保绿是用于描述植物表型的术语，例如，从而与标准参照相比， 延迟了叶子衰老(通过与叶绿素降解有关的叶子的黄化，可以最容易 地区分)。参见，Thomas H和Howarth CJ(2000)“Five ways to stay green” Journal of Experimental Botany 51：329-337。在高粱中， 已经鉴别出了几个保绿基因型，它们能在籽粒灌浆和成熟的过程中， 表现出叶子衰老的延迟。参见，Duncan RR，等(1981)“Descriptive comparison of senescent and non-senescent sorghum genotypes.” Agronomy Journal 73：849-853。而且，在有限水可用性的条件下， 这通常会加速叶子衰老(参见，例如，Rosenow DT和Clark LE(1981) Drought tolerance in sorghum.In：Loden HD，Wilkinson D，编 Proceedings of the 36th annual corn and sorghum industry research conference，18-31)，这些基因型能保持更多的绿叶区域， 且通常能继续灌浆籽粒(参见，例如，McBee GG，Waskom RM，Miller FR，Creelman RA(1983)Effect of senescence and non-senescence on carbohydrates in sorghum during late kernel maturity states. Crop Science 23：372-377；Rosenow DT，Quisenberry JE，Wendt CW，Clark LE(1983)Drought-tolerant sorghum and cotton germplasm. Agricultural Water Management 7：207-222；和 Borrell AK，Douglas ACL(1996)Maintaining green leaf area in grain sorghum increases yield in a water-limited environment. In：Foale MA，Henzell RG，Kneipp JF，编 Proceedings of the third Australian sorghum conference.Melbourne：Australian Institute of Agricultural Science，occasional Publication No. 93)。保绿表型还已经用作开发改良的玉米品种的选择标准，尤其是 关于耐旱性的开发。参见，例如，Russell WA(1991)Genetic improvement of maize yields. Advances in Agronomy 46：245- 298；和Bruce等(2002)，“Molecular and physiological approaches to maize improvement for drought tolerance” Journal of Experimental Botany，53(366)：13-25。
已经描述了5种根本不同的保绿类型，它们是类型A、B、C、D 和E(参见例如，Thomas H，Smart CM(1993)Crops that stay green. Annals of Applied Biology 123：193-219；和，Thomas和Howarth， 同上)。在类型A保绿中，延迟了衰老程序的启动，但是然后以正常 的速度进行。在类型B保绿中，尽管衰老程序的启动没有变化，但进 展相对更慢。在类型C保绿中，尽管以正常的速度进行衰老(如通过 测量生理功能所确定的，例如光合能力)，但仍然能保持叶绿素。类 型D保绿是更人工的，因为杀死叶子(即通过冷冻、煮沸或干燥)能阻 止衰老程序的启动，从而终止叶绿素的降解。在类型E保绿中，叶绿 素的起始水平更高，而叶子衰老的启动和进展没有变化，由此给出了 相对更低的进展速度的假象。类型A和B是功能性保绿的，因为光合 能力随着叶绿素含量而维持，并且它们是与高粱的高产量和耐旱性相 关的类型。尽管有该性状的潜在重要性，尤其是与高产量和耐旱性相 关的利益，但在理解遗传决定的保绿的生物化学的、生理的或分子的 基础方面，几乎没有取得进展(Thomas和Howarth，同上)。
本发明解决了这些和其他的问题。本发明涉及与植物的保绿潜力 表型有关的ACC合酶基因的鉴别和保绿潜力和/或乙烯生产的调节。 在阅读了下面的材料以后，会明白由这些基因编码的多肽、调节植物 的保绿潜力的方法、抑制植物的乙烯生产的方法、调节植物的不育性 的方法、和敲除的植物细胞和植物、以及其他的特征。
发明概述
本发明提供了调节保绿潜力和植物的不育性和调节(例如，抑制) 植物的乙烯合成和/或生产的方法和组合物。本发明还涉及植物的ACC 合酶核酸序列，示例例如，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10， 和一组多肽序列，例如，SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11， 它们可以调节这些活性。
在第一方面，本发明提供了分离的或重组的敲除的植物细胞，其 包含至少一个内源的ACC合酶基因中的至少一个破坏(例如，核酸序 列或其互补序列，其与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6) 或SEQ ID NO：3(gACS7)具有例如至少约70％、至少约75％、至少约 80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％ 或更高的序列同一性。与缺少该破坏的对应的对照植物细胞相比，该 破坏能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在一个实施方案 中，该至少一个内源的ACC合酶基因包含2个或更多个内源的ACC 合酶基因(例如，ACS2、ACS6和ACS7中的任意2个或更多个，例如， ACS2和ACS6)。类似地，在另一个实施方案中，该至少一个内源的 ACC合酶基因包含3个或更多个内源的ACC合酶基因。在某些实施方 案中，与对照植物细胞相比，该破坏会造成敲除的植物细胞减少乙烯 生产。
在一个实施方案中，通过将至少一个包含ACC合酶核酸序列或其 子序列的多核苷酸序列导入植物细胞中，从而使至少一个多核苷酸序 列以有义或反义方向连接到启动子上，且其中至少一个多核苷酸序列 与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3(gACS7)、 SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cACS7) 或SEQ ID NO：10(CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有例如至少 约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性，产生了敲除的植物 细胞中的至少一个破坏。在另一个实施方案中，通过导入至少一个多 核苷酸序列，其包含为RNA沉默或干扰构建的ACC合酶核酸序列的一 个或多个子序列，将破坏导入植物细胞中。
在另一个实施方案中，破坏包含一个或多个转座子的插入，其中 一个或多个转座子是在至少一个内源的ACC合酶基因中。在另一个实 施方案中，破坏包含在至少一个内源的ACC合酶基因中的一个或多个 点突变。破坏可以是在至少一个ACC合酶基因中的纯合的破坏。或 者，破坏是在至少一个ACC合酶基因中的杂合的破坏。在某些实施方 案中，当包含超过一个ACC合酶基因时，存在超过一个破坏，其可以 包括纯合的破坏、杂合的破坏或纯合的破坏和杂合的破坏的组合。
在某些实施方案中，本发明的植物细胞来自双子叶植物或单子叶 植物。在一个方面，植物细胞是在包含保绿潜力表型的杂合植物中。 在另一个方面，植物细胞是在包含不育表型、例如雄性不育表型的植 物中。从本发明的植物细胞再生的植物，也是本发明的特征。
本发明还提供了包含保绿潜力表型的敲除的植物。例如，本发明 提供了包含保绿潜力表型的敲除的植物，其中保绿潜力表型源自至少 一个内源的ACC合酶基因的破坏。在一个实施方案中，破坏包括一个 或多个转座子，且与对应的对照植物相比，能抑制至少一种ACC合酶 蛋白的表达或活性。在另一个实施方案中，破坏包括内源的ACC合 酶基因中的一个或多个点突变，且与对应的对照植物相比，能抑制至 少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在某些实施方案中，至少一个内 源的ACC合酶基因包含与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6) 或SEQ ID NO：3(gACS7)或其互补序列具有例如至少约70％、至少约 75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、 约99.5％或更高的序列同一性的核酸序列。在某些实施方案中，敲除 的植物是杂种植物。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实 施方案。
在另一个实施方案中，敲除的植物包括包含保绿潜力表型的转基 因植物。例如，本发明的转基因植物包括保绿潜力表型，后者源自至 少一个导入的能抑制乙烯合成的转基因。导入的转基因包括能编码至 少一种ACC合酶或其子序列的核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO：1 (gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3(gACS7)、SEQ ID NO：4 (cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cACS7)或SEQ ID NO：10 (CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有例如至少约70％、至少约 75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、 约99.5％或更高的序列同一性，且其构型能修饰至少一种ACC合酶的 表达或活性水平(例如，有义、反义、RNA沉默或干扰构型)。如果恰 当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
本发明的转基因植物也可以包括保绿潜力表型，后者源自至少一 个导入的能抑制乙烯合成的转基因，其中所述的至少一个导入的转基 因包含能编码至少一种ACC合酶的子序列的核酸序列，该至少一种 ACC合酶与SEQ ID NO：7(pACS2)、SEQ ID NO：8(pACS6)、SEQ ID NO.：9 (pACS7)或SEQ ID NO.：11(pCCRA178R)或其保守变体具有例如至少 约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性。核酸序列一般处于 RNA沉默或干扰构型(或者，例如，有义或反义构型)，且能修饰至少 一种ACC合酶的表达或活性水平。如果恰当，基本上所有的上述特征 也适用于该实施方案。
本发明的植物的保绿潜力包括但不限于，例如，与对应的对照植 物相比，(a)减少至少一种ACC合酶特异性的mRNA的生产；(b)减 少ACC合酶的生产；(c)减少乙烯的生产；(d)延迟叶子衰老；(e)增 强抗旱性；(f)长时间地维持光合活性；(g)增强的蒸腾；(h)增强 的气孔导度；(i)增强的CO2同化作用；(j)增强维持CO2同化作 用；或(k)(a)-(j)的任意组合；等。
本发明的一个方面提供了敲除的或转基因的植物，其包括不育表 型，例如，雄性或雌性不育表型。因而，一类实施方案提供了包含雄 性不育表型(例如，减少的花粉释放)的敲除的植物，其源自至少一 个内源的ACC合酶基因中的至少一个破坏。与对应的对照植物相比， 该破坏能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在一个实施方案 中，与对照植物相比，至少一个破坏会导致敲除的植物减少乙烯生 产。在一个实施方案中，至少一个破坏包括一个或多个转座子，其中 一个或多个转座子是在至少一个内源的ACC合酶基因中的。在另一个 实施方案中，至少一个破坏包含一个或多个点突变，其中一个或多个 点突变是在至少一个内源的ACC合酶基因中的。在另一个实施方案 中，通过导入至少一个多核苷酸序列，其包含为RNA沉默或干扰构建 的ACC合酶核酸序列的一个或多个子序列，将至少一个破坏导入敲除 的植物中。在某些实施方案中，至少一个内源的ACC合酶基因包含与 SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)或SEQ ID NO：3(gACS7) 或其互补序列具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少 约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的序 列同一性的核酸序列。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该 实施方案。
另一类实施方案提供了转基因的敲除的植物，其包含雄性不育表 型，后者源自至少一个导入的能抑制乙烯合成的转基因。至少一个导 入的转基因包含能编码至少一种ACC合酶的核酸序列，该核酸序列与 SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3(gACS7)、 SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cACS7) 或SEQ ID NO：10(CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有至少约85％ 序列同一性，且其构型能修饰至少一种ACC合酶的表达或活性水平 (例如，反义、有义或RNA沉默或干扰构型)。在某些实施方案中，转 基因包括组织-特异性的启动子或诱导型启动子。如果恰当，基本上 所有的上述特征也适用于该实施方案。
多核苷酸也是本发明的一个特征。在某些实施方案中，分离的或 重组的多核苷酸包含选自下述的成员：(a)多核苷酸或其互补序列， 其与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3 (gACS7)、SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6 (cACS7)或SEQ ID NO：10(CCRA178R)或其子序列或其保守变体具有 例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、 至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性；(b)多核 苷酸或其互补序列，其能编码SEQ ID NO：7(pACS2)、SEQ ID NO：8 (pACS6)、SEQ ID NO.：9(pACS7)或SEQ ID NO：11(pCCRA178R)的 多肽序列或其子序列或其保守变体；(c)多核苷酸或其互补序列，其 能在严格条件下与基本上完整长度的包含SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3(gACS7)、SEQ ID NO：4(cACS2)、 SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cACS7)或SEQ ID NO：10(CCRA178R) 的至少100个邻接核苷酸的多核苷酸子序列杂交，或者其能与(a)或 (b)的多核苷酸序列杂交；和，(d)多核苷酸，其与(a)、(b)或(c) 的多核苷酸序列具有至少约85％同一性。在某些实施方案中，当在植 物中表达时，多核苷酸能抑制乙烯生产。
本发明的多核苷酸可以包含或被包含在表达盒或载体中(例如， 病毒载体)。载体或表达盒可以包含可操作地连接到该多核苷酸上的 启动子(例如，组成型的、组织-特异性的或诱导型的启动子)。本发 明的多核苷酸可以以反义方向或有义方向连接到启动子上，被设置用 于RNA沉默或干扰等。
本发明还提供了抑制植物中的乙烯生产的方法(和通过这样的方 法生产的植物)。例如，抑制乙烯生产的方法包含灭活植物中的一个 或多个ACC合酶基因，其中一个或多个ACC合酶基因能编码一种或多 种ACC合酶，其中一种或多种ACC合酶中的至少一种与SEQ ID NO：7 (pACS2)、SEQ ID NO：8(pACS6)、SEQ ID NO：9(pAC7)或SEQ ID NO：11 (pCCRA178R)具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的同一 性。
在一个实施方案中，灭活步骤包含将一个或多个突变导入ACC合 酶基因序列，其中ACC合酶基因序列中的一个或多个突变包含一个或 多个转座子，由此与对应的对照植物相比，灭活一个或多个ACC合酶 基因。在另一个实施方案中，灭活步骤包含将一个或多个突变导入 ACC合酶基因序列，其中ACC合酶基因序列中的一个或多个突变包含 一个或多个点突变，由此与对应的对照植物相比，灭活一个或多个 ACC合酶基因。一个或多个突变可以包含，例如，在一个或多个ACC 合酶基因中的纯合的破坏，在一个或多个ACC合酶基因中的杂合的破 坏，或纯合的破坏和杂合的破坏的组合，如果破坏了超过一个ACC合 酶基因的话。在某些实施方案中，通过有性杂交导入了一个或多个 突变。在某些实施方案中，一个或多个ACC合酶基因中的至少一个与 SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)或SEQ ID NO：3(gAC7) 或其互补序列具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少 约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的同 一性。
在另一个实施方案中，灭活步骤包含：(a)将至少一个多核苷酸 序列导入植物中，其中至少一个多核苷酸序列包含能编码一种或多种 ACC合酶的核酸或其子序列和启动子，该启动子能在植物中起作用， 以生成RNA序列；和，(b)表达至少一个多核苷酸序列，由此与对应 的对照植物(例如，它的非-转基因亲本或相同物种的非-转基因植物) 相比，灭活一个或多个ACC合酶基因。例如，通过多种技术，包括但 不限于电穿孔、微粒轰击、土壤杆菌(Agrobacterium)-介导的转移 等，可以导入至少一个多核苷酸序列。在本发明的某些方面，多核 苷酸以有义方向或反义方向连接在启动子上，或被设置用于RNA沉默 或干扰。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
调节植物的保绿潜力的方法也是本发明的一个特征(通过这样的 方法生产的植物也同样是本发明的一个特征)。例如，调节保绿潜力 的方法包含：a)选择至少一个ACC合酶基因(例如，能编码ACC合酶， 例如SEQ ID NO：7(pACS2)、SEQ ID NO：8(pACS6)、SEQ ID NO：9(pAC7) 或SEQ ID NO：11(pCCRA178R))进行突变，从而提供至少一个需要 的ACC合酶基因；b)将突变形式(例如，至少一个ACC合酶基因或其 子序列的反义或有义构型，至少一个ACC合酶基因或其子序列的RNA 沉默构型，至少一个ACC合酶基因中的杂合突变，至少一个ACC合酶 基因中的纯合突变，或纯合突变和杂合突变的组合，如果选择了超过 一个ACC合酶基因的话，等)的至少一个需要的ACC合酶基因导入植 物；和，c)表达突变形式，从而调节植物的保绿潜力。在一个实施方 案中，选择至少一个ACC合酶基因，包含确定需要的保绿潜力的程度 (例如，弱、中等或强)。在某些实施方案中，通过土壤杆菌-介导的 转移、电穿孔、微粒轰击、有性杂交等，导入突变的基因。如果恰当， 基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
可以定性地(通过检测是否存在一种或多种目标产物)或定量地 (通过监控一种或多种目标产物的表达水平)检测表达产物。在一个实 施方案中，表达产物是RNA表达产物。本发明的方面任选地包括监控 核酸、多肽或化学药品(例如，ACC，乙烯，等)的表达水平，如本文 关于检测植物或植物群体中的ACC合酶、乙烯生产、保绿潜力等所指 出的。
本发明的组合物和方法可以包括许多植物，例如，禾本科 (Poaceae)(禾本科(Gramineae))的植物。禾本科的成员的实例包 括但不限于，Acamptoclados、芨芨草属(Achnatherum)、Achnella、 凤头黍属(Acroceras)、山羊草属(Aegilops)、Aegopgon、Agroelymus、 Agrohordeum、Agropogon、冰草属(Agropyron)、Agrositanion、剪 股颖属(Agrostis)、银须草属(Aira)、Allolepis、毛颖草属 (Alloteropsis)、看麦娘属(Alopecurus)、Amblyopyrum、Ammophila、 Ampelodesmos、Amphibromus、Amphicarpum、Amphilophis、 Anastrophus、Anatherum、须芒草属(Andropogron)、Anemathele、 赖草属(Aneurolepidium)、Anisantha、Anthaenantia、Anthephora、 Anthochloa、黄花茅属(Anthoxanthum)、Apera、水蔗草属(Apluda)、 Archtagrostis、Arctophila、Argillochloa、三芒草属(Aristida)、 燕麦草属(Arrhenatherum)、荩草属(Arthraxon)、Arthrostylidium、 青篱竹属(Arundinaria)、野古草属(Arundinella)、芦竹属(Arundo)、 Aspris、Atheropogon、燕麦属(Avena)、Avenella、Avenochloa、 Avenula、地毯草属(Axonopus)、箣竹属(Bambusa)、Beckmannia、 Blepharidachne、Blepharoneuron、孔颍草属(Bothriochloa)、格兰 马草属(Bouteloua)、臂形草属(Brachiaria)、短颖草属 (Brachyelytrum)、短柄草属(Brachypodium)、凌风草属(Briza)、 Brizopyrum、Bromelica、Bromopsis、雀麦属(Bromus)、野牛草属 (Buchloe)、Bulbilis、拂子茅属(Calamagrostis)、Calamovilfa、 Campulosus、Capriola、沿沟草属(Catabrosa)、Catapodium、 Cathestecum、Cenchropsis、蒺藜草属(Cenchrus)、酸模芒属 (Centotheca)、Ceratochloa、Chaetochloa、Chasmanthium、方竹属 (Chimonobambusa)、Chionochloa、虎尾草属(Chloris)、Chondrosum、 Chrysopon、Chusquea、单蕊草属(Cinna)、Cladoraphis、空轴茅属 (Coelorachis)、薏苡属(Coix)、莎禾属(Coleanthus)、Colpodium、 Coridochloa、Cornucopiae、蒲苇属(Cortaderia)、Corynephorus、 Cottea、Critesion、隐花草属(Crypsis)、Ctenium、Cutandia、 Cylindropyrum、香茅属(Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、洋狗 尾草属(Cynosurus)、Cytrococcum、鸭茅属(Dactylis)、龙爪茅属 (Dactyloctenium)、扁芒草属(Danthonia)、Dasyochloa、Dasyprum、 Davyella、牡竹属(Dendrocalamus)、发草属(Deschampsia)、 Desmazeria、野青茅属(Deyeuxia)、Diarina、龙常草属(Diarrhena)、 二型花属(Dichanthelium)、双花草属(Dichanthium)、Dichelachne、 Diectomus、马唐属(Digitaria)、雁茅属(Dimeria)、Dimorpostachys、 弯穗草属(Dinebra)、双稃草属(Diplachne)、Dissanthelium、 Dissochondrus、Distichlis、镰序竹属(Drepanostachyum)、Dupoa、 Dupontia、稗属(Echinochloa)、Ectosperma、Ehrharta、牛筋草属 (Eleusine)、Elyhordeum、Elyleymus、Elymordeum、披碱草属 (Elymus)、胶鳞禾属(Elyonurus)、Elysitanion、Elytesion、偃 麦草属(Elytrigia)、九顶草属(Enneapogon)、肠须草属(Enteropogon)、 Epicampes、画眉草属(Eragrostis)、蜈蚣草属(Eremochloa)、 Eremopoa、旱麦草属(Eremopyrum)、蔗茅属(Erianthus)、Ericoma、 Erichloa、Eriochrysis、Erioneuron、类蜀黍属(Euchlaena)、 Euclasta、黄金茅属(Eulalia)、拟金茅属(Eulaliopsis)、真穗草 属(Eustachys)、箭竹属(Fargesia)、羊茅属(Festuca)、Festulolium、 Fingerhuthia、Fluminia、耳稃草属(Garnotia)、Gastridium、 Gaudinia、巨竹属(Gigantochloa)、甜茅属(Glyceria)、Graphephorum、 Gymnopogon、Gynerium、球穗草属(Hackelochloa)、Hainardia、 Hakonechloa、Haynaldia、Heleochloa、异燕麦属(Helictotrichon)、 牛鞭草属(Hemarthria)、Hesperochloa、Hesperostipa、黄茅属 (Hateropogon)、Hibanobambusa、茅香属(Hierochloe)、Hilaria、 绒毛草属(Holcus)、Homalocenchrus、大麦属(Hordeum)、Hydrochloa、 膜稃草属(Hymenachne)、苞茅属(Hyparrhenia)、Hypogynium、猬 草属(Hystrix)、距花黍属(Ichnanthus)、白茅属(Imperata)、箬 竹属(Indocalamus)、柳叶箬属(Isachne)、鸭嘴草属(Ischaemum)、 Ixophorus、Koeleria、Korycarpus、兔草属(Lagurus)、Lamarckia、 Lasiacis、假稻属(Leersia)、千金子属(Leptochloa)、 Leptochloopsis、Leptocoryphium、薄稃草属(Leptoloma)、Leptogon、 细穗草属(Leptutus)、Lerchenfeldia、银穗草属(Leucopoa)、 Leymostachys、赖草属(Leymus)、Limnodea、Lithachne、黑麦草属 (Lolium)、Lophochlaena、Lophochloa、Lophopyrum、Ludolfia、 Luziola、Lycurus、Lygeum、Maltea、Manisuris、Megastachya、臭草 属(Malica)、糖蜜草属(Malinis)、Mibora、小草属(Microchloa)、 Microlaena、莠竹属(Microstegium)、栗草属(Malium)、芒属 (Miscanthus)、毛俭草属(Mnesithea)、Molinia、Monan thochloe、 Monerma、Monroa、乱子草属(Muhlenbergia)、Nardus、NaSSella、 Nazia、Neeragrostis、Neoschischkinia、Neostapfia、类芦属 (Neyraudia)、Nothoholcus、Olyra、Opizia、求米草属(Oplismenus)、 Orcuttia、稻属(Oryza)、落芒草属(Oryzopsis)、Otatea、滇竹属 (Oxytenanthera)、Panicularia、黍属(Panicum)、Pappophorum、 假牛鞭草属(Parapholis)、Pascopyrum、类雀稗属(Paspalidium)、 雀稗属(Paaspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、虉草属(Phalaris)、 Phalaroides、Phanopyrum、PharuS、Phippsia、梯牧草属(Paleum)、 Pholiurus、芦苇属(Phragmites)、刚竹属(Phyllostachys)、 PIptatherum、PIptochaetium、大明竹属(Pleioblastus)、Pleopogon、 Pleuraphis、Pleuropogon、早熟禾属(Poa)、Podagrostis、棒头草 属(Polypogon)、单序草属(Polytrias)、新麦草属(Psa thyros tachys)、 Pseudelymus、Pseudoroegneria、矢竹属(Pseudosasa)、细柄茅属 (Ptilagrostis)、碱茅属(Puccinellia)、Pucciphippsia、 Redfieldia、Reimaria、Reimarochloa、Rhaphis、Rhombolytrum、红 毛草属(Rhynchelytrum)、鹅观草属(Roegneria)、Rostraria、筒 轴茅属(Rottboellia)、Rytilix、甘蔗属(Saccharum)、囊颖草属 (Sacciolepis)、赤竹属(Sasa)、Sassella、华箬竹属(Sasamorpha)、 Savastana、Schedonnardus、齿稃属(Schismus)、裂稃茅属 (Schizachne)、裂稃草属(Schizachyrium)、裂穗草属 (Schizostachyum)、硬草属(Sclerochloa)、Scleropoa、Scleropogon、 Scolochloa、Scribneria、黑麦属(Secale)、业平竹属 (Semiarundinaria)、Sesleria、狗尾草属(Setaria)、倭竹属 (Shibataea)、Sieglingia、玉山竹属(Sinarundinaria)、唐竹属 (Sinobambusa)、慈竹属(Sinocalamus)、Sitanion、Sorghastrum、 高粱属(Sorghum)、大米草属(Spartina)、Sphenopholis、大油芒属 (Spodiopogon)、鼠尾栗属(Sporobolus)、Stapfia、Steinchisma、 钝叶草属(Stenotaphrum)、针茅属(Stipa)、Stipagrostis、 Stiporyzopsis、Swallenia、Syntherisma、Taeniatherum、Terrellia、 Terrelymus、莜竹属(Thamnoca lamus)、菅属(Themeda)、Thinopyrum、 卷轴草属(Thuarea)、棕叶芦属(Thysanolaena)、Torresia、 Torreyochloa、Trachynia、Trachypogon、锋芒草属(Tragus)、 Trichachne、Trichloris、Tricholaena、Trichoneura、Tridens、 Triodia、Triplasis、草沙蚕属(Tripogon)、摩擦草属(Tripsacum)、 Trisetobromus、三毛草属(Trisetum)、Triticosecale、小麦属 (Triticum)、Tuctoria、Uniola、Urachne、Uralepis、尾稃草属 (Urochloa)、Vahlodea、Valota、Vaseyochloa、Ventena ta、香根草 属(Vetiveria)、Vilfa、Vulpia、Willkommia、玉山竹属(Yushania)、 玉蜀黍属(Zea)、茭白属(Zizania)、Zizaniopsis和结缕草属(Zoysia)。 在一个实施方案中，植物是玉蜀黍、小麦、稻、高粱、大麦、燕麦、 草坪草、黑麦、大豆、番茄、马铃薯、胡椒、嫩茎花椰菜、卷心菜、 商业的玉米系等。
整合了一种或多种上述核酸或多肽的试剂盒也是本发明的一个 特征。这样的试剂盒可以包括任一种上述组分，且另外包括例如，本 文所述的任一种方法中的组分的使用说明书、包装材料、用于容纳组 分的容器等。例如，用于调节植物的保绿潜力的试剂盒包括一个容 器，其装有至少一个包含核酸序列的多核苷酸序列，其中该核酸序列 与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3(gACS7)、 SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cAC7) 或SEQ ID NO：10(CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有例如至少 约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约99％、约99.5％或更高的同一性。在另一个实施方案中， 试剂盒包括关于使用至少一个多核苷酸序列来控制植物的保绿潜力 的说明材料。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方 案。
作为另一个实例，用于调节植物的不育、例如雄性不育的试剂盒 包括一个容器，其装有至少一个包含核酸序列的多核苷酸序列，其中 该核酸序列与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3(gACS7)、SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cAC7)或SEQ ID NO：10(CCRA178R)或其子序列或其互补序 列具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少 约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的同一性。试剂盒 还任选地包括关于使用至少一个多核苷酸序列来控制植物的不育、例 如雄性不育的说明材料。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于 该实施方案。
定义
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定的装置或生 物学系统，它当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅用于 描述具体实施方案的目的，而无意进行限制。如在本说明书和所附权 利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和 “该(the)”包括复数对象，除非其内容清楚地作出相反说明。因而， 例如，“一个细胞”包括2个或更多个细胞的组合，等等。
除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发 明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在描述和要求保 护本发明时，根据下述的定义，使用下面的术语。
术语“植物”一般地指下述任意一种：全植物、植物部分或器官 (例如，叶子、茎、根，等)、茎干营养器官/结构(例如叶子、茎和 块茎)、根、花和花的器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心 皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)、果实(成熟的子房)、 植物组织(例如维管组织、基本组织，等)、组织培养愈伤组织和植 物细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)和它们的后代。如本文所 使用的，植物细胞还包括但不限于从下述组织中得到的或发现的细 胞：种子、培养物、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶子、 根、茎干、配子体、孢子体、花粉和小孢子。还可以将植物细胞理解 为包括从前述组织得到的修饰的细胞，例如原生质体。
术语“双子叶植物”指双子叶的植物。双子叶的植物属于具有2个 子叶(子叶)的被子植物的大亚纲。
术语“单子叶植物”指单子叶的植物，其在发育中的植物只具有1 个子叶。
术语“敲除的植物细胞”指具有在细胞的至少一个ACC合酶基因中 的破坏的植物细胞，与对照细胞相比，该破坏会导致降低的该基因编 码的ACC合酶的表达或活性。敲除可以是例如反义构建体、有义构建 体、RNA沉默构建体、RNA干扰、基因组破坏(例如，转座子、TILLING、 同源重组，等)等的结果。术语“敲除的植物”指在至少一个细胞中具 有至少一个ACC合酶基因破坏的植物。
术语“转基因的”指具有整合的核酸序列的植物，其包括但不限于 基因、多核苷酸、DNA、RNA等，与未导入的植物相比，它们已经被 导入了植物中。
术语“内源的”涉及已经存在于细胞中的任何基因或核酸序列。
“转座因子”(TE)或“转座性遗传因子”是可以在细胞中从一个位 置移动到另一个位置的DNA序列。转座因子的移动可以发生在附加体 至附加体、附加体至染色体、染色体至染色体或染色体至附加体。转 座因子的特征在于，在它们的末端存在反向重复序列。“转座酶”会酶 促地介导移动。在结构上，分别根据除了对于因子的移动必需的序列 外，有或没有遗传序列存在，将转座因子分成“转座子”(“TN”)或“插 入序列元件”(IS元件)。小-转座子或小-IS元件一般缺少能编码转 座酶的序列。
通常，以本领域公知的含义使用术语“核酸”或“多核苷酸”，其指 核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物，例如， 包含核苷酸的修饰的核苷酸聚合物、肽核酸等。在某些应用中，核酸 可以是聚合物，其包括多个单体类型，例如RNA和DNA亚基。核酸可 以是，例如，染色体或染色体片段、载体(例如，表达载体)、表达盒、 裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针 等。核酸可以是，例如，单链的和/或双链的。除非另有说明，除了 明确指出的任何序列外，本发明的特定核酸序列任选地包含或编码互 补的序列。
术语“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”指单一核酸中的邻接的核 苷酸序列或其表示，例如字符串。也就是说，根据上下文，“多核苷 酸序列”是核苷酸的聚合物(寡核苷酸、DNA、核酸，等)或代表着核苷 酸聚合物的字符串。从任何指定的多核苷酸序列，可以确定特定的核 酸或互补的多核苷酸序列(例如，互补的核酸)。
术语“子序列”或“片段”是完整序列的任意部分。
“表型”是由基因表达和环境的相互作用产生的个体植物的性状 表现。
“表达盒”是核酸构建体，例如，载体，例如质粒、病毒载体等， 其能生产转录物，和，潜在地，由多核苷酸序列编码的多肽。表达载 体能体内或体外地在外源细胞中生产转录物，例如，细菌细胞或植物 细胞，例如培养的植物原生质体。根据例如选择的启动子，产物的表 达可以是组成型的或诱导型的。该定义特别地包括未被翻译或不能被 翻译的反义、有义或RNA干扰或沉默构型。在表达载体的上下文中， 如果启动子能调节相关的多核苷酸序列的表达，则将所述启动子称作 “可操作地连接”在多核苷酸序列上。该术语也适用于替代性的外源基 因构建体，例如表达的或整合的转基因。同样地，术语可操作地连接 同样适用于与多核苷酸序列有关的替代性的或其他的转录调节序 列，例如增强子。
如果多核苷酸序列可以被转录(以剪接的或未剪接的形式)和/或 翻译成RNA或多肽或其子序列，则将多核苷酸序列称作“能编码”有 义或反义RNA分子或RNA沉默或干扰分子或多肽。
如上下文所指出的，“基因的表达”或“核酸的表达”指DNA向RNA 的转录(任选地包括RNA的修饰，例如，剪接)、RNA向多肽的翻译(可 能包括多肽的后续修饰，例如，翻译后修饰)或转录和翻译二者。
广泛地，使用术语“基因”指与生物学功能有关的所有核酸。基因 一般包括编码序列和/或表达这样的编码序列所需的调节序列。术语 “基因”适用于特定的基因组序列，以及由该基因组序列编码的cDNA 或mRNA。基因也包括不表达的核酸片段，其例如形成其他蛋白的识 别序列。不表达的调节序列包括启动子和增强子，调节蛋白例如转录 因子会结合在其上面，导致临近或附近序列的转录。
“多肽”是包含2个或更多个氨基酸残基的聚合物(例如，肽或蛋 白)。聚合物可以另外包含非氨基酸的元件，例如标记、猝灭剂、保 护基团等，且可以任选地包含修饰，例如糖基化等。多肽的氨基酸残 基可以是天然的或非天然的，且可以是未取代的、未修饰的、取代的 或修饰的。
术语“重组的”指已经通过人为干预，人工地或合成地(非天然 地)改变了该材料(例如，细胞、核酸或蛋白)。可以在处于它的自然 环境或状态中的材料上，或从它的自然环境或状态中取出的材料上， 进行改变。例如，“重组的核酸”是通过重组核酸产生的，例如，在克 隆、DNA改组的过程中或在其他过程中；“重组的多肽”或“重组的蛋 白”是通过表达重组的核酸生产的多肽或蛋白。重组的细胞的实例包 括含有重组的核酸和/或重组的多肽的细胞。
术语“载体”指可以繁殖核酸和/或在生物、细胞或细胞组分之间 转移核酸的工具。载体包括质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬粒、转 座子和人工染色体等，它们可以自主复制，或可以整合进宿主细胞的 染色体中。载体还可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由相同 链内的DNA和RNA组成的多核苷酸、多-赖氨酸-缀合的DNA或RNA、 肽-缀合的DNA或RNA、脂质体-缀合的DNA等，它们不能自主复制。
在本发明的上下文中，术语“分离的”指，生物学材料例如核酸或 蛋白基本上不合有天然伴随它的或在它的天然存在的环境中与其相 互作用的组分。分离的材料任选地包含在它的自然环境(例如细胞) 中不与该材料一起发现的材料。例如，如果材料处于它的自然环境(例 如细胞)中，则该材料已经被置于对于在该环境中发现的材料而言非 天然的细胞中的位置(例如，基因组或遗传因子)。例如，天然产生的 核酸(例如，编码序列、启动子、增强子，等)会变成分离的，如果 通过非天然产生的方式将其导入对该核酸而言非天然的基因组的基 因座中(例如，载体，例如质粒或病毒载体或扩增子)。分离的植物细 胞，例如，可以处于野生型植物细胞的天然环境(例如，全植株)以 外的环境中(例如，细胞培养系统或从细胞培养物中纯化的)。
关于多肽的术语“变体”指，相对于参照序列，被改变了一个或多 个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有“保守的”变化，其中取代的氨 基酸具有类似的结构或化学性质，例如，用异亮氨酸替换亮氨酸。或 者，变体可以具有“非保守的”变化，例如，用色氨酸替换甘氨酸。 类似的微小变化还可以包括氨基酸缺失或插入或二者。使用本领域众 所周知的计算机程序，例如，DNASTAR软件，可以发现关于确定能取 代、插入或删除哪个氨基酸残基、而不消除生物学或免疫学活性的指 导。还在下面描述了保守取代的实例。
如本文所使用的，“宿主细胞”是已经被或能被外源的多核苷酸序 列转化或转染的细胞。将“外源的多核苷酸序列”定义为指在细胞中非 天然的序列，或者其天然地存在于细胞中，但是在不同的遗传基因座 中、以不同的拷贝数存在或在不同的调节元件的指导下。
如本文所使用的，“启动子”包括位于转录起点上游且参与RNA聚 合酶和其他蛋白的识别和结合以启动转录的DNA区域。“植物启动 子”是能启动植物细胞的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但 不限于，从植物、植物病毒和包含能在植物细胞中表达的基因的细菌 得到的那些，所述细菌例如土壤杆菌或根瘤菌(Rhizobium)。在发 育控制下的启动子的实例包括能优先启动在某些组织(例如叶子、根 或种子)或空间上在诸如胚乳、胚或分生组织区的区域中的转录的启 动子。这样的启动子称作“组织-优选的”或“组织-特异性的”。时间上 受调节的启动子能在特定时间驱动表达，例如在授粉后O-25天。“细 胞类型-优选的”启动子主要驱动一个或多个器官中的某些细胞类型 中的表达，例如，根或叶子中的维管细胞。“诱导型”启动子是在环 境控制下的启动子，且可以是诱导型的或可去阻抑的。可能影响诱导 型启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在。组织- 特异性的、细胞类型-特异性的和诱导型的启动子构成了“非-组成型 的”启动子类型。“组成型的”启动子是在大多数环境条件下、在所 有或几乎所有组织中、在所有或几乎所有发育阶段中都有活性的启动 子。
如本文所使用的，“转化”是当外源DNA已经被导入到细胞膜内 时，这样的外源DNA“转化”细胞的过程。外源DNA可以整合或未整 合(共价地连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。在原核生物和 酵母中，例如，外源DNA可以维持在附加型元件、例如质粒上。关于 更高等的真核细胞，稳定地转化的或转染的细胞是这样的，其中外源 DNA已经整合进染色体中，从而它能通过染色体的复制被子细胞所遗 传。真核细胞建立细胞系或克隆(其由含有外源DNA的子细胞群体组 成)的能力，证实了该稳定性。
附图简述
图1示意地说明了植物例如拟南芥(Arabidopsis)中的乙烯生 物合成和信号传导基因。
图2示意地说明了分离的和作图的ACC合酶基因和Mu插入突 变。ACC6也称作ACS6，ACC2也称作ACS2，且ACC7也称作ACS7。
图3，小图A、B、C和D说明了植物例如玉米中的杂合的ACC合 酶敲除。小图A和小图B说明了野生型植物田中的杂合的ACC合酶敲 除的植物。小图C和小图D说明了来自杂合的ACC合酶敲除的植物的 叶子(小图的左侧)与来自ACC合酶野生型植物的叶子(小图的右侧) 的比较。
图4说明了与野生型叶子(左侧)和杂合的敲除的叶子(中间)相 比，在纯合的ACC合酶敲除的植物叶子(右侧)中观察到的增强的保绿 性状。
图5，小图A、B、C、D、E和F说明了在对照条件(小图A、B和 C)或干旱条件(小图D、E和F)下，野生型(B73，+/+)和ACS6无效(15， O/O)突变的叶子的叶子蒸腾(小图A和D)、气孔导度(小图B和E) 和CO2同化作用(小图C和F)。关于对照条件，使植物在较好灌溉 的条件下生长，并在授粉后40天(dap)，测量了植物的每片叶子。关 于干旱条件，使植物在有限水的条件下生长，并在授粉后40天，测 量了植物的每片叶子。数值代表着6次测定的平均值。
图6，小图A、B和C说明了野生型(B73，+/+)、ACS2无效(7，0/0) 和ACS6无效(15，0/0)突变的叶子的叶子蒸腾(小图A)、气孔导度 (小图B)和CO2同化作用(小图C)。使植物在有限水的条件下生长， 并在授粉后40天，测量了植物的每片叶子。数值代表着6次测定的 平均值。
图7示意地说明了ACC合酶基因序列的种系发生分析，其中(A47 (在本文中也称作ACS2或ACC2)、A50(在本文中也称作ACS7或 ACC7)、A65(在本文中也称作ACS6或ACC6))指示着玉米序列， (AtACS…)指示着拟南芥序列，(LeACS…)指示着番茄序列，(籼型 (OsiACS…)& 粳型(OsjACS…))指示着稻序列，(TaACS…)指示着 小麦序列，且(MaACS…)指示着香蕉序列。
图8说明了A47(也称作ACS2或ACC2)、A50(也称作ACS7或 ACC7)和A65(也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与双子叶植物 (AtACS、LeACS)和单子叶植物(OsiACS、OsjACS、TaACS和Ma ACS)物 种的肽共有序列比对。用最严格的标准(相同的氨基酸)进行了比对， 复数(plurality)是26.00，阈值是4，AveWeight是1.00，AveMatch 是2.78，且AvMisMatch是-2.25。SEQ ID NO如下：A47pep SEQ ID NO：25； A50pep SEQ ID NO：26；osiacslpep SEQ ID NO：27；osjacslpep SEQ ID NO：28；TaACS2pep SEQ ID NO：29；AtACSlpep SEQ ID NO：30； AtACS2pep SEQ ID NO：31；LeACS2pep SEQ ID NO：32；LeACS4pep SEQ ID NO：33；MaACS1pep SEQ ID NO：34；MaACS5pep SEQ ID NO：35； LeACS1Apep SEQ ID NO：36；LeACSlBpep SEQ ID NO：37；LeACS6pep SEQ ID NO：38；AtACS6pep SEQ ID NO：39；A65pep SEQ ID NO：40； osiacs2pep SEQ ID NO：41；AtACS5pep SEQ ID NO：42；AtACS9 SEQ ID NO：43；AtACS4pep SEQ ID NO：44；AtACS8 SEQ ID NO：45； MaACS2pep SEQ ID NO：46；MaACS3pep SEQ ID NO：47；LeACS3pep SEQ ID NO：48；LeACS7pep SEQ ID NO：49；OsjACS2pep SEQ ID NO：50； OsjACS3 SEQ ID NO：51；OsiACS3pep SEQ ID NO：52；和AtACS7 SEQ ID NO：53。
图9说明了A47(也称作ACS2或ACC2)、A50(也称作ACS7或 ACC7)和A65(也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与双子叶植物 (AtACS、LeACS)和单子叶植物(OsiACS、OsjACS、TaACS、MaACS)物 种(SEQ ID NO：25-53)的肽共有序列比对。用严格标准(相似的氨基酸 残基)进行了比对，复数是26.00，阈值是2，AveWeight是1.00， AveMatch是2.78，且AvMisMatch是-2.25。
图10明了A47(也称作ACS2或ACC2)、A50(也称作ACS7或 ACC 7)和A65(也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与双子叶植物 (AtACS、LeACS)和单子叶植物(OsiACS、OsjACS、TaACS、MaACS)物 种(SEQ ID NO：25-53)的肽共有序列比对。用较低的严格标准(稍微相 似的氨基酸残基)进行了比对，复数是26.00，阈值是0，AveWeight 是1.00，AveMatch是2.78，且AvMisMatch是-2.25。
图11说明了A47(也称作ACS2或ACC2)和A50(也称作ACS7或 ACC7)的ACC合酶序列与最类似于ACS2和ACS7的序列(SEQ ID NO：25-3)的肽共有序列比对。用最严格的标准(相同的氨基酸)进 行了比对，复数是15.00，阈值是4，AveWeight是1.00，AveMatch 是2.78，且AvMisMatch是-2.25。
图12说明了A47(也称作ACS2或ACC2)和A50(也称作ACS7或 ACC7)的ACC合酶序列与最类似于ACS2和ACS7的序列(SEQ ID NO：25-39)的肽共有序列比对。用严格标准(相似的氨基酸残基)进行 了比对，复数是15.00，阈值是2，AveWeight是1.00，AveMatch是 2.78，且AvMisMatch是-2.25。
图13说明了A65(也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与最类 似于ACS6的序列(SEQ ID NO：40-53)的肽共有序列比对。用最严格的 标准(相同的氨基酸)进行了比对，复数是14.00，阈值是4， AveWeight是1.00，AveMatch是2.78，且AvMisMatch是-2.25。
图14说明了A65(也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与最类 似于ACS6的序列(SEQ ID NO：40-53)的肽共有序列比对。用严格标准 (相似的氨基酸残基)进行了比对，复数是14.00，阈值是2，AveWeight 是1.00，AveMatch是2.78，且AvMisMatch是-2.25。
图15说明了A47(也称作ACS2或ACC2)、A50(也称作ACS7或 ACC7)和A65(也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列(SEQ ID NO：25-26 和40)的肽共有序列比对。用最严格的标准(相同的氨基酸)进行了 比对，复数是3.00，阈值是4，AveWeight是1.00，AveMatch是2.78， 且AvMisMatch是-2.25。
图16说明了A47(也称作ACS2或ACC2)、A 50(也称作ACS7或 ACC7)和A65(也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列(SEQ ID NO：25-26 和40)的肽共有序列比对。用严格标准(相似的氨基酸残基)进行了比 对，复数是3.00，阈值是2，AveWeight是1.00，AveMatch是2.78， 且AvMisMatch是-2.25。
图17小图A、B、C和D说明了野生型和ACC合酶敲除的植物的 总叶绿素数据。小图A和B说明了在正常条件(小图A)或干旱条件(小 图B)下生长的野生型(B73，+/+)、ACS2无效(0/0)和ACS6无效(0/0) 植物在授粉后40天的总叶绿素数据。小图C对比了在正常和干旱条 件下授粉后40天的野生型(B73，+/+)和ACS6无效(0/0)植物的总叶 绿素。小图D对比了在授粉后30和40天收集的B73(野生型)植物 的总叶绿素。
图18小图A、B、C和D说明了野生型和ACC合酶敲除的植物的 可溶蛋白数据。小图A和B说明了在正常条件(小图A)或干旱条件(小 图B)下生长的野生型(B73，+/+)、ACS2无效(0/0)和ACS6无效(0/0) 植物在授粉后40天的可溶蛋白数据。小图C对比了在正常和干旱条 件下授粉后40天的野生型(B73，+/+)和ACS6无效(0/0)植物的可溶 蛋白。小图D对比了在授粉后30和40天收集的B73(野生型)植物 的可溶蛋白。
图19，小图A和B说明了幼苗叶子中的乙烯生产。小图A说明了 各种系。在小图B中，幼苗叶子被按基因型计算平均值。在小图C中， 在20、30和40DAP，检测了野生型(即，B73)植物的每片叶子的乙 烯生产。叶子1代表着最老的存活的叶子，叶子11是最年轻的。进 行了3次测量，并报道平均值和标准差。
图20小图A说明了叶绿素数据，小图B说明了可溶蛋白，和小 图C说明了核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶表达。在黑暗处理7天后， 在成年野生型(即，ACS6/ACS6)、acs2/acs2和acs6/acs6植物的第3 最老的叶子(叶子3)、第6最老的叶子(叶子6)和第9最老的叶子(叶 子9)中，测量了叶绿素a+b(小图A)和可溶蛋白(小图B)的水平。 每天灌溉植物。在处理过程中，每天一次给其他的acs6/acs6植物灌 溉100μM ACC。还显示了灌溉100μM ACC、但是保持不具鞘的 acs6/acs6叶子。显示了3种个体植物叶子的平均值和标准差。(小 图C)使用稻抗-核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶抗血清，进行了相同叶 子的蛋白印迹分析。使用了来自相同鲜重的叶子样品的可溶蛋白。
图21小图A-C说明了ACS2发夹构建体。小图A是PHP20600的 示意图，该PHP20600含有能驱动ACS2发夹(由TR1和TR2组成的末 端重复序列)的表达的泛素启动子(UBI1ZM PRO)。RB代表着土壤杆菌 右边界序列。说明了49682碱基对盒的4126碱基对片段。小图B显 示了ZM-ACS2 TR1的序列(SEQ ID NO：54)，且小图C显示了ZM-ACS2 TR2的序列(SEQ ID NO：55)。
图22小图A-C说明了ACS6发夹构建体。小图A是PHP20323的 示意图，该PHP20323含有能驱动ACS6发夹(由TR1和TR2组成的末 端重复序列)的表达的泛素启动子(uBI1ZM PRO)。RB代表着土壤杆菌 右边界序列。说明了49108碱基对盒的3564碱基对片段。小图B显 示了ZM-ACS6 TR1的序列(SEQ ID NO：56)，且小图C显示了ZM-ACS6 TR2的序列(SEQ ID NO：57)。
图23小图A和B说明了ACS2-和ACS6-发夹构建体发生的事件。 小图A中的图显示了ACS2发夹(PHP20600)的各事件的数目和相关的 每个事件的转基因拷贝数。小图B中的图显示了ACS6发夹(PHP20323) 的各事件的数目和相关的每个事件的转基因拷贝数。
详细描述
“保绿”是常用的描述植物表型的术语。保绿是商业性农业的理想 性状，例如，与籽粒灌浆有关的理想性状。如在本文中所述的，已经 描述了5个根本不同的保绿类型，包括类型A、B、C、D和E(参见， 例如，Thomas H和Smart CM(1993)Crops that stay green. Annals of Applied Biology 123：193-219；和Thomas H和Howarth CJ(2000) Five ways to stay green. Journal of Experimental Botany 51： 329-337)。但是，仅有非常少的对遗传确定的保绿的生物化学的、生 理学的或分子基础的描述。参见，例如，Thomas和Howarth，同上。 本发明提供了保绿潜力的分子的/生物化学的基础。
已经显示，许多环境的和生理的条件能显著改变叶子衰老的时间 选择和进展，且可以提供关于该性状的基础的一些了解。在环境因素 中，光可能是最明显的，且已经长期地认为，通过将脱落的叶子置于 黑暗中，可以在许多植物物种中诱导叶子衰老。参见，例如，Weaver LM和Amasino RM(2001)Senescence is induced in individually darkened Arabidopsis leaves，but inhibited in whole darkened plants. Plant Physiology 127：876-886。还已经显示，有限的营 养和水可用性会过早地诱导叶子衰老。参见，例如，Rosenow DT，等 (1983)Drought-tolerant sorghum and cotton germplasm. Agricultural Water Management 7：207-222。在生理决定因素中， 生长调节剂在指导叶子衰老程序中起关键作用。细胞分裂素水平的改 变可以明显延迟叶子衰老。例如，用异戊烯基转移酶(ipt)(一种能 编码细胞分裂素生物合成中的限速步骤的土壤杆菌基因)转化的植 物，当置于衰老诱导型启动子控制下时，会导致自身调节的细胞分裂 素生产和强保绿表型。参见，例如，Gan S和Amasino RM(1995) Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270：1986-1988。但是，还有参与该性状的其 他因素。
例如，乙烯也已经涉入控制叶子衰老(参见，例如，Davis KM和 Grierson D(1989)Identification of cDNA clones for tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)mRNAs that accumulate during fruit ripening and leaf sencescence in response to ethylene. Planta 179：73-80)，且一些乙烯生产或感觉受损的双子叶植物也会 表现出叶子衰老的延迟(参见，例如，Picton S，等(1993)Altered fruit ripening and leaf senescence in tomatoes expressing an antisence ethylene-forming enzyme transgene. The Plant Journal 3：469-481；Grbic V和Bleeker AB(1995)Ethylene regulates the timing of leaf senescence in Arabidopsis. The Plant Journal 8：95-102；和，John I，等(1995)Delayed leaf senescence in ethylene-deficient ACC-oxidase antisence tomato plantss：molecular and physiological analysis. The Plant Journal 7：483-490)，其可以通过外源应用乙烯生物合成和作用的 抑制剂得到拟表型(参见，例如，Abeles FB，等(1992) Ethylene in Plant Biology.Academic Press，San Diego，CA)。
乙烯感觉包含膜-定位的受体，例如，在拟南芥中，所述受体包 括ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4(参见图1)。ETR1、ETR2和EIN4 由3个结构域组成：N-末端乙烯结合结构域、推定的组氨酸蛋白激酶 结构域和C-末端接受结构域，而ERS1和ERS2缺少接受结构域。基 于同源性，已经将这些基因分成2个亚族，其中ETR1和ERS1构成1 个亚族，且ETR2、ERS2和EIN4构成另一个。在拟南芥中，对功能丧 失的突变体的分析，已经揭示了乙烯会抑制这些受体的信号传导活性 和随后的它们活化CTR1的能力，所述CTR1是与哺乳动物的RAF-类 型丝氨酸/苏氨酸激酶有关的乙烯反应的负调节剂。乙烯信号转导途 径表明，乙烯向受体的结合，会抑制它自身的激酶活性，从而导致 CTR1活性的降低，并从而导致EIN2(其在CTR1下游起作用)活性的增 加，最终导致乙烯反应性的增加。已经观察了发育的和对乙烯响应的 乙烯受体家族成员的有差别的表达。
在确定乙烯在植物生长和发育中的作用时，鉴别和分析有乙烯生 物合成和感觉缺陷的拟南芥和番茄的突变体是有价值的。突变体分析 还有助于鉴别和表征乙烯信号转导途径。尽管已经在双子叶植物(例 如，拟南芥和番茄)中鉴别出了许多乙烯突变体，但是在单子叶植物 (例如，稻、小麦和玉米)中尚未鉴别出这样的突变体。在本文中描述 了，例如，ACC合酶缺陷的乙烯突变体(例如，在单子叶植物中)，该 ACC合酶是乙烯生物合成途径中的第一种酶。
本发明提供了来自植物的ACC合酶多核苷酸序列，其可以调节植 物的保绿潜力和乙烯生产，示例为，例如，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6 和SEQ ID NO：10，和例如，一组能调节植物的保绿潜力和/或乙烯生 产的多肽序列，例如，SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。 本发明还提供了ACC合酶缺陷的敲除的植物细胞、和具有保绿潜力表 型的敲除的植物、以及具有雄性不育表型的敲除的植物。本发明的植 物可以具有比对照植物更好的调节对环境应激的反应的特征，例如， 更高的对干旱应激的耐受性。本发明的植物还可以具有比对照植物更 高的对其他应激(例如，拥挤，例如，玉米)的耐受性。因而，可以以 比农民现在的实践更高的密度，种植本发明的植物。另外，在阐明乙 烯在植物发育中所起的调节作用以及它在调节对应激(例如，干旱、 拥挤，等)的反应中的作用时，本发明的植物是至关重要的。
植物中的乙烯
乙烯(C2H4)是气态的植物激素。它具有可变的作用范围，这可以 是组织和/或物种特异性的。例如，生理活性包括但不限于，促进食 物成熟、双子叶物种的叶子和果实的脱落、花衰老、水生植物的茎伸 展、根中的气体空间(通气组织)发育、叶子偏上性的弯曲、茎和茎干 膨胀(与矮化有关)、curcubit中的雌性特征、某些物种中的果实生 长、黄化的茎干中的顶钩闭合、根毛形成、凤梨科(Bromeliaceae) 的开花、黄化的茎干的横向地性和增加的基因表达(例如，多聚半乳 糖醛酸酶、纤维素酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶等的)。成熟果实 会自然地释放乙烯，且大多数植物组织也会释放乙烯，例如对应激(例 如，干旱、拥挤、疾病或病原体攻击、温度(冷或热)应激、创伤， 等)作出响应，和在成熟和衰老的器官中。
通过明确的包含ACC合酶推动的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或Ado Met)向环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的转化的途径，会从 甲硫氨酸生成乙烯(参见，例如，图1)。通过循环5’-甲硫腺苷，在 该过程中保藏硫。
ACC合酶是一种氨基转移酶，它能催化通过将S-腺苷甲硫氨酸转 化成ACC、形成乙烯的限速步骤。一般地，该酶需要吡哆醛磷酸作为 辅因子。ACC合酶一般地在多基因家族中编码。实例包括本文所述的 SEQ ID NO：1-3。各成员可以表现出组织-特异性的调节和/或会被环 境的和化学的刺激所诱导。本发明的特征包括ACC合酶序列和子序 列。参见本文中标题为“本发明的多核苷酸和多肽”的部分。
然后，通过ACC氧化酶(也称作乙烯形成酶)的作用，从ACC的 氧化生成乙烯，其中氰化氢作为副产物，它能被β-氰丙氨酸合酶解 毒。ACC氧化酶在多基因家族中编码，其中各成员能表现出组织-特 异性的调节和/或会被环境的和化学的刺激所诱导。缺氧和钴离子会 抑制ACC氧化酶的活性。ACC氧化酶是立体特异性的，且使用辅因 子，例如，Fe+2、O2、抗坏血酸盐等。最后，乙烯通过氧化代谢成CO2或环氧乙烷和乙二醇。
本发明的多核苷酸和多肽
本发明表征了ACC合酶的基因序列、编码核酸序列和氨基酸序列 的鉴别，所述的序列与例如植物的保绿潜力和/或乙烯生产有关。本 发明的序列可以通过调节乙烯的生产，来影响植物的保绿潜力。
本发明的多核苷酸序列包括，例如，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6 和SEQ ID NO：10代表的多核苷酸序列和其子序列。除了在所附的序 列表中特别提供的序列外，本发明包括结构上和/或功能上高度相关 的多核苷酸序列。例如，能编码SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9和SEQ  ID NO：11代表的多肽序列或其子序列的多核苷酸，是本发明的一个 实施方案。另外，本发明的多核苷酸序列包括能在严格条件下与包含 SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10中的任一个或其子序列(例 如，包含至少100个邻接核苷酸的子序列)的多核苷酸序列杂交的多 核苷酸序列。本发明的多核苷酸还包括设置用于RNA生产的ACC合酶 序列和/或子序列，例如，mRNA、反义RNA、有义RNA、RNA沉默和 干扰构型，等。
除了本发明的多核苷酸序列、例如在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6 和SEQ ID NO：10所列举的序列外，可以在本发明的组合物和方法中 使用基本上与本发明的多核苷酸相同的多核苷酸序列。将基本上相同 的或基本上类似的多核苷酸序列定义为，在逐个核苷酸的基础上，与 参照多核苷酸(例如，选自SEQ ID NO：1-6和10)的至少一个子序 列相同的多核苷酸序列。这样的多核苷酸可以包括，例如，相对于 SEQ ID NO：1-6和10中的任一个的插入、缺失和取代。例如，这样 的多核苷酸一般与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10 或其子序列的参照多核苷酸有至少约70％同一性。例如，在对比窗口 中的10个核苷酸中，有至少7个与选自例如SEQ ID NO：1-6和10 的参照序列相同。经常地，这样的序列与参照序列(例如，SEQ ID NO：1 至SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中的至少一个)有至少约70％、至少 约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约 98％、至少约99％或至少约99.5％的同一性。上述的本发明的多核苷酸 (例如，SEQ ID NO：1-6和10)的子序列，其包括例如至少约5个、 至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约50 个、至少约75个、至少约100个、至少约500个、约1000个或更多 个邻接核苷酸或它们的互补子序列，也是本发明的一个特征。这样的 子序列可以是，例如，寡核苷酸，例如合成的寡核苷酸，分离的寡核 苷酸，或全长基因或cDNA。
另外，本发明的多核苷酸包括与上述序列中的任一个互补的多核 苷酸序列。
本发明的多肽序列包括，例如，SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9和 SEQ ID NO：11代表的氨基酸序列和其子序列。除了在所附的序列表 中特别提供的序列外，本发明包括结构上和/或功能上高度相关的氨 基酸序列。例如，除了本发明的氨基酸序列、例如在SEQ ID NO：7至 SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：I1所列举的序列外，可以在本发明的组 合物和方法中使用基本上与本发明的多肽相同的氨基酸序列。将基本 上相同的或基本上类似的氨基酸序列定义为，在逐个氨基酸的基础 上，与参照多肽(例如，选自SEQ ID NO：7-9和11)的至少一个子 序列相同的氨基酸序列。这样的多肽可以包括，例如，相对于SEQ ID NO：7-9和11中的任一个的插入、缺失和取代。例如，这样的多肽一 般与选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11或其子序列 的参照多肽有至少约70％同一性。例如，在对比窗口中的10个氨基 酸中，有至少7个与选自例如SEQ ID NO：7-9和11的参照序列相同。 经常地，这样的序列与参照序列(例如，SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9 或SEQ ID NO：11中的至少一个)有至少约70％、至少约75％、至少约 80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％ 或至少约99.5％的同一性。上述的本发明的多肽(例如，SEQ ID NO： 7-9和11)的子序列，其包括例如至少约5个、至少约10个、至少 约15个、至少约20个、至少约25个、至少约50个、至少约75个、 至少约100个、至少约500个、约1000个或更多个邻接氨基酸，也 是本发明的一个特征。本发明的氨基酸序列或子序列的保守变体也是 本发明的氨基酸序列。本发明的多肽任选地是免疫原性的、酶活性 的、酶失活的等。
当翻译本发明的多核苷酸序列以形成多肽或多肽的子序列时，核 苷酸变化可以导致保守的或非保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代 是指具有功能上类似的侧链的残基的互换性。本领域众所周知保守取 代表，它提供了功能上类似的氨基酸。表1阐述了6组，它们含有彼 此为“保守取代”的氨基酸。在本领域可以得到其他保守取代图表，且 可以以类似的方式使用。
表1：保守的取代组   1   丙氨酸(A)  丝氨酸(S)   苏氨酸(T)   2   天冬氨酸(D)  谷氨酸(E)   3   天冬酰胺(N)  谷氨酰胺(Q)   4   精氨酸(R)  赖氨酸(K)   5   异亮氨酸(I)  亮氨酸(L)   甲硫氨酸(M)   缬氨酸(V)   6   苯丙氨酸(F)  酪氨酸(Y)   色氨酸(W)
本领域的普通技术人员能够明白，公开的核酸构建体的许多保守 取代会产生功能上等同的构建体。例如，如上面所讨论的，由于遗传 密码的简并性，“沉默的取代”(即，核酸序列中的不会导致编码的多 肽的改变的取代)是每个能编码氨基酸的核酸序列的暗含特征。类似 地，在氨基酸序列中的一个或少数几个氨基酸的“保守氨基酸取 代”(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多) 是用具有高度相似性质的不同氨基酸取代，且也可以容易地鉴别为与 公开的构建体高度相似。每个公开序列的这样的保守变体，是本发明 的特征。
得到本发明的保守变体以及更趋异型核酸和多肽的方法，是本领 域普遍知道的。除了可以天然产生的同系物外，该同系物可以通过例 如根据任一种非常确实的方法筛选基因组或表达文库来得到，参见， 例如，Ausubel等 Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2004)John Wiley & Sons，New York (“Ausubel”)；Sambrook等 Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(“Sambrook”)和Berger和Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)， 其他的变体可以通过任一种诱变方法来生产。本领域知道许多这样的 方法，包括定位诱变、寡核苷酸指导的诱变和许多其他的。例如，定 位诱变记载在，例如，Smith(1985)“In vitro mutagenesis” Ann. Rev.Genet.19：423-462和其中的参考文献，Botstein & Shortle (1985)“Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229：1193-1201；和Carter(1986)“Site-directed mutagenesis” Biochem.J.237：1-7。寡核苷酸指导的诱变记载在， 例如，Zoller & Smith(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res.10：6487-6500)。使用修饰的 碱基的诱变记载在，例如，Kunkel(1985)“Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492和Taylor等(1985)“The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl.Acids Res.13：8765-8787。使用有缺口的双链体DNA的诱变记载在，例如， Kramer等(1984)“The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl.Acids Res.12：9441-9460)。点错配诱变记载在，例如，Kramer等(1984) “Point Mismatch Repair” Ce11 38：879-887)。双链破坏诱变记载在， 例如，Mandecki(1986)“Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis” Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 83：7177-7181和Arnold(1993)“Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4：450-455)。 使用修复缺陷的宿主菌株的诱变记载在，例如，Carter等(1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl.Acids Res.13：4431-4443。通过总基因合成的诱 变记载在，例如，Nambiar等(1984)“Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223： 1299-1301。DNA改组记载在，例如，Stemmer(1994)“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370：389-391， 和Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution.” Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。
许多上面的方法另外记载在 Methods in Enzymology Volume 154 中，它还描述了有用的关于用各种诱变方法进行故障查找问题的控 制。还可以在商业上获得用于诱变、文库构建和其他多种产生方法的 试剂盒。例如，试剂盒可以购自，例如，Amersham International plc (Piscataway，NJ)(例如，使用上面的Eckstein方法)、Bio/Can Scientific(Mississauga，Ontario，加拿大)、Bio-Rad(Hercules， CA)(例如，使用上面的Kunkel方法)、Boehringer Mannheim Corp. (Ridgefield，Connecticut)、Clonetech Laboratories of BD Biosciences(Palo Alto，CA)、DNA Technologies(Gaithersburg， MD)、Epicentre Technologies(Madison，WI)(例如，5 prime 3 prime试剂盒)；Genpak Inc.(Stony Brook，New York)、Lemargo Inc (Toronto，加拿大)、Invitrogen Life Technologies(Carlsbad， California)、New England Biolabs(Beverly，MA)、Pharmacia Biotech(Peapack，New Jersey)、Promega Corp.(Madison，WI)、 QBiogene(Carlsbad，CA)和Stratagene(La Jolla，CA)(例如， QuickChangeTM定位诱变试剂盒和ChameleonTM双链的、定位诱变试 剂盒)。
确定序列关系
本发明的核酸和氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中提供的那些和其子序列，以及类似的序列。通过许多方法， 例如百分比同一性、杂交、免疫学地等，可以客观地确定类似的序列。 在本领域可以得到且众所周知许多用于确定2个或更多个序列之间 的关系(例如，同一性、相似性和/或同源性)的方法。这些方法包括 例如手工比对、计算机辅助的序列比对和其组合。可以普遍地得到用 于进行序列比对的许多算法(它们通常是计算机执行的)，或者可以 由技术人员生成。这些方法包括，例如，Smith和Waterman(1981) Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Pearson和Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444的相似性搜索方法； 和/或通过计算机执行这些算法(例如，GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0， Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)。
例如，使用BLAST算法进行序列同一性(和序列相似性)分析的软 件，记载在Altschul等(1990) J.Mol.Biol.215：403-410。该 软件可以公开地得到，例如，在ncbi.nlm.nih.gov环球网上从国家 生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)得到。该算法包含，首先通过识别查询序列的长度W 的短代码，当与数据库序列中的相同长度的的代码比对时，它会匹配 或满足一些正值阈值分数T，来识别出高得分序列对(HSP)。T是指临 近代码分数阈值。这些初始的临近代码命中结果，会起启动搜索的种 子的作用，以发现更长的含有它们的HSP。然后，沿着每个序列向两 个方向尽可能远地延伸代码命中结果，只要能增加累积比对分数即 可。对于核苷酸序列，使用参数M(对匹配残基对的奖励分数；总是 ＞0)和N(对错配残基的惩罚分数；总是＜0)，可以计算出累积分数。 对于氨基酸序列，使用分数矩阵来计算累积分数。当出现下述情况 时，停止每个方向的代码命中结果延伸：累积比对分数从它的最大实 现值减少了量X；由于一个或多个负-分数残基比对的累积，累积分 数达到0或以下；或者达到了每一序列的末端。BLAST算法参数W、T 和X决定了比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使 用下述默认值：代码长度(wordlength)(W)为11，期望值(E)为10， 截止值为100，M＝5，N＝-4和对比2条链。对于氨基酸序列，BLASTP (BLAST蛋白)程序使用下述默认值：代码长度(W)为3，期望值(E) 为10，和BLOSUM62分数矩阵(参见，Henikoff & Henikoff(1989) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
另外，BLAST算法能进行2个序列之间的相似性的统计学分析 (参见，例如，Karlin & Altschul(1993) Proc.Nat’l.Acad.Sci. uSA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和 概率(p(N))，后者能指示2个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配 的概率。例如，如果将测试核酸与参照核酸进行对比，得到的最小总 和概率小于约0.1或小于约0.01和或甚至小于约0.001，则认为该 核酸与参照序列相似(且，因此，在上下文中，同源的)。
有用的序列比对算法的另一个实例是PILEUP。PILEUP能使用累 进的、成对的比对，从一组相关序列中建立多个序列比对。它还可以 绘制树，其显示用于建立比对的聚类关系。PILEUP能使用Feng & Doolittle(1987) J.Mol.Evol.35：351-360的累进比对方法的简 化。使用的该方法类似于Higgins & Sharp(1989)CABIOS5：151-153 所述的方法。该程序可以比对，例如，最多达300个最大长度5,000 字母的序列。多重比对方法从2个最相似序列的成对比对开始，产生 一簇双比对序列。然后，可以将该聚簇与下一个最相关的序列或比对 的序列簇进行比对。通过简单延伸2个单个的序列的成对比对，可以 比对2簇序列。通过一系列累进的成对比对，可以实现最终的比对。 该程序也可以用于绘制树形图或聚类关系的树表示法。通过为序列对 比区域指定特定序列和它们的氨基酸或核苷酸坐标，可以运行该程 序。
适用于多重DNA或氨基酸序列比对的算法的其他实例是 CLUSTALW程序(Thompson，J.D.等(1994) Nucl.Acids.Res.22： 4673-4680)。CLUSTALW能在序列组之间进行多重成对的对比，并能 在同源性的基础上，将它们组装到多重比对中。缺口(Gap)开放和 缺口延伸惩罚可以分别是例如10和0.05。对于氨基酸比对，可以将 BLOSuM算法用作蛋白权重矩阵。参见，例如，Henikoff和Henikoff (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919。
核酸杂交
通过具有互补的或部分互补的多核苷酸序列的单链核酸(或其单 链区)之间的“杂交”，也可以评价本发明的ACC合酶核酸之间的相 似性。
杂交是核酸之间的物理关联的测量，所述的核酸一般在溶液中， 或者有一条核酸链固定化在固体支持体上，例如，膜、珠子、芯片、 过滤器等。在许多较好表征的物理化学力的基础上，例如氢键作用、 溶剂排斥、碱基堆积等，发生核酸杂交。许多核酸杂交方法是本领域 众所周知的。关于核酸杂交的广泛的指导，参见Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，part I， chapter 2，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”(Elsevier，New York)， 以及Ausubel等 Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2004)John Wiley & Sons，New York (“Ausubel”)；Sambrook等 Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(“Sambrook”)和Berger和Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)。 Hames和Higgins(1995) Gene Probes 1，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，England(Hames和Higgins 1)和Hames 和Higgins(1995) Gene Probes 2，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，England(Hames和Higgins 2)提供了DNA和RNA、 包括寡核苷酸的合成、标记、检测和定量的细节。
根据互补的和部分互补的核酸之间的理论解链温度(Tm)，选择了 适用于得到杂交、包括有差异的杂交的条件。在特定的一组条件下， 例如，溶剂组成、离子强度等，Tm是杂交核酸链之间的双链体发生50％ 变性时的温度。也就是说，Tm对应着与螺旋状向无规卷曲转变的中点 相对应的温度；对于长的核苷酸序列，它取决于多核苷酸的长度、核 苷酸组成和离子强度。
杂交后，可以通过系列洗涤去除未杂交的核酸，根据需要的结 果，可以调节它的严格性。低严格性洗涤条件(例如，使用更高的盐 和更低的温度)能提高灵敏度，但是可以产生非特异性的杂交信号和 高背景信号。更高严格性洗涤条件(例如，使用更低的盐和更高的接 近Tm的温度)能降低背景信号，一般主要保留特异性的信号。也参 见，Rapley，R.和Walker，J.M.编， Molecular Biomethods Handbook (Humana Press，Inc.1998)。
在核酸杂交实验的上下文中，例如DNA和RNA印迹杂交中，“严 格的杂交洗涤条件”或“严格的条件”是序列依赖性的，且在不同的环 境参数下是不同的。关于核酸杂交的广泛的指导，参见Tijssen (1993)，同上，和Hames和Higgins 1和Hames和Higgins 2，同上。
在DNA或RNA印迹中，在滤纸上进行的具有超过100个互补残基 的互补核酸杂交的严格杂交条件的实例是：2x SSC，50％甲酰胺，在 42℃，杂交过夜(例如，大约20小时)。严格的洗涤条件的实例是： 0.2xSSC在65℃洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见上面的 Sambrook)。通常，在低严格性洗涤以去除由于残余的未杂交的探针 形成的信号后，进行决定严格性的洗涤。低严格性洗涤的实例是2x SSC，在室温(例如，20℃，进行15分钟)。
通常，在特定的杂交测定中，是用不相关探针观察到的至少 2.5x-5x(且一般更高)的信噪比，能指示着特异性杂交的检测。在本 发明的上下文中，检测2个序列之间的最低严格的杂交，能指示着与 例如在本文的序列表中提供的ACC合酶的核酸的相对较强的结构相 似性。
为了本发明的目的，通常，将“高度严格的”杂交和洗涤条件选定 在比特定序列在给定的离子强度和pH的热解链温度(Tm)低约5℃或更 少(如下所述，在比较术语中也可以称作高度严格的条件)。在严格的 或高度严格的条件下，可以鉴别出与目标核苷酸序列(例如，“探针”) 密切相关或相同的靶序列。低严格性条件是与较低互补的序列相应 的。
例如，在确定严格的或高度严格的杂交(或甚至更严格的杂交)和 洗涤条件时，逐渐增加杂交和洗涤条件的严格性(例如，通过在杂交 或洗涤中，升高温度、降低盐浓度、升高去污剂浓度和/或升高有机 溶剂例如甲酰胺的浓度)，直到满足一组选择的标准。例如，逐渐增 加杂交和洗涤条件的严格性，直到包含一个或多个本发明的多核苷酸 序列(例如，选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10或 其子序列和/或其互补多核苷酸序列)的探针能结合完美匹配的互补 靶(同样，其是包含一个或多个选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6和 SEQ ID NO：10和其互补多核苷酸序列的核酸序列或子序列的核酸)， 根据需要，其信噪比是在探针与不匹配的靶的杂交中所观察到的信噪 比的至少2.5x，且任选地5x或10x或100x或更高。
使用源自能编码本发明的ACC合酶多肽的核酸的子序列，可以得 到新的靶核酸；这样的靶核酸也是本发明的一个特征。例如，这样的 靶核酸包括能在严格条件下与寡核苷酸探针杂交的序列，所述的寡核 苷酸探针对应着任一种本发明的多核苷酸的独特子序列，例如，SEQ ID NO：1-6、10或其互补序列；该探针任选地能编码任一种本发明 的多肽的独特子序列，例如，SEQ ID NO：7-9和11。
例如，选择杂交条件，在该条件下，与寡核苷酸探针完美互补的 靶寡核苷酸能与该探针杂交，其信噪比是靶寡核苷酸与阴性对照非互 补核酸杂交的信噪比的至少约5-10x。
通过提高杂交条件的严格性，可以实现更高的信噪比，从而得到 约15x、20x、30x、50x或更高的比率。具体信号取决于在相关测定 中使用的标记，例如，荧光标记、比色标记、放射性标记等。
载体、启动子和表达系统
本发明的核酸可以是众多形式中的任一种，例如表达盒、载体、 质粒或线性核酸序列。例如，载体、质粒、粘粒、细菌人工染色体 (BAC)、YAC(酵母人工染色体)、噬菌体、病毒和核酸片段可以包含 希望导入细胞中的ACC合酶核酸序列或其子序列。这些核酸构建体还 可以包含启动子、增强子、多接头、调节基因等。
因而，本发明还涉及，例如，包含本发明的多核苷酸的载体，整 合了本发明的载体的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明的多肽。
根据本发明的该方面，载体可以是，例如，质粒载体、单链或双 链的噬菌体载体、或单链或双链的RNA或DNA病毒载体。通过众所周 知的将DNA和RNA导入细胞中的技术，可以将这样的载体作为多核苷 酸、优选DNA导入细胞中。在噬菌体和病毒载体的情况下，通过众所 周知的感染和转导技术，还可以且优选地将载体作为包装的或包壳的 病毒导入细胞中。病毒载体可以是能复制的或复制缺陷的。在后一种 情况下，通常只能在互补宿主细胞中发生病毒繁殖。
在某些方面，在载体中优选的是，用于表达本发明的多核苷酸和 多肽的那些。通常，这样的载体包含对宿主中的表达有效的顺式作用 控制区，其可操作地连接到要表达的多核苷酸上。适当的反式作用因 子由宿主提供，由互补的载体提供，或由导入宿主后的载体自身提 供。
在该点上的某些优选的实施方案中，载体能提供优选的表达。这 样的优选的表达可以是诱导型的表达、时间限制的表达、或限于在某 些类型的细胞中占主要地位的表达、或上面的任意组合。在诱导型的 载体中特别优选的是，可以由容易操纵的环境因素(例如温度和营养 添加剂)诱导表达的载体。适用于本发明的该方面的许多载体，包括 在原核和真核宿主中使用的组成型的和诱导型的表达载体，是本领域 的技术人员众所周知的且常规使用的。这样的载体包括，除了别的以 外，染色体的、附加体的和病毒-衍生的载体，例如，源自细菌质粒、 噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(例 如杆状病毒、乳多空病毒例如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、 假狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体，和源自它们的组合的载体，例 如源自质粒和噬菌体遗传因子的那些，例如粘粒和噬粒和用于土壤杆 菌-介导的转化的二元载体。都可以用于根据本发明的该方面的表 达。
在植物中有功能的载体可以是源自土壤杆菌的二元质粒。这样的 载体能转化植物细胞。这些载体含有左和右边界序列，后者是整合进 宿主(植物)染色体中所必需的。最低限度时，在这些边界序列之间， 是要表达的基因(或本发明的其他多核苷酸序列)，一般在调节元件的 控制下。在一个实施方案中，还包括选择标记和报告基因。为了容易 地得到足够量的载体，可以使用允许在大肠杆菌(E.coli)中复制的 细菌起点。
作为实例，提供了下面的可以从商业上得到的载体。在载体中， 用于细菌中的优选的是，pQE70、pQE60和pQE-9，可以购自Qiagen； pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、 pNH18A、pNH46A，可以购自Stratagene；和ptrc99a、pKK223-3、 pKK233-3、pDR540、pRIT5，可以购自Pharmacia。在优选的真核载 体中，是pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可以购自Stratagene； 和pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，可以购自Pharmacia。有用的植物二 元载体包括BIN19和它的衍生物，可以购自Clontech。仅仅作为对 本领域的技术人员可以得到的用于根据本发明的该方面的许多市场 上销售的且众所周知的载体的说明，列出了这些载体。应当明白，在 本发明的该方面，可以使用适用于例如在宿主中导入、维持、繁殖或 表达本发明的多核苷酸或多肽的任何其他质粒或载体，下面更详细地 公开了其中的一些。
通常，表达构建体会含有转录起始和终止位点，且当该构建体能 编码多肽时，还在转录的区域中含有用于翻译的核糖体结合位点。由 构建体表达的成熟转录物的编码部分会在开始处包含翻译起始AUG， 和适当地位于要翻译的多肽末端的终止密码子。
另外，构建体可以含有控制区，其能调节以及造成表达。通常， 根据许多常用的方法，这样的区域会通过控制转录来运行，例如转录 因子、阻抑物结合位点和终止信号，除了别的以外。为了使翻译的蛋 白分泌进内质网的腔、壁膜间隙或胞外环境中，可以将适当的分泌信 号整合进表达的多肽中。这些信号可以是对多肽内源的，或者它们可 以是异源的信号。
通过将增强子序列插入载体中，可以增强高等真核生物对本发明 的DNA(例如，能编码多肽)的转录。增强子是DNA的顺式作用元件， 通常约10-300个碱基对，其能在特定的宿主细胞类型中起增强启 动子的转录活性的作用。增强子的实例包括SV40增强子，其位于在 碱基对100-270的复制起点的后侧(lateside)，巨细胞病毒早 期启动子增强子，在复制起点的后侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒增 强子。在本发明中用于增强导入的DNA片段的转录的其他增强子包 括，除了别的以外，病毒增强子，如在Odell等， Plant Mol.Biol. 10：263-72(1988)所述的35S启动子中的那些，和来自Fromm等， Plant Cell 1：977(1989)所述的冠瘿碱基因的增强子。增强子影响 包含在载体中的序列的表达的组织特异性和/或时间特异性。
终止区也能通过在适当点终止转录来促进有效表达。用于实现本 发明的有用的终止子包括但不限于，pinII(参见An等， Plant Cell 1(1)：115-122(1989))、glb1(参见Genbank登记号L22345)、gz (参见gzw64a终止子，Genbank登记号S78780)和来自土壤杆菌的 nos终止子。终止区可以关于启动子核苷酸序列是天然的，可以关于 目标DNA序列是天然的，或可以源自其他来源。例如，其他方便的终 止区可以从根癌土壤杆菌的Ti-质粒得到，例如章鱼肉碱合酶和胭脂 碱合酶终止区。也参见：Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262： 141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991) Genes Dev.5：141-149；Mogen等(1990) Plant Cell 2：1261-1272； Munroe等(1990)Gene 91：151-158；Ballas等1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等(1987)Nucleic Acids Res. 15：9627-9639。
在已知的适用于一般化的表达的真核启动子中，有CMV立即早期 启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病 毒LTR的启动子(例如劳斯肉瘤病毒(“RSV”)的那些)、金属硫蛋 白启动子(例如小鼠金属硫蛋白-I启动子)和各种植物启动子(例 如球蛋白-1)。当可以得到时，可以使用ACC合酶基因的天然启动子。 原核启动子的代表包括噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac、trp和 tac启动子，仅仅列举众所周知的启动子中的几个例子。
分离的或重组的整合了ACC合酶核酸的植物或植物细胞是本发明 的一个特征。基本上按照植物分子生物学领域的技术人员已知的许多 方式中的任一种，包括但不限于本文所述的方法，可以实现植物细胞 和原生质体的转化。参见，一般地， Methods in Enzymology，Vol. 153(Recombinant DNA Part D)Wu和Grossman(编)1987，Academic Press，在本文中引作参考。如本文所使用的，术语“转化”指，通过 导入核酸序列，例如，“异源的”、“外源的”或“外来的”核酸序列，改 变宿主植物的基因型。异源核酸序列不需要必须源自不同的来源，但 是在一定程度上，它已经存在于导入的细胞的外面。
除了Berger、Ausubel和Sambrook以外，关于植物细胞克隆、 培养和再生的有用的一般参考文献包括：Jones(编)(1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols--Methods in Molecular Biology，Volume 49 Humana Press Towata NJ；Payne等(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY(Payne)；和Gamborg和Phillips(编) (1995) Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)(Gamborg)。许多细胞培养基记载在Atlas 和Parks(编) The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL(Atlas)。关于植物细胞培养的其他信息， 可以在商业上得到的文献中找到，例如来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的 Life Science Reserch Cell Culture Catalogue  (1998)(Sigma-LSRCCC)和，例如，也来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的 Plant Culture Catalogue和附录(1997)(Sigma- PCCS)。关于植物细胞培养的其他细节，参见Croy，(编)(1993) Plant Molecular Biology Bios Scientific Publishers，Oxford，U.K。 也参见在本文中标题为“植物转化”的部分。
在本发明的一个实施方案中，制备了重组的载体，它包含一个或 多个适用于转化植物细胞的ACC合酶核酸或其子序列，例如，选自 SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10的。在另一个实施方 案中，方便地使用能编码需要的ACC合酶RNA或蛋白或其子序列(例 如，选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11)的核酸序 列，来构建可以导入需要的植物中的重组表达盒。在本发明的上下文 中，表达盒一般包含选择的ACC合酶核酸序列或子序列，其处于可操 作地连接到启动子序列和其他转录和翻译起始调节序列上的RNA构 型(例如，反义、有义、RNA沉默或干扰构型等)，所述序列足以指导 ACC合酶RNA构型序列在转化的植物的目标组织(例如，完整的植 株、叶子、花药、根等)中的转录。
通常，在植物的表达盒中使用的具体启动子取决于目标用途。众 多启动子中的任一种都可以是合适的。例如，可以将核酸与组成型 的、诱导型的、组织-特异性的(组织-优选的)或用于植物中表达的其 他启动子相组合。例如，可以有利地使用强或弱组成型的植物启动 子，其能指导ACC合酶RNA构型序列在所有植物组织中的表达。在 大多数环境条件和发育或细胞分化状态下，这样的启动子是有活性 的。组成型的启动子的实例包括根癌土壤杆菌的1′-或2′-启动子(参 见，例如，O′Grady(1995) Plant Mol.Biol.29：99-108)。其他植 物启动子包括核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶小亚基启动子、菜豆蛋白启 动子、醇脱氢酶(Adh)基因启动子(参见，例如，Millar(1996) Plant Mol.Biol.31：897-904)、蔗糖合酶启动子、(α-微管蛋白启动子、肌 动蛋白启动子，例如拟南芥肌动蛋白基因启动子(参见，例如，Huang (1997) Plant Mol.Biol.1997 33：125-139)、cab、PEPCase、R基 因复合物、来自拟南芥的ACTll(Huang等 Plant Mol.Biol. 33：125-139(1996))、来自拟南芥的Cat3(Zhong等， Mol.Gen. Genet.251：196-2O3(1996))、来自欧洲油菜(Brassica napus)的 能编码硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Solocombe等(1994) Plant Physiol.104：1167-1176)、来自玉米的GPc1(Martinez等 (1989) J.Mol.Biol 208：551-565)、来自玉米的Gpc2(Manjunath 等(1997)， Plant Mol.Biol.33：97-112)和来自技术人员已知的各 种植物基因的其他转录起始区。也参见Holtorf(1995)“Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana，” Plant Mol.Biol.29：637-646。也可以使用来自E8基因(参见，Deikman和 Fischer(1988) EMBO J 7：3315)和其他基因的启动子序列，以及对 单子叶物种特异性的启动子(例如，McElroy D.，等(1994.) Foreign gene expression in transgenic cereals. Trends Biotech.， 12：62-68)。其他组成型的启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心 启动子和WO 99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其他组成型 的启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985) Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等(1990) Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等(1989) Plant Mol. Biol.12：619-632和Christensen等(1992) Plant Mol. Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991) Theor.Appl.Genet. 81：581-588)；MAS(Velten等(1984) EMBO J.3：2723-2730)；ALS 启动子(美国专利号5,659,026)等。然而，其他的组成型的启动子包 括，例如，美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597； 5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。
除了本文指出的启动子外，在本发明中可以使用能在植物中运行 的细菌来源的启动子。它们包括，例如，章鱼肉碱合酶启动子、胭脂 碱合酶启动子和源自Ti质粒的其他启动子。参见，Herrera-Estrella 等(1983) Nature 303：209。也可以使用病毒启动子。病毒启动子的 实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S RNA启动子。参见， Odell等，(1985) Nature 313：810；和Dagless(1997) Arch.Virol. 142：183-191。来自能感染植物的病毒的组成型启动子的其他实例包 括烟草花叶病毒的启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动 子或玄参花叶病毒启动子，例如，玄参花叶病毒35S启动子(参见， 例如，Maiti(1997) Transgenic Res.6：143-156)，等。或者，通 过本领域已知的多种方法，包括序列分析、增强子或启动子捕获等， 可以从任意的病毒、细菌或植物来源鉴别出具有有用特征的新启动 子。
组织-优选的(组织-特异性的)启动子和增强子可以用于靶向特 定植物组织内的增强的基因表达。组织-优选的(组织-特异性的)启 动子包括，例如，记载在下述文献中的那些：Yamamoto等(1997) Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等(1997) Plant Cell Physiol. 38(7)：792-803；Hansen等(1997) Mol.Gen Genet. 254(3)：337-343；Russell等(1997) Transgenic Res. 6(2)：157-168；Rinehart等(1996) Plant Physiol. 112(3)：1331-1341；Van Camp等(1996) Plant Physiol. 112(2)：525-535；Canevascini等(1996) Plant Physiol. 112(2)：513-524；Yamamoto等(1994) Plant Cell Physiol. 35(5)：773-778；Lam(1994) Results Probl.Cell Differ. 20：181-196；Orozco等(1993) Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138； Matsuoka等(1993) Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590； 和Guevara-Garcia等(1993) Plant J.4(3)：495-505。如果需要， 可以修饰这样的启动子，以进行弱表达。
在某些实施方案中，可以使用叶子特异性的启动子，例如，来自 C4植物(玉米)的丙酮酸、正磷酸二激酶(PPDK)启动子，来自玉米 的cab-m1 Ca+2启动子，拟南芥(Arabidopsis thaliana)myb-相关 的基因启动子(Atmyb5)，核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)启动子(例如， 番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因，其在叶子和光-生长的幼苗中表 达，而RBCS1和RBCS2在发育中的番茄果实中表达，和/或核酮糖二 磷酸羧化酶启动子，其在叶片和叶鞘的叶肉细胞中几乎排它地高水平 地表达，等)等。参见，例如，Matsuoka等，(1993)Tissue-specific light-regulated expression directed by the promoter of a C4 gene，maize pyruvate，orthophosphate dikinase，in a C3 plant， rice， PNAS USA 90(20)：9586-90；(2000) Plant Cell Physiol. 41(1)：42-48；(2001) Plant Mol.Biol.45(1)：1-15；Shiina，T.等， (1997)Identification of Promoter Elements involved in the cytosolic Ca+2 mediated photoregulation of maize cab-m1 expression， Plant Physiol.115：477-483；Casal(1998) Plant Physiol.116：1533-1538；Li(1996)FEBS Lett.379：117-121；Busk (1997)Plant J.11：1285-1295；和Meier(1997)FEBS Lett. 415：91-95；和Matsuoka(1994) Plant J.6：311-319。其他叶子- 特异性的启动子包括，例如，Yamamoto等(1997) Plant J.12(2)： 255-265；Kwon等(1994) Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto 等(1994) Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等(1993) Plant J.3：509-18；Orozco等(1993) Plant Mol. Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka等(1993) Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90(20)：9586-9590。
在某些实施方案中，可以使用衰老特异性的启动子(例如，在果 实成熟、叶子衰老和脱落过程中有活性的番茄启动子，能编码半胱氨 酸蛋白酶的基因的玉米启动子，等)。参见，例如，Blume(1997) Plant J.12：731-746；Griffiths等，(1997)Sequencing，expression pattern and RFLP mapping of a senescence-enhanced cDNA from Zea Mays with high homology to oryzain gamma and aleurain， Plant Mol.Biol.34(5)：815-21；Zea mays partial seel gene for cysteine protease，promoter region and 5’coding region， Genbank AJ494982；Klebet-Janke，T.和Krupinska，K.(1997) Isolation of cDNA clones for genes showing enhanced expression in barley leaves during dark-induced senescence as well as during senescence under field conditions， Planta 203(3)： 332-40；和，Lee，RH等，(2001)Leaf senescence in rice plants： cloning and characterization of senescence up-regulated genes， J.Exp.Bot.52(358)：1117-21。
在其他的实施方案中，可以使用花药-特异性的启动子。这样的 启动子是本领域已知的，或者可以通过已知的技术发现；参见，例如， Bhalla和Singh(1999)Molecular control of male fertility in Br assica  Proc.10th  Annual Rapeseed Congress，Canberra， Australia；van Tunen等(1990)Pollen-and anther-specific chi promoters from petunia：tandem promoter regulation of the chiA gene. Plant Cell 2：393-40；Jeon等(1999)Isolation and characterization of an anther-specific gene，RA8，from rice (Oryza sativa L). Plant Molecular Biology 39：35-44；和Twell等 (1993)Activation and developmental regulation of an Arabidopsis anther-specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum. Sex.Plant Reprod.6：217-224。
根-优选的启动子是已知的，且可以从许多文献中可得到的启动 子中进行选择，或者从各种相容的物种中从新分离。参见，例如，Hire 等(1992) Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根-特异性的谷 氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991) Plant Cell 3(10)：1051-1061(在菜豆的GRP 1.8基因中的根-特异性的控制元 件)；Sanger等(1990) Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根癌土 壤杆菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根-特异性的启动子)；和Miao 等(1991) Plant Cell3(1)：11-22(能编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS) 的全长cDNA克隆，该酶在大豆的根和根瘤中表达)。也参见Bogusz等 (1990) Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮非豆科 植物Parasponia andersonii和有关的非-固氮非豆科植物山黄麻 (Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离出的2个根-特异性的启动 子。这些基因的启动子连接在β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因上，并导 入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)中，且在2种情况下，保持了根-特异性的启动子活 性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根土壤杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根-诱导 基因的启动子的分析(参见 Plant Science(Limerick)79(1)：69- 76)。他们认为，增强子和组织-优选的DNA决定簇在这些启动子中 是分离的。Teeri等(1989)使用与lacZ的基因融合显示，能编码章 鱼肉碱合酶的土壤杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中是特别有活性 的，TR2′基因在完整的植株中是根特异性的，且被叶子组织中的创伤 所刺激(参见，例如， EMBO J.8(2)：343-350)。融合到nptII(新霉 素磷酸转移酶II)上的TR1′基因表现出了类似的特征。其他的根- 优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等(1995) Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana等(1994) Plant Mol.Biol.25(4)：681-691。也参见，美国专利号5,837,876； 5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和 5,023,179。
“种子-优选的”启动子包括“种子-特异性的”启动子(在种子发育 过程中有活性的那些启动子，例如种子储存蛋白的启动子)以及“种子 -发芽”启动子(在种子发芽过程中有活性的那些启动子)。参见，例 如，Thompson等(1989) BioEssays 10：108，其在本文中引作参考。 这样的种子-优选的启动子包括但不限于，Cim1(细胞分裂素-诱导的 信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸 合酶)；mZE40-2，也称作Zm-40(美国专利6,403,862)；nuc1c(美 国专利6,407,315)；和celA(纤维素合酶)(参见WO 00/11177)。γ- 玉米醇溶蛋白是胚乳-特异性的启动子。Glob-1是胚-特异性的启动 子。对于双子叶植物，种子-特异性的启动子包括但不限于，豆β-菜 豆蛋白、napin、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、cruciferin等。对 于单子叶植物，种子-特异性的启动子包括但不限于，玉米15kDa玉 米醇溶蛋白启动子、22kDa玉米醇溶蛋白启动子、27kDa玉米醇溶 蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、27kDγ-玉米醇溶蛋白启动子 (例如gzw64A启动子，参见Genbank登记号S78780)、waxy启动子、 shrunken 1启动子、shrunken 2启动子、球蛋白1启动子(参见 Genbank登记号L22344)、ltp2启动子(Kalla，等，Plant Journal 6：849-860(1994)；美国专利5,525,716)、cim1启动子(参见美国专 利6,225,529)、玉米end1和end2启动子(参见美国专利6,528,704 和2002年12月4日提交的申请10/310,191)；nuc1启动子(美国专 利6,407,315)；Zm40启动子(美国专利6,403,862)；eep1和eep2； lec1(美国专利申请09/718,754)；硫氧还蛋白H启动子(美国临时 专利申请60/514,123)；mlip15启动子(美国专利6,479,734)；PCNA2 启动子；和shrunken-2启动子。(Shaw等，Plant Phys 98：1214-1216， 1992；Zhong Chen等，PNAS USA 100：3525-3530，2003)。但是， 本领域的技术人员知道可以用于实现本发明的其他启动子，例如 nucellain启动子(参见C.Linnestad，等，Nucellain，A Barley Homolog of the Dicot Vacuolar-Processing Proteasem Is Localized in Nucellar Cell Walls， Plant Physiol.118：1169- 80(1998)、kn1启动子(参见S.Hake和N.Ori，The Role of knottedl in Meristem Functions，B8：INTERACTIONS AND INTERSECTIONS IN PLANT PATHWAYS，COEUR D′ALENE，IDAHO， KEYSTONE SYMPOSIA，FEBRUARY 8-14，1999，at 27.)和F 3.7启动子 (Baszczynski等，Maydica 42：189-201(1997))，等。在某些实施 方案中，空间地起作用的启动子例如glb1，其是胚-优选的启动子； 或γ玉米醇溶蛋白，胚乳-优选的启动子；或在胚-周围区域有活性的 启动子(参见2004年2月25日提交的美国专利申请10/786,679)或 BETLl(参见G.Hueros，等，Plant Physiology 121：1143-1152(1999) 和Plant Cell 7：747-57(June 1995))，是有用的，包括优先在雌 性生殖组织中有活性的启动子，和在分生组织中、特别是在分生组织 的雌性生殖组织中有活性的那些。也参见，WO 00/12733，其中公开 了来自end1和end2基因的种子-优选的启动子。
组织-特异性的启动子可以驱动靶组织以外的组织中的可操作地 连接的序列的表达。因而，如本文所使用的，组织-特异性的启动子 是能驱动优先在靶组织中的表达的启动子，但是也可以导致在其他组 织中的一些表达。
本发明也预期使用时间上-起作用的启动子。例如，可以选择在 授粉后0-25天(DAP)、4-21、4-12或8-12DAP起作用的启动子，例 如，cim1和ltp2等启动子。也可以使用在授粉后-14至0天起作用 的启动子，例如SAG12(参见WO 96/29858，Richard M.Amasino， 1996年10月3日公开)和ZAG1或ZAG2(参见R.J.Schmidt，等， Identification and Molecu1ar Characterization of ZAG1，the Maize Homolog of the Arabidopsis Floral Homeotic Gene AGAMOUS， Plant-Cell5(7)：729-37(July 1993))。其他有用的启动子包括玉 米zag2.1、Zap(也称作ZmMADS；美国专利申请10/387,937；WO 03/078590)；和玉米tb1启动子(也参见Hubbarda等，Genetics 162：1927-1935，2002)。
当ACC合酶RNA构型核酸的超表达对植物是有害的时，技术人员 能够认识到，可以使用弱组成型的启动子，以进行低水平的表达(或 者，在某些实施方案中，可以使用诱导型的或组织-特异性的启动 子)。在高水平的表达对植物无害的那些情况下，可以使用强启动子， 例如，t-RNA或其他pol III启动子或强pol II启动子(例如，花椰 菜花叶病毒启动子，CaMV，35S启动子)。
当需要低水平表达时，可以使用弱启动子。通常，“弱启动子”意 指能驱动编码序列以低水平表达的启动子。低水平是指，在约1/1000 转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平。或者， 应当认识到，弱启动子也包括能驱动仅仅在少数细胞中表达、且在其 他细胞中不表达的启动子，以产生较低的总表达水平。当启动子驱动 不可接受的高水平表达时，可以缺失或修饰部分启动子序列，以降低 表达水平。这样的弱组成型的启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核 心启动子(WO 99/43838和美国专利号6,072,050)、核心35S CaMV 启动子等。
在本发明的某些实施方案中，可以使用诱导型的启动子。例如， 植物启动子可以在环境控制下。这样的启动子称作“诱导型的”启动 子。可以改变诱导型启动子进行的转录的环境条件的实例包括病原体 攻击、厌氧条件、高温和光的存在。例如，本发明包括干旱-诱导型 的玉米的启动子(Busk(1997) Plant J.11：1285-1295)；冷、干旱、 高盐诱导型的来自马铃薯的启动子(Kirch(1997) Plant Mol. Biol.33：897-909)等。
病原体-诱导型的启动子来自致病原因-相关蛋白(PR蛋白)的那 些，它们在感染病原体后被诱导；例如，PR蛋白，SAR蛋白、β-1，3- 葡聚糖酶、几丁质酶，等。参见，例如，Redolfi等(1983) Neth.J. Plant Pathol.89：245-254；Uknes等(1992) Plant Cell 4：645-656； 和Van Loon(1985) Plant Mol.Virol.4：111-116。也参见1999 年2月25日提交的标题为“Inducible Maize Promoters”的美国专利 申请系列号09/257,583。
令人感兴趣的是，能在病原体感染部位或其附近表达的启动子。 参见，例如，Marineau等(1987) Plant Mol.Biol.9：335-342； Matton等(1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch等(1986) Proc.Natl.Acad.Sci. 83：2427-2430；Somsisch等(1988) Mol.Gen.Genet.2：93-98； 和Yang(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.93：14972-14977。也参见， Chen等(1996) Plant J.10：955-966；Zhang等(1994) Proc.Natl. Acad.Sci.91：2507-2511；Warner等(1993) Plant J.3：191-201； Siebertz等(1989) Plant Cell 1：961-968；美国专利号5,750,386 (线虫-诱导型的)；和其中引用的参考文献。特别令人感兴趣的是，玉 米PRms基因的诱导型的启动子，它的表达由病原体串珠镰孢 (Fusarium moniliforme)所诱导(参见，例如，Cordero等(1992) Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。
另外，由于病原体通过创伤或昆虫破坏找到进入植物的入口，所 以可以使用创伤-诱导型的启动子来设计本发明。这样的创伤-诱导型 的启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990) Ann. Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等(1996) Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148； win1和win2(Stanford等(1989) Mol.Gen.Genet.215：200-208)； 系统素(McGurl等(1992) Science 225：1570-1573)；WIP1 (Rohmeier等(1993) Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等 (1993) FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok等(1994) Plant J.6(2)：141-150)；等。
或者，可以使用在暴露于植物激素(例如生长素)后诱导型的植 物启动子来表达本发明的多核苷酸。例如，本发明可以使用来自大豆 (Glycine max L.)的生长素-响应元件E1启动子子序列(AuxREs) (Liu(1997) Plant Physiol.115：397-407)；生长素-响应的拟南 芥GST6启动子(也对水杨酸和过氧化氢有响应)(Chen(1996) Plant J.10：955-966)；来自烟草的生长素-诱导型的parC启动子；植物 生物素响应元件(Streit(1997) Mol.Plant Microbe Interact. 10：933-937)；和对应激激素脱落酸有响应的启动子(Sheen(1996) Science 274：1900-1902)。
还可以使用在暴露于化学试剂后诱导型的植物启动子来表达本 发明的多核苷酸，所述的化学试剂可以应用于植物，例如除草剂或 抗生素。根据目的，启动子可以是化学试剂-诱导型的启动子，其中 化学试剂的应用会诱导基因表达，或化学试剂-阻抑型启动子，其中 化学试剂的应用会抑制基因表达。例如，可以使用玉米In2-2启动 子，它由苯磺酰胺除草剂安全剂活化(De Veylder(1997) Plant Cell Physiol.38：568-577)；不同的除草剂安全剂的应用，会诱导不同的 基因表达模式，包括在根、排水器和茎干顶端分生组织中的表达。ACC 合酶编码序列或RNA构型也可以在例如四环素-诱导型的和四环素- 阻抑型的启动子的控制下(参见，例如，Gatz等(1991) Mol.Gen. Genet.227：229-237；美国专利号5,814,618和5,789,156；和 Masgrau(1997) Plant J.11：465-473(描述了含有燕麦(Avena sativa L.)(燕麦)精氨酸脱羧酶基因和四环素-诱导型的启动子的 转基因烟草植物)；或，水杨酸-响应元件(Stange(1997) Plant J. 11：1315-1324。其他化学试剂-诱导型的启动子是本领域已知的，且 包括但不限于，玉米GST启动子，它能被用作出土前的除草剂的疏水 的亲电子的化合物活化，和烟草PR-la启动子，它能被水杨酸活化。 其他的令人感兴趣的化学试剂-调节的启动子包括类固醇-响应的启 动子(参见，例如，Schena等(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis等(1998) Plant J.14(2)：247-257) 中的糖皮质激素-诱导型的启动子。
还可以使用与除草剂耐受性和相关表型有关的基因的内源启动 子，来驱动ACC合酶RNA构型核酸的表达，例如，P450单加氧酶、 谷胱甘肽-S-转移酶、高谷胱甘肽-S-转移酶、草甘膦氧化酶和5-烯 醇丙酮莽草酸-2-磷酸合酶。例如，当需要在特定条件下启动表达时， 可以使用附着到本发明的多核苷酸上的植物启动子，所述的条件例如 干旱条件、短期生长条件、密度等。
还可以使用组织特异性的启动子来指导本发明的多核苷酸的表 达，包括ACC合酶RNA构型核酸，从而使本发明的多核苷酸仅仅在 某些组织或发育阶段中表达，例如，叶子、花药、根、茎干等。组织 特异性的表达可以是有利的，例如，当需要在某些组织中表达多核苷 酸而又不需要在其他组织中表达时。组织特异性的启动子是仅仅在特 定细胞或者组织中、在植物发育过程中的特定时间有活性的转录控制 元件，例如在营养组织或生殖组织中。在发育控制下的组织-特异性 的启动子的实例包括仅仅(或主要是仅仅)在某些组织中启动转录的 启动子，例如营养组织，例如根或叶子，或生殖组织，例如果实、胚 珠、种子、花粉、pistols、花或任意的胚组织。生殖组织-特异性的 启动子可以是，例如，花药-特异性的、胚珠-特异性的、胚-特异性 的、胚乳-特异性的、珠被-特异性的、种子和种皮-特异性的、花粉- 特异性的、花瓣-特异性的、萼片-特异性的或它们的一些组合。
应当明白，许多未提及的启动子也适用于本发明的该方面，它们 是技术人员熟知的，且能由技术人员以本文的讨论和实施例所述的方 式容易地使用。例如，本发明包括，在适当时，在重组环境中使用天 然的ACC合酶启动子来驱动酶(或ACC合酶多核苷酸序列或子序列的) 的表达。
在制备本发明的表达载体时，可以任选地使用除了与内源的ACC 合酶基因、mRNA或多肽序列或其子序列有关的序列之外的序列。例 如，还可以包含其他的调节元件，例如内含子、前导序列、聚腺苷酸 化区、信号/定位肽等。
包含本发明的多核苷酸的载体还可以包含标记基因，后者能赋予 植物细胞选择表型。例如，标记可以编码杀生物剂耐受性，尤其是抗 生素耐受性，例如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的耐受性， 或除草剂耐受性，例如对氯磺隆(chlorosulfuron——或 phophinothricin的耐受性。可以使用用于通过可视的反应产物(例 如，β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶)或通过 直接观察基因产物本身(例如，绿色荧光蛋白，GFP；Sheen等(1995) The Plant Journal 8：777)来监控基因表达和蛋白定位的报告基因， 例如用于监控植物细胞中的瞬时基因表达。
用于繁殖和表达的载体通常会包含选择标记。这样的标记也可以 适用于扩增，或者该载体可以含有用于该目的其他标记。在这点上， 表达载体优选地含有一个或多个选择标记基因，以提供用于选择转化 的宿主细胞的表型性状。优选的标记包括：对于真核细胞培养，是二 氢叶酸还原酶或新霉素抗性；对于培养大肠杆菌和其他原核生物，是 四环素或氨苄青霉素抗性基因。卡那霉素和除草剂抗性基因(PAT和 BAR)通常用于植物系统。
使用物理上临近导入的DNA片段的选择标记基因，能通过阳性遗 传选择或筛选，回收转化的细胞。选择标记基因还能对转基因植物群 体维持选择压力，以确保转基因植物能保持导入的DNA片段和它对启 动子和增强子的控制。
已经从细菌中分离了许多常用的用于植物转化的阳性选择标记 基因，且所述基因能编码代谢地解毒选择性的化学试剂(可以是抗生 素或除草剂)的酶。其他的阳性选择标记基因能编码改变的对抑制剂 不敏感的靶。
用于植物转化的选择标记基因的实例是BAR或PAT基因，它与选 择试剂双丙氨酰膦一起使用(Spencer等，J. Theor.Appl’d Genetics 79：625-631(1990))。另一种有用的选择标记基因是从Tn5 分离的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，当置于植物调节信号控 制下时，它能赋予对卡那霉素的抗性(Fraley等， Proc.Nat′lAcad. Sci.(USA)80：4803(1983))。能赋予对抗生素潮霉素的抗性的潮霉 素磷酸转移酶基因是有用的选择标记的另一个实例(Vanden Elzen等， Plant Mol.Biol.5：299(1985))。能赋予对抗生素的抗性的细菌来 源的其他阳性选择标记基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转 移酶、氨基糖苷-3′-腺苷酰转移酶和博来霉素抗性决定簇(Hayford 等， Plant Physiol.86：1216(1988)；Jones等， Mol.Gen.Genet. 210：86(1987)；Svab等， Plant Mol.Biol.14：197(1990)；Hille 等， Plant Mol.Biol.7：171(1986))。
用于植物转化的其他阳性选择标记基因不是细菌来源的。这些基 因包括小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶和 植物乙酰乳酸合酶(Eichholtz等， Somatic Cell Mol.Genet. 13：67(1987)；Shah等， Science 233：478(1986)；Charest等， Plant Cell Rep.8：643(1990))。合适的选择标记基因的其他实例 包括但不限于能编码对下述物质的抗性的基因：氯霉素，Herrera Estrella等(1983)EMBO J.2：987-992；氨甲蝶呤，Herrera Estrella等(1983)Nature 303：209-213；Meijer等(1991) Plant Mol.Biol.16：807-820；潮霉素，Waldron等(1985) Plant Mol. Biol.5：103-108；Zhijan等(1995) Plant Science108：219-227； 链霉素，Jones等(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91；壮观霉 素，Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.5：131-137；博 来霉素，Hille等(1990) Plant Mol.Biol.7：171-176；磺胺， Guerineau等(1990) Plant Mol.Biol.15：127-136；溴苯腈， Stalker等(1988)Science 242：419-423；草甘膦，Shaw等(1986) Science 233：478-481；膦丝菌素，DeBlock等(1987)EMBO J. 6：2513-2518。
另一类有用的用于DNA序列进行植物转化的标记基因需要筛选 推定转化的植物细胞，而不是直接遗传地选择转化的细胞对毒性物质 例如抗生素的抗性。这些基因特别适用于定量或观察DNA序列在特定 组织中的空间表达特征，且经常被称作报告基因，因为它们可以融合 到用于研究基因表达的基因或基因调节序列上。常用的用于筛选推定 转化的细胞的基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、萤 光素酶和氯霉素乙酰转移酶(Jefferson， Plant Mol.Biol.Rep. 5：387(1987)；Teeri等， EMBO J.8：343(1989)；Koncz等， Proc. Nat′l Acad.Sci.(USA)84：131(1987)；De Block等， EMBO J. 3：1681(1984))。可以在下述文献中发现本领域已知的其他合适的报 告基因的实例，例如：Jefferson等(1991)in Plant Molecular Biology Manual，ed.Gelvin等(Kluwer Academic Publishers)， 第1-33页；DeWet等(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737；Goff 等(1990)EMBO J.9：2517-2522；Kain等(1995)BioTechniques 19：650-655；和Chiu等(1996)Current Biology 6：325-330。用于 鉴别相对罕见的转化事件的另一个方案是，使用能编码玉蜀黍花色素 苷色素形成途径的显性的组成型调节剂的基因(Ludwig等， Science 247：449(1990))。
通过任一种众所周知的且常规的技术，可以将适当的DNA序列插 入载体中。通常，通过用一种或多种限制性内切核酸酶切割DNA序列 和表达载体，然后用T4DNA连接酶将限制片段连接到一起，可以将 用于表达的DNA序列连接到表达载体中。可以以正向或反向插入序 列。可以用于该目的的限制和连接方法，是技术人员众所周知的和常 规的。在Sambrook等，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL， 第2版；ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， New York(1989)中，非常详细地阐述了关于这一点的合适方法和使 用替代技术构建表达载体的方法，这也是技术人员众所周知的和常规 的。
通常，使用标准技术，将能任选地编码本发明的多肽的异源结构 序列的本发明的多核苷酸插入载体中，从而使它可操作地连接到表达 启动子上(如本文所使用的，可操作地连接包括指启动子和第二个序 列之间的功能连接，其中启动子序列能启动和介导与第二个序列对应 的DNA的转录。通常，可操作地连接指要连接的核酸序列是邻接的， 在必需连接2个蛋白编码区时，是邻接的且在相同的阅读框中)。当 多核苷酸用于表达多肽时，可以安排多核苷酸的位置，从而使转录起 点适当地位于核糖体结合位点的5′。核糖体结合位点是在AUG的5′， 该AUG能启动要表达的多肽的翻译。通常，不会存在以起始密码子(通 常是AUG)开始、且位于核糖体结合位点和起始密码子之间的其他可 读框。此外，通常，在多肽的末端会存在翻译终止密码子，且在用于 真核宿主的构建体中，会存在多腺苷酸化信号。在多核苷酸构建体 中，还可以包含适当地布置在转录区的3′端的转录终止信号。
对于设计用于表达多肽的核酸构建体，表达盒可以另外含有5’前 导序列。这样的前导序列可以起增强翻译的作用。翻译前导序列是本 领域已知的，且包括：小RNA病毒前导序列，例如：EMCV前导序列(脑 心肌炎5’非编码区)，Elroy-Stein等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci. USA 86：6126-6130；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV先导物(烟 草蚀纹病毒)，Allison等(1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)， Virology 154：9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak等 (1991)Nature 353：90-94；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未 翻译的前导序列(AMV RNA 4)，Jobling等(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，Gallie等(1989) Molecular Biology of RNA，第237-256页；和玉米褪绿斑驳病毒前 导序列(MCMV)Lommel等(1991)Virology 81：382-385。也参见 Della-Cioppa等(1987)Plant Physiology 84：965-968。该盒还 可以含有能增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。表达盒 一般还在分离的目标核苷酸序列的3’末端包含翻译终止区，例如，在 植物中有功能的翻译终止区。
在需要使分离的核苷酸序列的表达产物指向特定的细胞器(尤其 是质体、造粉体)或内质网或分泌到细胞表面或细胞外的情况下，表 达盒还可以包含运输肽的编码序列。这样的运输肽是本领域众所周知 的，且包括但不限于：酰基载体蛋白的运输肽、核酮糖二磷酸羧化酶 -加氧酶的小亚基、植物EPSP合酶等。
在制备表达盒时，可以操纵多种DNA片段，以提供适当方向的DNA 序列，且如果适当，在适当的阅读框中。为此目的，可以使用连接物 或接头来连接DNA片段，或者可以包含其他操作，以提供方便的限制 位点，去除多余的DNA，去除限制位点等。为此目的，可以包含体外 诱变、引物修复、限制酶切消化、退火和重新取代，例如转换和颠换。
如本文所指出的，本发明提供了能表达处于调节元件控制下的目 标基因的载体。通常，载体应当在植物细胞中是有功能的。有时，优 选地使用在其他宿主细胞中有功能的载体，例如，在大肠杆菌中(例 如，用于生产蛋白来得到抗体、DNA序列分析、构建插入片段或得到 核酸的量)。在Sambrook等(同上)中，讨论了用于在大肠杆菌中克 隆和表达的载体和方法。
在表达盒中包含可操作地连接到分离的核苷酸序列上的本发明 的启动子的转化载体，还可以含有至少一个其他的要共同转化进生物 中的基因的核苷酸序列。或者，可以在另一个转化载体上提供其他序 列。
使用许多众所周知的适于表达需要的RNA和/或多肽的技术，可 以将载体导入适当的宿主中，所述的载体含有本文其他地方所述的适 当的DNA序列、以及适当的启动子和其他适当的控制序列。本发明还 涉及含有上述的构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞例 如植物细胞，或低等真核细胞例如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核 细胞例如细菌细胞。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子 脂类-介导的转染、电穿孔、转导、scrape loading、冲击导入、感 染或其他方法，可以实现构建体向宿主细胞中的导入。许多标准的实 验室手册描述了这样的方法，例如Davis等，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，(1986)和Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。
适当的宿主的代表性的实例包括细菌细胞，例如链球菌、葡萄球 菌、大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉 属(Aspergillus)细胞；昆虫细胞例如果蝇(Drosophila)S2和灰 翅夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS和Bowes 黑素瘤细胞；和植物细胞。植物细胞可以源自广范围的植物种类，尤 其是单子叶植物，例如禾本科的物种，包括高粱(Sorghum bicolor) 和玉蜀黍，以及双子叶植物，例如大豆和低芥酸菜子(欧洲油菜、芜 菁(Brassica rapa ssp.))。优选地，植物包括玉米、大豆、向日 葵、红花、低芥酸菜子、小麦、大麦、黑麦、苜蓿、稻、燕麦、草坪 草和高粱；但是，本发明的分离的核酸和蛋白可以用于来自下述属的 物种：凤梨属(Ananas)、金鱼草属(Antirrhinum)、拟南芥属 (Arabidopsis)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠 茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、 Browaalia、山茶属(Camellia)、辣椒属(Capsicum)、Ciahorium、 柑橘属(Citrus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Cofea)、Cucumis(香 瓜属)、南瓜属(Cucurbita)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、 毛地黄属(Digitalis)、榕属(Ficus)、草莓属(Fragaria)、老鹳 草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵 属(Helianthus)、Heterocallis、大麦属(Hordeum)、天仙子属 (Hyoscyamus)、番薯属(Ipomoea)、胡桃属(Juglans)、莴苣属 (Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、Lotus(百脉 根属)、番茄属(Lycopersicon)、Majorana、杧果属(Mangifera)、 木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、芭蕉属(Musa)、Nemesis、 烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、驴食草属(Onobrychis)、 稻属(Oryza)、Panieum、天竺葵属(Pelargonium)、狼尾草属 (Pennisetum)、鳄梨属(Persea)、碧冬茄属(Petunia)、菜豆属 (Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、番石榴属(Psidium)、毛莨属 (Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、蔷薇属(Rosa)、Salpiglossis、 黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、茄属(Solanum)、白芥属 (Sinapis)、高粱属(Sorghum)、可可树属(Theobroma)、小麦属 (Triticum)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇 豆属(Vigna)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属，以及许多其他的实例(例 如，在本文中指出的其他属)。
本发明的启动子区可以分离自任意的植物，包括但不限于，玉米 (玉米；玉蜀黍)、低芥酸芥子(欧洲油菜、芜菁)、苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(普 通小麦(Triticum aestivum))、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutm))、甘薯(番薯 (Ipomoea batatus))、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑橘树 (Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、 香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Petsea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(杧果(Mangifera indica))、橄榄(油橄榄(Olea europaea))、燕麦、大麦、蔬菜、 观赏植物和针叶树。优选地，植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、 低芥酸芥子、小麦、大麦、黑麦、苜蓿、稻、燕麦、草坪草和高粱。
许多表达构建体的宿主是众所周知的，且本公开内容能使技术人 员容易地选择用于表达根据本发明的该方面的多肽的宿主。
可以在常规的营养培养基中培养工程化的宿主细胞，在适当时， 可以改良该培养基，以用于除了别的以外活化启动子、选择转化体或 扩增基因。通常，如本领域的技术人员会明白的，以前与选择的用于 表达的宿主细胞一起使用的培养条件，例如温度、pH等，也适用于 表达本发明的核酸和/或多肽。
可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或处于适当启动子控制下的其 他细胞中，表达成熟的蛋白。还可以使用无细胞的翻译系统，以使用 源自本发明的DNA构建体的RNA，来生产这样的蛋白。
在转化合适的宿主株、并使宿主株生长至适当的细胞密度(这时 选择的启动子是诱导型的)后，通过适当的方式(例如，温度变动或 暴露于化学诱导物)进行诱导，并另外培养细胞一段时间。
然后，一般通过离心收获细胞，通过物理的或化学的方式破坏， 并保留得到的粗提物用于进一步纯化。通过任一种方便的方法，包括 冷冻-融化循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂，可以破坏 用于表达蛋白的微生物细胞；这样的方法是本领域的技术人员众所周 知的。
抑制乙烯生产的方法
本发明还提供了抑制植物中的乙烯生产的方法(和通过这样的方 法生产的植物)。例如，抑制乙烯生产的方法包含灭活植物中的一个 或多个ACC合酶基因，其中一个或多个ACC合酶基因能编码一种或多 种ACC合酶。一般，一种或多种ACC合酶中的至少一种与SEQ ID NO：7 (pACS2)、SEQ ID NO：8(pACS6)、SEQ ID NO：9(pAC7)或SEQ ID NO：11 (pCCRAl78R)具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的同一 性。
反义、有义、RNA沉默或干扰构型
通过导入和表达能编码一种或多种ACC合酶或其子序列和启动子 的转基因序列，例如，反义或有义构型或RNA沉默或干扰构型等，由 此与对应的对照植物(例如，它的非-转基因的亲本或相同物种的非- 转基因的植物)相比、灭活一个或多个ACC合酶基因，可以灭活一个 或多个ACC合酶基因。也参见标题为“本发明的多核苷酸”的部分。 通过多种技术，包括但不限于，例如，电穿孔、微粒轰击、土壤杆菌 -介导的转移或其他可得到的方法，可以导入至少一个多核苷酸序 列。也参见，本文中的标题为“植物转化”的部分。在本发明的某些方 面，将多核苷酸以有义方向或反义方向连接到启动子上，或设置用于 RNA沉默或干扰。
在某些情况下，可以优选地沉默或下调某些基因，例如ACC合酶 基因。描述了依赖于同源性的基因沉默的应用的相关文献包括： Jorgensen， Trends Botechnol.8(12)：340-344(1990)；Flavell， Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)91：3490-3496(1994)；Finnegan等， Bio/Technology 12：883-888(1994)；Neuhuber等， Mol.Gen. Genet.244：230-241(1994)；Flavell等(1994)Proc.Nal.Acad. Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等(1996) Plant Mol. Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001) Plant Physiol. 126：930-938；Broin等(2002) Plant Cell 14：1417-1432； Stoutjesdijk等(2002) Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等 (2003)Phytochemistry 63：753-763；和美国专利号5,034,323、 5,283,184和5,942,657。或者，进行基因沉默的另一种方案可以是 使用反义技术(Rothstein等in  Plant Mol.Cell.Biol.6：221- 246(1989)；Liu等(2002) Plant Physiol.129：1732-1743和美 国专利号5,759,829和5,942,657。
反义核酸的应用是本领域众所周知的。反义核酸具有与靶核酸互 补的区域，所述的靶核酸例如，ACC合酶基因、mRNA或cDNA。反义 核酸可以是RNA、DNA、PNA或任何其他的适当的分子。反义序列和它 的互补有义序列之间可以形成双链体，从而导致基因的失活。反义核 酸可以通过与从基因转录的RNA形成双链体、通过与双链体DNA形 成三链体等，来抑制该基因表达。通过许多非常确定的技术(例如， 反义RNA或寡核苷酸(任选地包括修饰的核苷酸和/或连接，其能提 高对降解的抗性或改善细胞摄入)的化学合成或体外转录)，可以生产 反义核酸，例如，针对ACC合酶基因的。反义核酸和它们的应用记载 在，例如，Haselton和Alexander(June 5，2001)的美国专利 6,242,258，其标题为“Methods for the selective regulation of DNA and RNA transcription and translation by photoactivation”； 美国专利6,500,615；美国专利6,498,035；美国专利6,395,544；美 国专利5,563,050；E.Schuch等(1991) Symp Soc.Exp Biol 45：117-127；de Lange等，(1995) Curr Top Microbiol Immunol 197：57-75；Hamilton等(1995) Curr Top Microbiol Immunol 197：77-89；Finnegan等，(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93：8449-8454；Uhlmann和A.Pepan(1990)， Chem.Rev.90：543； P.D.Cook(1991)， Anti-Cancer Drug Design 6：585；J.Goodchild， Bioconjugate Chem.1(1990)165；和S.L.Beaucage和R.P.Iyer (1993)， Tetrahedron 49：6123；和F.Eckstein，Ed.(1991)， Oligonucleotides and Analogues--A Practical Approach，IRL Press。
还可以使用催化性的RNA分子或核酶来抑制ACC合酶基因的表 达。可以设计核酶，后者能特异性地与实际上任意的靶RNA配对，并 在特定位置切割磷酸二酯主链，从而在功能上灭活靶RNA。在进行该 切割时，核酶自身没有改变，并因而能再循环和切割其他分子。将核 酶序列包含在反义RNA中，能提供依赖它们的RNA-切割活性，从而 增强构建体的活性。
已经鉴别出了许多种类的核酶。例如，一类核酶源自许多能在植 物中自我切割和复制的小环状RNA。该RNA可以单独复制(类病毒 RNA)，或者与辅助病毒(卫星RNA)一起复制。RNA的实例包括来自鳄 梨白斑类病毒的RNA和来自下述病毒的卫星RNA：烟草环斑病毒、紫 花苜蓿易过性条纹病毒、绒毛烟斑驳病毒、茄属植物斑驳病毒和地三 叶草斑驳病毒。已经描述了靶RNA-特异性的核酶的设计和应用。参 见，例如，Haseloff等(1988) Nature，334：585-591。
通过抑制表达来灭活ACC合酶基因的另一种方法是通过有义抑 制。已经显示，导入表达盒，其中将核酸设计成相对于启动子是有义 方向，是阻滞需要的靶基因的转录的有效方法。参见，例如，Napoli 等(1990)， The Plant Cell 2：279-289，和美国专利号5,034,323、 5,231,020和5,283,184。
使用RNA沉默或干扰(RNAi)，其也可以称作转录后的基因沉默 (PTGS)或共抑制，也可以生产分离的或重组的包含一个或多个失活的 ACC合酶基因的植物。在本发明的上下文中，“RNA沉默”(也称作RNAi 或RNA-介导的干扰)指任何机理，细胞中存在的单链的或一般双链的 RNA通过该机理导致靶基因表达的抑制，所述的靶基因包含与RNA序 列相同或几乎相同的序列，这包括但不限于，RNA干扰，抑制从靶基 因转录的靶mRNA的翻译、而不改变mRNA的稳定性，和转录沉默(例 如，组蛋白乙酰化和异染色质形成，其会导致靶mRNA的转录的抑 制)。在“RNA干扰”中，单链的或双链的RNA在细胞中的存在，会导 致内切核酸切割和然后的靶mRNA的降解。
在一个实施方案中，将转基因(例如，ACC合酶基因或编码序列的 序列和/或子序列)导入植物细胞中，以通过RNA沉默或干扰 (RNAi)，灭活一个或多个ACC合酶基因。例如，序列或子序列包括： 小子序列，例如，约21-25个碱基长(与一个或多个ACC合酶基因子 序列具有例如至少80％、至少90％或约100％同一性)，大子序列，例 如，约25-100或约100-2000(或约200-1500，约250-1000，等)个 碱基长(其至少一个约21-25个碱基的区域与一个或多个ACC合酶基 因子序列具有至少80％、至少90％或100％同一性)，和/或完整的编码 序列或基因。在一个实施方案中，转基因包括该序列或子序列中的约 21-25个碱基长的区域，其与ACC合酶基因或编码序列具有至少80％、 至少90％或约100％同一性。
在文献中充分记载了RNAi在许多细胞类型(包括，例如，植物细 胞)和生物中抑制基因表达的用途，例如，通过干扰RNA的发夹(茎- 环)RNA的表达或2条链的表达，同样充分记载了用于确定适当的能 靶向目标基因(例如，ACC合酶基因)的干扰RNA的方法和用于生成 这样的干扰RNA的方法。例如，RNA干扰记载在例如，美国专利申请 公开号20020173478，20020162126和20020182223和Cogoni和 Macino(2000)“Post-transcriptionnal gene silencing across kingdoms” Genes Dev.，10：638-643；Guru T.(2000)，“A silence that speaks volumes” Nature 404：804-808；Hammond等，(2001)， “Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA” Nature Rev.Gen.2：110-119；Napoli等，(1990)“Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.” Plant Cell 2：279-289；Jorgensen等，(1996)，“Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers：comparison of sense vs.antisense constructs and single-copy vs.complex T-DNA sequences” Plant Mol.Biol.，31：957-973；Hannon G.J. (2002)“RNA interference” Nature.，Jul 11；418(6894)：244-51； Ueda R.(2001)“RNAi：a new technology in the post-genomic sequencing era” J Neurogenet.；15(3-4)：193-204；Ullu等(2002) “RNA interference：advances and questions” Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.Jan 29；357(1417)：65-70；Waterhouse等，(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95：133959-13964；Schmid等(2002) “Combinatorial RNAi：a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila” Trends Neurosci.Feb；25(2)：71-4； Zeng等(2003)“MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms”Proc.Natl. Acad.Sci.USA 100：9779-9784；Doench等(2003)“siRNAs can function as miRNAs”Genes & Dev.17：438-442；Bartel和Bartel (2003)“MicroRNAs：At the root of plant development？”Plant Physiology 132：709-717；Schwarz和Zamore(2002)“Why do miRNAs live in the miRNP？”Genes & Dev.16：1025-1031；Tang等(2003) “A biochemical framework for RNA silencing in plants”Genes & Dev.17：49-63；Meister等(2004)“Sequence-specific inhibition of microRNA-and siRNA-induced RNA silencing”RNA 10：544-550；Nelson等(2003)“The microRNA world：Small is mighty”Trends Biochem.Sci.28：534-540；Dykxhoorn等(2003) “Killing the messenger：Short RNAs that silence gene expression”Nature Reviews Molec.and Cell Biol.4：457-467； McManus和Sharp(2002)“Gene silencing in mammals by small interfering RNAs”Nature Reviews Genetics 3：737-747； Hutvagner和Zamore(2002)“RNAi：Nature abhors a double strand”Curr Opin Genet & Dev 200：225-232；和Agami(2002)“RNAi and related mechanisms and their potential use for therapy” Curr Opin Chem Biol 6：829-834。
可以表达用于诱导RNAi的ACC合酶多核苷酸序列或子序列，例 如，在组成型的启动子、诱导型的启动子或组织特异性的启动子的控 制下。在某些实施方案中，组织-特异性的启动子的表达可以是有利 的。例如，叶子-特异性的启动子的表达可以灭活叶子中的一个或多 个ACC合酶基因，生成保绿表型，而不灭活根中的ACC合酶基因(这 可以降低淹水耐受性)。类似地，花药-特异性的启动子的表达可以灭 活花药中的一个或多个ACC合酶基因，生成雄性不育表型表型，而不 灭活植物的其他部分中的ACC合酶基因。可以任选地组合这样的方 案，例如，以用于灭活叶子和花药中的一个或多个ACC合酶基因。
转座子
也可以灭活一个或多个ACC合酶基因，例如，通过基于转座子的 基因灭活。在一个实施方案中，灭活步骤包括在ACC合酶基因序列中 生成一个或多个突变，其中ACC合酶基因序列中的一个或多个突变包 含一个或多个转座子插入，由此与对应的对照植物相比，灭活一个或 多个ACC合酶基因。例如，该一个或多个突变包含在一个或多个ACC 合酶基因中的纯合的破坏，或者该一个或多个突变包含在一个或多个 ACC合酶基因中的杂合的破坏，或者如果破坏了超过一个ACC合酶基 因，则包含纯合的破坏和杂合的破坏的组合。
在二十世纪四十年代后期，Barbara McClintock首次在玉米中鉴 别出了转座子。转座因子的增变基因家族，例如，罗伯逊氏增变基因 (Mu)转座因子，一般在植物(例如，玉米)中用于基因诱变，因为 它们以高拷贝数(10-100)存在，且优先插入在基因内和周围。
根据它们的转座方式，可以将转座因子分成2大类。将它们称作 类别I和类别II；二者都可以用作诱变剂和送递载体。类别I转座 因子通过RNA中间体进行转座，并使用逆转录酶，即它们是逆转录因 子。存在至少3种类型的类别I转座因子，例如，反转录转座子、 反转录子、SINE-样因子。
反转录转座子一般含有LTR和能编码病毒外壳蛋白的基因(gag) 和逆转录酶、RNA酶H、整合酶和聚合酶(pol)基因。已经在植物物种 中描述了许多反转录转座子。这样的反转录转座子能在转座子编码的 逆转录酶和RNA酶H催化的反应中，通过RNA中间体进行移动和移 位。实例落在Tyl-copia和Ty3-gypsy组中以及SINE-样和LINE-样 分类中。更详细的讨论参见Kumar和Bennetzen(1999)Plant Retrotransposons in  Annual Review of Genetics 33：479.另外， 在许多植物物种也发现了DNA转座因子例如Ac、Taml和En/Spm， 且可以用于本发明中。
转座子(和IS元件)是用于将突变导入植物细胞中的普通工具。 将这些可移动的遗传因子送递给细胞，例如，通过有性杂交，选择转 座，并筛选得到的插入突变体，例如，针对目标表型。通过使分离的 或重组的植物与未破坏的植物杂交，例如，通过有性杂交，可以将包 含破坏的ACC合酶基因的植物导入其他植物中。根据要杂交的物种， 可以使用许多标准育种技术中的任一种。通过已知的方法，例如本文 所述的侧翼区的测序，可以确定TN在分离的或重组的植物的基因组 中的位置。例如，可以使用植物的PCR反应来扩增序列，然后可以对 其进行诊断测序，以确认它的来源。任选地，筛选插入突变体的理想 表型，例如与对照植物相比，ACC合酶的表达或活性的抑制、乙烯的 抑制或减少的生产、保绿潜力等。
TILLING
也可以使用TILLING来灭活一个或多个ACC合酶基因。TILLING 是在基因组学中靶向诱导的局部损伤( Targeting  Induced  Local Lesions  IN  Genomics)。参见，例如，McCallum等，(2000)， “Targeting Induced Local Lesions IN Genomics(TILLING)for Plant Functional Genomics”Plant Physiology 123：439-442； McCallum等，(2000)“Targeted screening for induced mutations” Nature Biotechnology 18：455-457；和Colbert等，(2001) “High-Throughput Screening for Induced Point Mutations”Plant Physiology 126：480-484。
TILLING组合了高密度点突变和突变的快速灵敏的检测。一般， 使用甲磺酸乙酯(EMS)来诱变植物种子。EMS能烷基化鸟嘌呤，这一 般导致错配。例如，将种子浸泡在约10-20mM的EMS溶液中约10- 20小时；洗涤种子，然后播种。该代植物称作M1。然后，让M1植物 自体受精。存在于能形成生殖组织的细胞中的突变会遗传给下一代 (M2)。一般，筛选M2植物中的目标基因的突变和/或特定表型。
例如，汇集来自M2植物的DNA，并通过检测异源双链体形成来检 测ACC合酶基因中的突变。一般，从每种M2植物制备了DNA，并汇 集。通过PCR，扩增了需要的ACC合酶基因。然后使汇集的样品变性， 并退火，以形成异源双链体。如果突变存在于一种植物中，则PCR产 物属于2种类型：野生型和突变型。通过分离PCR反应物，例如通过 变性高效液相色谱(DPHPLC)，可以鉴别出包含异源双链体的库。 DPHPLC能检测由异等位基因DNA的解链和退火产生的异源双链体中 的错配。在加热DNA的同时，进行色谱。异源双链体具有更低的热稳 定性，并形成解链泡，从而导致在色谱柱中更快的运动。当除了预期 的同源双链体以外还存在异源双链体时，会看到双峰。结果，鉴别出 了携带ACC合酶基因中的突变的库。然后，可以鉴别和测序组成选定 的汇集的群体的植物的各DNA。任选地，可以使携带ACC合酶中的理 想突变的植物与其他植物杂交，以去除背景突变。
也可以使用其他诱变方法来将突变导入ACC合酶基因中。将遗传 突变导入植物基因和选择具有理想性状的植物的方法是众所周知 的。例如，可以根据标准技术，用诱变化学物质处理种子或其他植物 材料。这样的化学物质包括但不限于下述的：硫酸二乙酯、乙烯亚胺 和N-亚硝基-N-乙脲。或者，可以使用来自诸如X-射线或γ-射线等 来源的电离辐射。
可以使用用于检测ACC合酶基因中的突变的其他检测方法，例 如，毛细管电泳(例如，恒定变性剂毛细管电泳和单链构象多态性)。 在另一个实例中，可以使用错配修复酶学(例如，来自芹菜的CEL I内 切核酸酶)，检测异源双链体。CEL I能识别错配，并在错配的3’侧 精确切割。通过用错配修复酶切割，然后进行例如变性凝胶电泳，可 以确定错配的精确碱基位置。参见，例如，Oleykowski等，(1998) “Mutation detection using a novel plant endonuclease”Nucleic Acids Res.26：4597-4602；和Colbert等，(2001)“High-Throughput Screening for Induced Point Mutations”Plant Physiology 126：480-484。
可以使含有突变的ACC合酶基因的植物与其他植物杂交，以将突 变导入另一种植物中。这可以使用标准育种技术来完成。
同源重组
也可以使用同源重组来灭活一个或多个ACC合酶基因。已经在植 物中证实了同源重组。参见，例如，Puchta等(1994)， Experientia 50：277-284；Swoboda等(1994)， EMBO J.13：484-489；Offringa 等(1993)， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7346-7350；Kempin 等(1997) Nature 389：802-803；和Terada等，(2002)“Efficient gene targeting by homologous recombination in rice” Nature Biotechnology，20(10)：1030-1034。
可以使用同源重组，以通过特异性地体内靶向ACC合酶基因，来 诱导靶向的基因修饰。体外产生了在选择的ACC合酶基因序列的部分 (包括5’上游、3’下游和基因内的区域)中的突变，例如在本文中提供 的那些，并使用标准技术导入了理想的植物中。突变的基因会以在转 基因植物中发生野生型基因的同源重组和靶向替换的方式，与靶ACC 合酶野生型基因相互作用，从而造成ACC合酶活性的抑制。
调节植物的保绿潜力的方法
调节植物的保绿潜力的方法也是本发明的特征。将不同程度的保 绿潜力导入植物中的能力，会提供以目的-特异性的方式导入该性状 的灵活的和简单的方案：例如，在具有更长的或更干燥的生长季节的 区域，为改良的籽粒灌浆或青贮饲料导入强保绿性状，相对而言，在 具有更短的生长季节的区域，为青贮饲料导入中等的保绿性状。另 外，本发明的植物的保绿潜力可以包括，例如，与对应的对照植物相 比，(a)减少至少一种ACC合酶特异性的mRNA的生产；(b)减少ACC 合酶的生产；(c)减少乙烯的生产；(d)延迟叶子衰老；(e)增强抗 旱性；(f)长时间地维持光合活性；(g)增强的蒸腾；(h)增强的气 孔导度；(i)增强的CO2同化作用；(j)增强维持CO2同化作用； 或(k)(a)-(j)的任意组合；等。
例如，本发明的方法可以包括：a)选择至少一个ACC合酶基因 进行突变，从而提供至少一个需要的ACC合酶基因；b)将至少一个 需要的ACC合酶基因的突变形式导入植物中；和c)表达突变形式， 从而调节植物的保绿潜力。通过这样的方法生成的植物也是本发明的 一个特征。
保绿潜力导入植物中的程度可由许多因素决定，例如，选择哪个 ACC合酶基因，突变的基因成员是以杂合的还是以纯合的状态存在， 或者可由灭活的该家族的成员的数目决定，或者可由2个或更多个这 样的因素的组合决定。在一个实施方案中，选择至少一个ACC合酶基 因包括确定需要的保绿潜力的程度(例如，弱(例如，ACS2)、中等或 强(例如，ACS6))。例如，ACS2系能表现出弱保绿表型，其衰老能 延迟约1周。ACS6系能表现出强保绿表型(例如，叶子衰老能延迟 约2-3周或更久)。ACS7系也可以表现出强保绿表型(例如，叶子衰 老能延迟约2-3周或更久)。例如，选择能编码特定ACC合酶的ACC 合酶基因，所述ACC合酶例如SEQ ID NO：7(pACS2)、SEQ ID NO：8 (pACS6)、SEQ ID NO：9(pAC7)或SEQ ID NO：11(pCCRA178R)。在一 个实施方案中，破坏了2个或更多个ACC合酶基因(例如，ACS2和 ACS6)，例如，以产生强保绿表型。在其他的实施方案中，破坏了3 个或更多个ACC合酶基因。
一旦选择了需要的ACC合酶基因，就将ACC合酶基因的突变形式 导入植物中。在某些实施方案中，通过土壤杆菌-介导的转移、电穿 孔、微粒轰击、同源重组或有性杂交，导入突变形式。在某些实施方 案中，突变形式包括，例如，在至少一个ACC合酶基因中的杂合突变， 在至少一个ACC合酶基因中的纯合突变，或如果选择了超过一个ACC 合酶基因，则为纯合突变和杂合突变的组合。在另一个实施方案中， 突变形式包括至少一个需要的反义、有义或RNA沉默或干扰构型的 ACC合酶基因的子序列。
可以以许多方式确定ACC合酶基因的突变形式的表达或突变形式 的表达结果。例如，可以定性地(存在或不存在一种或多种目标产物) 或定量地(通过监控一种或多种目标产物的表达水平)检测表达产 物。在一个实施方案中，表达产物是RNA表达产物。本发明任选地包 括监控如本文所指出的核酸或多肽的表达水平，以检测植物或植物群 体中的ACC合酶。也可以利用监控乙烯或ACC的水平，来检测ACC 合酶基因的突变形式的表达或活性的抑制。
除了与对照植物相比提高本发明的植物对干旱应激的耐受性以 外，本发明的另一个重要的方面是，可能更高密度地种植本发明的植 物，从而提高每英亩的玉米产量。在上个世纪，每英亩的玉米产量的 提高主要来自对拥挤的耐受性的提高，所述的拥挤是例如玉米中的应 激。调节应激的方法，例如，提高植物对拥挤的耐受性的方法，也是 本发明的一个特征。例如，本发明的方法可以包括：a)选择至少一 个ACC合酶基因进行突变，从而提供至少一个需要的ACC合酶基因；b) 将至少一个需要的ACC合酶基因的突变形式导入植物；和c)表达突 变形式，从而调节植物的应激。通过这样的方法生成的植物也是本发 明的一个特征。当通过需要的ACC合酶基因的突变形式减少了植物中 的乙烯生产时，植物不会感觉到拥挤。因而，可以以高于农民目前实 践的密度，种植本发明的植物。
在另一个方面，灭活本文所述的一个或多个ACC合酶基因，可以 影响对疾病或病原体攻击的反应。
调节植物的不育性的方法
调节植物的不育性(例如，雌性或雄性不育)的方法，也是本发 明的特征。将雌性或雄性不育导入植物的能力，允许快速生产雌性或 雄性不育系，例如，用于商业育种计划，例如，当需要异花传粉时， 用于生产杂种种子。
已经观察到ACC合酶敲除的植物，尤其是ACS6敲除的和 ACS2/ACS6双敲除的植物，会释放比野生型植物更少的花粉，这暗示 了破坏乙烯生产作为调节植物不育性的新方式。
例如，本发明的方法可以包括：a)选择至少一个ACC合酶基因 进行突变，从而提供至少一个需要的ACC合酶基因；b)将至少一个 需要的ACC合酶基因的突变形式导入植物；和，c)表达突变形式，从 而调节植物的不育性。通过这样的方法生成的植物也是本发明的一个 特征。
如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案，例如， 关于破坏的ACC合酶基因的数目、将ACC合酶基因的突变形式导入植 物中的技术、多核苷酸构建体等。
在一类实施方案中，通过转座子的插入，通过点突变或通过包含 反义、有义或RNA沉默或干扰构型的ACC合酶多核苷酸的转基因的组 成型表达，可以破坏至少一个ACC合酶基因。通过外源地提供乙烯， 例如，通过在适当的发育阶段给植物喷洒2-氯乙基膦酸(CEPA)，后 者能在水中分解以生成乙烯，可以繁殖这样的系。
在另一类实施方案中，通过在诱导型的启动子控制下的包含反 义、有义或RNA沉默或干扰构型的ACC合酶多核苷酸的转基因的表 达，可以破坏至少一个ACC合酶基因，这样可以根据需要诱导和/或 抑制不育性。在另一类实施方案中，通过在组织-特异性的启动子(例 如，花药-特异性的启动子)控制下的包含反义、有义或RNA沉默或 干扰构型的ACC合酶多核苷酸的转基因的表达，可以破坏至少一个 ACC合酶基因，以生成雄性不育植物。同样，如果需要，通过外源地 提供乙烯(例如，通过喷洒CEPA)，可以繁殖这样的系。
本发明的植物或植物细胞的筛选/表征
可以基因型地、生化地、表型地或组合其中的2种或更多种，筛 选和/或表征本发明的植物，以确定本发明的多核苷酸的存在、不存 在和/或表达(例如，量，调节，例如与对照细胞相比的减少或增加， 等)，本发明的多肽的存在、不存在、表达和/或酶活性，保绿潜力的 调节，拥挤的调节，和/或乙烯生产的调节。参见，例如，图19。
通过许多众所周知的技术中的任一种，包括基因组核酸序列的 PCR扩增和基因组核酸序列或表达的具有特定标记探针的核酸序列的 杂交(例如，DNA印迹、RNA印迹、斑点或狭线印迹，等)，可以进行 基因型分析。
例如，Pioneer Hybrid Int.开发的玉米的性状实用系统(Trait Utiliry System for Corn)(TUSC)是有力的基于PCR的筛选策略， 以用于鉴别特定基因中的Mu转座子插入，而无需可观察的表型。该 系统使用例如TIR-PCR，其中一种PCR引物源自靶基因，而另一种 (Mu-TIR)来自Mu的末端反向重复序列(TIR)区。使用这些从大量含有 Mu的植物收集的DNA的PCR反应中的引物，可以通过使用靶基因作 为探针的DNA印迹杂交，鉴别出成功的扩增。然后，筛选阳性库中的 个体，以鉴别在靶基因中含有Mu元件插入的候选系。为了确定插入 事件是限于体细胞还是也存在于种系中(且因此代表着可遗传的变 化)，可以任选地对来自候选物的后代进行与在原始筛选中使用的相 同的PCR/DNA印迹杂交分析。
也可以进行生化分析，来检测例如，蛋白生产的存在、不存在或 调节(例如，减少或增加)(例如，通过ELISA、蛋白印迹，等)，生 产的乙烯的存在和/或量，等。例如，可以回收表达的多肽，并通过 本领域众所周知的许多方法中的任一种，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸 提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色 谱、亲和色谱(例如，使用任一种在本文中指出的标记系统)、羟磷灰 石色谱和凝集素色谱，从分离的或重组的细胞培养物中进行纯化。根 据需要，可以使用蛋白重折叠步骤，来完成成熟蛋白的构型。最后， 可以在最后的纯化步骤中采用高效液相色谱(HPLC)。除了上面指出 的文献外，多种纯化方法是本领域众所周知的，包括，例如，在下述 文献中记载的那些：Sandana(1997) Bioseparation of Proteins， Academic Press，Inc.；和Bollag等(1996) Protein Methods，第 2版Wiley-Liss，NY；Walker(1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ，Harris和Angal(1990) Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris和Angal  Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford， England；Scopes(1993) Protein Purification：Principles and Practice第3版Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998) Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，第2版Wiley-VCH，NY；和Walker(1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ。
可以从细胞提取物中回收和测定化学试剂，例如，乙烯、ACC等。 例如，可以通过气相色谱-质谱测定ACC在酸性植物提取物中的内部 浓度，其作为在碱性次氯酸盐溶液等中分解后的乙烯。通过例如气相 色谱-质谱等，可以确定乙烯的浓度。参见，例如，Nagahama，K.，Ogawa， T.，Fujii，T.，Tazaki，M.，Tanase，S.，Morino，Y.和Fukuda，H. (1991)“Purification and properties of an ethyleneforming enzyme from Pseudomonas syringae” J.Gen.Microbiol.137： 2281-2286。例如，使用装配了例如基于氧化铝的柱(例如HP-PLOT A1203毛细管柱)和火焰电离检测器的气相色谱仪，可以测量乙烯。
表型分析包括，例如，分析植物的化学组成(例如，如在生化分 析下所述)、形态或生理特性的变化。例如，形态变化可以包括但不 限于，提高的保绿潜力、叶子衰老的延迟、抗旱性的提高、拥挤抗性 的提高等。生理特性可以包括，例如，增强的持续的光合作用、增强 的蒸腾、提高的气孔导度、增强的CO2同化作用、更长的CO2同化作 用的维持，等。
可以使用许多测定来监控保绿潜力。例如，测定包括但不限于， 肉眼检查监控光合作用测量和测量例如叶子的叶绿素、DNA、RNA和/ 或蛋白含量的水平。
本发明的植物
本发明的植物细胞包括但不限于，分生组织细胞，类型I、类型 II和类型III愈伤组织，未成熟的胚和配子细胞例如小孢子、花粉、 精子和卵子。在某些实施方案中，本发明的植物细胞来自双子叶植物 或单子叶植物。由本发明的植物细胞再生的植物也是本发明的特征。
在一个实施方案中，植物细胞是在包含保绿潜力表型的植物中 的，例如，杂种植物。在另一个实施方案中，植物细胞是在包含不育 表型(例如，雄性不育表型)的植物中的。通过一系列的育种操作， 可以将破坏的ACC合酶基因从一个植物系移动到另一个植物系。例 如，通过使包含一个或多个ACC合酶基因破坏的植物和对照植物进行 有性杂交，可以生成杂种植物。
敲除的植物细胞也是本发明的一个特征。在第一方面，本发明提 供了分离的或重组的敲除的植物细胞，其包含至少一个在至少一个内 源的ACC合酶基因(例如，核酸序列或其互补序列，其与SEQ ID NO：1 (gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)或SEQ ID NO：3(gACS7)具有例如至 少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少 约95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性)中的破坏。与缺 少该破坏的对应的对照植物细胞相比，该破坏能抑制至少一种ACC合 酶蛋白的表达或活性。在一个实施方案中，至少一个内源的ACC合酶 基因包含2个或更多个内源的ACC合酶基因。在另一个实施方案中， 至少一个内源的ACC合酶基因包含3个或更多个内源的ACC合酶基 因。在某些实施方案中，至少一个破坏会导致敲除的植物细胞与对照 植物细胞相比，减少乙烯生产。
在本发明的一个方面，植物细胞中的ACC合酶基因的破坏包含一 个或多个转座子，其中一个或多个转座子是在至少一个内源的ACC合 酶基因中的。在另一个方面，破坏包括在至少一个内源的ACC合酶基 因中的一个或多个点突变。任选地，破坏是在至少一个ACC合酶基因 中的纯合的破坏。或者，破坏是在至少一个ACC合酶基因中的杂合的 破坏。在某些实施方案中，涉及超过一个ACC合酶基因，且存在超过 一个破坏，这可以包括纯合的破坏、杂合的破坏或纯合的破坏和杂合 的破坏的组合。也参见在本文中标题为“转座子和TILLING”的部分。
在另一个实施方案中，通过抑制ACC合酶基因的表达，产生了ACC 合酶基因的破坏。例如，通过将至少一个包含ACC合酶核酸序列或其 子序列的多核苷酸序列导入植物细胞中，从而使至少一个多核苷酸序 列以有义或反义方向连接到启动子上，生产了敲除的植物细胞。多核 苷酸序列与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3 (gACS7)、SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6 (cACS7)或SEQ ID NO.：10(CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有 例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、 至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性。例如，通 过导入至少一个多核苷酸序列，其包含为RNA沉默或干扰所设计的 ACC合酶核酸序列的一个或多个子序列，可以生产敲除的植物细胞。 多核苷酸任选地包含载体、表达盒等。在另一个方面，通过同源重 组生产了敲除的植物细胞。也参见在本文中标题为“反义、有义、RNA 沉默或干扰构型”和“同源重组”的部分。
包含保绿潜力表型的敲除的植物是本发明的一个特征。一般地， 在敲除的植物中的保绿潜力表型源自至少一个内源的ACC合酶基因 的破坏。在一个实施方案中，破坏包含一个或多个转座子，且与对应 的对照植物相比，该破坏能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活 性。在另一个实施方案中，破坏包含一个或多个点突变，且与对应的 对照相比，能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在某些实施 方案中，至少一个内源的ACC合酶基因包含核酸序列或其互补序列， 其与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)或SEQ ID NO：3 (gACS7)或其互补序列具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、 至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高 的序列同一性。在某些实施方案中，敲除的植物是杂种植物。
本发明还表征了敲除的植物，其包含具有保绿潜力表型的转基因 植物。例如，本发明的转基因植物包括源自至少一个导入的能抑制乙 烯合成的转基因的保绿潜力表型，其中所述的至少一个导入的转基因 包含能编码至少一种ACC合酶或其子序列的核酸序列，该核酸序列与 SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)，SEQ ID NO：3(gACS7)、 SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cACS7) 或SEQ ID NO：10(CCRAl78R)或其子序列或其互补序列具有例如至少 约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性，且能修饰至少一种 ACC合酶的表达或活性水平。一般地，该构型是有义、反义或RNA沉 默或干扰构型。本发明的转基因植物还可以包括源自至少一个导入的 能抑制乙烯合成的转基因的保绿潜力表型，其中所述的至少一个导入 的转基因包含能编码至少一种ACC合酶的子序列的核酸序列，该至少 一种ACC合酶与SEQ ID NO：7(pACS2)、SEQ ID NO：8(pACS6)、SEQ ID NO.：9(pACS7)或SEQ ID NO：11(pCCRAl78R)或其保守变体具有例 如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、 至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性，且是RNA 沉默或干扰构型，且能修饰至少一种ACC合酶的表达或活性水平。在 一个方面，转基因任选地包含组织-特异性的启动子或诱导型的启动 子(例如，叶子-特异性的启动子、干旱-诱导型的启动子，等)。
本发明还表征了具有不育表型的敲除的植物，例如，雄性或雌性 不育表型。因而，一类实施方案提供了敲除的植物，其包含源自至少 一个在至少一个内源的ACC合酶基因中的破坏的雄性不育表型。与对 应的对照植物相比，该破坏能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活 性。例如，可以单独地或以任意的组合(例如，ACS6或ACS2和ACS6)， 破坏ACS2、ACS6和ACS7。一般地，与对照植物相比，至少一个破坏 会造成敲除的植物减少乙烯生产。
在一个实施方案中，至少一个破坏包含在至少一个内源的ACC合 酶基因中的一个或多个转座子。在另一个实施方案中，至少一个破坏 包含在至少一个内源的ACC合酶基因中的一个或多个点突变。在其他 的实施方案中，通过导入至少一个多核苷酸序列，其包含为RNA沉默 或干扰所设计的ACC合酶核酸序列的一个或多个子序列(或者，以有 义或反义构型)，将至少一个破坏导入敲除的植物中。如指出的，多 核苷酸序列任选地在诱导型的或组织-特异性的(例如，花药-特异性 的)启动子的控制下。
在一个实施方案中，雄性不育表型包含敲除的植物与对照植物相 比减少的花粉释放。例如，与对照植物释放的花粉相比，敲除的植物 可以释放最多50％、25％、10％、5％或1％，或者它可以释放不能检测到 的花粉。
本发明还表征了敲除的植物，其包含具有雄性不育表型的转基因 植物。例如，本发明的转基因植物包括源自至少一个导入的能抑制乙 烯合成的转基因的雄性不育表型，其中所述的至少一个导入的转基因 包含能编码至少一种ACC合酶或其子序列的核酸序列，该核酸序列与 SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)，SEQ ID NO：3(gACS7)、 SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、SEQ ID NO：6(cACS7) 或SEQ ID NO：10(CCRAl78R)或其子序列或其互补序列具有例如至少 约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性，且能修饰至少一种 ACC合酶的表达或活性水平。一般地，该构型是有义、反义或RNA沉 默或干扰构型。如指出的，转基因任选地包含组织一特异性的启动子 (例如，花药-特异性的启动子)或诱导型的启动子。
在本发明的方法和组合物中，可以使用基本上所有的植物。这些 物种包括但不限于下述科的成员：禾本科(以前的禾本科 (Graminae)，包括玉蜀黍(玉米)、黑麦、黑小麦、大麦、粟、稻、 小麦、燕麦等)；豆科(Leguminosae)(包括豌豆、豆类、小扁豆、 花生、西印度豆薯(yam bean)、豇豆、黎豆(velVet beans)、大 豆、三叶草、苜蓿、羽扇豆、野豌豆、莲、草木樨、紫藤、香豌豆等)； 菊科(Compositae)(维管植物的最大科，包括至少1,000个属，包 括重要的经济作物例如向日葵)和蔷薇科(Rosaciae)(包括悬钩子、 杏树、扁桃、桃树、玫瑰等)，以及坚果植物(包括胡桃、山核桃、榛 实等)，林木(包括松属(Pinus)、栎属(Quercus)、Pseutototsuga、 北美红杉属(Sequoia)、杨属(Populus)等)，和其他普通的作物植 物(例如，棉花、高粱、草坪草、番茄、马铃薯、胡椒、嫩茎花椰菜、 卷心菜等)。
其他的植物，以及上面指出的那些，包括来自下述属的植物： Acamptoclados、芨芨草属、Achnella、凤头黍属、山羊草属、Aegopgon、 Agroelymus、Agrohordeum、Agropogon、冰草属、Agrositanion、剪股 颖属、银须草属、Allolepis、毛颖草属、看麦娘属、Amblyopyrum、 Ammophila、Ampelodesmos、Amphibromus、Amphicarpum、Amphilophis、 Anastrophus、Ana therum、须芒草属、Anema thele、赖草属、Anisantha、 Anthaenantia、Anthephora、Anthochloa、黄花茅属、Apera、水蔗草 属、Archtagrostis、Arctophila、Argillochloa、三芒草属、燕麦草 属、荩草属、Arthrostylidium、青篱竹属、野古草属、芦竹属、Aspris、 Atheropogon、燕麦属(例如，燕麦)、Avenella、Avenochloa、Avenula、 地毯草属、箣竹属、Beckmannia、Blepharidachne、Blepharoneuron、 孔颍草属、格兰马草属、臂形草属、短颖草属、短柄草属、凌风草属、 Brizopyrum、Bromelica、Bromopsis、雀麦属、野牛草属、Bulbilis、 拂子茅属、Calamovilfa、Campulosus、Capriola、沿沟草属、 Catapodium、Cathestecum、Cenchropsis、蒺藜草属、酸模芒属、 Cera tochloa、Chaetochloa、Chasmanthium、方竹属、Chionochloa、 虎尾草属、Chondrosum、Chrysopon、Chusquea、单蕊草属、Cladoraphis、 空轴茅属、薏苡属、莎禾属、Colpodium、Coridochloa、Cornucopiae、 蒲苇属、Corynephorus、Cottea、Critesion、隐花草属、Ctenium、 Cutandia、Cylindropyrum、香茅属、狗牙根属、洋狗尾草属、 Cytrococcum、鸭茅属、龙爪茅属、扁芒草属、Dasyochloa、Dasyprum、 Davyeila、牡竹属、发草属、Desmazeria、野青茅属、Diarina、龙常草 属、二型花属、双花草属、Dichelachne、Diectomus、马唐属、雁茅属、 Dimorpostachys、弯穗草属、双稃草属、Dissanthelium、 Dissochondrus、Distichlis、镰序竹属、Dupoa、Dupontia、稗属、 Ectosperma、Ehrharta、牛筋草属、Elyhordeum、Elyleymus、 Elymordeum、披碱草属、胶鳞禾属、Elysitanion、Elytesion、偃麦草 属、九顶草属、肠须草属、Epicampes、画眉草属、蜈蚣草属、Eremopoa、 旱麦草属、蔗茅属、Ericoma、Erichloa、Eriochrysis、Erioneuron、 类蜀黍属、Euclasta、黄金茅属、拟金茅属、真穗草属、箭竹属、羊茅 属、Festulolium、Fingerhuthia、Fluminia、耳稃草属、Castridium、 Caudinia、巨竹属、甜茅属、Graphephorum、Gymnopogon、Gynerium、 球穗草属、Hainardia、Hakonechloa、Haynaldia、Heleochloa、异燕 麦属、牛鞭草属、Hesperochloa、Hesperostipa、黄茅属、 Hibanobambusa、茅香属、Hilaria、绒毛草属、Homalocenchrus、大麦 属(例如，大麦)、Hydrochloa、膜稃草属、苞茅属、Hypogynium、猬 草属、距花黍属、白茅属、箬竹属、柳叶箬属、鸭嘴草属、Ixophorus、 Koeleria、Korycarpus、兔草属、Lamarckia、Lasiacis、假稻属、千 金子属、Leptochloopsis、Leptocoryphium、薄稃草属、Leptogon、细 穗草属、Lerchenfeldia、银穗草属、Leymostachys、赖草属、Limnodea、 Lithachne、黑麦草属、Lophochlaena、Lophochloa、Lophopyrum、 Ludolfia、Luziola、Lycurus、Lygeum、Maltea、Manisuris、 Megastachya、臭草属、糖蜜草属、Mibora、小草属、Microlaena、莠竹 属、栗草属、芒属、毛俭草属、Molinia、Monanthochloe、Monerma、Monroa、 乱子草属、Nardus、Nassella、Nazia、Neeragrostis、Neoschischkinia、 Neostapfia、类芦属、Nothoholcus、Olyra、Opizia、求米草属、 Orcuttia、稻属(例如，稻)、落芒草属、Otatea、滇竹属、Panicularia、 黍属、Pappophorum、假牛鞭草属、Pascopyrum、类雀稗属、雀稗属、狼 尾草属(例如、粟)、虉草属、Phalaroides、Phanopyrum、Pharus、 Phippsia、梯牧草属、Pholiurus、芦苇属、刚竹属、Piptatherum、 Piptochaetium、大明竹属、Pleopogon、Pleuraphis、Pleuropogon、 早熟禾属、Podagrostis、棒头草属、单序草属、新麦草属、Pseudelymus、 Pseudoroegneria、矢竹属、细柄茅属、碱茅属、Pucciphippsia、 Redfieldia、Reimaria、Reimarochloa、Rhaphis、Rhombolytrum、红 毛草属、鹅观草属、Rostraria、筒轴茅属、Rytilix、甘蔗属、囊颖草 属、赤竹属、Sasaella、华箬竹属、Savastana、Schedonnardus、齿稃 属、裂稃茅属、裂稃草属、裂穗草属、硬草属、Scleropoa、Scleropogon、 Scolochloa、Scribneria、黑麦属(例如，黑麦)、业平竹属、Sesleria、 狗尾草属、倭竹属、Sieglingia、玉山竹属、唐竹属、慈竹属、Sitanion、 Sorghastrum、高粱属、大米草属、Sphenopholis、大油芒属、鼠尾栗属、 Stapfia、Steinchisma、钝叶草属、针茅属、Stipagrostis、 Stiporyzopsis、Swallenia、Syn therisma、Taeniatherum、Terrellia、 Terrelymus、莜竹属、菅属、Thinopyrum、卷轴草属、棕叶芦属、Torresia、 Torreyochloa、Trachynia、Trachypogon、锋芒草属、Trichachne、 Trichloris、Tricholaena、Trichoneura、Tridens、Triodia、 Triplasis、草沙蚕属、摩擦草属、Trisetobromus、三毛草属、 Triticosecale、小麦属(例如，小麦)、Tuctoria、Uniola、Urachne、 Uralepis、尾稃草属、Vahlodea、Valota、Vaseyochloa、Ventenata、 香根草属、Viifa、Vulpia、Willkommia、玉山竹属、玉蜀黍属(例如， 玉米)、茭白属、Zizaniopsis和结缕草属。
植物转化
通过许多常规技术，可以将本发明的核酸序列构建体(例如，分 离的核酸、重组的表达盒、等)导入培养的植物细胞或植物器官中的 植物细胞。例如、这些技术包括但不限于，感染、转导、转染、转位 和转化。可以单独地或与其他多核苷酸一起，导入核酸序列构建体。 可以独立地导入这些其他多核苷酸，或者与本发明的多核苷酸共导入 或连接在一起导入。
用于转化广泛种类的高等植物物种的技术是众所周知的，且记载 在技术和科学文献中。参见，例如，Payne等(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY(Payne)；Gamborg和Phillips(编)(1995) Plant Cell， Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Yerlag(Berlin Heidelberg New York) (Gamborg)；Croy，(编)(1993) Plant Molecular Biology Bios Scientific Publishers，Oxford，U.K；Jones(编)(1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols--Methods in Molecular Biology，Volume 49 Humana Press Towata NJ，以及其他的，等，以 及，例如，Weising等(1988) Ann.Rev.Genet.22：421。也参见， 1995年3月2日公开的标题为“Fertile，Transgenic Maize Plants and Methods for Their Production”的WO 95/06128。在本领域中 可以得到许多用于从许多植物种类建立可转化的原生质体并随后转 化培养的原生质体的方法，且在本文中引作参考。例如，参见， Hashimoto等(1990) Plant Physiol.93：857；Fowke和Constabel (编)(1994) Plant Protoplasts；Saunders等(1993) Applications of Plant In Vitro Technology Symposium，UPM 16-18； 和Lyznik等(1991) BioTechniques 10：295，它们中的每一篇都在 本文中引作参考。在本领域中可以得到许多方法来实现叶绿体转化和 表达(例如，Daniell等(1998) Nature Biotechnology 16：346； O’Neill等(1993) The Plant Journa l3：729；Maliga(1993) TIBTECH 11：1)。
例如，使用诸如植物细胞原生质体或胚发生愈伤组织的电穿孔、 PEG穿孔、粒子轰击、硅纤维送递或显微注射的技术，可以将核酸序 列直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用冲击法(例如粒 子轰击)将核酸序列构建体直接导入植物组织中。示例性的粒子包括 但不限于钨、金、铂等。或者，通过用病毒载体感染细胞，或通过组 合核酸序列构建体和合适的T-DNA侧翼区，并导入常规的根癌土壤 杆菌宿主载体中，可以导入核酸序列构建体。当细菌感染植物细胞 时，土壤杆菌宿主的侵入性功能会指导构建体和临近的标记向植物细 胞DNA的插入。参见，美国专利号5,591,616。
显微注射技术是本领域已知的，且较好地记载在科学和专利文献 中(参见，例如，Jones(编)(1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols--Methods in Molecular Biology，Volume 49Humana Press Towata NJ，以及其他的)。使用聚乙二醇沉淀导入 核酸序列构建体的方法记载在Paszkowski等(1984) EMBO J 3：2717 中。电穿孔技术记载在Fromm等(1985) Proc Nat’l Acad Sci USA 82：5824中。冲击转化技术记载在Klein等(1987) Nature 327：70 中；和Weeks等 Plant Physiol 102：1077和Tomes，D.等，IN：Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，编者O.L. Gamborg和G.C.Phillips，第8章，第197-213页(1995)。(也参 见Tomes等，美国专利号5,886,244；6,258,999；6,570,067； 5,879,918)。
也可以使用是植物病毒的病毒载体来将本发明的多核苷酸导入 植物中。一般地，将病毒用作以瞬时方式在植物宿主中表达外源DNA 序列的载体。与会导致DNA序列向植物基因组中的稳定整合的土壤杆 菌介导的转化形成对照，病毒载体通常无需染色体整合即可复制和表 达。植物病毒载体能提供许多优点，更具体地是：a)在大肠杆菌中 可以容易地操纵病毒基因组的DNA拷贝，并在需要时，进行体外转 录，以生成感染性的RNA拷贝；b)可以容易地将裸DNA、RNA或病毒 颗粒导入完整植株的机械地创伤的叶子中；c)每个细胞高拷贝数的 病毒基因组会导致导入的基因的高表达水平；d)各种病毒株可以容 易地感染普通的实验室植物物种以及单子叶植物和双子叶植物作物 物种；e)完整植物的感染，会允许单文库克隆的重复组织取样；f)重 组病毒颗粒的回收和纯化是简单且快速的；和g)因为在没有染色体 插入的情况下发生复制，所以表达不会发生位置效应。参见，例如， Scholthof，Scholthof和Jackson，(1996)“Plant Virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants，” Annu.Rev.of Phytopathol.34：299-323。
植物病毒会造成许多疾病，最常见叶子的斑点状损伤，即所谓的 花叶病。其他的症状包括枯斑、变形、旁枝和普遍的叶子黄化或红化。 已知植物病毒会感染所有主要的粮食作物以及大多数园艺目的的物 种。宿主范围随病毒而异，一些病毒会感染较广的宿主范围(例如， 苜蓿花叶病毒能感染超过50个植物科中的400个物种)，而其他的具 有较窄的宿主范围，有时限于单一物种(例如大麦黄花叶病毒)。可以 在本发明的方法和组合物中使用的宿主的基础上，选择适当的载体。
在本发明的某些实施方案中，载体包括植物病毒例如，RNA(单 链的或双链的)或DNA(单链的或双链的)病毒。这样的病毒的实例 包括但不限于，例如，苜蓿花叶病毒、雀麦草花叶病毒、毛状病毒、 香石竹潜病毒、香石竹斑驳病毒、花椰菜花叶病毒、线性病毒、豇豆 花叶病毒、隐病毒、南瓜花叶病毒、香石竹病毒、蚕豆萎蔫病毒、斐 济病毒、真菌传棒状病毒、双粒病毒、大麦病毒、等轴不稳定环斑病 毒、黄矮病毒、machlovirus、玉米褪绿矮缩病毒、玉米雷亚多非纳 病毒、坏死病毒、线虫传多面体病毒、欧防风黄点病毒、豌豆耳突花 叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、南 方菜豆花叶病毒、细病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、番茄斑萎 病病毒、番茄丛矮病毒、芜菁黄花叶病毒等。
一般地，植物病毒能编码开始感染、复制和全身传播所需的多种 蛋白，例如外壳蛋白、辅助因子、复制酶和移动蛋白。能编码许多这 样的蛋白的核苷酸序列是公众常识，且可以从许多数据库中得到，例 如(Genbank：可以从环球网上在ncbi.nlm.nih.gov/genbank/得 到；或EMBL：可以从环球网上在ebi.ac.uk.embl/得到)。
使用源自植物病毒的序列转化植物和植物细胞的方法包括上面 针对DNA分子所述的直接转化技术，参见例如，Jones，编(1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols，Humana Press， Totowa，NJ。另外，可以将病毒序列克隆到T-DNA边界序列附近， 并通过土壤杆菌介导的转化或土壤杆菌感染导入。
通过使用本领域众所周知的技术的机械接种，也可以导入包含植 物病毒载体(其包括本发明的多核苷酸)的病毒颗粒；关于详细的方 案，参见，例如，Cunningham和Porter，编(1997) Methods in Biotechnology，Vol.3.Recombinant Proteins from Plants： Production and Isolation of Clinically Useful Compounds。简 而言之，为了实验目的，用碳化硅(金刚砂)制备新鲜植物叶子粉末， 然后接种病毒转录物或壳体包裹的病毒的溶液，并轻轻摩擦。用于感 染作物植物的大规模适应也是本领域众所周知的，且一般包含使用割 草机或其他机械装置机械地浸渍叶子，随后定位喷洒病毒悬浮液，或 给叶子喷洒缓冲的高压病毒/金刚砂悬浮液。任一种上述的技术都可 以适应于本发明的载体，且根据选择的植物病毒和宿主物种以及特定 的转化应用的规模，可以用于替代性的应用。
在一些实施方案中，土壤杆菌介导的转化技术可以用于将本发明 的ACC合酶序列或子序列转移给转基因植物。土壤杆菌-介导的转化 可以广泛地用于转化双子叶植物；但是，某些单子叶植物也可以被土 壤杆菌转化。例如，稻的土壤杆菌转化记载在Hiei等(1994) Plant J.6：271；美国专利号5,187,073；美国专利号5,591,616；Li等 (1991) Science in China 34：54；和Raineri等(1990) Bio/Technology 8：33。还已经描述了通过土壤杆菌介导的转化转化 的玉米、大麦、黑小麦和芦笋(Xu等(1990) Chinese J Bot 2：81).
土壤杆菌介导的转化技术利用了根癌土壤杆菌的肿瘤-诱导(Ti) 质粒整合进植物细胞基因组中以将目标核酸共转移进植物细胞中的 能力。一般地，生产了表达载体，其中将目标核酸(例如本发明的 ACC合酶RNA构型核酸)连接进自主复制的质粒中，它也含有T-DNA 序列。T-DNA序列一般在侧翼连接目标表达盒核酸，且包含质粒的整 合序列。除了表达盒以外，T-DNA还一般包含标记序列，例如，抗生 素抗性基因。然后，将具有T-DNA和表达盒的质粒转染进土壤杆菌细 胞中。一般地，为了有效地转化植物细胞，根癌土壤杆菌细菌也具有 在质粒上的或整合进它的染色体中的必要的vir区域。关于土壤杆 菌介导的转化的讨论，参见，Firoozabady和Kuehnle，(1995) Plant Cell Tissue and Organ Culture Fundamental Methods，Gamborg 和Phillips(编)。
根癌土壤杆菌-介导的转化技术较好地记载在科学文献中。参 见，例如Horsch等， Science 233：496-498(1984)，和Fraley等， Proc.Natl.Acad.Sci(USA)80：4803(1983)。虽然土壤杆菌主 要用于双子叶植物，但某些单子叶植物也可以被土壤杆菌转化。例 如，美国专利号5,550,318描述了玉米的土壤杆菌转化。
其他的转染或转化方法包括：(1)发根土壤杆菌-介导的转化 (参见，例如，Lichtenstein和Fuller In：Genetic Engineering，vol. 6，PWJ Rigby，编，London，Academic Press，1987；和Lichtenstein， C.P.，和Draper，J，.In：DNA Cloning，Vol.II，D.M.Glover， 编，Oxford，IRI Press，1985)；申请PCT/US87/02512(WO 88/02405，1988年4月7日公开)描述了发根土壤杆菌株A4和它的 Ri质粒以及根癌土壤杆菌载体pARC8或pARC16的用途，(2)脂质 体-介导的DNA摄入(参见，例如，Freeman等， Plant Cell Physiol. 25：1353，1984)，和(3)涡旋方法(参见，例如，Kindle， Proc.Nat’l. Acad.Sci.(USA)87：1228，(1990)。
如Zhou等， Methods in Enzymology，101：433(1983)；D.Hess， Intern.Rev.Cytol.，107：367(1987)；Luo等， Plant Mol. Biol. Reporter，6：165(1988)所述，通过直接将DNA转入花粉中，也 可以将DNA导入植物中。如Pena等， Nature 325：274(1987)所述， 通过将DNA注射进植物的生殖器官中，可以得到多肽编码基因的表 达。如Neuhau s等， Theor.Appl.Genet.，75：30(1987)；和Benbrook 等，in  Proceedings Bio Expo.1986，Butterworth，Stoneham， Mass.，第27-54页(1986)所述，也可以将DNA直接注射进未成熟的 胚的细胞中，然后进行脱水胚的再水化。本领域已知许多可以用作载 体的植物病毒，其包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、双粒病毒、雀麦草 花叶病毒和烟草花叶病毒。
描述了合适的转化植物细胞的方法的其他文献包括：显微注射， Crossway等(1986)Biotechniques 4：320-334；电穿孔，Riggs等 (1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606；土壤杆菌-介 导的转化，参见例如，Townsend等，美国专利5,563,055；直接基因 转移，Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2717-2722；和冲击颗粒加 速，参见例如，Sanford等，美国专利4,945,050；Tomes等(1995) in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods， ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe等 (1988)Biotechnology 6：923-926。也参见Weissinger等(1988) Annual Rev.Genet.22：421-477；Sanford等(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等 (1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等(1988) Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Datta等(1990) Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；Klein等(1988)Plant Physiol.91：440-444 (玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8：833-839；Hooydaas- Van Slogteren等(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebier 等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科 (Liliaceae))；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.G.P.Cha pman等(Longman， New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等(1990)Plant Cell Reports 9：415-418；和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet. 84：560-566(颈须(whisker)-介导的转化)；D.Halluin等(1992) Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou等(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米，通过根癌土壤杆菌进行)；它们都在本文中引作 参考。
分离的、重组的或转基因植物的再生
可以培养通过植物转化技术衍生出的转化的植物细胞和分离的 或重组的植物细胞，包括上面讨论的那些，以再生具有需要的基因型 (即，敲除的ACC合酶核酸)和/或从而具有需要的表型(例如，保绿 表型、不育表型、抗拥挤的表型，等)的全植株。在能支持再生的培 养基中，培养可以通过例如选择或筛选鉴别出的需要的细胞。然后， 使细胞成熟为植物。例如，这样的再生技术可以依靠在组织培养生长 培养基中操作某些植物激素，一般地依靠已经与需要的核苷酸序列一 起导入的杀生物剂和/或除草剂标记。或者，可以进行筛选，以筛选 ACC合酶的表达和/或活性的抑制、通过敲除的ACC合酶核酸序列赋 予的乙烯生产的减少，等。从培养的原生质体再生植物记载在Evans 等(1983) Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，第124-176页，Macmillan Publishing Company，New York；Davey，(1983) Protoplasts，第12-29页，Birkhauser，Basal 1983；Dale， Protoplasts(1983)第31-41页，Birkhauser，Basel； 和Binding(1985) Regeneration of Plants，Plant Protoplasts第 21-73页，CRC Press，Boca Raton。从植物愈伤组织、外植体、器 官或其部分，也可以得到再生。这样的再生技术一般地记载在Klee等 (1987) Ann Rev of Plant Phys 38：467。也参见，例如，Payne和 Gamborg。关于玉米的转化和再生，参见，例如，美国专利5,736,369。
根据标准的植物组织培养技术，可以从例如单个细胞、愈伤组织 或叶盘，再生用植物表达载体转化的植物细胞。本领域众所周知，可 以成功地培养来自几乎所有植物的多种细胞、组织和器官，以再生完 整的植株。从培养的原生质体再生植物记载在Evans等， Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，Macmillilan Publishing Company，New York，第124-176 页(1983)；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，CRC Press，Boca Raton，第21-73页(1985)。
如Horsch等， Science，227：1229-1231(1985)所述，可以从 叶子外植体再生含有由土壤杆菌导入的外源基因的植物。用土壤杆菌 转化后，一般将外植体转移到选择培养基上。技术人员能认识到，选 择培养基取决于共同转染进外植体中的选择标记。如Fraley等， Proc.Nat’l.Acad.Sci.(U.S.A).，80：4803(1983)所述，在该方 法中，使转化体在有选择试剂存在的情况下，且在能诱导待转化的植 物物种的茎干再生的培养基中生长。该方法一般会产生茎干，例如， 在2-4周内，然后将这些转化的茎干(它们一般是例如约1-2cm长) 转移到适当的根-诱导培养基中，后者含有选择试剂和抗生素，以阻 止细菌生长。一般地，在根和茎干培养基中维持选择压力。
一般地，转化体会在约1-2周内发育出根，并形成小植株。小植 株达到约3-5cm高度后，将它们置于纤维罐内的无菌土壤中。本领 域的技术人员能够认识到，使用不同的驯化方法来得到不同物种的转 化植物。例如，发育出根和茎干后，将转化的植物的插条以及体细胞 胚转入培养基中，以产生小植株。关于转化的植物的选择和再生的描 述，参见，例如，Dodds和Roberts(1995) Experiments in Plant Tissue Culture，第3版，Cambridge University Press。本发明 的转基因植物可以是能育的或不育的。
也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分得到再生。这样 的再生技术一般地记载在Klee等， Ann.Rev.of Plant Phys.38： 467-486(1987)中。从单个的植物原生质体或各种外植体再生植物， 是本领域众所周知的。参见，例如，Methods for Plant Molecular Biology，A.Weissbach和H.Weissbach，编，Academic Press，Inc.， San Diego，Calif.(1988)。该再生和生长方法包括下述步骤：转化 的细胞和茎干的选择，使转化的茎干生根，和小植株在土壤中的生 长。关于玉米细胞培养和再生，一般地参见，The Maize Handbook， Freeling和Walbot，编，Springer，New York(1994)；Corn and Corn Improvement，第3版，Sprague和Dudley编，American Society of Agronomy，Madison，Wisconsin(1988)。
技术人员能够认识到，重组的表达盒稳定地整合进转基因植物中 并证实是可操作的以后，可以通过有性杂交将其导入其他植物中。根 据要杂交的物种，可以使用许多标准育种技术中的任一种。
在营养繁殖的作物中，可以通过制备插条或通过组织培养技术繁 殖成熟的转基因植物，以生产多株相同的植物。选择需要的转基因植 物，可以得到新品种，并为商业用途进行营养繁殖。在种子-繁殖的 作物中，可以使成熟的转基因植物自交，以生成纯合的自交植物。自 交植物能生成含有新导入的异源核酸的种子。可以使这些种子生长， 以生成能产生选择表型的植物。也可以使成熟的转基因植物与其他合 适的植物杂交，后者通常是另一种自交系或杂种系，包括例如，等基 因的未转化的自交系。
本发明包括从再生的植物得到的部分，例如花、种子、叶子、枝、 果实等，前提是这些部分包含含有本发明的分离的核酸的细胞。再生 的植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，前提是这些 植物包含导入的核酸序列。
通过例如标准的免疫印迹和DNA检测技术，可以针对传播本发明 的核酸筛选能表达选择标记的转基因植物。一般地，还评价转基因系 的异源核酸的表达水平。可以初步地确定RNA水平的表达，以鉴别和 定量表达-阳性的植物。可以使用标准的RNA分析技术，其包括PCR 扩增试验，后者使用设计用于仅仅扩增异源的RNA模板的寡核苷酸引 物，且包括使用异源核酸-特异性的探针的溶液杂交测定。然后，通 过使用本发明的可特异性地反应的抗体的蛋白免疫印迹分析，可以分 析RNA-阳性的植物的蛋白表达。另外，分别使用异源核酸特异性的 多核苷酸探针和抗体，可以根据标准方法实现原位杂交和免疫细胞化 学，以确定转基因组织内的表达部位。通常，一般筛选许多转基因系 的整合的核酸，以鉴别和选择具有最适当的表达特征的植物。
一些实施方案包含转基因植物，后者对添加的异源核酸是纯合 的；即，所述转基因植物含有2个添加的核酸序列，其是在染色体对 的每个染色体上的相同基因座上的1个基因。通过以下方法可以得到 纯合的转基因植物：有性交配(自交)含有单个添加的异源核酸的杂 合的(aka半合的)转基因植物，使一些产生的种子发芽，并分析得 到的植物与对照植物(即，天然的，非转基因的)相比，对本发明的 多核苷酸的改变的表达。还预期回交至亲本植物，与非-转基因的植 物远交，或与转基因了相同的或另一种或多种性状的植物远交。
还预期，转化的植物可以用于传统的育种计划，包括如US 5,706,603和US 5,704,160所公开的TOPCROSS授粉系统，它们中的 每一篇的内容在本文中引作参考。
除了Berger、Ausubel和Sambrook以外，关于植物细胞克隆、 培养和再生的有用的一般参考文献包括：Jones(编)(1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols--Methods in Molecular Biology，Volume 49 Humana Press Towata NJ；Payne等(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY(Payne)；和Gamborg和Phillips(编) (1995) Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)(Gamborg)。许多细胞培养基记载在Atlas 和Parks(编) The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL(Atlas)。关于植物细胞培养的其他信息， 可以在商业上得到的文献中找到，例如来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的 Life Science Research Cell Culture Catalogue(1998) (Sigma-LSRCCC)和，例如，也来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis， MO)的 Plant Culture Catalogue和附录(1997)(Sigma-PCCS)。关 于植物细胞培养的其他细节，参见Croy，(编)(1993) Plant Molecular Biology Bios Scientific Publishers，Oxford，U.K。
构建体和性状的“堆积”
在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与其他目标多核苷酸 序列组合(“堆积的”)使用，以生成具有需要的表型的植物。本发明的 多核苷酸可以堆积了任意的基因或基因的组合，且产生的组合可以包 括任意的一个或多个目标多核苷酸的多个拷贝。理想的组合会影响一 个或多个性状；也就是说，可以建立某些组合，来调节会影响ACC合 酶活性和/或乙烯生产的基因表达。可以设计其他的组合，来生产具 有许多理想性状的植物，所述的性状包括但不限于动物饲料所需的性 状，例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸 (例如hordothionins(美国专利号5,990,389；5,885,801； 5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等(1987) Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白 (Pedersen等(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等(1988) Gene 71：359；和Musumura等(1989) Plant Mol.Biol.12：123))； 提高的可消化性(例如，改性的储存蛋白(2001年11月7日提交的 美国申请系列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交 的美国申请系列号10/005,429))，其公开内容在本文中引作参考。 本发明的多核苷酸也可以堆积了昆虫、疾病或除草剂抗性所需的性状 (例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(美 国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881； Geiser等(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等(1994) Plant Mol.Biol.24：825)；串珠镰孢菌素解毒基因(美国专利号 5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science 262：1432；Mindrinos等 (1994)Cell 78：1089)；能产生除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突 变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，例如膦丝 菌素或草铵膦(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；以及 加工或加工产物所需的性状，例如高油(例如，美国专利号 6,232,529)；改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号 5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶 (AGP酶)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))； 和聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶、 多羟基丁酸盐合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等(1988)J. Bacteriol.170：5837-5847)，也会促进多羟基链烷酸酯(PHA)的表 达)，文献的公开内容在本文中引作参考。人们也可以组合本发明的 多核苷酸和能影响农艺学性状(例如雄性不育(例如，参见美国专利 号5.583,210)，茎强度，开花时间)或转化技术性状(例如细胞周 期调节或基因靶向(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821))的多核苷酸，文献的公开内容在本文中引作参考。
通过任意的方法，包括但不限于通过任意的常规的或TopCross 方法或遗传转化杂交育种植物，可以生成这些堆积的组合。如果通过 遗传转化植物堆积了性状，则可以在任意的时间且以任意的次序组合 目标多核苷酸序列。例如，可以将包含一个或多个理想性状的转基因 植物用作靶，以通过随后的转化导入其他性状。可以在共转化方法 中，与由任意的转化盒组合提供的目标多核苷酸同时导入性状。例 如，如果要导入2个序列，则这2个序列可以包含在分开的转化盒中 (反式)，或者包含在相同转化盒中(顺式)。目标序列的表达，可以由 相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能需要导入能 抑制目标多核苷酸的表达的转化盒。这可以通过其他抑制盒或超表达 盒的任意组合来实现，以在植物中产生需要的性状组合。
在育种方法中的用途
本发明的转化的植物可以用于植物育种程序。植物育种的目标 是，在单一品种或杂种中组合多种需要的性状。对于田间作物，这些 性状可以包括，例如，对疾病和昆虫的抗性，对热和干旱的耐受性， 缩短的作物成熟时间，更高的产量，和更好的农艺学质量。在机械收 获许多作物时，植物特性(例如发芽和群丛建立、生长速度、成熟度 和植株和穗高度)的均匀性是需要的。传统的植物育种是开发新的和 改良的商业作物的重要工具。本发明包括通过使第一种亲本玉米植物 与第二种亲本玉米植物杂交生产玉米植物的方法，其中一种或两种亲 本玉米植物是能表现出如本文所述的保绿表型、不育表型、拥挤抗性 表型等的转化的植物。
本领域已知的且用于玉米植物育种程序的植物育种技术包括但 不限于，轮回选择、集团选择、混合选择、回交、谱系育种、自由传 粉育种、限制性片段长度多态性增强的选择、遗传标记增强的选择、 双单倍体和转化。经常使用这些技术的组合。
通常，在玉米植物育种程序中，玉米杂种的开发需要纯合的自交 系的开发，这些系的杂交，和杂交的评价。可以得到许多分析方法， 来评价杂交的结果。最老的且最传统的分析方法是观察表型性状。或 者，可以检查植物的基因型。
使用植物育种领域众所周知的传统育种技术，可以将已经使用转 化技术工程改造进特定玉米植物中的遗传性状移动到另一个系中。例 如，经常使用回交方法来将转基因从转化的玉米植物移动到原种自交 系中，这样得到的后代会包含转基因。同样，如果使用自交系进行转 化，则可以使转基因植物杂交不同的自交系，以生产转基因的杂种玉 米植物。如本文所使用的，根据上下文，“杂交”可以指简单的X和 Y杂交或回交的过程。
在玉米植物育种程序中，玉米杂种的开发包含3个步骤：(1)从 多个种质库选择用于初次育种杂交的植物；(2)使从育种杂交选择的 植物自交数代，以产生一系列的自交系，它们尽管彼此不同但却是纯 育的，且是高度均匀的；和(3)使选择的自交系与不同的自交系杂 交，以产生杂种。在玉米的自交过程中，系的活力会降低。当2个不 同的自交系发生杂交、产生杂种时，会恢复活力。自交系的纯合性和 同质性的重要后果是，通过杂交特定自交对所生成的杂种总是相同 的。一旦已经鉴别出了能产生优良杂种的自交系，则可以无限地繁殖 杂种种子，只要能维持自交亲本的同质性即可。
本发明的转基因植物可以用于生产例如单交杂种、三系杂种或双 交杂种。当2个自交系杂交生成F1后代时，会生成单交杂种。使4 个自交系以(AxB和CxD)的配对杂交，然后使2个F1杂种再次 杂交(AxB)x(CxD)时，会生成双交杂种。从3个自交系可以生 成三系杂交杂种，其中使2个自交系杂交(AxB)，然后使得到的F1 杂种与第3个自交系杂交(AxB)xC。F1杂种表现出的许多杂种活 力和均匀性会在下一代(F2)中丧失。结果，消费而不种植由杂种生 成的种子。
抗体
可以使用本发明的多肽来生产对SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9和SEQ ID NO.：11的多肽和其保守变体特异性的抗体。对例如SEQ ID NO：7-9 和11和相关变体多肽特异性的抗体可以用于例如筛选和鉴别目的， 例如，与ACC合酶的活性、分布和表达有关的目的。
通过本领域众所周知的方法，可以生成对本发明的多肽特异性的 抗体。这样的抗体可以包括但不限于，多克隆的、单克隆的、嵌合的、 人源化的、单链的、Fab片段和由Fab表达文库产生的片段。
多肽不需要用于抗体生产的生物活性。全长多肽、子序列、片段 或寡肽可以是抗原性的。用于诱导特异性的抗体的肽一般具有至少约 10个氨基酸、且经常至少15或20个氨基酸的氨基酸序列。短链多 肽，例如，选自SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的多肽， 可以与另一种蛋白融合，后者例如匙孔血蓝蛋白和针对嵌合分子生成 的抗体。
用于生产多克隆和单克隆抗体的许多方法是本领域的技术人员 已知的，且可以适用于生产对本发明的多肽特异性的抗体，例如，与 SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11相对应的。参见，例如， Coligan(1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene， NY；和Harlow和Lane(1989) Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NY；Stites等(编) Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA， 和其中引用的文献；Goding(1986) Monoclonal Antibodies： Principles and Practice(第2版)Academic Press，New York，NY； Fundamental Immunology，例如，第4版(或更晚版本)，W.E.Paul (编)，Raven Press，N.Y.(1998)；和Kohler和Milstein(1975) Nature 256：495-497。其他合适的抗体制备技术包括在噬菌体或类 似载体中选择重组抗体文库。参见，Huse等(1989) Science 246： 1275-1281；和Ward，等(1989) Nature 341：544-546。特异性的单 克隆和多克隆抗体和抗血清通常会以至少约0.1μM、优选地至少约 0.01μM或更好、和最一般地且优选地0.001μM或更好的KD进行结 合。
用于调节保绿潜力或不育性的试剂盒
本发明的某些实施方案可以任选地作为试剂盒提供给用户。例 如，本发明的试剂盒可以含有一种或多种核酸、多肽、抗体、诊断核 酸或多肽，例如，抗体，探针组，例如，作为cDNA微阵列，一种或多 种如本文所述的载体和/或细胞系。最经常地，将试剂盒包装在合适 的容器中。试剂盒一般还包含一种或多种其他的试剂，例如，用于标 记表达产物的底物、标记、引物等，管和/或其他附件，用于收集样 品的试剂，缓冲液，杂交室，盖玻片，等。试剂盒还任选地包含说明 书组或用户手册，它们详细说明了优选的使用试剂盒组分来发现或应 用基因集合的方法。当根据说明书使用时，试剂盒可以用于例如评价 植物样品中的表达或多态性，例如，用于评价ACC合酶、乙烯生产、 保绿潜力、拥挤抗性潜力、不育性等。或者，可以根据使用至少一种 ACC合酶多核苷酸序列的说明书，使用试剂盒来控制植物的保绿潜 力。
作为另一个实例，用于调节植物的不育性(例如，雄性不育)的 试剂盒包括容器，它装有至少一种包含核酸序列的多核苷酸序列，其 中该核酸序列与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ ID NO：3(gACS7)、SEQ ID NO：4(cACS2)、SEQ ID NO：5(cACS6)、 SEQ ID NO：6(cAC7)或SEQ ID NO：10(CCRA178R)或其子序列或其互 补序列具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、 至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的同一性。试 剂盒也任选地包含关于使用至少一个多核苷酸序列控制植物的不育 性(例如，雄性不育)的说明材料。
其他核酸和蛋白测定
在本发明的上下文中，根据众所周知的分子生物学方法，操作核 酸和/或蛋白。关于许多这样的方法的详细方案，记载在例如，Ausubel 等 Current Protocols in Molecular Biology(supplemented through 2004)John Wiley & Sons，New York(“Ausubel”)；Sambrook 等 Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，Vol.1-3， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York， 1989(“Sambrook”)，和Berger和Kimmel  Guide to Molecular Cloning TechnIques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)。
除了上面的文献外，可以用于例如扩增本发明的多核苷酸的体外 扩增技术的方案，例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ- 复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA)，可参见： Mullis等(1987)美国专利号4,683,202； PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis等编)Academic Press Inc. San Diego，CA(1990)(“Innis”)；Arnheim和Levinson(1990) C&EN 36； The Journal Of NIH Research(1991)3：81；Kwoh等(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86，1173；Guatelli等(1990) Proc Natl Acad Sci USA 87：1874；Lomell等(1989) J Clin Chem 35：1826； Landegren等(1988) Science 241：1077；Van Brunt(1990) Biotechnology 8：291；Wu和Wallace(1989)Gene 4：560； Barringer等(1990)Gene 89：117，和Sooknanan和Malek(1995) Biotechnology 13：563。在本发明的上下文中，可以用于克隆核酸的 其他方法包括Wallace等美国专利号5,426,039。改进的通过PCR 扩增大核酸的方法总结在Cheng等(1994) Nature 369：684和其中 的参考文献。
利用多种包含基于单核苷酸-和/或三核苷酸的亚磷酰胺偶联化 学的固相方法，可以合成本发明的某些多核苷酸。例如，通过向延伸 的多核苷酸链顺序添加活化的单体和/或三聚体，可以合成核酸序 列。参见例如，Caruthers，M.H.等(1992) Meth Enzymol 211：3。 代替合成需要的序列，可以从许多商业渠道定制基本上任何核酸，例 如The Midland Certified Reagent Company(mcrc@oligos.com) (Midland，Texas)，The Great American Gene Company(可以在 genco.com从环球网上得到)(Ramona，CA)，ExpressGen，Inc.(可 以在expressgen.com从环球网上得到)(Chicago IL)，Operon Technologies，Inc.(可以在operon.com从环球网上得到)(Alameda CA)，和许多其他的。
实施例
下面的实施例用于解释而不是限制要求保护的发明。
实施例1：ACC合酶敲除的玉米的分离
因为已经将乙烯与促进一些物种的叶子衰老相关联，所以为了将 保绿潜力导入例如玉米中，我们通过灭活ACC合酶基因，减少了玉米 叶子中的乙烯生物合成。玉米ACC合酶基因家族由3个成员组成： ACS2、ACS6和ACS7。为了分离乙烯突变体，我们使用玉米的性状实 用系统(TUSC)，筛选了ACC合酶基因家族的每个成员的破坏。迄今为 止，我们已经通过跨过Mu/ACC合酶接头的测序，确定了8个突变系 (3个ACS6和5个ACS2)的准确的Mu插入位点。5个插入能稳定地遗 传；在图2中标明了它们的位置，该图也示意地说明了ACS7。
在ACS家族的单个基因成员以杂合突变体状态存在的那些植物的 叶子中，观察到了显著的保绿表型(参见图3，小图A、B、C和D)。 当以纯合突变体状态存在时，甚至观察到了更显著的保绿表型(参见 图4)。在图4中，将来自野生型(左侧)、杂合的ACC合酶敲除(中间) 和纯合的ACC合酶敲除(右侧)的叶子在黑暗中覆盖7天。来自纯合的 ACC合酶敲除的植物的叶子表现出了比杂合的ACC合酶敲除的叶子更 大的保绿性状，且表现出了比野生型植物的叶子基本上更大的保绿性 状。
导入的保绿潜力的程度是基因成员特异性的。结果，将强保绿性 状与一个成员(例如，ACS6)的突变一起导入，而将不太显著的保绿表 型与另一个成员(例如，ACS2)的突变一起导入。因此，导入系中的保 绿潜力的程度将受下述因素的控制：导入了哪一个突变的基因成员， 突变的基因成员是以杂合的还是以纯合的状态存在，和灭活的该家族 的成员的数目(例如，ACS2/ACS6双突变体具有强保绿表型)。与提 高的杂种直立性(standability)有关的性状包括对杆腐病和叶枯病 的抗性、遗传的茎强度、短植株高度和穗位置、和高保绿潜力。
一般地，叶子经历从开始经过扩展，最终以衰老结束的一般进 展。在扩展过程中，碳固定能力也增加，并最终在整个衰老期间降低 到低水平。参见，例如，Gay AP和Thomas H(1995)Leaf development in Lolium temulentum：photosynthesis in relation to growth and senescence. New Phytologist 130：159-168。这与谷类物种特别有 关，其中产量潜力很大程度上依赖于植物的固碳和将碳储存在种子中 (主要以淀粉的形式)的能力。启动衰老的时间选择和其进展的速度 均对最终有助于植物的特定叶子的总碳有显著的影响。参见，例如， Thomas H和HowarthCJ(2000)Five ways to stay green. Journal of Experimental Botany 51：329-337。这与能诱导过早的叶子衰老 的不利环境条件会减少产量潜力的那些作物特别相关。保绿是用于描 述表型的一般术语，其与标准参照相比，由此可以延迟叶子衰老(通 过与叶绿素降解有关的叶子的黄化，可以最容易地区分)。参见，例 如，Thomas和Howarth，同上。在高粱中，已经鉴别出了几个保绿基 因型，其能在籽粒灌浆和成熟过程中表现出叶子衰老的延迟。参见， 例如，Duncan RR，等(1981)Descriptive comparison of senescent and non-senescent sorghum genotypes. Agronomy Journal 73： 849-853。另外，在有限的水可获得性的条件下，这一般会加速叶子 衰老(例如，Rosenow DT和Clark LE(1981)Drought tolerance in sorghum.In：Loden HD，Wilkinson D，编 Proceedings of the 36th annual corn and sorghum industry research conference，18-31)， 这些基因型能保持更多的绿叶子区域，且能继续正常地灌浆(例如， McBee GG，等(1983)Effect of senescence and non-senescence on carbohydrates in sorghum during late kernel maturity states. Crop Science 23：372-377；Rosenow DT，等(1983)Drought- tolerant sorghum and cotton germplasm. Agricultural Water Management 7：207-222；和Borrell AK，Douglas ACL(1996) Maintaining green leaf area in grain sorghum increases yield in a water-limited environment.In：Foale MA，Henzell RG， Kneipp JF，编 Proceedings of the third Australian sorghum conference.Melbourne：Australian Institute of Agricultural Science，Occasional Publication No.93)。保绿表型还已经用作 开发改良的玉米品种的选择标准，尤其是关于耐旱性的开发。参见， 例如，Russell WA(1991)Genetic improvement of maize yields. Advances in Agronomy 46：245-298；和Bruce等，(2002)，Molecular and physiological approaches to maize improvement for drought tolerance、 Journal of Experimental Botany，53(366)：13-25。
已经描述了5种根本不同类型的保绿。参见，例如，Thomas H 和Smart CM(1993)Crops that stay green. Annals of Applied Biology 123：193-219；和Thomas和Howarth，同上。在类型A保绿 中，延迟了衰老程序的启动，但是然后以正常的速度进行。在类型B 保绿中，尽管衰老程序的启动没有变化，但进展相对更慢。在类型C 保绿中，尽管以正常的速度进行衰老(如通过测量生理功能所确定 的，例如光合能力)，但仍然能保持叶绿素。类型D保绿是更人工的， 因为杀死叶子(即通过冷冻、煮沸或干燥)能阻止衰老程序的启动，从 而终止叶绿素的降解。在类型E保绿中，叶绿素的起始水平更高，然 而叶子衰老的启动和进展没有变化，由此给出相对更低的进展速度的 假象。类型A和B是功能性保绿的，因为光合能力随着叶绿素含量而 维持，并且它们是与高粱的高产量和耐旱性相关的类型。尽管该性状 具有潜在重要性，尤其是与高产量和耐旱性相关的利益，但在理解遗 传决定的保绿的生物化学的、生理的或分子的基础方面，几乎没有取 得进展。参见，例如，Thomas和Howarth，同上。
已经显示，许多环境的和生理的条件能显著改变叶子衰老的时间 选择和进展，且可以提供关于该性状的基础的了解。在环境因素中， 光可能是最明显的，且已经长期地认为，通过将脱落的叶子置于黑暗 中，可以在许多植物物种中诱导叶子衰老。参见，例如，Weaver LM， Amasino RM(2001)Senescence is induced in individually darkened Arabidopsis leaves，but inhibited in whole darkened plants. Plant Physiology 127：876-886。还已经显示有限的营养 和水可获得性会过早地诱导叶子衰老(例如，Rosenow DT， Quisenberry JE，Wendt CW，Clark LE(1983)Drought-tolerant sorghum and cotton germplasm. Agricultural Water Management 7：207-222)。在生理决定因素中，生长调节剂在指导叶子衰老程序 中起关键作用。特别相关的是，观察到了细胞分裂素水平的改变可以 明显延迟叶子衰老。例如，用异戊烯基转移酶(ipt)(一种能编码细 胞分裂素生物合成中的限速步骤的土壤杆菌基因)转化的植物，当置 于衰老诱导型的启动子控制下时，会导致自身调节的细胞分裂素生产 和强保绿表型。参见，例如，Gan S，Amasino RM(1995)Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270：1986-1988。乙烯也已经涉入控制叶子衰老(例如，Davis KM和Grierson D(1989)Identification of cDNA clones for tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)mRNAs that accumulate during fruit ripening and leaf sencescence in response to ethylene. Planta 179：73-80)，且乙烯生产或感觉受损的植物也会表现出叶子 衰老的延迟(例如，Picton S，等(1993)Altered fruit ripening and leaf senescence in tomatoes expressing an antisence ethylene-forming enzyme transgene. The Plant Journal 3： 469-481；Grbic V和Bleeker AB(1995)Ethylene regulates the timing of leaf senescence in Arabidopsis. The Plant Journal 8：95-102；和John I，等(1995)Delayed leaf senescence in ethylene-deficient ACC-oxidase antisence tomato plants： molecular and physiological analysis. The Plant Journal 7： 483-490)，其可以通过外源应用乙烯生物合成和作用的抑制剂得到拟 表型(例如，Abeles FB，等(1992) Ethylene in Plant Biology. Academic Press，San Diego，CA)。
在确定乙烯在植物生长和发育中的重要作用时，鉴别和分析有乙 烯生物合成和感觉缺陷的拟南芥和番茄的突变体是有价值的。突变体 分析还有助于鉴别和表征乙烯信号转导途径。尽管已经在双子叶植物 (例如，拟南芥和番茄)中鉴别出了许多乙烯突变体，但是在单子叶植 物(例如，稻、小麦和玉米)中尚未鉴别出这样的突变体。在本文中 描述了ACC合酶缺陷的玉米突变体的鉴别，该ACC合酶是乙烯生物合 成途径中的第一种酶。在阐明乙烯在谷类发育过程中的调节作用以及 它在调节对环境应激的反应中的作用时，这些突变体是至关重要的。 从这样的突变体分析得到的知识，会增加关于乙烯在玉米发育中的作 用的理解，且与其他谷类作物物种有关。
突变体是乙烯生产缺乏的，且表现出了保绿表型。在正常的生长 条件下，且在延长的能在野生型植物中诱导过早开始叶子衰老的干旱 条件后，观察到了保绿。除了在水应激过程中叶绿素的维持外，ACC 合酶-缺乏的叶子能维持光合作用功能，并继续同化CO2。令人惊奇的 是，在正常的生长条件下，减少乙烯生产会改善所有叶子中的叶子功 能，并在干旱-应激的植物中维持高水平的功能，即使是对于那些在 野生型植物的类似年龄的叶子中尚未诱导衰老的叶子。这些发现表 明，乙烯可以用于在正常的生长条件下调节叶子功能，以及对干旱条 件作出响应。
材料和方法
从玉蜀黍克隆ACC合酶基因
为了有利于从玉米克隆ACC合酶基因，使用目前可以从GenBank 得到的序列信息，为在多个单子叶植物和双子叶植物物种中高度保守 的区域设计了引物。使用引物ACCF1(ccagatgggcctcgccgagaac；SEQ ID NO：12)和ACCl(gttggcgtagcagacgcggaacca；SEQ ID NO：13)， 在玉米基因组DNA上进行了初步的PCR反应，并揭示了3个不同大小 的片段的存在。对所有3个片段进行了测序，并证实了与其他已知的 ACC合酶基因的序列的高度相似性。
为了得到每个基因的完整基因组序列，使用Prime-a-Gene标记 系统(Promega)，用dCTP放射性标记了所有3个片段，并根据上面 Sambrook所述的方法，将其用于筛选EMBL3玉米(B73)基因组文库 (Stratagene)。在含有5X SSPE、5X Denhardt’s、50％甲酰胺和1％SDS 的缓冲液中，在30℃杂交过夜。在45℃，依次在含有0.1％SDS的1X SSPE和0.1X SSPE中洗涤印迹，并用增厚剂屏，在-80℃曝光于胶片。 共筛选了36个汇合的平板(150mm直径)。随后，通过使用上面的引 物的PCR，直接筛选了推定阳性的噬菌斑，以鉴别哪个克隆含有与最 初鉴别的3个片段相对应的片段。使用HotStarTaq(Qiagen)，完成 了PCR筛选。反应物在25μl总反应体积中含有1X缓冲液、200μM 每种dNTP、3μM MgCl2、0.25μM正向和反向引物、1.25U HotStarTaq 和作为模板的1μl原代噬菌体稀释液(总计1/600，在SM缓冲液 中)。反应条件如下：95℃/15分钟(1个循环)；95℃/1分钟、62℃ /1分钟、72℃/2分钟(35个循环)；72℃/5分钟(1个循环)。在1％ 琼脂糖凝胶上分离了样品，并用溴化乙锭染色后，显现产物。还对扩 增的所有片段进行限制分析，以鉴别其他潜在的序列特异性的独立于 子序列大小的差异。
为了有利于对这些基因的剩余部分进行测序，与对EMBL3载体的 左臂(gacaaactgcgcaactcgtgaaaggt；SEQ ID NO：14)或右臂 (ctcgtccgagaataacgagtggatct；SEQ ID NO：15)特异性的引物一起， 使用了引物ACCF1和ACC1，以扩增每一半基因。使用Takara LA Taq (Panvera)来扩增较大尺寸的片段。反应物在25μl总体积中含有1μl 噬菌体稀释液(总计1/600，在SM缓冲液中)和2μM每种引物(终浓 度)、1X缓冲液(终浓度)、400μM dNTP混合物(终浓度)和1.25U LA Taq。在下面的条件下，进行了反应：98℃/1分钟(1个循环)；98℃ /30秒、69℃/15分钟(35个循环)；72℃/10分钟(1个循环)。使用 StrataPrep PCR纯化试剂盒(Stratagene)，纯化了扩增的产物，并 送到University of Florida，Gainesville的测序机构，进行直接 测序。
ACC合酶敲除的突变体的鉴别
已经证实，玉米是突变体的丰富来源，部分地由于在它的基因组 中存在有活性的或以前有活性的转座因子系统。准确地取决于插入位 点在基因中的位置，转座子可以部分地或完全地灭活基因的表达。根 据冗余度的量(即存在多个家族成员和家族成员的组织特异性)，基因 灭活可以具有或不具有可观察到的表型。Pioneer Hybrid Int.开发 的玉米的性状实用系统(TUSC)是有力的基于PCR的筛选策略，它可以 用于鉴别特定基因中的Mu转座子插入，而无需可观察的表型。该筛 选方法最适合事先已经从玉米分离出的靶基因的。该系统使用TIR- PCR，其中一种PCR引物源自靶基因，而另一种(Mu-TIR)来自Mu的末 端反向重复序列(TIR)区。使用这些从大量含有Mu的植物收集的DNA 的PCR反应中的引物，可以通过使用靶基因作为探针的DNA印迹杂 交，鉴别出成功的扩增。然后，筛选阳性库中的个体，以鉴别在靶基 因中含有Mu元件插入的候选系。为了确定插入事件是限于体细胞还 是也存在于种系中(且因此代表着可遗传的变化)，可以对来自候选品 的后代进行与在原始筛选中使用的相同的PCR/DNA印迹杂交分析。
建立了研究计划，以鉴别乙烯生物合成中的敲除的突变体。为 此，使用对上面讨论的玉米ACC合酶基因特异性的4个引物(ACCF1， ccagatgggcctcgccgagaac，SEQ ID NO：12；ACC-1， gttggcgtagcagacgcggaacca，SEQ ID NO：13；ACC-C， cagttatgtgagggcacaccctacagcca，SEQ ID NO：16；ACC-D， catcgaatgccacagctcgaacaacttc，SEQ ID NO：17)，与Mu-TIR引物 (aagccaacgcca(a/t)cgcctc(c/t)atttcgt；SEQ ID NO：18)一起筛选 Mu插入。初步筛选可以推定地鉴别出19个单独的系，它们携带玉 米ACC合酶多基因家族中的Mu插入。播种来自每个系的种子，并从 每个个体的叶子提取DNA。为了DNA分离，从每株植物分离了1cm2 幼苗叶子，并置于装有一些沙的1.5ml离心管中。在液氮中快速冷冻 样品，并使用一次性的研杵(Fisher Scientific)研磨成细粉。立即 加入600μl提取缓冲液(100mM Tris(pH8.0)，50mM EDTA，200mM NaCl，1％SDS，10μl/ml β-巯基乙醇)，彻底混合。加入700μl苯 酚/氯仿(1∶1)，在12,000rpm离心样品10分钟。将500μl上清液 取到新管中，并在加入1/10体积3M醋酸钠和1体积异丙醇后，在 -20℃沉淀核酸。通过在12,000rpm离心，沉淀总核酸，用75％乙醇 洗涤3X，并重新悬浮到600μl H2O中。使用HotStarTaq(Qiagen)， 完成了PCR筛选。反应物在25μl总反应体积中含有1X缓冲液、200 μM每种dNTP、3mM MgCl2、0.25μM ACC合酶特异性的引物(ACCFl、 ACC-1、ACC-C或ACC-D)、0.25μM Mu特异性的引物(MuTIR)、0.25μl HotStarTaq和作为模板的1.5μl总核酸。反应条件如下：95℃/15 分钟(1个循环)；95℃/1分钟、62℃/1分钟、72℃/2分钟(35个循 环)；72℃/5分钟(1个循环)。在1％琼脂糖凝胶上分离了PCR产物， 用溴化乙锭染色后显现，并根据Sambrook等(1989)所述的方法转 移到尼龙膜上。如上面关于文库筛选所述，进行DNA印迹分析，只是 除了将杂交温度升高至45℃。从13个推定突变系中的每一个，播种 BC1(回交1)种子，并通过PCR/DNA印迹分析(如上所述)进行筛选。 在这些系中，发现只有5个系是稳定遗传的。将这5个系另外回交4 次，以使不相关的Mu插入的作用最小化。
使BC5种子自花传粉，以产生纯合的无效个体。通过使用Takara LA Taq和ACCFl和ACC-1引物的PCR，鉴别出了纯合的无效个体系。 反应物在25μl总体积中含有1μl叶子DNA、2μM每种引物(终浓 度)、1X缓冲液(终浓度)、400μM dNTP混合物(终浓度)和1.25U LA Taq。在下面的条件下进行反应：98℃/1分钟(1个循环)；98℃/30 秒、69℃/15分钟(35个循环)；72℃/10分钟(1个循环)。使用这些 引物和条件的野生型B73DNA的PCR，导致了与鉴别出的3个基因相 对应的3个不同大小的片段的扩增。对于一个无效插入-等位基因是 野生型或杂合的个体，会表现出该特征模式，而对于一个无效插入- 等位基因是纯合的个体，则缺少与插入所在的基因相对应的子序列。
为了确定Mu插入位点的准确位置，与MuTIR引物组合使用ACCF1 或ACC-1引物，扩增了来自每个系的PCR产物。然后，使用Mu-TIR 引物，跨过Mu/靶基因接头对这些片段测序。在图2中显示了这些Mu 元件在每个ACC合酶基因内的位置。
蛋白提取
为了总蛋白分离，在指定的时间收集了B73或突变植物的叶子， 在液氮中快速冷冻，并研磨成细粉。将1ml提取缓冲液(20mM HEPES (pH7.6)，100mM KCl，10％甘油)加入约0.1g冷冻的粉末中，并彻 底混合。在10,000rpm离心样品10分钟，将上清液取到新管中，并 根据Bradford(1976)的方法，以分光光度法确定了浓度。参见， Bradford MM(1976)A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem.72：248-254. (参见图18)。
叶绿素提取
在液氮中快速冷冻叶子，并研磨成细粉。将约0.1g样品取到 1.5ml管中，并称重。用1ml(或0.8ml)80％丙酮提取叶绿素5 次。合并单独的提取物，并用另外80％丙酮调节终体积至10ml(或 15ml)。根据Wellburn(1994)的方法，以分光光度法确定了叶绿 素含量(a+b)。参见，Wellburn，A.R.(1994)The spectral determination of chlorophylls a and b，as well as total caretenoids，using various solvents with spectrophotometers of different resolution. J.Plant Physiol.144：307-313.(参 见图17)。
光合作用的测量
在正常的和干旱-应激条件下，在田间使植物生长。给正常的植 物灌溉8小时，每周2次。对干旱-应激的植物，将水限制在约4小 时/周，从授粉前约1周开始，持续到授粉后3周。在该有限的水可 获得性阶段，干旱-应激的植物表现出了可看到的萎蔫和卷叶的迹 象。用便携的TPS-1光合作用系统(PP Systems)，确定了蒸腾、气 孔导度和CO2同化作用。在授粉后第40天，测量了植物上的每片叶 子。数值代表着6次测定的平均值。参见图5和6。
DNA和RNA纯化
为了总核酸分离，在所需的时间收集了B73的叶子，在液氮中快 速冷冻，并研磨成细粉。加入10ml提取缓冲液(100mM Tris(pH8.0)， 50mM EDTA，200mM NaCl，1％SDS，10μl/ml β-巯基乙醇)，并彻底 混合，直到解冻。加入10ml苯酚/氯仿(1∶1，体积∶体积)，并彻底 混合。在8,000rpm离心样品10分钟，将上清液取到新管中，并在 加入1/10体积3M醋酸钠和1体积异丙醇后，在-20℃沉淀核酸。通 过在8,000rpm离心，沉淀总核酸，并重新悬浮在1ml TE中。将一 半制备物(prep)用于DNA纯化，而将剩余的一半用于RNA纯化。(或 者，可以从1cm2幼苗叶子中提取DNA或总核酸，在液氮中快速冷冻， 并研磨成细粉。加入600μl提取缓冲液[100mM Tris(pH8.0)，50 mM EDTA，200mM NaCl，1％SDS，10μl/ml β-巯基乙醇]，并混合样 品。用700μl苯酚/氯仿(1∶1)提取样品，并在12,000rpm离心10 分钟。沉淀DNA，并重新悬浮在600μl H2O中。)
为了DNA纯化，将500μg无DNA酶的RNA酶加入管中，并在37 ℃温育1小时。在RNA酶消化后，加入等体积的苯酚/氯仿(1∶1，体 积∶体积)，并彻底混合。在10,000rpm离心样品10分钟，将上清液 取到新管中，并在加入1/10体积3M醋酸钠和1体积异丙醇后，在 -20℃沉淀DNA。将DNA重新悬浮到无菌水中，并以分光光度法确定 浓度。为了确定DNA完整性，在1.8％琼脂糖凝胶上分离了20mg DNA， 并在溴化乙锭染色后显现。根据上面Sambrook等所述的方法，通过2 轮LiCl2沉淀，纯化了RNA。
实时RT-PCR分析
用RQ1 DNA酶(Promega)处理了50μg总RNA，以确保不存在污 染的DNA。使用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen)，以寡脱氧胸苷酸(20) 作为引物，将2μg总RNA直接用于cDNA分析。
使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)，完成了转录 物丰度的分析。反应物在25μl总反应体积中含有1X缓冲液、0.5μl 反向转录反应物(相当于50ng总RNA)和0.25μM(终浓度)正向和 反向引物(参见下面的表2)。
                                     表2   基因   正向引物(5’-3’)   反向引物(5’-3’)   ZmACS47   atcgcgtacagcctctccaagga   SEQ ID NO：19   gatagtcttttgtcaaccatcccataga   SEQ ID NO：20   ZmACS50   atcgcgtacagcctctccaagga   SEQ ID NO：21   caacgtctctgtcactctgtgtaatgt   SEQ ID NO：22   ZmACS65   agctgtggaagaaggtggtcttcgaggt   SEQ ID NO：23   agtacgtgaccgtggtttctatga   SEQ ID NO：24
在下面的条件下，使用ABI PRISM 7700序列检测系统进行反应： 95℃/15分钟(1个循环)；95℃/30秒、62℃/30秒、72℃/2分钟(50 个循环)；72℃/5分钟(1个循环)。对每个基因分析了最少4次。
在琼脂糖凝胶上初次运行和显现了所有引物组合，以证实正确大 小的单一产物的存在。将所有扩增产物亚克隆进pGEM-T Easy载体系 统(Promega)中，以用于生成标准曲线，以有利于表达数据向拷贝/ μg RNA基础的转化。
乙烯测定
在授粉后20、30或40天(DAP)，从处于4-叶子阶段的幼苗叶子 的第2片完全-展开的叶子，或者从植物叶子的末端15cm，测量了 乙烯。在指定的时间收获了叶子，并在收集乙烯前回收在潮湿的纸巾 之间2小时。将叶子置于玻璃瓶中，并盖上橡胶隔片。在温育3-4小 时后，从每个瓶取样0.9mL顶部空间，并使用配备了基于HP Plot氧 化铝的毛细管柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)的6850 系列气相色谱系统(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)，测量了乙 烯含量。为每个样品测量了组织鲜重。测量了一式三份，并记录平均 值和标准差。
蛋白印迹分析
在指定的时间收集B73叶子，并在液氮中研磨成细粉。将1ml 提取缓冲液[20mM HEPES(pH7.6)，100mM KCl，10％甘油，1mM PMSF]加入约0.1g冷冻的粉末，并彻底混合。通过在10,000rpm 离心10分钟，沉淀细胞碎片，如(Bradford，1976)所述测定蛋白浓 度。从Tadahiko Mae博士(Tohoku University，Sendai，日本)，得 到了针对稻核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的大亚基的抗血清。使用标 准的SDS-PAGE，分离了蛋白提取物，并通过电印迹将蛋白转移到0.22 μm硝酸纤维素膜上。转移后，将膜在5％牛奶、溶于TPBS(0.1％TWEEN 20，13.7mM NaCl，0.27mM KCl，1mM Na2HPO4，0.14mM KH2PO4) 中的0.01％硫柳汞中封闭，然后用一般在具有1％牛奶的TPBS中以 1∶1000至1∶2000稀释的第一抗体温育1.5小时。然后，用TPBS洗 涤印迹2次，并用稀释至1∶5000-1∶10,000的山羊抗-兔辣根过氧化 酶-缀合的抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.)温育 1小时。用TPBS洗涤印迹2次，并一般使用化学发光(Amersham Corp)，在1-15分钟之间检测信号。
结果
ACC合酶敲除的突变体的鉴别
从自交系B73分离了能编码ACC合酶的3个基因，并测序(参见， 例如，SEQ ID NO：1-11)。该家族的2个成员(即，ACS2和ACS7)密 切相关(97％氨基酸同一性)，而第3个基因(即，ACS6)是明显更趋异 的(与ACS2和ACS7分别有54％和53％氨基酸同一性)。使用反向遗传 学方法来筛选ACC合酶基因家族成员中的转座子插入(Bensen等 (1995)Cloning and characterization of the maize Anl gene. Plant Cell 7：75-84)。鉴别了19个候选系，并通过末端反向重复序 列(TIR)-PCR，证实了其中的13个在3个ACC合酶基因中的一个中携 带Mu插入。其中，5个系能在第1次回交中将转座子稳定地遗传给 B73，后者另外回交4次，以减少不希望的Mu插入。然后，使植物自 花传粉，以产生纯合的无效个体，后者通过使用ACCF1和ACC-1引 物的PCR进行鉴别(参见方法)。使用这些引物的野生型系或杂合的无 效突变体的PCR扩增，导致了与3个ACC合酶基因相对应的3个不同 大小的片段，而纯合的无效突变体的PCR扩增的产物缺少与突变基因 相对应的片段。使用Mu-TIR引物，通过跨过Mu/ACC合酶接头测序， 测定了每个突变系的Mu插入位点(图2)。5个插入系中的4个在ACS2 中含有Mu：一个突变体在第3个外显子中含有插入，而其他的三个 在第4个外显子中的独特位置含有插入(图2)。第5个插入系在ACS6 的临近3′剪接位点的第2个内含子中含有Mu。定量实时RT-PCR揭 示，在玉米叶子发育过程中，所有3个基因都表达，并证实了Mu插 入会导致ACS表达的丧失或减少。在第1代中鉴别出了ACS7中的插 入，但不能遗传，这表明它们是体细胞突变体，或种系发育需要ACS7 的表达。
关于在胚乳和胚发育过程中ACC合酶表达模式的描述，参见 Gallie和Young(2004)The ethylene biosynthetic and perception machinery is differentially expressed during endosperm and embryo development  Mol Gen Genomics 271：267-281.
ACS6或ACS2基因破坏会减少乙烯合成
玉米叶子中的乙烯放出水平作为叶龄的函数增加(图19小图 C)。在20DAP，在叶子1(最老的活叶子)中观察到了最高水平的乙 烯，该最高水平在30DAP时已经前进到叶子3，且在40DAP时(即， 核成熟)前进到叶子4-5。为了确定上述的ACS6或ACS2的Mu破坏是 否会减少乙烯放出，从野生型和突变的植物的叶子4测量了乙烯。 acs2植物的乙烯放出是野生型植物的约55％，该水平类似于所有的 acs2突变的等位基因(图19小图A-B)。acs6植物的乙烯放出仅仅 是野生型植物的约10％(图19小图B)。acs2/acs6双突变的植物的 乙烯放出类似于acs6植物的。这些数据表明，与ACS2表达的丧失相 比，ACS6表达的丧失会更大地降低玉米叶子生产乙烯的能力。
ACS6的破坏会赋予保绿表型
乙烯放出的相当大增加与野生型叶子中衰老的可视迹象的出现 相关联，这表明乙烯能促进叶子进入衰老程序。如果这样，可以预期 acs6叶子的衰老的延迟，该叶子能生产明显更少的乙烯。为了证实 该可能性，使纯合的(即，acs6/acs6)、杂合的(即，ACS6/acs6)，和 野生型(即，ACS6/ACS6)植物在田间生长，直到授粉后50天。在该 阶段，最老的野生型叶子已经开始衰老，而对应的ACS6/acs6叶子 刚刚开始衰老，且acs6/acs6叶子保持完全绿色。这些观察表明， 乙烯放出水平会决定叶子衰老的时间选择。
在长期暴露于黑暗中以后，也可以诱导衰老。为了确定乙烯放出 的减少是否可以延迟黑暗-诱导的衰老，用套覆盖了来自成年植物的 叶子，以隔离光2周。使用来自新鲜植物(即，20DAP)的叶子来确保 能在实验过程中不发生年龄-相关的衰老，且它们保持附着在植物 上。还使用温室生长的玉米来避免任何加热，后者可能作为覆盖的后 果在田间发生。在2-周黑暗-处理后，实际上在覆盖的野生型叶子的 整个区域(通过从黄至绿的明显转变所指示的由套覆盖的区域，图4 左侧)观察到了衰老。ACS6/acs6叶子的尖已经经历了黑暗-诱导的衰 老，但是剩余的覆盖区域表现出了明显更少的衰老(图4中间)。相反 地，acs6/acs6叶子保持完全的绿色(图4右侧)。衰老程度与每种 生产的乙烯的量相关，其中ACS6/acs6叶子仅仅生产了70％野生型乙 烯，acs6/acs6叶子仅仅生产了14.6％野生型乙烯。这些结果表明， 乙烯能介导黑暗-诱导的衰老的开始，如它对天然衰老的介导一样。 它们也显示，丧失了一个ACS6拷贝的ACS6/acs6杂合突变体能生产 更少的乙烯，且表现出与acs2突变体观察到的类似的弱保绿表型， 所述的acs2突变体也表现出了乙烯放出的中等(即，40％)减少。
为了检查外源的ACC是否能补偿acs6突变体和逆转它的保绿表 型，在20DAP，通过用套覆盖7天，使来自ACS6/ACS6、acs2/acs2 和acs6/acs6植物的第3片最老的、第6片和第9片叶子发生黑暗- 诱导的衰老。在开始实验时，所有叶子都是完全绿的，且保持附着在 植物上。每天一次给acs6/acs6植物供给水或100μM ACC，持续7天。 7天后，在野生型(即，ASC6/ASC6)叶子中已经开始黑暗-诱导的衰 老，尽管它还没有发展到在2周黑暗处理后观察到的程度。黑暗-诱 导的衰老的程度作为叶子年龄的函数增加，从而叶子3表现出了比叶 子6或叶子9(它们更新鲜)更多的衰老，表明衰老的能力随叶子年 龄而增加。在acs2纯合突变体的叶子3中，也观察到了黑暗-诱导 的衰老，尽管它不如在对应的野生型叶子中观察到的显著。虽然acs6 纯合的叶子不表现出与图4中得到的观察相一致的黑暗-诱导的衰 老，但当给acs6叶子灌溉100μM ACC、持续7天时，观察到了与 野生型叶子类似的黑暗-诱导的衰老。ACC处理不会影响未覆盖的 acs6叶子，表明观察到的覆盖的acs6叶子的衰老是黑暗-处理特异 性的。
确定叶子3的叶绿素a+b的水平，证实了观察结果，因为在7 天黑暗处理后，acs6叶子能基本上维持比野生型叶子更多的叶绿 素，但是当灌溉100μM ACC时，不会如此(图20小图A)。ACC处理 自身不会诱导叶绿素的过早丧失，因为灌溉ACC的acs6突变体的未 覆盖的叶子不会丧失叶绿素。acs2叶子仅仅能维持比野生型叶子适 度更大量的叶绿素。用叶子6和叶子9观察到了类似的结果，虽然如 预期的，在这些更新鲜的叶子中的叶绿素的水平高于更老的叶子3样 品中的(图20小图A)。用总可溶叶蛋白观察到了类似的趋势：在黑 暗处理后，acs6叶子能基本上维持比野生型叶子更多的蛋白，但是 当灌溉100μM ACC时，不会如此(图20小图B)。
核酮糖二羧化酶(ribulose biscarboxylase)(Rubisco)的蛋白 印迹分析证实了黑暗-处理的B73叶子相当大地丧失了核酮糖二磷酸 羧化酶-加氧酶，最老的叶子(叶子3)的所述丧失大于最新鲜的(叶子 9)(图20小图C)。黑暗-处理的acs6叶子能基本上维持比黑暗-处 理的野生型叶子更多的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶，且acs2叶子 能维持中等水平的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(图20小图C)。灌溉 100μM ACC的黑暗-处理的acs6叶子丧失了与黑暗-处理的B73叶 子类似的量的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶，表明ACC能补偿ACC合 酶表达的丧失。当将它们维持在光照下时，在ACC-处理的acs6叶子 中没有观察到核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的丧失，表明单独的ACC 处理不会减少核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的水平。这些数据证实 了，外源的ACC可以补偿保绿表型，后者包含叶绿素和叶蛋白(例如 核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)的保持，从而表明这些植物中的衰老 的延迟是acs6突变体中的ACC合酶表达的丧失的减少的后果。
减少乙烯能延迟天然的叶子衰老，并减少叶绿素和蛋白的丧失
已知干旱会诱导叶子衰老的过早开始。为了研究干旱反应是否由 乙烯介导，并确定减少乙烯放出是否可以提高玉米的耐旱性，在较好 灌溉的(8小时，每周2次)和水-应激的条件(每周4小时，持续1个 月，从授粉前约1周开始，持续到授粉后3周)下，使纯合的acs6和 acs2突变的植物和野生型植物在田间生长。在有限的水可获得性阶 段，干旱-应激的植物表现出了叶子萎蔫和卷叶，这是干旱应激的视 觉确认。在水应激处理后，测量了叶子衰老和功能的程度。
在较好灌溉的条件下，最老的叶子的衰老在野生型植物中是明显 的，且在干旱条件的过程中，甚至更明显。用acs2植物观察到了类 似的结果。相反地，在较好灌溉的或干旱条件下，在acs6叶子中没 有观察到可视的衰老迹象。令人感兴趣的是，在acs6叶子中的花色 素苷生产也减少了。
为了证实保绿表型与高水平的叶绿素相关联，测量了叶绿素a 和b的水平。叶绿素随叶子年龄以及植物的年龄而减少(图17小图A 和D)。如预期的，叶绿素的最大减少与衰老的可视开始相关联。在 较好灌溉的条件下，acs6(ACS60/0)叶子中的叶绿素水平最高为已 经开始衰老的野生型植物的对应的叶子的8倍。令人惊奇的是，所有 acs6叶子(包括最新鲜的)中的叶绿素水平相当大地高于野生型植 物(图17小图A)。acs2(ACS2 0/0)叶子中的叶绿素水平中等地高 于野生型植物。这些结果表明，叶绿素含量的增加与乙烯生产的水平 负相关：acs2植物中的乙烯的中等减少与叶绿素含量的中等增加相 关联，而acs6植物中的乙烯的大量减少与叶绿素含量的相当大增加 相关联。这些结果也证实了，减少乙烯可以增加叶绿素的水平，即使 是在能表现出最大叶子功能的新鲜叶中(参见下面)。
在干旱条件下，突变的和野生型植物中的叶绿素水平会减少，但 是降低至仍然大于在野生型植物中的程度(图17小图B-C)。例如， 在水-应激的野生型植物的叶子5中的叶绿素水平与非-干旱植物相 比降低了2.5-倍，而在水-应激的acs6植物的叶子5中，仅仅降低 了20％(图17小图C)。结果，减少乙烯放出能在acs6植物的最老 的叶子中导致叶绿素水平最高为对应的野生型植物的叶子的20倍。 如用非-干旱植物观察到的，所有acs6叶子(包括最新鲜的)中的 叶绿素水平都更高。在干旱条件下，acs2叶子中的叶绿素含量也维 持中等地高于野生型植物。因而，ACS6表达的丧失能减少对水应激 的反应性，因为在那些已经在野生型植物中引起明显的叶绿素丧失的 应激条件下，能基本上维持叶绿素含量。
叶蛋白也随叶子年龄和植物年龄而减少(图18小图D)。如关于 叶绿素所观察到的，蛋白的大部分相当大的减少与衰老的可视开始相 关联(图18小图D)。在非-干旱条件下，acs6叶子中的蛋白水平最 高为已经开始衰老的野生型植物的对应的叶子的2倍(图18小图 A)。如关于叶绿素所观察到的，所有acs6叶子(包括最新鲜的)中 的蛋白水平都相当大地高于野生型植物，而acs2叶子中的蛋白水平 中等地高于野生型植物(图18小图A)。暴露于干旱条件，会在最老 的野生型叶子中导致比在acs6叶子中观察到的更大的蛋白降低(图 18小图B-C)。如用非-干旱植物所观察到的，所有acs6叶子(包括 最新鲜的)中的蛋白水平都更高。这些结果与叶绿素的结果相一致， 并暗示蛋白含量与乙烯放出的水平负相关。它们也证实了，acs6突 变体中的ACC合酶表达的丧失，能减少对水应激的反应性，因为在那 些已经在野生型植物中引起明显的蛋白减少的应激条件下，能基本上 维持蛋白水平。
在较好灌溉的和干旱条件的过程中，减少乙烯能维持叶子功能
叶绿素和蛋白在acs6叶子中的维持表明，也可以维持叶子功 能，例如蒸腾和同化CO2的能力。为研究这一点，当野生型植物的下 面的叶子已经开始衰老时，在40DAP，测量了较好灌溉的acs6和野 生型植物的每片叶子的蒸腾速度、气孔导度和CO2同化速度。acs6 植物的最新鲜的叶子表现出了比对照植物更高的蒸腾速度(图5小图 A)和气孔导度(图5小图B)，而在更老的叶子中没有观察到明显的 差异。相反地，所有acs6植物的叶子中的CO2同化速度基本上高于 对照植物(图5小图C)。更具体地，acs6植物的更老的叶子表现出 为野生型植物的超过2倍的CO2同化速度，且更新鲜的叶子中的CO2同 化速度从50％升高至100％(图5小图C)。
还研究了减少乙烯对在干旱条件下维持叶子功能的影响。当处于 干旱条件时(每周4小时，持续1个月，从授粉前约1周开始，持续 到授粉后3周)，野生型叶子中的蒸腾速度(图5小图D)和气孔导度 (图5小图E)明显减小，而它们在acs6叶子中很大程度上保持不受 影响，从而导致突变体基本上更高的蒸腾速度(图5小图D)和增加 的气孔导度(图5小图E)。另外，干旱处理能在野生型叶子中导致 CO2同化速度的显著降低，但是在acs6叶子中不能，从而导致更新 鲜的acs6叶子中的CO2同化作用比对照增加最多2.5-倍，且更老的 acs6叶子比对照增加最多6-倍(图5小图F)。这些结果表明，乙烯 能在干旱条件过程中控制叶子功能，且它的生产的减少能延迟更老的 叶子的叶子衰老，同时维持所有叶子的叶子功能，从而提供更大的耐 旱性。类似地，尽管不太明显，观察到了ACS2的结果(图6小图 A-C)。
讨论
总之，从玉米分离出了能影响乙烯生物合成的第一步的ACC合酶 突变体。这些突变体表现出了天然的、黑暗-诱导的和干旱-诱导的叶 子衰老的延迟和保绿表型。在暴露于乙烯后，衰老的延迟是可逆的。 在正常的或干旱条件下生长的过程中，ACC合酶突变的叶子表现出了 基本上更高的CO2同化速度。令人惊奇的是，在所有ACC合酶突变的 叶子(包括尚未进入天然的或干旱-诱导的衰老程序的最新鲜的)中， 观察到了改善的叶子功能。这些观察表明，乙烯能介导玉米对水应激 的反应，且减少乙烯生产可以用作在水应激过程中维持叶子性能的措 施，从而提高它对干旱条件的耐受性。如指出的，ACC合酶突变体可 以具有其他的有利表型，例如，雄性不育表型、拥挤抗性表型、改变 的病原体抗性等。
上面的实施例表明，无论是生长在较好灌溉的条件下，还是在一 般会诱导过早的叶子衰老的干旱条件下，乙烯都在调节玉米的叶子衰 老的开始中起重要作用。能导致ACS6表达丧失的乙烯放出的减少， 是指导天然的和干旱-诱导的叶子衰老的主要原因。尽管不希望受任 何具体理论的限制，但ACS6表达的丧失可以直接延迟进入衰老程 序，或者可以影响来自所有基因成员的总ACC合酶表达。单独的ACS2 敲除使乙烯生产减少了约40％，并导致了叶绿素和蛋白的小量增加。 相反地，acs6叶子中的乙烯生产减少了最高达90％，且acs6叶子含 有基本上更高水平的叶绿素和蛋白。这些观察表明，衰老程序的进入 受超过1个基因家族成员的控制。
在水-应激后，野生型叶子中的叶绿素和蛋白水平有相当大的降 低，但是在acs6叶子中维持不受影响。这些结果暗示了乙烯在玉米 叶子中的2种作用：在正常的生长条件下，乙烯可能有助于维持叶子 中的正确的叶绿素和蛋白水平，而在水应激过程中，乙烯可能用于减 少二者的水平。发现40％乙烯减少能导致叶绿素和蛋白的中等增加， 而90％减少能导致叶绿素和蛋白的相当大的增加，这表明这些叶子组 分可能受叶子中生产的乙烯水平的定量控制。如果再进一步减少乙烯 生产，则可以预期更大的叶子叶绿素和蛋白的增加。
处于干旱条件下的野生型玉米中的叶绿素和蛋白的丧失，伴有降 低的蒸腾速度、气孔导度和CO2同化作用。相反地，处于干旱条件下 的acs6植物叶子中的叶绿素和蛋白水平的维持，伴有蒸腾、气孔导 度和CO2同化作用的维持。这些结果表明，减少乙烯不但能赋予保绿 表型，而且实际上能在应激条件下维持叶子功能。发现乙烯能控制叶 子衰老的开始，这与该激素在其他物种中的作用相一致，所述的其他 物种例如拟南芥和番茄(Davis和Grierson(1989)Identification of cDNA clones for tomato(Lycopersicon esculentum Mill.) mRNAs that accumulate during fruit ripening and leaf sencescence in response to ethylene. Planta 179：73-80；Abeles 等(1992).Ehylene in Plant Biology.(San Diego：Academic Press)；Picton等(1993).Altered fruit ripening and leaf senescence in tomatoes expressing antisence ethylene-forming enzyme transgene  Plant J.3：469-481；Grbic和Bleecker(1995) Ethylene regulates the timing of leaf senescence in Arabidopsis  Plant J.8：95-102；John等(1995)Delayed leaf senescence in ethylene-deficient ACC-oxidase antisence tomato plantss：molecular and physiological analysis  Plant J. 7：483-490)。意外地发现，乙烯放出的减少会增加叶绿素和蛋白的水 平，并增加所有叶子(包括最新鲜的)中的CO2同化速度。这表明， 在叶子进入衰老程序之前很久，乙烯就在叶子功能的控制方面起积极 作用。同样意外地发现，乙烯的减少会影响所有叶子的水-应激反应。 这些发现表明，通过减少叶子中生成的乙烯的水平，可以将对干旱条 件增高的耐受性容易地导入玉米和任选的其他谷类物种中。
实施例2：序列比对和种系发生的分析
图7(ACS growtree 2)显示了本文所述的ACC合酶序列，例如， 来自玉米的(A47(在本文中也称作ACS2或ACC2)、A50(在本文中也 称作ACS7或ACC7)、A65(在本文中也称作ACS6或ACC6))，与来自 其他物种的ACC合酶序列的种系发生的分析，其中(AtACS…)指示着 拟南芥序列，(LeACS…)指示着番茄序列，(籼型(OsiACS…)和粳型 (OsjACS…))指示着稻序列，(TaACS…)指示着小麦序列，且(MaACS…) 指示着香蕉序列。在分析中，将指示的ACC合酶分成2个亚族。进一 步将1个亚族再分成单子叶植物(Zm(玉米)、Osi、Osj、Ta、Ma)ACS 基因和双子叶植物(At、Le)ACS基因。
图8-16显示了本文所述的ACC合酶序列，例如，来自玉米(Zm) 的(A47(在本文中也称作ACS2或ACC2)、A50(在本文中也称作ACS7 或ACC7)、A65(在本文中也称作ACS6或ACC6))与来自其他物种的 ACC合酶序列的多种肽共有序列比对。使用Pretty程序(例如，可以 从SeqWeb(GCG)网页上得到)，以确定具有不同的严格性(例如，最 严格的(相同的)、严格的(相似的氨基酸)或最不严格的(稍微相似 的氨基酸)的共有序列。在每幅图中，在“共有序列”后标示了严格性。 GapWeight是8且GapLengthWeight是2。
实施例3：通过发夹RNA表达进行ACC合酶敲除
如前面指出的，可以生产敲除的植物细胞和植物，例如，通过导 入设计用于RNA沉默或干扰的ACC合酶多核苷酸序列。该实施例描述 了发夹RNA表达盒，其用于修饰例如玉米的乙烯生产和保绿表型。如 前面指出的，ACC合酶的敲除，例如，通过hpRNA表达，可以产生 具有减少的一种或多种ACC合酶表达(最多达到且包括不可检测的 表达)的植物或植物细胞。
对能在植物中编码ACC合酶的ACC合酶基因(例如，启动子、其 他的非翻译区或编码区)特异性的发夹RNA(hpRNA)分子的表达，可 以改变植物的乙烯生产和保绿潜力、不育性、拥挤抗性等，例如，通 过RNA干扰和/或沉默。
通过将泛素启动子连接到ACS2或ACS6基因的编码序列部分的反 向重复序列上，制备了ACS2(PHP20600)和ACS6(PHP20323)的hpRNA 构建体(参见图21和22，小图A-C)。使用土壤杆菌-介导的转化技 术，将每个构建体转化进玉米中。以前描述了用于制备构建体和转化 玉米的核酸分子和方法，且是本领域已知的；参见，例如，在本文中 标题为“载体、启动子和表达系统”、“植物转化”、“其他核酸和蛋白 测定”的部分和下面的实施例“玉米的转化”。
对ACS2或ACS6编码序列特异性的hpRNA的表达，能产生没有 表现出营养和生殖生长异常的玉米植物。分别为ACS2-和ACS6-发夹 构建体，产生了共36和4O个单独的玉米转基因事件(图23，小图A 和B)。
为每个hpRNA构建体选择了约10个低拷贝数事件，以用于其他 的回交和转基因评价。为包含hpRNA转基因的回交系，评价了保绿潜 力表型，例如，如本文所述的(例如，通过肉眼检查、光合活性的测 量、叶绿素或蛋白含量的测定等，在正常的和干旱或其他应激条件 下)。
实施例4：玉米的转化
生物弹射击法(Biolistics)
通过粒子轰击，通常如Tomes，D.等，IN：Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，编O.L.Gamborg和 G.C.Phillips，Chapter 8，第197-213页(1995)所述和如下面简 单介绍的，将包含在载体中的本发明的多核苷酸转化进胚发生玉米愈 伤组织中。通过用结合有DNA质粒的钨颗粒轰击胚发生地响应的未 成熟的胚，生产了转基因玉米植物。质粒一般包含或由下述元件组 成：选择标记和未选择的结构基因，或选择标记和ACC合酶多核苷酸 序列或子序列，等。
颗粒的制备：
将0.5-1.8μ、优选1-1.8μ、最优选1μ的15mg钨颗粒(General Electric)加入2ml浓硝酸中。在0℃超声处理该悬浮液20分钟 (Branson Sonifier Model 450，40％输出，恒定工作循环)。通过在 10000rpm离心(Biofuge)1分钟，沉淀钨颗粒，并去除上清液。向沉 淀加入2ml无菌蒸馏水，并用简短的超声处理重新悬浮颗粒。沉淀 悬浮液，向沉淀加入1ml水醇，并用短的超声处理重新悬浮 颗粒。再用无菌蒸馏水冲洗、沉淀和再悬浮颗粒2次，最后将颗粒重 新悬浮到2ml无菌蒸馏水中。将颗粒再分成250-μl等分试样，并 冷冻储存。
颗粒-质粒DNA结合体的制备：
在水浴超声波仪(Branson Sonifier Model 450，20％输出，恒定 工作循环)中，简短地超声处理钨颗粒原液，并将50μl转移到微量 离心管中。载体一般是顺式的：也就是说，选择标记和目标基因(或 其他多核苷酸序列)是在同一个质粒上。
将质粒DNA加入颗粒，最终在10μL总体积中的DNA量为0.1-10 μg，并简短地超声处理。优选地，使用10μg(1μg/μL，在TE缓 冲液中)总DNA来混合用于轰击的DNA和颗粒。加入50微升(50μL) 无菌的2.5M CaCl2水溶液，简短地超声处理混合物，并涡旋。加入 20微升(20μL)无菌的0.1M亚精胺水溶液，简短地超声处理混合 物，并涡旋。在间歇的简短超声处理下，在室温温育混合物20分钟。 离心颗粒悬浮液，并去除上清液。向沉淀加入250微升(250μL)无水 乙醇，然后简短地超声处理。沉淀悬浮液，去除上清液，并加入60μl 无水乙醇。简短地超声处理悬浮液，然后将颗粒-DNA附聚体装载到 巨载体上。
组织的制备
玉米品种High Type II的未成熟胚是粒子轰击-介导的转化的 靶。该基因型是源自2个已知的玉米自交系(A188和B73)的杂交的 2个纯种遗传系(亲本A和B)的F1。根据Armstrong等， Maize Genetics Coop.News 65：92(1991)，选择2个亲本的体细胞胚发生 的强能力。
使F1植物的穗自交或同胞交配，且当盾片第一次变成不透明时， 从发育中的颖果无菌地切离胚。根据生长条件，该阶段发生在授粉后 约9-13天、最经常地在授粉后约10天。胚长度约0.75-1.5mm。 用20-50％Clorox灭菌穗的表面30分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗3 次。
用盾片朝上的方式，在胚发生诱导培养基中，培养未成熟的胚， 所述的培养基由N6基础盐、Eriksson维生素、0.5mg/l盐酸硫胺素、 30gm/l蔗糖、2.88gm/l L-脯氨酸、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、2gm/l Gelrite和8.5mg/l AgNO3组成。Chu等， Sci.Sin.18：659(1975)； Eriksson， Physiol.Plant 18：976(1965)。在121℃高压灭菌培养 基15分钟，并分装到100×25mm培养皿中。对AgNO3过滤除菌，并 加入高压灭菌后的培养基中。在28℃，在完全黑暗中培养组织。约3 -7天后，最经常约4天后，胚的盾片膨胀到它原始大小的约2倍， 在盾片的胚根鞘表面上的突起指示着胚发生组织的开始。最高达100％ 的胚能表现出该反应，但是最经常地，胚发生反应频率是约80％。
当观察到胚发生反应时，将胚转移到由诱导培养基(改良成含有 120gm/l蔗糖)组成的培养基中。确定胚的方向，以使胚根鞘极， 即胚发生反应的组织，朝向培养基的上面。以10个胚/培养皿，放置 在培养皿的约2cm直径的中心区域。在28℃，在完全黑暗下，将胚 在该培养基中维持3-16小时，优选4小时，再马上用结合有质粒DNA 的颗粒进行轰击，所述的质粒DNA含有选择和非选择标记基因。
为了实现胚的粒子轰击，使用DuPont PDS-1000颗粒加速装置， 加速颗粒-DNA附聚体。简短地超声处理颗粒-DNA附聚体，并将10μl 沉积在巨载体上，使乙醇蒸发。通过聚合物隔片(安全膜)的破裂，在 不锈钢停止筛(stopping screen)上加速巨载体。通过加压的氦， 实现破裂。在安全膜破坏压力的基础上，确定颗粒-DNA加速的速度。 使用200-1800磅/英寸2(psi)的安全膜压力，650-1100磅/英 寸2是优选的，约900磅/英寸2是最高度优选的。使用多个膜来实现 一定范围的破坏压力。
将含有具有胚的盘的架子置于巨载体平台底部以下5.1cm(架子 #3)。为了实现培养的未成熟胚的粒子轰击，将安全膜和带有干燥的 颗粒-DNA附聚体的巨载体安装在装置中。将输送给装置的He压力调 节到安全膜破坏压力以上200磅/英寸2。将装有靶胚的培养皿置于真 空室中，并位于加速颗粒的发射途径中。在室中建立真空，优选约 28Hg。运行装置后，释放真空，取出培养皿。
在轰击过程中及此后1-4天，将轰击的胚保持在调节渗透的培养 基中。将胚转移到选择培养基中，后者由N6基础盐、Eriksson维生 素、0.5mg/l盐酸硫胺素、30gm/l蔗糖、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、 2gm/l Gelrite、0.85mg/l AgNO3和3mg/l双丙氨酰膦组成 (Herbiace，Meiji)。过滤除菌后加入双丙氨酰膦。以10-14天的间 隔，将胚继代培养到新鲜的选择培养基中。约7周后，从约7％轰击 的胚中，增殖推定转化了选择和非选择标记基因的胚发生组织。拯救 推定的转基因组织，认为源自各胚的组织是一个事件，且能在选择培 养基上独立地繁殖。通过肉眼选择有组织的胚发生组织的最小邻接片 段，实现了2个克隆繁殖循环。
加工来自每个事件的组织样品，以回收DNA。用限制性内切核酸 酶限制DNA，并用引物序列进行探测，所述的引物序列设计用于扩增 与ACC合酶和质粒的非-ACC合酶部分重叠的DNA序列。推进具有可 扩增的序列的胚发生组织，以进行植物再生。
为了转基因植物的再生，在100×25mm培养皿中，在包含下述 成分的培养基中继代培养胚发生组织：MS盐和维生素(Murashige & Skoog， Physiol.Plant 15：473(1962))、100mg/l肌醇、60gm/l 蔗糖、3gm/l Gelrite、0.5mg/l玉米素、1mg/l吲哚-3-乙酸、 26.4ng/l顺式-反式-脱落酸和3mg/l双丙氨酰膦，并在28℃，在 黑暗中温育，直到较好地形成发育，可以看到成熟的体细胞胚。这需 要约14天。较好地形成的体细胞胚是不透明的和米色的，且由可识 别的盾片和胚芽鞘组成。在100×25mm培养皿内的发芽培养基中单 独继代培养胚，所述发芽培养基包含MS盐和维生素、100mg/l肌醇、 40gm/l蔗糖和1.5gm/l Gelrite，并在16小时光照：8小时黑暗的 光周期和来自冷-白荧光管的40meinsteinsm-2sec-1下温育。约7天 后，体细胞胚已经发芽，并生成明显的茎干和根。在125×25mm玻 璃管内的发芽培养基中继代培养各植物，以进一步使植物发育。在16 小时光照：8小时黑暗的光周期和来自冷-白荧光管的40 meinsteinsm-2sec-1下维持植物。约7天后，较好地建立了植物，并 移植到园艺土壤中，使其受冷而变得耐寒，盆栽到商业温室土壤混合 物中，并在温室中生长至性成熟。使用原种自交系作为雄性，以授粉 给再生的转基因植物。
土壤杆菌-介导的
当使用土壤杆菌-介导的转化时，如这里引作参考的PCT专利公 开WO98/32326所述，使用Zhao的方法。简而言之，从玉米分离未成 熟的胚，并使胚接触土壤杆菌的悬浮液(步骤1：感染步骤)。在该步 骤中，优选地将未成熟的胚浸泡在土壤杆菌悬浮液中，以开始接种。 将胚与土壤杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，在 感染步骤后，在固体培养基上培养未成熟的胚。在该共培养阶段后， 预期任选的“休眠”步骤。在该休眠步骤中，在有至少一种已知能抑 制土壤杆菌的生长的抗生素存在的情况下，温育胚，而不加入植物转 化体的选择试剂(步骤3：休眠步骤)。优选地，在含有抗生素、但是 没有选择试剂的固体培养基上培养未成熟的胚，以消除土壤杆菌和进 行感染的细胞的休眠阶段。然后，在含有选择试剂的培养基上培养接 种的胚，并回收生长的转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地， 在含有选择试剂的固体培养基上培养未成熟的胚，从而导致转化的细 胞的选择生长。然后，使愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)， 优选地，在固体培养基上培养在选择培养基上生长的愈伤组织，以再 生植物。
实施例5.转基因在单子叶植物中的表达
构建了质粒载体，其包含优选的可操作地连接到分离的多核苷酸 上的启动子，所述的多核苷酸包含ACC合酶多核苷酸序列或子序列 (例如，选自SEQ ID NO：1-6和10)。然后，可以通过下面的方法， 将该构建体导入玉米细胞中。
从源自玉米杂交系的发育中的颖果切离未成熟的玉米胚。在授粉 后10-11天，当它们是1.0-1.5mm长时，分离胚。然后，轴-侧 向下地放置胚，并接触琼脂糖-固化的N6培养基(Chu等(1975)Sci. Sin.Peking 18：659-668)。在27℃，将胚保持在黑暗中。脆弱的胚 发生愈伤组织，其由未分化的具有在胚柄结构中产生的体细胞原胚状 体和胚状体的细胞块组成，会从这些未成熟的胚的盾片增殖。可以在 N6培养基上培养从原代外植体分离的胚发生愈伤组织，并每2-3周 在该培养基上继代培养。
可以在转化实验中使用质粒p35S/Ac(Hoechst Ag，Frankfurt， 德国)或等同物，以提供选择标记。该质粒含有Pat基因(参见欧洲专 利公开0 242 236)，其能编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。酶PAT能 赋予对除草剂谷氨酰胺合成酶抑制剂例如膦丝菌素的抗性。p35S/Ac 中的pat基因是在来自花椰菜花叶病毒的35S启动子控制下的 (Odell等(1985)Nature 313：810-812)，且包含来自根癌土壤杆菌 的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区。
可以使用粒子轰击方法(Klein等(1987)Nature 327：70-73) 来将基因转入愈伤组织培养细胞。根据该方法，使用下面的技术，给 金颗粒(1μm直径)包被DNA。将10μg质粒DNA加入50μL金颗粒 悬浮液(60mg/mL)。向颗粒加入氯化钙(50μL 2.5M溶液)和无亚精 胺的碱(20μL 1.0M溶液)。在加入这些溶液的过程中，涡旋悬浮液。 10分钟后，简短地离心管(5秒，15,000rpm)，并去除上清液。将颗 粒重新悬浮到200μL无水乙醇中，再次离心，并去除上清液。再次 进行乙醇冲洗，将颗粒重新悬浮到终体积30μL乙醇中。可以将DNA- 包被的金颗粒的等分试样(5μL)置于Kapton飞行盘(flying disc) (Bio-Rad Labs)的中心。然后，使用1000磅/英寸2的氦压力，0.5cm 的间隙距离和1.0cm的飞行距离，用Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments，Hercules CA)将颗粒加速进玉米组织中。
为了轰击，将胚发生组织置于覆盖在琼脂糖-固化的N6培养基上 的滤纸上。将组织排列成薄层，并覆盖直径约5cm的圆形区域。将 含有组织的培养皿置于PDS-1000/He的室中，其离停止筛约8cm。然 后，抽出室中的空气，达到28英寸Hg的真空。使用当激波管中的He 压力达到1000磅/英寸2时会破裂的防爆膜，用氦冲击波加速巨载 体。
轰击后7天，可以将组织转移到N6培养基中，所述培养基含有 草铵膦(2mg/l)，且缺少酪蛋白或脯氨酸。使组织在该培养基中继 续缓慢生长。另外2周后，可以将组织转移到新鲜的N6培养基中， 所述培养基含有草铵膦。6周后，在一些含有草铵膦-补充的培养基 的平板上，可以鉴别出直径约1cm区域的有活力地生长的愈伤组织。 当在选择培养基上继代培养时，这些愈伤组织可以继续生长。
通过首先将组织簇转移到补充了0.2mg/l 2，4-D的N6培养基 中，可以从转基因的愈伤组织再生植物。2周后，可以将组织转移到 再生培养基中(Fromm等(1990)Bio/Technology 8：833-839)。
实施例6.转基因在双子叶植物中的表达
如下所述，用质粒轰击大豆胚，所述质粒包含优选的可操作地连 接到异源核苷酸序列上的启动子，所述的异源核苷酸序列包含ACC合 酶多核苷酸序列或子序列(例如，选自SEQ ID NO：1-6和10)。为了 诱导体细胞胚，从大豆栽培品种A2872的表面-灭菌的、未成熟的种 子，切离了长度3-5mm的子叶，然后在26℃，在适当的琼脂培养基 上，在光照或黑暗下培养6-10周。然后，切离能生成继代胚的体细 胞胚，并置于合适的液体培养基中。重复选择如前面繁殖的体细胞胚 簇(球形期的胚)后，如下所述维持悬浮液。
可以将大豆胚发生悬浮培养物维持在旋转振荡器上的35ml液体 培养基中，150rpm，26℃，16∶8小时白天/黑夜的荧光方案。通过 将约35mg组织接种进35ml液体培养基，每2周继代培养培养物。
然后，可以通过基枪轰击方法，转化大豆胚发生悬浮培养物 (Klein等(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利号 4,945,050)。可以使用DuPont Biolistic PDS1000/HE装置(氦改进 型)进行这些转化。
可以用于促进大豆转化的选择标记基因是由来自花椰菜花叶病 毒的35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)、来自质 粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz等 (1983)Gene 25：179-188)和来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的T-DNA 的胭脂碱合酶基因的3′区组成的转基因。可以分离包含优选的启动 子和异源的ACC合酶多核苷酸的目标表达盒作为限制片段。然后， 可以将该片段插入携带标记基因的载体的独特限制位点。
向50μl 60mg/ml 1μm金颗粒悬浮液中，加入(按次序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl2(2.5M)。 然后，将颗粒制剂搅拌3分钟，在微量离心机中旋转10秒钟，去除 上清液。然后，在400μl 70％乙醇中洗涤DNA-包被的颗粒1次，并 重新悬浮到40μl无水乙醇中。超声处理DNA/颗粒悬浮液3次，每 次1秒。然后，将5微升DNA-包被的金颗粒装载到每个巨载体盘中。
将约300-400mg 2周龄的悬浮培养物置于空60×15mm培养皿 中，并用吸管从组织去除残余的液体。对于每个转化实验，一般轰击 约5-10盘组织。将膜破坏压力设定在1100磅/英寸2，并将室抽至 28英寸汞的真空。将组织置于离阻滞筛约3.5英寸，并轰击3次。 轰击后，可以将组织分成2半，并放回液体中，如上所述进行培养。
轰击后5-7天，可以将液体培养基交换为新鲜的培养基，且轰击 后11-12天，交换为含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基。可以每周 更新选择培养基。轰击后7-8周，可以观察到从未转化的、坏死的胚 发生簇生长出绿色的、转化的组织。取出分离的绿色组织，并接种到 各烧瓶中，以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可 以将每个新系视作独立的转化事件。然后，可以继代培养这些悬浮 物，并维持成未成熟的胚簇，或通过各体细胞胚的成熟和发芽，再生 成整株植物。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于解释目的，且 本领域的技术人员可以根据它们作出多种改进或变化，它们包含在本 申请的精神和范围内，也包含在所附权利要求书的范围内。
尽管为了清楚和理解的目的，已经比较详细地描述了前面的发 明，但本领域的技术人员在阅读其公开内容后能够明白，可以在形式 和细节上作出多种变化，而不脱离本发明的真实范围。例如，可以以 各种组合使用上述的所有技术和装置。在本申请中引用的所有出版 物、专利、专利申请和/或其他文献，都在这里为所有目的整体引作 参考，其程度与为所有目的分别指明各出版物、专利、专利申请和/ 或其他文献引作参考相同。  SEQ ID：   类型   序列  SEQ ID：1   基因ACS2   (ACC2)   来自玉蜀   黍(Zm)   自交系   ′B73′的   ACC合酶   基因序列   (A47)   (＝从自交   系′Oh43′   原始分离   的ACC2   pcr片段)   AAACTTCATA CCGGTCGGTG CCTTACGTTC TCTGGCGTTC TTATCCTTTC   CTCCGCTTTT AGTCGATGAT TATAGTAGTT TCTACAACAA GCTTTCAACG   CCATTGACTA TTTTTTCCCC CATTGAAAAC GAACACCACC ATTGACACTG   ATAAATGTAG TACAGCATTT GACAACATAC TTTCCTAGAA AGTAACCAGC   AGAGACTGGA CGCTACGTAC TACCACACCA TTGGAGCAGC CAATTTAATC   GTGTATAGAA CTCCGTATCG AAATTTGTCT GTGAATGGAC CTTCATTTGC   ATCTAGGTCT AGTACAATGG ATTTCGAACA GGACAGCGCC GATCTGGCAA   TACACACACG CACGACGTAG CACAGCTGTT CTTCGTTCCA CGCGTTAATT   GAAGGCAAAG CGACTGTAGT TGCTGTTGGT GGCCAAGTTG TTTAATGCTA   TAGTAGCAGC CAGTCACTCC TAGGGCAAAT TTTAGGACTT TTGCATTGCA   TTGCCGCCAT GTAGAGGTTG ACTGCACACC GAGAATATCG AGCATTCATT 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  CAGACGCAGCACCTCCTGGCGTCGCTCCTGGGCGACAGGGACTTCACGCGGAGGTACATC   GCGGAGAACACGCGGCGGATCAGGGAGCGGCGCGAGCAGCTGGCGGAGGGCCTGGCGGCC   GTGGGCATCGAGTGCCTGGAGAGCAACGCGGGGCTCTTCTGCTGGGTCAACATGCGGCGC   CTGATGCGGAGCCGGTCGTTCGAGGGCGAGATGGAGCTGTGGAAGAAGGTGGTCTTCGAG   GTGGGGCTCAACATCTCCCCGGGCTCCTCCTGCCACTGCCGGGAGCCCGGCTGGTTCCGC   GTCTGCTTCGCCAACATGTCCGCCAAGACGCTCGACGTCGCGCTCCAGCGCCTGGGCGCC   TTCGCGGAGGCCGCCACCGCGGGGCGCCGCGTGCTTGCCCCCGCCAGGAGCATCAGCCTC   CCGGTCCGCTTCAGCTGGGCTAACCGCCTCACCCCGGGCTCCGCCGCCGACCGGAAGGCC   GAGCGG  SEQ ID：6   cDNA   ACS7   (ACC7)   来自玉蜀   黍(Zm)   自交系   ′B73′的   ACC合酶   cDNA序列   (A50)   (＝从自交   ATGGCCGGTAGCAGCGCGGAGCAGCTCCTCTCCAGGATCGCCGCCGGCGACGGCCACGGC   GAGAACTCGTCCTACTTCGACGGGTGGAAGGCCTACGACATGAACCCTTTCGACCTGCGC   CACAACCGCGACGGCGTCATCCAGATGGGCCTCGCCGAGAACCAACTGTCGTTGGACCTG   ATCGAGCAATGGAGCGTGGACCACCCGGAGGCGTCCATCTGCACGGCGCAGGGCGCGCCG   CAGTTCCGGAGGATAGCCAACTTCCAGGACTACCACGGCCTGCCGGAGTTCAGAGAGGCG   ATGGCCAAGTTCATGGGGCAGGTGAGGGGCGGCAAGGTGACGTTCGACCCCGACCGCGTC   GTCATGTGCGGAGGAGCCACCGGCGCGCAGGACACTCTCGCCTTCTGCCTCGCTGACCCG   GGCGACGCCTACCTCGTGCCGACGCCTTATTACCCAGCGTTCGACCGCGACTGTTGCTGG   AGGTCAGGAGTGAAGCTGCTGCCCATCGAATGCCACAGCTCGAACAACTTCACCCTCACC   AGGGAGGCGCTCGTGTCGGCCTACGACGGCGCGCGGAGGCAGGGCGTCCGCGTCAGGGGC   ATCCTCATCACCAACCCCTCCAACCCGCTGGGCACCACCATGGACCGCGGCACGCTGGCG   ATGCTCGCCGCGTTCGCCACAGAGCGCCGCGTCCACCTCATCTGCGACGAGATCTACGCG   GGCTCCGTCTTCGCCAAGCCGGGCTTCGTGAGCATCGCCGAGGTCATCGAGCGCGGCGAC   GCCCCGGGCTGCAACAGGGACCTCGTCCACATCGCGTACAGCCTCTCCAAGGACTTCGGC   CTCCCGGGCTTCCGCGTCGGCATCGTCTACTCCTACAACGACGACGTGGTGGCCTGCGCG   CGCAAGATGTCCAGCTTCGGCCTCGTCTCGTCGCAGACGCAGCACTTCCTGGCGATGATG   CTCGCCGACGCGGAGTTCATGGCACGCTTCCTCGCGGAGAGCGCGCGGCGGCTGGCGGCG   CGCCACGACCGCTTCGTCGCGGGCCTCCGCGAGGTCGGCATCGCGTGCCTGCCGGGCAAC   GCGGGCCTCTTCTCGTGGATGGACCTGCGGGGCATGCTCCGGGAGAAGACGCACGACGCG   系′Oh43′   原始分离   的ACC7   pcr片段)   GAGCTCGAGCTGTGGCGGGTCATCGTACACAGGGTGAAGCTCAACGTGTCGCCCGGCACG   TCGTTCCACTGCAACGAGCCCGGCTGGTTCCGCGTCTGCTACGCCAACATGGACGACGAC 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  原始分离   的ACC6   pcr片段)   MIADEKPQPQ LLSKKAACNS HGQDSSYFLG WEEYEKNPYD PVANPGGIIQ   MGLAENQLSF DLLEAWLEAN PDALGLRRGG ASVFRELALF QDYHGMPAFK   NALARFMSEQ RGYRVTFDPS NIVLTAGATS ANEALMFCLA DHGDAFLIPT   PYYPGFDRDL KWRTGAEIVP VHCTSGNGFR LTRAALDDAY RRAQKLRLRV   KGVLITNPSN PLGTTSPRAD LEMLVDFVAA KGIHLVSDEI YSGTVFADPG   FVSVLEVVAA RAATDDGVVG VGPLSDRVHV VYSLSKDLGL PGFRVGAIYS   SNAGVVSAAT KMSSFGLVSS QTQHLLASLL GDRDFTRRYI AENTRRIRER   REQLAEGLAA VGIECLESNA GLFCWVNMRR LMRSRSFEGE MELWKKVVFE   VGLNISPGSS CHCREPGWFR VCFANMSAKT LDVALQRLGA FAEAATAGRR   VLAPARSISL FVRFSWANRL TPGSAADRRA ER  SEQ ID：9   合酶aa   ACS7   (ACC7)   MAGSSAEQLL SRIAAGDGHG ENSSYFDGWK AYDMNPFDLR HNRDGVIQMG   LAENQLSLDL IEQWSVDHPE ASICTAQGAP QFRRIANFQD YHGLPEFREA   MAKFMGQVRG GKVTFDPDRV VMCGGATGAQ DTLAFCLADP GDAYLVPTPY   YPAFDRDCCW RSGVKLLPIE CHSSNNFTLT REALVSAYDG ARRQGVRVRG   来自玉蜀   黍(Zm)自   交系′B73′   的ACC合酶   氨基酸序   列(A50)   (＝从自交   系′Oh43′   原始分离   的ACC7   pcr片段)   ILITNPSNPL GTTMDRGTLA MLAAFATERR VHLICDEIYA GSVFAKPGFV   SIAEVIERGD APGCNRDLVH IAYSLSKDFG LPGFRVGIVY SYNDDVVACA   RKMSSFGLVS SQTQHFLAMM LADAEFMARF LAESARRLAA RHDRFVAGLR   EVGIACLPGN AGLFSWMDLR GMLREKTHDA ELELWRVIVH RVKLNVSPGT   SFHCNEPGWF RVCYANMDDD TMEVALDRIR RFVRQHQHSK AKAERWAATR   PLRLSLPRRG ATTASHLAIS SPLALLSPQS PMVHAS  SEQ ID：10   CCRAl78   R   ATGACCATGA TTACGCCAAG CTCTAATACG ACTCACTATA GGGAAAGCTG   GTACGCCTGC AGGTACCGGT CCGGAATTCC CGGGTCGACC CACGCGTCCG   CAGCAAGCTC ATCCCCTTCA AAACCCTCCG GCAGCCCAGC CAGCTAGTGG   TGATCTCTCA GCAGCGCGCC TGAACGTGTG CTCCCTGCTA AACTCTGCGC   CTCGGTAGGC AAGGAAAATT AAACCGGTCG TCGTCAGATT AAATGGCCGG   TAGCAGCGCG GAGCAGCTCC TCTCCAGGAT CGCCGCCGGC GATGGCCACG   GCGAGAACTC GTCCTACTTC GACGGGTGGA AGGCCTACGA CACGAACCCT   TTCGACCTGC GCCACAACCG CGACGGCGTC ATCCAGATGG GACTCGCCGA   GAACCAACTG TCGCTGGACC TGATCGAGCA ATGGAGCGTG GACCACCCGG   AGGCGTCCAT CTGCACGGCG CAGGGCGCGC CGCAGTTCCG GAGGATAGCC   AACTTCCAGG ACTACCACGG CCTGCCGGAG TTCAGAGAGG CGATGGCCAA   GTTCATGGGG CAGGTGAGGG GCGGCAAGGT GACGTTCGAC CCCGACCGCG 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本申请是非临时的实用专利申请，它要求享有下述现有临时专利 申请的优先权和利益：Gallie等在2003年6月23日提交的USSN 60/480,861，其标题为“Engineering single-gene-controlled staygreen potential into plants”，它在这里为所有目的引作参 考。
关于在联邦支持的研究和开发下产生的发明权利的声明
本发明得到了USDA/CREES的资助号95-35304-4657的政府支持 和国家科学基金会(National Science Foundation)的资助号 MCB-0076434-002的支持。政府可能对该发明具有某些权利。