0583] 肽FY TVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKC (SEQ ID NO:225);
[0584] 肽FZ LHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS (SEQ ID NO:226);和
[0585] 肽GA LQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEP (SEQ ID NO:227)。
[0586] 在本发明的另一实施方案中,基于1型细胞因子、呈现结构基序B的分离的肽和肽类似物具有结构式IX(SEQ ID NO:228):
[0587] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25
[0588] 其中:
[0589] X1是Cys(C)、Tyr(Y)或Ala(A);
[0590] X2是Ser(S)、Leu(L)或Glu(E);
[0591] X3是Arg(R)、Gln(Q)或Asn(N);
[0592] X4是Ser(S)或Leu(L);
[0593] X5是Ile(I)、Leu(L)或Lys(K);
[0594] X6是Trp(W)、Leu(L)或Lys(K);
[0595] X7是Leu(L)、Phe(F)或Tyr(Y);
[0596] X8是Ala(A)、Asn(N)或Phe(F);
[0597] X9是Arg(R)、Pro(P)或Asn(N);
[0598] X10是Lys(K)、Leu(L)或Ala(A);
[0599] X11是Ile(I)、Val(V)或Gly(G);
[0600] X12是带正电荷的氨基酸;
[0601] X13是极性氨基酸;
[0602] X14是带负电荷的氨基酸;
[0603] X15是Leu(L)、Gly(G)或Val(V);
[0604] X16是Thr(T)、Ile(I)或Ala(A);
[0605] X17是Ala(A)、Cys(C)或Asp(D);
[0606] X18是Leu(L)、Arg(R)或Asn(N);
[0607] X19是Thr(T)、Asn(N)或Gly(G);
[0608] X20是Glu(E)、Arg(R)或Thr(T);
[0609] X21是Ser(S)、Val(V)或Leu(L);
[0610] X22是Tyr(Y)、Thr(T)、Phe(F);
[0611] X23是Asn(N)或Leu(L);
[0612] X24是Asn(N)或Gly(G);
[0613] X25是Val(V)或Ile(I)。
[0614] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可包含少于25个氨基酸残基。事实上,包含少到24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式IX的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式IX的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0615] 由于猜测分离的式IX的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型在组织保护活性方面具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括极性的、带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X11、X12、X13、X14和X15没有被删除。
[0616] 分离的式IX的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物包含多达26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式IX的肽类似物的组织保护特性。
[0617] 式IX的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式IX的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0618] 在具体实施方案中,分离的肽和肽类似物选自如下定义的肽:
[0619] 肽GB CSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKH (SEQ ID NO:229);
[0620] 肽GC ELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDG (SEQ ID NO:230);
[0621] 肽GD YLQLLLFNPLVKTEGICRNRVTNNV (SEQ ID NO:231);和
[0622] 肽GE AENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGI (SEQ ID NO:232)。
[0623] 在本发明的另一实施方案中,呈现结构基序B的1型细胞因子的分离的肽和肽类似物具有结构式X(SEQ ID NO:233):
[0624] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25
[0625] 其中:
[0626] X1是Leu(L);
[0627] X2是Gly(G);
[0628] X3是Cys(C);
[0629] X4是Val(V);
[0630] X5是Leu(L);
[0631] X6是His(H);
[0632] X7是Arg(R);
[0633] X8是Leu(L);
[0634] X9是Ala(A);
[0635] X10是Asp(D);
[0636] X11是Leu(L);
[0637] X12是带负电荷的氨基酸;
[0638] X13是极性氨基酸;
[0639] X14是带正电荷的氨基酸;
[0640] X15是Leu(L);
[0641] X16是Pro(P);
[0642] X17是Lys(K);
[0643] X18是Ala(A);
[0644] X19是Gln(Q);
[0645] X20是Asp(D);
[0646] X21是Leu(L);
[0647] X22是Glu(E);
[0648] X23是Arg(R);
[0649] X24是Ser(S);
[0650] X25是Gly(G)。
[0651] 在某些实施方案中,分离的肽和肽类似物可包含少于25个氨基酸残基。事实上,包含少到24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或甚至10个氨基酸残基的结构式X的截短或内部删除形式基本上保持了分离的结构式X的肽和肽类似物的整体特征和组织保护特性。
[0652] 由于猜测分离的式X的肽和肽类似物的内部残基在空间上的紧凑电荷构型在组织保护活性方面具有重要性,因此在本发明的某些实施方案中,包括极性的、带负电荷的和带正电荷的残基以及直接相邻的氨基酸没有被删除。因此,在某些实施方案中,残基X11、X12、X13、X14和X15没有被删除。
[0653] 分离的式X的肽和肽类似物也可在其一端或两端或内部延伸具有额外的氨基酸残基,这些残基基本上不干扰,而且在一些实施方案中甚至增强了肽或肽类似物的结构和/或功能特性。事实上,延伸的核心肽和肽类似物包含多达26、27、28或29个氨基酸残基且被认为落在本发明的范围内。优选地,此类延伸肽将基本上保持式X的肽类似物的组织保护特性。
[0654] 式X的核心肽和肽类似物中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基代替,而不会显著不利地影响肽和肽类似物的活性,且在很多情况下甚至增强了所述活性。因此,本发明也涵盖了分离的式X的肽和肽类似物的改变或突变形式,其中,式中的至少一个且多达八个氨基酸残基被另一个氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中,七个、六个、五个、四个、三个、二个或一个氨基酸被保守取代。
[0655] 在具体实施方案中,分离的肽和肽类似物由以下氨基酸序列组成:
[0656] 肽GF LGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERSG (SEQ ID NO:234)。
[0657] 源自1型细胞因子、示例了本文上述结构基序C的肽的进一步例子包括但不限于,源自人血小板生成素的肽GG:DLRVLSKLLRDSHV(SEQ ID NO:235)、肽GH:
PTPVLLPAVDFSLGEWKTQM(SEQ ID NO:236)、 肽 GI:TAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFL (SEQ ID NO:237)、和肽GJ:PNRTSGLLETNFTAS(SEQ ID NO:238);源自GM-CSF 的肽GK:
PSTQPWEHVNAIQEARR(SEQ ID NO:239)、 肽 GL:NETVEVISE(SEQ IDNO:240)、 肽 GM:
QTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTM(SEQ ID NO:241)、 和 肽 GN:KDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO:242); 源 自 CNFT 的 肽 GO:CSRSIWLARKIRSD(SEQ ID NO:243)、 肽 GP:
NKNINLDSADGMPVASTD(SEQ ID NO:244)、 肽 GQ:LLQVAAFAYQIEELMILLEYK(SEQ ID NO:245)、和 肽 GR:ELSQWTVRSIHDLRFISS(SEQ ID NO:246);源 自 IL-6 的 肽 GS:
SERIDKQIRYILDGIS(SEQ ID NO:247)、肽 GT:AENNLNLPKMAEKD(SEQID NO:248)、肽 GU:
EEQARAVQMSTKVLIQ(SEQ ID NO:249)、和 肽GV:RSFKEFLQSSLR(SEQ ID NO:250);源 自IL-3 的 肽GW:SCNMIDEIITHLKQ(SEQ ID NO:251)、肽 GX:ENNLRRPNLEAFNRAVKS(SEQ ID NO:252)、和肽GY:HIKDGDWNEFRRKLTFYLKT(SEQ ID NO:253);源自人干扰素α的肽GZ:
SSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQ(SEQ ID NO:254)、 肽 HA:QQIFNLFTTKDSSAAWDE(SEQ ID NO:
255)、和肽HB:LMNADSILAVKKYFRRITLY(SEQ ID NO:256);源自人干扰素β的肽HC:
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLN(SEQ ID NO:257)、 肽 HD:DRMNFDIPEEIKQLQQFQK(SEQ ID NO:258)、肽HE:KLEKEDFTRGKLMSSLHLKR(SEQ ID NO:259)、和 肽 HF:FINRLTGYLRN(SEQ ID NO:260);源 自 人干 扰素 γ的肽 HG:CYCQDPYVKEAENLKKYFNA(SEQ ID NO:261)、肽 HH:ADNGTLFLGILKNWKEESDR(SEQ ID NO:262)、 肽 HI:NSNKKKRDDFEKLTNYSVTD(SEQ ID NO:263)、和 肽HJ:ELSPAAKTGKR(SEQ ID NO:264);源自人 干细 胞因 子的HK:
SLIIGFAAGALYWKKRQPSL(SEQ ID NO:265)、HL:RNRVTNNVKDVTKLV(SEQ ID NO:266)、肽HM:
DKLVNIVDDLVECVKE(SEQ ID NO:267)、和肽HN:SETSDCWSSTLSPEKDSRV(SEQ ID NO:268);以及源自人多种凝血因子缺乏蛋白2的肽HO:DELINIIDGVLRDDDKNND(SEQ ID NO:269)、肽HP:
GLDKNTVHDQEHIMEHLEGV(SEQ ID NO:270)、和肽HQ:QLHYFKMHDYDGNNLL(SEQ ID NO:271)。
[0658] 源自1型细胞因子、示例了本文上述结构基序D的肽的进一步例子包括但不限于,源自鞘脂激活蛋白C的肽HR:CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL(SEQ ID NO:45);源自hCNTF AB环的肽HS:YVKHQGLNKNINLDSVDGVP(SEQ ID NO:46);源自hIL-6AB环的肽HT:
EALAENNLNLPKMAG(SEQ ID NO:272);源自hIL-2AB环的肽HU:LQMILNGLNNYKNPKLT(SEQ ID NO:273);源自hIL-3AB环的肽HV:ILMENNLRRPNL(SEQ ID NO:274);源自hIL-γAB环的肽HW:FYLRNNQLVAGTL(SEQ ID NO:275);源自hLIF AB环的肽HX:YTAQGEPFPNNVELKLCAP(SEQ ID NO:276);源自hIL-1β螺旋C的肽HY:FNKIEINNKLEFESA(SEQ ID NO:277);和源自hONC-M螺旋C的肽HZ:RPNILGLRNNIYCMAQLL(SEQ ID NO:278)。
[0659] 源自1型细胞因子、示例了本文上述结构基序F的肽的进一步例子包括但不限于,源自hCNTF的肽IA:YVKHQGLNKNINLDSVDGVP-生物素(SEQID NO:279)和源自hIL-3的肽IB:D-生物素-ILMENNLRRPNL(SEQ ID NO:280)。
[0660] 这些前述的氨基酸仅仅是通过1型细胞因子受体信号转导的细胞因子超家族的一些成员的示例,且细胞因子超家族其它成员的同源区域将被技术人员容易地识别。
[0661] 6.3嵌合体
[0662] 本发明还涵盖了“嵌合”肽-线性氨基酸序列,其结合了呈现上述结构基序的EPO分子或其它I型细胞因子朝向外部的氨基酸的非线性结构元件。可用于本发明的嵌合肽可由不同氨基酸序列的结构元件结合到单一肽中而组成。也就是说,嵌合肽可包含源自非线性但邻近的结构元件的氨基酸序列,例如源自SEQ ID NO:1的氨基酸序列110-115、133-136和160-165的片段,其将使得螺旋C的C末端部分和环C-D的N-末端部分、环C-D中的β-折叠、和EPO的C-末端部分的结构元件可以被包含在单个肽中。另外,嵌合肽可被用来选出特定结构的重要特征,例如特定三级结构的朝向外部的氨基酸。因此,可用于本发明的方法的嵌合肽可由包含螺旋B氨基酸58、62、65、69、72、76、79、80、83、84和85(例如肽IC,QEQLERALNSS,SEQ ID NO:281)的片段组成,或者,换言之,由包含EPO螺旋B的所有存在于外部的氨基酸(如在PCT/US2006/031061中公开的)的片段组成。本发明也还涵盖了进一步的嵌合肽,其中第一个谷氨酰胺被焦谷氨酸盐代替(例如肽ID,UEQLERALNSS,SEQ ID NO:282)。
[0663] 此外,可以设计非天然存在的或嵌合的肽,所述肽通过氨基酸线性序列模拟本文上述促红细胞生成素或另一种1型细胞因子中任意两个氨基酸的氨甲酰基碳之间或任意两个氨基酸的侧链之间的关键的空间接近性,而且可以对评估源自其它蛋白的可能的组织保护嵌合体提供指导。本发明也因此针对新的嵌合的组织保护肽,包括呈现了引发组织保护的这些结构基序和关键的空间接近性的肽。
[0664] 此外,通过与两亲性肽螺旋相连可以增加本发明的肽的效力。两亲性肽螺旋是本领域熟知的,例如来自通过B类G-蛋白偶联受体信号转导的肽(例如Segrest等,1990,Proteins 8:103,其通过参考被完整并入本文),其用于将肽配体定位于细胞膜。此类螺旋的例子包括但不限于,来自以下的高度疏水区域:降血钙素(肽IE:ALSILVLLQAGS,SEQ ID NO:283);促肾上腺皮质激素释放激素(肽IF:VALLPCPPCRA,SEQ ID NO:284);β内啡肽(肽IG:NAIIKNAYKKG,SEQ ID NO:285);胰高血糖素(肽IH:GSWQRSLQDTE,SEQ ID NO:286);分泌素(肽II:GGSAARPAPP,SEQ ID NO:287);血管肠肽(肽IJ:NALAENDTPYY,SEQ ID NO:288);神经肽Y(肽IK:GALAEAYPSKP,SEQ ID NO:289);促性腺激素释放激素(肽IL:
GCSSQHWSYGL,SEQ ID NO:290);甲状旁腺激素(肽IM:VMIVMLAICFL,SEQ ID NO:291);胰腺多肽(肽IN:LRRYINMLTRP,SEQ ID NO:292);和降血钙素基因相关肽(肽IO:LALSILVLYQA,SEQ ID NO:293)(在Grace等,2004,PNAS 101:12836中公开,其通过参考被完整并入本文)。例如,可用于本发明的方法的嵌合肽可由具有EPO螺旋B的表面电荷基序的肽(肽IC:
QEQLERALNSS,SEQ ID NO:281)在羧基末端与胰腺多肽的两亲性螺旋(肽IN:LRRYINMLTRP,SEQ ID NO:292)连接形成嵌合肽(肽IP:QEQLERALNSSLRRYINMLTRP,SEQ ID NO:293)来制备,如PCT/US2006/031061中公开的。可以在两亲性螺旋的羧基末端进行进一步的修饰而不影响其组织保护特性。因此,通过用序列TR(肽IQ:QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR,SEQ ID NO:294)替代以上嵌合肽的末端Pro生成可用于治疗组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状中的肽的进一步的例子。
[0665] 此外,其它三级结构也可以替代上述螺旋与肽相连。例如,螺旋B存在于外部的氨基酸可以与EPO的AB环内发现的3折叠(肽IR:CSLNENI,SEQID NO:295)相连以形成具有序列肽IS:CSLNENIQEQLERALNSS(SEQ IDNO:296)的嵌合肽。另外,螺旋C的末端部分存在的氨基酸(肽IT:ALGKA,SEQ ID NO:297,对应于SEQ ID NO:1的氨基酸111、
112、113、116和118)可以与全部或部分的环CD-部分(肽IU:LGAQKEAISPPDAASAAPLRTI,SEQ ID NO:298,对 应 于SEQ ID NO:1 的 氨 基 酸 112-133)结 合 以 形 成 肽 IV:
ALGKALGAQKEAISPPDAASAAPLRTI(SEQ ID NO:299)。
[0666] 另外,呈现以上公开的各种基序——结构基序A(包括式I-IV)、结构基序B(包括式V-X)、结构基序C、结构基序D、结构基序E和结构基序F——的分离的肽也可以组合形成各种嵌合体。在某些实施方案中,嵌合体将排除肽IC,QEQLERALNSS,SEQ ID NO:281;肽IP:QEQLERALNSSLRRYINMLTRP,SEQ ID NO:293;肽IQ:QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR,SEQ ID NO:
294;肽IS:CSLNENIQEQLERALNSS,SEQ ID NO:296;肽IT:ALGKA,SEQ ID NO:297;和肽IV:
ALGKALGAQKEAISPPDAASAAPLRTI,SEQ ID NO:299。
[0667] 优选地,在被融合的肽之间存在连接臂以提供灵活性,以便被连接的肽可以呈现合适的结构定向,来与组织保护受体复合物结合。此类融合肽可能具有协同效应,其可能通过增强与组织保护受体复合物的结合或增长生物半衰期,联合获得比单个肽更强的组织保护效应。
[0668] 本领域普通技术人员将认识到将各种希望的结构元件组合到单个肽中从而将此类化合物在依照本发明的预防、治疗、改善或控制暴露于毒性剂导致的损伤、效应或症状的方法中的效应最大化的益处。此类嵌合体可包含氨基酸肽和非氨基酸元件,例如接头或桥原子或部分。
[0669] 6.4融合肽
[0670] 本发明进一步涵盖了可将两种或多种上述肽、源自肽的片段或嵌合体与相关或不相关蛋白(例如促红细胞生成素、白蛋白等)连接。可以生成此类融合肽以实现协同益处,增加肽的循环半衰期,或增加肽穿透内皮屏障(例如血脑屏障、血液-视网膜屏障等)的能力,或反之亦然,即实现与PCT/US01/49479(其作为WO 2002/053580公开,作为参考完整并入本文)中公开的类似的转运机制。
[0671] 6.5肽的制造
[0672] 可使用本领域熟知的重组或合成技术制备可用于本发明的方法的肽。特别地,固相蛋白合成非常适合长度相对短的肽且可以提供更高的产率和更一致的结果。另外,固相蛋白合成就肽的制造而言可以提供额外的灵活性。例如,可以在合成阶段将希望的化学修饰结合到肽中:高瓜氨酸可以替代赖氨酸用在肽的合成中,由此消除了在合成之后将肽氨基甲酰化的需要,或者带有保护功能基团的氨基酸在合成期间可以留在肽上。
[0673] 合成
[0674] 可用于本发明的方法的分离的肽和肽类似物可以使用常规的分步法或固相合成法来制备(参见例如,Merrifield,R.B.,1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154;Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams等编辑,1997,CRC Press,Boca Raton Fla.,以及其中引用的参考文献;Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,Atherton&Sheppard编辑,1989,IRL Press,Oxford,England,以及其中引用的参考文献)。
[0675] 或者,可用于本发明的肽和肽类似物可以通过片段缩合法制备,如在例如Liu等,1996,Tetrahedron Lett.37(7):933-936;Baca等,1995,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887;
Tam等,1995,Int.J.Peptide Protein Res.45:209-216;Schnolzer和Kent,1992,Science
256:221-225;Liu 和 Tam,1994,J.Am.Chem.Soc.116(10):4149-4153;Liu 和 Tam,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:6584-6588;Yamashiro和Li,1988,Int.J.Peptide Protein Res.31:322-334中描述的。该方法特别适合包含Gly(G)的肽。可用于合成本发明的肽和肽类似物的其它方法描述在Nakagawa等,1985,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092中。
[0676] 重组技术
[0677] 各种宿主-表达载体系统可以用来生产肽和肽类似物。这些宿主-表达系统代表了可以通过其生成并随后纯化感兴趣的肽的媒介物,其还代表了当被合适的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位呈现修饰的促红细胞生成素基因产物的细胞。这些系统包括但不限于细菌、昆虫、植物、哺乳动物(包括人宿主系统),例如但不限于,被包含肽编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;被包含促红细胞生成素相关的分子编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV;烟草花叶病毒TMV)感染,或被包含促红细胞生成素相关的分子编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统;或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统,包括人细胞系统,例如HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3、PERC6,所述重组表达构建体包含源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子;牛痘病毒7.5K启动子)。
[0678] 另外,可以选择宿主细胞株,其调节插入序列的表达,或以希望的具体方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的这些修饰和加工可能对蛋白功能是重要的。如本领域普通技术人员已知的,不同的宿主细胞具有特定的蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为了这一目的,可以使用真核宿主细胞,其具有的细胞体系能合适加工初始转录物、糖基化和磷酸化基因产物。这样的哺乳动物宿主细胞包括人宿主细胞,包括但不限于HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38。
[0679] 为了重组肽的长期、高产量的制备,稳定表达是优选的。例如,可以工程化稳定表达重组的组织保护细胞因子相关分子基因产物的细胞系。宿主细胞用被合适的表达控制元件控制的DNA和选择标记转化而不使用包含病毒复制原点的表达载体,所述表达控制元件例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等。引入外源DNA后,可以让工程细胞在富集培养基中生长1-2天,然后转换到选择性培养基。重组质粒中的选择标记赋予了选择抗性,且允许细胞在其染色体中稳定整合质粒并生长以形成灶,其继而可被克隆并扩增成细胞系。本方法可有利地用来工程化表达组织保护产物的细胞系。这些工程细胞系可能在筛选和评估影响EPO相关的分子基因产物的内源活性的化合物方面特别有用。
[0680] 进一步修饰
[0681] 具有额外修饰的肽也可以用于本发明的预防、治疗、改善或控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的方法中。例如,上述结构基序的肽可以用一个或多个(D)-氨基酸来合成。在本发明的肽中包含(L)-或(D)-氨基酸的选择部分取决于肽的期望特征。例如,结合一个或多个(D)-氨基酸可使得肽在体外或体内的稳定性增加。一个或多个(D)-氨基酸的结合也可以增加或降低肽的结合活性,如例如使用本文描述的生物测试或本领域熟知的其它方法测定的。
[0682] 用相应的对映体(D)-氨基酸序列替代全部或部分的(L)-氨基酸序列在肽链的相应部分提供了光学异构结构。反转全部或部分的(L)-氨基酸序列的序列提供了肽的逆向-类似物(retro-analogue)。对映体(L至D或D至L)置换和序列反转相结合提供了肽的逆向-反转-类似物(retro-inverso-analogue)。本领域技术人员已知,对映体肽、其逆向-类似物、和其逆向-反转-类似物与其母体肽维持显著的拓扑关系,且母体肽和其逆向-反转-类似物经常获得尤其高度的相似。所述关系和相似度可以反映在肽的生化特性中,尤其是相应的肽和类似物与受体蛋白的高度结合。对肽的逆向-反转-类似物特性的合成已经在例如Methods of Organic Chemistry(Houben-Weyl),Synthesis of Peptides andPeptidomimetics-Workbench 版,卷 E22c(总编 辑Goodman M.)2004(GeorgeThieme Verlag Stuttgart,New York)和其中引用的参考文献中讨论,所述文献通过参考被完整并入本文。
[0683] 氨基酸“修饰”指改变天然存在的氨基酸以制备非天然存在的氨基酸。含有非天然存在的氨基酸的本发明的肽的衍生物可以通过化学合成或通过在生物合成期间在肽中特定位点结合入非天然氨基酸来制备,如在Christopher J.Noren,Spencer J.Anthony-Cahill,Michael C.Griffith,Peter G.Schultz,1989Science,244:182-188中描述的,该文献通过参考被完整并入本文。
[0684] 与治疗有用的肽结构类似的肽模拟物可用来产生等同的治疗或预防作用。一般地,肽模拟物与范例多肽(即具有生化特性或药理活性的多肽)结构类似,但具有一个或多个肽键任选地被选自以下的键替代:-CH2-NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CH2SO-,所述替代通过本领域已知的和在以下参考文献中进一步描述的方法进行:Spatola,A.F.“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,andProteins”,B.Weinstein编 辑,Marcel Dekker,New York,267 页(1983);Spatola,A.F.,Vega Data(1983 年3 月),卷 1,第 3期,“Peptide Backbone Modifications”(综述);Morely,J.S.,Trends Pharma Sci(1980)463-468页(综述);Hudson,D.等,(1979)Int J Pept Prot Re 14:177-185(-CH2-NH-、-CH2-CH2-);Spatola,A.F.等,(1986)Life Sci 38:1243-1249(-CH2-S-);Hann,M.M.,(1982)J Chem SocPerkin Trans I 307-314(-CH=CH-,顺式和反式);Almquist,R.G.等,(1980)JMed Chem 23:
1392(-COCH2-);Jennings-White,C 等,(1982)Tetrahedron Lett23:2533(-COCH2-);
Szelke,M 等,European Appln.EP 45665(1982)CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-);
Holladay,M.W.等,(1983)Tetrahedron Lett24:4401-4404(-C(OH)CH2-);和Hruby,V.J.,(1982)Life Sci 31:189-199(-CH2-S-);各文献通过参考被完整并入本文。
[0685] 在另一个实施方案中,特别优选的非肽键是-CH2NH-。这样的肽模拟物可能比肽实施方案具有显著的优势,包括,例如:更加经济的生产、更强的化学稳定性、增强的药理特性(半衰期、吸收、效力、功效等)、改变的特异性(例如广谱生物活性)、降低的抗原性等。
[0686] 肽模拟物的各种设计是可能的。例如,本发明特别涵盖了其中的必要构象被非肽稳定化的环肽,Lobl等的美国专利号5,192,746,Aversa等的美国专利号5,576,423,Shashoua的美国专利号5,051,448,和Gaeta等的美国专利号5,559,103,所有文献通过参考被并入本文,其描述了创造这些化合物的多种方法。模仿肽序列的非肽化合物的合成也是本领域已知的。Eldred等,J.Med.Chem.37:3882(1994)(其通过参考被完整并入本文)描述了模仿肽序列的非肽拮抗剂。Likewise,Ku等,J.Med.Chem 38:9(1995)(其通过参考被完整并入本文)进一步阐明了一系列这样的化合物的合成。
[0687] 合成后可进行进一步的修饰。例如,肽可以被进一步化学修饰,即氨基甲酰化、乙酰化、琥珀酰化、胍基化、硝化、三硝基苯基化、脒基化等,所述修饰依照美国专利申请号10/188,905(其作为20030072737-A1在2003年4月17日公开,并公开了化学修饰的EPO)和依照2003年7月1日提交的美国专利申请号10/612,665和2000年12月29日提交的
美国专利申请号09/753,132进行,所述文献通过参考被完整并入本文。
[0688] 另外,肽可以由重组肽-突变蛋白(mutein)组成。公开的突变可包括取代、删除(包括内部删除)、增加(包括产生融合蛋白的增加)、或在氨基酸序列内和/或与其邻近的氨基酸残基的保守取代(但这导致“沉默”改变)、和非保守氨基酸改变、以及较大的插入和删除,如此前在PCT/US03/20964题为“RecombinantTissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic Acids Thereof for Protection,Restoration,and Enhancement of Responsive Cells,Tissues,and Organs”中公开的(其通过参考被完整并入本文)。
[0689] 保守或非保守的氨基酸取代可以在一个或多个氨基酸残基处发生。保守和非保守取代均可以进行。保守替代是在一组侧链相关的氨基酸族内发生的替代。遗传编码的氨基酸可以分成四族:(1)酸性的=Asp(D)、Glu(G);(2)碱性的=Lys(K)、Arg(R)、His(H);(3)非极性(疏水的)=Cys(C)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Met(M)、Trp(W)、Gly(G)、Tyr(Y);和(4)无电荷且极性的=Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)。非极性的氨基酸可以细分成:强疏水的=Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Met(M)、Phe(F);和适度疏水的=Gly(G)、Pro(P)、Cys(C)、Tyr(Y)、Trp(W)。作为替代方式,氨基酸整体可以分组为(1)酸性的=Asp(D)、Glu(G);(2)碱性的=Lys(K)、Arg(R)、His(H),(3)脂肪族的=Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T),其中Ser(S)和Thr(T)可任选地被单独分组为脂肪族-羟基;(4)芳香族的=Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W);(5)酰胺=Asn(N)、Glu(Q);和(6)含硫的=Cys(C)和Met(M)。(参见,例如,Biochemistry,第4版,L.Stryer编辑,WH Freeman and Co.,1995,其通过参考被完整并入本文)。
[0690] 或者,突变可以沿着肽的全部或部分编码序列被随机引入,例如通过饱和诱变,且可以筛选得到的突变体的生物活性,以识别维持活性的突变体。诱变后,编码的肽可被重组表达,而且可确定重组肽的活性。
[0691] 在另一个实施方案中,可以通过添加聚合物(例如聚乙二醇)、糖、或额外蛋白质(例如融合构建体)对肽进行进一步修饰以力求延长肽的半衰期或增强肽的组织保护作用。这些修饰的例子在WO/04022577A3和WO/05025606A1中公开,所述文献通过参考被完整并入本文。例如,聚乙二醇聚合物可以与肽IC相连以生成肽IW((SEQ ID NO:298)PEG-QEQLERALNSS)。
[0692] 取决于选择的偶联化学和肽上已存在或制造出的反应位点的数目,可以用可重复的方式添加一个、两个或选定数目的聚合物。PEG及其衍生物与肽连接的主要模式是通过肽氨基酸残基的非特异性键合(参见例如,美国专利号4,088,538、美国专利号4,496,689、美国专利号4,414,147、美国专利号4,055,635、和PCT WO 87/00056)。PEG与肽连接的另一种模式是通过糖肽上的糖基残基的非特异性氧化(参见例如WO 94/05332)。在这些非特异性方法中,PEG以随机的、非特异性的方式添加到肽骨架上的反应残基上。
[0693] 7.测试肽的试验
[0694] 可以使用各种试验来确定上述肽在用于本发明的治疗方法时的实用性。可以使用本领域已知的和在美国专利申请号10/554,517、10/612,665和11/997,898中公开的各种试验确认肽的组织保护活性。此外,缺乏红细胞生成活性或红细胞生成活性降低的肽可通过使用各种体外试验,例如EPO依赖性细胞系(UT-7)小鼠脾生物试验(Krystal,3
G.(1983)(促红细胞生成素的简单微量分析,其基于经苯肼处理的小鼠的脾细胞中 H-胸苷的结合量,Exp.Hematol.11,649-660)、或克隆试验(Spivak,J.L.,Seiber,F.(1983).Erythropoietin.Horm.Norm.Abnorm.Hum.Tissues 3,63-96),以及体内试验,例如低氧红细胞增多小鼠测试(Cotes PM,Bangham DR,Bio-assay of erythropoietin in mice madepolycythaemic by exposure to air at a reduced pressure,Nature.1961年9月9日;191:1065-7)来确认。另外,本领域普通技术人员将认识到,可以通过各种体外和体内试验确认肽预防、缓和或治疗组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的能力,尽管在某些实施方案中体内试验可能是优选的。
[0695] 7.1组织保护试验和模型
[0696] 本方法中使用的肽呈现组织保护特性,即抗凋亡、神经突生长、神经保护特性等。可以测试本发明的肽的组织保护活性,例如,保护细胞、组织或器官。可以使用体外和体内试验进一步测试保护活性。指示组织保护活性的体外测试包括,例如,细胞增殖试验、细胞分化试验、或检测被组织保护受体复合物例如组织保护细胞因子受体复合物上调的蛋白或核酸的存在和活性,例如,核仁蛋白、脑红蛋白、细胞球蛋白或frataxin。例如,脑红蛋白可能参与促进氧气的运输或短期储存。因此,氧气运输或储存试验可以用作识别或筛选调节组织保护活性的化合物的试验。
[0697] 脑红蛋白对缺氧或缺血产生应答而在中枢神经系统的细胞和组织中表达,且可提供保护以免受损伤(Sun等2001,PNAS 98:15306-15311;Schmid等,2003,J.Biol.Chem.276:1932-1935,各文献通过参考被完整并入本文)。细胞球蛋白可能在保护中扮演类似角色,但在各种组织中以变化的水平表达(Pesce等,2002,EMBO 3:1146-1151,其通过参考被完整并入本文)。在本发明的一个实施方案中,可以在将肽与细胞接触之前和之后,测量细胞中的上调蛋白的水平。在某些实施方案中,与组织保护活性相关的上调蛋白在细胞中的存在可以用来确认肽的组织保护活性。
[0698] 核仁蛋白可保护细胞免于损伤。其在细胞中发挥多种作用,包括调节转录过程、序列特异性RNA-结合蛋白、胞质分裂、成核、信号转导、T-细胞诱发的凋亡、染色质重构、或复制。其也可以作为细胞表面受体DNA/RNA解旋酶、DNA依赖性ATP酶、蛋白穿梭、转录因子成分、或转录抑制因子发挥功能(Srivastava和Pollard,1999,FASEB J.,13:1911-1922;和Glnisty等,1999,J.Cell Sci.,112:761-772,各文献通过参考被完整并入本文)。
[0699] Frataxin是线粒体铁代谢中涉及的蛋白,且此前已经显示,在体内和体外均被EPO强烈上调(Sturm等,(2005)Eur J Clin Invest 35:711,其通过参考被完整并入本文)。
[0700] 上调蛋白的表达可以通过检测细胞中对应于该蛋白的mRNA水平来检测。mRNA可以与特异性结合编码该上调蛋白的核酸的探针杂交。杂交可以由例如Northern印迹、Southern印迹、阵列杂交、亲和色谱或原位杂交组成。
[0701] 也可以使用体外神经保护试验检测本发明的肽的组织保护活性。例如,可以通过胰蛋白酶消化由新生大鼠海马制备原代神经元培养物,且通过如任何本领域已知的和/或本文描述的方法培养,例如在MEM-II生长培养基(Invitrogen),20mM D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、10%Nu-血清(牛;BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)、2%B27补充剂(Invitrogen)、26.2mM NaHCO3、100U/ml青霉素、和1mg/ml链霉亲和素(参见,例如,Leist等,2004,Science305:239-242,其通过参考被完整并入本文)中培养。在接种一天后,加入1μM胞嘧啶阿拉伯-呋喃糖苷。然后将培养了十三天的培养物用增加剂量的感兴趣的肽(3-3000pM)预培养24h。在第14天,去除培养基,并用含300μM NMDA的PBS在室温(RT)激发培养物。5分钟后,预处理的培养基返回到培养物中,然后将该培养物返回培养箱24h。
细胞在多聚甲醛中固定,用Hoechst 33342(Molecular Probes,Eugene,OR)染色,且对固缩的凋亡细胞核进行计数。包含NGF(50ng/ml)和MK801(1μM)作为阳性对照。
[0702] 可以使用动物模型系统来证实化合物的组织保护活性,或证实通过本发明的上述筛选方法识别的化合物的安全性和功效。可以使用动物模型测试在试验中识别的化合物对关注的一类组织损伤、疾病、状况或综合征的生物活性。所述动物模型系统包括被工程化从而包含与功能性读出系统偶联的组织保护受体复合物的动物,例如转基因小鼠。
[0703] 可以用来测试识别出的化合物的细胞或组织保护活性的功效的动物模型是本领域已知的且包括,例如,针对Lewis大鼠中急性实验性过敏性脑脊髓炎发作的保护,在接受了脑创伤、脑缺血(“中风”)或由兴奋性毒素刺激的癫痫后的小鼠中恢复或保护减弱的认知功能(Brines等,2000,PNAS,97:10295-10672,其通过参考被完整并入本文),针对诱发的视网膜缺血的保护(Rosenbaum等,1997,Vis.Res.37:3443-51,其通过参考被完整并入本文),针对坐骨神经损伤的保护,和针对心脏的缺血-再灌注损伤的保护(体外心肌细胞研究和体内缺血-再灌注损伤,参见,例如,Calvillo等,2003,PNAS100:4802-4806和Fiordaliso等,2005,PNAS 102:2046-2051,其各自通过参考被完整并入本文)。这些试验在Grasso等,(2004)Med Sci Monit 10:BRl-3,PCT公开号WO02/053580,或PCT申请PCT/US2006/031061中进一步详细描述,其各自通过参考被完整并入本文。其中描述的体内方法针对EPO的施用,但是,已经发现,取代EPO而被施用的组织保护蛋白也呈现类似的生物活性,例如,Leist等,(2004)Science 305:239-242,其通过参考被完整并入本文。供测试的肽也可以被替换。用于测定肽的组织保护活性的其它试验是本领域技术人员熟知的。
[0704] 或者,可使用细胞结合试验评估本发明的肽。例如,感兴趣的肽可以与生物标记物结合,例如易于检测的荧光或放射标记的标记物,并测试与表达EPOR和/或βc受体的经转染的BaF3细胞的结合。在96孔板中,将感兴趣的肽在生长培养基(RPMI 1640,10%胎牛血清、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺)中的八次1∶2连续稀释物铺板,使得每孔中的终体积为约100μl。可以用生长培养基(见上)将BaF3亲本系和用EPOR和/或βc受体转染的BaF3细胞洗涤三次,用生长培养基将细胞团重悬,并对细胞进行计数,且在生长培养基中将细胞稀释到5,000个细胞/100μl。然后向每个肽稀释液中加入100μl经稀释的细胞。将试验板然后在37℃培养箱中培养三到四天。然后洗涤板/细胞,并在荧光读板器上读板,或通过其它合适的方法来检测与感兴趣的肽的生物活性相关的生物标记物水平。
[0705] 类似地,可以利用竞争试验来测定肽是否是组织保护性的。在竞争试验中,已知是组织保护性的化合物可以与合适的生物标记物连接,所述化合物包括但不限于组织保护细胞因子,例如在美国专利申请号10/188,905和10/185,841(其各自通过参考被完整并入本文)中公开的化合物。
[0706] 在96孔板中,将已知的组织保护化合物/生物标记物在合适的生长培养基中的八次1∶2连续稀释物、以及已知的组织保护化合物/生物标记物的相同稀释物系列和过量的感兴趣的肽铺板。各稀释物的终体积应为约100μl。再次地,如以上所公开的,将BaF3细胞接种到板中并进行培养。在合适量的时间后,洗涤细胞,并在荧光读板器上读板,或通过本领域已知的任何其它合适的方法来检测生物标记物。如果包含已知的组织保护化合物/生物标记物和感兴趣的肽的板和/或孔的读数小于仅包含已知的组织保护化合物/生物标记物的板的读数,那么感兴趣的肽是组织保护性的。
[0707] 至今发现的许多蛋白因子,包括所有已知的细胞因子,已在一个或多个因子依赖性细胞增殖试验中呈现活性,因此这些试验成为细胞因子活性的方便的确认手段。肽的活性可以通过若干对细胞系的常规因子依赖性细胞增殖试验中的任何一个证实,所述细胞系包括但不限于32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e和CMK。这些细胞在肽的存在或缺乏下培养,且通过例如测量含氚胸苷的结合量,或通过基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴(MTT)的代谢分解的比色分析(Mosman,1983,J.Immunol.Meth.65:55-63,其通过参考被完整并入本文)来检测细胞增殖。
[0708] 如果肽呈现了组织保护活性,本领域普通技术人员将认识到,使用一种本领域技术人员已知的神经保护和组织保护试验来证实结果将是有益的,所述试验例如但不限于P-19和PC-12细胞试验。另外,各种体内模型,例如与脊髓损伤、缺血性中风、外周神经损伤、伤口、或心脏、眼、肾等的损伤相关的动物模型将有助于进一步对肽进行表征。合适的体外和体内试验公开在美国专利申请号10/188,905和10/185,841中,其通过参考被完整并入本文。
[0709] 7.2对具体适应症的试验
[0710] A.毒性剂
[0711] 可以使用本领域已知的或本文描述的各种试验证明在本发明的方法中使用的分离的肽在体外或体内抑制由暴露于毒性剂所导致的损伤、效应或症状。
[0712] 可以在本领域的各种体外试验中检测在本发明的方法中使用的进一步的肽,以确定其预防、治疗、改善或控制由暴露于毒性剂所导致的损伤、效应或症状的能力。一般而言,如下完成所述试验:选择合适的细胞系,将该细胞与感兴趣的毒性剂接触,用感兴趣的肽治疗一部分细胞,并确定在毒性剂的存在下以及在毒性剂和感兴趣的肽的存在下细胞的存活或应答。如果细胞在肽的存在下呈现了存活的改善或损伤、效应或症状的减少,该肽可以被认为是毒性暴露的可能的治疗剂。此外本领域普通技术人员将认识到,肽作为保护剂的能力可以通过在毒性剂激发前用肽处理细胞来评估。
[0713] 例如,对毒性剂的合适试验包括但不限于:化学药剂:a)皮肤细胞系,例如J-774(源自小鼠巨噬细胞的细胞系)、CHO-K1(源自中国仓鼠卵巢细胞的上皮细胞系株)、和HeLa(人子宫颈癌)(Sawyer,T.等,Hypothermia as an adjunctto vesicant-induced skin injury,Eplasty 2008;8:e25);b)针对糜烂剂的角膜细胞系(Amir,A.等,The corneal epithelium in sulfur mustard ocular injury-Invitro and ex vivo studies,Proceedings of the U.S.Army Medical DefenseBioscience Review,Aberdeen Proving Ground,MD(2004));c)巨噬细胞(AmirA.等,Sulfur mustard toxicity in macrophages:effect of dexamethasone,J ApplToxicol,20 Suppl 1:S51-8(2000));d) 上 呼 吸道细胞系(Andrew,D.J. 和C.D.Lindsay,Protection of human upper respiratory tract cell lines against sulphurmustard toxicity by gluthione esters,Hum Exp Toxicol 17(7):387-95(1998);Calvet等,Airway epithelial damage and release of inflammatory mediators inhuman lung parenchyma after sulfur mustard exposure,Hum Exp Toxicol18(2):77-81(1999);Langford,A.M. 等,The effect of sulphur mustard onglutathione levels in rat lung slices and the influence of treatment with arylthiolsand cysteine esters,Hum Exp Toxicol 15(8):619-24);e)皮肤模型(Blaha等,Effects of CEES on inflammatory mediators,heat shock protein 70A,histologyand ultrastructure in two skin models,J Appl Toxicol 20 Suppl 1:
S101-8(2000);Henemyre-Harris 等,An in vitro wound healing model to screen pharmacologicalinterventions for the effective treatment of cutaneous sulfur mustard injuries,Proceedings of the U.S.Army Medical Defense Bioscienee Review,AberdeenProving Ground,MD(2004))(关于合适的体外研究的更多文献,一般参见www.counteract.rutgers.edu/invitro.html);辐射剂:a)内皮细胞(Abderrahmani,R. 等,Role of plasminogen activator inhibitor type-1 in radiation-induced endothelialcell apoptosis,Radioprotection 2008,卷43,第5号),b)神经免 疫细胞(传入神经、肠感觉神经、肥大细胞)(Wang,J.等,Neuroimmune interactions:
potentialtarget for mitigating or treating intestinal radiation injury,British Journal ofRadiology(2007)80,S41-S48),c)血或淋巴细胞培养物(Lloyd DC等,
Phys MedBiol 18(3):421-31(1973);Lloyd DC 等,Mutat.Res.179(2):197-208(1987);
Blakely WF等,Stem Cells 13(Suppl 1):223-30(1995);Gotoh E等,Int.J.Radiation.Biol.81(1):33-40(2005));生物制剂:(a)外周血单核细胞(Rasha,H.等,Modeling of SEB-induced host gene expression to correlate in vitro to in vivoresponses:
Microarrays for biodefense and environmental applications,Biosensorsand Bioelectrics(2004)卷20,第4号,719-727)。
[0714] 此外,本领域已知用于评估治疗剂对毒性剂暴露的功效的合适的体内试验。本发明涵盖了使用大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、猪、绵羊、貂、狗和非人灵长目动物的动物模型,以及特别易受毒性剂影响的转基因动物(CD46小鼠)。特别地,本领域已知的试验包括但不限于:化学药剂:(1)Reid,F.M.,Sulfur mustard induced skin burns in weanling swine evaluated clinically andhistopathologically,Journal of applied toxicology,卷20(S1),S153-S160页(2001);(2)Isidore,M.A.等,A dorsal model for cutaneous vesicant injury2-chloroethyl ethyl sulfide using c57b1/6 mice,Cutaneous and ocular toxicology,卷 26(3),265-276(2007);(3) 一 般 参 见,www.counteract.rutgers.edu/animal.html;(4)Kassa J.等,The Choice:HI-6,pradoxime or Obidoxime against Nerve Agents ?,www.asanlte.com/ASANews-97/Antidot-Choice.html,(5)Shih,TM 等,Organophosphorous nerve agents-induced seizures and efficacy of atropine sulfateas anticonvulsant treatment,Pharmacol-Biochem-Behav.1999年 9 月,64(1),147-53,(6)Luo,C 等,Comparison of oxime reactivation and aging of the nerveagent-inhibited monkey and human acetylcholinesterases,Chemico-BiologicalInteractions,175(1-3),261-266(2008);辐射剂:(1)W.F.Blakely等,In Vitroand Animal Models of Partial-Body Dose Exposure:Use of Cytogenic andMolecular Biomarkers for Assesment of Inhomogeneous Dose ExposuresandRadiation Injury,PB-Rad-Injury 2008 Workshop,2008 年 5 月 5-6 日,AFRRI,Bethesda,Maryland;(2)Augustine,A等,Meeting Report:Animal Models ofRadiation Injury,Protection and Therapy,Radiation Research 164:100-109(2005);(3)Houchen,C等,Prosurvival and antiapoptotic effects of PGE2 inradiation injury are mediated by EP2 receptor in intestine,Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol,284:G490-G498,2003;(4)Jichun Chen,AnimalModels for Acquired Bone Marrow Failure Syndromes,Clinical Medicine&Research 3(2):102-108;生物制剂:(1)Biodefense:Research Methodology andAnimal Models,James R.Swearengen(编辑)2006 CRC Press。
[0715] B.炎症
[0716] 另外,可使用关于炎症的各种体外模型来评估肽保护或治疗炎症对身体的损伤、症状或效应的能力。首先,可以通过在用肽治疗后使用已知方法在炎症性试验中测量炎症介质的水平来确认肽调节炎症介质的能力,所述方法包括但不限于ELISA、流式细胞微珠阵列分析、高灵敏度和免疫浊度试验。例如,为确定肽是否调节TNF-α或IL-1,可使用LPS-介导的细胞因子生成的鼠模型。鼠模型中的一些小鼠用感兴趣的肽预处理,然后用LPS激发,而其它的小鼠将被盐水处理。然后收集血液,并可以通过ELISA试剂盒(OPT-EIA小鼠TNF-α和IL-1ELISA试剂盒(BD Biosciences))来确定血中的TNF-α和IL-1水平。如果治疗的动物中的TNF-α水平低于盐水处理的动物中的TNF-α水平,那么可以认为该肽调节了TNF-α。优选地,检测肽调节多于一种炎症介质的能力,且更优选地,所述介质不是TNF-α或者是除TNF-α以外的介质,且最优选地,所述介质是组胺。类似地,可以在另外的体外试验中检测肽,包括但不限于在Lopata,Andreas L.,Specialized in vitro Diagnostic Methods InThe Evaluation Of Hypersensitivity-An Overview,Current Allergy&ClinicalImmunology,2006年3月,第19卷,第1号(组胺和类胰蛋白酶试验),和Arulmozhi等,Pharmacological Investigations of Sapindus trifoliatus in various invitro and in vivo models of inflammation,Indian Journal of Pharmacology,卷
37:2,96-102(2005)(5-脂氧合酶(5-LO)、环加氧酶(COX)、白细胞三烯B4(LTB4)和一氧化氮合酶(NOS))中公开的试验。
[0717] 此外,炎症的体内试验可用于评估肽作为针对毒性剂的治疗剂的效用。体内试验,包括但不限于鼠EAE模型、利用转基因小鼠的试验(例如严重结肠炎的MDBiosciences DSS IBD鼠模型)、炎症性肠炎的MDBioscience TNBSIBD鼠模型、涉及美国专利号6,437,216中公开的IL-1敲除小鼠的模型、或涉及TNF-α的转基因小鼠模型,如在如下文献中所公开的:Probert等,Spontaneous inflammatory demyelinating disease in transgenic mice showingCNS-specific expression of tumor necrosis factor α.Proc.Natl.Acad.Sci.1995USA 92,11294-11298;Kontoyiannis 等,Impaired on/off regulation of TNFbiosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements:implications for joint andgut-associated immunopathologies.Immunity 10:387-398,1999;Keffer等,Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor:a predictive geneticmodel of arthritis.EMBO J.1991年12月;10(13):4025-31,或使用化学或合成物激发以诱发炎症的模型,例如在JPET 307:373-385,2003中公开的哮喘和慢性阻塞性肺病的模型、在EP1777234中公开的佐剂性关节炎模型、鼠LPS休克模型、鼠LPS肺模型、急性爪子炎症模型、或组氨酸激发的风团形成模型,如下面详细公开的。
[0718] 此外,使用熟知的临床研究检测化合物在人中的功效,例如皮肤点刺试验和支气管激发试验,在Ravensberg等,“Validated safety predictions of airwayresponses to house dust mites in asthma”,Clinical and Experimental Allergy,37:100-107(2007)中公开;哮喘研究,如在Diamant等,“Methods used in clinicaldevelopment of novel anti-asthma therapies”,Respiratory Medicine(2008)102,332-338中公开的;或鼻过敏原激发,如在Boot等,“Nasal Nitric Oxide:longitudinal reproducibility and the effects of a nasal allergen challenge in patientswith allergic rhinitis”,Allergy 2007:62:378-384中公开的。
[0719] C.癌症
[0720] 可以使用本领域已知的或本文描述的各种试验证实在本发明的方法中使用的分离的肽在体外或体内抑制肿瘤细胞增殖、细胞转化和肿瘤发生。这些试验可以使用癌症细胞系的细胞或来自患者的细胞。可以使用本领域熟知的许多试验来评估这些存活和/或生3
长;例如,细胞增殖可以通过测量 H-胸苷的结合量、通过直接细胞计数、通过检测已知基因例如原癌基因(例如fos、myc)或细胞周期标记(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3或E)的转录、翻译或活性的变化来测定。这些蛋白和mRNA水平和活性可以通过任何本领域熟知的方法测定。例如,蛋白可以通过已知的免疫诊断法来定量,例如使用可商业购买的抗体(例如,许多细胞周期标记抗体来自Santa Cruz,Inc.)的Western印迹或免疫沉淀。mRNA可以通过本领域熟知和常规的方法定量,例如通过northern分析、核糖核酸酶保护、与逆转录相关的聚合酶链式反应等。细胞活力可以通过使用台盼蓝染色或本领域已知的其它细胞死亡或活力标记物来评估。分化可以根据形态学的改变等来视觉评估。
[0721] 本发明提供了通过本领域已知的各种技术进行的细胞周期和细胞增殖分析,包括但不限于以下:
[0722] 作为一个例子,溴脱氧尿苷(“BRDU”)的结合可被用作识别增殖细胞的试验。BRDU试验通过BRDU向新合成的DNA中的结合来识别经历DNA合成的细胞群。然后新合成的DNA可以使用抗BRDU抗体检测(参见Hoshino等,1986,Int.J.Cancer 38,369;Campana等,1988,J.Immunol.Meth.107,79)。
[0723] 细胞增殖也可以使用(3H)-胸苷的结合来检测(参见例如,Chen,J.,1996,Oncogene 13:1395 403;Jeoung,J.,1995,J.Biol.Chem.270:1836773)。该试验可以对S3
期的DNA合成进行定量表征。在这个试验中,合成DNA的细胞将使 H-胸苷结合到新合成的DNA中。随后可以通过本领域标准技术测量所述结合,例如通过闪烁计数器(例如Beckman LS 3800液体闪烁计数器)对放射性同位素计数。
[0724] 对增殖细胞核抗原(PCNA)的检测也可被用来测量细胞增殖。PCNA是36千道尔顿的蛋白,其在增殖细胞特别是在细胞周期的G1早期和S期中的表达升高,因此该蛋白可作为增殖细胞的标记物。通过使用抗-PCNA抗体免疫染色识别阳性细胞(参见Li等,1996,Curr.Biol.6:189199;Vassilev等,1995,J Cell Sci.108:1205 15)。
[0725] 可以通过随时间对细胞群的样本进行计数(例如每日细胞计数)来测量细胞增殖。可以使用血球计和光学显微镜对细胞进行计数(例如HyLite血球计,Hausser Scientific)。为了获得感兴趣的细胞群的生长曲线,将细胞数对时间作图。在优选实施方案中,通过本方法计数的细胞首先与染料台盼蓝(Sigma)混合,使得活细胞排除染料,且被计数为该群体的有活力的成员。
[0726] 可以例如基于细胞的DNA倍体值测量细胞的DNA含量和/或有丝分裂指数。例如,处在细胞周期的G1期的细胞一般包含2N DNA倍体值。其中DNA已经复制但还没有进行有丝分裂的细胞(例如S-期中的细胞)将呈现比2N高且多达4N DNA含量的倍体值。倍体值和细胞周期动力学可以使用碘化丙啶试验进一步测量(参见例如,Turner,T.等,
1998,Prostate 34:17581)。或者,DNA倍性可以通过在计算机微密度测定染色系统(参见例如,Bacus,S.,1989,Am.J.Pathol.135:78392)中对DNA Feulgen染色(其以化学计量方式与DNA结合)的定量来确定。在另一实施方案中,DNA含量可以通过制备染色体分散(chromosomal spread)来分析(Zabalou,S.,1994,Hereditas.120:12740;Pardue,1994,Meth.Cell Biol.44:333351)。
[0727] 细胞周期蛋白(例如CycA、CycB、CycE、CycD、cdc2、Cdk4/6、Rb、p21或p27)的表达提供了与细胞或细胞群的增殖状态相关的关键信息。例如,抗增殖信号通路中的识别可以通过p21cip1的诱导来表示。p21在细胞中的表达水平增加导致延迟进入细胞周期的G1期(Harper等,1993,Cell 75:805 816;Li等,1996,Curr.Biol.6:189199)。p21诱导可以通过使用可商业购买的特异性抗-p21抗体(例如来自Santa Cruz,Inc.)免疫染色来识别。类似地,细胞周期蛋白可以通过使用可商业购买的抗体进行的Western印迹分析来检测。在另一实施方案中,在检测细胞周期蛋白前,细胞群体被同步。细胞周期蛋白也可以通过FACS(荧光激活细胞分类仪)分析使用针对感兴趣的蛋白的抗体来检测。
[0728] 对细胞周期长度或细胞周期速度的变化的检测也可被用于测量本发明的肽对细胞增殖的抑制。在一个实施方案中,通过细胞群体的倍增时间来确定细胞周期的长度(例如,使用与本发明的一种或多种肽接触或未与其接触的细胞)。在另一实施方案中,使用FACS分析来分析细胞周期进展的阶段,或纯化G1、S和G2/M部分(参见例如,Delia,D.等,1997,Oncogene 14:213747)。
[0729] 可以通过本文描述的方法或通过本领域已知的任何方法来检测细胞周期检控点的失效和/或细胞周期检控点的诱导。不受限制地,细胞周期检控点是确保某些细胞事件以特定的次序发生的机制。检控点基因定义为在早期事件没完成前允许晚期事件发生的突变(Weinert,T.和Hartwell,L.,1993,Genetics,134:6380)。细胞周期检控点基因的诱导或抑制可以例如通过Western印迹分析或通过免疫染色等方法检测。细胞周期检控点的失效可以进一步通过在特定事件没发生前细胞进展通过检控点来评估(例如,在没有完全复制基因组DNA的情况下进展到有丝分裂)。
[0730] 除了特定细胞周期蛋白表达的影响,细胞周期中涉及的蛋白的活性和翻译后修饰可在细胞的调节和增殖状态中发挥不可或缺的作用。本发明提供了涉及通过本领域已知的任何方法检测翻译后修饰(例如磷酸化)的试验。例如,检测磷酸化的酪氨酸残基的抗体是可商业购买的,且可用在Western印迹分析中以检测具有这些修饰的蛋白质。在另一例子中,修饰(例如十四烷基化)可以用薄层色谱或反相HPLC检测(参见例如,Glover,C,1988,Biochem.J.250:48591;Paige,L.,1988,Biochem J.;250:48591)。
[0731] 信号和细胞周期蛋白和/或蛋白复合物的活性经常由激酶活性介导。本发明提供了通过试验例如组蛋白H1试验对激酶活性的分析(参见例如,Delia,D.等,1997,Oncogene14:213747)。
[0732] 也可以使用本领域熟知的方法证明本发明的方法中使用的肽在体外培养的细胞中改变细胞增殖。细胞培养模型的具体实施例包括但不限于,针对肺癌的原发性大鼠肺肿瘤细胞(Swafford等,1997,Mol.Cell Biol,17:1366 1374)和大细胞未分化癌细胞系(Mabry等,1991,Cancer Cells,3:5358);针对结肠癌的结肠直肠细胞系(Park和Gazdar,1996,J.Cell Biochem.Suppl.24:131141);针对乳腺癌的多个已建立的细胞系(Hambly等,1997,Breast Cancer Res.Treat.43:247258;Gierthy 等,1997,Chemosphere 34:
14951505;Prasad和Church,1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.232:1419);针对前列腺癌的多种充分表征的细胞模型(Webber等,1996,Prostate,部分1,29:386 394;部分2,
30:5864;和部分3,30:136 142;Boulikas,1997,Anticancer Res.17:14711505);针对泌尿生殖系统癌症的连续的人膀胱癌细胞系(Ribeiro等,1997,Int.J.Radiat.Biol.72:
1120);移行细胞癌的器官培养(Booth等,1997,Lab Invest.76:843857)和大鼠进展模型(Vet等,1997,Biochim.Biophys Acta 1360:3944);以及针对白血病和淋巴瘤的已建立的细胞系(Drexler,1994,Leuk.Res.18:919927,Tohyama,1997,Int.J.Hematol 65:
309317)。
[0733] 本发明的肽也可被证明在体外抑制细胞转化(或进展为恶性表型)。在该实施方案中,将具有转化的细胞表型的细胞与一种或多种本发明的肽接触,并检测与转化的表型相关的特征(与体内致瘤能力相关的一组体外特征)的变化,例如但不限于软琼脂中的克隆形成、更圆的细胞形态、更松的底层附着、接触抑制的丧失、贴壁依赖性的丧失、蛋白酶例如纤溶酶原激活剂的释放、糖运输的增加、血清需求的降低、或胎儿抗原的表达等(参见Luria等,1978,General Virology,第3版,John Wiley&Sons,New York,436446页)。
[0734] 侵袭性的丧失或附着的降低也可被用来证明本发明的方法中使用的肽的抗癌作用。例如,转移性癌症形成的关键方面是前癌细胞或癌细胞从疾病的原发位点脱离并在继发位置建立新的生长克隆的能力。细胞侵袭外周位点的能力反映了癌状态的潜在可能。侵袭性的丧失可以通过本领域已知的各种技术测量,包括例如对E-钙粘蛋白-介导的细胞-细胞附着的诱导。这样的E-钙粘蛋白-介导的附着可以导致表型反转和侵袭性丧失(Hordijk等,1997,Science278:1464 66)。
[0735] 侵袭性的丧失可以进一步通过抑制细胞迁移来检测。各种2-维和3-维细胞间质可商业购得(Calbiochem-Novabiochem Corp.San Diego,Calif.)。可以通过显微镜、延时摄影或摄像、或通过本领域允许测量细胞迁移的任何方法来检测细胞迁移穿越或进入间质。在相关实施方案中,侵袭性的丧失通过对肝细胞生长因子(HGF)的应答来检测。HGF-诱发的细胞分散与细胞例如Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞的侵袭性相关。该试验识别了在对HGF的应答中已经丧失了细胞分散活性的细胞群(Hordijk等,1997,Science 278:
146466)。
[0736] 或 者,侵 袭 性 的 丧 失 可 以 通 过 细 胞 在 趋 化 小 室 (Neuroprobe/PrecisionBiochemicals Inc.Vancouver,BC)中的迁移来测量。在该试验中,化学引诱剂置于小室的一侧(例如底部小室),而细胞铺板到分隔出相反一侧的滤器上(例如顶部小室)。为了细胞从顶部小室移动到底部小室,细胞必须积极地通过滤器的小孔迁移。然后可将已经迁移的细胞数目的棋盘分析与侵袭性相关联(参见例如,Ohnishi,T.,1993,Biochem.Biophys.Res.Commun.193:51825)。
[0737] 在本发明的方法中使用的肽也可被证实在体内抑制肿瘤形成。本领域已知大量的过度增殖病症的动物模型,包括肿瘤发生和转移性扩散(参见表317-1,第317章,“Principles of Neoplasia”,在Harrison’s Principles of InternalMedicine中,第13版,Isselbacher等编,McGraw-Hill,N.Y.,1814页,和Lovejoy等,1997,J.Pathol.181:130135)。具体例子包括:对于肺癌,肿瘤结节向大鼠中的移植(Wang等,1997,Ann.Thorac.Surg.64:216219)或在缺失NK细胞的SCID小鼠中肺癌转移的建立(Yono和Sone,1997,Gan To KagakuRyoho 24:489 494);对于结肠癌,人结肠癌细胞向裸小鼠中的结肠癌移植(Gutman和Fidler,1995,World J.Surg.19:226 234)、人溃疡性结肠炎的冠狨猴模型(Warren,1996,Aliment.Pharmacol.Ther.10 Supp 12:4547)和具有腺瘤性息肉病肿瘤抑制物突变的小鼠模型(Polakis,1997,Biochim.Biophys.Acta1332:F127 F147);对于乳腺癌,乳腺癌的转基因模型(Dankort和Muller,1996,Cancer Treat.Res.83:71 88;
Amundadittir等,1996,Breast Cancer Res.Treat.39:119 135)和大鼠中的肿瘤化学诱发(Russo和Russo,1996,Breast Cancer Res.Treat.39:7-20);对于前列腺癌,化学诱发的和转基因的啮齿动物模型、和人异种移植模型(Royai等,1996,Semin.Oncol.23:3540);
对于泌尿生殖系统癌症,大鼠和小鼠中诱发的膀胱肿瘤(Oyasu,1995,Food Chem.Toxicol
33:747755)和人移行细胞癌向裸大鼠中的异种移植(Jarrett等,1995,J.Endourol.9:
17);以及对于造血系统癌症,动物中的同种异体髓移植(Appelbaum,1997,Leukemia
11(Suppl.4):S15S17)。此外,已经描述了可适用于许多类型癌症的一般动物模型,包括但不限于p53-缺陷型小鼠模型(Donehower,1996,Semin.Cancer Biol.7:269278)、Min小鼠(Shoemaker等,1997,Biochem.Biophys.Acta,1332:F25 F48)、和大鼠中对肿瘤的免疫应答(Frey,1997,Methods,12:173 188)。
[0738] 例如,可以向测试动物施用在本发明的方法中使用的肽,在一个实施方案中,测试动物倾向于发展一类肿瘤,而且随后将测试动物与没有施用本发明的肽的动物比较,检测肿瘤形成的降低的发生率。或者,可以向患有肿瘤的测试动物(例如已经通过引入恶性、肿瘤性、或已转化的细胞,或通过施用致癌物在其中诱发了肿瘤的动物)施用本发明的肽,并随后与没有施用本发明的肽的动物比较,检查测试动物中肿瘤的退化。
[0739] 8.治疗用途
[0740] A.对身体应答的介质的调节
[0741] 本领域普通技术人员将认识到,本发明的肽可被用来调节对组织损伤相关疾病或病症的身体应答的效应。特别地,可用上述肽调节的介质的例子是炎症介质,包括但不限于,源自血浆的炎症介质,例如缓激肽、C3、C5a、因子XII、膜攻击复合物、Hageman因子、纤溶酶、凝血酶、淋巴因子(巨噬细胞活化因子(MAF)、巨噬细胞迁移抑制因子(MMIF)、巨噬细胞趋化因子(MCF)、白细胞迁移抑制因子(LMIF)、组胺释放因子(HRFs)、和转移因子(TF));白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、…IL-15);肿瘤坏死因子(TNF-α(恶液质素)、TNF-β(淋巴毒素));干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IFN-τ);集落刺激因子(粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、和多集落刺激因子(IL-3));多肽生长因子(酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF);神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子(PDGF)、和血管内皮生长因子(VEGF));转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、α-趋化因子(IL-8、中性粒细胞激活蛋白2(NAP-2)、血小板因子-4(PF-4)、和β-血小板球蛋白(βTG));β-趋化因子(单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MCP-3、MIP-1α、巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP-1β),活化调节的正常T细胞表达和假定分泌趋化因子(RANTES)和应激蛋白(热激蛋白(HSP)、葡萄糖相关蛋白(GSP)、泛素、和超氧化物歧化酶(Mn)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、血小板碱性蛋白(PBP)、溶酶体颗粒、组胺、血清素、白细胞三烯B4、一氧化氮和/或前列腺素。在优选实施方案中,肽抑制或压制介质的活性,且更优选地抑制TNF-α、组胺、一氧化氮、和白细胞介素的活性。最优选地,肽抑制两种或多种炎症介质的活性。
[0742] B.各种疾病、病症和状况的治疗或预防
[0743] 本发明的组织保护肽和肽类似物也被用作治疗或预防各种疾病、病症和状况的治疗剂。本领域技术人员也会认识到,这些肽和肽类似物可以用来实现对组织保护受体复合物的调节,例如组织保护细胞因子复合物。可用来评估例如通过以上公开的发明试验而识别的化合物的治疗适应症的体外和体内技术在PCT申请号PCT/US01/49479、美国专利申请号10/188,905和10/185,841中公开。
[0744] 前述的本发明的组织保护肽和肽类似物一般地可用于对以下疾病或病症的预防、治疗性治疗、或预防性治疗:具有初步神经或精神症状的人类中枢神经系统或外周神经系统的疾病或病症、眼部疾病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸道疾病、肾、泌尿和生殖系统疾病、骨疾病、皮肤疾病、结缔组织疾病、胃肠道疾病、和内分泌及代谢异常。用途的例子包括但不限于,保护和修复由以下组织的创伤和炎症所导致的损伤:脑(缺血性中风、钝性创伤、蛛网膜下出血)、脊髓(缺血、钝力创伤)、外周神经(坐骨神经损伤、糖尿病神经病变、腕管综合征)、视网膜(黄斑水肿、糖尿病视网膜病变、青光眼)、和心脏(心肌梗塞、慢性心力衰竭)。特别地,这些疾病、病症和状况包括缺氧状况,其有害地影响应答组织,例如可兴奋组织,包括但不限于上面4.2部分(xiii)中指明的组织,或那些应答细胞组织或器官,表达合适的1型细胞因子受体的组织,例如EPO-R受体或组织保护受体复合物。因此,本发明的组织保护肽和肽类似物可以用来治疗或预防各种状况和环境下缺氧状况导致的对应答组织的损伤。这些状况和环境的非限制性例子在本文下面的表格中提供。
[0745] 组织保护肽和肽类似物在干细胞活性的调节中同样被关注。已经确定,呈现组织保护活性的细胞因子(例如EPO)能够调动干细胞,刺激其向损伤区域迁移,并协助修复过程,例如,发挥再生作用。例如,在实验性中风中,EPO介导成神经细胞向缺血性损伤区域的迁移,以在恢复期间再生神经元(Tsai等,J.Neurosci(2006)26:1269-74)。作为另一个例子,EPO和氨基甲酰化EPO(CEPO)将内皮祖细胞从骨髓调动到循环中。这些细胞然后移向远方区域并参与新血管的形成(关于EPO的作用,参见Bahlmann等,2003,Kidney Int.64:1648-1652)。尽管不希望受限于任何特别理论,相信本文公开的分离的肽和肽类似物对干细胞迁移具有类似作用。
[0746] 在使用本发明的组织保护肽和肽类似物可治疗和可预防的神经组织病理的保护的实施例中,这样的病理包括由神经组织的氧降低导致的病理。任何降低神经组织的氧气可利用性,导致应激、损伤和最终神经细胞死亡的状况,都可以使用本发明的组织保护肽和肽类似物治疗。这些状况一般被称作缺氧和/或缺血,产生于或包括但不限于中风、血管闭塞、出生前或出生后缺氧、窒息、气哽、溺水、一氧化碳中毒、烟雾吸入、创伤包括手术和放疗、窒息、癫痫、低血糖、慢性阻塞性肺病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、低血压休克、败血性休克、过敏性休克、胰岛素休克、镰形细胞危象、心脏停搏、节律异常、氮麻醉、血氧不足性缺氧(高原病、高原肺水肿、高原脑水肿、睡眠呼吸暂停、低通气、呼吸停止、分流)、高铁血红蛋白血症、组织中毒性缺氧、宫内缺氧、和心肺旁路过程引起的神经功能缺损。
[0747] 在一个实施方案中,例如,使用上述试验识别的本发明的组织保护肽和肽类似物,可以在手术过程或医疗过程之前、期间或之后,单独或作为组合物的一部分施用,以预防伤害或组织损伤风险导致的伤害或组织损伤。例如,手术过程可能包括肿瘤切除动脉瘤修复,而医疗过程可能包括分娩或接生。使用本发明的组织保护肽和肽类似物可治疗的由低血糖引起或导致的其它病理,包括胰岛素过量(也被称作医源性高胰岛素血症)、胰岛素瘤、生长激素缺乏、肾上腺皮质功能减退、药物过量、和某些肿瘤。
[0748] 由可兴奋神经组织损伤导致的其它病理包括癫痫病症,例如癫痫、惊厥或慢性癫痫病症。其它可治疗的状况和疾病包括但不限于疾病例如中风、多发性硬化、低血压、心脏停搏、慢性心力衰竭、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、脑瘫、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆、年龄相关的认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫病症、酒精中毒、视网膜缺血、青光眼导致的视神经损伤、和神经元缺失。
[0749] 本发明的具体的组织保护肽和肽类似物可以用来治疗或预防疾病状况或各种创伤导致的炎症,例如物理或化学诱发的炎症。本发明也涵盖了将组织保护肽和肽类似物用于治疗和预防一个或多个器官或组织中的炎症状况,包括但不限于大脑、脊髓、结缔组织、心脏、肺、肾和尿道、胰腺、眼和前列腺。这些创伤的非限制性例子包括但不限于在4.2部分(xvi)中列举的那些。此外组织保护肽可以用来治疗或预防缺血性和非缺血性状况导致的炎症,包括但不限于过敏、过敏性疾病、过敏症状、风湿性疾病、运动相关损伤、暴露于毒性剂、感染(包括病毒性、真菌性和细菌性),这些状况的进一步例子在上面4.2部分(iv)、(v)和(xvi)中公开。炎症可以是急性或慢性的。在炎症领域的进一步应用在2004年9月29日提交的PCT/US2004/031789(其作为WO2005/032467公开)内记录。
[0750] 本发明的具体的组织保护肽和肽类似物可以用来治疗脱髓鞘或髓鞘损害导致的中枢神经和外周神经系统疾病。这些疾病定义为主要包括起源未知的炎症性髓鞘病变,髓鞘形成缺乏疾病例如脑白质营养不良和明显起因引起的疾病除外。多发性硬化(MS)是脱髓鞘疾病中的典型疾病,而且病理上其特征主要为炎症性脱髓鞘和神经胶质增生的变化。因为其病因未知,其诊断是基于其临床特征做出的,即中枢神经系统损害的空间多样性和随时间多样性。此外,脱髓鞘疾病中包括急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、炎症性弥漫性硬化、急性和亚急性坏死性出血性脑脊髓炎、和横贯性脊髓炎。同样地,外周神经组织依赖Schwann细胞来维持髓鞘,如果这些细胞被损害,引起外周脱髓鞘疾病。
[0751] 本发明的组织保护肽和肽类似物可以用来治疗或预防心脏的状况和损伤,包括任何涉及心脏和/或相关组织(例如心包、主动脉和其它相关血管)的慢性或急性病理事件,包括缺血-再灌注损伤;充血性心力衰竭;心脏停搏;心肌梗塞;动脉粥样硬化、二尖瓣漏、心房扑动、化合物例如药物(例如多柔比星、赫赛汀、甲硫哒嗪和西沙必利)引起的心脏中毒;寄生性感染引起的心脏损伤(细菌、真菌、立克次体、和病毒,例如梅毒、慢性克氏锥虫(Trypanosomacruzi)感染);暴发性心脏淀粉样变性;心脏手术;心脏移植;血管成形术腹腔镜手术、创伤性心脏损伤(例如穿透性或钝性心脏损伤、和主动脉瓣膜破裂)、胸主动脉瘤的手术修复;肾上腺主动脉瘤;心肌梗塞或心力衰竭引起的心源性休克;神经源性休克和过敏反应。本发明的组织保护肽和肽类似物也可以用来治疗有心脏病例如心力衰竭(即,心脏不能够以代谢组织需要的速率血,或心脏可以仅在具有提高的充盈压时可以这样做)风险的那些个体。这些有风险的患者将包括患有心肌梗塞、冠心病、心肌炎、化疗、心肌病、高血压、瓣膜心脏疾病(最常见的是二尖瓣关闭不全和主动脉瓣狭窄)、和毒素诱发的心肌病(例如乙醇、可卡因等)等或存在患这些疾病风险的患者。
[0752] 本发明的组织保护肽和肽类似物可以用来治疗或预防眼例如视网膜组织的状况和损伤。这样的病症包括但不限于视网膜缺血、黄斑变性、视网膜脱离、视网膜色素变性、动脉硬化性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、视网膜水肿、低血压、和糖尿病视网膜病变。
[0753] 在另一个实施方案中,本发明的组织保护肽和肽类似物和本发明的原理可以用来预防或治疗暴露于毒性剂导致的损伤,即应答组织的辐射或化学损伤。在本发明的一个实施方案中,上述肽可用作治疗剂,以调节对毒性剂的身体应答的介质,优选地压制或抑制这些介质的活性。另外,上述肽可用作治疗剂,以治疗、预防、改善或控制暴露于毒性剂的损伤、效应或症状。该肽可被用于治疗对各种毒性剂的暴露,包括生物、化学或辐射剂。
[0754] 这些肽可以用来治疗生物制剂引起的损伤、效应或症状,所述生物制剂例如朊病毒、病毒、微生物(细菌和真菌)、和一些单细胞和多细胞的真核生物(即寄生物),包括但不限于上面4.2部分(viii)中列举的那些生物毒素。此外,本发明的肽可以用来预防、治疗、改善或控制化学药剂引起的损伤、效应或症状。这些药剂包括但不限于血液试剂、糜烂剂、神经试剂、肺部试剂、和失能剂。另外,本发明的肽可以用来预防、治疗、改善或控制对工业化学品的毒性暴露引起的损伤、效应或症状,所述工业化学品包括但不限于4.2部分(x)中所列举的。暴露于辐射剂引起的损伤、效应或症状是使用本发明的肽可预防、可治疗或可控制的。所述肽可以预防、治疗、改善或控制放射性制剂引起的损伤、效应或症状,包括137 60 241 252 192 238 90 226
α、β或γ辐射,且更具体地,可包括但不限于 Cs、Co、 Am、Cf、 Ir、Pu、Sr、 Ra、
91 92 95 99 106 131 132 139 140 141 144 233 235 238 228 229 230 231
Sr、Sr、Zr、Mo、 Ru、 Sb、 Te、 Te、 Ba、 La、 Ce、 U、 U、 U、 P、 P、 P、P、
232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 131
P、 P、P、 P、P、 P、P、 P、P、 P、P、 P、P、 P、P、 P和 I。此外,本领域
普通技术人员将认识到,所述肽也可被用来预防、介导、治疗或改善由于这些毒性剂的累积或协同使用(即,在散布生物制剂前使用放射性制剂使得受害者将对生物制剂更敏感;联合施用糜烂剂与神经试剂以防止受害者有效地寻求庇护或帮助;用生物或放射性制剂污染子弹或榴霰弹以抑制愈合进程或令其复杂化等)所引起的损伤、效应或症状。优选地,本发明的肽将能够治疗、调节、改善或预防对例如以下两种或多种细胞、器官或组织中的数种不同类型的细胞、器官或组织的有毒效应:中枢神经、外周神经、眼、心血管、心肺、呼吸道、肾、泌尿、生殖、肌肉骨骼、皮肤、结缔组织、胃肠道、造血、内分泌、和代谢。此外,本发明的肽可有效地作为同一种类中的超过一种毒性剂(即针对多于一种类型的化学、生物或放射性制剂-例如针对糜烂剂和神经试剂的预防剂)或不同种类的毒性剂(即对暴露于放射性制剂和化学药剂的治疗剂)的治疗剂或预防剂。本发明的组织保护肽和肽类似物的进一步用途是在中毒的治疗中,例如神经毒素中毒(例如软骨藻酸贝类中毒)、毒素(乙醇、可卡因等)、作为化疗剂的辐射暴露的后果;羽扇豆中毒(neurolathyrism);关岛病;肌萎缩性侧索硬化症;和帕金森氏症。
[0755] 如上面提到的,本发明也提供了用于通过外周施用上述组织保护肽增强哺乳动物中应答细胞、组织和器官的组织功能的本发明的组织保护肽和肽类似物。各种疾病和状况适于使用该方法治疗。例如,甚至在不存在任何状况或疾病时,可将该方法用于增强可兴奋组织的功能,引起认知功能增强。此外,组织保护细胞因子可用于改善伤口愈合的质量、减少愈合需要的时间、改善愈合组织的质量、和降低伤口造成的粘着的发生率。参见2004年9月29日提交的PCT/US2004/031789,其作为WO 2005/032467公开。此外,本发明的组织保护肽可以用于治疗、预防或控制化学药剂诱发的皮肤上的或沿着呼吸道的损害,例如发疱剂或糜烂剂或工业化学物质。
[0756] 本发明的肽的这些用途在下文中进一步详细描述,且包括在人和非人哺乳动物两者中学习和训练的增强。
[0757] 在另一个实施方案中,本发明的组织保护肽和肽类似物一般可以用于预防、治疗性治疗、预防性治疗或控制以下系统的各种癌症或肿瘤病症:中枢神经系统、外周神经系统、胃肠道/消化系统、泌尿生殖系统、肾上腺、妇科、头颈部、造血/血、肌肉骨骼/软组织、呼吸道、和乳房。所述用途的例子包括但不限于保护防止和修复4.2部分(ix)和(xxv)中列举的癌症或肿瘤病症导致的损伤。此外,本发明的肽可以用来预防、治疗性治疗、预防性治疗或控制肿瘤或癌症相关的各种综合征,包括但不限于上面4.2部分(xxviii)中列举的综合征。可以依照本发明的方法使用肽来解决上述综合征。例如,可以施用肽通过延迟疾病的肿瘤方面的发作、降低综合征相关的肿瘤生长的数目、或总体上增强受这些状况折磨的患者的生活质量或寿命来解决遗传性综合征例如LiFraumeni、遗传性非息肉结肠直肠癌、家族性腺瘤性息肉病、和VonHippel-Lindau综合征。也可以预防性地施用肽以解决与肿瘤病症或癌症的某些治疗、化疗或放疗相关的综合征,例如雄激素阻断综合征、治疗相关的骨髓增生异常综合征或嗜睡综合征,希望预防综合征或降低综合征的严重程度。
[0758] 此外,可以用肽来治疗或预防恶病质和恶病质相关的疾病。这些疾病包括但不限于癌症恶病质、厌食症、无力、贫血、肺结核、AIDS、充血性心力衰竭、肾衰竭、肝功能衰竭、慢性阻塞性肺病、肺气肿、肌肉萎缩、糖尿病、和内毒素血症。
[0759] 使用本发明提供的组织保护肽和肽类似物可治疗或可预防的中枢神经系统状况和疾病,包括但不限于,情感性精神障碍焦虑症抑郁症、孤独症、注意力缺乏多动症、和认知功能障碍。这些状况得益于神经功能的增强。其它依照本发明的教导可治疗的病症包括睡眠破坏,例如,睡眠呼吸暂停和旅行相关的病症;蛛网膜下的和动脉瘤的出血、低血压休克、震荡伤、败血性休克、过敏性休克、和各种脑炎和脑膜炎的后遗症,例如,结缔组织疾病相关的脑炎,例如狼疮。其它用途包括预防或保护免于神经毒素中毒例如软骨藻酸贝类中毒、羽扇豆中毒(neurolathyrism)、和关岛病、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏症;栓性或缺血性损伤的手术后治疗;全脑辐射;镰形细胞危象;和子痫。
[0760] 使用本发明的组织保护肽和肽类似物可治疗或可预防的进一步的一组状况包括线粒体功能障碍,无论是遗传性的还是获得性的,其是各种神经性疾病的起因,典型的是神经损伤和死亡。例如,Leigh病(亚急性坏死性脑病)的特征是神经元脱落引起的进行性视力丧失和脑病、和肌病。在这些情况下,有缺陷的线粒体代谢未能供应足够高能量的底物来为可兴奋细胞的代谢提供原料。组织保护肽或肽类似物优化了各种线粒体疾病中的失败功能。如上面提到的,缺氧状况有害地影响可兴奋组织。可兴奋组织包括但不限于:神经组织,例如外周神经系统(耳朵和视网膜)和中枢神经系统(大脑和脊髓)组织;心血管组织,例如心脏和相关神经的细胞;和腺体组织例如胰腺,其中T型钙通道和细胞-细胞缝隙连接一起参与胰岛素分泌。可兴奋组织的示范性列表包括但不限于器官和组织,其包括神经、骨骼肌、平滑肌、心肌、子宫、中枢神经系统、脊髓、脑、视网膜、嗅觉系统、和听觉系统。除了上述状况外,本发明的组织保护肽和肽类似物可用于吸入中毒的治疗,例如一氧化碳和烟雾吸入、严重哮喘、成人呼吸窘迫综合征、以及气哽和溺水。造成缺氧状况或通过其它手段诱发应答组织例如可兴奋组织损伤的进一步状况包括低血糖,其可能由胰岛素的不合适给药、或伴随产生胰岛素的肿瘤(胰岛素瘤)而发生。
[0761] 各种被描述源于可兴奋组织损伤的神经心理学病症是可使用本发明的组织保护肽和肽类似物治疗的。涉及神经损伤且本发明可治疗或可预防的慢性病症,包括中枢神经系统和/或外周神经系统相关病症,包括年龄相关的认知功能丧失和老年痴呆症、慢性癫痫病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、痴呆、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化、结节性硬化症、威尔森氏病、脑性和进行性核上性麻痹、关岛病、路易体痴呆、朊病毒病,例如海绵状脑病,例如克-雅氏病,亨廷顿舞蹈症、强直性肌营养不良、Freidrich′s共济失调和其它共济失调、以及抽动秽语综合征、癫痫病症例如癫痫和慢性癫痫病症、中风、脑或脊髓损伤、AIDS痴呆、酒精中毒、孤独症、视网膜缺血、青光眼、自主神经功能障碍例如高血压和睡眠障碍、和神经精神病症,其包括但不限于精神分裂症、分裂情感障碍、注意力缺乏症、恶劣心境障碍、严重抑郁症、躁狂症、强迫症精神活性物质使用障碍、焦虑、惊恐障碍、以及单相和双相情感障碍。另外的神经精神和神经退行性病症包括例如在美国精神病学会的精神疾病诊断与统计手册(DSM)中列举的那些。
[0762] 使用本发明的组织保护肽和肽类似物可治疗或可预防的另外一组状况包括肾疾病,例如肾衰竭,急性和慢性的。对肾的血液供给可以由于数种原因被切断,包括侵入血流的感染(败血症)引起的休克、内部或外部出血、作为严重腹泻或烧伤的后果的体液损失、对输血的应答、心脏停搏或心律失常、外科手术损伤和肾移植。上面的状况导致的对肾的血液流动减少,可能将血流量降低到危险的低水平一段时间,其足以引起急性肾衰竭的形成。降低的血流量也导致肾脏中的坏死或组织死亡,损伤肾小管细胞。肾衰竭也可能由疾病(间质性和糖尿病性)肾病综合征、感染、损伤(CPB-诱发的)、毒素(造影剂诱发的、化疗诱发的、环孢霉素)、自体免疫性炎症(例如狼疮、红细胞增多等)导致。本发明的组织保护肽和肽类似物协助修复或防止该损伤,帮助改善急性肾衰竭。此外,本发明的肽可被用于治疗、预防或改善尿路的疾病或病症,包括但不限尿路感染、刺激性膀胱、和对膀胱的创伤或辐射损伤。
[0763] 关于适于前述的组织保护肽和肽类似物治疗的各种状况和疾病,以下表格列举了额外的示范性的非限制性适应症。
[0764] 表1
[0765] 适于组织保护肽和肽类似物治疗的疾病和病症
[0766] 细胞、组织 功能障碍或病理 状况或疾病 类型
[0767] 或器官
[0768] 心脏 缺血 冠心病 急性、慢性、稳定型、不[0769] 稳定型
[0770] 心肌梗塞 心肌梗塞后综合征[0771] 心绞痛
[0772] 先天性心脏病 瓣膜心肌病[0773] 变异型心绞痛
[0774] 心脏破裂 动脉瘤性[0775] 血管炎
[0776] 心律失常 过速、心律过缓、室上性、 稳定型、不稳定型、过敏[0777] 心室传导异常 性、颈动脉窦淋巴结[0778] 充血性心力衰竭 左、右、两侧心室、收缩性、 心肌病(例如原发性家族[0779] 舒张性 性、感染性、代谢性)、[0780] 贮积病、缺乏、结缔组织[0781] 病症、浸润和肉芽肿、神[0782] 经血管性[0783] 心肌炎和心包炎 自体免疫性、感染性、原[0784] 发性
[0785] 肺原性心脏病
[0786] 辐射损伤
[0787] 钝性和穿透性创伤 手术、感染或炎症导致的胸
[0788] 内粘连
[0789] 毒素 可卡因毒性、阿霉素、重金
[0790] 属(钴)
[0791] 血管 高血压 原发性、继发性
[0792] 减压病
[0793] 纤维肌性增生
[0794] 动脉瘤 夹层、破裂、扩大
[0795] 癌症 血管瘤、血管外皮细胞瘤 血管肉瘤、恶性血管内皮[0796] 细胞瘤[0797] 肺 阻塞性 哮喘、慢性支气管炎、肺气
[0798] 肿和气道阻塞
[0799] 缺血性肺病 肺栓塞、肺动脉血栓、脂肪
[0800] 栓塞
[0801] 环境性肺病
[0802] 间质性肺病 原发性肺纤维化
[0803] 先天性 囊性纤维化
[0804] 肺原性心脏病
[0805] 创伤
[0806] 肺炎和局限性肺 炎感染性(包括禽流感)、寄生
[0807] 性、毒性、创伤性、烧伤性、
[0808] 吸入性
[0809] 结节病
[0810] 癌症和癌前病变 支气管类癌、燕麦细胞癌[0811] 辐射损伤
[0812] 胰腺 内分泌 糖尿病,I型和II型 β细胞衰竭、功能障碍、[0813] 糖尿病神经病变[0814] 胰腺的其它内分泌细胞衰
[0815] 竭
[0816] 外分泌 胰腺外分泌衰竭 胰腺炎[0817] 癌症和癌前病变 胰岛细胞腺瘤、胰岛素瘤、 胰岛细胞癌[0818] 胃泌素瘤 骨 骨质减少 原发性、继发性 性腺机能减退[0819] 固定化[0820] 绝经后的[0821] 年龄相关的[0822] 甲状旁腺功能亢进[0823] 甲状腺机能亢进[0824] 钙、镁、磷和/或维生素[0825] D缺乏[0826] 骨髓炎
[0827] 缺血性坏死
[0828] 创伤
[0829] 帕哲氏病
[0830] 癌症 骨瘤 骨肉瘤[0831] 皮肤 脱发 斑秃、全秃 原发性、继发性、男性型[0832] 脱发
[0833] 白癜风 局部、普遍化 原发性、继发性[0834] 溃疡 糖尿病、褥疮、缺血 压疮、压迫性溃疡、褥疮[0835] 外周血管疾病 感染、自体截肢
[0836] 手术伤口、裂伤
[0837] 烧伤
[0838] 辐射损伤 皮肤辐射综合征
[0839] 癌症和癌前病变 痣、乳头状瘤、脂溢性角化 黑色素瘤、鳞状细胞癌、[0840] 病、皮肤附件肿瘤 表皮样癌、基底细胞癌和[0841] 恶性皮肤附件肿瘤[0842] 自体免疫病 红斑狼疮、干燥综
[0843] 症 合征、类风湿性关
[0844] 节炎、肾小球肾炎、
[0845] 血管炎、纤维肌痛、
[0846] 强直性脊柱炎
[0847] Langerhans组织细
[0848] 胞增生症
[0849] 眼 视神经炎
[0850] 钝性和穿透性损
[0851] 伤、手术伤口、感
[0852] 染、结节病、镰形C
[0853] 疾病、视网膜脱离、
[0854] 颞动脉炎
[0855] 视网膜缺血、黄斑
[0856] 变性、视网膜色素
[0857] 变性、动脉硬化性
[0858] 视网膜病变、高血
[0859] 压性视网膜病变、
[0860] 视网膜动脉阻塞、
[0861] 视网膜静脉阻塞、
[0862] 低血压、糖尿病性
[0863] 视网膜病变、青光
[0864] 眼和黄斑水肿
[0865] 胚胎和胎儿 窒息
[0866] 的病症 缺血
[0867] 癌症和癌前病变 黏液瘤、葡萄胎 黏液肉瘤、脊索瘤、绒毛[0868] 膜癌[0869] CNS 慢性疲劳综合征、
[0870] 急性和慢性低渗和
[0871] 高渗综合征、AIDS
[0872] 痴呆、电击死
[0873] 脑型疟疾
[0874] 脑炎 狂犬病、疱疹
[0875] 脑膜炎
[0876] 硬脑膜下血肿
[0877] 尼古丁成瘾
[0878] 药物的滥用和撤回 可卡因、海洛因、快克
[0879] (crack)、大麻、LSD、PCP、
[0880] 多药滥用、摇头丸、阿片类
[0881] 物质、镇静催眠药、苯丙胺
[0882] 类、咖啡因、酒精
[0883] 强迫症
[0884] 精神病和抑郁症
[0885] 注意力缺乏和多动
[0886] 症
[0887] 椎管狭窄,横贯性
[0888] 脊髓炎,Guillian
[0889] Barré,对外周神经、
[0890] 脊髓或脑的创伤性
[0891] 损伤,神经根压迫,
[0892] 肿瘤或血管畸形引
[0893] 起的压迫,中暑
[0894] 癌症和癌前病变 神经节细胞瘤、脑膜瘤、神 神经胶质瘤(I-III级)、间[0895] 经鞘瘤、神经鞘膜瘤 变性、多形性胶质母细胞[0896] 瘤(IV级)、成神经细胞[0897] 瘤、成神经管细胞瘤、恶[0898] 性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤[0899] ENT 耳鸣、Meunière’s
[0900] 综合征、听力丧失
[0901] 创伤性损伤、气压
[0902] 伤
[0903] 肾 肾衰竭 急性、慢性 血管性/缺血性、间质性[0904] 疾病、糖尿病性肾病、肾[0905] 病综合征、感染、损伤、[0906] 造影剂诱发的、化疗诱发[0907] 的、环孢霉素、辐射诱发[0908] 的、心肺旁路诱发的[0909] 辐射损伤
[0910] 过敏性紫癜
[0911] 癌症或癌前病变 肾小管腺瘤 肾细胞癌、肾上腺样瘤[0912] 横纹肌 自体免疫病症 重症肌无力、皮肌炎、多发
[0913] 性肌炎
[0914] 肌病 遗传性代谢性、内分泌和毒
[0915] 性
[0916] 中暑
[0917] 挤压
[0918] 横纹肌溶解症
[0919] 线粒体疾病
[0920] 感染 坏死性筋膜炎
[0921] 癌症或癌前病变 横纹肌瘤 横纹肌肉瘤[0922] 性功能障碍 中央和外周(例如勃 药物继发的阳痿、(糖尿病)
[0923] 起功能障碍)
[0924] 肝 肝炎 病毒性、细菌性、寄生性
[0925] 缺血性疾病
[0926] 肝硬化、脂肪肝
[0927] 浸润性/代谢性疾病
[0928] 癌症或癌前病变 肝腺瘤 肝癌:肝细胞癌[0929] 胃肠道 缺血性肠炎
[0930] 炎症性肠炎
[0931] 坏死性小肠结肠炎
[0932] 手术或穿孔后的伤 由手术或感染导致的腹部
[0933] 口愈合 粘连
[0934] 癌症或癌前病变 类癌 恶性类癌[0935] 器官移植 供体、器官和受体 移植排斥应答、移植物排
[0936] 的治疗 斥、移植物功能延迟、移植
[0937] 物抗宿主病
[0938] 供组织再生、植入
[0939] 或移植的细胞或组
[0940] 织培养物的生长
[0941] 生殖道 不育 血管、自体免疫、子宫异常、
[0942] 着床障碍
[0943] 癌症或癌前病变 精原细胞瘤、无性细胞[0944] 瘤、绒毛膜癌、胚胎性癌、[0945] 内胚窦瘤、畸胎癌、[0946] Seroli-Leydig肿瘤、卵巢[0947] 男胚瘤、颗粒卵巢泡膜细[0948] 胞瘤、门细胞瘤、脂质细[0949] 胞瘤
[0950] 内分泌 腺体的功能亢进和
[0951] 不良
[0952] 癌症或癌前病变 嗜碱性腺瘤、嗜酸性腺瘤、甲状旁腺癌、甲状腺髓样[0953] 难染性腺瘤、甲状旁腺腺 癌、恶性嗜铬细胞瘤[0954] 瘤、C细胞增生、嗜铬细胞
[0955] 瘤
[0956] 全身 休克、恶病质、癌 败血性、血液动力学性、厌
[0957] 症恶病质 食症、无力、贫血
[0958] 寄生虫血症 疟疾、锥虫病、利什曼病
[0959] 如上面提到的,这些疾病、病症或状况仅是本发明的组织保护肽和肽类似物提供的益处范围的示例。因此,本发明一般地提供了对机械损伤或人类疾病的后果的防止性、治疗性或预防性治疗。本发明涵盖了对CNS和/或外周神经系统的疾病、病症或状况的预防、或治疗性或预防性治疗。本发明提供了对具有精神成分的疾病、病症或状况的预防、或治疗性或预防性治疗。本发明提供了对疾病、病症或状况的预防、或治疗性或预防性治疗,包括但不限于具有眼、心血管、心肺、呼吸道、肾、尿路、生殖、胃肠道、内分泌或代谢成分的疾病、病症或状况。肽可用于在一个或多个(优选地至少两个)器官或组织中防止、治疗性治疗、预防性治疗或控制组织损伤相关的疾病或病症以及其损伤、效应或症状,所述器官或组织包括但不限于大脑、脊髓、结缔组织、皮肤、胃肠道、生殖器官、肝、心脏、肺、肾、尿路、胰腺、眼和前列腺。
[0960] 在某些实施方案中,本发明的方法可能排除本发明的肽或特定的适应症。例如,在本发明的方法中可将根据结构基序C的肽排除用于WO 2006/119767和WO 2007/071248中公开的适应症,包括:手术后神经损伤;创伤性神经损伤;脊髓损伤、神经纤维的损害的髓鞘形成;缺血后损伤;中风;帕金森氏症;阿尔茨海默氏病;亨廷顿舞蹈症;精神分裂症、痴呆;多发性硬化、多梗塞性痴呆;糖尿病相关的神经变性;神经肌肉变性、影响生物钟或神经肌肉连接的病症;器官移植;遗传性或创伤性肌肉萎缩病症;性腺、胰腺、肾、心脏、肝和肠的退行性状况;I或II型糖尿病;肾病;精神病;神经症性障碍;人格障碍;性别偏差和障碍;智力低下;神经系统和感觉器官的疾病;认知异常;中枢神经系统的炎症性疾病;大脑变性;短期或长期记忆刺激;锥体外系疾病和异常运动障碍;运动神经元疾病;脊髓疾病;自主神经系统病症、外周神经系统疾病;神经病变;影响眼中多个结构的病症;耳朵疾病和乳突;新生儿中器官和软组织异常;在分娩和接生中施用麻醉或其它镇静的并发症;皮肤的疾病和损伤;神经和脊髓的损伤;药物中毒;医药和生物物质;代谢病症;内分泌腺病症;
嘌呤和嘧啶代谢病症;骨病症;肿瘤;癌症;脑的病毒性感染;Gillian-Barre综合征;疼痛综合征;孤独症和学习能力的刺激。同样地,例如,在本发明的方法中可将依照结构基序D的肽排除用于在美国专利号5,571,787、5,700,909、5,696,080、5,714,459、6,590,074、
6559,124、6,271,196、6,268,347、和6,849,602中公开的适应症,包括:神经瘤引起的神经性疼痛(截肢、神经横断)、神经压迫(嵌压性神经病变或肿瘤压迫)、神经创伤(压伤、拉伸或不完全横断);糖尿病;辐射,缺血,血管炎,脊髓灰质炎后综合征,酒精,淀粉样蛋白,毒素,HIV,甲状腺机能减退,尿毒症,维生素缺乏,化疗,ddC(扎西他滨),Fabry′s病,压迫(盘、肿瘤、疤痕组织),根性撕脱,炎症(疱疹后神经痛),脊髓挫伤,脊髓肿瘤,脊髓半切除,和脑干、丘脑或皮层的梗塞、肿瘤或创伤;和脱髓鞘疾病包括多发性硬化、急性播散性脑白质炎、进行性多灶性脑白质炎、异染性脑白质营养不良、和肾上腺性脑白质营养不良。对于另一个例子,在本发明的方法中可将依照结构基序E的肽排除用于在美国专利号7,259,146和美国专利公开号20030130197中公开的适应症,包括:急性神经退行性病症:脑缺血或梗塞包括栓性闭塞和血栓性闭塞;急性缺血后的再灌注;围产期缺氧-缺血性损伤;心脏停搏;颅内出血;颅内和脊柱内损害;和震荡摇晃婴儿综合征;慢性神经退行性病症:阿尔茨海默氏病、Pick′s病、弥散性路易体病、进行性核上性麻痹、多系统变性、慢性癫痫状况、运动神经元疾病、朊病毒病、外周疾病(包括EPO缺乏)相关的神经和精神表现,、血液丧失、肾衰竭、终末期肾病、肾移植、和贫血相关的其它疾病包括血液和非血液恶性病/肿瘤、化疗和其它药物相关的并发症、血液病症、炎症性和感染性病症、慢性全身性自体免疫性疾病、过敏性紫癜、溶血性尿毒症综合征、神经系统的化学/毒性/感染性/和辐射损伤,和脑病;神经丛病变;神经病变;腓骨肌萎缩症;Friedreich′s共济失调;异染性脑白质营养不良;Refsum′s病;肾上腺脊髓神经病变;共济失调-毛细管扩张;
Djerine-Sottas神经病变;Lambert-Eaton综合征;和颅神经障碍。作为进一步的例子,在本发明的方法中将依照结构基序F的肽排除用于在WO/2007/052154中公开的适应症,包括:免疫介导炎症;自体免疫性疾病包括桥本甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、全身性红斑狼疮;脱髓鞘疾病包括多发性硬化、横贯性脊髓炎、Guillain-Barre综合征、和进行性多灶性脑白质病、以及有机磷酸酯暴露导致的脱髓鞘;关节炎;急性脑血管损伤;急性脊髓损伤;急性脑损伤;急性心血管损伤;中风;创伤性损伤;移植排斥应答;和移植物排斥。
[0961] C.疾病、病症或状况的损伤、效应或症状的预防、治疗、改善或控制
[0962] 在本发明的进一步的实施方案中,本发明的治疗方法可用于预防、治疗、改善或控制上述疾病和病症的损伤、效应或症状。特别地,本治疗方法可以用于解决症状,包括但不限于恶病质,癌变,绝育,白内障形成,放射性皮炎,β烧伤,γ烧伤,细胞丧失(特别是骨髓、消化道细胞),造血、胃肠道、中枢神经、心血管、皮肤和/或生殖系统的损伤,急性辐射综合征(恶心感、呕吐、一般疾病和疲劳、免疫系统压抑、毛发脱落、无法控制的出血(口、皮下、肾)、大量腹泻、谵妄、昏迷和死亡),慢性辐射综合征,皮肤辐射综合征(炎症、红斑、干性或湿性脱屑、毛发脱落、起疱、变红、溃疡、皮脂腺和汗腺损伤、萎缩、纤维化、减轻或加重的皮肤色素沉着、和坏死),头痛,眩晕,恶心,呕吐,粘膜刺激,呼吸困难,意识障碍,昏迷,惊厥,过速-和过缓-节律异常,低血压,心血管性虚脱,acyanosis,心动过缓,瞳孔缩小,唾液分泌过多,腹泻,无意识的排尿,肌肉颤抖,初始去极化的弛缓性麻痹,棘波放电和惊厥,中间综合征,神经毒性酯酶抑制,有机磷酸酯诱发的延迟的神经病变,红斑,水肿,坏死和水疱,黑皮病,气管支气管炎,支气管痉挛,支气管阻塞,出血性肺水肿,呼吸衰竭,细菌性肺炎,眼红斑,流泪,眼部不适,眼中严重疼痛,眼睑痉挛,虹膜炎,失明,骨髓抑制,路易式毒气休克,肝坏死,灌注不足继发的肾衰竭,灼烧感(眼、鼻咽、口咽),大量流泪,鼻溢,嘶哑咳嗽,呼吸困难,吞咽痛,结膜炎,角膜损伤,鼻-口咽损伤/水肿,声门结构的炎症引起的呼吸窘迫,分泌,和/或喉痉挛,急性呼吸道综合征,定向障碍,行为改变,和应答性气道功能障碍综合征。
[0963] 如上面提到的,这些组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状仅是在本发明的方法中使用的肽可解决的病症范围的示例。因此,本发明一般提供了组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的防止性、治疗性或预防性治疗。
[0964] 可通过施用有效量的本发明的肽来治疗或预防组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状。在某些实施方案中,本发明提供了治疗或预防本文描述的疾病或病症的方法,包含向患有疾病或病症的个体施用能有效治疗或预防该疾病或病症的一定量的本发明的肽的步骤。在一个实施方案中,施用包含有效量的一种或多种本发明的肽或其药学上可接受的盐的组合物。
[0965] D.为了累积或协同效应,与其它治疗剂联合治疗
[0966] 在某些实施方案中,本发明涵盖了用于治疗、调节、改善或预防组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的方法,该方法包括对需要的患者施用有效量的肽和另一种合适的治疗剂,各自根据适合药物的方案施用。可以进行该方法来实现肽和治疗剂的作用的加成、协同或抵消(抵消治疗剂的副作用)益处。该方法包括肽和合适的治疗剂的同步、基本同步、或非同步施用。肽和合适的治疗剂的非同步施用,包括肽和合适的治疗剂的依序、交替、和急性及慢性施用。同样地,肽和合适的治疗剂可以在相同或分开的药物组合物中施用,而且如果分开施用,它们可以通过相同的施用途径或不同途径施用。合适的治疗方法和药剂可以包括但不限于氨基甲酸酯(吡啶斯的明、毒扁豆碱、氨基斯的明、新斯的明、普鲁斯的明、依斯的明、茂巴、单甲基克百威(decarbofuran))、抗胆碱能剂(苯海索、贝那替秦、双环哌丙醇、东莨菪碱、阿普罗芬、阿托品、东莨菪碱、阿地芬宁、卡拉美芬、五甲铵、美卡拉明、苯海索)PANPAL、氨基苯酚(氧化毒扁豆碱)、有机磷酸酯(TEPP、Paraxon、乙基-4-硝基苯基磷酸酯)、他克林、7-MEO-TA、石杉碱甲、胆碱脂酶(BuChE、AChE、三酯酶、对氧磷酶)、肟/重活化剂(HI-6、PAM、双复磷、双解磷、甲肟、Hlo-7、BI-6、K048、K033、氯解磷定(2-PAM Cl)、P2S、TMB4、2-PAMI)、苏拉明、苯二氮类、筒箭毒碱、美金刚、丙环定、尼莫地平、可乐定、解磷定、地西泮、脑啡肽、苯甲磺酰氟、碳酸氢钠、维生素E类似物(α-生育酚琥珀酸酯、γ-生育三烯酚)、超氧化物歧化酶/过氧化氢酶模拟物(EUK189)、硒、苄基苯乙烯基砜、截短的鞭毛蛋白、他汀类、染料木黄酮、加兰他敏、降低体温、5-雄烯二醇、CpG-寡聚脱氧核苷酸、抗菌剂、干细胞移植、氨磷汀、坦波尔(Tempol)、异黄酮、苄砜类似物、GM-CSF、G-CSF、碘化钾、氢氧化、普鲁士蓝、螯合剂(二乙烯三胺五乙酸(Ca-DTPA)、二乙烯三胺五乙酸锌(Zn-DTPA))、角质细胞生长因子、肠肽激素、β葡聚糖、奥曲肽、己酮可可碱、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、高铁血红蛋白形成剂(亚硝酸戊酯、亚硝酸钠)、硫代硫酸钠、钴化合物(羟钴胺素(维生素B12a))、类毒素、抗毒素、疫苗、被动抗体,化疗剂(包括但不限于甲氨蝶呤、紫杉醇、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、顺铂、卡铂、丝裂霉素、达卡巴嗪、丙卡巴肼、依托泊苷、喜树碱、博来霉素、多柔比星、伊达比星、柔红霉素、D放线菌素、普卡霉素、米托蒽醌、门冬酰胺酶、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇、和多西紫杉醇);辐射:γ-辐射;烷化剂;氮芥:环磷酰胺、异环磷酰胺曲磷胺、苯丁酸氮芥;亚硝基脲:卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、烷基磺酸白消安、曲奥舒凡;三氮烯:达卡巴嗪;含铂化合物:顺铂、卡铂、植物生物碱;长春花生物碱:长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨;紫杉烷:紫杉醇、多西紫杉醇;DNA拓扑异构酶抑制剂表鬼臼酯:依托泊苷、替尼泊苷、拓扑替康、9-氨基喜树碱伊立替康(Campto.RTM.)、克立那托;丝裂霉素:丝裂霉素C;抗代谢物剂、抗叶酸剂:DHFR抑制剂:甲氨蝶呤、三甲曲沙;IMP脱氢酶抑制剂:麦考酚酸、噻唑呋林、利巴韦林EICAR;核糖核苷酸还原酶抑制剂:羟基脲;去铁胺;嘧啶类似物:尿嘧啶类似物、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、去氧氟尿苷、雷替曲塞;
胞嘧啶类似物:阿糖胞苷(ara C)、胞嘧啶阿拉伯糖苷氟达拉滨;嘌呤类似物:巯基嘌呤、硫鸟嘌呤;激素治疗;受体拮抗剂:抗雌激素、三苯氧胺、雷洛昔芬甲地孕酮;LHRH激动剂:戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林;抗-雄激素:氟他胺、比卡鲁胺;类视黄醇/Deltoids维生素D3类似物:EB 1089、CB 1093、KH 1060;光动力学治疗:维替泊芬(BPD-MA)、酞菁光敏剂、Pc4去甲氧基-竹红菌素A(2BA-2-DMHA);细胞因子:干扰素-α、干扰素-γ、肿瘤坏死因子;异戊二烯化抑制剂:洛伐他汀;多巴胺能神经毒素:1-甲基-4-苯基吡啶盐离子;细胞周期抑制剂:星孢菌素;放线菌:放线菌素D、D放线菌素;博来霉素:博来霉素A2、博来霉素B2、培洛霉素;蒽环类:柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、
2+
米托蒽醌;MDR抑制剂:维拉帕米;Ca ATP酶抑制剂:毒胡萝卜素;TNF-a抑制剂/沙利度胺血管生成抑制剂3-(3,4-二甲氧基-苯基)-3-(1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-丙
TM TM TM TM
酰胺(SelCIDs )ImiDs 、Revlimid 、Actimid 。在本发明的另一个方面,根据本发明的药物组合物可以在制剂中包含肽与至少一种呈现组织保护功能的小分子。合适的小分子包括但不限于类固醇(例如拉扎洛依和糖皮质激素)、抗氧化剂(例如辅酶Q10、α硫辛酸、和NADH)、抗分解代谢的酶(例如谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、合成催化清除剂、以及模拟物)、吲哚衍生物(例如吲哚胺、咔唑和咔啉)、硝酸中和剂、腺苷/腺苷激动剂、植物化学成分(黄酮类)、草药提取物(杏(Glnko biloba)和姜黄)、维生素(维生素A、E和C)、氧化酶电子受体抑制剂(例如黄嘌呤氧化酶电子抑制剂)、矿物质(例如、锌和镁)、非类固醇抗炎症药物(例如阿司匹林、普生、和布洛芬)、及其组合。可以与本药物组合物联合使用额外的药剂,包括但不限于抗炎症剂(例如皮质类固醇、泼尼松和氢化可的松)、糖皮质激素、类固醇、非类固醇抗炎症药物(例如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、和COX-2抑制剂)、β-激动剂、抗胆碱剂和甲基黄嘌呤)、免疫调节剂(例如,小有机分子、T细胞受体调节剂、细胞因子受体调节剂、T-细胞消耗剂、细胞因子拮抗剂、单核因子拮抗剂、淋巴细胞抑制剂、或抗癌剂)、注射金、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、抗血管生成剂(例如血管生成抑制因子)、TNF-α拮抗剂(例如抗-TNFα抗体)、和内皮抑制素)、氨苯砜、补骨脂素(例如甲氧沙林和三甲沙林)、抗疟剂(例如羟基氯喹)、抗病毒性剂、抗组胺剂和抗生素(例如红霉素和青霉素)。
[0967] 在其它实施方案中,用于治疗、调节、改善或预防组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的本发明的方法进一步包含与诸如以下的治疗方法联合施用肽:化疗、放疗(x-射线辐射、高能兆伏级(大于1MeV能量的辐射)、电子束、正电压x-射线辐射、发射γ-射线的放射性同位素(镭、钴和其它元素的放射性同位素))、高压舱、心脏旁路机、血管成形术、体温降低、手术、血管成形术等,以实现肽和治疗方法作用的加成、协同或抵消(抵消治疗方法的副作用)益处。作为例子,在具体实施方案中,可以向经历了手术作为癌症治疗并同时接受化疗或放疗的患者施用肽。在另一具体实施方案中,在施用肽之前或之后施用化疗剂或放疗,优选地在至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月,更加优选地数个月(例如多达三个月)之前或之后。另外,本发明提供了用肽作为化疗或放疗的替代来治疗癌症或肿瘤疾病的方法,其中化疗或放疗已证明或可证明毒性过大,例如,对被治疗的患者造成不可接受或不可忍受的副作用。或者,本发明提供了治疗方法,其中在用化疗或放疗进行治疗之前、同时或之后施用肽以力求预防或改善治疗方法的毒性副作用。如实施例2中证明的,依照本方法施用的肽能够改善已知化疗剂顺铂的副作用。尽管上面实施例涉及癌症的治疗,可以理解,肽可以与本领域用于治疗组织损伤相关疾病或病症和由此产生的损伤、效应或症状(包括炎症和暴露于毒性剂)的其它方法联合施用以达到协同、加成或抵消效应。
[0968] E.肽的制剂和施用
[0969] 在一个实施方案中,本发明的方法提出可将包含肽的药物组合物全身施用以保护或治疗靶向的细胞、组织或器官。这些施用可以是肠胃外、通过吸入、或经粘膜的施用,例如口服、含服、鼻、直肠、阴道内、舌下、经眼、粘膜下或经皮施用。优选地,施用是肠胃外的,例如通过静脉内或腹腔内注射,而且也包括但不限于动脉内、肌肉内、皮内和皮下施用。
[0970] 对于其它施用途径,例如通过使用灌流液、注射入器官、或其它局部施用,将提供产生上述类似水平的肽的药物组合物。约15pM-30nM的水平是优选的。
[0971] 本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。在具体实施方案中,术语“药学上可接受的”指已被联邦或州政府的管理机构批准,或者在美国药典或其它普遍认可的外国药典中列举的用于动物的,且更具体地用于人的。术语“载体”指与治疗剂一同施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或运载体。这些药学载体可以为无菌液体,例如水中的盐水溶液和油,包括石油、动物油植物油或合成来源的油,例如花生油大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时,盐水溶液是优选的载体。盐水溶液和右旋糖溶液和甘油溶液也可以作为液体载体使用,特别是对于可注射溶液而言。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果希望的话,组合物也可以包含少量的润湿或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放配方等形式。可以用传统的粘合剂和载体例如甘油三酸酯将组合物配制为栓剂。本发明的化合物可被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐,例如源自盐酸、磷酸、醋酸、草酸酒石酸等的盐,以及与游离羧基形成的盐,例如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。合适的药学载体的例子描述在E.W.Martin的“Remington’sPharmaceutical Sciences”中,该文献通过参考被完整并入本文。这些组合物将包含治疗有效量的化合物(优选地为纯化形式)以及合适量的载体,以便提供适合对患者施用的形式。制剂应当适合施用模式。
[0972] 本发明也涵盖了提高肽(例如长效肽)的经粘膜吸收的制剂。适合口服施用的药物组合物可作为以下形式提供:胶囊或片剂;粉末或颗粒;溶液、糖浆或悬浮液(在水性或非水性液体中);可食用泡沫或搅成泡沫状的;或乳液。片剂或硬明胶胶囊可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊可以包含植物油、蜡、脂肪、半固体、或液体多元醇等。溶液和糖浆可以包含水、多元醇和糖。
[0973] 可以用延迟活性剂在胃肠道中的崩解和/或吸收的材料(例如,可以使用单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)对口服施用的活性剂进行包衣或与之混合。因此,可以实现活性剂数小时内的持续释放,且如果必要的话,可以保护活性剂使其不在胃内被分解。可以配制口服施用的药物组合物以促使活性剂由于特定的pH或酶条件而在特定的胃肠道位置释放。
[0974] 适合经皮施用的药物组合物可以被提供为离散型贴片,其旨在使药物组合物在延长的时间段中保持与受体表皮的紧密接触。适合表面施用(topicaladministration)的药物组合物可作为软膏、乳膏、悬浮液、洗液、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油提供。对于向皮肤、口、眼或其它外部组织的表面施用,表面软膏或乳膏是优选的。当配制在软膏中时,活性成分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。或者,活性成分可以用水包油基质或油包水基质配制在乳膏中。适合对眼表面施用的药物组合物包括滴眼液。在这些组合物中,可将活性成分溶解或悬浮在合适的载体(例如水性溶剂)中。适合在口中局部施用的药物组合物包括锭剂、含锭和漱口剂。
[0975] 适合鼻和肺施用的药物组合物可包含固体载体例如粉末(优选地,具有范围在20到500微米内的颗粒大小)。粉末可以用鼻嗅的方式施用,即由置于鼻附近的粉末容器经由鼻快速吸入。或者,适合鼻施用的组合物可以包含液体载体,例如鼻喷雾剂或滴鼻剂。或者,化合物向肺中的直接吸入可以通过深吸或由咬嘴进入咽部的装置来实现。这些组合物可以包含活性成分的水性或油溶液。通过吸入施用的组合物可以使用专门适配的装置供应,包括但不限于加压气溶胶、喷雾器或吹入器,其可以被构建以便提供预定剂量的活性成分。在优选实施方案中,本发明的药物组合物可被直接施用至鼻腔,或通过鼻腔或口咽施用至肺。
[0976] 适合直肠施用的药物组合物可以作为栓剂或灌肠剂提供。适合阴道施用的药物组合物可以作为阴道栓剂、卫生棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂提供。
[0977] 适合肠胃外施用的药物组合物包括水性和非水性的无菌可注射的溶液或悬浮液,其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质,其使得组合物与预期受体的血液基本等渗。可存在于这些组合物中的其它成分包括例如水、酒精、多元醇、甘油和植物油。适合肠胃外施用的组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中,例如密封的安瓿和小瓶,且可以冷冻干燥(冻干)状态储存,其仅要求在使用前即时加入无菌的液体载体,例如注射用无菌盐水溶液。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。在一个实施方案中,可提供包含肽的可注射溶液的自动注射器以供救护车、急诊室和战场环境的紧急使用,甚至供在居家环境中自我施用,特别是在可能发生创伤性截肢的可能性时,例如由于割草机的不慎使用。通过在最快时间向断落部分的多个位点施用肽,甚至在医疗人员抵达现场或在带有断趾的遭受痛苦的个体到达急诊室前施用肽,可以增加断足或断趾中的细胞和组织在重新连接后存活的可能性。
[0978] 在优选实施方案中,组合物依照常规程序被配制成适合对人进行静脉内施用的药物组合物。典型地,静脉内施用的组合物是在无菌的等渗水性缓冲液中的溶液。必要时,组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以减轻注射位置的疼痛。一般地,成分分开地或混合在一起在单位剂型中提供,例如,作为干燥的冻干粉或无水浓缩物在气密容器例如指示活性剂的数量的安瓿或小袋中提供。当组合物通过输液施用时,它可以用含有无菌医药级水或盐水的输液瓶配制。当组合物通过注射施用时,可以提供一安瓿无菌盐水,以便各成分可以在施用前混合。
[0979] 栓剂一般包含范围在0.5%到10%重量的活性成分;口服制剂优选地包含10%到95%的活性成分。
[0980] 可以提供灌流液组合物用于原位灌注。这样的药物组合物可以包含不适合对个体急性或慢性、局部或全身施用的肽的水平或肽的形式,但可作为器官浴、器官灌流液、或原位灌流液中发挥期望的功能,之后在将经处理的器官或组织暴露于或返回常规循环前去除或降低其中包含的肽的水平。
[0981] 本发明也提供了药物包装或试剂盒,其包含了装有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。这些容器任选地附有通知,其采用了监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式,且该通知反映了该机构对制造、使用或销售供人类施用的批准。
[0982] 在另一个实施方案中,例如,可以在控释系统中递送肽。例如,可以使用静脉内输液、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它施用模式施用肽。在一个实施方案中,可以使用泵(参见Langer,见上;Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald等,1980,Surgery 88:507;Saudek等,1989,N.Engl.J.Med.321:574,各文 献均通过参考被完整并入本文)。在另一个实施方案中,可以在囊泡特别是脂质体中递送化合物(参见Langer,Science249:1527-1533(1990);Treat等,Liposomes in the Therapy of Infectious Diseaseand Cancer中,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,353-365页(1989);WO 91/04014;美国专利号4,704,355;Lopez-Berestein,同上,317-327页;一般参见同上)。在另一个实施方案中,可以使用聚合材料(参见MedicalApplications of Controlled Release,Langer 和 Wise( 编 ),CRC Press:
Boca Raton,Florida,1974;Controlled Drug BioaVallability,Drug Product Design andPerformance,Smolen 和 Ball( 编 ),Wiley:New York(1984);Ranger 和 Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1953;也参见Levy等,1985,Science 228:
190;During等,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard等,1989,J.Neurosurg.71:105(各文献通过参考被完整并入本文)。
[0983] 在另一实施方案中,控释系统可以被放置在治疗靶点即靶向的细胞、组织或器官的附近,因此仅需要全身剂量的一部分(参见,例如,Goodson,MedicalApplications of Controlled Release中115-138页,卷2,见上,1984,该文献通过参考被完整并入本文)。其它的控释系统在Langer的综述(1990,Science249:1527-1533,该文献通过参考被完整并入本文)中讨论。
[0984] 在另一实施方案中,可通过鼻、含服、口服、直肠、阴道、经眼、经皮、肠胃外、吸入或舌下施用来施用经合适配制的肽。
[0985] 在具体实施方案中,可能希望对需要治疗的区域局部施用本发明的肽;这可以通过例如但不限于以下方式实现:手术期间局部输液、表面应用(例如与手术后伤口敷料联合)、通过注射、借由导管、借由栓剂、或借由植入物,所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝胶状的材料,包括膜例如硅橡胶膜或纤维。这些实施方案的非限制性例子可以是被植入血管、导管等的一部分中的被本发明的肽包衣的支架或其它骨架。
[0986] 优选的有效剂量的选择是技术人员基于对数个因素的考虑可以容易确定的,这些因素是本领域普通技术人员已知的。这些因素包括肽的特殊形式,和其药代动力学参数,例如生物利用度、代谢、半衰期等,它们将会在获取药学化合物的监管审批中通常使用的常规开发程序期间确立。剂量考虑的进一步的因素包括:待治疗的状况或疾病或在正常个体中待实现的益处、患者的体重、施用途径、施用是急性的还是慢性的、同时的用药、和其它已知将影响药剂施用功效的因素。因此,精确的剂量应当根据从业医师的判断和每个患者的情况决定,例如,根据个体患者的状况和免疫状态,和根据标准临床技术。
[0987] 在本发明的另一方面,提供了用于灌注和储存供移植器官的灌流液或灌注溶液,该灌注溶液包括有效保护应答细胞和相关细胞、组织或器官的一定量的肽或肽类似物。移植包括但不限于:同种异体移植,其中从供体获取器官(包括细胞、组织或其它身体部分),并将其移植到不同的受体中,供体和受体是相同的物种;自体移植,其中从身体的一部分取出器官并在另一部分进行替换,包括离体手术过程,其中可以移走器官,且在离体时对其进行切除、修复、或者以其他方式处理(例如肿瘤移除),然后将该器官返回到原始位置;或异种移植,其中在物种之间移植组织或器官。在一个实施方案中,灌注溶液是威斯康星大学(UW)溶液(美国专利号4,798,824,该文献通过参考被并入本文),其包含5%羟乙基淀粉(具有约200,000到约300,000的分子量而且基本不含乙二醇、氯乙醇、氯化钠和丙酮);25mM KH2PO4;3mM谷胱甘肽;5mM腺苷;10mM葡萄糖;10mM HEPES缓冲液;5mM葡萄糖酸镁;1.5mM CaCl2;105mM葡萄糖酸钠;200,000单位青霉素;40单位胰岛素;16mg地塞米松;12mg酚红;且具有7.4-7.5的pH值和约320mOsm/l的渗透压,并补充了合适量的本发明的肽。该特定灌流液仅是可通过包含有效量的肽而适合本发明用途的若干此类溶液的示例。在进一步的实施方案中,灌流液溶液包含约1到约500ng/ml的肽,或约40到约320ng/ml的肽。如上所述,任何形式的肽都可被用于本发明的该方面。
[0988] 尽管对于本发明的总体目的而言,优选的肽的受体是人,但本方法同等地适用于其它哺乳动物,特别是驯化的动物、家畜、伙伴、和动物园动物。但是,本发明不是如此限制的,其益处可被用于任何哺乳动物。
[0989] 在离体发明的进一步方面,可以使用任何肽,例如但不限于上述的肽。
[0990] 在本发明的另一方面,提供了用于在没有通过内皮细胞屏障与血管分离的细胞、组织或器官中预防、治疗或控制组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的方法和组合物,其通过将细胞、组织或器官直接暴露于包含肽的药物组合物,或向组织或器官的血管施用或令其接触包含肽的药物组合物来实现。
[0991] 与其它基于促红细胞生成素的组织保护化合物类似,本发明的肽可能可以从腔面运输到具有内皮细胞紧密连接的器官毛细血管的内皮细胞基底膜表面,包括例如脑、视网膜和睾丸。因此,可以治疗组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状对穿越屏障的细胞的效应。尽管不希望受限于任何特别的理论,转胞作用后,肽可以与细胞上的组织保护受体相互作用,例如,神经、眼(例如视网膜)、脂肪、结缔组织、毛发、牙齿、粘膜、胰腺、内分泌、耳、上皮、皮肤、肌肉、心脏、肺、肝、肾、小肠、肾上腺(例如肾上腺皮质、肾上腺髓质)、毛细血管、内皮、睾丸、卵巢、干细胞或子宫内膜细胞,且受体结合可以启动信号转导级联,导致应答细胞或组织内的基因表达程序的激活,保护细胞或组织或器官免受例如损害,例如由于暴露于毒性剂、炎症、缺氧等造成的损害。在另一实施方案中,依照PCT申请号PCT/US01/49479、美国专利申请号10/188,905和10/185,841的教导(各文献通过参考被并入本文),肽可以与能够穿过屏障的化合物(例如CEPO)交联从而被运输穿越屏障。
[0992] 因此,在本文以下部分详细描述了用于保护组织免于组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的方法。
[0993] 在本发明的一个实施方案的实践中,哺乳动物患者经历了针对癌症治疗的全身化疗,包括放疗,其一般具有有害作用,例如神经、肺、心脏、卵巢或睾丸损伤。包含上述组织保护肽或肽类似物的药物组合物的使用在化疗和/或放疗之前和期间进行,以保护各种组织和器官免受化疗剂损伤,例如保护睾丸。治疗可以持续,直到化疗剂的循环水平已经降至低于对哺乳动物身体具有潜在危险的水平。
[0994] 在本发明的另一个实施方案的实践中,计划从汽车事故的受害者中获得各种器官用于移植给多个受体,其中一些需要运输一段延伸的距离和时间段。在获取器官前,用包含本文所述的组织保护肽和肽类似物的药物组合物灌注供体。获取的供装运的器官可用包含如本文所述的组织保护肽或肽类似物的灌流液灌注,且储存在包含组织保护肽或肽类似物的浴中。可用脉动灌注装置并使用包含根据本发明的组织保护肽和肽类似物的灌流液连续灌注某些器官。在运输期间和植入及原位器官再灌注时发生器官功能的最小恶化。
[0995] 在本发明的另一实施方案中,在让个体暴露于毒性剂的危险活动中的参与者可以服用一剂药物组合物,其包含的肽足以预防(即延迟其发作、抑制、或停止)、保护、或缓和暴露于毒性剂的效应。特别地,该治疗方法可在各种涉及与毒性剂接触的职业中具有用途,例如矿工、化学制造商、军事人员(士兵、伞兵)、应急人员(警察、消防员、EMS、和灾难救援人员)、建筑工人、食品加工者、和动力反应堆的雇员。
[0996] 在本发明的另一个实施方案中,修复心脏瓣膜的手术过程需要暂时的心脏停搏和动脉闭塞。在手术前,将组织保护肽或肽类似物注入患者。这样的治疗预防了缺氧缺血性细胞损伤,特别是在再灌注后。另外,本发明的药物组合物可被预防性地使用以使个体为手术作好准备,力求限制手术过程相关的创伤或帮助个体从手术过程中恢复。尽管使用包含了组织保护肽和肽类似物的药物组合物的本治疗方法为手术过程提供了预防用途,其在诱发暂时缺血性事件的过程中可能特别有用,包括但不限于旁路过程(冠状动脉旁路)、血管成形术过程、截肢、和移植、以及直接对应答细胞、组织或器官进行的过程,如大脑和脊髓手术、和开心过程。这些过程可能涉及心肺(心脏肺脏)旁路的使用。
[0997] 在本发明的另一个实施方案中,在任何手术过程例如心肺旁路手术中,可以使用本发明的组织保护肽或肽类似物。在一个实施方案中,如上所述的包含组织保护肽和肽类似物的药物组合物的施用在旁路过程之前、期间和/或之后进行,以保护脑、心脏和其它器官的功能。
[0998] 在其中肽被用作离体应用或体内应用以治疗组织损伤相关疾病或病症或由此产生的损伤、效应或症状的前述例子中,本发明提供了剂量单位形式的药物组合物,其适合于预防、治疗或控制暴露于毒性剂的损伤和效应或其症状,所述剂量单位形式包含量的范围在约0.01pg到30mg、0.5pg到25mg、1pg到20mg、500pg到10mg、1ng到10mg、500ng到10mg、1μg到10mg、500μg到10mg、或1mg到10mg内的肽,和药学上可接受的载体。在优选实施方案中,肽的量在约0.5pg到1mg范围内。在优选实施方案中,制剂包含非红细胞生成的肽。
[0999] 此外,本发明的恢复性方面针对本发明的任何肽在制备用于恢复细胞、组织或器官功能障碍的药物组合物中的用途,其中治疗在造成功能障碍的原发损伤后和相当一段时间之后开始。此外,使用本发明的肽的治疗可以跨越疾病或状况在急性期和慢性期的疗程
[1000] 本发明的肽可以全身施用,其每次施用的剂量在约1ng至约300μg/kg体重,优选地约5-150μg/kg-体重,最优选地约10-100μg/kg-体重之间。例如,如果临床需要,可以每小时、每日重复施用,或在合适的间隔后重复施用,例如每1-12小时,优选地每6到12小时;每2-6天,优选地每2-4天;每1到12星期,优选地每1到3星期。在一个实施方案中,有效量的肽和药学上可接受的载体可以被包装在单个剂量小瓶或其它容器中。在另一实施方案中,可以使用能够发挥本发明描述的活性但不会造成血红蛋白浓度或血细胞比率增加的肽。这些肽在其中期望长期提供本发明的方法的例子中是优选的。实施例
[1001] 实施例1:肽合成的方法
[1002] A.肽A(SEQ ID NO:2,对应于EPO氨基酸序列38-57)和肽B(SEQ IDNO:3,对应于EPO氨基酸序列58-82)的合成
[1003] 使用如Band,D.,Chopra,N和Kent,S.,“Total Synthesis of Crambin”,J.AM.CHEM.SOC.2004,126,1377-1383(其通过参考被完整并入本文)中描述的“原位中和”Boc化学逐步固相肽合成法来合成EPO的片段——肽A(SEQID NO:2)和肽B(SEQ ID NO:3)。简α α言之,在-OCH2-Pam-树脂(游离 羧基肽)或在HSCH2CH2CO-Leu-OCH2-Pam-树脂( 硫酯肽)上合成对应于EPO氨基酸序列38-57(肽A,NITVPDTKVNFYAWKRMEVG,SEQ ID NO:2)和EPO氨基酸序列58-82(肽B,QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV,SEQ ID NO:3)的两个片段。在合成期间,如下保护各种氨基酸的侧链:Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(4-CH3Bzl)或Cys(ACM)、Glu(OcHex)、Lys(2-Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Tyr(Br-Z)。肽链组装后,通过用包含对甲酚的无水HF(90∶10,v/v)在0℃处理1小时,对所述肽去保护并同时将其从树脂支持物上裂解。在减压下蒸发HF后,沉淀粗产物并用冷的二乙醚磨碎,并将肽溶解在包含0.1%TFA的50%乙腈溶液中,并通过制备型HPLC系统纯化。使用LC-MS确认肽组合物。
[1004] 肽ID(UEQLERALNSS,SEQ ID NO:280)是11个氨基酸的线性肽,具有受保护的N-末端(被焦谷氨酸的5元环结构保护)和C-末端的游离羧基。其分子量为1257道尔顿。使用标准Fmoc固相肽合成法在Wang树脂上合成所述肽,通过制备型HPLC和离子交换色谱纯化,并冻干。醋酸根和铵以离子形式与肽分子的碱性和酸性基团结合,形成混合的盐。
[1005] 实施例2.组织保护肽和肽类似物为非红细胞生成的
[1006] A.体外评估
[1007] 使用人促红细胞生成素依赖性白血病细胞系UT-7epo来确定肽的红细胞生成效力。UT-7epo细胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ),目录号ACC 363)在含有10%FBS和5ng/ml促红细胞生成素的完全RPMI-1640培养基中生长。暴露于促红细胞生成素的细胞的增殖/存活(=活力增加)应答通过经典的红细胞型促红细胞生成素受体介导,且是对促红细胞生成素的变体刺激经典的促红细胞生成素受体的能力的定量测量。
[1008] 将UT-7epo细胞转移到包含10%供体牛血清、4mM L-谷氨酰胺、并补充了5ng/ml重组人促红细胞生成素的新鲜完全RPMI 1640培养基中。将细胞在含有20ml培养基/烧瓶2
的75cm 烧瓶中、在具有5%CO2的潮湿的培养箱中于37℃维持48小时。在试验的第二天,即在第48小时,将细胞由烧瓶转移到50-ml锥形管中,并在室温下以1,000rpm离心5分钟。
丢弃上清液,用10ml饥饿培养基(3%供体牛血清,4mM L-谷氨酰胺)洗涤细胞两次。然后将细胞重悬在饥饿培养基中,通过上下吹吸以获得单细胞悬浮液。用饥饿培养基稀释重悬
5 2
的细胞以获得4×10 细胞/ml的密度,并以每个25cm 烧瓶10ml总培养体积铺板。培养4小时后,再次将细胞转移到50-ml锥形管中。对照细胞始终维持在5ng/ml的重组人-促红细胞生成素中。
[1009] 将细胞在饥饿培养基中稀释至200,000细胞/ml,在96孔板中以100μl/孔铺板,并将细胞暴露于不同浓度的促红细胞生成素和肽ID(SEQ ID NO:280)。利用在包含3%血清的RPMI 1640培养基中的10倍系列稀释以生成浓度5pM到50nM的测试化合物。进一步培养48小时后,向每个孔中加入15ml WST-I细胞增殖试剂(Roche)溶液,并在37℃在CO2中培养1小时。混合1分钟后,在读板器中读板(在450nm的吸收,减去在650nm的背景吸收)。如图1中所示,与EPO的强红细胞生成效应相比,肽ID在剂量范围内不具有红细胞生成活性。这远低于所期望的,即非红细胞生成的肽或肽类似物在剂量低于1μg/ml(且更优选地,剂量低于10μg/ml)时将不具有红细胞生成活性。
[1010] B.体内评估
[1011] 为评估组织保护肽和肽类似物的红细胞生成活性,每日两次向SpragueDawley大鼠静脉内施用肽ID,共28天。九只雄性和九只雌性大鼠被分成组1-4,通过静脉内团注在1-28天接受每剂0、60、180和600μg/kg(分别为0、48、143和477nmol/kg)的处于PBS中的肽ID。在第29天收集血样以分析血液变量。通过使用自动分析仪(Keska Corporation)测定血红蛋白浓度。如图2所示,任何一组中的血红蛋白浓度不存在差异。
[1012] 此外,在兔子中评估肽ID的红细胞生成和造血作用。在研究开始前,对所有兔子采集血样以建立动物的血液基线。每日两次对新西兰白兔静脉内施用肽ID,共28天。对于该研究,六只雄性和雌性被分到组1和4,而四只雄性和四只雌性被分到组2和3。通过静脉内团注,组1接受了0、组2接受了每剂30μg(24nmol/kg体重)、组3接受了每剂90μg/kg(72nmol/kg体重);而组4接受了每剂300μg/kg(240nmol/kg体重)的处于PBS中的肽ID。在第29天收集血样以测试血液变量。基线与第29天血液参数的对比显示在血红蛋白浓度、血细胞比率、或血小板计数中没有不同(图3,a.b.和c.)。
[1013] 实施例3.在体外试验中肽或肽类似物是组织保护的
[1014] 可以使用任意数量的体外试验来容易地评估肽和肽类似物的组织保护。例如,针对兴奋性毒性的保护可以使用钾盐镁矾诱发的小鼠运动神经元死亡来测定。从如前所述的15天大的Sprague-Dawley大鼠胚胎获得脊髓(Siren等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:4044,该文献通过参考被完整并入本文)。前角经胰蛋白酶作用并以300×g离心10分钟通过4%BSA垫。将细胞(代表混合的神经元-神经胶质培养物)以2,000细胞/
cm的密度接种到预涂了聚-DL鸟氨酸和层粘连蛋白的24-mm孔板中。运动神经元通过免
2
疫淘洗(immunopanning)进一步纯化,并将细胞以低密度(20,000细胞/cm)接种到预涂了聚-DL-鸟氨酸和层粘连蛋白并包含完全培养基[Neurobasal/B27(2%);0.5mM L-谷氨酰胺;2%马血清;25mM 2巯基乙醇;25mM谷氨酸盐;1%青霉素和链霉素;1ng/ml BDNF]的
24-mm孔板上。在第4和第6天将培养基(无谷氨酸盐)重新添加到培养物中。通过与红藻氨酸(对混合的神经元-神经胶质培养物,5mM;对纯化的培养物,50mM)培养48小时,在第6天诱发培养中的细胞死亡。在诱发细胞死亡前72小时,将肽B(5ng/mL,1.8nM)、EPO(3.3nM)或运载体加入到培养物中,而且持续治疗48小时。然后丢弃培养基,用含4%(vol/vol)多聚甲醛的PBS固定细胞40分钟,用0.2%Triton X-100透性化,用含10%(vol/vol)FCS的PBS封闭,用针对未磷酸化的神经丝蛋白的抗体(SMI-32;1∶9,000)培养过夜,并且使用二氨基联苯通过抗生物素蛋白-生物素法可视化。通过对盖玻片四边的SMI-32阳性细胞进行计数并通过使用H33258对凋亡小体染色,从形态学上评估运动神经元的活力。如图
4中所示,肽B保护细胞免受谷氨酸盐受体激动剂红藻氨酸的神经毒性效应。
[1015] 实施例4.脑中动脉闭塞模型
[1016] 对Sprague Dawley大鼠(每组8只)进行以下MCAO方案。手术依照Brines等,2000,PNAS USA 97:10526-10531(该文献通过参考被完整并入本文)的教导进行。简言之,用水合氯醛(400mg/kg-体重,腹腔内)麻醉大鼠,让颈动脉可视化,且通过两次缝合堵塞并切断右颈动脉。邻近右眼眶且在其边缘的钻孔让脑中动脉(“MCA”)可视化,该MCA在鼻动脉的远端被烧灼。为产生环绕该固定的MCA损害的半暗带(边缘区域),通过使用由细钳提供的牵引堵塞对侧颈动脉1小时然后重新开通。
[1017] 向大鼠施用了盐水、作为单一静脉内剂量的肽ID(2μg/kg体重)、或作为再灌注的单一静脉内剂量(2μg/kg体重)的肽IX(LSEQARNQSEL,SEQ ID NO:299,其是肽B(SEQ ID NO:3)的混序形式),接着以2小时的间隔进行三次额外的注射。为评估损伤,对大鼠进行行为测试,或依照前述方案,在手术后24小时进行脑切片的四唑染色以测定损害体积。
[1018] (a)损害体积
[1019] 通过在手术后24小时对大脑切片进行的四唑染色确定损害的体积。与盐水治疗3 3
的大鼠(291±23mm)比较,肽ID在24小时显示了梗塞体积(225±20mm)的显著减少。
[1020] (b)行为测试
[1021] 也在足失误行为法中测试大鼠。依照Markgraf等,1992,Brain Research575:238-246(其通过参考被完整并入本文)的方法,在网格大小为30mm的升高的30cm×30cm不锈网格地板上测试大鼠。当被放置在网格上时,大鼠将试图四处移动,而且偶尔会将脚放在网格开口中(“足失误”),而不是放在网格上。在1分钟时间内测量足失误的数目。
[1022] 足失误数目指示了MCAO引起的大鼠认知损伤,足失误数目越少,认知损伤越轻。如图5中所示,与盐水治疗的大鼠(20.2±0.8足失误)和肽IX治疗的大鼠(20.1±2.1足
失误)比较,肽ID显著地改善了大鼠在足失误法中的表现(11.2±1.1足失误)。
[1023] 实施例5:双侧肾缺血试验
[1024] 六十只雄性C57/BL6小鼠(~25g;Charles River Laboratories)用氯胺酮(150mg/kg)和赛拉嗪(15mg/kg)腹腔内麻醉。将每只动物放置在设置在37℃的恒温毯上,且在中线剖腹手术后,使用非创伤性血管夹夹住肾蒂30分钟。在再灌注后的1分钟、6小时和12小时以标明的剂量通过腹腔内注射施用肽ID。在单剂量的研究中,小鼠接受了对照(PBS)、在1分钟接受1μg/kg肽IG、在30分钟接受1μg/kg肽IG、在6小时接受1μg/kg肽ID、或在6小时接受10μg/kg肽ID(每组12只小鼠)。在多剂量研究中,小鼠在再灌注的1分钟、6小时和12小时接受了多次剂量的对照(PBS)、0.1μg/kg肽ID、1μg/kg肽ID、或10μg/kg肽ID。
[1025] 二十四小时后,再次麻醉小鼠,并通过心脏穿刺获得血液。将血浆尿素和肌酸用作肾功能障碍的指标,并将天冬氨酸转氨酶用作肾损伤的指标。数据使用ANOVA分析,然后进行Dunnett’s事后检验比较。
[1026] 如图6中和图7A各图中所示,1μg/kg的肽ID或10μg/kg的肽ID引起肾功能障碍的这些生化标记降低。
[1027] 实施例6:伤口愈合
[1028] 伤口愈合的全层穿刺活检模型被用来评估肽ID。在该实验中,直径3.5mm的全层皮肤伤口位于Sprauge-Dawley大鼠剃过并脱毛的肩胛区域3cm宽方格的角落中。肽ID(24nmol/kg体重,9只大鼠)或PBS(9只大鼠)每日皮下施用,共10天。在系列数码照片中以盲方式测量的开放伤口的面积显示,接受了肽ID的动物呈现更快的愈合,如图8中所示。
[1029] 实施例7:认知的增强
[1030] 大鼠中的新对象识别范型被用来评估它们对先前体验的物体的记忆。具体地,成年Wistar大鼠暴露于新的测试对象,然后在24小时后再次暴露于该测试对象。将动物分成5组,接受:(1)运载体;(2)加兰他敏(3mg/kg,腹腔内),测试前1小时,作为阳性对照;(3)肽ID(24nmol/kg体重,腹腔内),首次暴露于新对象后3小时,(4)肽ID(24nmol/kg体重,腹腔内),每天两次,从训练前5天持续到训练后的第二天;和(5)肽ID(24nmol/kg体重,腹腔内),首次暴露于新对象前1小时。
[1031] 如图9中所示,与组1和5中的大鼠比较,组2-4的大鼠在测试中呈现了改善的对新对象的识别。这些结果暗示,肽ID可能影响记忆获得的巩固期。
[1032] 实施例8:顺铂诱发的肾病
[1033] 除了其它毒性以外,已知癌症化疗剂例如顺铂(CDDT)诱发肾损伤。通过每星期两次共5星期腹腔内施用2mg/kg CDDT来评估肽IC保护大鼠免受顺铂诱发的肾病的能力。同时以剂量0.4μg/kg施用肽IC,每星期三次,共5星期。通过测量尿液生成体积来评估肾功能。如图10中所示,肽IC的同步治疗针对CDDT引起的肾功能障碍进行保护。
[1034] 同样地,除了其它毒性,已知CDDT诱发外周神经病变。遵循以上对肾功能描述的实验设计,评估肽IC针对外周神经病变进行保护的能力。腹腔内施用2mg/kg CDDT,每星期两次,共5星期。同时以剂量0.4μg/kg施用肽IC,每星期三次,共5星期。通过热板反应潜伏期来评估神经病变,所述潜伏期是大鼠的足与热表面接触和收回脚之间的延迟期。如图11中所示,同步治疗预防了外周神经病变的出现。
[1035] 实施例9:皮层肿瘤植入
[1036] 依照Lampson等,Cancer Res.53:176-82:1993的方案进行皮层肿瘤植入研究以确定肽ID对肿瘤生长的作用。
[1037] 依照该方案,麻醉雄性CD fisher大鼠,剃除它们右侧的头皮并用消毒剂冲洗。然后在右颞叶大脑皮层上方的头皮上作一个小切口。在颅盖中钻1mm的孔,不刺伤硬脑膜。在无菌条件下,通过与精确的Hamilton注射器相连的22号针缓慢注射5μl活的50,000个9L/LacZ胶质肉瘤细胞。然后对环钻术位点使用骨蜡,缝合皮肤并腹腔内施用预防剂量的抗生素。每日向对照大鼠提供腹腔内盐水注射。用肽ID治疗的大鼠接受每日30μg/kg的腹膜腔内注射,持续25天。在植入后25天,将动物麻醉,用2%多聚甲醛灌注并固定大脑。
然后去除大脑并在大脑基质装置上切成1mm厚的冠状切片,通过平面方法测定肿瘤块的大小。
[1038] 图12证实了肽ID在该模型中抑制了皮层肿瘤的进一步生长。尽管盐水治疗的大2
鼠中肿瘤的相对体积生长到大于0.4cm,肽ID治疗的大鼠中的肿瘤没有经历肿瘤体积的生长。
[1039] 实施例10:9L胶质肉瘤植入模型
[1040] 依照上述的Lampson等,Cancer Res.53:176-82:1993的方法,通过使用Hamilton注射器向CD Fisher大鼠植入经LacZ基因转染的9L胶质肉瘤细胞。向右侧尾壳核中注射10微升的100,000个细胞。
[1041] 植入后两星期,将动物分成三组进行每日腹腔内注射:一组接受具有短血浆半衰期的肽ID,另一组接受肽IW(肽IC的聚乙二醇形式),而第三组接受盐水。25nmole/kg体重的剂量施用肽。三星期后,将动物杀死,并自大脑切出连续的1mm厚冠状切片,并用5-溴-4-氯-3-吲哚基-[β]-D-吡喃半乳糖苷(Xgal)培养。肿瘤细胞(包含LacZ基因)
将Xgal代谢成深蓝染色,确定肿瘤的程度。获得高分辨率的数码图像并使用平面方法测定染成蓝色的区域。数据表示为肿瘤浸润总面积。
[1042] 如图13所示,结果显示,在用具有较长半衰期的肽(肽IW)治疗的组中,肿瘤大小明显降低,其总面积与使用具有较短半衰期的肽(肽ID)在植入当天开始每日治疗并每日持续治疗直到杀死而在动物中所获得的总面积相当。相比之下,尽管接受了作用较短的肽(肽ID)的组在植入后两星期的平均面积小于盐水组,但并不是显著地不同。
[1043] 此外,图14提供了经盐水、肽ID、和肽IW治疗的大鼠的大脑的比较照片。可以清晰地看到,最大的肿瘤(暗区域)存在于经盐水治疗的大鼠中。用肽ID每天治疗的大鼠具有相当小的肿瘤,但用肽IW治疗的大鼠在两星期后呈现了最佳结果。
[1044] 这些发现与肽引起9L胶质肉瘤细胞系退化的能力一致。
[1045] 实施例11:(预示)癌症恶病质的治疗
[1046] 可以通过以下方法证实肽对于癌症的恶病质症状的能力。
[1047] 体重为约200g的大鼠被腹腔内接种108个AH-130肝癌细胞。同时,将用感兴趣的肽(例如肽ID或肽IW)治疗一组大鼠,其剂量处于治疗有效范围约0.10到2.0μg/kd/天内。用安慰剂治疗第二组。在第16天,将大鼠杀死。在接种前和第11天评估大鼠个体的食物摄取和运动活性。在第0天和第16天杀死后通过NMR扫描评估体重和身体组成。
[1048] 与安慰剂治疗的大鼠比较,预期用依照本发明的方法的肽治疗的大鼠将呈现更少的脂肪和肌肉萎缩。另外,肽治疗的大鼠的食物摄取和运动活性将被改善。
[1049] 实施例12:组胺诱发的耳朵炎症
[1050] 在 Brand 等,“Tea tree oil reduces histamine-induced oedema inmurineears”,Inflamm.Res.51(2002)283-289中公开的组胺诱发的水肿的小鼠模型中评估可用于本治疗方法的肽的拮抗组胺的促炎症效应的能力。简言之,在研究中使用24只Sprague Dawley大鼠(雄性,250克)。在组胺激发前,麻醉每只大鼠,并使用弹簧式千分尺测量大鼠耳朵的厚度。将20μl的60mg/ml组胺二磷酸盐溶液皮内注射到大鼠的一只耳朵中,且在30秒后,大鼠接受(1)30μg/kg肽ID,静脉内(12只大鼠)或(2)盐水,静脉内(12只大鼠)。然后将20μl的60mg/ml组胺二磷酸盐溶液皮内注射到大鼠的另一只耳朵中。随后在组胺激发后15、30、45和60分钟使用卡尺测量大鼠耳朵的厚度。
[1051] 如图15中可以看到的,与盐水比较,肽ID降低了与组胺激发相关的水肿的量。
[1052] 实施例13:组胺诱发的风团形成
[1053] 在大鼠中评估肽ID降低由皮内施用组胺诱发的血浆外渗(风团)的能力。向动物预先施用伊文思蓝染料(其与白蛋白紧密结合)以提供血管渗漏的可视标记。为测定肽IG活性的持续性,在肽ID施用(30μg/kg,静脉内施用)后的不同时间段,皮内施用剂量0.12μg的组胺,且染料泄露程度通过对组胺放置后15分钟(风团表面积在该时间点最大)获得的数码照片进行面积测量来定量。对每只动物仅在单个时间点进行测试以避免组胺施用对随后应答的影响。如图16中所示,发现单次剂量的肽ID施用压制风团形成,且压制效应在直至单次剂量后24小时仍可检测,显示了盐水与肽ID治疗的动物对比在面积上的差异。
[1054] 实施例14:组胺诱发的风团形成
[1055] 在异氟醚麻醉下,将12只Sprague-Dawley大鼠的腹部剃毛和脱毛。然后对每只大鼠静脉内注射(通过颈内静脉)伊文思蓝的稀释溶液(30mg/ml,于盐水中,1ml/kg体重)。5分钟后,以矩形样式在每只大鼠的腹部施用6次小剂量的组胺(皮内施用20微升组胺二磷酸盐)。15分钟后,当风团达到其最大尺寸时,对风团拍照,并通过数字面积测量法测定起疱面积。为测试各种肽的功效,在组胺注射后不久,对大鼠静脉内施用感兴趣的肽。测试的肽和结果记录如下。
[1056] A.促红细胞生成素
[1057] 在组胺激发时,大鼠接受了盐水或10μgm/kg的EPO。图17显示,经EPO治疗的大2 2
鼠的风团面积(损害面积)(约0.4cm)是经盐水治疗的动物的损害面积(约0.8cm)的一
半。
[1058] B.肽ID、肽IW和混序的肽ID(肽IY,SEQ ID NO:299,GLpLSEARNQSEL)
[1059] 在组胺激发时,大鼠接受了盐水、肽IY(30μg/kg)、肽ID(30μg/kg)、或肽IW(30μg/kg)。图18显示,经肽ID和肽IW治疗的大鼠的风团面积(损害面积,分别为约2 2 2
0.35cm 和0.3cm)是经盐水和肽IY治疗的动物的损害面积(各为约0.6cm)的一半。这
不仅证明了肽ID和IW在调节组胺和组胺相关的炎症应答方面的功效,而且,考虑到肽IY没有呈现抗炎症活性,还证明了上面公开的基序对肽的功效的重要性。
[1060] C.肽IW、逆向反转肽IC(肽IZ,SEQ ID NO.300,SSNLAQRELQEQ)、肽ID、和混序的肽IZ(肽JA(SEQ ID NO.301)LSEQARNQSEL)
[1061] 在组胺激发时,大鼠接受盐水、肽JA(30μg/kg)、肽IZ(30μg/kg)、肽IW(30μg/kg)或肽ID(30μg/kg)。图19显示,经肽IW、ID和IZ治疗的大鼠的风团面积(损害面积,2 2 2
分别为约0.3cm、0.35cm 和0.4cm)小于经盐水和肽JA治疗的动物的损害面积(各为约
2
0.6cm)。
[1062] 实施例15:褥疮试验
[1063] 依 照 Pierce 等,Selective A2A adenosine receptor activation reduces skinpressure ulcer formation and inflammation,Am J Physiol Heart CircPhysiol281:67-74,2001的公开,对24只成年Sprauge-Dawley大鼠执行褥疮(压疮)试验。简言之,将铁磁性钢板植入到大鼠皮肤的背部区域下。对在其下植入板的皮肤区域使用长方形的永久性磁铁从而压迫板和磁铁之间的皮肤。这一压迫减少了对皮肤的血流,造成缺血。对大鼠进行缺血-再灌注循环(2小时缺血与0.5小时再灌注)72小时时间。测量每只大鼠的伤口面积,且随后用盐水、30μg/kg肽ID皮下施用两次对大鼠进行治疗:一次在第一次缺血开始时,而第二次在24小时后、每日皮下施用30μg/kg肽ID、或每日施用EPO。每日测量每只大鼠的伤口面积,持续12天。图20证明,肽ID和EPO减小了伤口的尺寸,而且肽IG的每日施用导致最小的伤口大小。
[1064] 实施例16(预示实施例):皮肤点刺试验
[1065] 进行初步组胺皮肤点刺试验来测定基线。对处于半卧位置的患者在两前臂的掌侧(腕远侧皮肤横纹上超过5cm)进行皮肤点刺试验。用酒精清洗前臂并让其干燥。使用笔来标记用于组胺和阴性对照的预期皮肤试验位置,且标记彼此相距至少2cm。将一滴组胺二盐酸盐(10mg/ml)或阴性对照放置在合适的标记处,然后无菌的刺血针以90°角插入穿过各液滴并收回。然后在施用后15分钟观察位置上红斑的存在和风团形成。对风团拍照,然后使用数字面积测量法测定风团大小。
[1066] 使用上述方法,在至少3小时后再次进行皮肤点刺试验。可以在施用组胺激发前15分钟到2小时、在施用组胺激发的同时、或在组胺激发后1到60分钟对患者施用上述肽之一,以分别确定肽预防、控制/改善或治疗组胺诱发的炎症的能力。例如,在组胺点刺时,可通过静脉内或皮下注射给予患者一剂肽ID。预期用肽ID治疗后风团面积将减小约50%。
[1067] 实施例17:造血筛选试验中的辐射缓和活性
[1068] 在辐射损伤小鼠模型中评估可用于本治疗方法的肽在缓和放射性制剂对造血系统影响方面的能力。简言之,研究中使用的80只C57BL/6小鼠(50%雌性和50%雄性,15-28克)被分成两组。
[1069] 在两组中,以来自137Cs辐射源(GammaCell 40;Nordion International,Kanata,Ontario,Canada)的单次统一全身剂量的γ辐射向小鼠施用辐射,照射率为65-69cGy/分钟+/-2.5cGy。
[1070] 组A接受了LD70/30辐射剂量(796cGy),然后在辐射后24小时向20只小鼠施用肽ID(30μg/kg皮下),随后每天施用一次,共29天。剩下的20只小鼠(对照组)在辐射后24小时接受PBS(皮下),然后每天接受一次,共29天。
[1071] 组B接受了LD90/30辐射剂量(831cGy),然后在辐射后24小时向20只小鼠施用肽ID(30μg/kg皮下),随后每天施用一次,共29天。剩下的20只小鼠(对照组)在辐射后24小时接受PBS(皮下),然后每天接受一次,共29天。
[1072] 每天一次监测小鼠的存活,直到早期安乐死的迹象出现,然后两次/天直到第30天。
[1073] 如图21中所示,与接受PBS的小鼠相比,接受肽ID皮下施用的小鼠的三十天存活和总生存时间显著增加。特别地,在796cGy,与对照组的10%存活率相比,治疗小鼠呈现了45%存活率;而在831cGy,与对照组的5%存活率相比,治疗小鼠呈现了20%存活率。
[1074] 实施例18:胃肠道筛选试验中的辐射缓和活性
[1075] 在辐射损伤小鼠模型中评估可用于本治疗方法的肽在缓和放射性制剂对胃肠道系统影响方面的能力。简言之,在研究中使用30只C57BL/6小鼠(雄性,20-30克)。
[1076] 使用在300kV,10mA运行的Pantak HF320X-射线(Agfa NDT Ltd.,Reading,UK)对小鼠施用辐射。X-射线管具有额外过滤以提供2.3mm Cu半价层(HVL)的辐射质量。小鼠的头、胸、和前肢被屏蔽以保护它们的骨髓,并为GI应答作挑选。小鼠被约束在夹具中,且位于离X-射线管的焦点700mm远的位点。辐射以剂量率75.5cGy/min(未屏蔽的)和70.0cGy/min(屏蔽的)递送足以使小鼠暴露于15Gy辐射的一段时间。
[1077] 在辐射后24小时,向15只小鼠施用肽ID(30μg/kg皮下),然后在研究期间每天施用一次,而剩下15只小鼠(对照组)接受PBS(皮下),然后在研究期间每天接受一次。
[1078] 对小鼠每天称重和监测一次,直到腹泻和早期安乐死的迹象出现,然后每天称重和监测两次。
[1079] 如图22中所示,接受肽ID皮下施用的小鼠的二十天存活显著高于接受PBS的小鼠(治疗组中6只小鼠:对照组中1只)。
[1080] 本发明不限于所述具体实施方案的范围,所述具体实施方案意在作为本发明各方面的单个示例,且功能上等同的方法和组分在本发明的范围内。实际上,除了本文显示和描述的之外,基于以上描述和附图,本发明的各种修改对本领域技术人员将是显而易见的。这些修改应落在所附的权利要求的范围内。
[1081] 为了所有目的,本文引用的所有参考文献均通过参考被完整并入本文。
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