一种兔牙槽骨缺损模型的制备及应用
阅读：727发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种兔牙槽骨缺损模型的制备及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种构建兔 牙槽骨 缺损动物模型的制备方法及应用，利用无牙区制备非穿通性骨质缺损，价格相对低廉，其牙槽骨与人牙槽骨较为接近，用于制备动物牙槽骨模型具有较好的经济性和实用性。本发明建立了一种标记点清晰，边界规整、重复性好、可量化的标准化颌骨缺损模型。造模成功率高，操作简单且易于重复，可以有效地对材料的促成骨性能进行评价，进而为各类骨移植材料的筛选和评价提供可靠的影像学和 组织学 证据，应用范围广泛。，下面是一种兔牙槽骨缺损模型的制备及应用专利的具体信息内容。
1.一种构建兔牙槽骨缺损动物模型的制备方法，其特征在于，包括：
(1)对新西兰大白兔进行称重和麻醉处理；
(2)将所述新西兰兔侧卧位固定，并在所述兔进行备皮、消毒处理；
(3)颏孔区局麻后，暴露下颌无牙区，从口外垂直骨面切开，钝性分离软组织，暴露术野并剥离骨膜；
(4)利用牙周探针及球钻定位，生理盐水冷却下裂钻制备箱状缺损，以此获得兔牙槽骨缺损模型。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述新西兰大白兔的体重为
2.5-3.0kg。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述麻醉处理为：对所述兔按照3mg/kg的剂量耳缘静脉注射1％戊巴比妥钠；采用2％利多卡因对颏孔区行局麻。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述备皮处理的范围为下颌区至咬肌区。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述从口外垂直骨面切开的切口的长度为1.5cm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述箱状缺损的体积为10mm长x3mm宽x 4mm深。
7.一种利用权利要求1制备的模型评价骨移植材料的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)在获得的兔牙槽骨缺损模型的缺损处植入待测骨移植材料；
(2)缺损口用无菌骨蜡封闭，肌肉复位，间断性缝合皮肤，关闭创口；
(3)术后常规抗感染治疗及喂养；
(4)设定时间点行MicroCT颌骨扫描以及X线片影像；
(5)取下颌骨缺损样本，进行组织学染色和免疫组织化学染色，考察缺损区新骨形成量、植入材料残余率及材料与骨组织间的界面形态，同时观察炎症细胞、成骨细胞、新生胶原及血管形成情况。
一种兔牙槽骨缺损模型的制备及应用
技术领域
[0002] 颅颌面外伤、肿瘤、炎症等多种因素可导致牙槽骨缺损，进而出现牙齿松动脱落，影响患者正常口腔功能的发挥，已成为最常见的临床难题之一。随着国人生活水平及医疗意识的提高，越来越多患者寻求牙槽骨缺损修复治疗，以稳固天然牙、容纳种植体、利于义齿修复，恢复牙列功能及面部形态。研发理想的骨移植材料和实现牙槽骨再生日益成为口腔医学研究的热点和难点。对于各类新型骨移植材料，动物实验是其应用于临床的必经之路。然而，目前尚缺乏规范化的动物模型用于市场上大量涌现的新型骨移植材料的疗效评价。近年来对骨再生的修复研究已有众多相关动物模型，如颅骨缺损模型、股骨缺损模型、桡骨缺损模型、胫骨缺损模型等。然而，颌骨组织学来源特殊，其他部位的骨缺损模型无法充分模拟颌骨的再生情况。因此，发明适用于牙槽骨缺损的动物模型尤为重要。目前国内关于建立局部牙槽骨缺损动物模型的研究较少，各学者研究时采用的动物种类，以及制备的缺损部位、大小等具体方法各不相同，缺乏统一标准。其中，猴、猩猩、羊、犬、猪等大型动物存在价格高昂，饲养管理难度较大的问题，难以推广造模；小型动物如大鼠因口腔狭小不利操作，造模过程中易发生骨折、窒息乃至死亡，造模成功率低。而成年新西兰大白兔性格温顺，抗感染能力较强，个体适中便于钻孔造模、放置骨修复材料及后期成骨效应研究。根据文献报道，兔上颌骨腭弓弧度较大，黏骨膜较厚且受限于张口度，不宜制作骨缺损。而采用兔下颌骨作为缺损模型时，国内外学者往往选择下颌升支或下颌支的磨牙区。前者在组织学上无法有效模仿牙槽骨缺损，且下颌升支骨壁薄，植骨材料不易固定；后者制备极限缺损时极易损伤牙根，影响动物的咀嚼功能，不利于模拟正常咀嚼下牙槽骨的重建机制。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种兔牙槽骨缺损模型的制备方法，是一种适用于观察临床牙槽骨缺损再生情况的动物模型的制备方法。
[0005] 本发明提供的一种兔牙槽骨缺损模型的制备方法，通过以下步骤实现：
[0006] (1)对新西兰大白兔进行称重和麻醉处理；
[0007] (2)将所述新西兰兔侧卧位固定，并在所述兔进行备皮、消毒处理；
[0008] (3)颏孔区局麻后，于下颌无牙区，距下颌骨下缘2mm处，垂直牙槽骨面做口外平行切口，逐层钝性分离软组织，暴露术野并剥离骨膜；
[0009] (4)利用牙周探针及球钻定位，生理盐水冷却下裂钻制备箱状缺损，从而获得兔牙槽骨缺损模型。
[0010] 所述新西兰大白兔的体重为2.5-3.0kg，雌雄不限。
[0011] 所述麻醉处理包括：对所述新西兰大白兔按照3mg/kg的剂量以1％戊巴比妥钠进行耳缘静脉注射；沿颏孔方向以2％利多卡因行局麻。
[0012] 所述备皮处理的范围为颌下区至咬肌区。
[0013] 所述切口的长度为1.5cm。
[0014] 所述缺损的体积为10mm长x 3mm宽x 4mm深。
[0015] 本发明的另一个目的是提供所述的兔牙槽骨缺损模型用于评价骨移植材料的方法，通过以下步骤实现：
[0016] (1)在获得的兔牙槽骨缺损模型的缺损处植入待测骨移植材料；
[0017] (2)缺损口用无菌骨蜡封闭，肌肉复位，间断性缝合皮肤，关闭创口；
[0018] (3)术后常规抗感染治疗及喂养；
[0019] (4)于术后设定时间点行影像学评价及组织病理学分析。
[0020] 此外，根据本发明上述方法的构建兔牙槽骨缺损模型的方法还可以具有如下附加的技术特征。
[0021] 所述术后抗感染方法为连续7天肌注青霉素，每天30万单位。
[0022] 上述步骤(4)影像学评价方法包括：于术后设定的时间点对样本行MicroCT扫描以及X线片影像。
[0023] 上述步骤(4)组织病理学分析评价包括:对样本行HE及Masson染色，观察各组新生胶原数量及成熟度、新生血管数目、炎症细胞、成骨细胞和材料与组织间界面形成情况，与对照组进行比较；对样本行免疫组化染色：对组织中表达的成骨标志物I型胶原(collagen-I)及骨钙素(osteocalcin,OCN)行染色后，使用Image-J软件对每组3个视野中的标志物阳性区域进行计算，即阳性表达率％＝阳性表达面积/视野面积％，与对照组比较，并进行两两组间差异性分析。
[0024] 通过采用上述构建兔牙槽骨缺损模型的方法，所获得的动物模型可以有效地对多种骨移植材料进行测试评价，从而对材料产品的促成骨性能进行评价，对骨移植材料产品的研发提供指导。
[0025] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：提供的一种兔牙槽骨缺损模型是在兔下颌无牙区制备非穿通性骨质缺损，兔性格温顺，价格相对低廉，其牙槽骨与人牙槽骨较为接近，用于制备动物牙槽骨模型具有较好的经济性和实用性。本发明建立了一种标记点清晰，边界规整、重复性好、可量化的标准化颌骨缺损模型。造模成功率高，操作简单且易于重复；缺损区底部不与软组织相通，临近有牙区，能更好的模拟临床骨缺损的再生修复情况；并且缺损制备创伤小，不穿通牙髓，不需切断咬肌、不损伤面神经、颏神经、腮腺导管等，减少术后不适、进食困难，有利于实验动物的恢复及再生情况的观察。通过实验观察，本发明的颌骨缺损动物模型缺损8周时，缺损未完全愈合，能满足颌骨再生的研究的需求同时，能够为促进牙槽骨缺损修复的植骨材料的研发和评价提供动物模型和检测指标，可用于牙周病学、颌面外科学、正畸学等口腔各领域的相关研究，应用前景良好。利用该模型可有效地对骨移植材料进行评估，进而为骨移植材料的筛选和评价提供可靠依据。
附图说明
附图说明
[0026] 图1是本发明牙槽骨缺损动物模型的模式图。
[0027] 图2是本发明牙槽骨缺损动物模型的构建方法的分布示意图。
[0028] 图3是本发明牙槽骨缺损动物模型造模后的效果测试图(造模后8月Micro CT图)。
[0029] 图4是本发明的牙槽骨缺损动物模型用于骨移植材料评价的X线示意图。
[0030] 图5是本发明的牙槽骨缺损动物模型用于骨移植材料评价的HE染色图。图中字母表示Si:硅(材料B\C\D其中一种成分)；P:磷酸三钙(材料B\C\D其中一种成分；P/Si:材料B；B:材料A；N:新生骨；F:纤维组织；V:血管；a1、a 2:两周材料A组；a3、a4:四周材料A组；a5、a6:八周材料A组；a7、a8:十六周材料A组，B\C\D材料以此类推。
[0031] 图6是本发明的牙槽骨缺损动物模型用于骨移植材料评价的Masson染色图。图中字母表示Si:硅(材料B\C\D其中一种成分)；P:磷酸三钙(材料B\C\D其中一种成分)；P/Si:材料B；B:材料A；N:新生骨；F:纤维组织；V:血管。
[0032] 图7是本发明的牙槽骨缺损动物模型用于骨移植材料评价的免疫组化染色图。图中字母表示Si:硅(材料B\C\D其中一种成分)；P:磷酸三钙(材料B\C\D其中一种成分)；P/Si:材料B；B:材料A；N:新生骨；F:纤维组织；V:血管；Col-I：成骨相关标志物I型胶原；OCN：骨钙素。
具体实施方式
[0033] 本发明结合附图和具体实施例作进一步的详细说明。
[0034] 实施例1一种兔牙槽骨缺损模型的制备方法
[0035] 参见图1，一种兔牙槽骨缺损模型通过的制备方法，通过以下步骤实现：
[0036] (1)对体重为2.5-3.0kg新西兰大白兔进行称重和麻醉处理，雌雄不限；所述麻醉处理包括：对所述新西兰大白兔按照3mg/kg的剂量以1％戊巴比妥钠进行耳缘静脉注射；沿颏孔方向以2％利多卡因行局麻。
[0037] (2)将所述新西兰兔侧卧位固定，并在所述兔进行备皮、消毒处理；备皮处理的范围为颌下区至咬肌区；
[0038] (3)颏孔区局麻后，于下颌无牙区，距下颌骨下缘2mm处，垂直牙槽骨面做口外平行切口，切口的长度为1.5cm，逐层钝性分离软组织，暴露术野并剥离骨膜；
[0039] (4)利用牙周探针及球钻定位，生理盐水冷却下裂钻制备箱状缺损，从而获得兔牙槽骨缺损模型(图1)，图中1代表箱状缺损，缺损的体积为10mm长x 3mm宽x 4mm深。
[0040] 实施例2
[0041] (一)动物
[0042] 新西兰大白兔，8月，2.5-3.0kg，雌雄不限。
[0043] (二)器械和材料
[0045] (三)方法
[0046] 1.术前禁饲：动物术前24h禁饲不禁水。
[0047] 2.动物称重后固定于兔架。
[0048] 3.麻醉：耳缘静脉注射1％戊巴比妥钠，以3mg/kg的剂量进行注射。
[0049] 4.备皮：切实麻醉后，口内以及口周剃毛，洁后用聚维酮碘消毒。
[0051] 6.制备(见图2)
[0052] (1)距下颌骨下缘上方2mm处，平行于下颌骨下缘做切口，长度约15mm，钝性分离至骨面，遇可见大血管需结扎止血，防止出血量较大而影响实验。暴露牙槽骨，剥离骨膜，注意游离并保护颏神经及颏孔。
[0053] (2)距颏孔前1-2mm处为远中点，以牙周探针测10mm处为近中点，连通近、远中两点为中线，中线颊舌侧各扩展1.5mm作为边界线。使用牙科慢机、球钻和裂钻在生理盐水冲洗下，制备长为10mm、宽为3mm、深为4mm的箱状缺损。在磨孔过程中注意保护颏神经及牙根，防止局部过热而致组织坏死，注入生理盐水降温，清除骨碎。
[0054] (3)无菌骨蜡形成契合洞型的形态封闭洞口后肌肉复位，间断性缝合，缝合皮肤，关闭创口。
[0055] (4)所有动物麻醉清醒吼单笼饲养，笼内自由活动，统一标准饲养，术后7天内每日肌注青霉素30万IU，记录动物临床表现。
[0056] 7.兔牙槽骨缺损模型的效果测试
[0057] (1)大体情况：观察动物基本情况，包括局部区域肿胀及进食、活动情况；
[0058] (2)影像学检查：按照80KV，80mA条件进行microCT扫描及三维重建，精确测量缺损区新骨形成体积及残余植入材料体积(见图3)。
[0059] 结果显示，本发明的动物模型术后进食、活动自如，在8周内未发生自发性的完全骨愈合，可用于研究骨修复材料植入后促成骨修复的能力。
[0060] 8.兔牙槽骨缺损模型对骨缺损填充材料产品的性能评价
[0061] 取步骤1)造模的动物随机分为模型组A、模型组B、模型组C和模型组D。按步骤6进行造模并植入相应的骨填充材料(A、B、C、D)。术后于相应时间点(2周、4周、8周、16周)处死取材，行影像学检查、组织病理学检查等进行骨修复作用评价。
[0062] (1)影像学检查：于术后2周、4周、8周和16周处死取材，行X线检查；
[0063] (2)组织病理学检查：于术后相应时间点处死取材，4％多聚甲醛固定48小时、10％EDTA中脱钙2周、乙醇梯度脱水、石蜡包埋切片(纵切厚度5-7um)，HE染色(见图5)、Masson染色(见图6)观察炎症细胞、成骨细胞；于术后第8周和16周行免疫组化分析观察新生胶原及血管形成情况。(见图7)
[0064] X线显示D组新骨生成率最高，各微球植入组的缺损区材料残余率均低于对照组A组(p<0.05)；HE、Masson及免疫组化染色提示：术后8周、16周，D组较其它组骨小梁结构最为成熟，其残余材料形成核层降解、壳层保留的“中空”结构，合并新生骨组织长入，成骨相关标志物I型胶原和骨钙素表达最为显著。
[0065] 以上实施例说明，本发明的动物模型适用于观察临床牙槽骨缺损再生情况，利用该模型可有效地对骨移植材料的促成骨作用进行评估，进而为骨移植材料的研发和筛选提供可靠依据。本发明的牙槽骨缺损动物模型的缺损选区于新西兰大白兔的下颌无牙区域，牙槽骨较宽、骨质致密，与人牙槽骨较为接近。缺损底部不穿通，不与软组织相通，余留骨壁多，临近有牙区，有效模拟临床非穿通性牙槽骨缺损，可用于研究牙周炎骨缺损修复再生、种植体周围骨修复、正畸骨质重建等。本发明的另一优点是，本发明的模型适用于骨替代材料的研发。制备的缺损长度10mm、宽度3mm、深度4mm的箱装缺损，克服传统缺损模型深度不足的问题，在不损伤牙根的情况下有足够固位型，使得分散性颗粒型、球型骨移植材料得以填充固位，适用于对磷酸三钙、羟基磷灰石、生物陶瓷、bio-oss等骨移植材料的研究。本发明的第三个优点是，本发明的模型的缺损选区于兔下颌无牙区，骨质较厚，制备足够的深度也不损伤牙根，不穿通牙髓，减少混杂因素，本发明的动物模型更有利于研究牙槽骨骨缺损再生情况。本发明的第四个优点是，本发明模型的标记点清晰，边界规整、重复性好，本发明的模型属于可量化的标准化颌骨缺损模型。本发明的第五个优点是，本发明的模型动物创伤小，此模型切口小，不损伤咬肌、不分离深层肌肉，不损伤腮腺导管、面神经，不损伤牙根等，减少术后不适，有利于实验动物的恢复及对再生情况的观察。
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