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一种引导牙周组织再生术 生物膜及其制备方法和应用

阅读：309发布：2020-05-16

专利汇可以提供一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用，该方法分别培养牙周膜干细胞及制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液，将二者混合制成每毫升全氟三乙胺乳液中104-108个细胞的细胞-全氟三乙胺乳液，将制得的细胞-全氟三乙胺乳液接种于生物膜片上培养，终止培养后，即得到引导牙周组织再生术生物膜。本发明的引导牙周组织再生生物膜制备方法通过改善膜内的乏氧环境，在提高牙周膜干细胞植入后早期的存活效率的同时，抑制局部厌氧菌的滋生，极大的降低了引导组织再生术的失败率，提高了成功率，具有很好的经济和社会效益。，下面是一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别培养牙周膜干细胞及制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液，将二者混合制成每毫升全
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氟三乙胺乳液中10-10个干细胞的细胞-全氟三乙胺乳液，将制得的细胞-全氟三乙胺乳液接种于生物膜片上培养，终止培养后，即得到引导牙周组织再生术生物膜。
2.根据权利要求1所述的引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，所述的培养牙周膜干细胞的步骤具体为：
1.1)人牙周膜细胞原代培养：取因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为组织块，用1mg/mL的I型胶原酶置于37℃消化30min，将组织块均匀接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10％FBS和青链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱中，培养10-15天，每2天换液，待细胞达到80％融合时，胰酶消化传代；
1.2)分离和纯化人牙周膜干细胞：用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞：取步骤1.1得到的细胞用α-MEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为10/mL以下，接种于96孔板，每孔0.1mL，放入37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱，12h后待细胞贴壁后镜下观察标记含单个细胞的孔，补加0.2mL培养基继续培养，每隔3天换液；当细胞形成克隆并长至孔底40％时，胰酶消化，扩大培养，即得人牙周膜干细胞。
3.根据权利要求2所述的引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，还包括步骤1.3)人牙周膜干细胞的鉴定：将经步骤1.2)培养出的人牙周膜干细胞进行克隆形成实验、免疫细胞化学染色、流式细胞术分析及多向诱导分化实验；要求细胞的克隆形成率高于12％，免疫化学染色STRO-1和CD146阳性率高于30％，流式细胞术分析STRO-1和CD146阳性率高于85％，多向分化实验可诱导细胞成骨和成脂。
4.根据权利要求1所述的引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，所述的制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液的步骤具体为：
2.1)称取蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液内，配制成质量体积百分比浓度为
15％～16.6％的蛋黄卵磷脂与Tyrode盐缓冲液的混合溶液，于280W～320W功率下，超声乳化1～3次，每次超声10～20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备得基础乳液；
2.2)另取全氟三乙胺原液，将经步骤2.1)制备出的基础乳液与全氟三乙胺原液按
20:1-1:20的体积比混合，于280W～320W功率下，超声乳化8～12次，每次超声10～20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；
2.3)、将经步骤2.2)制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内8min～12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；
2.4)、采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤2.3)处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌富氧的全氟三丁胺乳液。
5.根据权利要求1所述的引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，所述的制备细胞-全氟三乙胺乳液的步骤具体为：将培养状态良好的牙周膜干细胞，加入到制
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备的全氟三乙胺乳液中，制成每毫升10-10个细胞的全氟三乙胺乳液，即细胞-全氟三乙胺乳液。
6.根据权利要求1所述的引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，所述的生物膜片上培养步骤具体为：将剪成1.5cm×1.5cm生物膜片置于24孔板上，取细胞-全氟三乙胺乳液接种于生物膜片上，培养8-48h后终止培养。
7.根据权利要求1所述的引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，所述的生物膜片为Bio-Gide胶原膜。
8.根据权利要求1所述的引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，其特征在于，所述的全氟三乙胺原液质量浓度大于98％。
9.权利要求1～8中任意一项所述的方法制得的引导牙周组织再生术生物膜。
10.权利要求9所述的引导牙周组织再生术生物膜在牙周病损部位引导牙周组织再生中的应用。

说明书全文

一种引导牙周组织再生术 生物膜及其制备方法和应用

【技术领域】

[0001] 本发明属于生物膜制备技术领域，特别涉及一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用。【背景技术】

[0002] 牙周炎是人类牙齿丢失的首要病因。牙周组织再生是牙周病治疗的最终目的，但传统的牙周洁治和刮治等基础治疗，只能消除病因，不能修复已经丧失的牙周组织。引导组织再生术牙周治疗中的常用方法，是在牙周手术中利用膜性材料作为屏障，阻挡牙龈上皮在愈合过程中沿根面生长，阻挡牙龈结缔组织与根面接触，并提供一定的空间，引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领根面，从而在已暴露于牙周袋内的根面上形成新的牙骨质，并有牙周膜纤维埋入，形成牙周组织的再生，即形成新附着性愈合。

[0003] 用于引导组织再生术的膜性材料可分为两类：不可吸收性膜和可吸收性膜。Bio-Gide胶原膜为一种可吸收生物膜,不需要二次手术取出,它能有效阻挡牙龈结缔组织长入牙周膜,有利于牙周膜细胞形成新的附着。但是，对于一些重度牙周炎患者，Bio-Gide膜引导组织再生的程度往往不甚理想，一部分原因是重度牙周炎患者其牙周膜及牙槽骨等牙周组织丧失过多，很难引导其恢复到正常水平，另一部分原因是局部的厌氧环境使得生物膜易于被细菌污染，从而造成手术失败。

[0004] 牙周膜干细胞是从牙周膜组织中分离出的具有多向分化潜能的干细胞，该细胞可分化成牙周的三种组织：牙槽骨、牙周膜和牙骨质，被认为是牙周组织工程的首选种子细胞。将牙周膜干细胞接种到Bio-Gide膜用于牙周引导组织再生术，可提高引导组织再生术后牙周组织再生的程度。因此，功能性的接种牙周膜干细胞的Bio-Gide复合生物膜具有非常可观的临床应用前景。

[0005] 然而，在该复合生物膜植入早期，其内部缺乏新生的血管，膜内部的细胞将难以通过渗透作用获得营养和氧分的支持。如何能够保证膜内的牙周膜干细胞能够保持良好的活性和功能状态，并改善局部的厌氧环境，提高牙周组织再生术的成功率，成为了目前一个急需要解决的问题。【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用，该生物膜可提高牙周组织再生的效率，解决了现有生物膜引导牙周组织再生时出现的早期氧供不足问题。

[0007] 本发明解决技术问题所采用的技术方案包括以下步骤：

[0008] 一种引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 分别培养牙周膜干细胞及制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液，将二者混合制成每毫4 8
升全氟三乙胺乳液中10-10个干细胞的细胞-全氟三乙胺乳液，将制得的细胞-全氟三乙胺乳液接种于生物膜片上培养，终止培养后，即得到引导牙周组织再生术生物膜。

[0010] 作为本发明的进一步改进，所述的培养牙周膜干细胞的步骤具体为：

[0011] 1.1)人牙周膜细胞原代培养：取因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为1mm×1mm×1mm的组织块，用1mg/mL的I型胶原酶置于37℃消化30min，将组织块均匀接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10％FBS和青链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱中，培养10-15天，每2天换液，待细胞达到80％融合时，胰酶消化传代；

[0012] 1.2)分离和纯化人牙周膜干细胞：用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞：取步骤1.1得到的细胞用α-MEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为10/mL以下，接种于96孔板，每孔0.1mL，放入37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱，12h后待细胞贴壁后镜下观察标记含单个细胞的孔，补加0.2mL培养基继续培养，每隔3天换液；当细胞形成克隆并长至孔底40％时，胰酶消化，扩大培养，即得人牙周膜干细胞。

[0013] 作为本发明的进一步改进，还包括步骤1.3)人牙周膜干细胞的鉴定：将经步骤1.2)培养出的人牙周膜干细胞进行克隆形成实验、免疫细胞化学染色、流式细胞术分析及多向诱导分化实验；要求细胞的克隆形成率高于12％，免疫化学染色STRO-1和CD146阳性率高于30％，流式细胞术分析STRO-1和CD146阳性率高于85％，多向分化实验可诱导细胞成骨和成脂。

[0014] 作为本发明的进一步改进，所述的制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液的步骤具体为：

[0015] 2.1)称取蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液内，配制成质量体积百分比浓度为15％～16.6％的蛋黄卵磷脂与Tyrode盐缓冲液的混合溶液，于280W～320W功率下，超声乳化1～3次，每次超声10～20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备得基础乳液；

[0016] 2.2)另取全氟三乙胺原液，将经步骤2.1)制备出的基础乳液与全氟三乙胺原液按20:1-1:20的体积比混合，于280W～320W功率下，超声乳化8～12次，每次超声10～20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；

[0017] 2.3)、将经步骤2.2)制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内8min～12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；

[0018] 2.4)、采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤2.3)处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌富氧的全氟三丁胺乳液。

[0019] 作为本发明的进一步改进，所述的制备细胞-全氟三乙胺乳液的步骤具体为：将4 8
培养状态良好的牙周膜干细胞，加入到制备的全氟三乙胺乳液中，制成每毫升10-10个细胞的全氟三乙胺乳液，即细胞-全氟三乙胺乳液。

[0020] 作为本发明的进一步改进，所述的生物膜片上培养步骤具体为：将剪成1.5cm×1.5cm生物膜片置于24孔板上，取细胞-全氟三乙胺乳液接种于生物膜片上，培养
8-48h后终止培养。

[0021] 作为本发明的进一步改进，所述的生物膜片为Bio-Gide胶原膜。

[0022] 作为本发明的进一步改进，所述的全氟三乙胺原液质量浓度大于98％。

[0023] 上述的方法制得的引导牙周组织再生术生物膜。

[0024] 一种引导牙周组织再生术生物膜在牙周病损部位引导牙周组织再生中的应用。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0026] 本发明一种引导牙周组织再生术生物膜的制备方法，选择生物膜、全氟三丁胺(Perfluorotributylamine，PFTBA)水凝胶及牙周膜干细胞，其中将PFTBA作为增氧剂，为植入Bio-Gide胶原膜内的牙周膜干细胞提供早期的氧供，提高了牙周膜干细胞的存活率，保持了牙周膜干细胞的活性和功能，从而最大限度的发挥引导牙周组织再生的能力，促进了牙周组织的再生和恢复。本发明的引导牙周组织再生生物膜制备方法通过改善膜内的乏氧环境，在提高牙周膜干细胞植入后早期的存活效率的同时，抑制局部厌氧菌的滋生，极大的降低了引导组织再生术的失败率，提高了成功率，具有很好的经济和社会效益。

[0027] 本发明一种引导牙周组织再生术生物膜，采用牙周膜干细胞的复合可提高牙周组织再生的效率，采用全氟三乙胺解决了现有生物膜引导牙周组织再生时出现的早期氧供不足问题。

[0028] 应用本发明的引导牙周组织再生生物膜在进行引导牙周组织再生术的过程中，牙周膜干细胞可分化为牙周组织，提高了本生物膜促进牙周组织再生的效率。【附图说明】

[0029] 图1是本发明的制备方法原理图。

[0030] 图2是本发明的再生膜可显著促进牙周组织愈合验证对比图。【具体实施方式】

[0031] 如图1所示，本发明的全氟三乙胺乳液与牙周膜干细胞复合的引导牙周组织再生术生物膜制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0032] 步骤1、人牙周膜干细胞的培养与纯化：

[0033] 1.1人牙周膜细胞原代培养：取12-45岁之间因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，立即在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为1mm×1mm×1mm大小的组织块，用I型胶原酶(1mg/mL)置于37℃消化30min，将组织块均匀接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10％FBS和青链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、
5％CO2饱和湿度条件的培养箱中，培养10-15天，每2天换液。待细胞达到80％融合时，胰酶消化传代。

[0034] 1.2分离和纯化人牙周膜干细胞：用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞：取上述细胞用α-MEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为10/mL以下，接种于96孔板，每孔0.1mL，放入37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱，12h后待细胞贴壁后镜下观察标记含单个细胞的孔，补加0.2mL培养基继续培养，每隔3天换液。当细胞形成克隆(集落细胞数多于50)并长至孔底40％时，胰酶消化，扩大培养，即得人牙周膜干细胞。

[0035] 1.3人牙周膜干细胞的鉴定：将经步骤1.2培养出的人牙周膜干细胞进行克隆形成实验、免疫细胞化学染色、流式细胞术分析及多向诱导分化实验。要求细胞的克隆形成率高于12％，免疫化学染色STRO-1和CD146阳性率高于30％，流式细胞术分析STRO-1和CD146阳性率高于85％，多向分化实验可诱导细胞成骨和成脂。

[0036] 步骤2、制备无菌富氧的全氟三乙胺乳液：

[0037] 步骤2.1、称取蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液内，配制成质量体积百分比浓度为15％～16.6％的蛋黄卵磷脂与Tyrode盐缓冲液的混合溶液，于280W～320W功率下，超声乳化1～3次，每次10～20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出基础乳液；

[0038] 步骤2.2、另取全氟三乙胺原液(浓度大于98％)，将经步骤2.1制备出的基础乳液与全氟三乙胺原液按体积比为(20:1-1:20)混合，并于280W～320W功率下，超声乳化8～12次，每次10～20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；

[0039] 步骤2.3、将经步骤2.2制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内8min～12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；

[0040] 步骤2.4、采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤2.3处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液。

[0041] 步骤3、将经步骤2配制的全氟三乙胺乳液与经步骤1得到的种子细胞混合，并复合到Bio-Gide生物膜内，得到本发明的全氟三丁胺乳液与牙周膜干细胞复合的引导牙周组织再生生物膜：

[0042] 步骤3.1、将步骤1中的状态良好的牙周膜干细胞，加入到步骤2配制的全氟三乙4 8
胺乳液中，制成每毫升10-10个细胞的全氟三乙胺乳液，即混合溶液A；

[0043] 步骤3.2、将Bio-Gide生物膜(Geistlich Pharma AG，瑞士)剪成1.5cm×1.5cm，置于24孔板。取混合溶液A接种于生物膜片上常规培养，在培养8-48h后终止培养，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与牙周膜干细胞复合的引导牙周组织再生生物膜。

[0044] 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0045] 实例1

[0046] 称取蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液内，配制成质量体积百分比浓度为15％的蛋黄卵磷脂与Tyrode盐缓冲液的混合溶液，于280W功率下，超声乳化3次，每次10秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出基础乳液；另取全氟三乙胺原液(浓度:98％)，基础乳液与全氟三乙胺原液按体积比为8:1混合，并于280W功率下，超声乳化8次，每次10秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；将制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内8min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤2.3处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液。培养人牙周膜干细胞：取12岁因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，立即在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为1mm×1mm×1mm大小的组织块，用I型胶原酶(1mg/mL)置于37℃消化30min，将组织块均匀接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10％FBS和青链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱中，培养10天，每2天换液。待细胞达到80％融合时，胰酶消化传代。分离和纯化人牙周膜干细胞：用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞：取上述细胞用α-MEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为10/mL以下，接种于96孔板，每孔0.1mL，放入37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱，12h后待细胞贴壁后镜下观察标记含单个细胞的孔，补加0.2mL培养基继续培养，每隔3天换液。当细胞形成克隆(集落细胞数多于50)并长至孔底40％时，胰酶消化，扩大培养，即得人牙周膜干细胞。将经培养出的人牙周膜干细胞进行克隆形成实验、免疫细胞化学染色、流式细胞术分析及多向诱导分化实验。要求细胞的克隆形成率高于12％，免疫化学染色STRO-1和CD146阳性率高于30％，流式细胞术分析STRO-1和CD146阳性率高于85％，多向分化实验可诱导细胞成骨和成脂。6
将状态良好的牙周膜干细胞，加入到已配制的全氟三乙胺乳液中，制成每毫升10个细胞的全氟三乙胺乳液，即混合溶液A；将Bio-Gide生物膜(Geistlich Pharma AG，瑞士)剪成
1.5cm×1.5cm，置于24孔板。取混合溶液A接种于生物膜片上常规培养，在培养8-48h后终止培养，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与牙周膜干细胞复合的引导牙周组织再生生物膜。

[0047] 实例2

[0048] 称取蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液内，配制成质量体积百分比浓度为16％的蛋黄卵磷脂与Tyrode盐缓冲液的混合溶液，于300W功率下，超声乳化3次，每次20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出基础乳液；另取全氟三乙胺原液(浓度大于98％)，基础乳液与全氟三乙胺原液按体积比为4:1混合，并于300W功率下，超声乳化10次，每次20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；将制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内10min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；
采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤2.3处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液。培养人牙周膜干细胞：取15岁因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，立即在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为1mm×1mm×1mm大小的组织块，用I型胶原酶(1mg/mL)置于37℃消化30min，将组织块均匀接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10％FBS和青链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱中，培养12天，每2天换液。待细胞达到80％融合时，胰酶消化传代。分离和纯化人牙周膜干细胞：用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞：取上述细胞用α-MEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为10/mL以下，接种于96孔板，每孔0.1mL，放入37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱，12h后待细胞贴壁后镜下观察标记含单个细胞的孔，补加0.2mL培养基继续培养，每隔3天换液。当细胞形成克隆(集落细胞数多于50)并长至孔底40％时，胰酶消化，扩大培养，即得人牙周膜干细胞。将经培养出的人牙周膜干细胞进行克隆形成实验、免疫细胞化学染色、流式细胞术分析及多向诱导分化实验。要求细胞的克隆形成率高于12％，免疫化学染色STRO-1和CD146阳性率高于30％，流式细胞术分析STRO-1和CD146阳性率高于85％，多向分化实验可诱导细胞成骨和成脂。
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将状态良好的牙周膜干细胞，加入到已配制的全氟三乙胺乳液中，制成每毫升10个细胞的全氟三乙胺乳液，即混合溶液A；将Bio-Gide生物膜(Geistlich Pharma AG，瑞士)剪成
1.5cm×1.5cm，置于24孔板。取混合溶液A接种于生物膜片上常规培养，在培养8-48h后终止培养，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与牙周膜干细胞复合的引导牙周组织再生生物膜。

[0049] 实例3

[0050] 称取蛋黄卵磷脂加入到Tyrode盐缓冲液内，配制成质量体积百分比浓度为16.6％的蛋黄卵磷脂与Tyrode盐缓冲液的混合溶液，于320W功率下，超声乳化3次，每次
20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出基础乳液；另取全氟三乙胺原液(浓度大于98％)，基础乳液与全氟三乙胺原液按体积比为3:2混合，并于320W功率下，超声乳化
12次，每次20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；
将制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤2.3处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液。培养人牙周膜干细胞：取45岁因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，立即在超净工作台内冠根单向刮取根中1/3牙周膜组织，修剪成为1mm×1mm×1mm大小的组织块，用I型胶原酶(1mg/mL)置于37℃消化30min，将组织块均匀接种于6孔板内，盖无菌盖玻片，滴加含10％FBS和青链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱中，培养15天，每2天换液。待细胞达到80％融合时，胰酶消化传代。分离和纯化人牙周膜干细胞：用有限稀释法克隆培养分离的人牙周膜干细胞：取上述细胞用α-MEM制成单细胞悬液，调整细胞密度为10/mL以下，接种于96孔板，每孔0.1mL，放入37℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱，12h后待细胞贴壁后镜下观察标记含单个细胞的孔，补加0.2mL培养基继续培养，每隔3天换液。当细胞形成克隆(集落细胞数多于50)并长至孔底40％时，胰酶消化，扩大培养，即得人牙周膜干细胞。将经培养出的人牙周膜干细胞进行克隆形成实验、免疫细胞化学染色、流式细胞术分析及多向诱导分化实验。要求细胞的克隆形成率高于12％，免疫化学染色STRO-1和CD146阳性率高于30％，流式细胞术分析STRO-1和CD146阳性率高于85％，多向分化实验可诱导细胞成骨和成脂。将状态良好的牙周膜干细胞，加入到已配制的全氟三乙胺乳液中，制成每
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毫升10个细胞的全氟三乙胺乳液，即混合溶液A；将Bio-Gide生物膜(Geistlich Pharma AG，瑞士)剪成1.5cm×1.5cm，置于24孔板。取混合溶液A接种于生物膜片上常规培养，在培养8-48h后终止培养，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与牙周膜干细胞复合的引导牙周组织再生生物膜。

[0051] 本发明各成份在组方中的作用如下：

[0052] 本发明中所用Bio-Gide生物膜是瑞士盖氏制药有限公司的产品，是由猪胶原加工纯化制成的双层可吸收胶原膜，具有刺激骨形成的功能，已在临床广泛应用，主要用于种植的同时应用骨再生术，拔牙后即刻种植体周围的骨增加术、拔牙后延期种植体周围的骨增加术、骨裂损处引导性骨再生术、局部牙槽嵴增高术(为延迟种植)、牙槽嵴扩展术(为修复治疗)、根切除术，囊肿切除术及残根拔除术后的骨缺损充填、牙周骨缺损。

[0053] 本发明中的所用全氟三乙胺是全氟化合物的一种，化学性能稳定，且无毒、无色、无味，不溶于水，仅有较低的脂溶性。其具有高密度、高蒸气压、高沸点和低粘度、低表面张力等理化特性，更重要的是其具有良好的气体溶解度，对氧的溶解度约为水的20倍，是全血的2～3倍，对二氧化碳的溶解度是水的3倍，这些特点使其成为良好的氧气的运载介质，可以在缺氧环境下促进细胞的存活和增殖。最早被用于血液代用品。将牙周膜干细胞与全氟三乙胺乳液混合培养，在缺氧环境下(0.5％O2,5％CO2,37℃)环境下，与不含全氟三乙胺的乳液相比，含全氟三乙胺的乳液中牙周膜干细胞存活率显著提高，并且向成骨及成纤维方向分化增强。

[0054] 本发明中的所用的牙周膜干细胞可分化为牙周组织，提高了本生物膜促进牙周组织再生的效率。

[0055] 本发明制备的生物膜材料的应用：

[0056] 该生物膜主要用于牙周组织再生，将本发明的引导牙周组织再生生物膜植入牙周病损部位，可形成新的具有原来特殊功能和形态的牙周组织，达到修复创伤和重建功能的效果。进行引导牙周组织再生术的过程中，牙周膜干细胞可分化为牙周组织，提高了本生物膜促进牙周组织再生的效率。

[0057] 分别应用本发明的全氟三乙胺乳液与牙周膜干细胞复合的牙周组织再生生物膜(再生膜)、Bio-Gide胶原膜来修复大鼠下颌第一磨牙颊侧牙周膜缺损，21天后检测再生骨2
组织面积(mm)。发现本发明的再生膜可显著促进牙周组织愈合，该组再生骨组织面积显著高于Bio-Gide胶原膜及空白对照组，具体结果见图2。

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一种引导牙周组织再生术生物膜及其制备方法和应用

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