技术领域
[0001] 本
发明属于
生物医学材料领域，具体涉及一种引导牙周组织再生屏障膜及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]
牙周病是人类
口腔两大类主要
疾病之一，在我国和世界范围均有较高的患病率。随着我国人口的老龄化，牙周病的问题将会更突出。牙周病的
治疗不仅在于
炎症消除，更重要的是在于使已破坏的牙周组织再生和形成牙周新附着。如何实现牙周组织完全再生，是至今尚未解决的难题，也是牙周病研究领域中的重要课题和突破点。引导组织再生(Guided tissue regeneration，GTR)技术是解决这一临床难题最常用、有效的方法之一。屏障膜的使用是GTR技术中的关键环节，屏障膜的性能在一定程度上决定了GTR技术的成败。
[0003] GTR屏障膜主要有两种：(1)不可吸收性膜材料：以膨体聚四氟乙烯为主要代表，已较广泛用于实验研究和临床治疗(如商品名：Gore-Tex)，但此类膜需二次手术取出，且取出时间难以掌握，放置时间过长会影响牙周组织再生和增加感染机会，现已较少使用；(2)可吸收性膜材料：主要有
胶原蛋白膜、聚乳酸膜、乳酸-乙酸共聚物膜等，此类膜的优点是能在体内逐渐降解，避免二次手术，减少了创伤。目前，国外进口的可降
解吸收的牙周组织再生材料(如商品名：Bio-Guide)在临床上应用最广泛，然而其价格非常昂贵，在国内的应用范围和推广程度受到限制，而国内自主研发的可降解吸收的牙周再生材料在市场中相对还十分稀缺。因此，制备和构建具有诱导牙周组织再生能
力的新型可降解高分子GTR屏障膜具有迫切性和重要意义。
[0004] 大豆
蛋白质(Soy protein，SPI)是来源最丰富的
植物蛋白，除了作为大众营养食品外，在生物医学上还具有显著的生理活性。最近有研究表明，在富含大豆蛋白质的溶液中，牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)能较长时间保持良好活性，提示SPI有应用于GTR屏障膜的潜力。壳聚糖是自然界唯一的
碱性多糖，研究表明，与胶原等可降解高分子材料相比较，壳聚糖除了具有良好的
生物降解性和
生物相容性外，还具有促进组织修复、
止血、防止组织粘连、抗菌等生物活性，更具有应用于GTR中的优势。此外，单一的材料会存在一些不足：SPI制备的材料耐
水性较差，遇水易溶胀、
变形和失去力学强度，通过改性处理可克服这些缺点；而壳聚糖在弱酸性环境中易于溶解和流失，其微观结构、力学性能和降解性能的可调控性较差，它的细胞亲和力不够，细胞
吸附性较弱，也需进一步改性处理。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于解决目前引导牙周组织再生屏障膜存在的诸多问题，提供一种引导牙周组织再生屏障膜及其制备方法与应用。本发明以两种来源丰富的天然高分子材料—大豆蛋白质和壳聚糖为原料，通过流延法结合
冷冻干燥技术，携载一类生物活性因子，得到一种具有双层非对称结构的组织再生屏障膜，达到了取长补短、优势互补的目的。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 一种引导牙周组织再生屏障膜，为致密层、疏松层双层非对称结构的组织再生屏障膜，其制备方法包括如下步骤：
[0008] (1)分别配制大豆蛋白质溶液和壳聚糖溶液；所述的大豆蛋白质溶液的配制原料包括大豆蛋白质、水、NaOH、
冰乙酸，其浓度优选为2～4％(
质量百分比)；所述的壳聚糖溶液的配制原料包括壳聚糖、水、冰乙酸，其浓度优选为2～3％(质量百分比)。
[0009] (2)物理共混制备大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液：将大豆蛋白质溶液加至壳聚糖溶液(前后顺序不可颠倒)中，搅拌均匀，离心脱气后制得大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液；所述复合溶液中大豆蛋白质的量优选为大豆蛋白质和壳聚糖总质量的1～50％。
[0010] (3)大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液经流延法制得双层非对称屏障膜的致密层：将大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液倒入模具中，烘干后在其表面均匀划线，置-10～-30℃预冷。所述的模具优选为聚四氟乙烯模具。
[0011] 在致密层上采用冷冻干燥法制备双层非对称复合屏障膜的疏松层：往所得样品上倒入大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液，快速摇匀，迅速置-60～-90℃冷冻12～24h，
真空冷冻干燥成型。用NaOH溶液除酸，再用水洗涤至pH为中性，再次冷冻后抽干(真空冷冻干燥)。
[0012] (4)将步骤(3)所得样品浸泡于生物活性因子溶液中，取出后-60～-90℃冷冻12～24h，真空冷冻干燥成型，得到引导牙周组织再生屏障膜。
[0013] 步骤(1)中所述的大豆蛋白质溶液的配制方法优选为：按照质量比大豆蛋白质:蒸馏水:5％NaOH溶液＝1:14:9，先将大豆蛋白质在少许蒸馏水中溶胀，再滴加5％NaOH溶液搅拌均匀，补足剩余蒸馏水后，在50～60℃水浴30～60min。然后将其逐滴滴加到冰乙酸中，搅拌至溶液为乳白色无沉淀状态。
[0014] 步骤(1)中所述的壳聚糖溶液的配制方法优选为：称取壳聚糖溶于2～3％冰乙
酸溶液中，完全溶解后，离心脱气10～15min。
[0015] 优选的，所述的引导牙周组织再生屏障膜的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)分别配制大豆蛋白质溶液和壳聚糖溶液：
[0017] 大豆蛋白质溶液：按照质量比大豆蛋白质:蒸馏水:5％NaOH溶液＝1:14:9，先将大豆蛋白质在少许蒸馏水中溶胀，再滴加5％NaOH溶液搅拌均匀，补足剩余蒸馏水后，在50～60℃水浴30～60min。然后将其逐滴滴加到冰乙酸中，搅拌至溶液为乳白色无沉淀状态制备
2～4％的大豆蛋白质溶液。
[0018] 壳聚糖溶液：称取壳聚糖粉末溶于2～3％的冰乙酸溶液中搅拌至完全溶解后，离心脱气10～15min制备2～3％的壳聚糖溶液。
[0019] (2)将大豆蛋白质溶液缓慢加入到壳聚糖溶液中，搅拌均匀，离心脱气，制得大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液，复合溶液中大豆蛋白质的量为大豆蛋白质和壳聚糖总质量的1～50％。
[0020] (3)将大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，烘干后在其表面均匀划线，置-20℃预冷。预冷后取出，倒上一层大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液，快速摇匀，迅速放入-80℃冷冻12～24h，置于
冷冻干燥机中冷冻抽干。抽干后用5％NaOH溶液浸泡10～15min除酸，之后用流水冲洗24h，再用去离子水浸泡洗涤数小时至pH为中性，再次放入-80℃冷冻12～24h，置于真空冷冻干燥机中冷冻抽干。
[0021] (4)将步骤(3)所得样品浸泡于生物活性因子溶液中浸泡1～2h，放入-80℃冷冻12～24h，置于真空冷冻干燥机中冷冻抽干，得到引导牙周组织再生屏障膜。
[0022] 所述的引导牙周组织再生屏障膜具有双层非对称结构，其一侧为平整致密面，另一侧为多孔疏松面。其致密面可对其他细胞(尤其是增殖速度较快的
成纤维细胞)起到一定的阻隔作用，阻止
牙龈上皮和牙龈结缔组织向根面生长，为牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)的增殖分化留出足够的空间；其疏松面为疏松多孔的三维立体结构，孔隙排列规则，孔隙之间相互贯通，利于营养物吸收与代谢废物的排出，利于PDLSCs的增殖与分化。
[0023] 本发明的引导牙周组织再生屏障膜可用于组织修复中，即可用于制备或作为修复组织用制品。所述的修复组织用制品包括牙周组织再生膜、
骨修复膜、人工
皮肤、
人工血管、人工神经
导管、人工韧带。
[0024] 本发明相对于
现有技术具有如下优点和效果：
[0025] 本发明操作步骤简单，组织再生屏障膜的制备过程中没有添加
醛类等有毒
试剂，反应体系温和，能较好保留两种天然高分子材料以及添加生物活性因子的生物活性。
[0026] 本发明在设计工艺上，利用流延法和冷冻干燥法制备非对称性双层屏障膜，膜中各组分均具有不同的生物活性，通过功能互补和协同作用，以及设计成具有平滑致密层和粗糙网络层的双层非对称结构，使得该类屏障膜除了作为一种生物相容性好，能在体内降解和具有分隔屏障作用外，同时还具有诱导组织再生的作用。
附图说明
[0027] 图1为本发明引导牙周组织再生屏障膜的扫描电镜照片。A、B分别为未结合生物活性因子的复合屏障膜致密面和疏松面；C、D分别为结合生物活性因子的复合屏障膜致密面和疏松面。
[0028] 图2为引导牙周组织再生屏障膜体外降解4周的扫描电镜照片。
[0029] 图3为引导牙周组织再生屏障膜体外诱导PDLSCs成骨分化的光镜照片。
具体实施方式
[0030] 下面结合
实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0031] 实施例1引导牙周组织再生屏障膜的制备
[0032] (1)大豆蛋白质溶液的配制：称取5g大豆蛋白质溶于45g蒸馏水中，滴加45g 5％NaOH溶液，搅拌均匀，再加蒸馏水25g，50℃水浴30min。称取120g水浴后溶液逐滴滴加到45.3g冰乙酸中，滴加期间在磁力搅拌器上不断搅拌，配好的大豆蛋白质溶液为乳白色，无沉淀。
[0033] (2)壳聚糖溶液的配制：称取20g壳聚糖粉末溶于980g 2％冰乙酸中搅拌均匀，放置过夜至完全溶解，4℃下7500rpm/min离心脱气10min制备得到2％的壳聚糖溶液，备用。
[0034] (3)大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液的配制：称取144.3g步骤(1)配制的大豆蛋白溶液缓慢加入到500g步骤(2)配制的壳聚糖溶液中，精密定时电动搅拌器搅拌均匀(5h以上)，4℃下6000rpm/min离心8min，得到大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液。
[0035] (4)大豆蛋白质/壳聚糖双层非对称复合屏障膜的制备：将步骤(3)得到的大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液倒入聚四氟乙烯模具中(溶液厚度约1mm)，放入60℃烘干，用大头针在表面有规则地划线，放入-20℃预冷30min，取出，倒入约2mm厚的大豆蛋白质/壳聚糖复合溶液，快速摇匀，迅速放入-80℃冷冻过夜，再置于真空冷冻干燥机中冷冻抽干；抽干后用5％NaOH溶液浸泡10～15min除酸，之后用流水冲洗24h，再用去离子水浸泡洗涤数小时至pH为中性，再次放入-80℃，于次日拿出冷冻抽干成型，得到大豆蛋白质/壳聚糖双层非对称复合屏障膜。
[0036] (5)大豆蛋白质/壳聚糖双层非对称复合屏障膜携载生物活性因子：将上述步骤-7(4)得到的复合屏障膜浸泡于辛伐他丁溶液(5×10 mol/L)中1h，取出置于-80℃
冰箱冷冻过夜，真空冷冻干燥成型，得到携带生物活性因子辛伐他丁的大豆蛋白质/壳聚糖双层非对称复合屏障膜。
[0037] (6)上述(4)和(5)所得复合屏障膜经液氮冷冻后，真空干燥3h，分别将样品的疏松面和致密面粘贴于
铜台上，经离子溅射仪喷金
镀膜后，用扫描
电子显微镜观察样品的疏松面和致密面形态(
加速电压为20kV)。从图1可以看出，结合生物活性因子前后的复合屏障膜的疏松面均为三维网状结构，孔隙之间相互贯通，孔隙规则，孔径大小约50μm，有利于营养吸收与代谢废物的排出，利于PDLSCs的增殖与分化；其致密面较平整光滑、无孔隙结构，将对增殖速度较快的成纤维细胞起到一定的阻隔作用。
[0038] 实施例2引导牙周组织再生屏障膜的体外降解性试验
[0039] (1)配制含溶菌酶的
磷酸盐缓冲液(溶菌酶含量为1.5mg/mL)，过滤除菌置4℃备用。
[0040] (2)称取实施例1所述携载生物活性因子的复合屏障膜0.1g，置于离心管中，经高压
蒸汽灭菌；
[0041] (3)在无菌操作下，往上述(2)离心管加入含溶菌酶的磷酸盐缓冲液10mL，置于37℃恒温摇床低速摇动，每天半量换液，保证溶液pH相对稳定；
[0042] (4)分别于3天、1周、2周、3周、4周、8周取样检测(每个时间点设3个平行样)，将取出的样品轻轻用双蒸水漂洗3次，放入烘箱60℃烘干至恒重后称重并记录；
[0043] (5)按公式：降解率＝(测试前质量-测试后质量)/测试前质量×100％，计算出复合屏障膜的体外降解率，试验结果如表1所示。可以看出，随时间延长，复合屏障膜的降解率逐渐增加，在4周内降解速度缓慢。图2为处理4周后的复合屏障膜的扫描电镜照片，可见复合屏障膜材料疏松层孔径增大，但整体形态保持较完好，可起到支持牙周组织的作用，符合作为牙周组织再生屏障膜的要求。
[0044] 表1复合屏障膜体外降解率
[0045]
[0046] 实施例3引导牙周组织再生屏障膜的体外促进PDLSCs增殖及分化试验[0047] (1)将实施例1中所述携带生物活性因子的复合屏障膜剪碎，121℃高温高压蒸汽灭菌30min，称取0.1g复合屏障膜置于20mL DMEM无血清培养液，浸提2天后取出培养液，1000rpm/min离心10min后取上清，即为复合屏障膜的浸提液，放入4℃冰箱保存备用；
[0048] (2)取生长状态良好的第3代PDLSCs，胰酶消化后，制备成
密度为1×105/mL细胞悬液，分别接种至96孔板(每孔200μL)及24孔板(每孔1mL)，37℃5％CO2
培养箱中培养24h；
[0049] (3)待上述(2)96孔板中细胞贴壁后，弃去原有培养液，PBS缓冲液漂洗2次，每孔按照不同浓度梯度(浸提液与培养液之比依次为0:100、10:90、20:80、30:70、40:60)的浸提液换液，继续培养48h；
[0050] (4)取出96孔板，每孔加MTT工作液(5mg/mL)20μL，放入培养箱继续培养4h；
[0051] (5)取出96孔板，轻轻吸出液体，每孔加入150μL DMSO溶解；
[0052] (6)酶标仪振荡3min后于492nm下检测各孔吸光度值。
[0053] 按公式：(实验组OD-背景OD)/(对照OD-背景OD)×100％，计算出细胞相对增殖率。结果如表2所示，复合屏障膜在体外可较好促进PDLSCs增殖。
[0054] 表2复合屏障膜体外促进PDLSCs增殖情况
[0055]
[0056] (7)上述(2)接种至24孔板中细胞贴壁后，按照浸提液:培养基之比为3:7换液，置37℃培养，隔天换液；7天后吸弃孔内培养液，用PBS缓冲液漂洗3次，加入4％多聚甲醛固定
10min，再用缓冲液漂洗3次；向培养孔加入3mL茜素红染液，37℃避光孵育30min，PBS缓冲液漂洗5min，置于倒置相差显微镜下观察并照相记录。图3为光镜下茜素红
染色后PDLSCs的照片，可见细胞内出现明显的
钙化结节，表明该复合屏障膜可较好地诱导PDLSCs往成骨方向分化，符合牙周组织再生的要求。
[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
