技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，尤其涉及一种通过花药培养途径高效脱除百合病毒的食用百合的花药培养脱毒方法。
背景技术
[0002] 百合是单子叶
植物亚纲百合科百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）的所有种类的总称，根据用途可分为药用百合、食用百合和观赏用百合（观赏百合）。据《中华人民共和国药典》（2005年版一部）规定，百合科植物卷丹（Lilium lancifolium. Thunb.）、百合（Lilium brownii F.E. Brownii var. viridulum Baker.）、细叶百合（Lilium pumilum DC.）的干燥肉质鳞叶为药用百合。而我国食用百合的主要品种有甘肃兰州百合、湖南邵阳百合、江苏宜兴百合，以兰州百合品质最好，在生产栽培、花卉市场常见的观赏用百合则有3大品种群，分别是庸香百合杂种系、亚洲百合杂种系和东方百合杂种系。
[0003] 食用百合是野生百合经过多年的良种驯化、品种筛选、以及人工栽培后，可供食用的、安全无毒的食品。我国自古就有食用百合的习惯。宋代林洪在《山家清供》中提到百合食用方法“春秋仲月采百合根暴干，捣筛和面作汤饼，最益气血，又蒸熟可以佐酒”。明代《花疏》中记有“百合宜兴最多，人取其根馈客”。明代中叶编纂的《平凉县志》中记载“蔬则百合山药最佳”。《本草纲目》中有“百合新者，可蒸可煮，和肉更佳；干者做粉食，最宜人”。明代高濂在《饮馔服食》中收有百合面，即“用百合捣为粉，和面搜为饼，为面食亦可”。
[0004] 迄今，食用百合已成为我国经济价值较高的药食两用植物，具有较好地药用价值和保健功能。百合鳞片含有丰富的
淀粉、
蛋白质、脂肪、糖类、果胶质、维生素、胡萝卜素等，还含有
钙、磷、锌、
铁、硒等13种微量元素和18种
氨基酸，具有润
肺止咳、清心安神、养阴
止血、补脾健胃、清
热解毒等功效。据资料统计，百合包括栽培种和野生种全世界有100多种，产于我国的有39种，其中有10个品种可供食用；而目前栽培面积较大的品种主要有宜兴百合、龙牙百合、兰州百合、川百合四种。
[0005] 百合以有性方式（
种子繁殖）和无性方式进行繁殖，商业上主要以扦插繁殖和分球繁殖等
无性繁殖为主，长期的无性繁殖将会使体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒病，并导致种性退化，食用百合也不例外。病毒病经常对百合生产造成严重危害，其中发生普遍、危害严重的病毒有4种，即百合无病症病毒（LSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、百合 X 病毒（LVX）和郁金香顶裂病毒等4种病毒危害。近年来，随着百合引种数量的增加、种植面积的扩大以及不规范的种球自繁，病毒病已开始在我国各百合种植区发生流行，一般发病率为40%-50%，二代种球的带毒率在90%以上。病毒病对食用百合的危害表现主要有：植株严重矮化，脉明，花叶，畸形，
坏死斑，鳞茎变小，产量下降，种质明显退化，开花少且小，有的甚至盲花，严重时整株枯死，严重制约了我国食用百合的产量和
质量。
[0006] 如何减少和消除病毒病，生产优质无毒种苗，是食用百合种球商品化生产面临的一个重要问题。目前，百合病毒病已成为仅次于
真菌病害的主要病害，由于病毒复制与植物代谢密切相关，而且有些病毒的抗逆性很强，一直没有有效的防治措施，因此，获得无病毒苗成为优质高产食用百合的关键。目前，生产上主要是通
过热处理、组培茎尖脱毒和化学处理等方法进行脱毒。然而，目前的食用百合脱毒方法并不完善，各种脱毒方法均有其不足之处。
热处理是利用病毒和植物对
温度敏感性的差异不同，利用高温对植物进行处理，高温使病毒
钝化，在植物体内很难繁殖，部分植物细胞耐高温
加速细胞分裂和繁殖，从而获得无病毒的新生植物组织部分，再进一步繁殖得到无病毒苗，然而热处理不能脱除所有病毒，且影响百合存活率；茎尖培养脱毒是利用病毒在植物体内分布不均匀，在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒，因此，采用茎尖离体培养的方法可以脱除病毒，其缺点是植物的存活率很低；化学处理法是将抗病毒药剂注射进植物体内或者加入培养基中，以达到除去病毒的目的，一般要与茎尖组织培养相结合应用，可一定程度的提高茎尖脱毒效率和存活率。
[0007] 花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分
化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株的一种技术，花药培养主要用途为培育单倍体植株，然而，由于小孢子基本不携带病毒，通过花药培养培育的植株几乎能达到完全脱毒的目的，因此，若将离体的食用百合花药培育成单倍体植株，进而选择食用百合的单倍体植株加倍的正常植株来育苗，可以较好的达到食用百合脱毒的目的。
[0008] 然而，现有的食用百合花药培养效率较低，远远达不到生产的要求，主要在于百合花药诱导效率过低。培养基是花药培养的物质
基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。筛选和优化培养基组分，提高培养基的诱导率，是提高花药培养
力的有效措施。
[0009] 通过大量食用百合花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些提高花药诱导力的添加物并组合其种类搭配及浓度，摸索出了一种高效率地诱导食用百合花药诱导培养的培养基配方，达到了通过食用百合花药培养进行脱毒的产业化应用效率。我们的研究结果对于食用百合的脱毒技术的进步具有较大的意义。
发明内容
[0010] 本发明的目的是针对
现有技术存在的
缺陷，提供了一种通过花药培养途径高效脱除百合病毒的食用百合的花药培养脱毒方法。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
[0012] 一种食用百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤如下：
[0013] （1）配制食用百合花药诱导培养基
[0014] 食用百合花药诱导培养基按每升蒸馏
水中由以下物质配制而成：
[0015] 大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；
[0016] 微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；
[0017] 铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；
[0018] 有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L；
[0019]
激素：2，4-D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；
[0020]
凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；
[0021] 活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，
水解蛋白 0.8～1.0g/L，
活性炭 0.35～0.45g/L；
[0023] 将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60-80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至
沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8-6.0，然后将培养基分装于500ml的三
角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压
蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
[0024] （2）接种花药的选材
[0025] 在食用百合正常现蕾开花季节，上午取材，用
冰壶带回实验室；
[0026] （3）花药消毒与接种
[0027] 将花蕾用
自来水冲洗10～20min，在超净
工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；
[0028] （4）花药诱导培养
[0029] 将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，50-65d后诱导出花药胚性愈伤；
[0030] （5）胚性愈伤分化与继代培养
[0031] 无菌条件下将诱导成功的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25-40天至小芽长至0.6cm以上，将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上继代培养，2-3个月后即可得到直径 0.8-2.0cm 的百合小鳞茎；
[0032] （6）食用百合鳞茎的炼苗与移栽
[0033] 将食用百合小鳞茎的三角瓶
封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入
温室内，定期喷施百合壮苗
营养液来壮苗；
[0034] （7）食用百合单倍体植株的剔除
[0035] 采用根尖压片法观察所得食用百合植株的倍性，剔除仅含12条
染色体的百合单倍体植株。
[0036] 所述的食用百合品种选为龙牙百合或川百合。
[0037] 所述步骤（1）的食用百合花药诱导培养基的最佳配方为：
[0038] 按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
[0039] 大量元素：KNO3 2600mg/L，NH4NO3 1700mg/L，KH2PO4 460mg/L，MgSO4∙7H2O 370mg/L，CaCl2∙2H2O 840mg/L；
[0040] 微量元素：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.25mg/L，KI 0.825mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L；
[0041] 铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 37.5mg/L，FeSO4∙7H2O 27.5mg/L；
[0042] 有机成分：肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丝氨酸 0.8mg/L；
[0043] 激素：2，4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L；
[0044] 凝固剂：植物凝胶 6.25g/L；
[0045] 活性添加剂：椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白 0.9g/L，活性炭 0.4g/L；
[0046] 碳源：蔗糖60g/L。
[0047] 所述步骤（2）中的筛选百合花蕾的标准为：按照花蕾长度为22～28mm、花蕾内花药中的小孢子大都处于单核期的标准选择花蕾。
[0048] 所述步骤（4）中花药诱导培养的培养条件控制为：
温度控制为24℃-27℃，湿度控制为65%-80%，黑暗条件。
[0049] 所述步骤（5）中分化培养的培养基配方为：MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA；培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗。
[0050] 所述步骤（5）中继代培养的培养基配方为：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA；培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗。
[0051] 所述步骤（6）中百合壮苗营养液的配方为：KH2PO4 0.3g/L，CaSO4 0.1g/L，MgSO4∙7H2O 0.1g/L，ZnSO4∙7H2O 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 0.6mg/L，CuSO4 0.1mg/L，MnSO4∙4H2O
0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L；将以上个成分定量充分溶解在纯净水里即成营养液；
[0052] 所述的百合壮苗营养液的用法为：百合鳞茎移栽时浇一次，以后每7-10天浇一次，每次用量为50-80ml/株百合。
[0053] 所述步骤（7）中食用百合单倍体植株的剔除在生产上的标准可以简化为：移栽后的食用百合生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后30%的植株剔除。
[0054] 本发明相比现有技术有如下优点：
[0055] 本发明通过优化食用百合花药培养途径的培养基配方，摸索出了一种高效率地诱导食用百合花药诱导培养的培养基，使得食用百合的花培效率达到了通过食用百合花药培养进行脱毒生产脱毒植株的产业化应用要求。
[0056] 由于食用百合花药中的花粉基本不携带病毒，通过花药培养培育的食用百合花粉植株几乎能达到完全脱毒的目的，我们将花粉植株进行百合病毒检测也发现，该脱毒方法几乎达到100%脱毒，大大提高了食用百合种质，获得了产量和品质均得到极大提升的食用百合脱毒株。
具体实施方式
[0057] 下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。
[0059] 2012年7月，选择大田栽培的食用百合品种龙牙百合和川百合的花药分别进行花培诱导脱毒，其详细步骤如下：
[0060] （1）配制食用百合花药诱导培养基
[0061] 按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
[0062] 大量元素：KNO3 2600mg/L，NH4NO3 1700mg/L，KH2PO4 460mg/L，MgSO4∙7H2O 370mg/L，CaCl2∙2H2O 840mg/L；
[0063] 微量元素：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.25mg/L，KI 0.825mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L；
[0064] 铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 37.5mg/L，FeSO4∙7H2O 27.5mg/L；
[0065] 有机成分：肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丝氨酸 0.8mg/L；
[0066] 激素：2，4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L；
[0067] 凝固剂：植物凝胶 6.25g/L；
[0068] 活性添加剂：椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白 0.9g/L，活性炭 0.4g/L；
[0069] 碳源：蔗糖60g/L；
[0070] 将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至70℃左右，然后加入碳源、植物凝胶和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.9，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固即得；
[0071] （2）接种花药的选材
[0072] 在龙牙百合和川百合正常现蕾开花季节，上午取材，按照花蕾长度为22～28mm、花蕾内花药中的小孢子大都处于单核期的标准选择花蕾，分别用冰壶带回实验室；
[0073] （3）花药消毒与接种
[0074] 将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；
[0075] （4）花药诱导培养
[0076] 将接种龙牙百合和川百合花药后的培养基分别进行花药诱导培养，培养室
环境控制为：温度24℃-27℃，湿度65%-80%，黑暗条件；花药诱导培养50-65d后，龙牙百合和川百合均诱导出幼嫩黄白、松散状的花药胚性愈伤，统计龙牙百合和川百合愈伤组织诱导率，分别达到了21.8%和15.4%；
[0077] （5）胚性愈伤分化与继代培养
[0078] 无菌条件下将诱导成功的龙牙百合和川百合的胚性愈伤组织转接到分化培养基上（分化培养基配方为：MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA），光照条件下（培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗）分化培养25-40天至小芽长至0.6cm以上，此时统计愈伤组织分化率，龙牙百合和川百合愈伤组织分化率分别为77.8%和82.0%；将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上（继代培养基配方为：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA）继代培养（培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗），2-3个月后得到直径 0.8-2.0cm 的百合小鳞茎；
[0079] （6）鳞茎的炼苗与移栽
[0080] 将龙牙百合和川百合小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，喷施百合壮苗营养液壮苗（百合壮苗营养液的配方为：KH2PO4 0.3g/L，CaSO4 0.1g/L，MgSO4∙7H2O 0.1g/L，ZnSO4∙7H2O 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 0.6mg/L，CuSO4 0.1mg/L，MnSO4∙4H2O 0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L；将以上个成分定量充分溶解在纯净水里即成营养液），百合壮苗营养液的施用用法为：百合鳞茎移栽时浇一次，以后每7-10天浇一次，每次用量为50-80ml/株百合；
[0081] （7）单倍体植株的剔除
[0082] 采用根尖压片法观察所得龙牙百合和川百合植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植株；统计龙牙百合和川百合单倍体植株的比例，分别为26.5%和23.7%，且龙牙百合和川百合单倍体植株在各自的花培群体中均表现为最矮，生长至现蕾期时差异尤为明显，因此，在生产上剔除百合单倍体植株的标准可以简化为：移栽后的香水百合生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后约30%的植株剔除。
[0083] 实施例2
[0084] 2013年，采用目前常用的茎尖分生组织培养结合热处理和茎尖培养结合病毒唑化学处理的两种常规百合脱毒方法对百合品种龙牙百合和川百合进行脱毒处理，分别获得龙牙百合和川百合脱毒苗，将实施例1采用本发明的技术路线获得的龙牙百合和川百合脱毒苗冷冻株，一起检测侵染百合的3种主要病毒：黄瓜花叶病毒（CMV）、百合无症病毒（LSV）和百合斑驳病毒（LMoV），比较本发明的技术路线与常规脱毒方法对百合常见病毒的脱毒效果差异。鉴定方法采用多重RT-PCR技术（参照陈进等《百合三种主要病毒的RT-PCR检测及脱毒技术研究》），三种脱毒方法对龙牙百合和川百合三种病毒的脱毒效果如表1。
[0085]
[0086] 分别将三种脱毒方法获得的龙牙百合和川百合脱毒小鳞茎进行大田栽培，9月中旬栽培，2014年秋季
收获种球，称重，统计种球重量，统计数据如下表2。
[0087]
[0088] 由表1可以发现，本发明的食用百合的花药培养脱毒方法基本可以达到完全脱毒的效果，相比目前常规的百合脱毒方法，脱毒效果有了极大的进步。由表2可以发现，本发明的食用百合的花药培养脱毒方法获得的脱毒苗收获的种球较常规的百合脱毒方法对百合的种球提升更显著，对百合种性复壮效果更明显，而且本发明的百合花药培养操作技术较常规茎尖培养操作技术要求低，因而更便于产业化实施。因此，本发明对食用百合的脱毒需求具有巨大的进步和极大的产业化价值。
[0089] 上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
