JNK信号转导途径的细胞渗透肽抑制剂用于治疗多种疾病的新用途
阅读：740发布：2021-12-12
专利汇可以提供JNK信号转导途径的细胞渗透肽抑制剂用于治疗多种疾病的新用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及蛋白激酶 抑制剂 的应用，并且更具体地涉及蛋白激酶c-Jun 氨 基末端激酶的抑制剂，JNK抑制剂序列，嵌合肽，或编码它们的核酸以及包含它们的药物组合物用于 治疗 与JNK 信号 传导强相关的多种 疾病 或病症的应用。，下面是JNK信号转导途径的细胞渗透肽抑制剂用于治疗多种疾病的新用途专利的具体信息内容。
1.包含长度少于150个氨基酸的JNK抑制剂序列在制备用于治疗受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，其中受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症选自下述组的炎性或非炎性疾病：
(a)年龄相关的黄斑变性(AMD)，特别是湿性或干性形式的年龄相关的黄斑变性，和白内障，
(b)眼炎性疾病，特别选自：葡萄膜炎，巩膜炎，角膜手术，结膜炎，非传染性角膜炎，虹膜炎，脉络膜视网膜炎症，损伤眼睛视网膜的炎性病(视网膜病变)，特别是糖尿病性视网膜病变，动脉高血压诱导的高血压性视网膜病变，辐射诱发的视网膜病变，日光诱发的日光性视网膜病变，外伤诱发的视网膜病变，例如，普尔夏视网膜病变，早产儿视网膜病变(ROP)和高粘滞性相关的视网膜病变，
(c)艾迪生病，丙种球蛋白缺乏血症，斑秃，肌萎缩性侧索硬化，抗磷脂综合征，特应性变态反应，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性心肌病，自身免疫性肠病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性内耳病，自身免疫性淋巴细胞增生综合征，自身免疫性多内分泌腺综合征，自身免疫性孕酮皮炎，特发性血小板减少性紫癜，自身免疫性荨麻疹，巴洛同心性硬化，大疱性类天疱疮，卡斯尔曼病，瘢痕性类天疱疮，冷凝集素疾病，补体成分2缺乏相关的疾病，库欣综合征，Dagos病，痛性肥胖症，嗜酸细胞性肺炎，获得性大疱性表皮松解，新生儿溶血病，冷球蛋白血症，伊文思综合征，进行性骨化性纤维发育不良，胃肠类天疱疮，古德帕斯丘综合征，桥本脑病，妊娠类天疱疮，肺动脉栓塞综合征，低丙球蛋白血症，兰伯特-伊顿肌无力综合征，硬化性苔癣，硬斑病，急性苔藓痘疮样糠疹，重症肌无力，发作性睡病，神经性肌强直，眼阵挛-肌阵挛综合征，副肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症，面部偏瘫侧萎缩，恶性贫血，POEMS综合征，坏疽性脓皮病，单纯红细胞再生障碍，雷诺现象，下肢不宁综合征，腹膜后纤维化，2型自身免疫性多内分泌腺综合征，僵人综合征，Susac综合征，发热嗜中性粒细胞皮肤病，西登哈姆舞蹈病，血小板减少症，和白癜风，(d)关节炎，特别是青少年特发性关节炎，银屑病性关节炎和类风湿性关节炎，和关节病，以及骨关节炎，
(e)皮肤病，特别是选自银屑病，湿疹，皮炎，痤疮，口腔溃疡，红斑，扁平苔藓，肉状瘤病，血管炎，成人线性IgA疾病，
(f)tau病变，淀粉样变性和朊病毒病，
(g)息肉，
(h)口腔或颌骨的炎性疾病，特别是牙髓炎，种植牙周炎，牙周炎，牙龈炎，口炎，粘膜炎，脱皮病，颞颌关节病症，
(i)骨坏死，
(j)脑脊髓炎，特别是急性播散性脑脊髓炎，脊椎炎，特别是强直性脊柱炎，抗合成酶综合征，皮炎，特别是特应性皮炎或接触性皮炎，肝炎，特别是自身免疫性肝炎，自身免疫性周围神经病，胰腺炎，特别是自身免疫性胰腺炎，贝切特病，比克斯塔夫病，脑炎，Blau综合征，腹腔病，美洲锥虫病，多神经病，特别是慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，骨髓炎，特别是慢性复发性多病灶性骨髓炎，丘-施综合征，耳蜗前庭综合征，巨细胞动脉炎，肢端硬皮综合征，脉管炎，特别是皮肤小血管脉管炎和荨麻疹性血管炎，疱疹样皮炎，皮肌炎，系统性硬皮病，德雷斯勒综合征，药物诱发的红斑狼疮，盘状红斑狼疮，肌腱末端炎，嗜酸细胞性筋膜炎，嗜酸细胞性胃肠炎，结节性红斑，特发性肺纤维化，胃炎，格雷夫斯病，吉兰-巴雷综合征，桥本甲状腺炎，亨诺赫-舍恩莱茵紫癜，化脓性汗腺炎，特发性炎症性脱髓鞘疾病，肌炎，特别是包涵体肌炎，膀胱炎，特别是间质性膀胱炎，川崎病，扁平苔癣，类狼疮性肝炎，Majeed综合征，美尼尔病，显微镜下多血管炎，混合性结缔组织病，脊髓炎，特别是视神经脊髓炎，甲状腺炎，特别是奥德甲状腺炎，风湿病，特别是复发性风湿病，Parsonage-Turner综合征，寻常天疱疮，静脉周脑脊髓炎，结节性多发性动脉炎，多肌痛，特别是风湿性多肌痛，多肌炎，肝硬化，特别是原发性胆汁性肝硬变，胆管炎，特别是原发性硬化性胆管炎，进行性炎症性神经病，罗斯默森脑炎，复发性多软骨炎，关节炎，特别是反应性关节炎(莱特尔病)和类风湿性关节炎，风湿热，结节病，Schnitzler综合征，血清病，脊椎关节病，高安动脉炎，托洛萨-亨特综合征，横贯性脊髓炎，和韦格纳肉芽肿，
(k)纤维变性疾病和/或病症，特别选自肺、心脏、肝、骨髓、纵隔、腹膜后腔、皮肤、肠、关节和肩部纤维化，
(l)肾疾病和/或病症，特别选自一般肾小球肾炎，特别是膜增生性肾小球肾炎，系膜增生性肾小球肾炎，急进性肾小球肾炎，一般肾病，特别是膜性肾病或糖尿病肾病，一般肾炎，特别是狼疮肾炎，肾盂肾炎，间质性肾炎，肾小管间质性肾炎，慢性间质性肾炎或急性肾炎，和微小病变疾病和局灶性节段性肾小球硬化症，
(m)交感性眼炎，
(n)皮肤、肾、心脏、肺、胰腺、肝、血细胞、骨髓、角膜、事故严重损伤的肢体，特别是手指、手、脚、脸、鼻子、骨、心脏瓣膜、血管或肠移植排斥反应，
(o)皮质基底节变性，进行性核上性麻痹，精神分裂症，遗传性克雅病，运动神经元病，脊髓小脑性共济失调/萎缩，痴呆，特别是额颞痴呆，具有雷维小体的痴呆，多系统萎缩，遗传性痉挛性轻截瘫，佛莱德立希共济失调，CMT病，和
(p)所述疾病是遗传性或非遗传性代谢病，特别选自下述的组：碳水化合物代谢的代谢病，例如，糖原贮积病，氨基酸代谢病，例如，苯丙酮尿症，枫糖尿病，1型戊二酸血症，尿素循环障碍或尿素循环缺陷，例如，氨甲酰磷酸合酶I缺乏，有机酸代谢病(有机酸尿症)，例如，尿黑酸尿症，脂肪酸氧化和线粒体代谢病，例如，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏(通常缩写为MCADD.)，卟啉代谢病，例如急性间歇性卟啉病，嘌呤或嘧啶代谢病，例如，莱施-奈恩综合征，类固醇代谢病症，例如，类脂先天性肾上腺增生，或先天性肾上腺增生，线粒体功能障碍，例如，卡恩斯-塞尔综合征，过氧化物酶体功能障碍，例如，Zellweger综合征，或溶酶体贮积病，例如，戈谢病或尼曼皮克病。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述病症/疾病是AMD或白内障。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述病症/疾病是视网膜病变，特别是糖尿病性视网膜病变。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述病症/疾病是银屑病。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述病症/疾病是移植物排斥或移植排斥反应，特别是肾、胰腺、皮肤或心脏移植的移植物排斥。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述病症/疾病是肾小球肾炎。
7.包含长度少于150个氨基酸的JNK抑制剂序列用于在其移植前处理组织或器官移植物的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述移植物是肾、心脏、肺、胰腺、肝、血细胞、骨髓、角膜、事故严重损伤的肢体，特别是手指、手、脚、脸、鼻子、骨、心脏瓣膜、血管或肠移植物。
9.根据权利要求1-8中任一项的JNK抑制剂序列的用途，其中所述JNK抑制剂序列包含5-150个氨基酸残基的范围，更优选10-100个氨基酸残基，甚至更优选10-75个氨基酸残基，和最优选10-50个氨基酸残基的范围。
10.根据权利要求1-9中任一项的JNK抑制剂序列的用途，其中所述JNK抑制剂序列结合c-jun氨基末端激酶(JNK)。
11.根据权利要求1-10中任一项的JNK抑制剂序列的用途，其中当所述JNK抑制剂序列存在于表达JNK的细胞中时，所述JNK抑制剂序列抑制至少一种JNK靶向的转录因子的活化。
12.根据权利要求1-11中任一项的JNK抑制剂序列的用途，其中所述JNK靶向的转录因子选自由c-Jun、ATF2和Elk1组成的组。
13.根据权利要求1-12中任一项的JNK抑制剂序列的用途，其中当所述肽存在于表达JNK的细胞中时，所述JNK抑制剂序列改变JNK的作用。
14.根据权利要求1-13中任一项的用途，其中所述JNK抑制剂序列由L-氨基酸、D-氨基酸、或二者的组合构成，优选包含至少1个或甚至2个，优选至少3、4或5个，更优选至少
6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸可以以区段方式、非区段方式或以交替的方式排列在所述JNK抑制剂序列中。
15.根据前述权利要求中任一项的应用，其中所述JNK抑制剂序列包含SEQ ID NO：
102，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105的序列中的任一个限定或编码的人或大鼠IB1序列的片段、变体、或所述片段的变体。
16.根据权利要求1-15中任一项的用途，其中所述JNK抑制剂序列包含SEQ ID NOs：
1至4，13至20和33至100中的至少一个氨基酸序列，或其片段、衍生物或变体，或由SEQ ID NOs：1至4，13至20和33至100中的至少一个氨基酸序列，或其片段、衍生物或变体组成。
17.包含通过共价键连接的至少一个第一结构域和至少一个第二结构域的嵌合肽在制备用于治疗受试者中与受试者中的JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，所述第一结构域包含运输序列，并且所述第二结构域包含如在权利要求1至16中任一项所定义的JNK抑制剂序列，其中所述与受试者中的JNK信号传导强相关的疾病或病症如权利要求1-8中任一项所定义。
18.权利要求14的嵌合肽的用途，其中所述嵌合肽由L-氨基酸、D-氨基酸、或二者的组合构成，优选包含至少1个或甚至2个，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸可以以区段方式、非区段方式或以交替的方式排列在所述嵌合肽中。
19.权利要求17或18任一项的嵌合肽的用途，其中所述运输序列包含人免疫缺陷病毒TAT多肽的氨基酸序列。
20.权利要求17-19中任一项的嵌合肽的用途，其中所述运输序列由SEQ ID NO：5，6，
7，8，21或22的氨基酸序列组成或包含SEQ ID NO：5，6，7，8，21或22的氨基酸序列。
21.权利要求17-20中任一项的嵌合肽的用途，其中所述运输序列增强所述肽的细胞摄取。
22.权利要求17-21中任一项的嵌合肽的用途，其中所述运输序列指引所述肽的核定位。
23.权利要求17-22中任一项的嵌合肽的用途，其中所述嵌合肽由SEQ ID NOs：9至12和23至32中任一个的氨基酸序列，或其片段、或变体组成，或包含SEQ ID NOs：9至12和
23至32中任一个的氨基酸序列，或其片段、或变体。
24.权利要求17-23中任一项的嵌合肽的用途，其中所述嵌合肽由SEQ ID NO：9或11的氨基酸序列组成或包含SEQ ID NO：9或11的氨基酸序列。
25.编码如在权利要求1至20中任一项定义的JNK抑制剂序列或如在权利要求17至
24中任一项定义的嵌合肽的分离的核酸在制备用于治疗受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，其中受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症如权利要求1-8中任一项所定义。
26.包含在权利要求25中定义的核酸的载体在制备用于治疗受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，其中受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症如权利要求1-8中任一项所定义。
27.包含如在权利要求26中定义的载体的细胞在制备用于治疗受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，其中受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症如权利要求1-8中任一项所定义。
28.免疫特异性结合权利要求1至16中任一项的JNK抑制剂序列或权利要求17至
24中任一项的嵌合肽的抗体在制备用于治疗受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，其中受试者中与JNK信号传导强相关的疾病或病症如权利要求
1-8中任一项所定义。
29.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述药物组合物将通过选自由以下组成的组的施用途径施用：肠胃外途径，包括静脉内、肌肉内、皮下、皮内、经皮途径，肠内途径，包括口服、经直肠途径，局部途径，包括经鼻、鼻内途径，和其它途径，包括表皮或贴片递送。
30.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的剂量(每kg体重)在以下范围内：多达10mmol/kg，优选多达1mmol/kg，更优选多达100μmol/kg，甚至更优选多达10μmol/kg，甚至更优选多达1μmol/kg，甚至更优选多达100nmol/kg，最优选多达50nmol/kg。
31.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的剂量在以下范围内：从约1pmol/kg至约1mmol/kg，从约10pmol/kg至约0,1mmol/kg，从约10pmol/kg至约0,01mmol/kg，从约50pmol/kg至约1μmol/kg，从约100pmol/kg至约500nmol/kg，从约200pmol/kg至约300nmol/kg，从约300pmol/kg至约100nmol/kg，从约500pmol/kg至约50nmol/kg，从约750pmol/kg至约30nmol/kg，从约250pmol/kg至约
5nmol/kg，从约1nmol/kg至约10nmol/kg，或任意两个所述值的组合。
JNK信号转导途径的细胞渗透肽抑制剂用于治疗多种疾病
的新用途
[0001] 本发明涉及蛋白激酶抑制剂的应用，并且更具体地涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶的抑制剂，JNK抑制剂序列，嵌合肽，或编码它们的核酸以及包含它们的药物组合物用于治疗与JNK信号传导强相关的多种疾病或病症的应用。
[0002] c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminal kinase，JNK)是有丝分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶的应激激活组的成员。这些激酶与控制细胞生长和分化关联，并且更通常地，与细胞对环境刺激的应答关联。JNK信号转导通路响应环境应激和通过几类细胞表面受体的参与而被激活。这些受体可以包括细胞因子受体，蛇根碱受体和受体酪氨酸激酶。在哺乳动物细胞中，JNK已经与生物过程(比如致癌性转化和调控针对环境应激适应性应答)相关联。JNK还已经与调解免疫应答相关联，所述免疫应答包括免疫细胞的成熟和分化，以及引起由免疫系统鉴别为要破坏的细胞中的程序性细胞死亡。该独特的性质使JNK信号传导成为开发药理学干预有希望的靶标。在一些神经病症中，JNK信号传导尤其与缺血性卒中(ischemic stroke)和帕金森病相关联，并且与其它在下文进一步提到的疾病关联。此外，显示有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38α通过对抗JNK-cJun-通路负调控细胞增殖。因此，有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38α似乎在抑制正常和癌症细胞增殖中起作用并且，作为进一步的，证明JNK参与到癌症疾病中(参见例如Hui等人，Nature Genetics，Vol 39，No.6，June 2007)。还显示，c-Jun N-末端激酶(JNK)参与到由脊神经结扎(SNL)产生的神经病性疼痛(neuropathic pain)中，其中SNL诱导缓慢和持久的JNK(尤其JNK1)活化，然而SNL之后在脊髓小胶质细胞发现p38有丝分裂原活化蛋白激酶活化，其到21天时降到接近基线水平(Zhuang等人，The Journal of Neuroscience，March 29，2006，26(13)：3551-3560))。
[0003] 因此，JNK信号传导通路的抑制或中断，特别是提供JNK信号传导途径的抑制剂，似乎在与JNK信号传导强烈相关的病症的斗争方面是有希望的途径。然而，到目前为止，仅存在少数JNK信号传导通路的抑制剂。
[0004] 现有技术中已知的JNK信号传导通路的抑制剂特别包括例如上游激酶抑制剂(例如，CEP-1347)，JNK的小化学抑制剂(SP600125和AS601245)，其例如通过与蛋白激酶的ATP-结合位点竞争直接影响激酶活性，和JNK及其底物间的相互作用的肽抑制剂(D-JNKI和I-JIP)(参见例如Kuan等人，Current Drug Targets-CNS&Neurological Disorders，February 2005，vol.4，no.1，pp.63-67(5))。
[0005] 上游激酶抑制剂CEP-1347(KT7515)是混合谱系激酶家族的半合成抑制剂。在原代胚胎培养物和分化的PC12细胞中在断供营养后，以及在用1-甲基-4-苯基四氢吡啶处理的小鼠中，CEP-1347(KT7515)以抑制c-Jun氨基末端激酶(JNKs)活化的剂量促进神经元存活。此外，CEP-1347(KT7515)能够促进培养的鸡胚背根神经节、交感、睫状和运动神经th元的长期存活(例如参见Borasio等人，Neuroreport.9(7)：1435-1439，May 11 1998.)。
[0006] 发现小的化学JNK抑制剂SP600125减少c-Jun磷酸化水平，保护多巴胺能神经元抵抗凋亡，并且部分恢复C57BL/6N小鼠中MPTP-诱导的PD中的多巴胺水平(Wang等人，Neurosci Res.2004 Feb；48(2)；195-202)。这些结果还表明JNK途径是体内MPTP神经毒性作用的主要调控剂，并且抑制JNK活性可能代表治疗PD的新型有效的策略。
[0007] 小的化学抑制剂的另一个实例是前文提及的JNK-抑制剂AS601245。AS601245抑制JNK信号传导途径并且在脑缺血后促进细胞存活。在体内，在短暂全身缺血的沙鼠模型中，AS601245提供显著的针对延缓的海马趾CA1神经元丧失的包含作用。这一作用受JNK抑制的调控，因此受c-Jun表达和磷酸化的调控(例如参见Carboni等人，J Pharmacol Exp thTher.2004Jul；310(1)：25-32.Epub 2004 Feb 26 )。
[0008] JNK信号传导途径的第三类抑制剂代表JNK与其底物之间相互作用的肽抑制剂，如上文所提及的。作为构建所述JNK抑制剂肽的起点，可以利用天然存在的JNK蛋白的序列比对。典型地，这些蛋白包含JNK结合结构域(JNK binding domains，JBDs)，并且存在于多种胰岛素结合(insulin binding，IB)蛋白中，如IB1或IB2中。这样的示例性序列比对的结果例如IB1[SEQ ID NO：13]，IB2[SEQ ID NO：14]，c-Jun[SEQ ID NO：15]和ATF2[SEQ ID NO：16]的JNK结合结构域之间的序列比对(例如参见图1A-1C)。所述比对揭示部分保守的8氨基酸序列(例如参见图1A)。IB1与IB2的JBDs的比较进一步揭示在这两个序列间高度保守的7个氨基酸和3个氨基酸的两个区段。
[0009] 基于所述比对构建的序列例如公开在WO 01/27268或WO 2007/031280中。WO2007/031280和WO 01/27268公开了小细胞渗透性融合肽，其包含来源于HIV-TAT蛋白的碱性运输序列的所谓的TAT细胞渗透序列和IB1的最少20个氨基酸的抑制序列。两种成分彼此共价连接。WO 2007/031280和WO 01/27268中公开的示例性的MAPK-JNK信号传导途径抑制剂(并且目前是唯一的抑制剂)例如是L-JNKI1(由L氨基酸构成的JNK-抑制剂肽)或蛋白酶耐受性D-JNKI1肽(由非天然D氨基酸构成的JNK-抑制剂肽)。这些JNK-抑制剂(JNKI)肽对JNK(JNK1，JNK2和JNK3)是特异性的。与上文讨论的那些小化合物抑制剂相比，WO 2007/031280或WO 01/27268中的抑制剂序列，例如，JNKI1，相反抑制的是JNK与其底物之间的相互作用。通过其来源于TAT的运输序列，该融合肽被有效地转运到细胞中。由于通过该允许成分获得的新特性，该融合肽被主动转运到细胞中，在细胞中它们保持有效性直到被蛋白水解降解。
[0010] 然而，WO 2007/031280或WO 01/27268所述的肽仅显示在特别有限数量的疾病中是有活性的，特别是在非恶性或免疫学相关的细胞增殖疾病中是有效的。
[0011] 因此，本发明的一个目的是鉴定其他可以用JNK抑制剂肽抗击的疾病。本发明的另一个目的是提供新型JNK抑制剂肽及其衍生物(的用途)，其用于治疗那些疾病和目前尚未知或已知与JNK信号传导强相关的疾病。
[0012] 这一目的通过使用JNK抑制剂序列来解决，所述JNK抑制剂序列优选如本文定义，典型地包含长度少于150个氨基酸，用于制备治疗受试者中多种与JNK信号传导强相关的炎性或非炎性疾病的药物组合物，其中所述疾病或病症选自下述组：
[0013] (a)脑脊髓炎(encephalomyelitis)，特别是急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis)，脊 椎 炎(spondylitis)，特 别 是强 直性 脊 柱炎(ankylosing spondylitis)，抗 合成 酶 综 合 征(antisynthetase syndrome)，皮炎(dermatitis)，特别是特应性皮炎(atopic dermatitis)或接触性皮炎(contact dermatitis)，肝炎(hepatitis)，特别是自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)，自身免疫性周围神经病(autoimmune peripheral neuropathy)，胰腺炎(pancreatitis)，特别是自身免疫性胰腺炎(autoimmune pancreatitis)，贝切特病(Behcet’s disease)，比克斯塔夫病(Bickerstaff’s)，脑炎(encephalitis)，Blau综合征(Blau syndrome)，腹腔病(Coeliac disease)，美洲锥虫病(Chagas disease)，多神经病(polyneuropathy)，特别是慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)，骨髓炎(osteomyelitis)，特别是慢性复发性多病灶性骨髓炎(chronic recurrent multifocal osteomyelitis)，丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)，耳蜗前庭综合征(Cogan syndrome)，巨细胞动脉炎(giant-cell arteritis)，肢端硬皮综合征(CREST syndrome)，脉管炎(vasculitis)，特别是皮肤小血管脉管炎(cutaneous small-vessel vasculitis)和荨麻疹性血管炎(urticarial vasculitis)，疱疹样皮炎(dermatitis herpetiformis)，皮肌炎(dermatomyositis)，系统性硬皮病(systemic scleroderma)，德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)，药物诱发的红斑狼疮(drug-induced lupus erythematosus)，盘状红斑狼疮(discoid lupus erythematosus)，肌腱末端炎(enthesitis)，嗜酸细胞性筋膜炎(eosinophilic fasciitis)，嗜酸细胞性胃肠炎(eosinophilic gastroenteritis)，结节性红斑(erythema nodosum)，特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis)，胃炎(gastritis)，格雷夫斯病(Grave’s disease)，吉兰-巴雷综合征(Guillain-barré syndrome)，桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)，亨诺赫-舍恩莱茵紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，化脓性汗腺炎(Hidradenitis suppurativa)，特发性炎症性脱髓鞘疾病(Idiopathic inflammatory demyelinating diseases)，肌炎 (myositis)，特 别 是 包 涵 体 肌 炎(inclusion body myositis)，膀胱炎(cystitis)，特别是间质性膀胱炎(interstitial cystitis)，川崎病(Kawasaki disease)，扁平苔癣(Lichen planus)，类狼疮性肝炎(lupoid hepatitis)，Majeed综合征(Majeed syndrome)，美尼尔 病(Ménière’s disease)，显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis)，混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease)，脊髓炎(myelitis)，特别是视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)，甲状腺炎(thyroiditis)，特别是奥德甲状腺炎(Ord’s thyroiditis)，风湿病(rheumatism)，特别是复发性风湿病(palindromic rheumatism)，Parsonage-Turner综合征(Parsonage-Turner syndrome)，寻常天疱疮(pemphigus vulgaris)，静脉周脑脊髓炎(perivenous encephalomyelitis)，结节性多发性动脉炎(polyarteritis nodosa)，多肌痛(polymyalgia)，特别是风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)，多肌炎(polymyositis)，肝硬化(cirrhosis)，特别是原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)，胆管炎(cholangitis)，特别是原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)，进行性炎症性神经病(progressive inflammatory neuropathy)，罗斯默森脑炎(Rasmussen’s encephalitis)，复发性多软骨炎(relapsing polychondritis)，关节炎(arthritis)，特别是反应性关节炎(reactive arthritis)(莱特尔病)和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，风湿热(rheumatic fever)，结节病(sarcoidosis)，Schnitzler综合征(Schnitzler syndrome)，血清病(serum sickness)，脊椎关节病(spondyloarthropathy)，高安动脉炎(Takayasu’s arteritis)，托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)，横贯性脊髓炎(transverse myelitis)，和韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)，
[0014] (b)眼炎性疾病，特别选自：葡萄膜炎(uveitis)，巩膜炎(scleritis)，角膜手术(corneal surgery)，结膜炎(conjunctivitis)，非传染性角膜炎(non-infectious keratitis)，虹膜炎(iritis)，脉络膜视网膜炎症(chorioretinal inflammation)，损伤眼睛视网膜的炎性病(inflammatory diseases damaging the retina of the eye)(视网膜病变(retinopathy))，特别是糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)，动脉高血压诱导的高血压性视网膜病变(arterial hypertension induced hypertensive retinopathy)，辐射诱发的视网膜病变(radiation induced retinopathy)，日光诱发的日光性视网膜病(sun-induced solar retinopathy)，外伤诱发的视网膜病变(trauma-induced retinopathy)，例如，普尔夏视网膜病(Purtscher’s retinopathy)，早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)和高粘滞性相关的视网膜病变(hyperviscosity-related retinopathy)，
[0015] (c) 艾 迪 生 病 (Addison’s disease)，丙 种 球 蛋 白 缺 乏 血 症(Agammaglobulinemia)，斑秃(Alopecia areata)，肌萎缩性侧索硬化(Amytrophic lateral sclerosis)，抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome)，特应性变态反应(Atopic allergy)，自身免疫性再生障碍性贫血(Autoimmune aplastic anemia)，自身免疫性心肌病(Autoimmune cardiomyopathy)，自身免疫性肠病(Autoimmune enteropathy)，自身免疫性溶血性贫血(Autoimmune hemolytic anemia)，自身免疫性内耳病(Autoimmune inner ear，disease)，自身免疫性淋巴细胞增生综合征(Autoimmune lymphoproliferative syndrome)，自身免疫性多内分泌腺综合征(Autoimmune polyendocrine syndrome)，自身免疫性孕酮皮炎(Autoimmune progesterone dermatitis)，特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura)，自身免疫性荨麻疹(Autoimmune urticaria)，巴洛同心性硬化(Balo concentric sclerosis)，大疱性类天疱疮(Bullous pemphigoid)，卡斯尔曼病(Castleman’s disease)，瘢痕性类天疱疮 (Cicatricial pemphigoid)，冷凝集素疾病(Cold agglutinin disease)，补体成分2缺乏相关的疾病(Complement component 2 deficiency associated disease)，库欣综合征(Cushing’s syndrome)，Dagos病(Dagos disease)，痛性肥胖症(Adiposis dolorosa)，嗜酸细胞性肺炎(Eosinophilic pneumonia)，获得性大疱性表皮松解(Epidermolysis bullosa acquisita)，新生儿溶血病(Hemolytic disease of the newborn)，冷球蛋白血症(Cryoglobulinemia)，伊文思综合征(Evans syndrome)，进行性骨化性纤维发育不良(Fibrodysplasia ossificans progressive)，胃肠类天疱疮(Gastrointestinal pemphigoid)，古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)，桥本脑病(Hashimoto’s encephalopathy)，妊娠类天疱疮(Gestational pemphigoid)，肺动脉栓塞综合征(Hughes-stovin syndrome)，低丙球蛋白血症(Hypogammaglobulinemia)，兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-eaton myasthenic syndrome)，硬化性苔癣(Lichen sclerosus)，硬斑病(Morphea)，急性苔藓痘疮样糠疹(Pityriasis lichenoides et varioliformis acuta)，重症肌无力(Myasthenia gravis)，发作性睡病(Narcolepsy)，神经性肌强直(Neuromyotonia)，眼阵挛-肌阵挛综合征(Opsoclonus myoclonus syndrome)，副肿瘤性小脑变性(Paraneoplastic cerebellar degeneration)，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)，面部偏瘫侧萎缩(Parry-romberg syndrome)，恶性贫血(Pernicious anemia)，POEMS综合征(POEMS syndrome)，坏疽性脓皮病(Pyoderma gangrenosum)，单纯红细胞再生障碍(Pure red cell aplasia)，雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)，下肢不宁综合征(Restless legs syndrome)，腹膜后纤维化(Retroperitoneal fibrosis)，2型自身免疫性多内分泌腺综合征(Autoimmune polyendocrine syndrome type 2)，僵人综合征(Stiff person syndrome)，Susac综合征(Susac’s syndrome)，发热嗜中性细胞皮肤病(Febrile neutrophilic dermatosis)，西登哈姆舞蹈病(Sydenham’s chorea)，血小板减少症(Thrombocytopenia)，和白癜风(vitiligo)，
[0016] (d)关节炎(arthritis)，特别是青少年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis)，银屑病性关节炎(psoriastic arthritis)和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，和关节病(arthrosis)，以及骨关节炎(osteoarthritis)，
[0017] (e)皮肤病，特别是选自银屑病(psoriasis)，湿疹(eczema)，皮炎(dermatitis)，痤疮(acne)，口腔溃疡(mouth ulcers)，红斑(erythema)，扁平苔藓(lichen plan)，肉状瘤病(sarcoidose)，血管炎(vascularitis)，成人线性IgA疾病(adult linear IgA disease)，
[0019] (g)息肉(polypes)，
[0020] (h)口腔或颌骨的炎性疾病，特别是牙髓炎(pulpitis)，种植牙周炎 (periimplantitis)，牙 周 炎 (periodontitis)，牙 龈 炎 (gingivitis)，口 炎(stomatitis)，粘膜炎(mucositis)，脱皮病(desquamative disorders)，颞颌关节病症(temporomandibular joint disorder)，
[0021] (i)骨坏死(osteonecrosis)，
[0022] (j)年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，特别是湿性或干性年龄相关的黄斑变性，和白内障(cataract)，
[0023] (k)纤维变性疾病和/或病症(fibrotic diseases and/or disorders)，特别选自肺、心脏、肝、骨髓、纵隔、腹膜后腔、皮肤、肠、关节和肩部纤维化，
[0024] (l)肾疾病和/或病症(kidney diseases and/or disorders)，一般特别选自肾小球肾炎(glomerulonephritis)，特别是膜增生性肾小球肾炎(membrano-proliferative glomerulonephritis)，系 膜 增 生 性 肾 小 球 肾 炎 (mesangio-proliferative glomerulonephritis)，急进性肾小球肾炎(rapidly progressive glomerulonephritis)，一般的肾病(nephrophathies)，特别是膜性肾病(membranous nephropathy)或糖尿病肾病(diabetic nephropathy)，一般的肾炎(nephritis)，特别是狼疮肾炎(lupus nephritis)，肾盂肾炎(pyelonephritis)，间质性肾炎(interstitial nephritis)，肾小管间质性肾炎(tubulointerstitial nephritis)，慢性间质性肾炎(chronic nephritis)或急性肾炎(acute nephritis)，和微小病变疾病(minimal change disease)和局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis)，
[0025] (m)交感性眼炎(sympathetic ophthalmia)，
[0027] (o)皮质基底节变性(Corticobasal degeneration)，进行性核上性麻痹(progresive supranuclear palsy)，精神分裂症(schizophrenia)，遗传性克雅病(inherited Kreutzfeld Jacob)，运动神经元病(motor neurone disease)，脊髓小脑性共济失调/萎缩(spinocerebellar ataxia/atrophie)，痴呆(dementia)，特别是额颞痴呆(frontotemporal dementia)，雷维小体痴呆(dementia with lewy bodies)，多系统萎缩(multiple system atrophy)，遗传性痉挛性轻截瘫(hereditary spastic paraparesis)，佛莱德立希共济失调(Friedreich’s ataxiea)，CMT病(Charcot Marie toot)，和[0028] (p)所述疾病是遗传性或非遗传性代谢病，特别选自下述的组：碳水化合物代谢的代谢病(metabolic disorders of the carbohydrate metabolism)，例如，糖原贮积病(glycogen storage disease)，氨基酸代谢病(disorders of amino acid metabolism)，例如，苯丙酮尿症(phenylketonuria)，枫糖尿病(maple syrup urine disease)，1型戊二酸血症(glutaric acidemia type 1)，尿素循环障碍(urea Cycle Disorder)或尿素循环缺陷(urea Cycle Defects)，例如，氨甲酰磷酸合酶I缺乏(carbamoyl phosphate synthetase I deficiency)，有机酸代谢病(disorders of organic acid metabolism)(有机酸尿症(organic acidurias))，例如，尿黑酸尿症(alcaptonuria)，脂肪酸氧化和线粒体代谢病(disorders of fatty acid oxidation and mitochondrial metabolism)，例如，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏(medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency)(通常缩写为MCADD.)，卟啉代谢病(disorders of porphyrin metabolism)，例如急性间歇性卟啉病(acute intermittent porphyria)，嘌呤或嘧啶代谢病(disorders of purine or pyrimidine metabolism)，例如，莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)，类固醇代谢病症(Disorders of steroid metabolism)，例如，类脂先天性肾上腺增生(lipoid congenital adrenal hyperplasia)，或先天性肾上腺增生(congenital adrenal hyperplasia)，线粒体功能障碍(disorders of mitochondrial function)，例如，卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)，过氧化物酶体功能障碍(disorders of peroxisomal function)，例如，Zellweger综合征(Zellweger syndrome)，或溶酶体贮积病(lysosomal storage disorders)，例如，戈谢病(Gaucher′s disease)或尼曼皮克病(Niemann Pick disease)。
[0029] 按照一个优选的实施方案，待治疗的病症/疾病是AMD(湿性或干性形式)和白内障。
[0030] 按照一个优选的实施方案，待治疗的病症/疾病是视网膜病变，特别是糖尿病性视网膜病变。
[0031] 按照一个优选的实施方案，待治疗的病症/疾病是银屑病。
[0032] 按照另一个优选的实施方案，待治疗的病症/疾病是移植排斥(graftrejection)或移植排斥反应，特别是肝、肺、肾、胰腺、皮肤或心脏移植的移植物排斥，例如，移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应。
[0033] 按照另一个优选的实施方案，待治疗的病症/疾病是肾小球肾炎。
[0034] 此外，在下文中公开其他待治疗的疾病：
[0035] 例如，本发明的JNK抑制剂可以用于炎性疾病的治疗，例如，包括急性炎症以及慢性炎症的治疗。本发明的JNK抑制剂可以用于治疗任意类型的组织炎症，例如，眼炎症，口腔炎症，呼吸系统炎症，包括，特别是肺部炎症，皮肤炎症，心血管系统内的炎症，脑部炎症，耳部炎症等。对于此类炎性疾病状态的一些非限制性的实例是粘膜炎(mucositis)，口腔炎(stomatitis)，种植牙周炎(peri-implantitis)，视网膜炎(retinitis)，脉络膜炎(chorioiditis)，干燥性角结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)，炎性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)，葡萄膜炎(uveitis)(例如，前葡萄膜炎(anterior uveitis)，中间葡萄膜炎(intermediate uveitis)，后葡萄膜炎(posterior uveitis))，牙周炎(periodontitis)，COPD，哮喘(asthma)，牙髓炎(pulpitis)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，局限性肠炎(Crohn’s disease)，银屑病性关节炎(psoriatic arthritis)，脉管炎(vasculitis)，间质性膀胱炎(interstitial cystitis)；在感染或伤口部位的急性炎症(acute inflammation at a site of infection or wound)，脑膜炎(meningitis)，脑炎(encephalitis)，肺炎(pneumonia)，咽炎(pharyngitis)，扁桃体炎(tonsillitis)，耳炎(otitis)(包括中耳炎(otitis media))，脉管炎，滑膜炎(synovitis)，肠炎(enteritis)，局限性肠炎，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)，移植排斥等。
[0036] 例如，本文公开的JNK抑制剂可以用在治疗下述疾病的方法中：耳部疾病(特别是内耳疾病)，听力丧失(特别是急性听力丧失)，损伤的毛细胞硬纤毛(damaged hair cell stereocilia)，毛细胞凋亡(hair cell apoptosis)，噪音性创伤(noise trauma)，耳炎(otitis)，中耳炎(otitis media)等。听力丧失和相关的毛细胞凋亡是由对细胞的应激情形导致的病症的非限制性实例，在所述细胞中JNK抑制可以调节应激反应，并且例如阻断凋亡。
[0037] 本发明的JNK抑制剂还可以用于治疗代谢病症，例如，用于治疗糖尿病(1型或2型，特别是1型)，法布里病(Fabry disease)，戈谢病(Gaucher disease)，低体温病(hypothermia)，过高热性缺氧(hyperthermia hypoxia)，脂质组织细胞增多症(lipid histiocytosis)，脂质沉积(lipidoses)，异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)，粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis)，尼曼皮克病(Niemann Pick disease)，肥胖(obesity)，和沃尔曼病(Wolman′s disease)。低温病，过高热病(hyperthermia)和缺氧病(hypoxia)也是关于细胞的胁迫情形的非限制性实例，在所述细胞中JNK抑制可以调节应激反应，并且例如阻断凋亡。
[0038] 类似地，本发明的JNK抑制剂分别可以用于治疗神经、神经元和/或神经变性疾病。例如，此类疾病的实例是亚历山大病(Alexander disease)，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)，肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，卒中(apoplexy)，运动失调性毛细血管扩张症(Ataxia Telangiectasia)，切断的或另外断裂的轴突，轴突切断术(axotomy)，脑损伤(brain lesions)，CMT(Charcot-Marie-Tooth)，皮质基底节变性，痴呆，神经系统疾病或病症，张力失常(dystonia)，癫痫(epilepsy)，法伯病(Farber′s disease)，弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia，SCA)，神经节苷脂累积病(gangliosidoses)，吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)，遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia)，赫希施普龙病(Hirschsprung′s disease)，人免疫缺陷病毒痴呆症(human immunodeficiency virus dementia)，亨廷顿病(Huntington′s disease)，脑梗死(infarct of the brain)，缺血性发作(ischemic stroke)，克 拉 伯 病(Krabbe disease)，Lennox Gastaut 综 合 征 (Lennox Gastaut Syndrome)，无脑回(lissencephaly)，多发性硬化(multiple sclerosis)，脊髓发育不良综合征(myelodysplastic syndromes)，脊髓病(myelopathy)，AIDS-相关的神经变性病(AIDS-related neurodegenerative diseases)，2型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 2，NF-2)，neurolatyerism，神经元凋亡(neuronal apoptosis)，神经元死亡(neuronal death)，神经性疼痛(neuropathic pain)，神经病变(neuropathy)，化疗诱发的神经病变(chemotherapy induced neuropathy)，糖尿病诱发的神经病变(diabetes induced neuropathy)，NMDA-诱发的神经毒性(NMDA-induced neurotoxicity)，疼痛，帕金森病(Parkinson’s disease)，帕金森综合征(parkinsonism)，皮克病(Pick′s Disease)，多神经病(polyneuropathy)，进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)，Sandhoff病(Sandhoff disease)，脊柱裂(spina bifida)，卒中(stroke)，Tay Sachs，TBI(弥散性轴索损伤(diffuse axonal injury))，例如由炎性疼痛诱导的深色神经元(dark neurone)的治疗，West综合征(West Syndrome)，脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)等。
[0039] 关于自身免疫性病症，例如，本发明的JNK抑制剂肽可以用在治疗CNS的自身免疫性疾病、自发炎性疾病、乳糜泻(Celiac disease)；舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)等的治疗方法中。
[0040] 可以用本发明的JNK抑制剂治疗的骨疾病的实例例如是关节炎，盘疝出(disc herniation)，进行性骨化性纤维发育不全(fibrodysplasia ossificans progressiva，FOP)，骨关节炎，骨硬化症(osteopetrosis)，骨质疏松症(osteoporosis)，特别是糖尿病诱导的骨质疏松症(diabetes induced osteoporosis)，佩吉特病(Paget′s Disease)，类风湿性关节炎等。
[0041] 可以用本发明的JNK抑制剂治疗的皮肤疾病的实例例如是银屑病和红斑狼疮。
[0042] 可以用本发明的JNK抑制剂治疗的眼疾病包括，例如，年龄相关的黄斑变性(AMD)；血管样条纹(angioid streaks)；前部缺血性视神经病变(anterior ischemic optic neuropathy)；前葡萄膜炎(anterior uveitis)；白内障，特别是年龄相关的白内障；中心性渗出性脉络膜视网膜病变(central exudative chorioretinopathy)；中心性浆液性脉络膜视网膜病变(central serous chorioretinopathy)；睑板腺囊肿(chalazion)；
chorioderemia；脉 络膜炎(chorioiditis)；脉络膜硬 化(choroidal sclerosis)；
结膜炎(conjunctivitis)；睫状体炎(cyclitis)；糖尿病视网膜病变(diabetic
retinopathy)；干眼综合征(dry eye syndrome)；眼内炎(endophthalmitis)；巩膜外层炎(episcleritis)；眼感染(eye infection)；白点状眼底(fundus albipunctatus)；脉络膜与视网膜的环状萎缩(gyrate atrophy of choroid and retina)；睑腺炎(hordeolum)；
眼睑的炎性疾病；脉络膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the choroid)；睫状体的炎性疾病(inflammatory diseases of the ciliary body)；结膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the conjunctiva)；角膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the cornea)；虹膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the iris)；泪腺的炎性疾病；眶骨的炎性疾病；巩膜的炎性疾病；玻璃体的炎性疾病；葡萄膜的炎性疾病；视网膜的炎性疾病；中间葡萄膜炎；虹膜炎(irititis)；角膜炎；利伯病(Leber′s disease)；多病灶性病症(multifocal choroiditis)；眼肌的肌炎；新生血管性黄斑病变(neovascular maculopathy)(例如，由高度近视(high myopia)，倾斜盘综合征(tilted disc syndrome)，脉络膜骨瘤(choroidal osteoma)等)；NMDA诱导的视网膜毒性(NMDA induced retinotoxicity)；眼病的非慢性或慢性炎症(non-chronic or chronic inflammatory eye diseases)；小口病(Oguchi′s disease)；视神经疾病；眼眶蜂窝织炎(orbital phlegmon)；panophtalmitis；全葡萄膜炎(panuveitis)；后囊浑浊(post caspule opacification)；后囊浑浊(posterior capsule opacification，PCO)(白内障术后并发症(cataract after-surgery complication))；后葡萄膜炎；增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy)；视网膜动脉闭塞(retinal artery occlusion)；视网膜剥离(retinal detachment)，视网膜疾病(retinal diseases)；视网膜损伤(retinal injuries)；视网膜巨动脉瘤(retinal macroaneurysm)；视网膜色素上皮脱离(retinal pigment epithelium detachment)；视网膜静脉闭塞(retinal vein occlusion)；视网膜炎(retinitis)；色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)；
白点状视网膜炎(retinitis punctata albescens)；视网膜病变，特别是早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)和糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)；
巩膜炎(scleritis)；斯塔加特病(Stargardt′s disease)；发炎的眼部伤口和/或眼部伤口边缘的治疗；眼部手术或外伤后眼内炎症的治疗；葡萄膜炎；卵黄状黄斑营养不良(vitelliform macular dystrophy)；等。
chorioderemia；脉 络膜炎(chorioiditis)；脉络膜硬 化(choroidal sclerosis)；
结膜炎(conjunctivitis)；睫状体炎(cyclitis)；糖尿病视网膜病变(diabetic
retinopathy)；干眼综合征(dry eye syndrome)；眼内炎(endophthalmitis)；巩膜外层炎(episcleritis)；眼感染(eye infection)；白点状眼底(fundus albipunctatus)；脉络膜与视网膜的环状萎缩(gyrate atrophy of choroid and retina)；睑腺炎(hordeolum)；
眼睑的炎性疾病；脉络膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the choroid)；睫状体的炎性疾病(inflammatory diseases of the ciliary body)；结膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the conjunctiva)；角膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the cornea)；虹膜的炎性疾病(inflammatory diseases of the iris)；泪腺的炎性疾病；眶骨的炎性疾病；巩膜的炎性疾病；玻璃体的炎性疾病；葡萄膜的炎性疾病；视网膜的炎性疾病；中间葡萄膜炎；虹膜炎(irititis)；角膜炎；利伯病(Leber′s disease)；多病灶性病症(multifocal choroiditis)；眼肌的肌炎；新生血管性黄斑病变(neovascular maculopathy)(例如，由高度近视(high myopia)，倾斜盘综合征(tilted disc syndrome)，脉络膜骨瘤(choroidal osteoma)等)；NMDA诱导的视网膜毒性(NMDA induced retinotoxicity)；眼病的非慢性或慢性炎症(non-chronic or chronic inflammatory eye diseases)；小口病(Oguchi′s disease)；视神经疾病；眼眶蜂窝织炎(orbital phlegmon)；panophtalmitis；全葡萄膜炎(panuveitis)；后囊浑浊(post caspule opacification)；后囊浑浊(posterior capsule opacification，PCO)(白内障术后并发症(cataract after-surgery complication))；后葡萄膜炎；增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy)；视网膜动脉闭塞(retinal artery occlusion)；视网膜剥离(retinal detachment)，视网膜疾病(retinal diseases)；视网膜损伤(retinal injuries)；视网膜巨动脉瘤(retinal macroaneurysm)；视网膜色素上皮脱离(retinal pigment epithelium detachment)；视网膜静脉闭塞(retinal vein occlusion)；视网膜炎(retinitis)；色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)；
白点状视网膜炎(retinitis punctata albescens)；视网膜病变，特别是早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)和糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)；
巩膜炎(scleritis)；斯塔加特病(Stargardt′s disease)；发炎的眼部伤口和/或眼部伤口边缘的治疗；眼部手术或外伤后眼内炎症的治疗；葡萄膜炎；卵黄状黄斑营养不良(vitelliform macular dystrophy)；等。
[0043] 可以用本文公开的JNK抑制剂治疗的示例性的口腔疾病是牙周炎(periodontitis)，特别是慢性牙周炎；粘膜炎(mucositis)，口腔脱皮病症(oral desquamative disorders)，口腔扁平苔藓(oral liquen planus)，寻常天疱疮(pemphigus vulgaris)，牙髓炎；口腔炎；颞颌关节病症(temporomandibular joint disorder)，种植牙周炎等。
[0044] 本发明还适合用于治疗导致膀胱功能丧失的疾病(例如，尿失禁(urinary incontinence)，膀胱活动过度(overactive bladder)，间质性膀胱炎(interstitial cystitis)，或膀胱癌(bladder cancer))。
[0045] 另一个应用领域是治疗疼痛，特别是神经性、伴随性(incident)、突破性(breakthrough)、精神性或幻觉性疼痛，所有这些类型的疼痛是急性或慢性形式。
[0046] 类似地，如之前关于其他JNK抑制剂已经提议的，本发明的JNK抑制剂可以用于治疗增生性疾病，如癌症和肿瘤疾病，诸如听神经鞘瘤(acusticus neurinoma)、肺癌；急性淋巴细胞白血病(L1，L2，L3)；急性类淋巴细胞白血病(acute lymphoid leukaemia，ALL)；急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)；腺癌(adenocarcinomas)；肛门癌(anal carcinoma)；支气管瘤(bronchial carcinoma)；宫颈癌(cervix carcinoma)；
宫颈癌(cervical cancer)；星形细胞瘤(astrocytoma)；基底细胞癌(basalioma)；具有Bcr-Abl转化的癌症(cancer with Bcr-Abl transformation)；膀胱癌(bladder cancer)；胚细胞瘤(blastomas)；骨癌(bone cancer)；脑转移(brain metastases)；脑瘤(brain tumours)；乳腺癌(breast cancer)；伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)；
类癌(carcinoids)；宫颈癌；慢性林班细胞性白血病(chronic lymphocytic leukaemia，CLL)；慢性髓性白血病(chronic myeloid leukaemia，CML)；结肠癌(colon cancer)；结肠癌(colon carcinoma)；子宫体癌(corpus carcinoma)；颅咽管瘤(craniopharyngeomas)；
CUP综合征(CUP syndrome)；病毒诱导的肿瘤(virus-induced tumours)；EBV-诱导的B细胞淋巴瘤(EBV-induced B cell lymphoma)；子宫内膜癌(endometrium carcinoma)；
红白血病(erytholeukemia)(M6)；食道癌(esophagus cancer)；胆囊癌(gallbladder cancer)；胃肠癌(gastrointestinal cancer)；胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors)；胃肠瘤(gastrointestinal tumours)；泌尿生殖器肿瘤(genitourinary cancer)；青光眼(glaucoma)；胶质母细胞瘤(glioblastoma)；神经胶质瘤(gliomas)；
头颈瘤(head/neck tumours)；乙型肝炎诱导的肿瘤(hepatitis B-induced tumours)；
肝细胞或肝细胞性癌(hepatocell or hepatocellular carcinomas)；肝细胞瘤
(hepatomas)；疱疹病毒-诱导的肿瘤(herpes virus-induced tumours)；霍奇金综合征(Hodgkin′s syndrome)；HTLV-1-诱导的淋巴瘤(HTLV-1-induced lymphomas)；
HTLV-2-诱导的淋巴瘤(HTLV-2-induced lymphomas)；胰岛瘤(insulinomas)；肠癌(intestinal cancer)；卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)；肾癌(kidney cancer)；肾癌(kidney carcinomas)；喉癌(laryngeal cancer)；白血病(leukemia)；眼睑瘤(lid tumour)；肝癌(liver cancer)；肝转移(liver metastases)；肺癌(lung cancer)；淋巴癌(lymphoid cancer)；淋巴瘤(lymphomas)；恶性黑素瘤(malignant melanomas)；
乳腺癌(mammary carcinomas)；外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；髓母细胞瘤(medulloblastoma)；巨核母细胞性白血病(megakaryoblastic leukemia)M7)；黑素瘤(melanoma)，特别是恶性黑素瘤；脑膜瘤(meningioma)；间皮瘤(mesothelioma)；单核细胞性白血病(monocytic leukemia)(MS)；多发性骨髓瘤(multiple myeloma)；蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)；成髓细胞白血病(myeloblastic leukemia)(M1)；
成髓细胞白血病(M2)；粒单核细胞白血病(myelomonocytic leukemia)(M4)；神经鞘瘤(neurinoma)；非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphomas)；非小细胞癌(non-small cell carcinoma)；非小 细胞 肺癌 (non-small cell carcinoma of the lung)；食道癌(oesophageal cancer)；食道癌(oesophageal carcinoma)；少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)；卵巢癌(ovarian cancer)；卵巢癌(ovarian carcinoma)；胰腺癌(pancreatic cancer)；胰腺癌(pancreatic carcinoma)；乳头瘤病毒诱导的癌症(papilloma virus-induced carcinomas)；阴茎癌(penis cancer)；脑垂体瘤(pituitary tumour)；浆细胞瘤(plasmocytoma)；前髓细胞性白血病(promyelocytic leukemia)(M3)；
前列腺癌(prostate cancer)；前列腺瘤(prostate tumours)；直肠瘤(rectal tumours)；
直肠癌(rectum carcinoma)；肾细胞癌(renal-cell carcinoma)；视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)；肉瘤(sarcomas)；Schneeberger病(Schneeberger′s disease)；小细胞肺癌(small cell lung carcinomas)；小肠癌(small intestine cancer)；小肠瘤(small intestine tumours)；软组织瘤(soft tissue tumours)；脊柱瘤(spinalioma)；
鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)；胃癌(stomach cancer)；睾丸癌(testicular cancer)；喉癌(throat cancer)；胸腺瘤(thymoma)；甲状腺癌(thyroid cancer)；甲状腺癌(thyroid carcinoma)；舌癌(tongue cancer)；未分化的AML(MO)；尿道癌(urethral cancer)；子宫癌(uterine cancer)；阴道癌(vaginal cancer)；希佩尔-林道病(Von Hippel Lindau disease)；外阴癌(vulval cancer)；肾母细胞瘤(Wilms′Tumor)；着色性干皮病(Xeroderma pigmentosum)；等。
宫颈癌(cervical cancer)；星形细胞瘤(astrocytoma)；基底细胞癌(basalioma)；具有Bcr-Abl转化的癌症(cancer with Bcr-Abl transformation)；膀胱癌(bladder cancer)；胚细胞瘤(blastomas)；骨癌(bone cancer)；脑转移(brain metastases)；脑瘤(brain tumours)；乳腺癌(breast cancer)；伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)；
类癌(carcinoids)；宫颈癌；慢性林班细胞性白血病(chronic lymphocytic leukaemia，CLL)；慢性髓性白血病(chronic myeloid leukaemia，CML)；结肠癌(colon cancer)；结肠癌(colon carcinoma)；子宫体癌(corpus carcinoma)；颅咽管瘤(craniopharyngeomas)；
CUP综合征(CUP syndrome)；病毒诱导的肿瘤(virus-induced tumours)；EBV-诱导的B细胞淋巴瘤(EBV-induced B cell lymphoma)；子宫内膜癌(endometrium carcinoma)；
红白血病(erytholeukemia)(M6)；食道癌(esophagus cancer)；胆囊癌(gallbladder cancer)；胃肠癌(gastrointestinal cancer)；胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors)；胃肠瘤(gastrointestinal tumours)；泌尿生殖器肿瘤(genitourinary cancer)；青光眼(glaucoma)；胶质母细胞瘤(glioblastoma)；神经胶质瘤(gliomas)；
头颈瘤(head/neck tumours)；乙型肝炎诱导的肿瘤(hepatitis B-induced tumours)；
肝细胞或肝细胞性癌(hepatocell or hepatocellular carcinomas)；肝细胞瘤
(hepatomas)；疱疹病毒-诱导的肿瘤(herpes virus-induced tumours)；霍奇金综合征(Hodgkin′s syndrome)；HTLV-1-诱导的淋巴瘤(HTLV-1-induced lymphomas)；
HTLV-2-诱导的淋巴瘤(HTLV-2-induced lymphomas)；胰岛瘤(insulinomas)；肠癌(intestinal cancer)；卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)；肾癌(kidney cancer)；肾癌(kidney carcinomas)；喉癌(laryngeal cancer)；白血病(leukemia)；眼睑瘤(lid tumour)；肝癌(liver cancer)；肝转移(liver metastases)；肺癌(lung cancer)；淋巴癌(lymphoid cancer)；淋巴瘤(lymphomas)；恶性黑素瘤(malignant melanomas)；
乳腺癌(mammary carcinomas)；外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；髓母细胞瘤(medulloblastoma)；巨核母细胞性白血病(megakaryoblastic leukemia)M7)；黑素瘤(melanoma)，特别是恶性黑素瘤；脑膜瘤(meningioma)；间皮瘤(mesothelioma)；单核细胞性白血病(monocytic leukemia)(MS)；多发性骨髓瘤(multiple myeloma)；蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)；成髓细胞白血病(myeloblastic leukemia)(M1)；
成髓细胞白血病(M2)；粒单核细胞白血病(myelomonocytic leukemia)(M4)；神经鞘瘤(neurinoma)；非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphomas)；非小细胞癌(non-small cell carcinoma)；非小 细胞 肺癌 (non-small cell carcinoma of the lung)；食道癌(oesophageal cancer)；食道癌(oesophageal carcinoma)；少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)；卵巢癌(ovarian cancer)；卵巢癌(ovarian carcinoma)；胰腺癌(pancreatic cancer)；胰腺癌(pancreatic carcinoma)；乳头瘤病毒诱导的癌症(papilloma virus-induced carcinomas)；阴茎癌(penis cancer)；脑垂体瘤(pituitary tumour)；浆细胞瘤(plasmocytoma)；前髓细胞性白血病(promyelocytic leukemia)(M3)；
前列腺癌(prostate cancer)；前列腺瘤(prostate tumours)；直肠瘤(rectal tumours)；
直肠癌(rectum carcinoma)；肾细胞癌(renal-cell carcinoma)；视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)；肉瘤(sarcomas)；Schneeberger病(Schneeberger′s disease)；小细胞肺癌(small cell lung carcinomas)；小肠癌(small intestine cancer)；小肠瘤(small intestine tumours)；软组织瘤(soft tissue tumours)；脊柱瘤(spinalioma)；
鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)；胃癌(stomach cancer)；睾丸癌(testicular cancer)；喉癌(throat cancer)；胸腺瘤(thymoma)；甲状腺癌(thyroid cancer)；甲状腺癌(thyroid carcinoma)；舌癌(tongue cancer)；未分化的AML(MO)；尿道癌(urethral cancer)；子宫癌(uterine cancer)；阴道癌(vaginal cancer)；希佩尔-林道病(Von Hippel Lindau disease)；外阴癌(vulval cancer)；肾母细胞瘤(Wilms′Tumor)；着色性干皮病(Xeroderma pigmentosum)；等。
[0047] 由于JNK信号传导还参与多种心血管疾病和病症，因此在过去已经提议了JNK抑制剂在治疗此类疾病中的应用。因此，例如，本发明的抑制剂可以用于治疗心血管疾病，如动脉高血压(arterial hypertension)；动脉硬化(arteriosclerosis)；动脉硬化损伤(arteriosclerotic lesions)；贝赫切特综合征(Behcet′s syndrome)；血管分叉(bifurcations of blood vessels)；心脏肥大(cardiac hypertrophy)；心血管肥大(cardiavascular hypertrophy)；心肌病(cardiomyopathies)，特别是化疗诱导的心肌病(chemotherapy induced cardiomyopathies)；脑缺血症(cerebral ischemia)；冠心病(coronary heart diseases)；腹主动脉的扩张(dilatation of the abdominal aorta)；病灶性脑缺血(focal cerebral ischemia)；整体性脑缺血(global cerebral ischemia)；心脏肥大(heart hypertrophy)；肾下动脉瘤高血压(infrarenal aneurism hypertension)；缺血(ischemia)；心肌梗死(myocardial infarct)，特别是急性心肌梗死(acute myocardial infarction)；心肌炎(myocarditis)；再灌注(reperfusion)；再狭窄(restenosis)；脉管炎(vasculitis)；韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)；等。
[0048] 在心血管疾病的情形中，本发明的JNK抑制剂还可以与下述补充性使用：冠状动脉旁路移植手术(CABG手术)；经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)；和/或支架治疗(stent treatment)，例如以预防或治疗由所述(手术)治疗导致的内膜增生。
[0049] 可以用本发明的JNK抑制剂有效治疗的呼吸系统疾病，特别是肺部疾病，例如是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)；哮喘；涉及呼吸系统的慢性疾病；慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)；囊性纤维化(cystic fibrosis)；炎性肺病(inflammatory lung diseases)；肺炎(pneumonia)；肺纤维化(pulmonary fibrosis)；等。
[0050] 如同现有技术中的抑制剂，本发明的抑制剂还可以用于治疗肠道疾病，例如，结肠炎(colitis)(例如，非典型性结肠炎(atypical colitis)，化学性结肠炎(chemical colitis)；胶原性结肠炎(collagenous colitis)，远端结肠炎(distal colitis)，改道性结肠炎(diversion colitis)；爆发性结肠炎(fulminant colitis)，不确定的结肠炎(indeterminate colitis)，传染性结肠炎(infectious colitis)，缺血性结肠炎(ischemic colitis)，淋巴细胞结肠炎(lymphocytic colitis)，或镜下结肠炎(microscopic colitis))，局限性肠炎(Crohn’s disease)，胃肠炎(gastroenteritis)，赫希施普龙病(Hirschsprung′s disease)，炎性消化性疾病(inflammatory digestive diseases)；炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，克罗恩病(Morbus Crohn)，非慢性或慢性消化性疾病(non-chronic or chronic digestive diseases)，非慢性或慢性炎性消化性疾病(non-chronic or chronic inflammatory digestive diseases)；局限性肠炎(regional enteritis)；溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)等。
[0051] 本发明的JNK抑制剂还可以作为用于治疗传染病(例如，由细菌或病毒感染导致的传染病)的治疗剂。例如，本文公开的JNK抑制剂可以用于预防或减轻由所述感染引起的炎性反应。所述疾病状态的实例(不被认为是限制性的)是病毒性脑炎(viral encephalitis)；病毒诱导的癌症(例如，如上文所述)，人免疫缺陷病毒痴呆症，脑膜炎，脑膜脑炎(meningoencephalitis)，脑脊髓炎(encephalomyelitis)，扁桃体炎(tonsillitis)，等。
[0052] 存在多种其他的可以使用本发明的JNK抑制剂作为治疗的疾病、疾病状态和病症，例如，Aarskog综合征(Aarskog syndrome)，醋氨酚肝毒性(acetaminophen hepatotoxicity)；奥-里异常(Alder-Reilly anomaly)斑秃；α-1-抗胰蛋白酶缺乏(alpha-1-antitrypsin deficiency)；过敏性(anaphylaxis)；凋亡；凋亡细胞死亡；非典型性溶血性尿毒症综合征(atypical hemolytic uremic syndrome)；嗜碱细胞减少(basopenia)；嗜碱细胞增多(basophilia)；双相性精神障碍(bipolar disorders)；烧伤；细胞剪切力(cellular shear stress)；白细胞异常色素减退综合征(Chedial-Higashi syndrome)；由化疗药物导致的DNA损伤；胆汁淤积(cholestasis)；11号染色体，部分单体性11q；22号染色体，三体性镶嵌；慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease)；
肝炎(hepatitis)，如慢性或爆发性肝炎；临床抑郁症(clinical depression)；常见变异型低丙种球蛋白血症(common variable hypogammaglobulinemia)；先天性C3缺乏(congenital C3 deficiency)；抗活化诱导的细胞死亡(AICD)的CTL保护(CTL
protection from activation-induced cell death(AICD))；耳聋；抑郁和抑郁性障碍(depressive disorders)(特别是预防在细胞因子诱导的疾病行为背景上发展抑郁性障碍)，迪乔治综合征(DiGeorge′s syndrome)；由缺陷性凋亡引起的疾病；肝病；脊柱疾病；
子宫疾病；由于暴露于DNA损伤剂和/或电离辐射以及导致的细胞应激产生的疾病状态和症状；唐氏综合征(Down Syndrome)；迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)；
外胚层发育不良(ectodermal dysplasias)；子宫内膜异位症(endometriosis)；嗜酸粒细胞减少(eosinopenia)；嗜酸性粒细胞增多症(eosinophilia)；外毒细胞死亡(exocitoxic cell death)；胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome)；纤维化；纤维变性病(fibrotic disease)；纤维组织形成(formation of fibrous tissue)；自由基(导致细胞胁迫)；移植排斥；移植物抗宿主病(Graft versus host Disease)，特别是皮肤移植物抗宿主病(skin graft versus host)；脱发(hair loss)；溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome)；肝毒性(hepatotoxicity)；痛觉过敏(hyperalgesia)，诸如糖尿病诱导的痛觉过敏(diabetes induced hyperalgesia)；过高热(hyperthermia)；
低血糖(hypoglycemia)；甲状腺功能减退(hypothyroidism)；特发性嗜酸细胞增多综 合 征(idiopathic hypereosinophilic syndrome)；IgA肾 病 (IgA nephropathy)；
婴儿性连锁无丙种球蛋白血症(infantile sex-linked agammaglobulinemia)；炎性痛(inflammatory pain)；肾下动脉瘤(infrarenal aneyrism)；胰岛再生(islet regeneration)；islet transplantation；Job综合征(Job′s syndrome)(高-IgE)；
懒惰白细胞综合征(lazy leukocyte syndrome)；白细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(leukocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency)；脑白质营养不良症(leukodystrophy)；白血球减少症(leukopenia)；淋巴细胞白细胞增多(lymphocytic leukocytosis)；淋巴细胞减少(lymphocytopenia)；淋巴细胞增多(lymphocytosis)；严重抑郁(major depression)；躁狂症(mania)；躁狂性抑郁(maniac depression)；马方综合征(Marfan syndrome)；肥大细胞增多症(mastocytosis)；梅-赫异常(May Hegglin Anomaly)；II型膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis Type II)；单核细胞减少(monocytopenia)；单核细胞增多(monocytosis)；良性髓过氧化物酶缺乏症(myeloperoxidase deficiency-benign)；肌病(myopathies)；嗜中性白血球减少症(neutropenia)；嗜中性白细胞增多症(neutrophilia)；奈泽洛夫综合征(Nezelofs syndrome)；器官移植(organ transplantation)；氧化性应激损伤(oxidative stress injuries)；佩-许异常(Pelger-Huet anomaly)；多囊性肾病(polycystic kidney diseases)；透析后综合征(post-dialysis syndrome)；放射综合征(radiation syndromes)；放射线疗法(radiotherapy)；肾病(renal diseases)；肾衰竭(renal failure)；由活化诱导的细胞死亡导致的复发性(rescuing CTL from activation induced cell death)；重症 联 合免 疫 缺陷 (severe combined immunodeficiency disease)；移植排斥；移植；三体性；单相抑郁症(unipolar depression)；UV-诱导的损伤(UV-induced injuries)；威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott Aldrich syndrome)；伤口愈合；等。
肝炎(hepatitis)，如慢性或爆发性肝炎；临床抑郁症(clinical depression)；常见变异型低丙种球蛋白血症(common variable hypogammaglobulinemia)；先天性C3缺乏(congenital C3 deficiency)；抗活化诱导的细胞死亡(AICD)的CTL保护(CTL
protection from activation-induced cell death(AICD))；耳聋；抑郁和抑郁性障碍(depressive disorders)(特别是预防在细胞因子诱导的疾病行为背景上发展抑郁性障碍)，迪乔治综合征(DiGeorge′s syndrome)；由缺陷性凋亡引起的疾病；肝病；脊柱疾病；
子宫疾病；由于暴露于DNA损伤剂和/或电离辐射以及导致的细胞应激产生的疾病状态和症状；唐氏综合征(Down Syndrome)；迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)；
外胚层发育不良(ectodermal dysplasias)；子宫内膜异位症(endometriosis)；嗜酸粒细胞减少(eosinopenia)；嗜酸性粒细胞增多症(eosinophilia)；外毒细胞死亡(exocitoxic cell death)；胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome)；纤维化；纤维变性病(fibrotic disease)；纤维组织形成(formation of fibrous tissue)；自由基(导致细胞胁迫)；移植排斥；移植物抗宿主病(Graft versus host Disease)，特别是皮肤移植物抗宿主病(skin graft versus host)；脱发(hair loss)；溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome)；肝毒性(hepatotoxicity)；痛觉过敏(hyperalgesia)，诸如糖尿病诱导的痛觉过敏(diabetes induced hyperalgesia)；过高热(hyperthermia)；
低血糖(hypoglycemia)；甲状腺功能减退(hypothyroidism)；特发性嗜酸细胞增多综 合 征(idiopathic hypereosinophilic syndrome)；IgA肾 病 (IgA nephropathy)；
婴儿性连锁无丙种球蛋白血症(infantile sex-linked agammaglobulinemia)；炎性痛(inflammatory pain)；肾下动脉瘤(infrarenal aneyrism)；胰岛再生(islet regeneration)；islet transplantation；Job综合征(Job′s syndrome)(高-IgE)；
懒惰白细胞综合征(lazy leukocyte syndrome)；白细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(leukocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency)；脑白质营养不良症(leukodystrophy)；白血球减少症(leukopenia)；淋巴细胞白细胞增多(lymphocytic leukocytosis)；淋巴细胞减少(lymphocytopenia)；淋巴细胞增多(lymphocytosis)；严重抑郁(major depression)；躁狂症(mania)；躁狂性抑郁(maniac depression)；马方综合征(Marfan syndrome)；肥大细胞增多症(mastocytosis)；梅-赫异常(May Hegglin Anomaly)；II型膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis Type II)；单核细胞减少(monocytopenia)；单核细胞增多(monocytosis)；良性髓过氧化物酶缺乏症(myeloperoxidase deficiency-benign)；肌病(myopathies)；嗜中性白血球减少症(neutropenia)；嗜中性白细胞增多症(neutrophilia)；奈泽洛夫综合征(Nezelofs syndrome)；器官移植(organ transplantation)；氧化性应激损伤(oxidative stress injuries)；佩-许异常(Pelger-Huet anomaly)；多囊性肾病(polycystic kidney diseases)；透析后综合征(post-dialysis syndrome)；放射综合征(radiation syndromes)；放射线疗法(radiotherapy)；肾病(renal diseases)；肾衰竭(renal failure)；由活化诱导的细胞死亡导致的复发性(rescuing CTL from activation induced cell death)；重症 联 合免 疫 缺陷 (severe combined immunodeficiency disease)；移植排斥；移植；三体性；单相抑郁症(unipolar depression)；UV-诱导的损伤(UV-induced injuries)；威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott Aldrich syndrome)；伤口愈合；等。
[0053] 本发明的发明人认为下述特别适合用本发明的JNK抑制剂治疗：颞颌关节病症(temporomandibular joint disorder)，粘膜炎，口腔炎，口腔扁平苔藓(oral liquen planus)(脱皮性病症(desquamative disorder))，寻常天疱疮(脱皮性病症)，牙周炎，慢性牙周炎，牙髓炎，种植牙周炎，葡萄膜炎(前葡萄膜炎，中间葡萄膜炎，后葡萄膜炎)，干燥性角结膜炎(干眼综合征)，冠状动脉旁路移植手术(CABG手术)，急性心肌梗死(acute myocardial infarction)，预防经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后的内膜增生，预防纸浆放置后的内膜增生，动脉粥样硬化，COPD，哮喘，类风湿性关节炎，骨关节炎，局限性肠炎，炎性肠病(IBD)，银屑病，糖尿病，卒中，帕金森病，阿尔茨海默病，系统性红斑狼疮，和脉管炎，特别是韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)。
[0054] 按照本发明的另一方面，包含长度少于150个氨基酸的抑制剂序列用于在移植之前(体外)处理组织或器官移植物。通常，来源于脑死亡的供体的移植物典型地不进行WIT，具有8-12小时的CIT(从获得医院运到分离实验室需要的时间)。发现所述移植物可以用本发明所述的JNK抑制剂预处理，从而提高其直到植入到宿主中的存活力和功能性。对于本发明的这一方面，所述移植物是肾、心脏、肺、胰腺、肝、血细胞、骨髓、角膜、意外切断的肢体，特别是手指、手、脚、脸、鼻子、骨、心脏瓣膜、血管或肠移植物，优选肾、心脏、胰腺或皮肤移植物。
[0055] 由于本领域所示的JNK抑制剂序列仅证明可用于有限的疾病，因此，可以使用本文定义的JNK抑制剂序列，并且适合用于上文提及的与JNK信号传导强相关的疾病或病症的治疗，是令人惊讶的发现。尽管JNK抑制剂序列通常是本领域已知的，但是这不是显而易见的，也不是现有技术提示的。
[0056] 典型地，上文定义的JNK抑制剂序列可以来源于人或大鼠IB1序列，优选地来自由下述任一种序列定义或编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：102(显示来自大鼠的IB1 cDNA序列及其预测的氨基酸序列)，SEQ ID NO：103(显示由rIB1基因的外显子-内含子边界-剪接供体编码的来自大鼠的IB1蛋白序列)，SEQ ID NO：104(显示来自智人(Homo sapiens)的IB1蛋白序列)，或SEQ ID NO：105(显示来自智人的IB1 cDNA序列)，更优选地来自由下述任一序列定义或编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：104(显示来自智人的IB1蛋白序列)，或SEQ ID NO：105(显示来自智人的IB1 cDNA序列)，或来自其任意片段或变体。换言之，所述JNK抑制剂序列包含人或大鼠IB1序列的片段、变体或所述片段的变体。人或大鼠IB序列分别由SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105的序列定义或编码。
[0057] 优选地，如本文使用的此种JNK抑制剂序列包含总长少于150个氨基酸残基，优选在从5至150个氨基酸残基的范围内，更优选10至100个氨基酸残基的范围内，甚至更优选10至75个氨基酸残基的范围内和最优选10至50个氨基酸残基的范围内，例如10至30个，10至20个，或10至15个氨基酸残基的范围内。
[0058] 更优选地，此种JNK抑制剂序列和以上范围可以选自以上提到的序列中的任一个，甚至更优选选自如根据SEQ ID NO：104定义的或如由SEQ ID NO：105编码的氨基酸序列，甚至更优选在SEQ ID NO：105的核苷酸420和980之间或SEQ ID NO：104的氨基酸105和291之间的区域，并且最优选在SEQ ID NO：105的核苷酸561和647之间或SEQ ID NO：104的氨基酸152和180之间的区域。
[0059] 根据一个具体的实施方案，如本文使用的JNK抑制剂序列典型地结合JNK和/或抑制至少一种JNK激活的转录因子(例如c-Jun或ATF2(分别参见例如SEQ ID NOs：15和16)或E1k1)的激活。
[0060] 同样地，如本文使用的JNK抑制剂序列优选包含至少一个根据SEQ ID NOs：1至4，13至20和33至100的任一个的氨基酸序列，或其片段，衍生物或变体或由至少一个根据SEQ ID NOs：1至4，13至20和33至100的任一个的氨基酸序列，或其片段，衍生物或变体组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含1，2，3，4或甚至更多个拷贝的根据SEQ ID NOs：1至4，13至20和33至100，或其变体，片段或衍生物的氨基酸序列。如果以多于一个拷贝存在，则可以将如本文使用的根据SEQ ID NOs：1至4，13至20和33至100，或其变体，片段，或衍生物的这些氨基酸序列在没有任何接头序列的情况下直接彼此连接或通过包含1至10，优选1至5个氨基酸的接头序列直接彼此连接。形成所述接头序列的氨基酸优选选自作为氨基酸残基的甘氨酸或脯氨酸。更优选地，如本文使用的，根据SEQ ID NOs：1至4，13至20和33至100，或其片段，变体或衍生物的这些氨基酸序列，可以通过两个，三个或更多个脯氨酸残基的铰链彼此分开。
[0061] 如本文使用的JNK抑制剂序列可以由L-氨基酸，D-氨基酸，或二者的组合构成。优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列包含至少1或甚至2个，优选至少3，4或5个，更优选至少6，7，8或9个和甚至更优选至少10或更多个D-和/或L-氨基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸可以以区段方式(blockwise)，非区段方式(non-blockwise)或以交替的方式排列在如本文使用的JNK抑制剂序列中。
[0062] 根据一个优选的实施方案，如本文使用的JNK抑制剂序列可以仅由L-氨基酸构成。那么，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据SEQ ID NO：1或3的至少一种″天然的JNK抑制剂序列″或由根据SEQ ID NO：1或3的至少一种″天然的JNK抑制剂序列″组成。在本文中，术语″天然的″或″天然的JNK抑制剂序列″指根据如本文使用的完全由L-氨基酸构成的SEQ ID NOs：1或3的任一个的未改变的JNK抑制剂序列。
[0063] 因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含以下或由以下组成：至少一种(天b a b然的)氨基酸序列NH2-Xn-Xn-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn-COOH(L-IB通用)[SEQ ID NO：3]和/或IB1的JNK结合结构域(JBDs)XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX(L-IB(通用))[SEQ ID NO：
a
19]。在本文中，每个X典型地表示氨基酸残基，优选选自任何(天然的)氨基酸残基。Xn典型地表示一个氨基酸残基，优选选自除丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基，其中n(Xb
的重复数量)是0或1。此外，每个Xn可以选自任何氨基酸残基，其中n(X的重复数量)a
是0-5，5-10，10-15，15-20，20-30或更多，条件是如果n(X的重复数量)对于Xn是0，则b b
Xn优选在其C端不包含丝氨酸或苏氨酸，以便在此位置避免丝氨酸或苏氨酸。优选地，Xna b
表示源自SEQ ID NO：1或3的肽残基的连续的一段序列。Xn和Xn可以表示D或L氨基酸之一。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含选自包含IB1的JNK结合结构域DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(L-IB1)[SEQ ID NO：17]的组的至少一种(天然的)氨基酸序列或由选自包含IB1的JNK结合结构域DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(L-IB1)[SEQ ID NO：17]的组的至少一种(天然的)氨基酸序列组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列进一步可以包含至少一种(天然的)氨基酸序列NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-IB1(s))[SEQ ID NO：1]或由至少一种(天然的)氨基酸序列
a
19]。在本文中，每个X典型地表示氨基酸残基，优选选自任何(天然的)氨基酸残基。Xn典型地表示一个氨基酸残基，优选选自除丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基，其中n(Xb
的重复数量)是0或1。此外，每个Xn可以选自任何氨基酸残基，其中n(X的重复数量)a
是0-5，5-10，10-15，15-20，20-30或更多，条件是如果n(X的重复数量)对于Xn是0，则b b
Xn优选在其C端不包含丝氨酸或苏氨酸，以便在此位置避免丝氨酸或苏氨酸。优选地，Xna b
表示源自SEQ ID NO：1或3的肽残基的连续的一段序列。Xn和Xn可以表示D或L氨基酸之一。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含选自包含IB1的JNK结合结构域DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(L-IB1)[SEQ ID NO：17]的组的至少一种(天然的)氨基酸序列或由选自包含IB1的JNK结合结构域DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(L-IB1)[SEQ ID NO：17]的组的至少一种(天然的)氨基酸序列组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列进一步可以包含至少一种(天然的)氨基酸序列NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-IB1(s))[SEQ ID NO：1]或由至少一种(天然的)氨基酸序列
[0064] NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-IB1(s))[SEQ ID NO：1]组成。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含以下或由以下组成：选自包含下述IB1的JNK结合结构域的组的至少一种(天然的)氨基酸序列：
[0065] L-IB1(s1)(NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：33)；
[0066] L-IB 1(s2)(NH2-TTLNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：34)；
[0067] L-IB1(s3)(NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：35)；
[0068] L-IB1(s4)(NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：36)；
[0069] L-IB1(s5)(NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：37)；
[0070] L-IB1(s6)(NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：38)；
[0071] L-IB1(s7)(NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：39)；
[0072] L-IB1(s8)(NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：40)；
[0073] L-IB1(s9)(NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：41)；
[0074] L-IB1(s10)(NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：42)；
[0075] L-IB1(s11)(NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：43)；
[0076] L-IB1(s12)(NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：44)；
[0077] L-IB1(s13)(NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：45)；
[0078] L-IB1(s14)(NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：46)；
[0079] L-IB1(s15)(NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：47)；
[0080] L-IB1(s16)(NH2-NLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：48)；
[0081] L-IB1(s17)(NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：49)；
[0082] L-IB1(s18)(NH2-TLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：50)；
[0083] L-IB1(s19)(NH2-TTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：51)；
[0084] L-IB1(s20)(NH2-PTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：52)；
[0085] L-IB1(s21)(NH2-RPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：53)；
[0086] L-IB1(s22)(NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：54)；
[0087] L-IB1(s23)(NH2-PKRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：55)；
[0088] L-IB1(s24)(NH2-RPKRPTTLNLF-COOH，SEQ ID NO：56)；
[0089] L-IB1(s25)(NH2-LFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：57)；
[0090] L-IB1(s26)(NH2-NLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：58)；
[0091] L-IB1(s27)(NH2-LNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：59)；
[0092] L-IB1(s28)(NH2-TLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：60)；
[0093] L-IB1(s29)(NH2-TTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：61)；
[0094] L-IB1(s30)(NH2-PTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：62)；
[0095] L-IB1(s31)(NH2-RPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：63)；
[0096] L-IB1(s32)(NH2-KRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：64)；
[0097] L-IB1(s33)(NH2-PKRPTTLNLF-COOH，SEQ ID NO：65)；和
[0098] L-IB1(s34)(NH2-RPKRPTTLNL-COOH，SEQ ID NO：66)。
[0099] 此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含以下或由以下组成：选自包含IB1的(长)JNK结合结构域(JBD)
[0100] PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(IB1-长)[SEQ ID NO：13]，IB2的(长)JNK结合结构域IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS(IB2-长)[SEQ ID NO：14]，c-Jun的JNK结合结构域
[0101] GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH(c-Jun)[SEQ ID NO：15]，ATF2的JNK结合结构域TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV(ATF2)[SEQ ID NO：16](参见例如图1A-1C)的组的至少一种(天然的)氨基酸序列。在本文中，比对揭示部分保守的8氨基酸序列(参见例如图1A)并且IB1和IB2的JBD的进一步比较揭示这两条序列之间高度保守的七个和三个氨基酸的两个区段。
[0102] 根据另一个优选的实施方案，如本文使用的JNK抑制剂序列可以部分或完全由如以上定义的D-氨基酸构成。更优选地，这些由D-氨基酸构成的JNK抑制剂序列是以上(天然的)JNK抑制剂序列的非天然的D逆反(retro-inverso)序列。术语″逆反序列″指线性肽序列的异构体，其中序列的方向是反转的并且每个氨基酸残基的手性是倒转的(参见例如Jameson等人，Nature，368，744-746(1994)；Brady等人，Nature，368，692-693(1994))。结合D-对映异构体和反向合成的优势是在各个酰胺键中羰基和氨基基团的位置互换，同时在每个α碳的侧链基团的位置是被保留的。除非另有具体陈述，认为任何如根据本发明使用的给定L-氨基酸序列或肽可以通过合成对于相应的天然的L-氨基酸序列或肽的反向序列或肽而转变为D逆反序列或肽。
[0103] 如本文使用的和如以上定义的D逆反序列具有多种有用的性质。例如，如本文使用的D逆反序列像如本文使用的L-氨基酸序列一样有效地进入细胞，然而如本文使用的D逆反序列比相应的L-氨基酸序列更稳定。
[0104] 因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含以下或由以下组成：至少一种根b a b据氨基酸序列NH2-Xn-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn-Xn-COOH(D-IB1通用)[SEQ ID NO：4]和/或XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX(D-IB(通用))[SEQ ID NO：20]的D逆反序列。如在本文a b b
中使用的，X，Xn和Xn是如以上定义的(优选，表示D氨基酸)，其中Xn优选表示源自SEQ ID NO：2或4的残基的连续的一段序列。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据包含IB1的JNK结合结构域(JBD)TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD(D-IB1)[SEQ ID NO：18]的氨基酸序列的至少一种D逆反序列或由根据包含IB1的JNK结合结构域(JBD)TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD(D-IB1)[SEQ ID NO：18]的氨基酸序列的至少一种D逆反序列组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据氨基酸序列NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH(D-IB1(s))[SEQ ID NO：2]的至少一种D逆反序列或由根据氨基酸序列NH
2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH(D-IB1(s))[SEQ ID NO：2]的至少一种D逆反序列组成。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含以下或由以下组成：根据包含IB1的JNK结合结构域(JBD)
中使用的，X，Xn和Xn是如以上定义的(优选，表示D氨基酸)，其中Xn优选表示源自SEQ ID NO：2或4的残基的连续的一段序列。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据包含IB1的JNK结合结构域(JBD)TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD(D-IB1)[SEQ ID NO：18]的氨基酸序列的至少一种D逆反序列或由根据包含IB1的JNK结合结构域(JBD)TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD(D-IB1)[SEQ ID NO：18]的氨基酸序列的至少一种D逆反序列组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据氨基酸序列NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH(D-IB1(s))[SEQ ID NO：2]的至少一种D逆反序列或由根据氨基酸序列NH
2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH(D-IB1(s))[SEQ ID NO：2]的至少一种D逆反序列组成。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含以下或由以下组成：根据包含IB1的JNK结合结构域(JBD)
[0105] D-IB1(s1)(NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：67)；
[0106] D-IB1(s2)(NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：68)；
[0107] D-IB1(s3)(NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：69)；
[0108] D-IB1(s4)(NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：70)；
[0109] D-IB1(s5)(NH2-SRPVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：71)；
[0110] D-IB1(s6)(NH2-QSRPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：72)；
[0111] D-IB1(s7)(NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：73)；
[0112] D-IB1(s8)(NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：74)；
[0113] D-IB1(s9)(NH2-QPFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：75)；
[0114] D-IB1(s10)(NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：76)；
[0115] D-IB1(s11)(NH2-PVQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：77)；
[0116] D-IB1(s12)(NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：78)；
[0117] D-IB1(s13)(NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：79)；
[0118] D-IB1(s14)(NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：80)；
[0119] D-IB1(s15)(NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：81)；
[0120] D-IB1(s16)(NH2-FLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：82)；
[0121] D-IB1(s17)(NH2-PFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：83)；
[0122] D-IB1(s18)(NH2-QPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：84)；
[0123] D-IB1(s19)(NH2-VQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：85)；
[0124] D-IB1(s20)(NH2-PVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：86)；
[0125] D-IB1(s21)(NH2-RPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：87)；
[0126] D-IB1(s22)(NH2-SRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：88)；
[0127] D-IB1(s23)(NH2-QSRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：89)；
[0128] D-IB1(s24)(NH2-DQSRPVQPFLN-COOH，SEQ ID NO：90)；
[0129] D-IB1(s25)(NH2-DQSRPVQPFL-COOH，SEQ ID NO：91)；
[0130] D-IB1(s26)(NH2-QSRPVQPFLN-COOH，SEQ ID NO：92)；
[0131] D-IB1(s27)(NH2-SRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：93)；
[0132] D-IB1(s28)(NH2-RPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：94)；
[0133] D-IB1(s29)(NH2-PVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：95)；
[0134] D-IB1(s30)(NH2-VQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：96)；
[0135] D-IB1(s31)(NH2-QPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：97)；
[0136] D-IB1(s32)(NH2-PFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：98)；
[0137] D-IB1(s33)(NH2-FLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：99)；和
[0138] D-IB1(s34)(NH2-LNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：100)的氨基酸序列的至少一种D逆反序列。
[0139] 如本文使用的和如以上公开的JNK抑制剂序列提供于表1中(SEQ ID NO：s1-4，13-20和33-100)。该表提供了如本文使用的JNK抑制剂序列的名称，以及其序列识别编号，其长度，和氨基酸序列。此外，表1显示序列以及其一般的结构式，例如分别对于SEQ ID NO’s：1，2，5，6，9和11以及SEQ ID NO’s：3，4，7，8，10和12。此外表1公开了嵌合序列SEQ ID NOs：9-12和23-32(见下文)，L-IB1序列SEQ ID NOs：33至66和D-IB1序列SEQ ID NOs：67至100。
[0140] 表1
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145] 根据另一个优选的实施方案，如本文使用的JNK抑制剂序列包含以上定义的根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的天然或非天然的氨基酸序列的至少一种变体，片段和/或衍生物或由以上定义的根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的天然或非天然的氨基酸序列的至少一种变体，片段和/或衍生物组成。优选地，这些变体，片段和/或衍生物保持上文公开的如本文使用的天然或非天然JNK抑制剂序列，尤其根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的天然或非天然氨基酸序列的生物活性，即结合JNK和/或抑制至少一种激活JNK的转录因子(例如c-Jun，ATF2或Elk1)的激活。功能性可以通过各种测试(例如肽对其靶分子的结合测试)，或通过生物物理方法(例如光谱学，计算机建模，结构分析等)进行测试。尤其，可以通过亲水性分析(参见例如Hopp和Woods，1981.Proc Natl Acad Sci USA 78：3824-3828)分析如上文定义的JNK抑制剂序列或其变体，片段和/或衍生物，所述亲水性分析可以用于鉴别肽的疏水和亲水区，因此，有助于以下：用于实验操作的底物设计，例如在结合实验中，或对于抗体合成。还可以进行二级结构分析以鉴别如本文使用的JNK抑制剂序列的区域或其变体，片段和/或衍生物的呈现特定结构基序的区域(参见例如Chou和Fasman，1974，Biochem 13：222-223)。可以使用本领域可用的计算机软件程序完成操作，翻译，二级结构预测，亲水性和疏水性图谱，开放阅读框预测和制图，和确定序列同源性。还可以使用其它结构分析方法，包括，例如X-射线晶体学(参见例如Engstrom，1974.Biochem Exp Biol 11：7-13)，质谱分析和气相色谱分析(参见例如METHODS IN PROTEIN SCIENCE，1997，J.Wiley和Sons，New York，NY)和计算机建模(参见例如Fletterick和Zoller，编辑，1986.计算机图形和分子建模(Computer Graphics and Molecular Modeling)：CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
[0146] 因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的至少一种变体或由根据SEQ ID NOs：1-4，
13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的至少一种变体组成。在本发明的上下文中，“根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体”优选为源自根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的序列中的任一个的序列，其中所述变体包含根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的氨基酸序列的氨基酸改变。此种改变典型地包含根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的氨基酸的1至20个，优选1至10个和更优选1至5个取代，添加和/或缺失，其中所述变体展现与根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的序列中的任一个至少约30％，50％，70％，80％，90％，95％，98％或甚至99％的序列同一性。
13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的至少一种变体组成。在本发明的上下文中，“根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体”优选为源自根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的序列中的任一个的序列，其中所述变体包含根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的氨基酸序列的氨基酸改变。此种改变典型地包含根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的氨基酸的1至20个，优选1至10个和更优选1至5个取代，添加和/或缺失，其中所述变体展现与根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的序列中的任一个至少约30％，50％，70％，80％，90％，95％，98％或甚至99％的序列同一性。
[0147] 如果如上文限定和本文使用的根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体通过特定氨基酸的取代获得，则此种取代优选包含保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代可以包括具有充分类似的物理化学性质的组中的同义氨基酸残基，以致该组成员之间的取代将保持分子的生物活性(参见例如Grantham，R.(1974)，Science 185，862-864)。对于熟练技术人员明显的是，氨基酸还可以插入上文定义的序列和/或从上文定义的序列中缺失而不改变其功能，尤其如果插入和/或缺失仅包括少数几个氨基酸，例如少于二十个，和优选少于十个，和不移除或取代对于功能活性关键的氨基酸。此外，取代应该在如本文使用的变体中被避免，所述取代导致在氨基酸位置的额外的苏氨酸，所述氨基酸位置是对磷酸化酶、优选激酶可接近的，以避免体内或体外灭活如本文使用的JNK-抑制剂序列或如本文使用的嵌合肽。
[0148] 优选地，被分类为相同的组和典型地通过保守的氨基酸取代可互换的同义氨基酸残基定义于表2中。
[0149] 表2
[0150] 同义氨基酸残基的优选组
[0151]
[0152] 如本文使用的SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的变体的特定形式是如本文使用的根据SEQ ID NOs：1，1-4，13-20和33-100”的(天然的或非天然的)氨基酸序列的片段，其典型地通过与SEQ ID NOs 1-4，13-20和33-100相比至少一个缺失而改变。优选地，片段包含SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100中任一个的至少4个连续的氨基酸，该长度典型地足以允许特异识别源自这些序列的任一个的表位。甚至更优选地，所述片段包含SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100中任一个的4至18个，4至15个，或最优选4至10个连续的氨基酸，其中范围的下限可以是4，或5，6，7，8，9，或10。氨基酸缺失可以发生在SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的任何位置，优选在N-或C-末端。
[0153] 此外，如上文描述的，根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的片段，可以限定为与如本文使用的根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的序列中任一个共享至少约30％，50％，70％，80％，90％，95％，98％，或甚至99％的序列同一性的序列。
[0154] 如本文使用的JNK抑制剂序列可以进一步包含如上文定义的根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的至少一种衍生物或由如上文定义的根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的至少一种衍生物组成。在本文中，“根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的衍生物”优选为源自根据SEQ ID NOs：1-4，13-20和33-100的序列中任一个的氨基酸序列，其中所述衍生物包含至少一个修饰的L-或D-氨基酸(形成非天然氨基酸(s))，优选1至20个，更优选1至10个，和甚至更优选1至5个修饰的L-或D-氨基酸。变体或片段的衍生物也落入本发明的范围内。
[0155] 在这方面“修饰的氨基酸”可以是任何例如通过在各种生物中的不同糖基化，通过磷酸化或通过标记特定氨基酸而改变的氨基酸。那么此种标记典型地选自包含以下标记的组：
[0156] (i)放射性标记，即放射性磷酸化或具有硫，氢，碳，氮等的放射性标记；
[0157] (ii)有色染料(例如地高辛等)；
[0158] (iii)荧光基团(例如荧光素等)；
[0159] (iv)化学发光基团；
[0160] (v)用于固定于固相上的基团(例如His-标签，生物素，strep-标签，flag-标签，抗体，抗原等)；和
[0161] (vi)(i)至(v)中提及的标记中的两种或更多种标记的组合。
[0162] 在上述背景下，具有与本发明的查询氨基酸序列“共享”至少，例如95％的“序列同一性”的序列的氨基酸序列，意在表示除了被研究(subject)氨基酸序列可以包括每100个查询氨基酸序列的氨基酸中多达五个氨基酸的改变之外，被研究氨基酸序列的序列与查询序列是相同的。换句话说，为了获得与查询氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，被研究序列中至多5％(100个中的5个)氨基酸残基可以用另一个氨基酸插入或替代或缺失。
[0163] 对于没有精确的对应关系的序列，第一序列的″％同一性″可以根据第二序列确定。一般而言，比对要比较的这两条序列以给出序列间的最大相关性。这可以包括在一条或两条序列中插入″缺口″以增强比对的程度。随后可以确定每个被比较序列的全长的％同一性(所谓的总体比对)(这尤其适于相同或相似长度的序列)，或确定较短的、限定长度的序列的％同一性(所谓的局部比对)(这更适于不等长的序列)。
[0164] 比较尤其如本文使用的两条或更多条序列的同一性和同源性的方法在本领域中公知。因此例如，在Wisconsin序列分析包，版本9.1中可用的程序(Devereux等人，1984，Nucleic Acids Res.12，387-395.)，例如程序BESTFIT和GAP，可以用于确定两条多核苷酸之间的％同一性和两条多肽序列之间的％同一性和％同源性。BESTFIT使用(Smith和Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147，195-197.)的″局部同源性″算法并且发现两条序列之间相似性最好的单个区域。用于确定序列间同一性和/或相似性的其它程序也在本领域中已知，例如BLAST程序家族(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)，通过万维网址ncbi.nlm.nih.gov NCBI的主页可访问)和FASTA(Pearson(1990)，Methods Enzymol.183，63-98；Pearson和 Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A85，
2444-2448.)。
2444-2448.)。
[0165] 可以通过本领域公知的方法，例如通过如下文讨论的化学合成或通过遗传工程方法，获得或生产如根据本发明使用和如上文定义的JNK-抑制剂序列。例如，可以通过使用肽合成仪合成与如本文使用的JNK抑制剂序列的一部分相对应的、包括所述JNK抑制剂序列的所需区域、或介导所需体外或体内活性的肽。
[0166] 可以通过允许如本文使用和如上文定义的JNK抑制剂序列有效转运入细胞的运输序列，进一步修饰如本文使用和如上文定义的JNK抑制剂序列。此种修饰的JNK抑制剂序列优选地被提供为和用作嵌合序列。
[0167] 根据第二个方面，本发明因此提供包括至少一个第一结构域和至少一个第二结构域的嵌合肽用于制备治疗受试者中如上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物的用途，其中所述嵌合肽的第一结构域包含运输序列，同时所述嵌合肽的第二结构域包含优选如上文定义的根据SEQ ID NO：1-4，13-20和33-100或其衍生物或片段的序列中任一个的JNK抑制剂序列。
[0168] 典型地，根据本发明使用的嵌合肽具有至少25个氨基酸残基，例如25至250个氨基酸残基，更优选25至200个氨基酸残基，甚至更优选25至150个氨基酸残基，25至100个和最优选氨基酸25至50个氨基酸残基的长度。
[0169] 作为第一结构域，如本文使用的嵌合肽优选包含运输序列，所述运输序列典型地选自指引肽(所述氨基酸序列存在于其中)至所需的细胞目的地的任何氨基酸序列。因此，如本文使用的所述运输序列，典型地指引所述肽穿过质膜，例如从细胞外，通过质膜，并进入细胞质。备选地，或此外，所述运输序列可以通过例如组合两种组分(例如用于细胞渗透性的组分和用于核定位的组分)或通过具有例如细胞膜转运和靶向的例如核内转运的性质的一个单一组分，指引所述肽至所需的细胞内位置，例如细胞核，核糖体，内质网(ER)，溶酶体，或过氧化物酶体。所述运输序列可以另外包含另一个组分，所述另一个组分能够结合细胞质组分或细胞的任何其它组分或细胞区室(例如内质网，线粒体，暗装置(gloom apparatus)，溶酶体囊泡)。因此，例如第一结构域的运输序列和第二结构域的JNK抑制剂序列可以被定位在细胞质或任何其它细胞区室中。这允许确定在摄取后嵌合肽在细胞中的定位。
[0170] 优选地，所述运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)具有5至150个氨基酸序列的长度，更优选5至100个氨基酸的长度和最优选地从5至50个，5至30个或甚至5至15个氨基酸的长度。
[0171] 更优选地，所述运输序列(包含如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可以作为第一结构域中连续的一段氨基酸序列存在。备选地，第一结构域中的所述运输序列可以被分为两个或更多个片段，其中所有这些片段组装为整个运输序列并且可以通过1至10个，优选1至5个氨基酸彼此分开，条件是运输序列照这样保留其如以上公开的载体性质。分开所述运输序列的片段的这些氨基酸可以例如选自与所述运输序列不同的氨基酸序列。备选地，所述第一结构域可以包含由多于一个组分构成的运输序列，每个组分具有其自身的功能用于转运第二结构域的货物JNK抑制剂序列至例如特定的细胞区室。
[0172] 如上文定义的运输序列可以由L-氨基酸，D-氨基酸，或二者的组合构成。优选地，所述运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可以包含至少1个或甚至2个，优选至少3，4或5个，更优选至少6，7，8或9个和甚至更优选至少10个或更多D-和/或L-氨基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸可以以区段方式，非区段方式或以交替的方式排列在所述JNK运输序列中。
[0173] 根据一个备选的实施方案，如本文使用的嵌合肽的运输序列可以仅由L-氨基酸构成。更优选地，如本文使用的嵌合肽的运输序列包含至少一个如上文定义的“天然的”运输序列或由至少一个如上文定义的“天然的”运输序列组成。在本文中，术语“天然的”指完全由L-氨基酸构成的未改变的运输序列。
[0174] 根据另一个备选的实施方案，如本文使用的嵌合肽的运输序列可以仅由D-氨基酸构成。更优选地，如本文使用的嵌合肽的运输序列可以包含如上文提供的序列的D逆反肽。
[0175] 可以从天然存在的来源获得或可以通过使用遗传工程技术或化学合成(参见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：A laboratory manual.第二版.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)生产如本文使用的的嵌合肽的第一结构域的运输序列。
[0176] 可以使用的第一结构域的运输序列的来源包括，例如天然的蛋白，比如例如TAT蛋白(例如在美国专利5,804,604和5,674,980中描述的，这些参考文献中的每个在本文通过引用并入)，VP22(在例如WO 97/05265；Elliott和O′Hare，Cell 88：
223-233(1997)中描述的)，非病毒蛋白(Jackson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
10691-10695(1992))，源自触角足的(例如触角足载体序列)或源自碱性肽的运输序列，例如具有5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸长度和包含至少80％，更优选85％或甚至90％碱性氨基酸(比如例如精氨酸，赖氨酸和/或组氨酸)的肽。此外，在此一并公开用作运输序列的天然蛋白之一的变体，片段和衍生物。至于变体，片段和衍生物，其指的是上文对于如本文使用的JNK抑制剂序列给出的定义。变体，片段以及衍生物相应地定义为以上对于如本文使用的JNK抑制剂序列所阐述的。尤其，在运输序列的上下文中，变体或片段或衍生物可以被定义为与如上文定义的用作运输序列的天然蛋白共享至少约30％，50％，
70％，80％，90％，95％，98％，或甚至99％序列同一性的序列。
223-233(1997)中描述的)，非病毒蛋白(Jackson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
10691-10695(1992))，源自触角足的(例如触角足载体序列)或源自碱性肽的运输序列，例如具有5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸长度和包含至少80％，更优选85％或甚至90％碱性氨基酸(比如例如精氨酸，赖氨酸和/或组氨酸)的肽。此外，在此一并公开用作运输序列的天然蛋白之一的变体，片段和衍生物。至于变体，片段和衍生物，其指的是上文对于如本文使用的JNK抑制剂序列给出的定义。变体，片段以及衍生物相应地定义为以上对于如本文使用的JNK抑制剂序列所阐述的。尤其，在运输序列的上下文中，变体或片段或衍生物可以被定义为与如上文定义的用作运输序列的天然蛋白共享至少约30％，50％，
70％，80％，90％，95％，98％，或甚至99％序列同一性的序列。
[0177] 在如本文使用的嵌合肽的一个优选的实施方案中，第一结构域的运输序列包含源自人免疫缺陷病毒(HIV)1 TAT蛋白、尤其组成TAT蛋白的86个氨基酸的一些或全部的序列或由源自人免疫缺陷病毒(HIV)1 TAT蛋白、尤其组成TAT蛋白的86个氨基酸的一些或全部的序列组成。
[0178] 对于运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)，全长TAT蛋白的部分序列可以用于形成TAT蛋白的功能性有效片段，即包括介导进入和摄取入细胞的区域的TAT肽。关于此种序列是否是TAT蛋白的功能有效片段，可以使用已知技术确定(参见例如Franked等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：7397-7401(1989))。因此，如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列可以源自包含少于86个氨基酸和呈现摄取入细胞和任选地摄取入细胞核的TAT蛋白序列的功能性有效片段或部分。更优选地，要用作载体以介导嵌合肽渗透通过细胞膜的TAT的部分序列(片段)，意在包含全长TAT的碱性(basic)区域(氨基酸48至57或49至57)。
[0179] 根据更优选的实施方案，所述运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可以包含以下或由以下组成：包含TAT残基48至57或49至57的氨基酸序列，和b b最优选地通用TAT序列NH2-Xn-RKKRRQRRR-Xn-COOH(L-通用-TAT(s))[SEQ ID NO：7]和/b
或XXXXRKKRRQ RRRXXXX(L-通用-TAT)[SEQ ID NO：21]的氨基酸序列，其中X或Xn为如b
上文定义的。此外，SEQ ID NOs：8中“Xn”残基的数量不限于描述的那个，并且可以如上文描述改变。备选地，包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域的运输序列可以包含含有例如氨基酸序列NH2-GRKKRRQRRR-COOH(L-TAT)[SEQ ID NO：5]的肽或由含有例如氨基酸序列NH2-GRKKRRQRRR-COOH(L-TAT)[SEQ ID NO：5]的肽组成。
或XXXXRKKRRQ RRRXXXX(L-通用-TAT)[SEQ ID NO：21]的氨基酸序列，其中X或Xn为如b
上文定义的。此外，SEQ ID NOs：8中“Xn”残基的数量不限于描述的那个，并且可以如上文描述改变。备选地，包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域的运输序列可以包含含有例如氨基酸序列NH2-GRKKRRQRRR-COOH(L-TAT)[SEQ ID NO：5]的肽或由含有例如氨基酸序列NH2-GRKKRRQRRR-COOH(L-TAT)[SEQ ID NO：5]的肽组成。
[0180] 根据另一个更优选的实施方案，所述运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可以包含如上文提供的序列的D逆反肽，即具有
b b
序 列 NH2-Xn-RRRQRRKKR-Xn-COOH(D- 通 用 -TAT(s))[SEQ ID NO：8] 和 / 或
XXXXRRRQRRKKRXXXX(D-通用-TAT)[SEQ ID NO：22]的通用TAT序列的D逆反序列。此外，b b
这里，Xn为如上文定义的(优选表示D氨基酸)。此外，SEQ ID NOs：8中“Xn”残基的数量不限于描述的那个，并且可以如上文描述改变。最优选地，如本文使用的运输序列可以包含D逆反序列NH2-RRRQRRKKRG-COOH(D-TAT)[SEQ ID NO：6]。
b b
序 列 NH2-Xn-RRRQRRKKR-Xn-COOH(D- 通 用 -TAT(s))[SEQ ID NO：8] 和 / 或
XXXXRRRQRRKKRXXXX(D-通用-TAT)[SEQ ID NO：22]的通用TAT序列的D逆反序列。此外，b b
这里，Xn为如上文定义的(优选表示D氨基酸)。此外，SEQ ID NOs：8中“Xn”残基的数量不限于描述的那个，并且可以如上文描述改变。最优选地，如本文使用的运输序列可以包含D逆反序列NH2-RRRQRRKKRG-COOH(D-TAT)[SEQ ID NO：6]。
[0181] 根据另一个实施方案，包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列可以包含如上文定义的运输序列的变体或由如上文定义的运输序列的变体组成。“运输序列的变体”优选为源自如上文定义的运输序列的序列，其中所述变体包含修饰，例如，存在于如上文定义的运输序列中的至少一个氨基酸的添加，(内部的)缺失(导致片段)和/或取代。此种修饰典型地包含1至20个，优选1至10个和更优选1至5个氨基酸的取代，添加和/或缺失。此外，所述变体优选地与如上文定义的运输序列，更优选与SEQ ID NOs：5至8或21至22的任一个展现至少约30％，50％，70％，80％，90％，95％，98％或甚至99％的序列同一性。
[0182] 优选地，包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列的此种修饰导致运输序列具有增加或减少的稳定性。备选地，运输序列的变体可以被设计成调节如本文使用的嵌合肽的细胞内定位。当外部加入时，如上文定义的此种变体典型地设计为这样：所述运输序列进入细胞的能力被保留(即摄取运输序列的变体进入细胞基本上与使用天然蛋白的运输序列的摄取类似)。例如，改变认为对核定位重要的碱性区域(参见例如Dang和Lee，J.Biol.Chem.264：18019-18023(1989)；Hauber等人，J.Virol.63：1181-1187(1989)；等人，J.Virol.63：1-8(1989))可以导致所述运输序列细胞质定位或部分细胞质定位，并且因此，导致如本文使用的作为所述嵌合肽组分的JNK抑制剂序列的细胞质定位或部分细胞质定位。除以上之外，可以例如通过将例如胆固醇或其它脂部分连接于所述运输序列将进一步的修饰引入变体，以产生具有增加的膜可溶性的运输序列。可以使用熟练技术人员典型已知的技术生产包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列的上文公开的任何变体(参见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：A laboratory manual.第二版.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
[0183] 作为第二结构域，如本文使用的嵌合肽典型地包含JNK抑制剂序列，所述JNK抑制剂序列选自如上文定义的任何JNK抑制剂序列，包括这些JNK抑制剂序列的变体，片段和/或衍生物。
[0184] 可以连接如本文使用的嵌合肽的两个结构域，即所述第一和所述第二结构域，比如以形成功能单位。可以应用如通常在本领域中已知的连接第一和第二结构域的任何方法。
[0185] 根据一个实施方案，优选通过共价键连接如本文使用的嵌合肽的所述第一和所述第二结构域。如本文定义的共价键可以是例如肽键，所述肽键可以通过表达如上文定义的嵌合肽为融合蛋白而获得。可以以如下文描述的类似于标准重组DNA技术的方式或容易从标准重组DNA技术改编的方式形成和使用如本文描述的融合蛋白。然而，还可以通过侧链连接两个结构域或可以通过化学接头部分连接两个结构域。
[0186] 如本文使用的嵌合肽的所述第一和/或第二结构域在所述嵌合肽中可以以一个或更多拷贝存在。如果两个结构域都以单个拷贝存在，则所述第一结构域可以连接于第二结构域的N-末端或C-末端之一。如果以多个拷贝存在，则所述第一和第二结构域可以以任何可能的顺序排列。例如所述第一结构域可以以多个拷贝数，例如优选以连续顺序排列的两个、三个或更多拷贝存在于如本文使用的嵌合肽中。那么，所述第二结构域可以以存在于包含第一结构域的序列的N-或C-末端的单个拷贝存在。备选地，所述第二结构域可以以多个拷贝数，例如以两个，三个或更多拷贝存在，并且所述第一结构域可以以单个拷贝存在。根据两个备选方案，第一和第二结构域可以在连续排列中的任何位置存在。典型的排列显示如下：例如，第一结构域-第一结构域-第一结构域-第二结构域；第一结构域-第一结构域-第二结构域-第一结构域；第一结构域-第二结构域-第一结构域-第一结构域；或例如第二结构域-第一结构域-第一结构域-第一结构域。对于熟练技术人员，很好理解这些实例仅用于说明的目的并且不应限制本发明的范围。因此，拷贝数和排列可以如最初定义改变。
[0187] 优选地，所述第一和第二结构域可以没有任何接头直接彼此连接。备选地，它们可以通过包含1至10个，优选1至5个氨基酸的接头序列彼此连接。形成接头序列的氨基酸优选地选自作为氨基酸残基的甘氨酸或脯氨酸。更优选地，所述第一和第二结构域可以通过所述第一和第二结构域之间两个，三个或更多个脯氨酸残基的铰链彼此分开。
[0188] 包含至少一个第一和至少一个第二结构域的如上文定义的和如本文使用的嵌合肽，可以由L-氨基酸，D-氨基酸，或二者的组合构成。其中，每个结构域(以及使用的接头)可以由L-氨基酸，D-氨基酸，或二者的组合构成(例如D-TAT和L-IB1(s)或L-TAT和D-IB1(s)，等)。优选地，如本文使用的嵌合肽可以包含至少1个或甚至2个，优选至少3，4或5个，更优选至少6，7，8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸可以在如本文使用的嵌合肽中以区段方式、非区段方式或以交替的方式排列。
[0189] 根据一个特定的实施方案，如本文使用的嵌合肽包含根据通用L-TAT-IB肽NH2-Xnb b a b-RKKRRQRRR-Xn-Xn-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn-COOH(L-TAT-IB(通用)(s))[SEQ ID NO：10]的L-氨基酸嵌合肽或由根据通用L-TAT-IB肽NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xa b a b
n-Xn-COOH(L-TAT-IB(通用))[SEQ ID NO：10]的L-氨基酸嵌合肽组成，其中X，Xn和Xn优选为如上文定义的。更优选地，如本文使用的嵌合肽包含L-氨基酸嵌合肽
n-Xn-COOH(L-TAT-IB(通用))[SEQ ID NO：10]的L-氨基酸嵌合肽组成，其中X，Xn和Xn优选为如上文定义的。更优选地，如本文使用的嵌合肽包含L-氨基酸嵌合肽
[0190] NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-TAT-IB1(s))[SEQ ID NO：9]或由L-氨基酸嵌合肽
[0191] NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-TAT-IB1(s))[SEQ ID NO：9]组成。备选地或此外，如本文使用的嵌合肽包含L-氨基酸嵌合肽序列GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT(L-TAT-IB1)[SEQ ID NO：23]，或XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX(L-TAT-IB通用)[SEQ ID NO：24]或由L-氨基酸嵌合肽序列GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT(L-TAT-IB1)[SEQ ID NO：23]，或XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX(L-TAT-IB通用)[SEQ ID NO：24]组成，其中X也优选为如上文定义的，或如本文使用的嵌合肽包含L-氨基酸嵌合肽序列
[0192] RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s1))[SEQ ID NO：27]，GRKKRRQRRc cRXnRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO：28]，或RKKRRQRRRXnRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：29]或由L-氨基酸嵌合肽序列
[0193] RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s1))[SEQ ID NO：27]，GRKKRRQRRc cRXnRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO：28]，或RKKRRQRRRXnRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：29]组成。在本文中，每个X典型地表示如上文定义c
的氨基酸残基，更优选地，Xn表示连续的一段肽残基序列，每个X彼此独立地选自甘氨酸或c
脯氨酸，例如一段单调的(monotonic)甘氨酸序列或一段单调的脯氨酸序列，其中n(Xn的c
重复数量)典型地为0-5，5-10，10-15，15-20，20-30或甚至更多，优选0-5或5-10。Xn可以表示D或L氨基酸之一。
的氨基酸残基，更优选地，Xn表示连续的一段肽残基序列，每个X彼此独立地选自甘氨酸或c
脯氨酸，例如一段单调的(monotonic)甘氨酸序列或一段单调的脯氨酸序列，其中n(Xn的c
重复数量)典型地为0-5，5-10，10-15，15-20，20-30或甚至更多，优选0-5或5-10。Xn可以表示D或L氨基酸之一。
[0194] 根据一个备选的特定实施方案，如本文使用的嵌合肽包含上文公开的L-氨基酸嵌合肽的D-氨基酸嵌合肽或由上文公开的L-氨基酸嵌合肽的D-氨基酸嵌合肽组成。根b a b据本发明典型的D逆反嵌合肽为例如通用D-TAT-IB肽NH2-Xn-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn-Xn-b a b
RRRQRRKKR-Xn-COOH(D-TAT-IB(通用)(s))[SEQ ID NO：12]。在此，X，Xn和Xn优选为如上文定义的(优选表示D氨基酸)。更优选地，如本文使用的嵌合肽包含根据TAT-IB1肽[0195] NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH(D-TAT-IB1(s))[SEQ ID NO：11]的D-氨基酸嵌合肽或由根据TAT-IB1肽
RRRQRRKKR-Xn-COOH(D-TAT-IB(通用)(s))[SEQ ID NO：12]。在此，X，Xn和Xn优选为如上文定义的(优选表示D氨基酸)。更优选地，如本文使用的嵌合肽包含根据TAT-IB1肽[0195] NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH(D-TAT-IB1(s))[SEQ ID NO：11]的D-氨基酸嵌合肽或由根据TAT-IB1肽
[0196] NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH(D-TAT-IB1(s))[SEQ ID NO：11]的D-氨基酸嵌合肽组成。备选地或此外，如本文使用的嵌合肽包含D-氨基酸嵌合肽序列[0197] TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG(D-TAT-IB1)[SEQ ID NO：25]，或[0198] XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX(D-TAT-IB通用)[SEQ ID NO：26]或由D-氨基酸嵌合肽序列
[0199] TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG(D-TAT-IB1)[SEQ ID NO：25]，或[0200] XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX(D-TAT-IB通用)[SEQ ID NO：26]组成，其中X也优选为如上文定义的，或如本文使用的嵌合肽包含D-氨基酸嵌合肽序列[0201] DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR(D-TAT-IB1(s1))[SEQ ID NO：30]，DQSRPVQPFc c
LNLTTPRKPRXnRRRQRRKKRG(D-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO：31]，或DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXnRRRQRRKKR(D-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：32]或由D-氨基酸嵌合肽序列
LNLTTPRKPRXnRRRQRRKKRG(D-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO：31]，或DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXnRRRQRRKKR(D-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：32]或由D-氨基酸嵌合肽序列
[0202] DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR(D-TAT-IB1(s1))[SEQ ID NO：30]，DQSRPVQPFc cLNLTTPRKPRXnRRRQRRKKRG(D-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO：31]，或DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXnRc
RRQRRKKR(D-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：32]组成。Xn可以是如上文定义的。
RRQRRKKR(D-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：32]组成。Xn可以是如上文定义的。
[0203] 如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域可以通过以本领域中已知的任何合适方式进行的化学或生物化学偶联而彼此连接，例如通过在所述第一和所述第二结构域之间建立肽键(例如通过将所述第一和第二结构域表达为融合蛋白)或例如通过交联如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域。
[0204] 适于化学交联如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域的很多已知方法是非特异的，即它们不将偶联点引导至转运多肽或货物大分子上的任何特定位点。作为结果，使用非特异交联剂可以攻击功能位点或空间上阻断活性位点，造成偶联的蛋白在生物学上失活。因此，优选使用此种允许所述第一和第二结构域更特异地偶联的交联方法。
[0205] 在本文中，增加偶联特异性的一个途径是直接化学偶联于在要被偶联的所述第一和第二结构域的一个或二者中存在仅一次或几次的官能团。例如，作为仅有的包含巯基基团的蛋白氨基酸半胱氨酸，其在很多蛋白中仅出现几次。此外，例如，如果多肽不包含赖氨酸残基，则特异于伯胺的交联试剂将对那个多肽的氨基末端有选择性。成功应用该方法以增加偶联特异性需要多肽在分子的可以改变而不丧失分子的生物活性的区域中具有合适的稀有和反应性的残基。当它们存在于多肽序列的多个部分中，它们参与交联反应将以其他方式可能干扰生物活性时，半胱氨酸残基可以被替代。当半胱氨酸残基被替代时，典型地需要最小化导致的多肽折叠中的改变。当替代是在化学上和空间上类似于半胱氨酸时，多肽折叠中的改变是最小化的。由于这些原因，丝氨酸优选为半胱氨酸的替代物。如在以下实施例中证明的，为了交联的目的，半胱氨酸残基可以被引入多肽的氨基酸序列。当引入半胱氨酸残基时，在氨基或羧基端处或接近氨基或羧基端处引入是优选的。对于此种氨基酸序列修饰，常规方法是可用的，其中通过化学合成或通过表达重组DNA生产感兴趣的多肽。
[0206] 偶联如上文定义和本文使用的嵌合肽的所述第一和第二结构域还可以通过偶联剂或缀合剂完成。存在一些可以使用的分子间交联试剂(参见例如，Means和Feeney，CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS，Holden-Day，1974，pp.39-43)。在这些试剂中有例如，N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)或N，N′-(1，3-亚苯基)二马来酰亚胺(这二者对巯基基团都是高度特异的并且形成不可逆连接)；N，N′-亚甲基-双-(碘乙酰胺)或其它具有6至11个碳亚甲基桥的此种试剂(其对巯基基团是相对特异的)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可逆连接)。其它用于此目的的交联试剂包括：与氨基和酚基团形成不可逆交联的p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯砜)；
己二亚胺二甲酯(其对氨基基团特异)；苯酚-1，4二磺酰氯(其主要与氨基基团反应)；
六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或苯偶氮基-p-二异氰酸酯(其主要与氨基基团反应)；戊二醛(其与一些不同的侧链反应)和去重氮联苯胺(disdiazobenzidine)(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)。
己二亚胺二甲酯(其对氨基基团特异)；苯酚-1，4二磺酰氯(其主要与氨基基团反应)；
六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或苯偶氮基-p-二异氰酸酯(其主要与氨基基团反应)；戊二醛(其与一些不同的侧链反应)和去重氮联苯胺(disdiazobenzidine)(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)。
[0207] 用于交联如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域的交联试剂可以是同型双官能的，即具有经历同样反应的两个官能团。优选的同型双官能的交联试剂是二马来酰亚胺己烷(″BMH″)。BMH包含两个马来酰亚胺官能团，其与包含巯基的化合物特异性地在温和条件下(pH 6.5-7.7)反应。所述两个马来酰亚胺基团通过烃链连接。因此，BMH用于包含半胱氨酸残基的多肽的不可逆交联。
[0208] 用于交联如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域的交联试剂还可以是异型双官能的。异型双官能的交联剂具有两个不同的官能团，例如胺-反应基团和巯基-反应基团，它们将交联两个分别具有游离胺和巯基的蛋白。异型双官能交联剂的实例是琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(″SMCC″)，m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(″MBS″)，和琥珀酰亚胺4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(″SMPB″)(MBS的延伸链类似物)。这些交联剂的琥珀酰亚胺基团与伯胺反应，并且巯基-反应性马来酰亚胺与半胱氨酸残基的巯基形成共价键。
[0209] 适于交联如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域的交联试剂经常具有低的水溶性。亲水部分，比如磺酸基团，可以因此被添加入交联试剂以改善其水溶性。在这方面，Sulfo-MBS和Sulfo-SMCC是根据本发明可以使用的关于水溶性修饰的交联试剂的实例。
[0210] 同样地，很多交联试剂获得基本上在细胞条件下不能裂解的缀合物。然而，尤其适于交联如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域的一些交联试剂包含共价键，比如二硫键，其在细胞条件下是可裂解的。例如，Traut′s试剂，二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(″DSP″)，和N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(″SPDP″)是公知的可裂解交联剂。使用可裂解交联试剂允许货物部分在递送到靶细胞之后从转运多肽上分离。也可以使用直接的二硫键连接。
[0211] 很多交联试剂，包括以上讨论的那些，是可市购的。从商业供应商处容易获取其使用的详细说明。蛋白交联和缀合物制备方面的通用参考文献是：Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC出版社(1991)。
[0212] 如上文定义的嵌合肽的所述第一和第二结构域的化学交联可以包括使用间隔臂(spacer arms)。间隔臂提供分子内柔性或调节缀合物部分之间分子间距离并且借此可以帮助保持生物活性。间隔臂可以是包括间隔氨基酸(例如脯氨酸)的多肽部分的形式。备选地，间隔臂可以是交联试剂的一部分，比如在″长链SPDP″中(Pierce Chem.Co.，Rockford，IL.，目录No.21651H)。
[0213] 此外，在本文可以使用上文公开的嵌合肽之一的变体，片段或衍生物。至于片段和变体，其通常指上文对于JNK抑制剂序列给出的定义。
[0214] 尤其，本发明的情况下，“嵌合肽的变体”优选为源自根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列中任一个的序列，其中所述嵌合变体包含如本文使用的根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的嵌合肽的氨基酸改变。此种改变典型地包含1至20个，优选地1至10个和更优选1至5个根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的氨基酸的取代，添加和/或缺失(导致片段)，其中如本文使用的改变的嵌合肽呈现与根据SEQ ID NOs：9至12和23至
32的序列中任一个至少约30％，50％，70％，80％，或95％，98％，或甚至99％的序列同一性。优选地，这些变体保留如包含在如本文使用的嵌合肽中的第一和第二结构域的生物活性，即如以上公开的第一结构域的运输活性和用于结合JNK和/或抑制至少一种激活JNK的转录因子的激活的第二结构域的活性。
32的序列中任一个至少约30％，50％，70％，80％，或95％，98％，或甚至99％的序列同一性。优选地，这些变体保留如包含在如本文使用的嵌合肽中的第一和第二结构域的生物活性，即如以上公开的第一结构域的运输活性和用于结合JNK和/或抑制至少一种激活JNK的转录因子的激活的第二结构域的活性。
[0215] 因此，如本文使用的嵌合肽还包含在前公开的嵌合肽的、尤其根据SEQ ID NOs：9至12和23至32中任一个的嵌合肽序列的片段。因此，在本发明的情况下，“嵌合肽的片段”优选为源自根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列中任一个的序列，其中所述片段包含SEQ ID NOs：9至12和23至32中任一个的至少4个连续的氨基酸。该片段优选包含的长度足以允许特异识别源自这些序列中任一个的表位并足以将所述序列转运入细胞、核或另外的优选的位置。甚至更优选地，所述片段包含SEQ ID NOs：9至12和23至32中任一个的4至18个，4至15个，或最优选地4至10个连续的氨基酸。如本文使用的嵌合肽的片段进一步可以定义为与根据SEQ ID NOs：99至12和23至32中任一个的序列的任一个共享至少约30％，50％，70％，80％，或95％，98％，或甚至99％的序列同一性的序列。
[0216] 最后，如本文使用的嵌合肽还包含在前公开的嵌合肽的、尤其根据SEQ ID NOs：9至12和23至32中任一个的嵌合肽序列的衍生物。
[0217] 本发明此外涉及编码如上文定义的JNK抑制剂序列、全部如上文定义的嵌合肽或其片段、变体或衍生物的核酸序列用于制备治疗受试者中如上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物的用途。优选的合适的编码如本文使用的JNK抑制剂序列的核酸典型地选自人IB1核酸(GenBank登录号(AF074091)，大鼠IB1核酸(GenBank登录号AF 108959)，或人IB2(GenBank登录号AF218778)或选自编码如上文定义的序列，即根据SEQ ID NO：1-26的任何序列中任一个的任何核酸序列。
[0218] 编码如本文使用的JNK抑制剂序列或如本文使用的嵌合肽的核酸可以通过本领域中已知的任何方法获得(例如通过使用可杂交于序列的3′-和5′-端的合成的引物来PCR扩增和/或通过使用对给定基因序列特异的寡核苷酸序列从cDNA或基因组文库克隆)。
[0219] 此外，也在本文中公开在严格条件下与编码如上文定义的(天然的)JNK抑制剂序列或嵌合肽的合适链杂交的核酸序列。优选地，此种核酸序列包含至少6个(连续的)核酸，其具有足以允许特异杂交的长度。更优选地，此种核酸序列包含6至38个，甚至更优选6至30个，和最优选地6至20个或6至10个(连续的)核酸。
[0220] “严格条件”是序列依赖性的并且在不同环境下将不同。通常，严格条件可以选择以在限定的离子强度和pH下低于对于特定序列的热解链点(TM)约5℃。所述TM是(在限定的离子强度和pH下)靶序列的50％杂交于完全匹配的探针的温度。典型地，严格条件将是在pH 7、盐浓度至少为约0.02摩尔和温度至少为约60℃的那些条件。因为其它因素可以影响杂交的严格度(其中包括互补链的碱基组成和尺寸)，有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所以参数的组合比任一个的绝对测量值更重要。
[0221] “高严格度条件”可以包含以下，例如步骤1：包含DNA的滤器在由6*SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA，和500μg/ml变性的鲑精DNA构成的缓冲液中在65℃过夜预处理8小时。步骤2：滤器在以上加入100mg/6 32
ml变性的鲑精DNA和5-20*10cpm的 P-标记的探针的预杂交混合物中在65℃杂交48小时。步骤3：滤器在包含2*SSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll，和0.01％BSA的溶液中在37℃洗涤1小时。这之后在0.1*SSC中在50℃洗涤45分钟。步骤4：放射自显影滤器。其它可以使用的高严格度的条件是本领域中公知的(参见例如Ausubel等人，(编辑)，1993，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，NY；和Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual)，Stockton Press，NY)。
ml变性的鲑精DNA和5-20*10cpm的 P-标记的探针的预杂交混合物中在65℃杂交48小时。步骤3：滤器在包含2*SSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll，和0.01％BSA的溶液中在37℃洗涤1小时。这之后在0.1*SSC中在50℃洗涤45分钟。步骤4：放射自显影滤器。其它可以使用的高严格度的条件是本领域中公知的(参见例如Ausubel等人，(编辑)，1993，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，NY；和Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual)，Stockton Press，NY)。
[0222] “中等严格度条件”可以包括以下：步骤1：包含DNA的滤器在55℃、在包含6*SSC，5*Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100mg/ml变性鲑精DNA的溶液中预处理6小时。步骤
6 32
2：滤器在加入5-20*10cpm P-标记的探针的相同的溶液中在55℃杂交18-20小时。步骤
3：在包含2*SSC，0.1％SDS的溶液中在37℃洗涤滤器1小时，然后在包含1*SSC和0.1％SDS的溶液中在60℃洗涤两次30分钟。步骤4：吸干滤器并曝光放射自显影。其它可以使用的中等严格度的条件是本领域中公知的(参见例如Ausubel等人，(编辑)，1993，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，NY；和Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual)，Stockton Press，NY)。
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2：滤器在加入5-20*10cpm P-标记的探针的相同的溶液中在55℃杂交18-20小时。步骤
3：在包含2*SSC，0.1％SDS的溶液中在37℃洗涤滤器1小时，然后在包含1*SSC和0.1％SDS的溶液中在60℃洗涤两次30分钟。步骤4：吸干滤器并曝光放射自显影。其它可以使用的中等严格度的条件是本领域中公知的(参见例如Ausubel等人，(编辑)，1993，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，NY；和Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual)，Stockton Press，NY)。
[0223] 最后，“低严格度条件”可以包括：步骤1：包含DNA的滤器在包含35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml变性鲑精DNA的溶液中在40℃预处理6小时。步骤2：滤器在加入0.02％PVP，
0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑精DNA，10％(wt/vol)右旋糖酐硫酸盐，和5-20x
6 32
10cpm P-标记的探针的相同溶液中在40℃杂交18-20小时。步骤3：滤器在包含2X SSC，
25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA，和0.1％SDS的溶液中在55C洗涤1.5小时。用新鲜溶液替代洗涤溶液并在60℃孵育额外的1.5小时。步骤4：吸干滤器并曝光放射自显影。
如果需要，在65-68℃第三次洗涤滤器并重曝光于胶片。其它可以使用的低严格度的条件是本领域中公知的(例如如用于跨物种杂交的)。参见例如Ausubel等人，(编辑)，1993，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，NY；和Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual)，Stockton Press，NY。
0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑精DNA，10％(wt/vol)右旋糖酐硫酸盐，和5-20x
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10cpm P-标记的探针的相同溶液中在40℃杂交18-20小时。步骤3：滤器在包含2X SSC，
25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA，和0.1％SDS的溶液中在55C洗涤1.5小时。用新鲜溶液替代洗涤溶液并在60℃孵育额外的1.5小时。步骤4：吸干滤器并曝光放射自显影。
如果需要，在65-68℃第三次洗涤滤器并重曝光于胶片。其它可以使用的低严格度的条件是本领域中公知的(例如如用于跨物种杂交的)。参见例如Ausubel等人，(编辑)，1993，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，NY；和Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual)，Stockton Press，NY。
[0224] 根据本发明如上文定义的核酸序列可以用于表达肽，即如本文使用的JNK抑制剂序列或如本文使用的嵌合肽，用于分析，表征或治疗用途；作为其中相关肽(如本文使用的)优先表达(组成型的或在组织分化或发育的特定阶段或在疾病状态中)的组织的标志物。这些核酸的其它用途包括，例如核酸在基于凝胶电泳的分析中的分子量标记。
[0225] 根据本发明的一个进一步实施方案，表达载体可以用于以上重组表达一个或多个如上文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的目的。在本文使用的术语“表达载体”表示双链或单链的环形或线性DNA或RNA。其进一步包含至少一种如上文定义的要转入宿主细胞或转入单细胞或多细胞宿主生物体的核酸。如本文使用的表达载体优选包含编码如本文使用的JNK抑制剂序列或其片段或变体，或如本文使用的嵌合肽，或其片段或变体的如上文定义的核酸。此外，根据本发明的表达载体优选包含支持表达的合适的元件，所述元件包括各种调控元件，比如源自病毒，细菌，植物，哺乳动物及其它真核生物来源的驱动插入的多核苷酸在宿主细胞中的表达的增强子/启动子，比如绝缘子，边界元件，LCRs(例如由Blackwood和Kadonaga(1998)，Science 281，61-63描述的)或基质/支架附着区(例如由Li，Harju和Peterson，(1999)，Trends Genet.15，403-408描述的)。在一些实施方案中，所述调控元件是异源的(即不是天然的基因启动子)。备选地，必要的转录和翻译信号也可以由基因的天然启动子和/或其侧翼区提供。
[0226] 如本文使用的术语“启动子”指这样的DNA区域，所述DNA区域行使功能以控制一个或更多个如上文定义的核酸序列的转录，并且结构上通过相互作用以调节启动子功能的对于DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点及其它DNA序列的存在来鉴别。启动子的功能表达启动片段是保留作为启动子的活性的缩短的或截短的启动子序列。启动子活性可以通过本领域中已知的任何测定法测量(参见例如Wood，de Wet，Dewji，和DeLuca，(1984)，Biochem Biophys.Res.Commun.124，592-596；Seliger和McElroy，(1960)，Arch.Biochem.Biophys.88，136-141)或从 商购)。
[0227] 将用于如本文定义的表达载体的″增强子区域″，典型地指行使功能以增加一个或更多基因的转录的DNA区域。更具体地，如本文使用的术语“增强子”，是这样的DNA调控元件，其不论要表达的基因的定位和方位，增强，扩大，改善或改良基因的表达，并且可以增强，扩大，改善或改良多于一个启动子的表达。
[0228] 要用于如本文定义的表达载体的启动子/增强子序列，可以使用植物，动物，昆虫，或真菌调控序列。例如，可以使用源自酵母及其它真菌的启动子/增强子元件(例如GAL4启动子，醇脱氢酶启动子，磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子)。备选地，或此外，它们可以包括动物转录控制区，例如(i)在胰β细胞内有活性的胰岛素基因控制区(参见例如Hanahan，等人，1985.Nature 315：115-122)；(ii)在淋巴样细胞内有活性的免疫球蛋白控制区(参见例如Grosschedl，等人，1984，Cell 38：647-658)；(iii)在肝中有活性的白蛋白基因控制区(参见例如Pinckert，等人，1987.Genes和Dev 1：268-276；(iv)在脑少突胶质细胞内有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(参见例如Readhead，等人，1987，Cell 48：703-712)；和(v)在下丘脑内有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(参见例如Mason，等人，1986，Science 234：1372-1378)，等。
[0229] 此外，如本文定义的表达载体可以包含扩增标志物。该扩增标志物可以选自由例如腺苷脱氨酶(ADA)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，多重耐药基因(MDR)，鸟氨酸脱羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸抗性(CAD)组成的组。
[0230] 适于本发明的例举的表达载体或其衍生物尤其包括，例如人或动物病毒(例如痘病毒或腺病毒)；昆虫病毒(例如杆状病毒)；酵母载体；噬菌体载体(例如λ噬菌体)；质粒载体和粘粒载体。
[0231] 本发明此外可以使用多种宿主-载体系统，所述系统能够表达如上文定义的核酸的肽编码序列。这些包括，但不限于：(i)用痘病毒，腺病毒等感染的哺乳动物细胞系统；(ii)用杆状病毒等感染的昆虫细胞系统；(iii)包含酵母载体的酵母或(iv)用噬菌体，DNA，质粒DNA，或粘粒DNA转化的细菌。依赖于使用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任一个。
[0232] 优选地，适于此种宿主-载体系统的宿主细胞株，可以被选择以调节感兴趣的插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰或处理由所述序列编码的表达的肽。此外，从某些启动子的表达可以在某些的诱导剂存在下在选择的宿主株中被增强；这样便于遗传改造的肽的表达的控制。此外，不同的宿主细胞具有对表达的肽的特有的和特定的翻译和翻译后加工和修饰机制(例如糖基化，磷酸化，等)。可以因此选择合适的细胞系或宿主系统，以保证获得外源肽的所需修饰和加工。例如，在细菌系统内的肽表达可以用于产生非糖基化的核心肽；然而在哺乳动物细胞内的表达保证异源肽的″天然的″糖基化。
[0233] 本发明还提供针对上述JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的抗体用于制备治疗本文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症的药物组合物的用途。此外，记述了用于产生对本发明所述的JNK抑制剂序列特异性的或对包含所述抑制剂序列的嵌合肽特异性的抗体的有效方式，并且可以用于这一目的。
[0234] 根据本发明，本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，以及其片段、变体或衍生物可以用足免疫原来产生免疫特异性结合这些肽成分的抗体。所述抗体包括，例如，多克隆的、单克隆的、嵌合的、单链、Fab片段和Fab表达文库。在一个具体的实施方案中，本发明提供针对上文定义的嵌合肽或JNK抑制剂序列的抗体。本领域内已知的多种方法可以用来生产这些抗体。
[0235] 例如，可以通过注射上文定义的任意嵌合肽或JNK抑制剂序列免疫多种宿主动物来产生多克隆抗体。由此可以使用多种佐剂来增加免疫学反应，其包括，但不限于，弗氏(完全的和不完全的)佐剂，矿物胶(例如，氢氧化铝)，表面活性物质(例如，溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳液，二硝基酚等)，CpG，聚合物，Pluronics，和人佐剂，如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
[0236] 为了制备针对如上文定义的嵌合肽或JNK抑制剂序列的单克隆抗体，可以使用任何技术，其通过连续的细胞系培养提供抗体分子的产生。所述技术包括，但不限于，杂交瘤技术(参见Kohler和Milstein，1975.Nature256：495-497)；三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor，等人，1983，Immunol Today 4：72)和EBV杂交瘤技术，来产生人单克隆抗体(参见Cole，等人，1985.在：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症治疗)中，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。人单克隆抗体可以用于实施本发明，并且可以通过使用人杂交瘤产生(参见Cote，等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA80：2026-2030)，或通过在体外用埃巴病毒转化人B细胞产生(参见Cole，等人，1985.在：
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症治疗)中(Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96))。
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症治疗)中(Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96))。
[0237] 根据本发明，技术可以适合用于产生针对本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的单链抗体(例如参见美国专利号4,946,778)。另外，方法可以适合用于构建Fab表达文库(例如参见Huse等人，1989.Science 246：1275-1281)，以允许快速有效地鉴定具有需要的针对这些JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的特异性的单克隆Fab片段。非人抗体可以通过本领域公知的技术“人源化”(例如参见美国专利号5,225,539)。包含针对本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的独特型的抗体片段可以通过本领域已知的技术产生，所述技术包括，例如，(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生F(ab′)2片段；(ii)通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生Fab片段；(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生Fab片段，和(iv)Fv片段。
[0238] 在本发明的一个实施方案中，可以用于筛选抗体并且具有需要的特异性的方法包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域已知的其他免疫学-介导的技术。在具体的实施方案中，通过产生与本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽具有所述表位的片段结合的杂交瘤而促进对本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的特定表位(例如，其典型的包含长度为5-20、优选8-18个、更优选8-11个氨基酸的片段)特异性的抗体的选择。本文发明还提供这些对上文定义的表位特异性的抗体。
[0239] 本文定义的抗体可以用于本领域内已知的方法，涉及JNK抑制剂序列(和/或相对应地上文定义的嵌合肽)的定位和/或定量，例如用于测量适当的生理学样品中所述肽的水平，用于诊断方法，或用于对所述肽成像等。
[0240] 根据本发明定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸、载体、宿主细胞和/或抗体可以配制于药物组合物中，所述药物组合物可以应用于预防或治疗如本文定义的任何疾病，尤其应用于预防或治疗如本文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症。典型地，根据本发明使用的此种药物组合物包括活性组分，例如：(i)如上文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，和/或其变体，片段或衍生物，尤其是根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列的任一个的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列的任一个的嵌合肽，和/或包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至22任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段中的任何一个或更多个；和/或(ii)编码如上文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽和/或其变体或片段的核酸，和/或(iii)包含如上文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，和/或其变体，片段或衍生物中的任一个或更多个的细胞，和/或(iv)用编码如上文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽和/或其变体或片段的载体和/或核酸转染的细胞。
[0241] 根据一个优选的实施方案，如根据本发明使用的此种药物组合物典型地包含安全和有效量的如上文定义的组分，优选安全和有效量的至少一种根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列和/或至少一种根据SEQ ID NOs：
9至12和23至32的序列中任一个的嵌合肽，和/或至少一种包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至22任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段，或至少一种编码它们的核酸，或至少一种如上文定义的载体、宿主细胞或抗体。
9至12和23至32的序列中任一个的嵌合肽，和/或至少一种包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至22任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段，或至少一种编码它们的核酸，或至少一种如上文定义的载体、宿主细胞或抗体。
[0242] 本发明人另外发现，本文定义的所述JNK-抑制剂序列和嵌合肽分别表现出在本发明的疾病所涉及的细胞中的特别好的吸收率。因此，要施用于受试者的药物组合物中JNK-抑制剂序列和嵌合肽分别的量可以具有非常低的剂量(不限制于此)。因此，所述剂量可以远低于对本领域中已知的肽药物(比如DTS-108)的剂量，(Florence Meyer-Losic等人，Clin Cancer Res.，2008，2145-53)。这具有一些积极的方面，例如潜在的副反应的减少和成本的降低。
[0243] 优选地，所述剂量(每kg体重)在以下范围内：多达10mmol/kg，优选地多达1mmol/kg，更优选多达100μmol/kg，甚至更优选多达10μmol/kg，甚至更优选多达1μmol/kg，甚至更优选多达100nmol/kg，最优选地多达50nmol/kg。
[0244] 因此，所述剂量范围可以优选从约1pmol/kg至约1mmol/kg，从约10pmol/kg至约0，1mmol/kg，从约10pmol/kg至约0，01mmol/kg，从约50pmol/kg至约1μmol/kg，从约100pmol/kg至约500nmol/kg，从约200pmol/kg至约300nmol/kg，从约300pmol/kg至约100nmol/kg，从约500pmol/kg至约50nmol/kg，从约750pmol/kg至约30nmol/kg，从约250pmol/kg至约5nmol/kg，从约1nmol/kg至约10nmol/kg，或所述值的任意两个的组合。
[0245] 在本文中，当使用上文的药物组合物时，治疗的处方，例如剂量等方面的决定典型地在全科医生及其它医生的责任范围内，并且典型地考虑要治疗的疾病、个体患者的病状、递送的部位、施用方法和从业人员已知的其它因素。以上提到的技术和方案的实例可在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第16版，Osol，A.(编辑)，1980中找到。因此，对于根据本发明使用的药物组合物的组分，如上文定义的″安全和有效量″意为足以显著诱导本文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症的积极改变的这些组分中的每一种或全部的量。然而，同时，″安全和有效量″足够小以避免严重的副作用，也就是说允许利益和风险之间合理的关系。这些范围的确定典型地位于合理的医学判断的范围内。此种组分的″安全和有效量″将随要治疗的特定疾病，并且也随要治疗的患者的年龄和身体条件，疾病的严重度，治疗的持续时间，伴随治疗、使用的特定药学可接受载体性质，和类似因素，在随行医生的知识和经验内而不同。可以根据本发明使用根据本发明的药物组合物，用于人和也用于兽医的医学目的。
[0246] 除了这些物质中的一种之外，根据本发明使用的药物组合物还可以包含，(相容的)药学可接受载体，赋形剂，缓冲剂，稳定剂或本领域技术人员公知的其它物质。
[0247] 在本文中，措辞″(相容的)药学可接受载体″优选包括组合物的液体或非液体基础。术语″相容的″意为如本文使用的药物组合物的成分能够与如上文定义的药学活性组分并且与另一个组分以这样的方式混合，以致于在普通使用条件下没有发生将显著降低组合物的药学有效性的相互作用。当然药学可接受载体必须具有充分高的纯度和充分低的毒性，以使它们适于施用于要被治疗的人。
[0248] 如果以液体形式提供如本文使用的药物组合物，则所述药学可接受载体将典型地包含一种或更多种(相容的)药学可接受液体载体。所述组合物可以包含(相容的)药学可接受液体载体，例如无热源水；等渗盐水或缓冲(含水)溶液(例如磷酸盐，柠檬酸盐等缓冲溶液，植物油(比如，例如，花生油，棉籽油，芝麻油，橄榄油，玉米油和源自可可属的油)；多元醇，比如，例如，聚丙二醇，甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；藻酸，等。尤其是对于如本文使用的药物组合物的注射，可以使用缓冲液，优选含水缓冲液。
[0249] 如果以固体形式提供如本文使用的药物组合物，则所述药学可接受载体将典型地包含一种或多种(相容的)药学可接受固体载体。所述组合物可以包含(相容的)药学可接受固体载体，例如也可以使用适于施用于人的一种或多种相容的固体或液体填充物或稀释剂或包封化合物。此种(相容的)药学可接受固体载体的一些实例是例如糖，比如，例如，乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如，例如，玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，比如，例如，羧甲基纤维素钠，乙基纤维素，乙酸纤维素；粉末的黄蓍胶；麦芽；明胶；动物脂；固体助流剂，比如，例如，硬脂酸，硬脂酸镁；硫酸钙，等。
[0250] (相容的)药学可接受载体或其它物质的确切种类可以取决于给药途径。(相容的)药学可接受载体的选择可以因此原则上通过根据本发明使用的药物组合物施用的方式来确定。可以例如，全身施用根据本发明使用的药物组合物。给药途径包括，例如，肠胃外途径(例如通过注射)，比如静脉内，肌肉内，皮下，皮内，或经皮途径给药等，肠内途径，比如口服，或直肠途径等，局部途径，比如经鼻，或鼻内途径等，或其它途径，比如表皮途径或贴片递送。
[0251] 要使用的药物组合物的合适的量可以通过使用动物模型的常规实验确定。此种模型包括(没有暗示任何限制)兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类模型。优选的用于注射的单位剂型包括无菌水溶液，生理盐水或其混合物。此种溶液的pH应调节到约7.4。用于注射的合适的载体包括水凝胶，用于控制或延迟释放的装置，聚乳酸和胶原基质。用于局部应用的合适的药学可接受载体包括适于用于洗剂，乳膏，凝胶等的那些。如果化合物要经口服施用，片剂、胶囊等是优选的单位剂型。用于制备可以用于口服施用的单位剂型的药学可接受载体是本领域公知的。其选择将依赖于次要的考虑因素，比如味道，成本和可储存性，其对本发明的目的不是至关重要的，并且本领域技术人员可以容易地完成。
[0252] 用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括如上文定义的固体载体，比如明胶，和任选的辅剂。用于口服施用的液体药物组合物通常可以包括如上文定义的液体载体，比如水，石油，动物或植物油，矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类比如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0253] 对于静脉内、皮肤或皮下注射，或者在患处注射，活性成分将为肠外可接受的水溶液形式，所述水溶液无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如，等渗载体比如氯化钠注射液、Ringer′s注射液、乳酸盐Ringer′s注射液制备合适的溶液。按需要可以包括防腐剂，稳定剂，缓冲剂，抗氧化剂和/或其它添加剂。不论其是否是多肽，肽，或核酸分子，要给予个体的其它根据本发明的药用化合物优选以″预防有效量”或“治疗有效量”施用(根据具体情况而定)，这足以对个体显示出益处。施用的实际量，和施用的速率和时程，将依赖于被治疗的疾病的性质和严重度。
[0254] 预防和/或治疗如本文定义的疾病典型地包括施用如上文定义的药物组合物。术语“调节”包括当JNK在上述任一种疾病中过表达时抑制其表达。其还包括在上述任何疾病中抑制c-jun、ATF2或NFAT4的磷酸化，例如，通过使用根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的至少一种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列中任一个的至少一种嵌合肽，和/或包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至
22中任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的至少一种JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段，作为细胞中天然c-jun、ATF2和NFAT4结合位点的竞争性抑制剂。术语“调节”还包括由c-jun、ATF2或NFAT4和它们相关的配偶体组成(不限于其中)的转录因子的异型和同型复合体的抑制，所述复合体比如例如由c-jun、AFT2和c-fos组成的AP-1复合体。当上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症与JNK过表达相关时，可以将所述抑制性JNK抑制剂序列引入到细胞中。
在一些情况下，“调节”可以于是包括例如通过使用IB肽-特异的抗体增加JNK表达，所述IB肽-特异的抗体阻断IB-肽对JNK的结合，从而阻止由IB-相关肽导致的JNK抑制。
22中任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的至少一种JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段，作为细胞中天然c-jun、ATF2和NFAT4结合位点的竞争性抑制剂。术语“调节”还包括由c-jun、ATF2或NFAT4和它们相关的配偶体组成(不限于其中)的转录因子的异型和同型复合体的抑制，所述复合体比如例如由c-jun、AFT2和c-fos组成的AP-1复合体。当上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症与JNK过表达相关时，可以将所述抑制性JNK抑制剂序列引入到细胞中。
在一些情况下，“调节”可以于是包括例如通过使用IB肽-特异的抗体增加JNK表达，所述IB肽-特异的抗体阻断IB-肽对JNK的结合，从而阻止由IB-相关肽导致的JNK抑制。
[0255] 用如以上公开的药物组合物预防和/或治疗受试者可以典型地通过向受试者(体内)施用(“治疗有效”)量的所述药物组合物来完成，其中所述受试者可以是例如任何哺乳动物，例如人，灵长类动物，小鼠，大鼠，狗，猫，牛，马或猪。术语“治疗有效”意为药物组合物的活性组分的量足以改善上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症。
[0256] 因此，如上文定义的任意肽，例如根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的至少一种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列中任一个的至少一种嵌合肽，和/或包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至22中任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的至少一种JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段，可以用于治疗上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症，例如，通过调节活化的JNK信号传导途径进行。
[0257] 然而，上文定义的肽还可以由核酸编码，于是核酸可以形成本发明药物组合物的一部分，例如，用于基因治疗。在本文中，基因治疗指通过例如以如上文定义的药物组合物的方式向受试者施用如上文定义的特定核酸进行的治疗，其中所述核酸仅包含L-氨基酸。在本发明的该实施方案中，核酸产生其编码的肽，所述肽随后用于通过调节疾病或紊乱的功能发挥治疗作用。在本发明的实践中可以使用本领域内可用的与基因治疗相关的任何方法(参见例如Goldspiel，等人，1993.Clin Pharm 12：488-505)。
[0258] 在一个优选的实施方案中，如上文定义的和如用于基因治疗的核酸是在合适的宿主内编码和表达如上文定义的IB-相关肽中任何一个或多个的表达载体的一部分，即根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列中任一个的嵌合肽，和/或包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至22中任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段。在一个特定的实施方案中，此种表达载体具有可操作地连接于JNK抑制剂序列的编码区的启动子。所述启动子可以如上文定义，例如是诱导型的或组成型的，和任选地组织特异型的。
[0259] 在另一个特定的实施方案中，如上文定义的核酸分子用于基因治疗，其中如上文定义的核酸分子的编码序列(和任何其它其所需的序列)在其侧面相接在基因组内所需位点启动同源重组的区域，因此提供这些核酸在染色体内表达(参见例如Koller和Smithies，1989.Proc Natl Acad Sci USA 86：8932-8935)。
[0260] 为了基因治疗的目的，根据本发明的如上文定义的核酸向患者的递送，尤其在上文提到的如上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症的情况下，可以是直接的(即患者直接暴露于核酸或包含核酸的载体)或间接的(即首先用核酸体外转化细胞，然后移植入患者)。这两种途径分别被称为体内(in vivo)或离体(ex vivo)基因治疗。在本发明一个特定的实施方案中，核酸直接体内施用，在那其被表达以产生编码的产物。这可以通过本领域中已知的很多方法中的任一个完成，所述方法包括，例如构建核酸为合适的核酸表达载体的一部分并以如下方式施用：其成为细胞内的(例如通过使用有缺陷的或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体感染；参见美国专利4,980,286)；直接注射裸露的DNA；使用微粒轰击(例如“基因枪”；Biolistic，DuPont)；用脂质包被核酸；使用相关的细胞表面受体/转染剂；包裹在脂质体，微粒，或微胶囊中；与已知进入核的肽连接的方式施用其；或通过以与倾向于受体介导的内吞作用的配体连接的方式施用其(参见例如Wu和Wu，1987.J Biol Chem 262：4429-4432)，其可以用于“靶向”特异表达目标受体的细胞类型等。
[0261] 在本发明的实践中基因治疗的另外的途径包括将基因(包含如上文定义的核酸)通过比如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染、病毒感染等方法转入体外组织培养物中的细胞中。通常，转移方法包括可选择的标志物伴随转入细胞。随后将细胞置于选择压力下(例如抗生素抗性)，以便促进分离那些已经摄取和表达被转移的基因的细胞。随后将那些细胞递送给患者。在一个特定的实施方案中，在体内施用产生的重组细胞之前，通过本领域内已知的任何方法(包括例如转染，电穿孔，微注射，用包含感兴趣的核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移，原生质球融合，和类似的保证受体细胞的必要的发育和生理功能不被转移破坏的方法)将核酸引入细胞。参见例如Loeffler和Behr，1993.Meth Enzymol 217：599-618。为稳定转移核酸入细胞，从而由细胞可表达核酸，应该提供选择的技术。优选地，转移的核酸是由细胞后代可遗传和表达的。
[0262] 在本发明的优选的实施方案中，产生的重组细胞可以通过各种本领域内已知的方法递送于患者，所述方法包括，例如注射上皮细胞(例如皮下地)，应用重组皮肤细胞在患者上皮肤移植，和静脉内注射重组血液细胞(例如造血干或祖细胞)。设想的使用的细胞总量依赖所需的效果，患者状态等，并且可以由本领域技术人员确定。可以引入核酸用于基因治疗目的的细胞包括任何所需的，可用的细胞类型，并且可以是异种的，异源的，同源的，或自体的。细胞类型包括，但不限于，分化的比如上皮细胞，内皮细胞，角化细胞，成纤维细胞，肌肉细胞，肝细胞和血细胞，或各种干细胞或祖细胞，尤其是胚胎心肌细胞，肝干细胞(国际专利公开WO 94/08598)，神经干细胞(Stemple和Anderson，1992，Cell 71：973-985)，造血干细胞或祖先细胞，例如如从骨髓，脐带血，外周血，胎儿肝等获得的。在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞对于患者是自体的。
[0263] 备选地和/或此外，对于治疗如本文提到的疾病，可以通过使用靶向系统(比如(靶向)抗体或细胞特异的配体)对某些类型的细胞更特异地使用靶向治疗以递送如上文定义的JNK抑制剂序列，嵌合肽，和/或核酸。用于靶向的抗体典型地特异于与如以下定义的任何疾病相关的细胞的细胞表面蛋白。通过举例的方式，这些抗体可以被引导至细胞表面抗体(比如例如B细胞相关表面蛋白(比如MHC类别II DR蛋白，CD18(LFA-1 β链)，CD45RO，CD40或Bgp95)，或选自例如CD2，CD4，CD5，CD7，CD8，CD9，CD10，CD13，CD16，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD30，CD33，CD34，CD38，CD39，CD4，CD43，CD45，CD52，CD56，CD68，CD71，CD138，等的细胞表面蛋白)。靶向构建体可以典型地通过将根据本发明如本文定义的JNK抑制剂序列，嵌合肽，和核酸共价结合于特异于细胞表面蛋白的抗体或通过结合于细胞特异的配体来制备。蛋白可以例如结合于此种抗体或可以通过肽键或通过化学偶联、交联等与其连接。靶向治疗可以于是通过以药学有效量将所述靶向构建体通过如以下定义的任何施用途径施用于患者，例如腹膜内，经鼻，静脉内，口服和贴片递送途径来进行。优选地，连接于如上文定义的靶向抗体或细胞特异的配体的根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列，嵌合肽，或核酸，可以例如通过水解共价键，通过肽酶或通过任何其它合适的方法体外或体内释放。备选地，如果根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列，嵌合肽，或核酸连接于小细胞特异的配体，则配体的释放可以不进行。如果存在于细胞表面上，则所述嵌合肽可以凭其运输序列的活性进入细胞。由于多种原因，靶向可以是理想的；例如如果根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列，嵌合肽，和核酸是不可接受地毒性的或如果其否则需要太高的剂量。
[0264] 代替直接施用根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，它们可以通过从引入细胞的编码基因(例如从被施用的病毒载体)表达而在靶细胞中生成。所述病毒载体典型地编码根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。所述载体能够靶向要处理的特定的细胞。此外，所述载体可以包含调控元件，其通过靶细胞在限定的调节下或多或少地选择性地启动。该技术代表VDEPT技术(病毒引导的酶前药治疗)的变体，其使用成熟蛋白代替其前体形式。
[0265] 备选地，可以通过使用抗体或病毒以前体形式施用如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。这些JNK抑制剂序列和/或嵌合肽可以随后通过产生于要处理的细胞中或靶向于要处理的细胞的激活剂转变为活性形式。该类型的方法有时被称为ADEPT(抗体引导的酶前药治疗)或VDEPT(病毒引导的酶前药治疗)；前者包括通过缀合于细胞特异的抗体将激活剂靶向细胞，而后者包括在载体中通过从病毒载体中的编码DNA表达产生激活剂(例如JNK抑制剂序列或嵌合肽)(参见例如，EP-A-415731和WO 90/07936)。
[0266] 根据一个进一步的实施方案，如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列或针对JNK抑制剂序列或针对嵌合肽的抗体，例如根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列中任一个的嵌合肽，和/或包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至22中任一个的运输序列的、根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或片段，可以用于(体外)测定(例如免疫测定)以检测、预测、诊断或监测如上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症，或监测其治疗。所述免疫测定可以通过包括以下的方法进行：将源自患者的样品与针对如上文定义的JNK抑制剂序列，嵌合肽，或核酸序列的抗体，在免疫特异结合可以发生的条件下接触，并随后检测或测量由抗体导致的任何免疫特异结合的量。在一个特定的实施方案中，特异于JNK抑制剂序列，嵌合肽或核酸序列的抗体可以用于分析源自患者的组织或血清样品中JNK或JNK抑制剂序列的存在；其中JNK的异常水平指示疾病的状况。可以利用的免疫测定包括，但不限于，使用比如免疫印迹，放射免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，“夹心”免疫测定，免疫沉淀测定，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散测定，凝集测定，荧光免疫测定，补体结合测定，免疫放射分析测定，和蛋白-A免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。备选地，(体外)测定可以通过将如上文定义的，JNK抑制剂序列，嵌合肽，核酸序列或针对JNK抑制剂序列或针对嵌合肽的抗体，递送到典型地选自例如培养的动物细胞、人细胞或微生物的靶细胞，并且通过熟练技术人员典型已知的生物物理方法以监视细胞反应来进行。
其中典型使用的靶细胞可以是培养的细胞(体外)或体内细胞，即组成活体动物或人的器官或组织的细胞，或存在于活体动物或人中的微生物。
其中典型使用的靶细胞可以是培养的细胞(体外)或体内细胞，即组成活体动物或人的器官或组织的细胞，或存在于活体动物或人中的微生物。
[0267] 本发明此外提供用于诊断或治疗目的，尤其用于治疗、预防或监测如上文定义的与JNK信号传导强相关的疾病或病症的试剂盒的用途，其中所述试剂盒包括一个或多个容器，其包含如上文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列和/或针对这些JNK抑制剂序列或针对嵌合肽的抗体(例如针对根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列，针对根据SEQ ID NOs：9至12和23至32的序列中任一个的嵌合肽，针对包含根据SEQ ID NOs：5至8和21至22任一个的运输序列的根据SEQ ID NOs：1至4和13至20和33至100的序列中任一个的JNK抑制剂序列，或针对在上文定义内的其变体或片段的抗JNK抑制剂序列抗体)，或此种抗JNK抑制剂序列抗体和任选地所述抗体的被标记的结合配偶体。由此引入抗体的标记可以包括，但不限于，化学发光的，酶促的，荧光的，比色的或放射性部分。在另一个特定的实施方案中，提供用于治疗、预防或监测与JNK信号传导强相关的疾病或病症的诊断用途的试剂盒，所述试剂盒包含一个或更多个包含编码如上文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的核酸或备选地互补于如上文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的核酸的容器，任选地，还提供针对这些核酸的被标记的结合配偶体。在一个备选的特定实施方案中，所述试剂盒可以用于上文的目的的试剂盒，包含一个或更多个容器，能够用作聚合酶链式反应(PCR；参见例如Innis，等人，1990.PCR方案，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)的扩增引物的一对寡核苷酸引物(例如各自6-30个核苷酸的长度)，连接酶链式反应，循环探针反应等，或其它在如上文定义的核酸情况下使用的本领域内已知的方法。所述试剂盒可以任选地进一步包含预定量的如上文定义的JNK抑制剂序列，如上文定义的嵌合肽或编码这些的核酸，用作用于上述目的的测定中的诊断剂、标准物或对照。
[0269] 在本文引用各种出版物，其公开的内容以其整体通过引用并入。
[0270] 除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管在本发明的实践和测试中可以使用与本文描述的那些相似或等价的方法和材料，然而合适的方法和材料描述如下。本文提到的所有出版物，专利申请，专利及其它参考文献以其整体通过引用并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅用作说明目的并且不意在限制。本发明的其他特征和优点将通过下文详细的说明书和权利要求书而清楚可见。
附图说明
[0271] 图1A-C是显示在所述的转录因子中的保守的JBD结构域区的比对的图表。本文所用的JNK抑制剂序列通过进行序列比对来鉴定。该比对的结果示例性显示在图1A-1C中。图1A显示IB1、IB2、c-Jun和ATF2的JBDs之间同源性最高的区域。图B显示用于比较原因的L-IB1(s)和L-IB1的JBDs的氨基酸序列。完全保守的残基用星号表示，而在GFP-JBD23Mut载体中变为Ala的残基用空心圆圈表示。图1C显示包含JNK抑制剂序列和运输序列的嵌合蛋白的氨基酸序列。在所示的实例中，所述运输序列来源于免疫缺陷病毒(HIV)TAT多肽，所述JNK抑制剂序列来源于IB1(s)多肽。在图B和C中，人、小鼠和大鼠序列是相同的。
[0272] 图2是显示来自人、小鼠和大鼠的通用TAT-IB融合肽的序列的图表。
[0273] 图3显示以单孔方式用SEQ ID NOs：9和11所述的融合肽抑制HepG2细胞中的内源性JNK-活性的结果。从图3可以看出，特别是图3中的图d，SEQ ID NO：11所述的D-TAT-IB1(s)(此处缩写为D-JNKI)有效抑制JNK活性，甚至优于SEQ ID NO：9所述的L-TAT-IB1(s)(此处缩写为L-JNKI)。
[0274] 图4显示使用SEQ ID NO：11所述的嵌合JNK抑制剂序列(还称为XG-102，见实施例12)的细胞毒性测定的结果。可以看出，XG-102(SEQ ID NO：11)对于HFFs没有细胞毒性。将HFFs接种在96孔组织培养板中。加入包含DMSO(以与5μM药物相同的水平)或1、2和5μM的XG-102的培养基24小时。立即加入中性红，将细胞固定，然后提取染料。在540nm测量吸光度。在DMSO与1μM XG-102之间没有观察到差异。
[0275] 图5显示为检测SEQ ID NO：11所述的嵌合JNK抑制剂序列(还称为XG-102)针对水痘带状疱疹病毒(Varizella Zoster Virus，VZV)的活性进行的蚀斑减少测定的结果(见实施例12)。可以看出，XG-102(SEQ ID NO：11)是有效的Varizella Zoster Virus(VZV)抑制剂，特别是以0.5μM和1μM的浓度。
[0276] 图6显示使用SEQ ID NO：11所述的嵌合JNK抑制剂序列(还称为XG-102)抑制在培养的人成纤维细胞中的水痘带状疱疹病毒(Varizella Zoster Virus，VZV)的结果(见实施例12)。可以看出，VZV表现出显著的针对XG-102(SEQ ID NO：11)的敏感性。在存在阴性对照(XG-100，单独的Tat肽)的条件下，VZV复制是正常的。因此，XG-102(SEQ ID NO：11)已经在所检测的最低浓度0.25μM防止VZV复制。
[0277] 图7显示使用博来霉素诱导的急性肺部炎症的动物模型在慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗中使用肺匀浆物中的MPO检测的XG-102(SEQ ID NO：11)对肺中细胞招募的活性。可以看出，MPO在博来霉素施用后没有被显著诱导。由此，XG-102(SEQ ID NO：11)对肺中MPO水平仅具有很少的作用。
[0278] 图8显示使用博来霉素诱导的急性肺纤维化的动物模型在慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗中XG-102(SEQ ID NO：11)对TNF水平的活性。当测量TNF水平时，在BLM模型中观察到在施用XG-102(SEQ ID NO：11)后BALF中TNF水平减少的趋势。TNF水平在BLM后非常低。
[0279] 图9显示在使用博来霉素诱导的急性肺纤维化的动物模型在慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗中XG-102(SEQ ID NO：11)对支气管肺泡灌洗空间中细胞招募的活性。XG-102(SEQ ID NO：11)以0.1mg/kg显著减少淋巴细胞的招募和在炎症阶段过程中招募的总细胞数目(在该点特征在于淋巴细胞招募)。XG-102(SEQ ID NO：11)以0.1mg/kg增强淋巴细胞招募或进入到支气管肺泡空间中的总细胞数目(n＝5只小鼠/组；*，p＜0.05；
**，p＜0.001)。
**，p＜0.001)。
[0280] 图10描述使用博来霉素诱导的急性肺纤维化的动物模型在慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗中的组织学结果。将3μm的肺切片用苏木精和曙红染色。在BLM施用后10天观察到炎性细胞积聚、纤维化区域、肺结构的丧失。可以看出，在施用低剂量(0.001mg/kg)的XG-102后观察到这些参数的减少，而施用高剂量(0.1mg/kg)的XG-102没有观察到这些参数的减少。
[0281] 图11显示通过ELISA确定的使用XG-102(SEQ ID NO：11)治疗对脑Aβ1-40和Aβ1-42水平的影响。该图显示在用Triton 40和Triton 42的不同的脑匀浆级分中通过ELISA确定的Aβ1-40(左图)和Aβ1-42(右图)水平。数据表示为具有个体值(黑色)和组平均数±SEM的散点图。限制性差异用星号标记(*p＜0.05；**p＜0.01)。对于Aβ1-42仅在Triton X-100级分中观察到显著的组差异。
[0282] 图12显示通过ELISA确定的使用XG-102(SEQ ID NO：11)的治疗对CSF Aβ1-40和Aβ1-42水平的影响。该图显示通过ELISA确定的CSF中Aβ1-40(左图)和Aβ1-42(右图)水平。数据表示为具有个体值(黑色)和组平均数±SEM的散点图。显著性差异用星号标记(*p＜0.05；**p＜0.01)。以两种剂量的XG-102(SEQ ID NO：11)进行治疗导致CSF中Aβ1-40和Aβ1-42的显著减少。
[0283] 图13显示对hAPP Tg小鼠中硫磺素S染色显现的蚀斑数目的治疗作用：该图表2
示在皮质和海马中每mm硫酸素S染色的蚀斑的数目。XG-102(SEQ ID NO：11)治疗以负剂量依赖性方式减少海马中蚀斑的数目。数据表示为平均数+SEM。N＝8只/组。*...p＜0.05；**...p＜0.01。
示在皮质和海马中每mm硫酸素S染色的蚀斑的数目。XG-102(SEQ ID NO：11)治疗以负剂量依赖性方式减少海马中蚀斑的数目。数据表示为平均数+SEM。N＝8只/组。*...p＜0.05；**...p＜0.01。
[0284] 图14显示在hAPP Tg小鼠中对硫酸素S显现的蚀斑面积[％]的治疗作用：该图显示皮质和海马中硫酸素S阳性蚀斑的蚀斑面积[％]。XG-102(SEQ ID NO：11)显著减少海马中蚀斑占据的面积。数据表示为平均数+SEM。N＝8只/组。
[0285] 图15描述在2型糖尿病动物模型中施用XG-102(SEQ ID NO：11)对空腹血糖水平(绝对的和相对的)的结果。在组A和C中每隔三天测量空腹血糖直到第68天，并且在规律基础上直到第111天终止。我们观察到，与赋形剂对照相比，用XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)治疗的糖尿病db/db小鼠的空腹血糖水平明显而显著的(p＜0.001)减少。用XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)治疗的小鼠的空腹血糖水平达到约5mmol/L的低平台。在作用在给药14天后是明显的并且在整个研究中持续，由此在从第21天至第111天的整个淘汰期间持续。相反，在28天的给药过程中，我们没有观察到低剂量XG-102(SEQ ID NO：
11)(1mg/kg)的作用。
11)(1mg/kg)的作用。
[0286] 图16描述在2型糖尿病动物模型中施用10mg/kg的XG-102(SEQ ID NO：11)对体重的结果。我们观察到，与赋形剂对照相比，在用XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)治疗的小鼠中明显和显著的(p＜0.001)防止体重增加。该作用从给药第28天起是明显的，并且一直保持到第111天终止时。相反，在28天的给药过程中，我们没有观察到低剂量XG-102(SEQ ID NO：11)(1mg/kg)对体重的作用。
[0287] 图17，18描述在图17(g)和18中的第68个研究日在代谢笼中测量的赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)在2型糖尿病动物模型中对24小时的食物和水摄入、和尿和粪便产生的影响。与赋形剂对照相比，我们没有观察到XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)对任意所测量的参数的显著作用，但是观察到食物摄入和尿产生减少的趋势。
[0288] 图19，20描述在2型糖尿病动物模型中在第57、77和108天测量的赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)对胰岛素、MCP-1和IL-6的血浆水平的影响(图19)；对tPAI-1、TNF和抵抗素的血浆水平的影响(图20)；除了血浆抵抗素水平(其在第77和108天，在XG-102(SEQ ID NO：11)治疗的动物中显著更高)之外，与赋形剂对照相比，我们没有观察到XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)对任意所测量的参数的显著作用。
[0289] 图21显示在2型糖尿病动物模型中赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)对附睾、腹股沟皮下和腹膜后脂肪垫的组织重量的影响。我们观察到，与赋形剂对照相比，在用XG-102治疗的小鼠中附睾(p＜0.05)和腹膜后(p＜0.01)脂肪质量的显著减少。
[0290] 图22显示在2型糖尿病动物模型中赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)对脑、脾和心脏的组织重量的影响。与赋形剂对照相比，我们没有观察到XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)对这些参数的显著影响。
[0291] 图23描述在2型糖尿病动物模型中赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：11)(10mg/kg)对肾和肝组织重量的影响。我们观察到，与赋形剂对照相比，在用XG-102(SEQ ID NO：11)治疗的小鼠中肾(p＜0.05)和肝(p＜0.01)质量显著减少。
[0292] 图24将原代培养的巨噬细胞用XG-102(SEQ ID NO：11)温育，并且彻底洗涤。使用特异性抗XG-102的抗体揭示XG-102(SEQ ID NO：11)的存在。XG-102强烈地结合在原代巨噬细胞中。
[0293] 图25将小鼠通过三种不同的施用途径(s.c.，i.v.，i.p.)用C14放射性标记的肽(1mg/kg)治疗。在注射后72小时将动物处死，并且处理用于免疫放射学研究。将矢状面切片曝光，并且揭示出主要在肝、脾和骨髓中的XG-102肽积聚(XG-102：SEQ ID NO：11)。
[0294] 图26显示在静脉内注射1mg/kg XG-102的大鼠肝中针对XG-102(SEQ ID NO：11)的免疫染色。动物在注射后24小时处死。使用DAB底物进行显示。该图再次显示出在肝、尤其是在肝巨噬细胞(巨噬细胞)中明显的XG-102积聚。
[0295] 图27显示在两种细胞系中对细胞因子和趋化因子释放的抑制作用。XG-102(SEQ ID NO：11)抑制骨髓和淋巴细胞系中的细胞因子释放，减少THP-1细胞中LPS-诱导的TNFa、IL-6和MCP-1释放(图A-C)和减少Jurkat细胞中PMA&离子霉素诱导的IFNg、IL-6和IL-2的产生(图D-F)。对照(XG-101)由于其较低的稳定性而有效性较低。
[0296] 图28显示在原代细胞中抑制细胞因子释放。XG-102(SEQ ID NO：11)还抑制原代淋巴细胞和骨髓细胞中的细胞因子释放，减少鼠巨噬细胞中LPS-诱导的TNFa、IL-6和Rantes的释放(图A-C)和减少鼠T细胞中PMA&离子霉素诱导的TNFa和IFNg产生(图D-E)。作用以XG-102的非细胞毒性浓度发生(图F)。
[0297] 图29显示源自大鼠的IB1 cDNA序列及其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)。
[0298] 图30显示rIB1基因的外显子-内含子边界-剪切供体编码的源自大鼠的IB1蛋白序列(SEQ ID NO：103)。
[0299] 图31显示源自智人(Homo sapiens)的IB1蛋白序列(SEQ ID NO：104)。
[0300] 图32显示源自智人的IB1 cDNA序列(SEQ ID NO：105)。
[0301] 图33胰岛分离对JNK/p38活化的影响。设计该实验来鉴定由分离过程引发的任何作用，由此对JNK或p38的作用。使用微管蛋白检测作为对照。显示作为消化时间(分钟)的函数的蛋白质印迹染色。
[0302] 图34由该图显示XG-102对JNK活化的作用。
[0303] 图35在分离过程中XG-102对JNK活化的作用。
[0304] 图36在分离过程中XG-102对OCR/DNA的作用。
[0305] 图37通过HPLC分析XG-102(DJNK抑制剂)对ATP/蛋白J的作用。
[0306] 图38显示在培养7天后测量的XG-103显著增加胰岛的存活性(OCR/DNA)。
[0307] 图39图41(A)：在荧光素注射后10分钟的荧光素血管造影评价(平均得分)。显示五组(XG-102 300微克/ml，XG-102 3mg/ml，Kencort retard，0，9％NaCl溶液，未治疗的)在第14天和第21天的平均得分。
[0308] 图41(B)对五组(XG-102 300微克/ml，XG-102 3mg/ml，Kencort retard，0，9％NaCl溶液，未治疗的)在第14天和第21天，在荧光素注射后10分钟产生的荧光素血管造影评价(平均得分)。
[0309] 图41(C)对五组(XG-102 300微克/ml，XG-102 3mg/ml，Kencort retard，0，9％NaCl溶液，未治疗的)在第14天和第21天，荧光素注射后10分钟发生ChNV的形成。
[0310] 图41(D)荧光素渗漏的发生延长至第14天和第21天；对于五组(XG-102 300微克/ml，XG-102 3mg/ml，Kencort retard，0，9％NaCl溶液，未治疗的)。
[0311] 图40显示在阿霉素诱导的肾病变诱导时评价XG-102对肾组织的作用的实验设计。显示大鼠组和它们的治疗方案。
[0312] 图41显示XG-102没有引发针对蛋白尿的任何不利作用。利用ELISA测定来确定组1、组4和组5作为观察期的函数的白蛋白浓度(第5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，25，38，41天)。
[0313] 图42在实验开始后8天的组织学分析。比较组1阿霉素治疗的大鼠(左手侧)和组4阿霉素与XG-102治疗的大鼠(右手侧)。
[0314] 图43在实验开始后14天的组织学分析。比较组1阿霉素治疗的大鼠(左手侧)和组4阿霉素与XG-102治疗的大鼠(右手侧)。
[0315] 图44在实验开始后19天的组织学分析。比较组1阿霉素治疗的大鼠(左手侧)和组4阿霉素与XG-102治疗的大鼠(右手侧)。
[0316] 图45在实验开始后41天的组织学分析。比较组1阿霉素治疗的大鼠(左手侧)和组4阿霉素与XG-102治疗的大鼠(右手侧)。
[0317] 图46在实验开始后8天c-jun表达的组织学分析(染色)。左手侧为阿霉素治疗的组织学制备物，中间：阿霉素与XG-102治疗的(导致间质中c-jun表达的显著减少)，并且右侧是对照。
[0318] 图47在实验开始后14天c-jun表达的组织学分析(染色)。左手侧为阿霉素治疗的组织学制备物，中间：阿霉素与XG-102治疗的(导致间质中c-jun表达的显著减少)，并且右侧是对照。
[0319] 图48显示在ADR施用后第8，14，29，41和56天在阿霉素(ADR)-诱导的肾病变模型中大鼠通过蛋白尿(A)和尿水平(B)评估的肾功能。第1组(“ADR”)和第2组(“ADR+XG-102”)已经在第0天用ADR处理，以诱导肾病变，而第3组(“NaCl”)和第4组(“XG-102”)接受0.9％NaCL。并且，第2组和第4组已经在第0天用XG-102治疗，而第1组和第3组接受赋形剂(0.9％NaCl)。
[0320] 图49显示用高碘酸-Schiff(PAS)染色的阿霉素(ADR)-诱导的肾病变模型中大鼠的肾切片(初始放大率x40)。对于左列所示的切片，大鼠在ADR施用后第8天处死，而对于左列所示的切片，大鼠在第56天处死。ADR仅施用给“ADR”和“ADR+XG102”组，而“NaCl”组仅接受0.9％NaCL。“ADR+XG102”组已经在第0天用XG-102治疗，而其余的组(“ADR”和“NaCl”)接受赋形剂(0.9％NaCl)。
[0321] 图50显示对“ADR”组(上图，其在第0天已经用ADR和赋形剂处理)和对“ADR+XG102”组(下图，其在第0天已经用ADR与XG-102治疗)在ADR施用后第8天(左侧四幅图)和第56天(右侧四幅图)用马森三色(Masson’s trichrome)评价的ADR肾病变中的肾纤维化。在左侧图中对每一天显示x10倍的初始放大率，并且在右侧图中对每一天显示x40倍的初始放大率。
[0322] 图51研究XG-102对嘌呤霉素氨基酸核苷(PAN)-诱导的肾病变的作用的实验的研究设计。在第0天和第14天，注射PAN或其赋形剂用于诱导肾病变。在第0天和第14天，先施用PAN，接着施用XG-102。从第0天至第42天，XG-102或其赋形剂通过静脉内途径每周施用一次，如上文所述。在第56天，将动物处死，并且采集样品(血液和肾)。
[0323] 图52显示在嘌呤霉素氨基核苷(PAN)-诱导的肾病变中XG-102对肾小球硬化症(glomerulosclerosis)损伤的作用。XG-102施用给第3-6组(在图例上标记为“cpd”)。如在实施例20的研究计划中所述的，第2组和第6组在静脉内注射的次数方面是不同的。
注意到，第2组的评分与Najakima等人(2010)使用相同的实验流程报道的评分非常相似。使用未配对Student t-检验，***P＜0.001相对于第1组；使用单因素ANOVA接着Newman-Keuls检验，#P＜0.05，###P＜0.001相对于第2组；使用未配对的Student t-检验，§§§P＜0.001相对于第2组。
注意到，第2组的评分与Najakima等人(2010)使用相同的实验流程报道的评分非常相似。使用未配对Student t-检验，***P＜0.001相对于第1组；使用单因素ANOVA接着Newman-Keuls检验，#P＜0.05，###P＜0.001相对于第2组；使用未配对的Student t-检验，§§§P＜0.001相对于第2组。
[0324] 图53显示在嘌呤霉素氨基核苷(PAN)-诱导的肾病变中XG-102对肾小球损伤的作用。XG-102施用给第3-6组(在图例上标记为“cpd”)。如在实施例20的研究计划中所述的，第2组和第6组在静脉内注射的次数方面是不同的。使用未配对Student t-检验，***P＜0.001相对于第1组；使用单因素ANOVA接着Newman-Keuls检验，###P＜0.001相对于第2组；使用未配对的Student t-检验，§§§P＜0.001相对于第2组。
[0325] 图54显示在糖尿病肾病变大鼠模型中研究长期施用XG-102的作用的实施例21的研究时间表。动物在到达后立即置于高脂肪饮食中。第E和F组的动物每天从基线相向前每日给药。
[0326] 图55显示在糖尿病性肾病变大鼠模型中长期施用XG-102对大鼠体重的影响。在STZ模型中，用XG-102治疗的大鼠与赋形剂-治疗的大鼠相比在体重上没有表现出区别。然而，用阳性参比物(氯沙坦(Losartan))治疗的大鼠的体重显著更低。
[0327] 图56显示在评价胰岛分离/移植中针对XG-102的剂量反应的实验(实施例22)中由15-min缺血诱导的XG-102剂量依赖性减少的JNK(A)和PAF2(B)磷酸化。分离大鼠胰岛在动物处死后立即进行或者在15分钟的热缺血期间后进行。通过在分离过程结束时的蛋白质印迹评估JNK活化。作为阴性对照，对未处理的大鼠胰腺评估JNK活化。
[0328] 图57显示XG-102对大鼠胰腺胰岛的功能和存活力的作用，而所述胰岛是从15分钟缺血的大鼠和从未缺血的大鼠分离的胰岛。在胰岛分离后直接进行和在37℃培养第18小时进行静态胰岛素分泌检测(基底的或使用葡萄糖刺激的)。分离影响胰岛功能，而与温育18小时的胰岛(无论什么条件)相比，在分离后直接使用的胰岛中基底胰岛素分泌较高。然而，在该实验中，在培养后，缺血和抑制剂XG-102对胰岛功能没有影响。
[0329] 图58显示另一个实验，其中缺血持续到30分钟，并且XG-102以100μM使用。仍然，当在分离后直接进行胰岛素分泌检测时观察到高基底分泌。并且，30分钟的缺血在诱导JNK活化方面似乎是比15分钟更好的模型。当胰岛从缺血大鼠分离并用XG-102温育时，与缺血大鼠相比，葡萄糖诱导的胰岛素分泌较高。
[0330] 图59包括在实施例27的研究(即，随机化的、双盲、平行组、对照的、多中心试验)中的患者安排，以与在手术后眼内炎症中的地塞米松滴眼液相比，评估单次结膜下注射XG-102的功效和安全性(II期临床)。
[0331] 图60显示对于实施例27的研究，三个治疗组XG-102 90μg，XG-102 900μg和地塞米松，在对PP分析群体结膜下注射研究治疗物后多达第28天的评估前房相比级别。垂直线表示标准差(SD)。
[0332] 图61显示对于实施例27的研究，对于关于第28天的前房细胞等级的PP和FAS数据组出第一个二级结果之外的初期结果的结果：置信区间和非劣效性边界。
[0333] 图62显示对于实施例27的研究，对于三个治疗组XG-102 90μg，XG-102 900μg和地塞米松，在施用结膜下注射的研究治疗物后多达第28天获得的前房闪烁等级(对于FAS)。垂直线表示标准差(SD)。
[0334] 图63显示对于实施例27的研究，对于FAS在整个研究期间直到第28天在确定的时间点获得的LFM(激光闪烁计(Laser Flare Meter))测量。垂直线表示标准差(SD)。
[0335] 图64显示对于实施例27的研究，剂量组报道的不利事件(严重的和不严重的)的总结。
[0336] 图65显示对于实施例27的研究，对于随机化到三个研究组中的任一个中的至少2％的患者报道的AEs(通过MedDRA SOC和PT term评分)的总结。
[0337] 图66显示对于实施例27的研究，报道的严重不利事件(SAEs)的总结。
[0338] 图67显示在实施例28中，在XG-102(在称为“D-JNKI1”的图中)或PBS处理的f/f Δli* f/f f/Mapk14 与Mapk14 小鼠(左图)和在XG-102(即“D-JNKI1”)处理的Mapk14 Jun
f Δli* Δli*
与Mapk14 Jun 小鼠(右图)中肝细胞的增殖。对小鼠注射XG-102(20mg/kg体重)
或PBS，如果合适，在DEN处理之前注射。通过在DEN处理后48小时的Ki67染色分析肝细胞的增殖。显示了Ki67-阳性细胞的定量。
f Δli* Δli*
与Mapk14 Jun 小鼠(右图)中肝细胞的增殖。对小鼠注射XG-102(20mg/kg体重)
或PBS，如果合适，在DEN处理之前注射。通过在DEN处理后48小时的Ki67染色分析肝细胞的增殖。显示了Ki67-阳性细胞的定量。
[0339] 图68将3×106个Huh7人肝癌细胞皮下注射到4周龄裸鼠的两胁区域(实施例29)。在Huh7注射后将裸鼠每周用XG-102以5mg/kg腹膜内治疗两次。每周测量肿瘤体积两次。在异种移植后4周将小鼠处死。圆点圆表示异种移植的肿瘤。
[0340] 图69显示实施例30，显示携带同位注射的HEP G2肿瘤的小鼠的平均体重和平均体重变化曲线。将小鼠按照Q4Dx4治疗时间表用XG-102以1mg/kg/inj静脉内治疗，在D10和D41重复两次。由此，在图70中显示各自的统计数据。
[0341] 图70显示实施例30小鼠对XG-102的耐受性。显示了平均体重和MBWC±SD。MBWC％对应于考虑的日子与第一次治疗的日子(D10)之间的平均体重的变化。将赋形剂治疗组视为参比，利用Bonferroni-Dunn检验进行统计学分析。
[0342] 图71显示实施例30小鼠的长久存活曲线，由此显示直到处死日(D185)每组存活的小鼠的比例。将小鼠按照Q4Dx4治疗时间表用XG-102以所示的剂量治疗，在D10和D41重复两次。
[0343] 图72显示实施例31小鼠对单独的或组合的XG-102和XG-414治疗的耐受性。显示了平均体重和平均体重变化±SD。MBWC％对应于考虑的日子与第一次治疗的日子(DIO)之间的平均体重的变化。
[0344] 图73显示实施例31小鼠的长久存活曲线，由此显示直到处死日(D171)每组存活的小鼠的比例。计算中排除在D67处死用于解剖的小鼠。将小鼠按照Q4Dx4治疗时间表用XG-102以所示的剂量治疗，在D10和D41重复两次。
[0345] 图74显示实施例31，通过显微镜评价在D67或在D67与最终处死日之间处死的小鼠观察到的肿瘤侵入，以柱状图表示。肿瘤存活水平以图例所示的4种不同的类别分类。
[0346] 图75显示实施例32，在抗肿瘤活性实验过程中携带PC-3肿瘤的小鼠的评价肿瘤体积。在D33，3组动物(每组5只)用赋形剂和XG-102(0.1和1mg/kg/inj，Q4Dx4)进行治疗。
[0347] 图76显示实施例33，在用赋形剂或按照Q1Dx14治疗时间表用X0-102以0.1和1mgl/kg/adm.治疗的PO或SC的不同组中，在小鼠盲肠进行HCT 116肿瘤异种移植后二十六天，在肝内或在其周围(肝门)观察到的转移瘤侵入的柱状图。按图例所述进行显微镜观察的分类。
[0348] 图77显示实施例34，在白化病大鼠右眼中的视网膜电描记术(ERG)测量。实施例
[0349] 实施例1：鉴定JNK抑制剂序列
[0350] 通过已知的JNK结合结构域JBDs之间的序列比对鉴定对于JNK有效相互作用重要的氨基酸序列。在IB1[SEQ ID NO：13]、IB2[SEQ ID NO：14]，c-Jun[SEQ ID NO：15]与ATF2[SEQ ID NO：16]的JBDs之间的序列比较限定了一段弱保守的8个氨基酸的序列(见图1A)。由于在结合JKN方面，IB1和IB2的JBDs的有效性大约是c-Jun或ATF2的100倍(Dickens等人Science 277：693(1997)，有理由得出IB1与IB2之间的保守残基必定对于赋予最大结合是重要的。IB1与IB2的JBDs之间的比较限定了两个在这两个序列之间高度保守的七个和三个氨基酸的结构单元。
[0351] 这两个结构单元包含在L-IB1(s)[SEQ ID NO：1]中19个氨基酸的肽序列内，并且出于比较原因还显示在来源于IB1[SEQ ID NO：17]的23个氨基酸的肽序列内。这些序列显示在图1B中，L-IB1序列中的破折号表示为比对保守残基与L-IB1(s)在该序列中的缺口。
[0352] 实施例2：制备JNK抑制剂融合蛋白
[0353] 通过经由两个脯氨酸残基组成的接头将SEQ ID NO：1的C端共价连接到SEQ ID NO：5所述的来源于HIV-TAT4g 57的10个氨基酸长的载体肽(Vives等人，J Biol.Chem.272：16010(1997))的N端而合成SEQ ID NO：9所述的JNK抑制剂融合蛋白。该接头用来允许最大的灵活度，并且防止不需要的二级结构变化。还制备基本构建体，并且分别命名为L-IB1(s)(SEQ ID NO：1)和L-TAT[SEQ ID NO：5]。
[0354] 相应地合成SEQ ID NO：11所述的所有D逆反肽。还制备基本构建体，并且分别命名为D-IB1(s)[SEQ ID NO：2]和D-TAT[SEQ ID NO：6]。
[0355] 通过经典Fmock合成产生SEQ ID NOs：9，10，11和12所述的所有D和L融合肽，并且通过质谱法进一步分析。最后通过HPLC纯化它们。为了确定脯氨酸接头的作用，制备两种类型的TAT肽，一种具有两个脯氨酸，一种没有两个脯氨酸。加入两个脯氨酸似乎不改变所述TAT肽的进入和在细胞内的定位。显示所述保守氨基酸残基的通用肽在图2中给出。
[0356] 实施例3：通过JBD19抑制细胞死亡
[0357] 研究IB1(s)19个氨基酸长的JBD序列对JNK生物学活性的影响。该19个氨基酸的序列N端连接绿色荧光蛋白(GFP JBD19构建体)，并且评价该构建体对IL1诱导的胰腺β细胞凋亡的影响。在之前表明该凋亡模型通过转染JBD1-280而被阻断，而本领域已知的ERK1/2或p38的特异性抑制剂没有防止该凋亡。
[0358] 合成对应于JBD19并且包含19个氨基酸的保守序列的寡核苷酸以及在完全保守的区域突变的序列，并且直接插入到编码绿色荧光蛋白(GFP)的pEGFP-N1载体(购自Clontech)的EcoRI和SalI位点中。将产生胰岛素的TC-3细胞在补充有10％胎牛血清、100μg/mL链霉素、100单位/mL青霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养。用所示的载体转染产生胰岛素的TC-3细胞，并且向细胞培养基中加入IL-1(10ng/mL)。在加入IL-1后48小时使用倒置荧光显微镜计数凋亡细胞的数目。通过细胞质的特征性“起泡(blebbing out)”区分凋亡的细胞与正常的细胞，并且在两天后计数。
[0359] GFP是用作对照的绿色荧光蛋白表达载体；JBD19是表达与来源于IB1的JBD的19个氨基酸的序列连接的嵌合GFP的载体；JBD19Mut是与GFP-JBD19相同的载体，但是具有图1B所示的在四个保守残基处突变的JBD；并且JBD1-280是与完整的JBD(aa 1-280)连接的GFP载体。表达GFP-JBD19的载体与完整JBD1-280一样有效地防止IL-1诱导的胰腺细胞凋亡。
[0360] 作为另外的对照，在完全保守的IB1(s)残基处突变的序列具有极大减少的防止凋亡的能力。
[0361] 实施例4：TAT-IB1(s)肽的细胞输入
[0362] 评价TAT与TAT-IB1(s)肽(″TAT-IB肽″)的L-和D-对映体形式进入细胞的能力。L-TAT，D-TAT，L-TAT-IB1(s)，和D-TAT-IB1(s)肽[分别为SEQ ID NOs：5，6，9和12]通过在N端添加与荧光素缀合的甘氨酸残基而进行标记。将标记的肽(1μM)添加到TC-3细胞培养物中，将其如实施例3所述进行维持。在预先确定的时间，将细胞用PBS洗涤，并且在荧光显微镜下检查之前在冰冷的甲醇-丙酮(1∶1)中固定五分钟。利用荧光素标记的BSA(1μM，12摩尔/摩尔BSA)作为对照。结果证明所有上述荧光素标记的肽在加入培养基中时都有效地、快速地(少于五分钟)进入细胞。相反，荧光素标记的牛血清白蛋白(1μM BSA，12摩尔荧光素/摩尔BSA)不进入细胞。
[0364] 1周后，来自全部-D逆反肽的荧光信号仍然非常强，并且在治疗后2周，该信号仅略微减少。
[0365] 实施例5：c-JUN、ATF2和Elk1磷酸化的体外抑制
[0366] 在体外研究所述肽对其靶转录因子的JNKs-介导的磷酸化的影响。使用转录和翻译兔网织红细胞裂解试剂盒(TRANSCRIPTION AND TRANSLATION rabbit reticulocyte lysate kit，Promega)产生重组的且未活化的JNK1，JNK2和JNK3，并且用于使用c-Jun、ATF2和Elk1(单独的或与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合)作为底物的固相激酶测定中。进行剂量反应研究，其中L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽(0-25μM)与在反应缓冲液(20mM Tris-乙酸，1mM EGTA，10mM对硝基苯基磷酸(pNPP)，5mM焦磷酸钠，10mM p-甘油磷酸酯，
1mM二硫苏糖醇)中的重组JNK1、JNK2或JNK3激酶混合20分钟。然后，通过加入10mM
33
MgCl2和5pCi P--dATP与1μg的GST-Jun(aa 1-89)、GST-AFT2(aa 1-96)或GST-ELK1(aa
307-428)起始激酶反应。GST-融合蛋白购自Stratagene(La Jolla，CA)。
1mM二硫苏糖醇)中的重组JNK1、JNK2或JNK3激酶混合20分钟。然后，通过加入10mM
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MgCl2和5pCi P--dATP与1μg的GST-Jun(aa 1-89)、GST-AFT2(aa 1-96)或GST-ELK1(aa
307-428)起始激酶反应。GST-融合蛋白购自Stratagene(La Jolla，CA)。
[0367] 还向所述混合物中加入10μL谷胱甘肽-琼脂珠子。然后通过在变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离反应产物。将凝胶干燥，随后暴露于X-射线胶片(Kodak)。在低至2.5μM的TAT-IB(s)肽剂量观察到对JNKs引起的c-Jun、ATF2和Elk1磷酸化的接近完全的抑制。然而，一个显著的例外是不存在对Elk1的JNK3磷酸化的TAT-IB(s)抑制。总之，TAT-IB1(s)肽在抑制其靶转录因子的JNK家族磷酸化方面表现出优越的作用。
按上文所述分析D-TAT，D-TAT-IB1(s)和L-TAT-IB1(s)肽(0-250μM剂量研究)抑制重组JNK1、JNK2和JNK3对GST-Jun(aa 1-73)的磷酸化的能力。总之，D-TAT-IB1(s)肽减少c-Jun的JNK-介导的磷酸化，但是其有效性水平比L-TAT-IB1(s)低约10-20倍。
按上文所述分析D-TAT，D-TAT-IB1(s)和L-TAT-IB1(s)肽(0-250μM剂量研究)抑制重组JNK1、JNK2和JNK3对GST-Jun(aa 1-73)的磷酸化的能力。总之，D-TAT-IB1(s)肽减少c-Jun的JNK-介导的磷酸化，但是其有效性水平比L-TAT-IB1(s)低约10-20倍。
[0368] 实施例6：抑制活化的JNKs对c-JUN的磷酸化
[0369] 使用GST-Jun破坏来自UV光照射的HeLa细胞或IL-1处理的PTC细胞的JNKs来评价本文定义的L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽对由应激刺激激活的JNKs的作用。PTC细胞按上文所述进行培养。HeLa细胞培养在补充有10％胎牛血清、100μg/mL链霉素，100单位/ml青霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中。在用于细胞提取制备前1小时，将PTC细胞2
按上文所述用IL 活化，而HeLa c细胞用UV光(20J/m)活化。通过将细胞培养物刮到裂解缓冲液(20mM Tris-乙酸，1mM EGTA，1％Triton X-100，10mM对硝基苯基磷酸，5mM焦磷酸钠，10mMP-甘油磷酸酯，1mM二硫苏糖醇)中而从对照、UV光照射的HeLa细胞和IL-1处理的TC-3细胞制备细胞提取物。通过在SS-34 Beckman转子中以15,000rpm离心五分钟而去除碎片。将100μg提取物用1μg GST-jun(氨基酸1-89)和10μL谷胱甘肽-琼脂糖珠子(Sigma)在室温温育1小时。用刮擦缓冲液洗涤四次后，将珠子在补充有L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽(25μM)的相同的缓冲液中重悬20分钟。然后，通过加入10mM MgCl2和
33
5pCi P-γ-dATP起始激酶反应，并且在30℃温育30分钟。
按上文所述用IL 活化，而HeLa c细胞用UV光(20J/m)活化。通过将细胞培养物刮到裂解缓冲液(20mM Tris-乙酸，1mM EGTA，1％Triton X-100，10mM对硝基苯基磷酸，5mM焦磷酸钠，10mMP-甘油磷酸酯，1mM二硫苏糖醇)中而从对照、UV光照射的HeLa细胞和IL-1处理的TC-3细胞制备细胞提取物。通过在SS-34 Beckman转子中以15,000rpm离心五分钟而去除碎片。将100μg提取物用1μg GST-jun(氨基酸1-89)和10μL谷胱甘肽-琼脂糖珠子(Sigma)在室温温育1小时。用刮擦缓冲液洗涤四次后，将珠子在补充有L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽(25μM)的相同的缓冲液中重悬20分钟。然后，通过加入10mM MgCl2和
33
5pCi P-γ-dATP起始激酶反应，并且在30℃温育30分钟。
[0370] 然后通过在变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离反应产物。将凝胶干燥，并且随后暴露于X-射线胶片(Kodak)。在这些实验中，所述TAT-IB(s)肽有效地防止活化的JNKs对c-Jun的磷酸化。
[0371] 实施例7：通过本文定义的TAT-IB(s)肽在体外抑制c-JUN的磷酸化
[0372] 为了确定本文定义的细胞渗透肽能否在体内阻断JNK信号传导，我们使用异源GAL4系统。将按上述培养的HeLa细胞用5xGAL-LUC报道子载体以及包含连接到GAL4 DNA-结合结构域上的c-Jun活化结构域(氨基酸1-89)的GAL-Jun表达构建体
(Stratagene)共转染。通过共转染表达直接的上游激酶MKK4和MKK7的载体实现JNK的活化(见Whitmarsh等人，Science 285：1573(1999))。简言之，使用DOTAP(Boehringer
5
Mannheim)按照供应商的使用说明在3.5-cm培养皿中用质粒转染3x10个细胞。对于涉及GAL-Jun的实验，20ng的质粒与1μg的报道子质粒pFR-Luc(Stratagene)和0.5μg的MKK4或MKK7表达质粒一起转染。转染后三小时，更换细胞培养基，并且加入TAT和TAT-IB1(s)肽(1μM)。在针对蛋白含量标准化后，在16小时后，使用购自Promega的“双报道子系统”测量荧光素酶活性。加入TAT-IB1(s)肽阻断在MKK4和MKK7介导的JNK活化后的c-Jun活化。由于HeLa细胞表达JNK1与JNK2同种型，但不表达JNK3，我们用JNK3转染细胞。同样地，所述TAT-IB(s)肽抑制JNK2介导的c-Jun活化。
(Stratagene)共转染。通过共转染表达直接的上游激酶MKK4和MKK7的载体实现JNK的活化(见Whitmarsh等人，Science 285：1573(1999))。简言之，使用DOTAP(Boehringer
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Mannheim)按照供应商的使用说明在3.5-cm培养皿中用质粒转染3x10个细胞。对于涉及GAL-Jun的实验，20ng的质粒与1μg的报道子质粒pFR-Luc(Stratagene)和0.5μg的MKK4或MKK7表达质粒一起转染。转染后三小时，更换细胞培养基，并且加入TAT和TAT-IB1(s)肽(1μM)。在针对蛋白含量标准化后，在16小时后，使用购自Promega的“双报道子系统”测量荧光素酶活性。加入TAT-IB1(s)肽阻断在MKK4和MKK7介导的JNK活化后的c-Jun活化。由于HeLa细胞表达JNK1与JNK2同种型，但不表达JNK3，我们用JNK3转染细胞。同样地，所述TAT-IB(s)肽抑制JNK2介导的c-Jun活化。
[0373] 实施例8：合成全部-D逆反IB(s)肽及其变体
[0374] 本发明的肽可以是以反式合成的全部-D氨基酸肽，用于防止天然的蛋白水解(即，全部-D逆反肽)。本发明的全部-D逆反肽将为肽提供与天然肽相似的功能特性，其中组成氨基酸的侧基对应于天然肽比对，但是将保留蛋白酶抗性主链。
[0375] 本发明的逆反肽是使用D-氨基酸通过将所述氨基酸连接到肽链中而合成的类似物，从而使所述逆反肽类似物中的氨基酸序列与所选的作为模型的肽的氨基酸序列完全相反。为了举例说明，如果天然存在的TAT蛋白(由L-氨基酸形成)具有序列GRKKRRQRRR[SEQ ID NO：5]，则该肽的逆反肽类似物(由D-氨基酸形成)将具有序列RRRQRRKKRG[SEQ ID NO：6]。合成D-氨基酸链形成逆反肽的方法在本领域中是公知的(例如参见Jameson等人，Nature，368，744-746(1994)；Brady等人，Nature，368，692-693(1994)；Guichard等人，J.Med.Chem.39，2030-2039(1996))。具体地，通过经典F-mock合成产生SEQ ID NOs 2，4，6，8，11-12，18，20，22和25-26所述的逆肽，并且通过质谱法进一步分析。最后通过HPLC纯化它们。
[0376] 由于天然肽固有的问题是被天然蛋白酶降解和固有的免疫原性，因此将制备的本发明的异型二价或异型多价化合物，以包括需要的肽的“逆反异构体”。因此，保护所述肽抵抗天然的蛋白水解通过延长半衰期和减少以主动破坏所述肽为目的的免疫反应的程度而增加该特异性的异型二价或异型多价化合物的有效性。
[0377] 实施例9：全部-D逆反IB(s)肽及其变体的长期生物学活性
[0378] 当与天然L-氨基酸类似物相比时，对包含D-TAT-IB(s)逆反物的肽异型缀合物(参见上述嵌合序列)预测长期的生物学活性，这归功于保护D-TAT-IB(s)肽抵抗天然蛋白酶的降解，如实施例5中所示。
[0379] 分析了D-TAT-IB1(s)肽对IL-1诱导的胰腺β细胞死亡的抑制作用。按上述将TC-3细胞用一次单一的添加的所示的肽(1，μM)温育30分钟，然后加入IL-1(10ng/ml)。
[0380] 然后，在用IL-1温育两天后，使用碘化丙啶和Hoechst 33342核染色计数凋亡的细胞。对每次实验计数最少1,000个细胞。显示平均值的标准误差(SEM)，n＝5。D-TAT-IB1肽以与L-TAT-IB肽相似的程度减少IL-1诱导的凋亡。
[0381] 还分析了D-TAT-IB1肽对IL-1P诱导的细胞死亡的长期抑制作用。将TC-3细胞如上文用一次单一的添加所示的肽(1μM)温育30分钟，然后加入IL-1(10ng/ml)，之后是每两天加入细胞因子。然后，在用IL-1温育15天后，使用碘化丙啶和Hoechst 33342核染色计数凋亡的细胞。注意，一次单一添加TAT-IB1肽没有赋予长期的保护作用。对每次实验计数最少1.000个细胞。结果，D-TAT-IB1(s)，而不是L-TAT-IB1(s)，能够赋予长期(15天)的保护作用。
[0382] 实施例10：通过按照本发明使用的L-TAT-IB1(s)肽抑制JNK转录因子
[0383] 使用AP-1双标记的探针(5′-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3′(SEQ ID NO：101)进行凝胶阻留测定。提取用或不用所示的5ng/ml TNF-α处理一小时的HeLa细胞核提取物。在加入TNF-α前30分钟加入按照本发明使用的TAT和L-TAT-IB1(s)肽。仅显示具有特异性AP-1 DNA复合物的凝胶的部分(通过使用未标记的特异性和非特异性竞争剂的竞争实验证明)。
[0384] 按照本发明使用的L-TAT-IB1(s)肽在TNF-α的存在下减少AP-1 DNA结合复合物的形成。
[0385] 实施例11：使用全部在单孔中的方法抑制HepG2细胞中内源性的JNK活性(见图3)
[0386] 在实验前一天，以3’000个细胞/孔接种HepG2细胞。然后，加入增加浓度的白介素-1[IL-1βv)]或肿瘤坏死因子[TNFα](a)以激活JNK 30分钟。将细胞在20mM Hepes，0.5％吐温pH 7.4中裂解，并且加工以用于Alpha筛选JNK。(b)Z’关于10ng/ml IL-1诱导的JNK活性，并且在384孔/平板(n＝96)中测量。(c)用化学JNK抑制剂[星形孢菌素(staurosporin)和SP600125]抑制内源性IL-1β-诱导的JNK活性。(d)SEQ ID NO：9所述的肽抑制剂L-TAT-IB1(s)(此处缩写为L-JNKi(v))和SEQ ID NO：11所述的D-TAT-IB1(s)(此处缩写为D-JNKi)和JBDs(对应于不含TAT序列的L-JNKI)对IL-1依赖性JNK活性的影响。所有的组由三次独立的实验表示(n＝3)。
[0387] 方法：Alpha筛选(AlphaScreen)激酶测定
[0388] 原理：Alpha筛选是一种用于以微量平板形式研究生物分子相互作用的基于非放射性珠子的技术。缩写ALPHA表示放大的发光邻近性同源性测定(Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay)。其涉及这样的生物学相互作用，即使“供体”和“接受体”珠子紧密靠近，然后化学反应级联起作用产生放大的信号。当在680nm进行激光激发时，在“供体”珠子上的光敏剂(酞菁)将环境中的氧转化为激发的单线状态。在其4μsec的半衰期内，该单线氧分子能够在溶液中扩散多达约200nm。并且如果接受体珠子在该邻近距离内，所述单线氧与“接受体”珠子中的二甲基噻吩衍生物反应，产生在370nm处的化学发光，该化学发光进一步激活同一“接受体”珠子内包含的荧光团。激发的荧光团随后发射520-620nm处的光。在不存在接受体珠子的条件下，单线氧开始回到基态，并且不产生信号。
[0389] 首先，将激酶试剂(B-GST-cJun，抗P-cJun抗体和活性JNK3)稀释在激酶缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，100μM Na3VO4，0.01％吐温-20)中，并且添加到孔中(15μl)。然后，将反应物在存在10μM ATP的条件下在23℃温育1小时。通过加入10μl稀释在检测缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4，20mM NaCl，80mM EDTA，0.3％BSA)中的珠子混合物(蛋白质A接受体20μg/ml和链霉抗生物素蛋白供体20μg/ml)，然后在暗处在23℃再温育一小时，而进行检测。为了测量JNK内源性活性，如上文所述进行激酶测定，不同之处在于用细胞裂解物替代活性JNK3，并且在细胞裂解后加入反应激酶成分。B-GST-cjun和P-cJun抗体以相同的浓度使用，而ATP以50μM而不是10μM使用。直接在Fusion或En Vision装置上分析Alpha筛选信号。
[0390] 实施例12：确定全部-D逆反IB(s)肽及其变体在治疗病毒感染-水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)中的活性
[0391] 按照本发明使用的IB(s)肽和全部-D逆反IB(s)肽的活性的确定在培养的宿主细胞(人包皮成纤维细胞(HFFs))中使用JNK抑制剂肽XG-102(SEQ ID NO：11)作为测试化合物进行检测。病毒是需要功能性细胞环境来完成其生命周期的专性细胞内寄生菌；濒死的细胞不支持病毒复制。另外，细胞功能抑制剂可能是对细胞有毒的，其能够非特异性地防止病毒生长。因此，有病或濒死的宿主细胞可能表现出非特异性减少的病毒滴度。由于这可能产生假结果，因此先进行细胞毒性测定，确定所培养的细胞对测试化合物的耐受性。然后，进行蚀斑减少测定，之后关于被感染的细胞中的病毒性蛇串疮病毒(Viral Zoster Virus，VZV)检测JNK抑制剂肽XG-102(SEQ ID NO：11)的活性。
[0392] A)确定全部-D逆反IB(s)肽的细胞毒性：
[0393] 为了确定毒性，将培养的细胞(人包皮成纤维细胞(HFFs))接种在96孔组织培养平板中。加入包含DMSO(以与5μM XG-102(SEQ ID NO：11)相同的水平)的培养基或几种浓度(1，2和5μM)的XG-102(SEQ ID NO：11)24小时。然后，进行中性红测定。用于细胞毒性测定的中性红比色测定(以6次重复的设定)用来设定后续功效测定(如在Taylor等人，2004，J.Virology，78：2853-2862中进行的)的最大剂量。活细胞吸附中性红，并且因此吸光度水平是细胞存活力和数量的定量量度。中性红摄入与细胞数目成正比，并且还反映正常的胞吞作用。因此，在0或24小时向培养基中加入中性红的短暂脉冲。在固定和提取后，加入染料，并且在ELISA平板读数仪中在540nm测量每份样品中的染料量(见图4)。与单独的DMSO稀释剂(对照)相比，使用任何量的XG-102(SEQ ID NO：11)都没有观察到细胞毒性，并且细胞生长没有受到限制。因此，1μM的标准浓度对HFF细胞没有作用，并且更高的剂量也是被良好耐受的。
[0394] B)评价XG-102(SEQ ID NO：11)针对水痘带状疱疹病毒(VZV)的抗病毒作用的蚀斑减少测定
[0395] 为了确定XG-102(SEQ ID NO：11)是否具有剂量依赖性的抗病毒作用，检测了围绕标准1μM剂量的一定范围的浓度。在该蚀斑减少测定中，将24孔平板中汇合的人包皮成纤维细胞(HFFs)与VZV-感染的HFFs以1∶100的比率(感染复数MOI＝0.01)温育，并且吸附到细胞中2小时。洗掉过量的病毒，并且加入含有0(仅有DMSO)，0.5，1或2μM XG-102(SEQ ID NO：11)的培养基。在该时间取出一份样品测量初始感染水平；其中每个孔包含～150pfu。24小时后，将一式两份孔用胰蛋白酶消化，然后将细胞混悬液一式三份滴定到MeWo细胞单层上来确定每份样品中VZV-感染的细胞的数目。在非限制性生长过程中，由于其是通过细胞-细胞传播繁殖的，因此VZV通常在1天增加10倍。这是对仅用DMSO处理的培养物所观察到的，其产生1200±430pfu(图5)。确定的结果如下所述：
[0396]XG-102(SEQ ID NO：11) VZV传播(pfu)±SD
0μM(DMSO) 1233±432
0.5μM 260±53
1.0μM 212±48
2.0μM 312±79
0μM(DMSO) 1233±432
0.5μM 260±53
1.0μM 212±48
2.0μM 312±79
[0397] 因此，XG-102(SEQ ID NO：11)在所有检测的浓度都具有强抗病毒作用，VZV产量接近200-300pfu。使用这些结果的图内插EC50，经计算，约0.3μM XG-102(SEQ ID NO：11)引起VZV产量减少50％。
[0398] 从细胞毒性和功效数据，计算初级选择指数(Tox/EC50)为5.0μM/0.3μM，其给出的值为～17，其中，由于XG-102(SEQ ID NO：11)的浓度没有接近将杀死50％的细胞，认为真正的SI甚至更高。
[0399] C)测量在使用了XG-102(SEQ ID NO：11)的人包皮成纤维细胞(HFFs)中的水痘带状疱疹病毒(VZV)复制
[0400] 为了确定XG-102防止水痘带状疱疹病毒(VZV)在使用了XG-102(SEQ ID NO：11)的人包皮成纤维细胞(HFFs)中的复制的最小有效剂量，将汇合的HFFs单层接种VZV-BAC-Luc毒株2小时，然后用浓度为0.25、0.5或1.0μM的XG-102(SEQ ID NO：11)或用阴性对照(XG-100，1.0μM)处理24小时。通过荧光素酶测定测量病毒产量。样品一式三份，显示平均发光；误差条表示平均数的标准差。
[0401] 结果，在存在阴性对照(仅有Tat肽)的条件下，VZV复制是正常的，XG-102(SEQ ID NO：11)以所检测的最低浓度0.25μM防止VZV复制。在该实验中不能确定最低有效剂量。尽管还不知道VZV为什么在复制过程中以来JNK活性，但是似乎存在对该酶的重要需要。因此，低浓度(0.25μM)的XG-102(SEQ ID NO：11)足以完全阻断在培养物中传播的VZV。对于这种作用的一种可能的解释是这一量的XG-102(SEQ ID NO：11)结合被感染的细胞中的所有JNK分子。备选地，0.25μM XG-102(SEQ ID NO：11)可以减少JNK活性低于最适于VZV复制的阈值水平。该实验的结果总结在图6中。
[0402] 实施例13：确定全部-D逆反IB(s)肽及其变体在治疗慢性阻塞性肺病(COPD)中的活性
[0403] 为了确定示例性的全部-D逆反IB(s)肽XG-102(SEQ ID NO：11)在治疗慢性阻塞性肺病(COPD)中的活性，在博来霉素诱导的急性肺部炎症和纤维化的动物模型中使用XG-102(SEQ ID NO：11)。博来霉素诱导的炎症和纤维化的方法之前在文献中记载过。本实验的目的是研究皮下(s.c.)途径的XG-102(SEQ ID NO：11)对博来霉素诱导的炎症和纤维化中支气管肺泡灌洗液(BAL)和肺中嗜中性粒细胞招募的影响：
[0404] -在单次博来霉素(10mg/kg)给药后1天
[0405] -在第10天，发生了纤维化
[0406] 1)方法和实验步骤
[0407] 随着单次鼻内给药博来霉素，皮下给予两种剂量的测试化合物XG-102(SEQ ID NO：11)和赋形剂对照，并且在1天和10天后分析小鼠。模型中所用的动物是每组10只C57BL/6小鼠(8周龄)。实验组包括赋形剂，0.001mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)和0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)，并且治疗由在博来霉素给药之前进行的然后每3天进行的重复的皮下XG-102(SEQ ID NO：11)给药组成。24小时的急性肺部炎症通过BAL灌洗液、细胞学、细胞计数和肺髓过氧化物酶活性监测。将所述化合物的作用与赋形剂对照进行比较。在单次剂量的博来霉素后第10天使用苏木精和曙红染色组织学评估肺纤维化。
[0408] 1.1)博来霉素给药
[0409] 在光氯胺酮-xylasine麻醉下，通过以40μL的体积鼻滴注经由呼吸道给予购自Bellon Laboratories(Montrouge，France)的在盐水中的硫酸博来霉素(10mg/kg体重)或盐水。用于博来霉素诱导的炎症和纤维化的博来霉素给药的组包括：赋形剂，0.001mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)和0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)。用于博来霉素诱导的炎症的途径是皮下(s.c.)途径，并且给药以单一剂量发生。用于博来霉素诱导的纤维化的途径是皮下(s.c.)途径，并且给药在10天内发生3次。
[0410] 1.2)支气管肺泡灌洗液(BALF)
[0411] 切开气管后，插入塑料套管，并且用加热至37℃的0.3ml PBS清洗空隙。将收集的样品分成两个级分：第一个(1ml，对应于前2次灌洗)用于调节剂测量，第二个用于细胞确定(4ml)。将第一个级分离心(600g，10min)，并且分出上清，保存在-80℃直到进行调节剂确定时。然后，将细胞沉淀物重悬在0.4ml无菌NaCl，0,9％中，并且与第二级分汇合用于细胞计数。
[0412] 1.3)肺匀浆
[0413] BAL后，摘下整个肺，并放置在具有1ml PBS的微型管(Lysing matrix D，Q Bio Gene，Illkrich，France)中，使用 系统(FP120，Q Bio Gene，Illkrich，France)制备总肺组织提取物，然后将提取物离心，并将上清在调节剂测量和用Sircol胶原测定(France Biochem Division，France)进行胶原测定之前保存在-80℃。
[0414] 1.4)细胞计数和确定
[0415] 使用Malassez血球计确定在BAL液中的总细胞计数。在用MGG Diff-quick(Dade Behring AG)染色后在细胞离心涂片制备物(Cytospin 3，Thermo Shandon)上进行分差异性细胞计数(Differential cell counts)。差异性细胞计数使用标准形态标准在200个细胞上进行。
[0416] 1.5)TNF测量
[0417] 使用ELISA测定试剂盒(Mouse DuoSet，R&D system，Minneapolis，USA)按照供应商的使用说明确定BALF中的TNF水平。结果以pg/ml报告。
[0418] 1.6)MPO-测量
[0419] 施用XG-102时测量MPO-水平。在该实验中，在博来霉素后，没有显著诱导MPO。此外，XG-102对肺中的MPO水平没有影响。
[0420] 1.7)组织学
[0421] BAL和肺灌注之后，将大肺叶固定在4％缓冲的甲醛中用于标准显微镜分析。3-m的切片用苏木精和曙红(H&E)染色。
[0422] 2.)结果
[0423] A)第一研究：博来霉素(BLM)诱导的急性肺部炎症
[0424] 组：赋形剂，XG-102(SEQ ID NO：11)0.001mg/kg和XG-102(SEQ ID NO：11)0.1mg/kg
[0425] 途径：皮下(s.c.)途径，单次剂量
[0426] a)在支气管肺泡灌洗空间的细胞招募
[0427] 在炎症阶段过程中，0.1mg/kg的XG-102(SEQ ID NO：11)显著减少嗜中性粒细胞招募和招募的总细胞数目。0.001mg/kg的XG-102(SEQ ID NO：11)对进入到支气管肺泡空间的嗜中性粒细胞招募或其他细胞类型没有影响(一次代表性实验，n＝5只小鼠/组；*，p＜0.05；**，p＜0.001)。
[0428] b)在肺匀浆物中用MPO在肺部招募细胞
[0429] 髓过氧化物酶(MPO)在宿主防御系统中起重要作用。该140kDa的蛋白由两条53kDa的重链和两条15kDa的轻链构成，最先在二十世纪六十年代(1960s)发现。响应白细胞活化由嗜中性粒细胞和单核细胞释放的MPO允许将过氧化氢和氯离子转化为次氯酸(HOCl)，其为一种强氧化剂。尽管MPO在防御系统中作为重要的目的，但是多种研究表明MPO还在几种炎症病况中起作用，其中，例如，升高的MPO水平已经与冠状动脉疾病相关联。
此外，组织MPO水平反映嗜中性粒细胞活化的状态并且给出嗜中性粒细胞组织浸润的指征。
此外，组织MPO水平反映嗜中性粒细胞活化的状态并且给出嗜中性粒细胞组织浸润的指征。
[0430] 在本实验中，在博来霉素给药后没有显著诱导MPO。因此，XG-102(SEQ ID NO：11)对肺部的MPO水平没有影响(见图7)。
[0431] c)TNF测量
[0432] 当测量TNF水平时，尽管在BLM给药后TNF水平非常低，仍然观察到在XG-102(SEQ ID NO：11)施用后BALF中TNF水平减少的趋势(见图8)。
[0433] d)结论
[0434] 可以观察到，0.1mg/kg的XG-102(SEQ ID NO：11)减少支气管肺泡空间的嗜中性粒细胞和总细胞招募并且诱导减少TNF水平的趋势。并且，组织学切片研究表明支气管周空间中炎性细胞积聚的减少。因此，可以推出XG-102(SEQ ID NO：11)减少博来霉素-诱导的炎症。
[0435] 按照获得的结果，另外在纤维化模型中进行本实验。
[0436] B)第二研究：博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化
[0437] 组：赋形剂，XG-102(SEQ ID NO：11)0.001mg/kg和XG-102(SEQ ID NO：11)0.1mg/kg
[0438] 途径：皮下(s.c.)途径，10天3次
[0439] a)在支气管肺泡灌洗空间的细胞招募
[0440] 在炎症阶段(在该点以淋巴细胞招募为特征)过程中，0.001mg/kg的XG-102(SEQ ID NO：11)显著减少淋巴细胞招募和招募的总细胞数目。0.1mg/kg的XG-102(SEQ ID NO：11)没有影响(n＝5只小鼠/组；*，p＜0.05；**，p＜0.001)(见图9)。
[0441] a)组织学
[0442] 将3μm的肺切片用苏木精和曙红染色。在BLM给药后10天观察炎性细胞积聚、纤维化面积、肺结构的丧失。在施用低剂量的(0.001mg/kg)而不是高剂量的(0.1mg/kg)XG-102后观察到这些参数的减少(见图10)。
[0443] b)结论：
[0444] 可以推出，XG-102(SEQ ID NO：11)以0,001mg/kg的低剂量施用3次减少博来霉素-诱导的晚期炎症，特别是在该时间观察到的淋巴细胞招募。此外，测试的物质以该剂量施用3次减弱博来霉素-诱导的纤维化。可能观察到具有更保存的肺结构的减少扩展的纤维化面积。
[0445] 实施例14：确定全部-D逆反IB(s)肽及其变体在治疗阿尔茨海默病中的活性[0446] 为了确定示例性的全部-D逆反IB(s)肽XG-102(SEQ ID NO：11)在阿尔茨海默病中的活性，使用行为Morris水迷宫检测和测量蚀斑负荷的免疫组织学检测与测量小鼠脑中β-淀粉样蛋白1-40和β-淀粉样蛋白 1-42水平的ELISA检测，在过表达具有London与Swedish突变的APP751的hAPP-转基因小鼠模型中评价XG-102(SEQ ID NO：11)。
[0447] a)方法
[0448] i)诱导
[0449] 设计本研究使用5月龄(±2周)雌性hAPP Tg小鼠来评价测试物质(XG-102，SEQ ID NO：11)对行为、生化和组织学标记的功效。因此，每两周或三周治疗小鼠，直到4个月，并且在治疗期间结束时，在Morris水迷宫中评价行为。在处死的脑中，采集CSF和血液。确定Tg小鼠的四份不同的脑匀浆物级分中和CSF中的Aβ40和Aβ42水平。在8只Tg动物/治疗组的皮质和海马中定量蚀斑负荷。
[0450] ii)动物
[0451] 将具有C57BL/6xDBA背景的5月龄(±2周)的雌性Tg小鼠随机分到治疗组1-3中(n＝12)。动物从5月龄开始每隔两周或每隔三周以皮下(s.c.)应用进行赋形剂或两次不同浓度的XG-102(SEQ ID NO：11)施用，并且持续多达4月。用于本研究的所有动物具有黑眼睛，并且可能性看出MWM集合之外的标志。然而，必须排除动物的视觉能力差，这在治疗开始前对本研究中包括的所有动物(包括保留的动物)在视觉平台训练(所谓的预先检测)中进行控制。如果已经确定特定动物的视觉障碍，则将从本研究中排除所述小鼠。
[0452] iii)动物鉴别和笼养
[0453] 小鼠分别通过耳部标记进行鉴别。将它们笼养在由 供应的标准化啮齿动物垫层上的分别通风的笼子(IVCs)中。每个笼子包含最多五只小鼠。按照根据国际标准撰写的JSW标准操作方法(JSW Standard Operating Procedures(SOP GEN011))保持小鼠。每个笼子通过显示下述的着色卡片鉴别：研究号，性别，动物的个体登记号(IRN)，出生日期，以及筛查日期和治疗组分配。研究过程中的温度保持在约24℃，并且相对湿度保持在约40-70％。将动物笼养在恒定的光-周期下(12小时光/暗)。动物可随意获得正常的自来水。
[0454] iv)治疗
[0455] 将40只雌性hAPP转基因小鼠在四个月内用0.1mg/kg体重/每两周或10mg/kg体重/每三周的两种剂量的测试物质XG-102(SEQ ID NO：11)(n＝12只/组)治疗或用赋形剂(n＝12)每三周一次皮下(s.c.)治疗。
[0456] v)Morris水迷宫(MWM)
[0457] 在直径为100cm的黑色圆形池中进行Morris水迷宫(MWM)任务。在22±1℃的温度下填充自来水，并且将池实际分成四个扇形。一个透明的平台(直径为8cm)放置在水表面下约0.5cm。在整个检测期间，除了预先检测，都将该平台放置在该池的西南四分之一圆中。在持续4天的训练期间前一天，动物必须进行所谓的“预先检测”(两个持续60秒的试验)，以确保每只动物的视觉能力都是正常的。只有完成该任务的动物包括在MWM检测中。在MWM任务中，每只小鼠必须在连续的四天进行三次试验。单次试验最多持续一分钟的最大值。在该时间过程中，小鼠具有发现隐藏的透明的靶标的机会。如果动物不能找到从水中出去的“路”，研究者直到或将该小鼠放置在平台上。每次试验后，允许小鼠在平台上休息10-15秒。在该时间过程中，小鼠具有在周围环境中定向的可能性。研究在暗光条件下进行，以防止追踪系统受到不利影响(Kaminski；PCS，Biomedical Research Systems)。在围绕池的壁上，固定具有黑色、粗体的几何符号(例如，圆形和方形)的海报，小鼠可以利用这些符号作为它们定位的标志。每次试验的一个游泳组由5或6只小鼠组成，以便确保约
5-10分钟的间隔时间(intertrial time)。对于定量目标四分之一圆中的逃跑潜伏期(时间[秒]-小鼠需要发现隐藏的平台由此从水中逃出的时间)、途径(到达靶标的轨迹长度(米))和停留(abidance)，使用计算机化的追踪系统。计算机与放置在池中心上方的摄像机连接。该摄像机检测固定在小鼠尾巴上的小毛夹上的发光二极管(LED)的信号。在第4天最后一次试验后一小时，小鼠必须完成所谓的探测试验(probe trial)。在这时，从池中移除所述平台，并且在一分钟的探测试验过程中没有该平台；实验者计数穿过之前的靶位置的次数。另外，计算在该四分之一圆以及另外三个四分之一圆中的停留。在本试验过程中，小鼠不能得到任何(无论如何-天然的)平台的线索。
5-10分钟的间隔时间(intertrial time)。对于定量目标四分之一圆中的逃跑潜伏期(时间[秒]-小鼠需要发现隐藏的平台由此从水中逃出的时间)、途径(到达靶标的轨迹长度(米))和停留(abidance)，使用计算机化的追踪系统。计算机与放置在池中心上方的摄像机连接。该摄像机检测固定在小鼠尾巴上的小毛夹上的发光二极管(LED)的信号。在第4天最后一次试验后一小时，小鼠必须完成所谓的探测试验(probe trial)。在这时，从池中移除所述平台，并且在一分钟的探测试验过程中没有该平台；实验者计数穿过之前的靶位置的次数。另外，计算在该四分之一圆以及另外三个四分之一圆中的停留。在本试验过程中，小鼠不能得到任何(无论如何-天然的)平台的线索。
[0458] vi)组织取样
[0459] 在治疗期结束时，并且在所有形态检测之后，将所有剩下的小鼠(n＝28)处死。因此，将所有小鼠通过SOP MET030所述的标准吸入麻醉剂(异氟醚，Baxter)进行镇静处理。通过钝剥离并且暴露枕骨大孔而获得脑脊液(CSF)。当暴露时，将巴斯德移液管插入到枕骨大孔中约0.3-1mm的深度。通过抽吸和毛细作用收集CSF，直到流动完全终止。将每份样品的两份等分试样立即冷冻，并且保存在-80℃，直到准备用ELISA技术进行进一步的分析之前。CSF取样后，将每只小鼠以屈膝仰卧位(dorsal recumbence)放置，切开胸腔，并将连接1cc注射器的26号针头插入到右心室腔中。对所述针施加轻微的抽吸，并且将血液收集到EDTA中，然后用于获得血浆。为了得到血浆，将来自每只小鼠的血液样品使用具有悬桶的转子(GH-3.8Beckman)在离心机(GS-6R Beckman)中以1,750rpm(700g)离心10分钟。将血浆冷冻并保存在-20℃直到进一步的分析。在血液取样后，将转基因小鼠用0.9％氯化钠心内灌注。快速摘下脑，并且切下小脑。将所有小鼠的右半球在新鲜制备的4％低聚甲醛/PBS(pH 7.4)中在室温浸没固定一小时。然后，将脑转移到15％蔗糖PBS溶液中
24小时以确保冷冻保存。次日，将脑在异戊烷中冷冻并保存在-80℃直到用于组织学研究(SOPMET042)。将左半球称重，并且在液氮中冷冻，保存在-80℃用于生化分析。
24小时以确保冷冻保存。次日，将脑在异戊烷中冷冻并保存在-80℃直到用于组织学研究(SOPMET042)。将左半球称重，并且在液氮中冷冻，保存在-80℃用于生化分析。
[0460] vii)确定Aβ1-40和Aβ1-42
[0461] 在每只Tg小鼠的四份不同的脑匀浆物级分中以及在CSF样品中，用ELISA技术评价Aβ1-40和Aβ1-42水平。高敏感性Aβ1-40和Aβ1-42ELISA检测试剂盒购自瑞士的The TMGenetics Company (SOP MET058)。CSF按上文所述制备。对于脑匀浆物，将冷冻的半球在包含蛋白酶抑制剂混合物的TRIS缓冲的盐水(TBS)-缓冲液(5ml)中匀浆。将1.25ml的这种初始脑TBS匀浆物保存在-80℃，1.25ml进行进一步的研究。将其余的脑匀浆物(2.5ml)离心，并且将得到的上清(＝TBS级分)等分并保存在-20℃直到用于ELISA确定。
沉淀物悬浮在Triton X-100(2.5ml)中，离心，并且将上清(＝Triton X-100级分)等分并保存在-20℃。使用SDS(2.5ml)重复这些步骤。将来自SDS级分的沉淀物悬浮在70％甲酸(0.5ml)中，然后进行离心。将得到的上清用等分的1M TRIS(9.5ml)中和，并且保存在-20℃(＝FA级分)。将四份脑匀浆物级分(TBS，Triton X-100，SDS和FA)的样品用于通过ELISA技术进行Aβ1-40和Aβ1-42确定。ELISA检测试剂盒购自瑞士的The Genetics TM
Company (SOP MET062)。可以假定TBS和Triton X-100增溶单聚体至寡聚体结构。聚合物，如初原纤维和水溶性的原纤维可以溶解在SDS和FA中。在这一方面，所有四种级分的研究还提供关于A聚合状态的认识。
沉淀物悬浮在Triton X-100(2.5ml)中，离心，并且将上清(＝Triton X-100级分)等分并保存在-20℃。使用SDS(2.5ml)重复这些步骤。将来自SDS级分的沉淀物悬浮在70％甲酸(0.5ml)中，然后进行离心。将得到的上清用等分的1M TRIS(9.5ml)中和，并且保存在-20℃(＝FA级分)。将四份脑匀浆物级分(TBS，Triton X-100，SDS和FA)的样品用于通过ELISA技术进行Aβ1-40和Aβ1-42确定。ELISA检测试剂盒购自瑞士的The Genetics TM
Company (SOP MET062)。可以假定TBS和Triton X-100增溶单聚体至寡聚体结构。聚合物，如初原纤维和水溶性的原纤维可以溶解在SDS和FA中。在这一方面，所有四种级分的研究还提供关于A聚合状态的认识。
[0462] viii)脑形态评价
[0463] 所有研究的Tg小鼠的脑组织以完全相同的方式进行处理，以避免由于该方法的变化引起的偏差。由24Tg小鼠(每组8只)的脑半球矢状切割每层20个冷冻切片(共5层)，每个厚10μm(Leica CM 3050S)，并且处理5个(每层一个)并评价蚀斑负荷的定量。五个矢状层对应Paxinos和Franklin的形态学图集“The Mouse Brain(小鼠脑)”(第
2版)所述的图104-105，107-108，111-112，115-116和118-119。第一层指定为需要包括具有其区域CA1，CA2，CA3，GDlb和GDmb的整个海马。使用单克隆人Aβ-特异性抗体
6E10(Signet)和硫黄素S染色在海马和皮质中定量评价免疫反应性。将其余未使用的脑半球或组织保留并保存在JSW CNS直到项目结束。
2版)所述的图104-105，107-108，111-112，115-116和118-119。第一层指定为需要包括具有其区域CA1，CA2，CA3，GDlb和GDmb的整个海马。使用单克隆人Aβ-特异性抗体
6E10(Signet)和硫黄素S染色在海马和皮质中定量评价免疫反应性。将其余未使用的脑半球或组织保留并保存在JSW CNS直到项目结束。
[0464] b)评价
[0465] i)行为
[0466] 在Morris水迷宫试验中，利用专门的计算机软件，对每只Tg动物测量游泳路径长度、逃跑潜伏期、游泳速度，以及在探测试验中，穿过之前的平台位置的次数和在池的每个四分之一圆中待的时间。
[0467] ii)生化评价
[0468] 利用商购的Aβ1-40和Aβ1-42ELISAs分析来自所有Tg小鼠的CSF样品以及来自脑制备物的样品。同时进行适当的标准物的测量。来自脑制备物的样品一式两份分析。由于小的样品量，CSF样品仅以单一测量进行分析。
[0469] iii)组织学
[0470] i1)测量淀粉样蛋白沉积和蚀斑负荷
[0471] 对于6E10免疫组织化学，使用下述评价方法：
[0472] aa)比较(Contrast)图片以显现切片边缘，而不对图片应用比较。
[0473] bb)交互绘制皮质轮廓和下述皮质面积的测量(＝区域面积)。
[0474] cc)交互绘制目的区域(AOI)，其中染色的目标物以基于特定强度的阈值水平(对2
于每张图片阈值水平相同)和高于8μm的尺寸进行检测。
于每张图片阈值水平相同)和高于8μm的尺寸进行检测。
[0475] dd)在平滑比较以增强信号/噪声比(对于每张图片都是相同的)后，测量每个目标物的面积，AOI中染色区域的总和以及目标物的数目。
[0476] ee)对海马重复aa)-dd)。
[0477] ff)计算平均蚀斑尺寸(＝“蚀斑总面积/蚀斑数目”)，相对蚀斑数目和面积(＝“蚀斑数目/区域面积”和“蚀斑总面积/区域面积*100”).
[0478] gg)将自动化的数据输出到Excel总分析表中，包括下述参数：图片名称，区域面积，蚀斑数目，蚀斑面积总和，相对蚀斑数目，相对蚀斑面积和平均蚀斑尺寸。注释区分别用来记录图片质量和排除标准。排除标准是失去切片的部分、多个皱纹、显著的裂缝或染色不一致性(例如，由于膨胀导致，所述膨胀可以阻碍封闭剂完全的活性)。
[0479] hh)关闭图片不用保存(保存原始数据)。
[0480] c)结果
[0481] i)整体观察
[0482] 研究中共包括40只雌性hAPP Tg小鼠。在这些小鼠中，12只动物由于未知的原因在治疗期结束之前死亡。
[0483] ii)行为结果
[0484] MWM中的空间学习仍然广泛地不受XG-102(SEQ ID NO：11)治疗的影响。0.1mg/kg治疗的小鼠在第1和第4天之间表现出具有较差的学习表现的趋势。在第1天和第4天平均表现的双因素ANOVA揭示所有组高显著性的学习(p＜0.001)，但是也有因素治疗的显著影响(p＝0.045)。然而，Bonferroni’s post检验没有得到显著性。
[0485] iii)生化结果
[0486] aa)脑匀浆物级分中的Aβ水平
[0487] 使用测试化合物XG-102(SEQ ID NO：11)的治疗不影响脑匀浆物Aβ1-40水平(见图11)。Aβ1-42水平的组差异仅在Triton X-100级分中出现。此处，与赋形剂组相比(p＜0.05)以及与高剂量组相比(p＜0.01)，用低剂量测试化合物XG-102(SEQ ID NO：11)(0.1mg/kg)治疗的动物表现出显著的减少。
[0488] bb)CSF Aβ水平
[0489] 与赋形剂组相比，用测试物质XG-102(SEQ ID NO：2)治疗后，CSF中Aβ1-40和Aβ1-42水平显著减少。对于二者，Aβ1-40与Aβ1-42p-值对于高剂量(10mg/kg)XG-102(SEQ ID NO：2)是p＜0.01并且对于低剂量XG-102(SEQ ID NO：2)是＜0.05(见图12)。
[0490] iv)脑组织学和免疫组织化学结果
[0491] aa)淀粉样蛋白沉积和蚀斑负荷
[0492] 用两种不同的方法定量蚀斑负荷。一方面，使用主要针对人淀粉样蛋白肽的AA1-17的6E10进行IHC染色，另一方面，进行标记β-折叠结构和成熟的、神经炎蚀斑核心的硫黄素S染色。首先，在所有组中测量的区域面积、皮质和海马高度一致，这表明可以排除切割与IHC方法中的问题，并且在某种程度上也排除治疗诱导的萎缩(使用这种方法，＞5％的变化可以检测到)。6E10和硫黄素S定量揭示在XG-102(SEQ ID NO：11)治疗后蚀斑中心β-折叠结构的选择性减少，而人淀粉样蛋白仍然不受治疗的影响或略微增加。详细来说，在10mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)治疗的小鼠中，相对于赋形剂，皮质6E10IR蚀斑负荷增加，然而，对海马蚀斑的数目达到显著性水平。图13和14显示，与6E10IHC相反，所述XG-102(SEQ ID NO：11)治疗导致海马硫黄素S阳性蚀斑数目以及面积百分数(蚀斑数目：对于10mg/kg p＜0.05，对于0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)p＜0.01)的负剂量依赖性减少。0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)治疗还减少平均蚀斑尺寸，然而，该作用在ANOVA(未配对的双尾T检验：p＝0.074)中没有达到显著性水平。对皮质蚀斑没有这些作用，其是一种更可能是由于海马中比皮质晚的蚀斑病理学发作导致的情形。在五月龄开始治疗准确地命中海马中蚀斑沉积的时间点，而皮质蚀斑在三月龄时在用于定量的放大倍数下开始变得明显。定性地，6E10与硫黄素S染色的蚀斑的比例增加，并且在双重标记的切片中可观察到的β-折叠蚀斑核心在尺寸上变得更小。总之，这些数据支持XG-102(SEQ ID NO：11)治疗起作用分别抵抗蚀斑沉积的早期阶段中的β-折叠形成和蚀斑核心中的β折叠形成。
[0493] d)作用总结和结论
[0494] ·在Morris水迷宫中测量的空间导航保持广泛地不受治疗的影响。0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)的治疗导致第一训练日与最后训练日之间略差的学习表现。
[0495] ·除了Triton X-100级分中的减少，在0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)组中，Aβ1-40与Aβ1-42脑水平保持稳定。
[0496] ·对于两种剂量和片段，在CSF中可检测到Aβ水平的减少。
[0497] ·在6E10定量中，XG-102(SEQ ID NO：11)治疗导致较高剂量组中人β淀粉样蛋白的增加趋势，这与在Aβ ELISA中获得的数据相一致。
[0498] ·与在XG-102(SEQ ID NO：11)治疗后通过硫黄素S染色检测到的海马β-折叠负荷剂量依赖性减少(以低剂量0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO：11)在更高程度上减少)相反，而皮质蚀斑负荷保持不变。按照在治疗开始时在海马中蚀斑沉积的年龄-依赖性的发作，这暗示对在蚀斑沉积早期的β-折叠形成的早作用。
[0499] 实施例15：确定全部-D逆反IB(s)肽及其变体在治疗2型糖尿病中的活性
[0500] 实施例15设计用来确定IB(s)肽与全部-D逆反IB(s)肽及其变体在治疗2型糖尿病中的活性，特别是通过每隔三天评价空腹血糖水平(28天)来确定2型糖尿病db/db小鼠模型中用XG-102(SEQ ID NO：11)长期治疗的作用。
[0501] a)材料和动物
[0502] i)动物
[0503] 总共二十(20)只雄性db/db小鼠(8周龄)获自Charles River(Germany)。当到达时，将动物分组笼养(n＝6-7只/组)并且供应常规的啮齿动物食物(Altromin标准#1324食物；C.Petersen，Ringsted，Denmark)和随意的水，除非另外指明。小鼠在12：12L/D循环(4：00开灯，16：00关灯)下和在控制温度与湿度的房间中笼养。
[0504] ii)分组和随机化
[0505] 在第-4天，按照血糖水平将小鼠随机分组(空腹；血糖在Biosen S线分析仪(EKF diagnostic，Germany)上测量)，以参与下述药物治疗组中的一个组(n＝6)：
[0506] 1)赋形剂组，皮下(S.C.)(生理盐水)
[0507] 2)XG-102(SEQ ID NO：11)；1mg/kg；皮下
[0508] 3)XG-102(SEQ ID NO：11)；10mg/kg；皮下
[0509] 所有列出的剂量是关于游离碱计算的。药物纯度：95.28％，肽含量：78.0％。所有的化合物以3ml/kg的体积皮下(s.c)施用。关于赋形剂对照和XG-102(SEQ ID NO：11)的配制说明如下所述：
[0510] 首先，将XG-102(SEQ ID NO：11)溶解在赋形剂中。按照下文详细所述的步骤制备制剂(浓度为0.33和3.3mg/ml，分别对应于1和10mg/kg的剂量)。考虑检测物的纯度和肽含量计算并表示浓度(倍增系数为1.346)。
[0511] ■制备储液：将冷冻干燥的测试化合物XG-102(SEQ ID NO：11)最少解冻一小时并且在赋形剂中制成1mM(对应3.823mg/mL)的储液。制备用于每个治疗日的等分试样并且保存在约-80℃。在每个治疗日进行将该储液稀释到所需要的浓度；
[0512] ■储液保存：在约-80℃；
[0513] ■稀释的制剂的保存：在室温最多保存24小时。
[0514] 在增溶之前，将粉剂保存在-20℃。储液在约-80℃的稳定性为3个月；用于动物给药的稀释的制剂在室温的稳定性为24小时。未使用的稀释的物质如果保存在4-8℃可以存储多达7天。
[0515] c)实验方法
[0516] 在适应8天后，按照所示的分组，将小鼠在04.00PM关灯之前8小时通过皮下给药在08.00AM每天治疗持续21天。然后，在第21研究日，停止最高浓度的XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)的给药，而赋形剂对照和XG-102(SEQ ID NO：2)(1mg/kg)的每日给药持续至第28研究日。从第28天直到在第111天终止，在淘汰期(不给药)观察赋形剂和XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)治疗的小鼠，而用XG-102(SEQ ID NO：2)(1mg/kg)治疗的小鼠在28天的治疗后处死。
[0517] i)血糖
[0518] 在给药后6小时通过从尾静脉采集10μl血液样品到血细胞容量计管中从7小时禁食的动物测量血糖然后在Biosen s-线分析仪(EKF-diagnostic；Germany)上分析。
[0519] ii)代谢笼
[0520] 组1+3：将小鼠放置在代谢笼中，用于记录24小时食物和水摄入以及24-小时尿和粪便产生。将小鼠分级成两个n＝6-7只的亚组，然后在第71-72研究日进行代谢表征。
[0521] iii)脂肪细胞因子组
[0522] 组1+3：在三个时机(研究日57、66和108)，使用EDTA包被的血细胞容量计管(100μl)从尾静脉采集血液。在血液离心后，收集血浆并保存在-20℃直到测量。然后，使用基于Luminex的7-plex确定下述脂肪细胞因子/细胞因子组：瘦素，抵抗素，MCP-1，PAI-1，TNF，胰岛素和白介素-6(IL-6)。
[0523] iv)终止
[0524] 组1+3(第111天)：切下下述器官并称重：腹股沟皮下脂肪，附睾脂肪，腹膜后脂肪，脑，肝，肾，脾和心脏。所有上述器官为在4％PFA中的样品，用于可能的将来的组织病理学检查。此外，取样胰腺(整块)用于可能的体视学和免疫组织化学分析，并且取样眼睛用于可能的后续视网膜病变分析。组2(第28天)：不采集组织或血浆。
[0525] c)结果
[0526] i)整体观察
[0527] 在急性给药期间，动物表现出正常的警惕性和活性水平，并且在药物治疗的动物中没有镇静的迹象。在赋形剂治疗的动物中食物和水摄入在正常范围内。然而，在大约两周给药后，在皮下组织中观察到作为与XG-102(SEQ ID NO：2)化合物的反应的结节性纤维化，在所有组C的小鼠中，这些发展成开放性伤口。在组B中，观察到轻度结节性纤维化。结果，使用注射部位的更替。在动物给药结束后，所述动物得到治愈并且结节性纤维化逐渐消失。我们在赋形剂治疗的动物中没有观察到临床作用。
[0528] ii)血糖
[0529] 空腹血糖水平(绝对的和相对的)显示在图15中。在组A和C中每隔三天测量空腹血糖直到第68天，并且规律地直到第111天终止。我们观察到，与赋形剂对照相比，用XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)治疗的糖尿病性db/db小鼠的空腹血糖水平明显而显著的(p＜0.001)减少。用XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)治疗的小鼠的空腹血糖水平达到约5mmol/L的低平台。这一作用在给药14天后明显，并且在整个研究中持续，由此在从第21天到第111天的整个淘汰期中持续。相反，在28天的给药过程中，我们没有观察到低剂量XG-102(SEQ ID NO：2)(1mg/kg)的作用。
[0530] iii)体重
[0531] 体重确定(绝对的和相对的)显示在图16中。我们观察到，与赋形剂对照相比，在用XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)治疗的小鼠中对于体重增加的明显且显著(p＜0.001)的预防。这一作用从给药第28天明显，并且保持到第111天终止那天。相反，在28天的给药过程中，我们没有观察到低剂量XG-102(SEQ ID NO：2)(1mg/kg)对体重的作用。
[0532] iv)代谢笼
[0533] 在第68研究日在代谢笼中测量的赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对24小时食物和水摄入、以及尿和粪便产生的影响显示在图17(g)和18中(对体重g标准化)。与赋形剂对照相比，尽管观察到食物摄入和尿产生减少的趋势，但是我们没有观察到XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对任意测量的参数的显著影响。
[0534] v)脂肪细胞因子
[0535] 在第57、77和108天测量的赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对胰岛素、MCP-1和IL-6血浆水平的影响显示在图19中；对tPAI-1、TNF和抵抗素血浆水平的影响显示在图20中；与赋形剂对照相比，除了血浆抵抗素水平之外(其在XG-102(SEQ ID NO：2)治疗的动物中在第77和108天显著更高)，我们没有观察到XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对任意测量的参数的显著影响。
[0536] vi)在结束时的组织重量
[0537] 赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对附睾、腹股沟皮下和腹膜后脂肪垫的组织重量的影响显示在图21中。与赋形剂对照相比，我们观察到在用XG-102治疗的小鼠中附睾(p＜0.05)和腹膜后(p＜0.01)脂肪量的显著减少。赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对脑、脾和心脏组织重量的影响显示在图22中。与赋形剂对照相比，我们没有观察到XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对这些参数的显著影响。最后，赋形剂或XG-102(SEQ ID NO：2)(10mg/kg)对肾和肝组织重量的影响显示在图23中。与赋形剂对照相比，我们观察到在用XG-102(SEQ ID NO：2)治疗的小鼠中肾(p＜0.05)和肝(p＜0.01)质量的显著减少。
[0538] 总结所述结果，施用XG-102(SEQ ID NO：11)，10mg/kg，似乎导致血糖水平的显著降低，因此，XG-102(SEQ ID NO：11)似乎是用于治疗糖尿病和升高的血糖水平的有希望的新型工具。
[0539] 实施例16：在随机的、双盲的、安慰剂对照的剂量升高的I期研究中施用给健康男性志愿者的10、40和80μg/kg XG-102(SEQ ID No.：11)的单次静脉内输注的安全性、耐受性和药物代谢动力学
[0540] 本研究的主要目的是评估对健康男性志愿者静脉内(iv)输注单一升高剂量的XG-102后XG-102的安全性和耐受性。本研究的次要目的是评估在对健康男性志愿者静脉内输注单次升高剂量的XG-102后XG-102的药物代谢动力学。剂量作为60分钟的静脉内输注施用。为了对照目的，向对照受试者施用安慰剂静脉内输注。
[0541] 这是一次单中心、随机的、双盲、安慰剂对照的、升高的单次剂量、相继的组研究。以剂量升高的次序研究三个XG-102剂量水平(10，40和80μg/kg)，在每个组内，受试者随机化，使得6名受试者接受XG-102，2名受试者接受安慰剂。在给药前3-周期间内进行筛查。对于每名受试者，给药在第0天发生。在他们从CRU离开(在给药后24小时)之前，研究者检查所有受试者的健康状况。在给药后8±2天和28±5天受试者回到CRU进行研究后评估。
[0542] 共有24名受试者(年龄为18-45岁的健康的男性受试者)，分成3组，每组8名。24名受试者加入并且完成了本研究。关于所有受试者的数据包括在安全性分析中；关于接受XG-102的所有受试者的数据包括在药物代谢动力学分析中。
[0543]
[0544] 观察到的t1/2值是短暂的。通过Cmax测量的峰暴露和通过AUC0-last测量的累积暴露随剂量增加。随Cmax剂量的增加似乎在图表检验和其剂量正常化值的几何平均数的基础上更加成线性比例，在最高80μg/kg的剂量后，其对于其余的剂量高于90％的置信区间。随AUC0-last剂量的增加从40至80μg/kg明显更加成线性比例，原因在于关于其几何平均剂量标准化值的90％置信区间不与在其他检测的剂量后的那些重合；而当比较10和40μg/kg后的值时，90％的置信区间重合，但是其在10μg/kg剂量后的几何平均剂量正常化的值低于在40μg/kg剂量后的对应90％置信区间中的所有值。
[0545] 当作为10，40或80μg/kg的单次静脉内剂量施用到健康男性受试者中时，XG-102是安全的并且良好耐受的。在接受XG-102的受试者中不利事件的发生率与在接受安慰剂的受试者中的发生率相似。在临床实验室数据、生命体征、ECGs、体格检查或眼部检查(眼底和IOP)中没有临床显著发现。
[0546] 在XG-102静脉内输注结束时，其血浆浓度迅速减少，至开始10μg/kgXG-102静脉内输注后至多2小时，至开始40μg/kg XG-102静脉内输注后至多3小时，和至开始80μg/kg XG-102静脉内输注后至多7小时，产生低于定量下限的值。测量的t1/2和MRT值是短暂的，每剂量水平的几何平均值分别在0.36至0.65小时和0.76至1.02小时的范围内。
[0547] XG-102的AUC0-last随测试的剂量范围更加成线性比例增加，对于其在40μg/kg与80μg/kg剂量之间标准化的几何平均剂量具有非重合的90％置信区间，并且对于其在10μg/kg与40μg/kg之间标准化的几何平均剂量的90％置信区间之间仅有有限的重合。
[0548] XG-102的Cmax似乎随40至80μg/kg的剂量更加成线性比例增加。在80μg/kg剂量组中几何平均剂量标准化的Cmax高于并且在关于其他剂量组中几何平均剂量标准化的Cmax的90％置信区间之外，但是在所有剂量水平中，关于几何平均剂量标准化的Cmax的90％置信区间是重合的。
[0549] 在用10和40μg/kg剂量治疗的受试者中，XG-102药效学参数的受试者间变化是中等的(大部分参数的几何平均数的CV％约在15-30％范围内，例外的是10μg/kg剂量组中的t1/2和总Vss)，但是在80μg/kg剂量组中更高，约在29-44％范围内，除了MRT(14.7％)之外。该较高的变化可能是低样品尺寸的影响或是观察到的非线性(其在该剂量更清楚)的结果。
[0550] 实施例17：使用XG-102(SEQ ID No.：11)提高猪胰岛分离结果
[0551] 目的是使用猪模型来评价XG-102(a)阻断在胰岛分离过程中发生的JNK的过度活化(导致细胞应急和死亡)的能力；(b)减少胰岛死亡的能力，着导致分离后胰岛存活力的改善。
[0552] 猪胰岛分离导致JNK的显著活化，这是在胰岛分离程序开始后～20分钟时在组织样品中最先观察到的(图33)。分析现有的数据表明，在获得和运输到分离实验室过程中在胰腺水平上以及在分离过程中在胰岛分离溶液中加入Xigen XG-102 JNK抑制剂(10微摩尔浓度)阻断JNK的活化(图34)，减少c-fos基因的相对表达(图35)，并且对新鲜分离的胰岛的存活力具有统计学显著的且重要的作用，如通过OCR/DNA(图36)和ATP/蛋白[总细胞蛋白]测量的(图37)。比较总是用来源于相同胰腺供体的配对的未治疗的对照进行。图36和37所示的胰岛存活力的数据与在分离过程中典型观察到的JNK活化的减少(图33)和得到的c-fos基因表达的减少(图35)一致。在培养7天后，存活力、JNK活化和c-fos表达的差异变得更小。
[0553] 6/6(100％)分离导致高于截点的OCR/DNA值，并且成功地移植到NHPs中(图38)。这证实在该模型中，甚至存活力的中等提高可能对制备物的可移植性具有深远的影响。基于可获得的数据，证明XG-102是一种优异的试剂可用于临床上人或猪胰岛的分离。
[0554] 猪模型与下列原因相关：(1)与大鼠或犬的胰腺相比，或猪胰腺的尺寸更接近人的胰腺；(2)认为猪胰岛是将来临床胰岛异种移植的可行性选择-因此，急需的猪胰岛分离的改进最终可能是临床相关的。
[0555] 用于来源于脑死亡供体的临床胰岛同种移植的人胰腺典型地不进行WIT，但是具有8-12小时的CIT(从获得医院运输到分离实验室所需要的时间)。
[0556] 将来自无心跳供体的人胰腺暴露于-′15分钟的WIT，并且由于考虑由WIT导致的损伤，当时没有按常规使用，并且它们还将经历8-12小时的CIT。
[0557] 从慢性胰腺炎患者摘下的用于胰岛自体移植的器官可以经历WIT并且是有限的(1-2小时的C IT)。预测在下述猪模型中报道的改善在临床自体移植情形中将甚至更大，原因在于来自慢性胰腺炎患者的胰腺典型地是发炎的并且已经收到胁迫。还预测在具有持久的冷缺血时间的临床同种情形中也是真实的，并且已经由使用不同JNK抑制剂的其他组进行了报道。JNK活化随着从胰腺获得时的时间的CIT增加。用JNK抑制剂阻断JNK活化提高胰岛产量、存活力和移植结果，并且在所检测的最长久的冷的缺血时间是最显著的。
[0558] 实施例18：使用大鼠氩激光-诱导的脉络膜新生血管化模型，XG-102(SEQ ID No.11)在减少脉络膜新生血管化中的功效
[0559] 本实施例的目的是在激光-诱导的脉络膜新生血管化(ChNV)大鼠模型中，确定XG-102以两种剂量的两次玻璃体内使用是否导致脉络膜新生血管化减少。该模型允许对测试化合物对治疗年龄相关的黄斑变性的潜在用途做出预测。
[0560] 将四十(40)只(+10只备用)有色Brown Norway大鼠分成五(5)组，每组八(8)只动物。在右眼中使用532nm氩激光视网膜凝固器(150mW六(6)个75μm-尺寸的点持续100ms)诱导脉络膜新生血管化。在第0天(刚好在诱导后)和第7天通过玻璃体内注射施用测试、参比和对照物质。在诱导后第14天和第21天对治疗的和未治疗的动物在荧光素(示踪剂)皮下注射后10分钟进行血管造影。
[0561] 在第23天处死后，获得从所有动物的接受治疗的右眼并将脉络膜扁平封固。应发起人的要求，没有进行ChNV体积的定量。
[0562] 实验设置：
[0563] XG-102：3 000μg/ml(等价于15μg/只眼睛)和300μg/ml(等价于1.5μg/只眼睛)。 Retard(4％曲安奈德)作为对照参比，对照赋形剂：盐水(0.9％NaCl)。
[0564] 动物
[0565]
[0566]
[0567] 研究设计
[0568] 将四十(40)(+十(10)只备用)有色Brown Norway品系大鼠分成五(5)组，每组8只(+2只备用)动物。在右眼中使用532nm氩激光视网膜凝固器(150mW六(6)个75μm-尺寸的点持续100ms)诱导脉络膜新生血管化。
[0569] 在第0天(在相同的麻醉下诱导新生血管化)和第7天，通过玻璃体内注射将测试项目(两个剂量，组1-2)、赋形剂和参比(5μl)施用到右眼中。在第14天和第21天在右眼中使用Heidelberg视网膜血管造影(Heidelberg’s Retinal Angiography(HRA))评价评价治疗和未治疗动物的眼底新生血管。
[0570] 下表总结了治疗组中动物的分配：
[0571]
[0572]
[0573] 动物的选择
[0574] 本研究中包括四十(40)+十(10)只备用动物。仅选择不具有明显的眼部缺陷迹象的动物。然后，在 软件中通过随机函数进行治疗组中的分配。诱导并追踪五十(50)只动物。治疗组中的随机分配确定每组八只动物和备用动物。仅当正常包括的一只或两只动物死亡、在给药程序过程中对晶状体有影响或具有角膜浑浊(由于反复的麻醉导致)时，才在结果的计算中包括这些后者动物。
[0575] 诱导新生血管化
[0576] 在第0天，通过肌内注射赛拉嗪/氯胺酮(xylazine/ketamine)的混合物将动物麻醉。通过滴注一滴0.5％的托吡卡胺(tropicamide)将右眼的瞳孔散瞳。然后，使用氩激光视网膜凝固器(532nm；150mW；100ms)通过裂隙灯用接触镜在主要血管分支之间的视盘周围进行六(6)次脉络膜烧伤(75μm点尺寸)。在激光处理时产生气泡证实玻璃膜(Bruch’s membrane)的破裂。
[0577] 给药途径和方法
[0578] 通过肌内注射赛拉嗪/氯胺酮的混合物将动物麻醉。在第0天和第7天以右眼剂量方案玻璃体内注射测试项目、参比和赋形剂(5μl)。注射在手术显微镜下进行。
[0579] 在第0天安排的玻璃体内注射在诱导新生血管化后在相同的麻醉下进行。
[0580] 玻璃体内注射定位在睫状环的颞上区域，并且使用封固在10μl Hamilton上的30G-针头进行。然后将填装的注射器封固到UltraMicroPump III中以获得微升范围内的准确注射。
[0581] 体重
[0582] 在研究开始之前记录所有动物的体重，然后每周记录一次。在诱导和治疗前(基线)、然后在第7、14和21天记录的动物体重全部在基线的正常范围内：180，6±12，3g(平均数±SD，n＝40)。在第21天，在测试项目、赋形剂和未治疗的组之间没有观察到相关的差异。对于300μg/ml和3000μg/ml的XG-102，动物分别增重+53g(+29％)和+62g(+34％)，相对于赋形剂组和未治疗组分别增重+56g(+31％)和+59g(+34％)。
[0583] 用 retard治疗的动物在基线与诱导后第21天之间增重+21g(+12％)。
[0584] 荧光素血管造影
[0585] 在第14和21天使用HRA进行荧光素血管造影。在通过肌内注射赛拉嗪/氯胺酮混合物麻醉和散瞳后，使用26G胰岛素注射器皮下注射250μl/100g(体重)的10％荧光素钠，并且在染料注射后10分钟记录荧光素照片。
[0586] 本研究在四十(40)只Brown Norway大鼠上进行。氩激光用来在右眼中诱导ChNV。ChNV的发展通过荧光素血管造影(FA)进行评价。治疗(测试，参比和对照项目)在诱导后第0天和第7天通过玻璃体内给药进行。在诱导后第14和21天，在荧光素(示踪剂)注射后10分钟进行血管造影。分级是基于每个损伤中荧光素的最高强度，并且其不是通过渗漏区域的尺寸确定的。
[0587] 结果表示为每个时间点的组平均得分和对每次治疗在给定的强度得分和在两个时间点中任一个的点数目的发生率。使用Mann和Whitney检验确定在治疗组与对照组之间的FA得分中是否存在统计学显著差异。当使用Mann和Whitney-U检验得到p＜0.05时，归为统计学显著性。
[0588] 图39A显示荧光素渗漏的强度(平均得分±SD)。并且图39B显示在两个时间点在测试项目-治疗的眼中渗漏点的比例。图39C和39D分别显示渗漏点百分数(得分＞0)和最大的渗漏点(得分为3).
[0589] 通过荧光素血管造影评价
[0590] 在血管造影图片上的荧光素渗漏由两名检查者以遮蔽方式进行评价，并且按下述分级：得分0，没有渗漏；得分1，轻微着色的；得分2，中等着色的；得分3，强烈着色的。如果分配给一个特定损伤的两个得分不一致，则使用较高的得分进行分析。
[0591] 通过在扁平封固制剂上标记用ChNV的异凝集素B4进行评价(可选的定量)
[0592] 在第23天，在通过腹膜内注射 处死后，采集治疗的右眼并且在室温用4％低聚甲醛溶液固定1小时。清洗后，切下视网膜、脉络膜和巩膜。将视网膜小心地剥离。
将巩膜-脉络膜扁平封固，并且在用FITC-异凝集素B41抗体封闭后进行温育。
将巩膜-脉络膜扁平封固，并且在用FITC-异凝集素B41抗体封闭后进行温育。
[0593] 统计学分析
[0594] 对于所有参数计算组平均值和标准差。为了评估不同浓度的测试项目与赋形剂之间差异的统计学显著性，使用Mann和Whitney U检验。
[0595] 结果
[0596] (1)参比化合物康宁克通(Kenacort)相对于赋形剂和未治疗的组
[0597] 下表总结了在第14和21天在10分钟的FA结果(n＝8只动物/组，右眼)
[0598]
[0599]
[0600] 请注意，数字数据可能已经四舍五入进行表示，因此，人工重新计算可能导致略微不同的值。
[0601] 在第14天，在未治疗的右眼中90％的点是渗漏的，这表明形成了ChNV。平均得分为2.1±1.0(n＝48)。在第21天，未治疗的动物表现出96％的渗漏点和2.1±0.9(n＝48)的平均得分，这表明ChNV的持久性。
[0602] 在第14天，在赋形剂治疗的眼中100％的点是渗漏的，平均得分为2.9±0.5(n＝48)，这表明ChNV的形成和严重性。到第21天，在具有94％的点是渗透的渗漏点发生率和平均得分2.2±1.0(n＝48)中没有相关的变化，这表明ChNV的持久性。
[0603] FA评分揭示，在第14天，与赋形剂相比，在第0和7天两次玻璃体内给药后retard显著减少97％的荧光素渗漏(p＜0.001，Mann&Whitney-U检验)，如由0.1±0.3(n＝46)的平均得分相对于赋形剂组的2.9±0.5所示。
[0604] 与赋形剂治疗的动物(其在第14天表现出100％的渗漏点)相比，在retard组渗漏点的发生率减少，具有13％的渗漏点。
[0605] 到第21天，与赋形剂治疗的动物相比，用 retard治疗两次的动物表现出86％血管渗漏的相关减少(p＜0.001，Mann&Whitney检验)，如分别由0.3±0.5(n＝
45)相对于2.2±1.0的平均得分所示。
45)相对于2.2±1.0的平均得分所示。
[0606] 在第21天，与赋形剂组相比，渗漏点的比例不变，如关于 retard的31％渗漏点相对于关于赋形剂的94％渗漏点所示。
[0607] (2)XG-102-治疗的组相对于赋形剂组
[0608] 下表总结了在第14和21天在10分钟的FA结果(n＝8只动物/组，右眼)。
[0609]
[0610] 请注意，数字数据可能已经四舍五入进行表示，因此，人工重新计算可能导致略微不同的值。
[0611] 结果的总结提供在图39中。
[0612] 在以两种剂量玻璃体内给药XG-102后，动物的整体行为没有变化。在临床随访期间没有发现相关的并发症。
[0613] 在研究期间动物体重增加：对于300μg/ml和3000μg/ml的XG-102分别增加+53g(+29％)和+62g(+34％)，相对于赋形剂组和未治疗组分别为+56g(+31％)和+59g(+34％)。用 治疗的动物表现出21g(+12％)的增重。
[0614] 在赋形剂组中，诱导的眼在激光损伤后14和21天表现出一致的荧光素渗漏。在第14天，平均荧光素渗漏为2.9±0.5(n＝48impacts)，具有100％的渗漏点，这表明ChNV的形成和严重性。在第21天，ChNV的形成保持一致，具有94％的渗漏点和2.2±1.0(n＝48impacts)的平均荧光素渗漏。
[0615] 在第0和7天两次玻璃体内给药 (200μg/给药)抑制诱导后第14和21天的ChNV形成的发生率，在第14和21天，对于 retard分别具有0.1±0.3(p
＜0.001)和0.3±0.5(p＜0.001)的平均得分，相对于赋形剂的2.9±0.5和2.2±1.0的平均得分。在第14天，在参比治疗的组中，13％的损伤显示出渗漏，而在赋形剂组中100％显现出渗漏。到第21天，与赋形剂(94％)相比，使用 retard，渗漏点的发生率
保持减少(31％)。
＜0.001)和0.3±0.5(p＜0.001)的平均得分，相对于赋形剂的2.9±0.5和2.2±1.0的平均得分。在第14天，在参比治疗的组中，13％的损伤显示出渗漏，而在赋形剂组中100％显现出渗漏。到第21天，与赋形剂(94％)相比，使用 retard，渗漏点的发生率
保持减少(31％)。
[0616] 与赋形剂相比，用300μg/mL和3000μg/mL的XG-102治疗的动物在第14天表现出显著的血管渗漏减少，对于低剂量，减少17％(p＜0.05)，平均得分为2.4±0.9，对于高剂量XG-102，减少41％(p＜0.001)，平均得分为1.7±0.7。在第21天，与赋形剂相比，两种剂量的XG-102都没有显示出血管渗漏的相关减少。
[0617] 在第14天，对于300μg/ml和3000μg/ml XG-102组，记录具有得分3的点的比例减少，如对于低和高XG-102浓度分别为66％和12％的得分3所示，相较于赋形剂组90％的点得分3。
[0618] 使用测量ChNV的解剖学和功能方法并且在给定的实验条件下，以300和3000μg/ml玻璃体内给药的XG-102在最后一次给药后7天(研究的第14天)抑制血管渗漏。
[0619] 实施例19：XG-102对阿霉素-诱导的肾病变的作用
[0620] 本实施例的目的是研究XG-102对炎性肾病(即肾病变)的作用，阿霉素处理在大鼠和小鼠中诱导模拟人病灶性节段性和肾小球硬化(focal segmental and glomerular sclerosis(FSGS))的肾小球疾病。在该模型中，在疾病过程中发生管和间质炎症损伤，部分是由于大量的蛋白尿导致。在不进行治疗时，肾病在八周内进展为晚期肾衰竭。足细胞损伤是导致肾小球硬化症(glomerulosclerosis)的顺序中的初始步骤之一。本研究的目的是研究XG-102是否能够预防肾损伤和肾衰竭的发展。
[0621] 向大鼠静脉内施用XG-102(对照NaCl 0,9％)。总共50只大鼠进行治疗，其中3组(10只大鼠)接受XG-102(低剂量(20μg/kg)，中剂量(200μg/kg)和高剂量(2000μg/kg))。所有这些组(以及安慰剂组)在第0天都用10mg/kg阿霉素处理。第五组10只动物没有接受任何阿霉素，并且由NaCl对照补足(treted)。在第8、14、29和41天提供组织学制备物。
[0622] 这些组织学制备物清楚地表明，在整个观察期间，XG-102对阿霉素诱导的肾病变具有显著的正作用。肾脏组织显著地从细胞丧失中得到挽救，见图42-45。不用XG-102治疗或用XG-102治疗对c-jun表达的影响分别提供在图46和47中。
[0623] 在进一步的研究中，使用40只雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River)(分成4组，每组十只大鼠)。肾病变通过在第0天单次静脉内注射10mg/kg阿霉素而诱导。在第
0天，在尾静脉内静脉内给药XG-102(SEQ ID NO：11；2mg/kg；在NaCl 0.9％中)。给药体积为0.2ml。
0天，在尾静脉内静脉内给药XG-102(SEQ ID NO：11；2mg/kg；在NaCl 0.9％中)。给药体积为0.2ml。
[0624] 下表总结随机分配：
[0625]
[0626] 每天观察所有动物的整体行为和外观。监测动物的健康(垂死的动物，异常重要的体重减轻，物质的主要耐受性等)。没有大鼠被去除。
[0627] 在第7、14、28、42和56天从每组4只大鼠的尾静脉采集血液。使用购自Advia Chemistry 1650(Bayer Healthcare AG，Leverkusen，Germany)的适当的试剂盒测量血清肌酸酐浓度、血液尿素和蛋白血。在第7、14、28、42和56天在麻醉后将每组两只大鼠处死。在动物处死后，采集两个肾。为了组织病理学检验，将固定的组织样本在分级的醇溶液中脱水处理，在甲苯中透明化处理，并且包埋在石蜡中。切片(4μm)用高碘酸-Schiff(PAS)染色，并且进行马森三色染色(Masson's trichrome staining)以检测胶原沉积。在显微镜下进行肾小球和小管间质硬化病的定量。
[0628] 结果使用Microsoft 软件以个体和总结的数据表的形式表示。数字结果表示为平均数±平均数的标准误差(SEM)。由于检测的动物的数量少，没有进行统计学分析。
[0629] 在疾病进展过程中，XG-102对肾功能的作用：
[0630] 测量尿和肌酸酐血清水平以研究肾病病程中的肾功能。由于肌酸酐干扰热量剂量(calorimetric dosage)，因此仅分析尿素，其是肾功能的精细指示剂。然而，在未治疗的大鼠中，尿素血清水平显著是稳定的(低于5mmol/l)，ADR诱导尿素水平的进展性增加，其从第28天急剧升高至第41天的高达25mmol/l，然后第56天升高到高达48mmol/l，这反映了晚期肾衰竭(图38B)。另一方面，在整个病程中XG-102-治疗的大鼠表现出低于10mmol/l的尿素血清水平(图48B)。另一方面，在整个病程中XG-102-治疗的大鼠表现出低于10mmol/l的尿素血清水平(图48B)。用单独的XG-102治疗的大鼠的肾功能与0.9％NaCl-治疗的大鼠的肾功能相似。这些结果表明XG-102防止进展为肾病和肾衰竭。
[0631] 组织病理学发现(PAS和马森三色染色)：
[0632] 在光学显微镜下评价ADR-诱导的结构变化。盐水-治疗的对照大鼠显现出形态学正常的肾小球和小管。在第8天，在ADR肾病组中的光学显微镜检查显示一些具有病灶性节段性肾小球硬化病和蛋白质样管型(proteinaceous casts)的区域。相反，尽管在XG-102-治疗的大鼠中一些小管充满了蛋白，但是肾小球表现出正常的结构，没有或有不连续的肾小球系膜细胞过多，而效果结构和间质没有表现出病理学变化(图49)。到第14天，ADR处理的小鼠表现出进展性肾小球硬化病、透明沉积(hyaline deposits)和小管扩张和管型形成(cast formation)。在该组中，肾小球硬化病的程度急剧加重，并且扩散，到第29和41天，在大部分肾小球的肾小球簇和Bowman's腔之间具有明显的粘连，这与严重的小管萎缩和间质纤维化相关。在第56天，在所有肾小球中观察到扩散的肾小球硬化病(图50)。然而，与ADR-处理的大鼠相比，XG-102-治疗的大鼠在第8天具有相对正常的外观，并且在第56天发展很少的病灶性和节段性肾小球硬化病和小管间质纤维化。总之，这些结果强烈暗示XG-102预防肾小球和小管间质纤维化的发展，并且可以解释该组中肾功能的保持。
[0633] 本研究结果提供了XG-102预防ADR诱导的肾小球和小管间质损伤的进展的证据。并且，该分子保持肾功能。
[0634] 实施例20：XG-102对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)-诱导的肾病变的作用
[0635] 本研究的目的是在56天期间评价XG-102对大鼠中慢性嘌呤霉素氨基核苷-诱导的肾病变的作用。嘌呤霉素氨基核苷(PAN)是一种足细胞毒素，诱导足细胞足突的丧失和融合。PAN-诱导的肾病变是一种充分描述的人特发性肾病综合征和病灶性节段性肾小球硬化病模型(Pippin JW，2008)。在具有PAN肾病的大鼠中观察到的肾小球形态变化与人微小病变疾病(human minimal change disease(MCD))和病灶性节段性肾小球硬化病(FSGS)中的那些变化紧密相似。在大鼠中腹膜内给药PAN导致肾病综合征的快速发展，特征在于蛋白尿、低白蛋白血症和高胆固醇血症(急性期)。这是一种充分确定的人MCD动物模型。已经在通过重复腹膜内PAN注射诱导的慢性PAN肾病中观察到病灶性节段性肾小球硬化病的病理性损伤(Nakajima，T.，Kanozawa，K.，&Mitarai，T.(2010).Effects of edaravone against glomerular injury in rats with chronic puromycin aminonucleoside nephrosis(依达拉奉抗具有慢性嘌呤霉素氨基核苷肾病的大鼠中的肾小球损伤的作用).J Saitama medical university，37(1))。按照损伤机制，PAN通过产生活性氧种类(ROS)和组织损伤引起直接的DNA损伤，包括慢性期的肾小球硬化病和间质纤维化(Hewitson TD，
2012)。
2012)。
[0636] 在该实验中，使用90只雄性Wistar大鼠(Charles River，France)(分成6组，每组15只大鼠)。为了诱导肾病变，在第0天以130mg/kg(5ml/kg)的剂量和在第14天以60mg/kg(5ml/kg)的剂量腹膜内施用嘌呤霉素氨基核苷(PAN)(Nakajima，T.，Kanozawa，K.，&Mitarai，T.(2010).Effects of edaravone against glomerular injury in rats with chronic puromycin aminonucleoside nephrosis(依达拉奉抗具有慢性嘌呤霉素氨基核苷肾病的大鼠中的肾小球损伤的作用).J Saitama medical university，37(1))。对照大鼠(组1)在第0天和第14天腹膜内(i.p)接受等量的盐水。从第0天第一次PAN注射开始向尾静脉(i.v.)施用XG-102或其赋形剂(NaCl 0.9％)每周一次(组1-5)，在第
0、7、14、21、28、35和42天共7次注射。在分开的实验组(组6)中，在第0天PAN注射后，从第21天开始向尾静脉(i.v.)施用XG-102每周一次，在第21，28，35和42天共4次注射。
0、7、14、21、28、35和42天共7次注射。在分开的实验组(组6)中，在第0天PAN注射后，从第21天开始向尾静脉(i.v.)施用XG-102每周一次，在第21，28，35和42天共4次注射。
[0637] 对于XG-102施用，将XG-102粉末以检测的最高浓度溶解在赋形剂NaCl 0.9％中。然后，该最高浓度表示较低浓度的储液。将每份储液过滤(0.2μm)除菌。通过将过滤的储液稀释在盐水(0.9％NaCl)中制备要施用的较低浓度的溶液，这取决于静脉内注射所用的体积。
[0638] 下表总结了实验组：
[0639]
[0640] 该研究设计显示在图51中。简言之，在第0天和第14天，注射PAN或其赋形剂(盐水)用于诱导肾病变。在第0天和第14天，先施用PAN，然后是XG-102给药。从第0天到第42天，如上文所述通过静脉内(i.v.)途径每周给药XG-102或其赋形剂(NaCl 0.9％)-次。
[0641] 将动物每周称重一次。所有PAN-处理的动物都表现出体重减轻。然而，所有PAN-处理的动物在体重上是相似的，即，与PAN/盐水组(组2)相比，没有观察到XG-102对体重的影响。
[0642] 在第56天，将动物处死，并且采集样品(血液和肾)。具体地，对于血液和肾取样，通过注射戊巴比妥(60mg/kg；Ceva Sante Animale；Libourne，France)将动物麻醉。从腹静脉采集血液样品，转移到管中用于凝固(EDTA3K；30分钟，4℃)，然后离心(10分钟，3000rpm，4℃)用于血浆收集。在用于肌酸酐和尿素测定之前将血浆保存在-20℃。摘下肾，清除所有的结缔组织和被膜，并且在电子微量天平(Mettler，Toledo)上称重。将肾样品在10％福尔马林溶液(Sigma Aldrich，France)中固定24-72小时，特别是48小时，然后包埋在石蜡中。每块切割三个切片(3-5μm)。载玻片通过苏木精/曙红(HE)、PAS-乌洛托品银(PAS-methenamine silver)和Sirius Red染色，分别用于形态变化的组织学评价、肾小球硬化病和间质纤维化定量。所有的载玻片使用购自Hamamatsu(Japan)的Nanozoomer
2.0HT以X20数字化。组织学制备物和成像由Histalim(Montpellier，France)进行。由Genotoul的Phenotypage平台使用ABX Pentra 400临床化学分析仪(HORIBA)定量血浆肌酸酐和尿素。
2.0HT以X20数字化。组织学制备物和成像由Histalim(Montpellier，France)进行。由Genotoul的Phenotypage平台使用ABX Pentra 400临床化学分析仪(HORIBA)定量血浆肌酸酐和尿素。
[0643] 在专家组织病理学评价后，通过半定量评分表示结果。对于肾小球硬化病的组织学检查，使用半定量评分系统评价肾小球的变化，如Nakajima，T.，Kanozawa，K.，&Mitarai，T.(2010).Effects of edaravone against glomerular injury in rats with chronic puromycin aminonucleoside nephrosis(依达拉奉抗具有慢性嘌呤霉素氨基核苷肾病的大鼠中的肾小球损伤的作用).J Saitama medical university，37(1)所述，其通过引用结合在本文中。简言之，评估每张肾切片(每只动物2张切片)25个肾小球中的肾小球损伤的程度，每只动物共评估50个肾小球。在个体肾小球中损伤的程度基于肾小球涉及的百分数用0-4的等级进行分级。
[0644] 得分0：正常，
[0645] 得分1：多达25％的肾小球中的损伤，
[0646] 得分2：25-50％的肾小球损伤，
[0647] 得分3：50-75％的肾小球损伤，和
[0648] 得分4：75-100％的肾小球损伤。
[0649] 所有的数据计算为平均数值±平均数的标准误差(s.e.m.)。使用GraphPad Prism，第4版(GraphPad Software Inc.，LaJolla，USA)进行统计学分析。所有组的比较使用双因素ANOVA进行，然后通过Bonferroni’s post-检验比较体重结果。使用未配对的Student t-检验进行组1(盐水/盐水)与组2(PAN/盐水)之间的比较。使用单因素ANOVA然后通过Newman-Keuls检验比较赋形剂和XG-102的作用。接受P＜0.05的值为统计学显著性的。组2(PAN/赋形剂)和组6(PAN/XG-1024mg/kg-4iv)之间的比较使用未配对的Student t-检验进行。
[0650] 肾小球硬化病损伤的结果显示在图52中。本研究的一个主要目的是在大鼠中通过重复的嘌呤霉素氨基核苷注射诱导的病灶性节段性肾小球硬化病(FSGS)的充分建立的模型中评价肾小球硬化病损伤。结果显示7次静脉内注射XG-102以剂量依赖性方式显著减轻PAN-诱导的肾小球硬化病。然而，1mg/kg的剂量对该病理学特征没有作用。从第21天开始的剂量为4mg/kg的4次静脉内注射XG-102导致XG-102减轻PAN诱导的肾小球硬化病的强作用(图52)。
[0651] 肾小球损伤的结果显示在图53中。本研究的一个主要目的是评价XG-102对大鼠中通过重复PAN注射诱导的肾小球损伤的作用。结果表明，(i)XG-102具有预防性作用，其中以2和4mg/kg的剂量7次静脉内注射在损伤严重性方面(肾小球损伤评分)显著减轻PAN-诱导的肾小球硬化病，还显著减少肾小球损伤的发生率(损伤的肾小球的百分数)，并且(ii)XG-102具有治愈性作用，其中从PNA给药后第21天开始以4mg/kg的剂量4次静脉内注射XG-102在损伤严重性(肾小球损伤评分)和肾小球损伤发生率(损伤的肾小球的百分数)两方面引起对肾小球硬化病的强作用。
[0652] 实施例21：在糖尿病性视网膜病变大鼠模型中长期给药XG-102的作用
[0653] 本研究的目的是评价在糖尿病性视网膜病变大鼠模型中长期给药JNK抑制剂肽XG-102(1，2，4mg/kg，每周静脉内给药，持续9周)。氯沙坦(Losartan)用作阳性对照。
[0654] 使用购自Charles River(Margate，Kent)的74只雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g；包括4只备用动物)。将大鼠成对笼养在聚丙烯笼子中，在所有时间自由获取高脂肪食物(D12492 60％千卡来源于脂肪)和自来水。饮食购自美国新泽西的Research Diets。所有的动物在正常光照下维持在21±4℃和55±20％湿度(开灯：07：00-19：00)。
[0655] 研究时间表显示在图54中。在整个研究中动物成对笼养。在3周时间内，将它们每周称重(仅在第三周，食物和水称重两次(即，在周一和周四给药STZ前的那周))。在适应的第三周，使用手持葡萄糖计(One Touch Ultra 2)在自由喂食状态从侧尾静脉采集血液样品。血液取样在约09：00开始。
[0656] 由于研究的规模，动物作为两个独立的团体(由于成对笼养，尽可能每个n＝4或6只)在阶段外运行72小时(见图54)。约40只动物分配到团体A中，其余30只分配到团体B中，尽可能平衡体重、血浆葡萄糖和食物与水的摄取。为了诱导糖尿病，使用链脲霉素(STZ)。由于给药STZ的动物的糖尿病表型高度依赖于STZ的批次，因此进行初步研究，以确定最佳的STZ剂量(35或45mg/kg，腹膜内(ip))。在动物维持饮食约3周后给予STZ或赋形剂，如图54详细所示。备用动物给药STZ(每个团体一对)。
[0657]
[0658] 对每对动物实施相同的处理(即，二者都是赋形剂处理的或二者都将是STZ-处理的)。在STZ给药后7天的时间期间，将动物每天称重，并且每周确定食物和水两次。对于其余的研究持续时间，动物每周两次称重并且每周两次评估水和食物的摄入(总是在静脉内给药那天和典型地在补充水那天)。然后，基于体重和STZ后获得的食物和水摄入，将动物依据给药方案的不同按下文详细所述分配到组B-F中。
[0659]组 剂量 团体A 团体B
B-E IV给药 24 16
F-G PO给药 12 8
B-E IV给药 24 16
F-G PO给药 12 8
[0660] 在STZ(或赋形剂)处理后一周，使用血糖测量计(One Touch Ultra2)以自由喂食状态从侧尾静脉采集血液样品(血液样品在约09：00开始采集)。然后，组A-E的动物通过静脉内途径给药赋形剂，并且组F-G的动物通过口服途径给药1％甲基纤维素。组F-G的动物持续每天给药一次，每天大约在09：00开始。在给药前将动物称重(记录该重量)。仅在与静脉内组(A-E)相同的日子记录食物和水。
[0661] 基线阶段持续一周。在这一周快结束时，已经给予血糖和可获得的体重与食物和水摄入数据将动物分配到药物治疗。分配如下表详细所示。
[0662]组 组 STZ 团体A 团体B 总N
A 赋形剂(盐水)-NON-STZ NO 4 6 9-10
B 赋形剂(盐水，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
C XG-102(1mg/kg，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
D XG-102(2mg/kg，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
E XG-102(4mg/kg，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
F Vehicle(甲基纤维素，po，每天) STZ 6 4 9-10
G 氯沙坦(25mg/kg，po，每天) STZ 6 4 9-10
A 赋形剂(盐水)-NON-STZ NO 4 6 9-10
B 赋形剂(盐水，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
C XG-102(1mg/kg，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
D XG-102(2mg/kg，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
E XG-102(4mg/kg，静脉内，每周) STZ 6 4 9-10
F Vehicle(甲基纤维素，po，每天) STZ 6 4 9-10
G 氯沙坦(25mg/kg，po，每天) STZ 6 4 9-10
[0663] 给药持续9周(共9次给药，见图54)。组F和G中的动物每天大约在09:00称重并给药。组A-E的动物每周通过静脉内途径给药一次(如图54详细所示)。在所有组中，食物和水的摄入每周确定两次(在静脉内给药那天和在补充水那天)。血糖每月确定。样品如之前详细所述由血糖测量计(One Touch Ultra2)采集。血液样品在自由喂食状态采集(在大约09:00开始)。以后动物按照规定的时间表通过各自的途径及时给药。给药后，将每只动物放置在代谢笼(可自由获取食物和水)中持续24小时的期间。为减少挥发，将玻璃尿收集器放置在装有冰的聚苯乙烯容器(Sca-online，UK)中。由于预测日常尿体积随着STZ增加，因此以时间间隔(例如，每8小时)收集尿(并且冷冻保存)，确保对每个代谢笼可以记录二十四小时的总尿体积。将在每个时间点的等分试样汇集，以使每只动物收集单份24小时的样品。取出汇集的24小时尿液中的10份300μl的等分试样并且冷冻在-80℃。使用COBAS C111和相关的试剂确定尿样品(对于所有的尿分析，n＝2)的肌酸酐、葡萄糖、尿素、总蛋白和电解质(Na，K，Cl和Ca)。对于尿收集期，在放置在笼中时和离开时对大鼠称重。还计算消耗的食物和饮用的水。如之前所述，再给药一个月后，再次确定血糖和尿参数(肌酸酐，葡萄糖，尿素，总蛋白和电解质)(见图54)。
[0664] 在治疗的第8周(见图54)，使用FITC-菊糖法评估动物的肾小球滤过率(GFR)。这是基于Stridh，S.，Sallstrom，J.等人(2009)：“C-Peptide Normalizes Glomerular Filtration Rate in Hyperfiltrating Conscious Diabetic Rats”Oxygen Transport to tissue XXX Advances in experimental medicical and biology.645：219-25的方法进行的，其通过引用结合在本文中。具体地，将FITC-菊糖(1.5％)溶解在盐水中，并且通过0.45μm注射器滤器过滤。为了去除残留的游离FITC，将溶液用1000Da截留透析膜(Spectra Por 6，购白Fisher UK)在4℃在2000ml盐水中透析过夜，并且避光。在使用之前将透析过的胰岛素通过0.22μm注射器滤器过滤。每只动物通过尾静脉(即，静脉内)给药1ml(15mg)FITC-菊糖。在给药后2，5，9，15，24，35，55，80分钟，采集血液样品(80μl)置于锂-肝素采集管(Sarstedt CB300LH)中。每份血液样品在冷却的离心机中进行离心，并且将血浆样品分配到干净的等分小瓶中用于后续以496nm激发和520nm发生确定荧光。
[0665] 在结束时，将动物和食物与水称重。然后，将动物处死，并且通过心脏穿刺采集最终的血液样品(在EDTA-包被的管中约4.5mL)。将血液样品在冷却的离心机中离心，并且将等分试样(5份0.5mL的等分试样)冷冻保存(-80℃)。在解剖尸体时，摘下左肾和右肾，并称重。每个肾矢状切除两半，并且放置在10％中性缓冲的福尔马林的容器中固定约5天。然后，将肾用石蜡包埋，并且将每个肾的一半放置在一个盒中以产生一个石蜡块，以用于后续的处理(即，一块有一半右肾和一半左肾)。其余的半块肾弃掉。对于石蜡块，使用Tissue Tek VIP处理机(使用分级的醇以脱水，和使用二甲苯作为透明化剂(clearant))制备所有的组织。然后将块浸没在石蜡组织-蜡中，然后包埋在新鲜的组织-蜡中，将肾组织切成约4-5μm，并且用苏木精和曙红(H&E)和高碘酸(PAS)的方法染色。然后，将载玻片送去由病理学家评估(例如，送到Harlan Laboratories Ltd.UK)。病理学家使用“+，++，+++”系统(或类似的)半定量地评价所有通过H&E和PAS染色的载玻片的肾小球硬化病、小管萎缩和间质扩散。
[0666] XG-102在商购的无菌盐水中以1ml/kg的体积定剂量。为了这一目的，在通过加入无菌盐水进行第一次给药之前配制XG-102，由此配制了最高的剂量(4mg/ml)，并且通过稀释该4mg/ml的储液制备较低的剂量。然后，对每个给药期制备等分试样并在使用前冷冻保存(-80℃，在-80℃稳定3个月)。在给药的早上，将每份等分试样从冷冻室中取出，并允许在给药前在室温解冻(例如，30分钟)。在给药前，将解冻的溶液通过倒置混合。在解冻后尽可能快地完成所有的给药，但是在所有情形中，都是在8小时内完成，原因在于测试项目在室温在盐水中以10μg/ml-50mg/ml的浓度稳定8小时。使用无菌聚丙烯塑料(包括移液管头)。在使用前以及在稀释成较低剂量之前，将储液过滤除菌(0.2μm)。氯沙坦钾购自化学品供应商(例如，Tocris UK)，并且在每个早上以5ml/kg的体积在1％甲基纤维素的赋形剂中制备用于给药。在适当情形中使用给药因子。
[0667] 在研究结束时，分析体重和食物和水瓶的重量。结果表示为体重，前4周每周的体重变化和此后每4周的体重变化，以及在整个药物给药期间，与对照组相比，在研究和药物治疗结束时体重减少的％，食物和水摄入，累计食物摄入和前4周每周的平均食物和水摄入和此后每4周的平均食物和水摄入和整个喂养研究持续期间的平均食物和水摄入。不同的治疗对体重和食物、累计食物和水摄入的影响通过双因素协方差分析进行分析，以治疗和团体作为因子和以基线(第1天的体重或第-6天至第0天的平均食物或水消耗)作为共变量，然后通过适当的多重比较检验(双尾)来比较每一个组与适当的STZ赋形剂组。血糖通过通用的线性模型进行分析，所述通用的线性模型以治疗和团体作为因子，以基线体重、饲养次序和研究前血浆水平作为共变量。使用适当的转化和/或稳健的回归技术来减少外围因素(outliers)的影响。适当的多重比较检验(双尾)用来比较每个组与适当的STZ赋形剂组。尿肌酸酐、葡萄糖、尿素、总蛋白和电解质表示为治疗组平均数±SEM。分析通过通用的线性模型进行，所述通用的线性模型以治疗和团体作为因子。可以利用适当的转化和/或稳健的回归技术来减少外围因素的影响。适当的多重比较检验(双尾)用来比较每个组与适当的STZ赋形剂组。肾脏重量通过通用的线性模型进行分析，所述通用的线性模型以治疗和团体作为因子，第1天体重作为共变量。为了确定除了由体重变化引起的作用之外的作用，通过以治疗和团体作为因子和终末体重作为共变量的通用线性模型进行分析。如果合适，使用对照转化和/或稳健的回归技术。使用适当的多重比较技术来比较每一个组与适当的STZ赋形剂组。对于病理学评估，将每次治疗与适当的STZ赋形剂组通过精确的Wilcoxon秩和检验进行比较。
[0668] GFR计算为FITC菊糖的剂量/AUC0-∞。AUC(FITC菊糖浓度的)通过对数-线性梯形法则(Stridh)(将2-5分钟线外推至0分钟)和24-80分钟的末期阶段过程中对数-转化的数据的线性回归计算。计算的GFR值通过双因素方差分析(以治疗和团体作为因子)进行分析。如果合适，使用对数转化和/或稳健的回归技术。
[0669] 在除GFR外的所有分析中，由于在基线周内通过不同途径给药可能影响用作共变量的基线值，因此，静脉内给药的动物与经口(po)给药的动物分开分析。在上述所有分析中排除非STZ组。进行单独的分析来比较非STZ组，包括分析中所有的组，但是使用用STZ处理之前的界线共变量，而不是在给药前那周的基线共变量。在所有的分析中，认为小于0.05的p值是统计学显著的。
[0670] 在糖尿病性视网膜病变大鼠模型中长期给药XG-102对大鼠体重的影响显示在图55中。只有非STZ处理的大鼠表现出体重增加。用XG-102治疗的大鼠与STZ模型中赋形剂治疗的大鼠相比没有表现出体重的差别。然而，用阳性参比氯沙坦治疗的大鼠的体重显著较低。这些结果表明XG-102是充分耐受的，而阳性参比氯沙坦导致显著的体重减轻。
[0671] 实施例22：在胰岛分离/移植中评价针对XG-102的剂量反应
[0672] 本研究基于之前关于胰岛分离的研究(参见实施例17)和基于Noguchi等人发表的论文(Noguchi，H.，S.Matsumoto，等人(2009).″Ductal injection of JNK inhibitors before pancreas preservation prevents islet apoptosis and improves islet graft function(在保存胰腺之前管注射JNK抑制剂防止胰岛凋亡并且提高胰岛移植功能).″Hum Gene Ther20(1)：73-85.)。在猪胰岛分离模型中的这些研究已经表明，胰岛早在开始胰岛分离程序后20分钟就开始经历了明显的JNK活化。这一活化是组合热缺血、酶消化和对已经虚弱的组织的机械胁迫的方法的结果。实施例17的研究已经表明，在获得时向冲洗到猪胰腺中的保存液中血管内加入XG-102(10μM)对其他细胞存活力和功能性具有显著的影响，如通过氧消耗率(OCR)和ATP浓度评估的，并且与JNK活化和c-fos基因表达的减少相关。Noguchi等人已经使用了不同的抑制剂，并且在获得后立即将其以相同的摩尔浓度加入到胰腺管中。使用猪和人胰腺。通过ATP浓度评估，它们对胰岛存活力表现出相似的作用，而且在糖尿病小鼠肾被膜下移植后表现出糖尿病逆转的体内作用。本组实验的目的是确定XG-102的剂量-反应曲线和在胰岛分离中使用的最佳浓度。为了回答这一问题，使用啮齿动物模型。尽管知晓人与啮齿动物胰腺和胰岛之间的差异，但是，由于其直接性和高成本有效性，仍然选择这一模型。这些实验的目的仅是确定需要的XG-102的最佳剂量，大鼠模型似乎是有效的。由于主要目的是抑制人胰腺中的JNK以改善临床同种胰岛移植的结果，因此，在这些实验中进行抑制剂的管内注射。这实际上是该化合物用于临床设置的最可能的方式。
[0673] 为了评估分离后大鼠胰岛中的JNK活化，用胶原蛋白酶通过经典的酶法从Lewis大鼠分离Langerhans胰岛。分离在处死动物后立即进行或在15分钟的热缺血期间后立即进行。在分离过程结束时，通过蛋白质印迹评估JNK活化。对作为阴性对照的未处理的大鼠胰腺评估JNK活化。实验对每种缺血条件3只大鼠加一只阴性对照进行，并且重复3次。这表示总共21只Lewis大鼠。图56所示的结果表明XG-102剂量依赖性减少由15分钟缺血诱导的JNK(图56A)和PAF2(图56B)磷酸化。
[0674] 为了研究XG-102对胰岛存活力的作用，基于之前实验的结果选择关于缺血持续时间的最佳模型(没有热缺血相对于15分钟的热缺血)，即，最可能在JNK抑制后表现出差异的模型。使用稀释在胶原蛋白酶溶液中的设定浓度的XG-102或赋形剂并且在酶消化胰腺之前注射到胰腺管中进行分离。在整个分离过程中在所用的不同的清洗或纯化溶液中和在培养基中使用相同摩尔浓度的XG-102或赋形剂。分离的胰岛在基于RPMI的培养基中培养过夜。对于每组实验，使用下述XG-102浓度：1μM，3μM，10μM，50μM和100μM。在每组中关于每种浓度使用三只动物，并且实验依据结果重复2-3次。这表示总共60-90只Lewis大鼠。确定胰岛产量。进行下述胰岛存活力的评估：JNK活化，OCR，ATP浓度，胱天蛋白酶释放等。
[0675] 为了研究XG-102在体内对胰岛功能的作用，进行补充分离，以评估JNK抑制对体内胰岛功能的作用。体内实验仅对使用在体外实验中最有效的XG-102摩尔浓度(如上文详细所述)分离的胰岛或使用赋形剂进行。胰岛分离按上述进行。对于每次分离，将1000和2000IEQ移植到链脲霉素诱导的糖尿病免疫缺陷小鼠的肾被膜下。比较植入XG-102-处理的胰岛或对照胰岛的动物之间逆转糖尿病的动物比例和逆转糖尿病所需要的时间。移植重复3次。需要的动物数目约为30只Lewis大鼠和24只NOD-scid小鼠。
[0676] 如图57所示，为了研究XG-102对大鼠胰腺胰岛功能和存活力的影响，从缺血15分钟的大鼠和不缺血的大鼠分离胰岛。在胰岛分离后直接进行和在37℃培养18小时时进行静态胰岛素分泌检测(基底或使用葡萄糖刺激)。可以观察到分离影响胰岛功能。与不管在什么条件下培育18小时的胰岛相比，在分离后直接使用的胰岛中的实际基底胰岛素分泌较高。这些高的基底水平反映胰岛的胁迫。然而，在培养后，在该实验中，缺血和抑制剂XG-102对胰岛功能没有影响。
[0677] 由于在之前的实验中已经表明来自15分钟缺血大鼠的胰岛与来自对照大鼠的胰岛响应葡萄糖分泌相同量的胰岛素，因此进行新的实验，其中缺血持续至30分钟并且JNK抑制剂XG-102以100μM使用(图58)。在这一实验中，仍然观察到当在分离后直接进行胰岛素分泌检测时的高基底分泌。并且，30分钟的缺血对胰岛功能具有不利影响。这些初步的结果表明，30分钟的缺血似乎是比15分钟更好的诱导JNK活化的模型。当来自缺血大鼠的胰岛被分离并且用XG-102温育时，与缺血大鼠相比，葡萄糖-诱导的胰岛素分泌更高(图58)，这表明XG-102对胰岛功能的阳性作用。
[0678] 实施例23：在大鼠激光诱导的脉络膜新生血管化(CNV)中XG-102(SEO ID No.11)在结膜下注射后的功效
[0679] 本研究的目的是在激光诱导的脉络膜新生血管化(CNV)模型中确定XG-102(一种JNK-抑制剂)在通过结膜下注射给药到大鼠中时的功效。如在实施例18的情形中所述的，该模型允许预测化合物用于治疗年龄相关的黄斑变性(AMD)的潜在应用。与实施例18所述的研究相反，选择结膜下给药途径用于本研究，原因在于其是用于在人中给药的另一种优选途径。
[0680] 分配下述实验组：
[0681]
[0682] 赋形剂对照，即0.9％NaCl，如收到那样给药。曲安奈德4％作为“参比物质2”，并且也如收到那样给药。对于XG-102制剂，在赋形剂(即0.9％注射用氯化钠)中制备等于最高剂量的储液，并且通过0.22μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤器过滤除菌。较低剂量水平通过直接稀释所述储液而制备。剂量制剂以适当的浓度制备一次，以满足剂量水平要求。所有的稀释液通过用赋形剂直接稀释储液而制备。制备两份给药等分试样(第1和8天)并且保存在设定保持在-20℃的冰箱中。在给药的每一天将每个剂量水平的等分试样在环境温度解冻，并且溶液在室温保持不长于6小时。
[0683] 使用44只雄性Brown Norway大鼠(Charles River；10周龄)。在动物送到与开始治疗之间允许最少14天的适应期，以使动物适应实验室环境。动物通过设计获得相似的组平均体重的分层次随机化方案分组。健康较差或处于极端体重范围的动物不分到组中。在开始给药之前，将任意认为不适合用于本研究的分配动物用备用动物替换，所述备用动物获自同一批货运，并且保持在相同的环境条件下。开始给药后，在替换期间，在意外受伤、为测试物品相关的健康问题或相似的情形中，将研究动物用备用动物替换。备用动物在3天内用作研究的替换物。到达时，将动物单独笼养直到随机化。随机化后，将动物成组笼养(同一给药组多达3只动物一起)在装有自动供水阀门的不锈钢打孔地板笼子中。在指定的程序/活动期间将动物分开。在整个研究过程中，除了在指定的程序之外，随意供应PMI营养国际标准啮齿动物食物No.5CR4(14％蛋白)。每只动物通过自动供水系统可自由获得通过反渗透和紫外线照射处理后的地方自来水(除了在指定的程序过程之外)。除了在研究程序/活动过程之外，将动物群养以进行生理学/环境富集，并且提供诸如躲藏管和咀嚼物体的东西。
[0684] 在研究的第1天，进行激光诱导的脉络膜新生血管或(CNV)程序。在CNV程序之前，向两只眼睛滴加散瞳滴剂(1％托吡卡胺)。当兽医眼科医生认为适当时进行另外的滴加。在所述程序之前和过程中将动物欧诺个异氟烷/氧气混合物麻醉。在麻醉下，使用810nm二极管激光器以300mW的初始功率设置(对于泡形成，激光功率可以增加)、80μm的初始点尺寸和0.1秒的持续时间在每只眼视盘周围的主要视网膜血管之间做出4-点模式。
按需要调整激光参数，以确保破坏玻璃膜(Bruch’s membrane)(与泡形成相关)。如果对于特定的点没有证实玻璃膜的破坏，将其记录下来。在该情形或在出血的情形中，如果兽医眼科医师认为是适当的，可以添加另一个点。对于每个激光点记录任何明显的事件，诸如视网膜出血。如果出血肽严重的话，则将该动物从本研究中排除并且替换。在该程序中，必要时，用盐水溶液和/或羧甲基纤维素钠1.0％保持眼睛的水合。
按需要调整激光参数，以确保破坏玻璃膜(Bruch’s membrane)(与泡形成相关)。如果对于特定的点没有证实玻璃膜的破坏，将其记录下来。在该情形或在出血的情形中，如果兽医眼科医师认为是适当的，可以添加另一个点。对于每个激光点记录任何明显的事件，诸如视网膜出血。如果出血肽严重的话，则将该动物从本研究中排除并且替换。在该程序中，必要时，用盐水溶液和/或羧甲基纤维素钠1.0％保持眼睛的水合。
[0685] 如上述实验设计所示，在第1和8天，将赋形剂对照、测试物质或参比物质通过结膜下注射给药到每只动物的左眼和右眼中。将动物麻醉(异氟烷)用于剂量给药，这由得到认证的兽医眼科医生进行。在治疗前那天、注射后，将局部抗生素(庆大霉素眼用溶液)滴加到两只眼睛中两次，并且在注射后那天至少滴加一次。在给药前，向每只眼睛滴加散瞳滴剂(1％托吡卡胺和/或2.5％苯福林(phenylephrine))(当兽医眼科医生认为适当时，可以进行另外的滴加)。在给药过程中，动物保持在用异氟烷/氧气的麻醉下。结膜用注射用0.9％氯化钠USP冲洗。对于每次结膜下注射使用连接有0.5cc Terumo胰岛素注射器的29-号1/2-英寸的针(一个注射器/组/治疗)。在第1和8天，将XG-102、赋形剂对照或参比物质以50μL/眼的剂量体积给药到每只动物的眼睛中。在每次治疗后立即检查两只眼睛，以记录由给药程序引起的任何异常。
[0686] 进行下文列出的实际程序、观察和测量。如果认为合适，可以进行更频繁的观察。在整个研究过程中，进行死亡率/濒死性(Moribundity)检查，每天两次，即上午一次下午一次，由此观察动物的整体健康/死亡率和濒死性。除非鉴定或证实可能的发现需要，在观察期间不将动物从笼中取出。从第-1周开始，进行笼边观察，每天一次，其中除非鉴定或证实可能的发现需要，在观察期间不将动物从笼中取出。从第-1周开始，每周进行详细的临床观察，其中将动物从笼中取出进行检查。从第-2周开始，每周记录体重，这仅用于健康监测目的，其中将动物分别称重。在治疗前期间最后一周期间开始，除了在规定的处死那天之外，每周定量测量食物消耗，这仅用于健康监测目的。当进行了用于筛查目的的预先研究时，进行眼科检查，由此所有的动物都进行眼底镜(间接检眼镜检查)和生物显微镜(裂隙灯)检查。所用的散瞳药是1％托吡卡胺。当进行了预先研究并且在第1、2和3周末期，进行荧光素血管造影，其中在检测前至少10分钟向每只眼睛中滴加散瞳滴剂(1％托吡卡胺)(如果认为必要，可以施用另外的滴加)。通过经常用盐水溶液冲洗保持眼睛的水合。必要时，将动物保持在异氟烷/氧气混合物下和/或使用镇静剂混合物(氯胺酮75mg/kg；赛拉嗪7.5g/kg)。获得红外和/或无红模式的单张和/或ART眼底图片，作为血管造影的参比图片。通过快速尾静脉注射(通过abbocath)给药0.2ml 10％荧光素钠注射液USP，然后用0.5ml盐水冲洗。在荧光素注射后至少2分钟并且不晚于荧光素注射后5分钟从两只眼睛记录静止图片。为了评价静止图片上的单个激光点，由2名独立的读者以0-4的等级半定量评价所述静止图片的渗漏，这两名独立的读者随后将确定一致的评分。
[0687] 在荧光素血管造影评分程序中，首先，将血管造影图片(JPEG或BMP)从HRA2输出并且复制到CD或其他适当的媒体上，并且在适当的计算机上浏览。在分级程序中，以用于分级的适当的聚焦水平选择图片。(可能需要多于1张图片/眼睛，以分级所有的激光点)。血管造影可以由2名科学人员独立分级，并且记录关于每一个激光点的等级。在每个人分级完成后，比较这些等级，由两方检查任意的差异，并且同意一个等级并记录。分级等级为
0-4，如下文所示：
0-4，如下文所示：
[0688] 0＝没有渗漏(仅可见激光瘢痕或扩散非常小的超荧光区域)。
[0689] 1＝最低的渗漏(通常保持在激光诱导的缺陷区内的小的扩散区域或固体超荧光区域)。
[0690] 2＝略微渗漏(通常保持在激光诱导的缺陷区域边界内的半固体超荧光)。
[0691] 3＝中度渗漏(通常保持在激光诱导的缺陷区域边界内的半固体至固体超荧光)。
[0692] 4＝大量渗漏(延伸超过激光诱导的缺陷区域边界的超荧光区域)。
[0693] 如果动物在研究过程中死亡或被处死，不进行尸体解剖并且将动物尸体丢弃。存活到规定的处死日期的动物具有记录的最终体重。将所述动物在异氟烷麻醉后进行腹主动脉放血法。当可能时，将动物以剂量组为中心处死，以便在整个日期过程中每组(包括对照)有相似数量的动物进行尸体解剖。从所有动物采集在下述组织收集和保存表中鉴定的代表性组织样品并且保存在10％中性缓冲的福尔马林中，除非另外指明：
[0694]
[0695] X＝进行的程序；-＝不适用的。
[0696] 在本研究中使用下述评判计算机化系统：
[0697]
[0698] 对于体重、食物消耗和荧光素血管造影计算平均数和标准差。其他数据以个体基础报告。
[0699] 实施例24：JNK抑制剂XG-102对大鼠牙周炎模型中的炎症反应的抑制作用[0700] 本研究的目的是研究XG-102(SEQ ID NO：11)对大鼠牙周炎模型中诱导的炎症的抑制作用。
[0701] 在本研究中使用30只大鼠(分成4组，每组十只大鼠)。实验性牙周炎通过在第0天放置在第一磨牙(每只动物一颗磨牙)周围的结扎线诱导。齿龈内(IGV)给药2或4mg/kg的一剂量。
[0702] 下表总结了随机分配：
[0703]
[0704]
[0705] 每天观察所有动物的整体行为和外观。如果动物的健康不允许研究的继续(濒死的动物，异常重要的体重减轻，物质的主要不耐受性等……)，将动物在研究主管的负责下出于伦理原因处死。牙周炎的炎症方面通过宏观观察牙龈组织进行分析。测量蚀斑指数和牙龈炎症指数作为牙周病临床指数。
[0706] 大约在第17天，将动物处死，并且采集样品。为了评估炎性细胞，通过组织形态测量进行炎性细胞的定量。为了评估炎性蛋白水平，从牙龈组织匀浆物中测量炎性蛋白(p-JNK，TNF，IL-1，IL-10，MMP-8，MMP-9)的水平。为了评估组织破坏，对每组3只动物通过放射线学分析(micro-CT)评价骨组织破坏。通过组织学分析评估牙周复杂的破坏。为了评估骨骼微结构，通过放射线学分析(micro-CT)评价骨小梁的测量(厚度、分开)。为了鉴定口腔细菌，通过针对9种牙周病原体的DNA探针(实时PCR)鉴定牙袋(dental pockets)中的细菌群体。对于胶原构架，使用偏振光显微镜检查进行总胶原量的测量。通过组织形态计测分析评价胶原I/胶原III比例。
[0707] 实施例25：XG-102(SEQ ID No.11)在链脲霉素处理的大鼠(IVT)中的糖尿病性视网膜病变预防研究中的作用
[0708] 本研究的目的是确定当通过玻璃体内注射给药到链脲酶素(STZ)-处理的(高血糖)大鼠中时XG-102预防糖尿病性视网膜病变的能力。
[0709] 研究设计如下：
[0710]
[0711]
[0712] 来自组2，3，4的所有动物在第-7天接受55mg/kg静脉内(IV)剂量的STZ。
[0713] 预先称重包含0.0412g诱导剂(STZ)的无菌小瓶，密封并且转移到给药室中用于在第-7天给药给组2-4的动物和备用动物。提供一式两份设置的空的、适当标记的无菌小瓶。将重建的STZ溶液填充到这些小瓶中用于给药。参比物质0.9％NaCl如收到那样给药。XG-102用1.383的校正因数进行制备。在赋形剂(即0.9％注射用氯化钠)中制备等于最高剂量水平的储液，并且通过0.22μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤器过滤除菌。较低剂量水平通过直接稀释所述储液而制备。剂量制剂以适当的浓度制备一次，以满足剂量水平要求。所有的稀释液通过用赋形剂直接稀释储液而制备。制备三份给药等分试样(第1、8和15天)并且保存在设定保持在-20℃的冰箱中。在给药的每一天将每个剂量水平的等分试样在环境温度解冻，并且溶液在室温保持不长于6小时。
[0714] 60只雄性Brown Norway大鼠获自Charles River Labs，Inc.，Portage，Il。所述动物约8周龄，称重为166-228g。由于Brown Norway大鼠是接受的用于STZ-诱导的糖尿病性视网膜病变模型中的物种，因此选择Brown Norway大鼠作为本研究的动物模型。认为在本研究中使用的动物总数是正确表征测试物质的作用所需要的最少数目。设计本研究，以使其不需要不必要数量的动物来实现其目的。在动物送到与开始治疗之间允许最少20天的适应期，以使动物适应实验室环境。动物通过设计获得相似的组平均体重的分层次随机化方案分组。健康较差或处于极端体重范围的动物不分到组中。在开始给药之前，将任意认为不适合用于本研究的分配动物用备用动物替换，所述备用动物获自同一批货运，并且保持在相同的环境条件下。备用动物在开始3天内用作研究的替换物。到达时，将动物单独笼养直到随机化。随机化后，将动物成组笼养(同一给药组多达3只动物一起)在装有自动供水阀门的不锈钢打孔地板笼子中。在研究记录中记录保持所述动物的房间。在指定的程序/活动期间将动物分开。保持温度为19℃-25℃，相对湿度为30％-70％。保持12-小鼠光/12-小时暗循环，除了当指定的程序中断时。在整个研究过程中，除了在指定的程序之外，随意供应PMI营养国际标准啮齿动物食物No.5CR4(14％蛋白)。每只动物通过自动供水系统可自由获得通过反渗透和紫外线照射处理后的地方自来水(除了在指定的程序过程之外)。除了当被研究程序/活动中断之外，将动物群养以进行生理学/环境富集，并且提供诸如躲藏管和咀嚼物体的东西。
[0715] 为了施用诱导剂(组2-4，第-7天)，在注射3分钟内将一小瓶STZ/只动物(包括备用动物)用1.5mL注射用无菌水USP重建，以提供27.5mg/mL的浓度。将小瓶倒置或涡旋，以溶解STZ。将得到的溶液通过0.22μmMillex-GV滤器过滤到空的无菌适当标记的小瓶中。在第-7天在配制的3分钟内由注射器通过静脉内注射施用STZ(55mg/kg)。剂量体积为2mL/kg，并且实际的剂量给药是基于每只动物最近的实际体重计算。动物在注射过程中受到控制。
[0716] 如实验设计表所示，在第1、8和15天将测试物质或参比物质通过玻璃体内注射施用到每只动物的左眼和右眼中。将动物麻醉(异氟烷)用于剂量给药，这由得到认证的兽医眼科医生进行。在治疗前那天、注射后，将局部抗生素(庆大霉素眼用溶液)滴加到两只眼睛中两次，并且在注射后那天至少滴加一次。在给药前，向每只眼睛滴加散瞳滴剂(1％托吡卡胺和/或2.5％苯福林)(当兽医眼科医生认为适当时，可以进行另外的滴加)。在给药过程中，动物保持在用异氟烷/氧气的麻醉下。结膜用注射用0.9％氯化钠USP冲洗。对于每次玻璃体内注射使用具有32-gauge1/2-英寸的针的10μL Hamilton注射器(一个注射器/组/治疗)。剂量体积是5μL/眼。在每次治疗后立即通过裂隙灯生物显微镜检查和/或间接检眼镜检查来检查两只眼睛，以记录由给药程序引起的任何异常(尤其是晶状体、玻璃体和视网膜)。认为角膜混浊是包括麻醉的实验程序继发的。这些混浊中的一些还与角膜血管化相关。记录其他眼部发现，但是通常是低发生率或组间偶发性的，和/或不持久的。这些发现包括，但不限于：多病灶/弥散性角膜混浊，玻璃体气泡，病灶性/弥散性/多病灶玻璃体混浊，和病灶性视网膜混浊。
[0717] 通过玻璃体内注射施用链脲霉素来在大鼠中诱导糖尿病性视网膜病变。由于玻璃体内注射途径是人中的目的给药途径，因此对测试物质选择玻璃体内注射途径。基于之前的概念研究以及MTD和使用IVT给药途径的毒性研究的证据获得的信息选择剂量水平。
[0718] 对于研究动物进行下文列出的活着程序、观察和测量。在整个研究中，每天两次观察动物的整体健康/死亡率和濒死性，即上午一次下午一次。除非鉴定或证实可能的发现需要，在观察期间不将动物从笼中取出。从第-1周开始，将动物从笼中取出，并且每周进行详细的临床观察。从第-1周开始，每天单独称重动物两次。在预先处理期最后一周期间开始每周定量测量食物消耗。所有的动物都在预先处理时进行眼底镜(间接检眼镜检查)和生物显微镜(裂隙灯)检查并且在第22天再次进行。使用的散瞳药是1％托吡卡胺。在每TM次眼科检查后，在预先研究和在第22天，使用Tono Vet 反弹眼压计测量眼内压。在与预测最后的测量相同的时间进行治疗前眼压测量读数，以减少昼夜变化性。
[0719] 在预先处理时和在荧光素血管造影前第6、13和20天进行视网膜电流图评价。在ERG记录之前将动物适应黑暗过夜，然后肌内注射75mg/kg氯胺酮和7.5mg/kg赛拉嗪进行麻醉。在检测之前向每只眼睛中滴加托吡卡胺(1％)(如果认为有必要，实施另外的滴加)。眼睑通过眼睑扩张器的方式缩回，并且在每只眼睛的表面上放置接触镜或金环电极。将针电极皮肤放置在每只眼睛下(参比)和在头上、眉毛后或在尾巴根处(接地)。在将接触镜电极放置到眼睛上之前，向所述接触镜电极的内表面上滴加羧甲基纤维素(1％)滴剂。每个ERG时机由下述系列的暗视单闪刺激(scotopic single flash stimuli)组成。
[0720] 1)-30dB单闪，a-波振幅和潜伏期，平均5次单闪，在闪烁之间间隔10秒。
[0721] 2)-10dB单闪，a-和b-波振幅和潜伏期，平均5次单闪，在闪烁之间间隔15秒。
[0722] 3)0dB，平均2次单闪，a-和b-波振幅和潜伏期，在闪烁之间间隔约120秒(更长的时间是可接受的)。
[0723] 在评价暗视反应之后，使动物适应约25-30cd/m2的背景光约5分钟的时间(更长的时间是可接受的)，然后是平均20次1Hz的光适应性白闪光(a-和b-波振幅和潜伏期)，然后是20次29Hz的光适应性闪光(b-波振幅和潜伏期)。分析波形的a-和b-波振幅和潜伏期，并且滤光来自0dB暗视刺激的1-4的振荡电位(OP)并分析振幅和潜伏期。
[0724] 在预先处理时和在视网膜电描记术之后第7、14和21天进行荧光素血管造影评价。在程序之前和程序过程中使用异氟烷/氧气混合物作为麻醉剂。必要时使用散瞳剂，即1％的托吡卡胺。按需要通过浇注盐水溶液保持眼睛的水合。通过快速尾静脉注射施用0.2mL 10％荧光素钠注射液U.S.P.，然后用0.5mL盐水冲洗。在荧光素注射后10-15分钟之间记录两只眼睛的眼底静态图片。图片先从右眼拍摄，然后再拍左眼。在血管造影后向眼睛中施用局部温和性眼用软膏。定性评价图片的血管完整性/弥散性渗漏。
[0725] 在预先-STZ处理时，第-6天(即，STZ施用后那天)进行血糖水平确定，并且在此后每周进行三次(对所有动物)。按需要可以进行另外的血糖测量以监测动物的健康状况。使用从尾静脉采集的血滴通过血糖测量计确定水平。数值以mmol/L测量并且通过乘以18转化成mg/dL，以用于报告目的。尿葡萄糖水平确定从第-1周开始每周在过夜收集后进行。在收集期间动物具有获得食物和水平的途径。由临床实验室部分使用P800分析仪测量尿葡萄糖。在异氟烷麻醉后从腹主动脉进行。在可能时，将动物以剂量组为中心处死，以使在整个研究中每组相似数量的动物(包括对照)在相似的时间进行尸体解剖。
[0726] 主要的研究动物进行完全的尸体解剖检查，其包括评价尸体和肌肉骨骼系统；所有外表面和孔；脑的颅腔和外表面；和胸腔、腹部和骨盆腔以及它们相关的器官和组织。尸体解剖程序由具有适当的训练和动物解剖与总体病理学经验的有资格的人员进行。可用兽医病理学家或其他适当的有资格人员。
[0727] 从所有的动物采集下文鉴定的代表性的组织样品，并且保存在10％中性缓冲的福尔马林中，除非另外指明。
[0728] 组织采集和保存
[0729]
[0730] X＝进行的程序；-＝不适用的。
[0731] 在本研究中评价下述参数和终点：死亡率，临床迹象，体重，体重变化，食物消耗，眼科学，眼内压，视网膜电描记术(ERG)，荧光素血管造影，血糖和尿糖确定，整体尸体解剖检查。
[0732] 与糖尿病性视网膜病变大鼠模型一致，存在高血糖-相关的死亡，恶化病症的临床迹象，和体重减轻，体重增加，增加的食物消耗，和严重增加的血糖和尿糖水平。在STZ-诱导的组中观察到的多眼变化次于高血糖状态的本质(即，显著的前皮质白内障)。在研究过程中没有XG-102-相关的死亡。对体重、体重增加或食物消耗没有XG-102-相关的临床迹象或影响。荧光素血管造影成像没有揭示任何血管渗漏，并且在尸体解剖时没有明显的XG-102-相关的宏观发现。
[0733] 在第6、13和20天，给予≤2μg/眼XG-102的动物的暗视和光适应性ERG评估的一些振幅略微增加或者与STZ-处理的对照动物相当，但是这些反应通常保持在对照变化性之内。XG-102组的潜伏期是相当的并且保持在对照和/或预先处理变化性之内。当比较给予≤2μg/眼XG-102的动物与STZ-处理的对照时，在振荡电位振幅方面存在一些偶发性差异。
[0734] 下表包括所有时机的(分别是预先处理，和第6、13和20天)ERG刺激的振幅总结。值表示组平均数和标准差(见下)：
[0735]
[0736]
[0737]
[0738]
[0739]
[0740]
[0741] 从这些数据可以得出，XG-102存在逆转波幅减少的趋势。
[0742] 实施例26：XG-102(SEQ ID No.11)在链脲霉素处理的白化病大鼠(结膜下)中的糖尿病性视网膜病变预防研究中的作用
[0743] 本研究的目的是确定XG-102在每周结膜下注射给药到链脲霉素(STZ)-处理的(高血糖)大鼠持续3周预防糖尿病性视网膜病变的能力。
[0744] 实验设计显示如下：
[0745]
[0746]
[0747] 组2-5的所有动物在第-7天接受55mg/kg静脉内(IV)STZ剂量。
[0748] 使用首次用于实验的Long Evans大鼠(42只雄性动物；在给药时为10周龄；Charles River，St.Constant，QC)。由于Long Evans大鼠是接受的用于STZ-诱导的糖尿病性视网膜病变模型的物种，因此选择Long Evans大鼠作为用于本研究的动物模型。认为在本研究中使用的动物总数是正确表征测试物质的作用所需要的最少数目，并且设计这一总数，以使其不需要不必要数量的动物来实现其目的。此时，实验室动物研究为外推至人提供最好的可用的基础。目前还不存在不使用活动物的可接受的模型。备用动物的突出释放将是在第4天。动物笼养在不锈钢笼中。每天以适于动物尺寸和年龄的量提供PMI营养国际标准啮齿动物食物No.5CR4(14％蛋白)。每只动物可自由获得通过反渗透过滤处理和经过UV光处理的当地自来水。除了在研究程序/活动中之外，将动物群养(至多3只动物/笼)用于生理学/环境富集，并且提供诸如躲藏管和咀嚼物体的东西。只分配确认适合用于本研究的动物。当到达时，将动物单独笼养直到随机化。在随机化之后，动物将被群养。
[0749] 预先称重包含0.0412g诱导剂(STZ)的无菌小瓶，密封并且转移到给药室中用于在第-7天给药给组2-5的动物和所选的备用动物。提供一式两份设置的空的、适当标记的无菌小瓶。将重建的STZ溶液填充到这些小瓶中用于给药。使用提供的校正因数制备测试物质XG-102。在赋形剂(即0.9％注射用氯化钠)中制备等于最高剂量水平的储液，并且通过0.22μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤器过滤除菌。较低剂量水平通过用盐水直接稀释所述储液而制备。制备给药等分试样，并且保存在设定保持在-20℃的冰箱中。在给药的每一天将每个剂量水平的等分试样在环境温度解冻，并且溶液在室温保持不长于6小时。赋形剂，即0.9％注射用氯化钠如收到那样施用。在注射3分钟内将一小瓶STZ/只动物(包括备用动物)用1.5mL注射用无菌水USP重建，以提供27.5mg/mL的浓度。将小瓶倒置或涡旋，以溶解STZ。将重建的STZ溶液通过0.22μm Millex-GV滤器过滤到空的无菌小瓶中用于给药。
在第-7天在配制的3分钟内由注射器通过静脉内注射施用STZ。剂量体积为2mL/kg，并且实际的剂量给药是基于每只动物最近的实际体重计算。动物在注射过程中受到控制。如果血糖水平≥250mg/dL，则认为STZ-处理的动物是糖尿病性的。在第1、8和15天将测试物质或赋形剂通过结膜下注射给药到每只动物的左眼和右眼中，并且在第24天(Rep 1)、第
23天(Rep 2和3)、第22天(Rep 4)和第34天(Rep 1)、第33天(Rep 2和3)和第32天
(Rep 4)再次给药。将动物麻醉(异氟烷)用于剂量给药，这由得到认证的兽医眼科医生进行。在治疗前那天、注射后，将局部抗生素(0.3％妥布霉素药膏)应用到两只眼睛中两次，并且在注射后那天至少滴加一次。在给药前，向每只眼睛滴加散瞳滴剂(1％托吡卡胺和/或2.5％苯福林(phenylephrine))(当兽医眼科医生认为适当时，可以进行另外的滴加)。
在给药过程中，动物保持在用异氟烷/氧气的麻醉下。结膜用注射用0.9％氯化钠USP冲洗。对于每次结膜下注射使用连接有0.5cc Terumo胰岛素注射器的29-号1/2-英寸的针(一个注射器/组/治疗)。测试物质或参比物质以50μL/眼的剂量体积给药到每只动物的眼睛中。在每次治疗后立即检查两只眼睛，以记录由给药程序引起的任何异常。IV给药链脲霉素以在大鼠中诱导糖尿病性视网膜病变。由于结膜下途径是人中的目的给药途径，因此对测试物质选择结膜下途径。基于之前的概念研究以及MTD和使用结膜下给药途径的毒性研究的证据获得的信息选择剂量水平。，每天至少两次(AM和PM)进行患病率/死亡率检查。每天进行一次笼边观察。每周进行详细地临床检查。每周进行定量食物消耗。每周记录两次体重。在预先研究时进行眼科检查，并且在第37天(Rep 1)、第36天(Rep 2和
3)和第35天(Rep4)再次进行。所有的动物都进行眼底镜(间接检眼镜检查)和生物显微镜(裂隙灯)检查。所用的散瞳药是1％托吡卡胺。在研究前和第37天(Rep 1)、第36天(Rep 2和3)与第35天(Rep 4)测量眼内压。在与预测最后的测量相同的时间进行治TM
疗前眼压测量读数，以减少昼夜变化性。眼内压在眼科检查后施用Tono Vet 反弹眼压计测量。
在第-7天在配制的3分钟内由注射器通过静脉内注射施用STZ。剂量体积为2mL/kg，并且实际的剂量给药是基于每只动物最近的实际体重计算。动物在注射过程中受到控制。如果血糖水平≥250mg/dL，则认为STZ-处理的动物是糖尿病性的。在第1、8和15天将测试物质或赋形剂通过结膜下注射给药到每只动物的左眼和右眼中，并且在第24天(Rep 1)、第
23天(Rep 2和3)、第22天(Rep 4)和第34天(Rep 1)、第33天(Rep 2和3)和第32天
(Rep 4)再次给药。将动物麻醉(异氟烷)用于剂量给药，这由得到认证的兽医眼科医生进行。在治疗前那天、注射后，将局部抗生素(0.3％妥布霉素药膏)应用到两只眼睛中两次，并且在注射后那天至少滴加一次。在给药前，向每只眼睛滴加散瞳滴剂(1％托吡卡胺和/或2.5％苯福林(phenylephrine))(当兽医眼科医生认为适当时，可以进行另外的滴加)。
在给药过程中，动物保持在用异氟烷/氧气的麻醉下。结膜用注射用0.9％氯化钠USP冲洗。对于每次结膜下注射使用连接有0.5cc Terumo胰岛素注射器的29-号1/2-英寸的针(一个注射器/组/治疗)。测试物质或参比物质以50μL/眼的剂量体积给药到每只动物的眼睛中。在每次治疗后立即检查两只眼睛，以记录由给药程序引起的任何异常。IV给药链脲霉素以在大鼠中诱导糖尿病性视网膜病变。由于结膜下途径是人中的目的给药途径，因此对测试物质选择结膜下途径。基于之前的概念研究以及MTD和使用结膜下给药途径的毒性研究的证据获得的信息选择剂量水平。，每天至少两次(AM和PM)进行患病率/死亡率检查。每天进行一次笼边观察。每周进行详细地临床检查。每周进行定量食物消耗。每周记录两次体重。在预先研究时进行眼科检查，并且在第37天(Rep 1)、第36天(Rep 2和
3)和第35天(Rep4)再次进行。所有的动物都进行眼底镜(间接检眼镜检查)和生物显微镜(裂隙灯)检查。所用的散瞳药是1％托吡卡胺。在研究前和第37天(Rep 1)、第36天(Rep 2和3)与第35天(Rep 4)测量眼内压。在与预测最后的测量相同的时间进行治TM
疗前眼压测量读数，以减少昼夜变化性。眼内压在眼科检查后施用Tono Vet 反弹眼压计测量。
[0750] 在预先处理和第7、14、21天和第36天(Rep 1)、第35天(Rep 2和3)与第34天(Rep 4)进行视网膜电流图评价。在ERG记录之前将动物适应黑暗过夜，然后肌内注射75mg/kg氯胺酮和7.5mg/kg赛拉嗪进行麻醉。在检测之前向每只眼睛中滴加托吡卡胺(1％)(如果认为有必要，实施另外的滴加)。眼睑通过眼睑扩张器的方式缩回，并且在每只眼睛的表面上放置接触镜或金环电极。将针电极皮肤放置在每只眼睛下(参比)和在眉毛后的头上或在尾巴根处(接地)。在将接触镜电极放置到眼睛上之前，向所述接触镜电极的内表面上滴加羧甲基纤维素(1％)滴剂。
[0751] 1)-30dB单闪，平均5次单闪，在闪烁之间间隔10秒。
[0752] 2)-10dB单闪，平均5次单闪，在闪烁之间间隔15秒。
[0753] 3)0dB，平均2次单闪，在闪烁之间间隔约120秒(更长的时间是可接受的)。
[0754] 在评价暗视反应之后，使动物适应约25-30cd/m2的背景光约5分钟的时间(更长的时间是可接受的)，然后是平均20次1Hz的光适应性白闪光，然后是20次29Hz的光适应性闪光。分析波形的a-和b-波振幅和潜伏期，并且滤光来自0dB暗视刺激的1-4的振荡电位(OP)并分析振幅和潜伏期。
[0755] 在预先处理(第-2或-1天)和在第8、15、22天，与第35天(Rep 1)，第34天(Rep 2和3)和第33天(Rep 4)进行Indocyanin绿血管造影评价。在程序之前和过程中使用异氟烷/氧气混合物作为麻醉剂。需要时，使用的散瞳剂是1％托吡卡胺。按需要通过浇注盐水溶液保持眼睛的水合。通过快速尾静脉注射施用0.2mL 0.5％Indocyanin绿，然后用0.5mL盐水冲洗。在ICG注射后10-15分钟之间记录两只眼睛的眼底静态图片。图片先从右眼拍摄，然后再拍左眼。在血管造影后向眼睛中施用局部温和性眼用软膏。定性评价图片的血管完整性/弥散性渗漏。
[0756] 在预先-STZ处理时，在第-6天(即，STZ施用后那天)测量血糖水平，并且在第-1天再测量。按需要可以进行另外的血糖测量以监测动物的健康状况。使用从尾静脉采集的血滴通过血糖测量计确定水平。数值以mmol/L测量并且通过乘以18转化成mg/dL，以用于报告目的。
[0757] 将存活到规定的处死日期的主要的研究动物通过在异氟烷麻醉后从腹主动脉放血而处死。当可能时，将动物以剂量组为中心处死，以便在整个日期过程中每组(包括对照)有相似数量的动物进行尸体解剖。从全部动物采集代表性的组织样品(眼睛、视神经)并且保存在10％中性缓冲的福尔马林中，除非另外指明。眼睛和视神经从两侧采集并且在Davidson’s固定剂中固定24-48小时，然后保存在70％乙醇中(仅对于处死的动物)。
[0758] 实施例27：随机、双盲、平行组、对照的、多中心试验，以评估XG-102单次结膜下注射与地塞米松滴眼液相比在手术后眼内炎症中的功效和安全性(II期临床)
[0759] 尽管在眼科手术中的技术进步，这一程序的物理创伤继续诱导需要治疗的手术后眼部炎症。在眼组织中，花生四烯酸通过环加氧酶(COX)代谢成前列腺素(PG)，前列腺素是最重要的脂质来源的炎症调节剂1。手术创伤引起花生四烯酸级联的启动，其又通过激活COX-1和COX-2产生PGs。细胞膜中的磷脂是磷脂酶A的底物以产生花生四烯酸，由花生四烯酸产生化学独特性PGs家族和白三烯2。治疗眼部炎症的‘黄金标准物’是局部皮质类固醇和/或非甾体抗炎药(NSAIDs)。(短期)皮质类固醇应用所报告的副作用包括白内障形成、增加的眼内压(IOP)、增加的对病毒感染的易感性和角膜上皮与间质伤口愈合的延迟3，4。另外，已知使用皮质类固醇长久的治疗诱导系统性副作用，诸如葡萄糖损害(glucose impairment)、高血压、发展青光眼、视敏度缺陷、视野丧失和较后的囊性白内障形成5。研究中的研究药物产物(IMP)-XG-102-是蛋白酶-耐受性肽，其以非腺苷三磷酸(ATP)竞争性方式选择性地抑制c-Jun N-端激酶(JNK)活性。XG-102是31个D-氨基酸的JNK抑制剂肽，具有除甘氨酸(其是非手性的)外D-构型的所有氨基酸。作出这一选择增加化合物对蛋白酶的耐受性，所述蛋白酶通常在它们施加后很快将肽降解。由于JNK活化导致激活剂蛋白-1(AP-1)转录因子家族和其他参与自身免疫性和炎性疾病的细胞因子的磷酸化和活化，抑制JNK途径的化合物可能具有所示的治疗价值。在大鼠和兔中的眼睛MTD(最大耐受剂量)研究以及在兔中的眼睛局部耐受性表明，在结膜下、玻璃体内(IVT)和静脉内(iv)给药后，XG-102是良好耐受的。在大鼠和兔中结膜下给药后的眼睛MTD研究表明，在大鼠中无观察到的副作用水平(No Observed Adverse Effect Level(NOAEL))约为20μg，在兔中为600μg。在兔中研究了单次和重复(每天，持续7天)的结膜下给药后的眼睛药动学，并显示，在给药后7天，XG-102仍然存在于脉络膜、球结膜和虹膜-睫状体中，取决于眼睛结构，tmax为1-4小时，而在血浆中在任何时候都检测不到XG-102。考虑到目前的‘黄金标准物’治疗(手术后)眼内炎症有害的副作用，临床上需要发现其他的治疗备选物，其一方面有效减轻炎症，而另一方面不具有与皮质类固醇应用相关的(有害的)副作用。XG-102在目前进行的临床前研究和I/Ib期研究中都表现出有希望的结果。
[0760] 之前的试验是开放标记、单中心、剂量增加/剂量发现研究，其设计用来在具有手术后或创伤后眼内炎症的患者中评估除‘通常的’手术后(post-op)抗炎治疗之外施用的XG-102单次结膜下注射的安全性和耐受性。研究的XG-102剂量为45，90，450和900μg。在本研究中总共有20名患者参加(每个剂量组5名患者)。之前的研究的结论是在具有最近的手术后或创伤眼内炎症的患者中作为结膜下注射施用的XG-102是安全的和充分耐受的。在之前的研究成功完成之后，决定继续在眼内炎症中研发XG-102并且进行本研究，其中目的是与地塞米松滴眼液比较，评价在手术后眼内炎症进展过程中手术后立即给药的单次结膜下XG-102剂量的功效和安全性，如通过房细胞等级(chamber cell grade)评估的。
这是研究XG-102在手术后眼内炎症的发展中作为单独的治疗施用时的功效的首次研究。
这是研究XG-102在手术后眼内炎症的发展中作为单独的治疗施用时的功效的首次研究。
[0761] SDD-1002-035研究的目的是，与在手术后眼内炎症中4次/天持续21天施用的地塞米松相比，评价在手术程序结束后最多3小时内施用的90或900μg的单次结膜下XG-102注射的功效和安全性。
[0762] SDD-1002-035研究的主要目的是评价在手术后眼内炎症的进展过程中单次结膜下注射900μg XG-102是否不次于4次/天持续21天施用的地塞米松滴眼液的治疗。按照该试验的主要目的，主要结果通过比较XG-102900μg与地塞米松滴眼液在结膜下注射研究治疗施用后第28天的平均前房细胞等级进行评价。
[0763] 次要目的是与地塞米松滴眼液(4次/天，施用21天)相比较，评价单次结膜下注射90μg或900μg XG-102对下述的作用：
[0764] 功效结果参数：
[0765] a)第28天的前房细胞等级(XG-102 90μg相对于地塞米松)
[0766] b)第7天和第14天的前房细胞等级(XG-102 900μg相对于地塞米松)
[0767] c)第7天和第14天的前房细胞等级(XG-102 90μg相对于地塞米松)
[0768] d)第7、14天和第28天的前房细胞等级(XG-102 900μg相对于地塞米松)
[0769] e)第7、14天和第28天的前房细胞等级(XG-102 90μg相对于地塞米松)
[0770] f)挽救药物使用(Rescue medication use)
[0771] g)眼内炎症随时间的进展
[0772] 安全性和耐受性结果参数：
[0773] a)通过ETDRS法的视敏度
[0774] b)裂隙灯检查发现
[0775] c)眼底检查的结果
[0776] d)眼内压(IOP)测量
[0777] e)生命体征(血压(BP)，脉率(PR)和节律)
[0778] f)血液学和化学实验室检测的结果
[0779] g)不利事件的发生
[0780] h)在患者亚组(约30名)中施用研究治疗后1小时XG-102在血浆中的存在(或不存在)
[0781] 本试验是使用三个相等规模的平行组的随机的(1∶1∶1)、对照的、双盲、多中心非劣效性临床试验。随机化(受中心的阻碍)使用基于网络的、安全的随机化系统进行。符合条件的患者是男性或女性(绝经后或通过输卵管结扎或子宫切除而不育的)，年龄＞
18岁，并且已经进行下述眼睛手术中的一种：(a)前段和后段联合手术，其可能包括用于下述的手术：白内障与视网膜剥离，白内障与黄斑前膜(epimacular membrane)和/或白内障与黄斑裂孔或(b)青光眼手术或(c)复杂的后段手术或(d)复杂的眼内手术，其可以包括与糖尿病性视网膜病变相关的白内障手术和/或复杂的视网膜剥离眼睛手术。如果在随机化时刻存在下述排除标准中的任一种，则患者不适合参与：
18岁，并且已经进行下述眼睛手术中的一种：(a)前段和后段联合手术，其可能包括用于下述的手术：白内障与视网膜剥离，白内障与黄斑前膜(epimacular membrane)和/或白内障与黄斑裂孔或(b)青光眼手术或(c)复杂的后段手术或(d)复杂的眼内手术，其可以包括与糖尿病性视网膜病变相关的白内障手术和/或复杂的视网膜剥离眼睛手术。如果在随机化时刻存在下述排除标准中的任一种，则患者不适合参与：
[0782] 1.在实施研究治疗前12周内施用了任意的研究药物。
[0783] 2.存在针对开地塞米松滴眼液处方的禁忌症。
[0784] 3.存在持久的真菌或细菌眼睛感染，抗感染治疗难治的。
[0785] 4.已知由皮质类固醇应用引起的眼内高压病史。
[0786] 5.存在角膜溃疡、角膜穿孔或与不完全的表皮细胞再生相关的损伤。
[0787] 6.存在研究者判断可能干扰本研究的任何手术或医学病症。
[0788] 7.针对蛋白型药物或针对疫苗的任何严重的副反应或超敏性病史。
[0789] 8.目前治疗季节性过敏反应(实例：花粉热，哮喘)。
[0790] 9.有分娩可能性的女性。
[0791] 10.在研究中具有非绝经女性配偶多达第28天(即，进行最后一次访视的日期)的不愿意使用有效的避孕方法(例如，组合的避孕丸或屏障法)的男性。
[0792] 11.不愿意遵守该流程的规定的患者。
[0793] 本研究流程计划138名患者被随机化并且施用研究治疗的结膜下注射。在研究流程中还阐明，没有施用研究治疗的结膜下注射的随机化的患者将被替换。将患者随机分配为XG-102 90或900μg，其在眼睛手术结束后最多3小时内以250μl的单次结膜下注射施用，或者分配为地塞米松滴眼液，其每天滴注4次持续21天。第一研究治疗滴眼液在结膜下注射研究治疗后最多15分钟内滴注。为了保持盲性，随机分到XG-102组的患者接受包含NaCl 0.9％溶液的滴眼液，随机分到地塞米松组的患者施用包含NaCl0.9％的结膜下注射。在施用结膜下注射研究治疗后，访视患者共持续28(±5)天。他们回到门诊进行研究流程要求的访视/调查。下表显示计划的访视时间表以及每次访视进行的程序/调查。研究流程计划数据安全性和监测板(data safety and monitoring board(DSMB))负责监视患者的安全性。这通过在研究过程中除检查累积的患者数据之外还在严重不利事件(SAE)发生时检查它们而实现。关于数据检查时间的详情详细显示在DSMB表格中。
[0794]
[0795] a.在进行手术程序之前和在进行任何研究相关的程序之前获得知情同意书。
[0796] b.在进行眼睛手术之前完成。
[0797] c.下述血液样品在手术程序进行之前进行。进行的化学血液样品为：天冬氨酸转氨酶(AST)，丙氨酸转氨酶(ALT)，C-反应蛋白(CRP)，肌酸激酶(CK)，葡萄糖，肌酸酐和γ-谷氨酰转肽酶。血液学：血红蛋白(Hb)，血细胞比容(HCT)和全部白细胞计数。
[0798] d.在进行手术程序之前，确定患者的合格性。在手术程序开始之前，将合格的患者用基于网络的系统随机化。
[0799] e.在结膜下注射前至少一小时将研究治疗小瓶从冰箱中取出。在准备研究治疗注射器之前，将小瓶放置在安全位置在环境温度解冻。在与研究治疗小瓶相同的时间从药店取回研究治疗滴眼液。
[0800] f.在手术程序结束后最多3小时之内进行研究治疗的施用(结膜下注射和滴眼液)。先施用结膜下注射，然后在5-15分钟后施用滴眼液。
[0801] g.在从 -Dieu医院招募的约30名患者中在施用研究治疗后1小时进行。
[0802] h.在开始施用研究治疗时立即开始观察不利事件的发生。
[0803] 将患者随机分到下述三个研究组中的一个中：
[0804] 1.单次结膜下注射XG-102 90μg+安慰剂滴眼液4次/天，持续21天，或
[0805] 2.单次结膜下注射XG-102 900μg+安慰剂滴眼液4次/天，持续21天，或
[0806] 3.单次结膜下注射NaCl 0.9％+地塞米松滴眼液4次/天，持续21天。
[0807] 随机化(受中心的阻碍)使用基于网络的(即e-SOCDATTM)随机化系统围绕中心进行。
[0808] 测试产品XG-102以90和900μg的剂量使用(单次给药250μl)。给药模式是单次结膜下注射。治疗的持续时间是单次给药(结膜下注射)。(供应批次号XG-102 90μg：PF.243.CR，和供应批次号XG-102 900μg：PF.245.CR)。
[0809] 参比产品地塞米松 以1mg/ml的剂量使用。给药模式是滴眼液(4次/天，21天)。治疗的持续时间是21天-4次/天(批次号：X750和Z472)。
[0810] 安慰剂NaCl以0.9％的剂量使用。给药模式是单次结膜下注射(250μL)或滴眼液(4次/天，21天)。治疗的持续时间是单次给药(结膜下注射)或对于滴眼液是21天-4次/天。供应的批次号：Y479(滴眼液)和1139512112(结膜下注射)。
[0811] 基于临床前药理学和毒物学研究以及从之前的研究获得的安全性和初步功效数据，选择两个剂量-90和900μg XG-102-用于该试验。在SDD-1002-023研究中，90与900μg剂量的安全性模式相似。另外，在两个剂量组中，眼内炎症的减轻，与皮质类固醇滴眼液组合，以相同的方式表现。考虑到为本研究进行的预防措施(DSMB的作用，在持久性炎症的情形中引入开放标记的抗炎治疗的可能性)，为本研究所选的XG-102剂量一方面被认为不损害患者的安全性，而另一方面足够高，足以提供对本研究的目的有意义的数据。结膜下给药途径是用于具有研究的诊断结果的患者的目的给药途径中的一种，原因在于已经在动物和人中显示了使用这种给药途径的安全性和功效。选择用于本研究的地塞米松剂量(即1mg/ml/0.4ml滴眼液)以及频率(即每天4滴)和持续时间(即，21天)是用于地塞米松滴眼液的标准剂量/持续时间，如在临床实践中用于手术眼睛炎症。
[0812] 研究流程规定，研究治疗的结膜下注射需要在眼睛手术结束时最多3小时内施用，并且这需要在最多15分钟内接着滴注第一次研究治疗滴眼液。在眼睛手术结束时施用研究治疗在眼睛手术程序(其是本研究包括的一部分)后按照抗炎治疗的标准给药途径进行。
[0813] 研究者、患者、CC(协调中心)的手术队伍和发起人员(除了药物警戒人员之外)都不了解随机化计划。包含XG-102溶液或安慰剂(即NaCl0.9％溶液)的研究治疗小瓶在外观和一致性上是相同的。包含地塞米松溶液或NaCl 0.9％的单次剂量容器中的滴眼液在外观和一致性上是相同的。研究治疗的包装和标签按照GMP(良好制造实践)和GCP(良好临床实践)进行。另外，附在研究治疗包装上的标签的内容与关于临床试验的当地规定一致。对每名患者提供两个相同编号的治疗包装。一个研究治疗‘包装’包含1小瓶XG-102溶液(90或900μg)或1小瓶安慰剂(NaCl 0.9％)-这取决于患者随机分到的治疗组-并且第二‘包装’包含在单次剂量容器中的滴眼液，其包含地塞米松或安慰剂(NaCl 0.9％)，具有充足的供应量，足以允许4次/天持续21天的治疗。一旦分配给患者，研究治疗包装号就不再分配给另一名患者。患者的研究鉴别号(即，患者鉴别号)由进行该研究治疗的人手写在标签上。对于XG-102和安慰剂溶液，外部研究治疗盒的尺寸和形状是相同的。在紧急情形中，即，需要知晓患者的研究治疗分配以确定所涉及的患者的进一步的医药管理，或者如果需要知晓患者的治疗分配用于调节性报告目的，则代表药物警戒官员的不知情的研究者或发起人分别具有对所涉及的患者的研究治疗编码的使用者访问权限(通过e-SOCDATTM内安全的、基于网络的试验特异性治疗分配系统)。如果访问了任一名患者的治疗编码，则追踪关于研究治疗编码访问的所有信息(即，访问所述治疗编码的人的姓名、原因、日期和时间以及所访问的患者的编码)并且保存在基于网络的系统中(如果访问了该研究治疗的编码)。
[0814] 主要目的是通过结膜下施用研究治疗后第28天的平均前房细胞等级进行评价。用于主要目的的评价的标准为：
[0815] a.在第28天的前房细胞等级(XG-102 900μg相对于地塞米松)
[0816] 用于次要目的的评价的标准为：
[0817] a.在第28天的前房细胞等级(XG-102 90μg相对于地塞米松)
[0818] b.在第7天和第14天的前房细胞等级(XG-102 900μg相对于地塞米松)
[0819] c.在第7天和第14天的前房细胞等级(XG-102 90μg相对于地塞米松)
[0820] d.在第7、14天和第28天的前房细胞等级(XG-102 900μg相对于地塞米松)[0821] e.在第7、14天和第28天的前房细胞等级(XG-102 90μg相对于地塞米松)[0822] f.挽救药物使用
[0823] g.眼内炎症随时间的进展，如通过清除的眼睛炎症评估的。
[0824] 在上文的表格中可以找到描述访视时间和频率以及在每次访视时进行的程序的流程图。在基线(即，在手术那天，但是在进行手术之前)进行眼科检查。然后，在施用结膜下注射后21(±3)消失观察患者，然后在7(±1)、14(±2)和28(±5)天观察患者。为了减少手术者的变化性，对现场(sites)有指示：可能的情形中，在整个试验过程中，由同一名受试者对同一名患者进行所有的眼科检查。眼科测量按照研究特定的指示进行。后者在初始访视过程中和在每次监测访视过程中由现场团队回顾并讨论。为了确定细胞/闪烁计数和细胞/闪烁等级，由使用SUN工作组定义的现场使用SUN工作组协议(″Standardization of Uveitis Nomenclature for Reporting Clinical Data.Results of the First International Workshop.，″American Journal of Ophthalmology，vol
140，no.3，pp.509-516，2005)。
140，no.3，pp.509-516，2005)。
[0825] 用于安全性评价的标准为：
[0826] a.通过ETDRS法测量视敏度
[0827] b.裂隙灯检查发现
[0828] c.眼底检查的结果
[0829] d.眼内压(IOP)测量
[0830] e.生命体征(血压(BP)，脉率(PR)和节律)
[0831] f.血液学和化学实验室检测的结果
[0832] g.不利事件的发生
[0833] h.在患者亚组(约30名)中施用研究治疗后1小时XG-102在血浆中的存在(或不存在)
[0834] 不利事件的定义为：
[0835] 不利事件(AE)定义为‘在施用医药产品的患者中任意不需要的医学事件，并且其不必与该治疗具有因果性关系’。因此，AE是暂时与医药产品的使用相关的任何不利的和非目的性征兆、症状或疾病，不论是否认为与所述医药产品相关。
[0836] 如果是下述事件，则认为AE是严重的：
[0837] ·导致死亡
[0838] ·有生命危险
[0839] ·需要受试者住院或延长当前的住院
[0840] ·导致持久性的或显著的残疾/无能力
[0841] ·导致治疗期间怀孕的后代的先天性异常/出生缺陷
[0842] ·医学上显著并且危害患者或者需要干预以防止上述结果之一
[0843] “严重”定义中的术语“有生命危险的”是指受试者在该事件时具有死亡危险的事件；其不指假设可能引起死亡的事件(如果其更严重)。怀疑的意料之外的严重不良反应(SUSAR)定义为怀疑与治疗相关的不良反应，其是意料之外的(即，与实施的研究治疗预测的结果不一致)和严重的。
[0844] 在位于一个地点的32名患者亚组中国评价血浆中XG-102的量(血浆)。在结膜下施用研究治疗后60分钟使用Li-肝素管获得静脉血液样品(2ml)。获得样品的准确时刻录入到e-CRF上提供的空间。血液样品在室温以2,500RPM离心10分钟。离心后，使用移液管将血浆转移到两个1.5ml冻存管中。然后，将冻存管放置在-80℃的冰箱中，然后在干冰中与温度数据记录一起寄到负责分析的中心实验室。当中心实验室收到时，将样品保存在-80℃直到进行分析时。
[0845] 统计学方法：主要目的是在结膜下注射研究治疗后第28天XG-102 900μg与地塞米松滴眼液对前房细胞等级的非劣性比较(non in-inferiority comparison)。主要结果是分析符合方案(PP)群体(Per-Protocol(PP)population)并且出于灵敏性原因重复全分析组(Full Analysis Set(FAS))。如果在估测差异附近的95％CI的上限为0.5前房细胞等级以下，则可以宣布XG-102 900μg对地塞米松的非劣性。以与主要结果相同的方式分析比较XG-102 90μg与地塞米松的第一二级终点-在第28天的前房细胞等级。所有其他的二级结果使用0.005的双侧α值通过关于FAS的优越性检验进行评价。对FAS组针对接受的治疗进行安全性分析。
[0846] 本研究中包括的患者的安排显示在图59中。第一名患者在2012年7月18日提供知情同意书。最后一名患者在2013年9月02日随机化，对最后一名患者，最后的访视在2013年10月03日进行。共有157名患者提供了知情同意书，这些中有151名随机分组。
在这151名随机化的患者中，6名没有施用研究治疗的结膜下注射。根据研究流程的需要，将这些随机化的患者替换。共有145名患者施用了研究治疗的结膜下注射(即，XG-102或安慰剂)，并且144名患者按本研究流程的计划完成了研究。共有1名患者从随访中退出。
下表显示三个研究组的随访的完成性：
在这151名随机化的患者中，6名没有施用研究治疗的结膜下注射。根据研究流程的需要，将这些随机化的患者替换。共有145名患者施用了研究治疗的结膜下注射(即，XG-102或安慰剂)，并且144名患者按本研究流程的计划完成了研究。共有1名患者从随访中退出。
下表显示三个研究组的随访的完成性：
[0847]
[0848] 数据是患者数目(％)。N＝每组患者数目，#＝数目，μg＝微克，％＝百分数，tx＝治疗。
[0849] 全分析组(FAS)包括对其开始/实施研究治疗的结膜下注射的所有随机化的患者。FAS组按照意向性治疗原则进行分析，即，评价患者随机分到的治疗组中的患者而不管所接受的治疗。另外，从FAS分析组去除关于在允许的时间机会之外进行的访视的数据。
[0850] PP分析组是FAS的子集。如果由于在随机化后的主要扰乱和/或在随访过程中引入开放标记抗炎治疗，则从PP分析数据组中排除患者。另外，从PP分析组中去除关于在允许的时间机会之外进行的访视的数据。
[0851] 安全性组包括开始/实施研究治疗的结膜下注射的所有随机化的患者。患者按治疗(即，按照他们所接受的治疗)进行分析。安全性组是关于安全性分析的主要分析组。
[0852] 在三个治疗组之间关于FAS和PP人群平衡基线特征和同患多症。下表显示用于PP分析人群的治疗组的主要基线同患多症。与XG-102 900μg(41％)和地塞米松组(40％)相比，在分配到XG-102 90μg(52％)的患者中患有视网膜剥离的患者百分比较高，而与XG-102 90μg组(22％)和地塞米松组(26％)相比，在随机分到XG-102 900μg组(33％)的患者中患有糖尿病的患者百分数较高。
[0853]
[0854] 数据是患者数目(％)。N＝每组患者数目，#＝数目，μg＝微克，％＝百分数。
[0855] 下表显示治疗组、在基线的眼睛手术的适应症以及对PP分析人群进行的手术的类型。与分配到XG-102 900μg(46％)和地塞米松组(42％)的那些患者相比，在分配到XG-102 90μg(50％)中的患者中进行复杂后段手术的患者百分数较高。在每个治疗组中在基线进行的手术过程中滴注气体(SF6或C2F6)的患者的百分数分别为43％(XG-10290μg)，37％(XG-102 900μg)和38％(地塞米松)。
[0856]
[0857]
[0858] 数据是患者数目(％)。N＝每组患者数目，#＝数目，μg＝微克，％＝百分数，SD＝标准差。Nr.available＝可获得数据的患者的数目。
[0859] 在第28天的前房细胞等级-XG-102 900μg相对于地塞米松：
[0860] 主要的终点作为第28天前房细胞等级的评价差异进行分析，其使用调整的重复测量模型比较XG-102 900μg剂量与地塞米松组。在重复模型中仅使用第7、14和28天访视收集的数据。对PP分析数据组进行主要分析，并且对FAS数据组进行灵敏性分析。对于第一二级结果，-即，第28天的前房细胞等级(XG-102 90μg相对于地塞米松)-以与主要终点相同的方式使用相同的0.5前房细胞等级的非劣性边界确定非劣性。图60中显示关于三个治疗组-即，XG-102 90μg，XG-102 900μg和地塞米松-对PP分析人群施用研究治疗的结膜下注射后多达28天的评价前房细胞等级，而统计学模型结果显示在下表中：
[0861]
[0862] 访视2(施用研究tx后7天+/-2天)
[0863]
[0864] 访视3(施用研究tx后14天+/-3天)
[0865]
[0866] 访视4(施用研究tx后28天+/-8天)
[0867]
[0868] CI＝置信区间，μg＝微克，％＝百分数，tx＝治疗。
[0869] *主要比较′
[0870] 关于PP和FAS数据组的主要结果以及第一二级结果的结果显示在图61中。在通过第28天的前房细胞等级评估的手术后眼内炎症进展方面，XG-102 900μg不次于地塞米松滴眼液(差异：-0.054前房细胞等级，95％置信区间(CI)-0.350-0.242，p＜0.001)。对FAS重复相同的分析，发现XG-102 900μg不次于地塞米松滴眼液(差异：-0.032细胞等级，95％CI-0.301-0.238，p＜0.001)。鉴于对于FAS和PP分析组的上边界与零交叉，对于在第28天的前房细胞等级，XG-102 900μg不优于地塞米松滴眼液(对于FAS，p＝0.818，对于PP分析组，p＝0.720)。
[0871] 在第28天的前房细胞等级-XG-102 90μg相对于地塞米松：
[0872] 考虑比较XG-102 90μg与地塞米松滴眼液的二级终点，在手术后眼内炎症进展方面，XG-102 90μg不次于地塞米松滴眼液(差异：0.086前房细胞等级，95％CI-0.214-0.385，p＝0.003)。对FAS重复相同的分析，并且发现XG-102 90μg不次于地塞米松滴眼液(差异：0.053前房细胞等级95％CI-0.215-0.321p＜0.001)。
[0873] 关于XG-102 90μg相对于地塞米松和XG-102 900μg相对于地塞米松在第7和14天的前房细胞等级：
[0874] 对FAS数据组进行关于XG-102 90μg相对于地塞米松和XG-102 900μg相对于地塞米松在第7和14天的前房细胞等级的统计学分析。在第7天或第14天，在XG-10290μg与地塞米松之间和XG-102 900μg与地塞米松之间的前房细胞等级方面没有统计学显著差异。
[0875] 关于XG-102 90μg相对于地塞米松和XG-102 900μg相对于地塞米松在第7、14和28天的前房闪烁等级：
[0876] 多达28天获得的前房闪烁等级(关于FAS)显示在图62中，并且模型结果显示在下表中。在第7天或第14天或第28天在XG-102 90μg与地塞米松之间和XG-102 900μg与地塞米松之间的前房闪烁等级方面没有统计学显著差异。
[0877]
[0878] 访视2(施用研究tx后7天+/-2天)
[0879]
[0880] 访视3(施用研究tx后14天+/-3天)
[0881]
[0882] 访视4(施用研究tx后28天+/-8天)
[0883]
[0884] CI＝置信区间，μg＝微克，％＝百分数，tx＝治疗。
[0885] 清除的眼睛炎症：
[0886] 随时间进行的眼睛炎症评价通过清除的眼睛炎症(cleared ocularinflammation)进行评估。后者定义为具有等级为0的合计眼部炎症得分的受试者的比例，所述等级为0的合计眼部炎症得分定义为前房细胞等级＝0和前房闪烁等级＝0。这一结果在第7、14天和第28天进行评价，比较XG-102 900μg与地塞米松和XG-102 90μg与地塞米松。关于FAS和PP群体的总结统计学结果显示在下表中。考虑对FAS进行的分析，与通常的护理组相比，对于分配到XG-102 900μg组的患者，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.76(95％CI 0.25-2.28)，在手术后第14天为1.25(95％CI 0.47-3.32)，并且在手术后第28天为1.13(95％CI 0.49-2.60)。考虑分配到XG-102 90μg组的患者，与通常的护理组相比，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.52(95％CI 0.15-1.83)，在手术后第14天为0.85(95％CI 0.30-2.40)，并且在手术后第28天为1.24(95％CI
0.54-2.87)。考虑对PP分析组进行的分析，与通常的护理组相比，对于分配到XG-102
900μg组的患者，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.84(95％CI 0.28-2.46)，在手术后第14天为1.12(95％CI 0.41-3.05)，并且在手术后第28天为1.26(95％CI
0.52-3.04)。考虑到分配到XG-102 90μg组的患者，与通常的护理组相比，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.56(95％CI 0.16-1.97)，在手术后第14天为0.97(95％CI
0.34-2.77)，并且在手术后第28天为1.45(95％CI 0.58-3.61)。
0.54-2.87)。考虑对PP分析组进行的分析，与通常的护理组相比，对于分配到XG-102
900μg组的患者，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.84(95％CI 0.28-2.46)，在手术后第14天为1.12(95％CI 0.41-3.05)，并且在手术后第28天为1.26(95％CI
0.52-3.04)。考虑到分配到XG-102 90μg组的患者，与通常的护理组相比，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.56(95％CI 0.16-1.97)，在手术后第14天为0.97(95％CI
0.34-2.77)，并且在手术后第28天为1.45(95％CI 0.58-3.61)。
[0887]
[0888]
[0889] 数据是患者数目(％)。N＝每组患者数目，#＝数目，μg＝微克，％＝百分数，tx＝治疗。
[0890] **清除的眼睛炎症定义为0个细胞(即，细胞等级为0)和没有闪烁(即，闪烁等级为0)。
[0891] 激光闪烁计(LFM)：
[0892] 在整个研究过程中在确定的时间点获得的LFM测量在图63中描述为随时间且多达第28天对FAS的LFM测量。
[0893] 在研究流程中将挽救药物疗法定义为任意开放标记的抗炎眼睛治疗，其在随访过程中由于研究者判断的持久性的眼睛炎症而对患者开出。本研究程序规定，在引入开放标记的抗炎眼睛治疗时终止研究治疗滴眼液。当与地塞米松组相比较时，在XG-102 90μg组引入挽救药物疗法的患者的百分数是统计学不同的(对于XG-102 90μg和地塞米松组分布为21.3％相对于4.0％(p＝0.013))，而XG-102 900μg与地塞米松之间的差异(对于这两个组分布为14.6％和4.0％)不是统计学显著的(p＝0.88)。
[0894] 血浆中的药效学：
[0895] 在从Hotel Dieu医院(Paris)招募的32名患者的亚组中结膜下施用XG-102后60分钟采集血液样品用于定量XG-102。血浆中XG-102定量的分析报告显示，在任意患者的血浆样品中没有检测到XG-102-见下表：
[0896]
[0897] 数据是患者数目(％)。N＝获得XG-102定量样品的患者数目，#＝数目，μg＝微克，％＝百分数。LLOQ＝小于定量界限。*低于LLOQ的值(即，＜10ng/mL)被认为是‘不能检测到的’。
[0898] 综上所述，在手术后眼内炎症的进展过程中，XG-102 900μg不次于地塞米松滴眼液(差异：-0.054前房细胞等级，95％CI-0.350-0.242，p＜0.001)。对FAS重复相同的分析，发现XG-102 900μg不次于地塞米松滴眼液(差异：-0.032细胞等级，95％CI-0.301-0.238，p＜0.001)。鉴于关于对于FAS和PP分析组的上边界与零交叉，对于在第28天的前房细胞等级，XG-102 900μg不优于地塞米松滴眼液(对于FAS，p＝0.818，对于PP分析组，p＝0.720)。
[0899] 关于比较XG-102 90μg与地塞米松滴眼液的二级终点，在手术后眼内炎症的进展方面XG-102 90μg不次于地塞米松滴眼液(差异：0.086前房细胞等级，95％CI-0.214-0.385，p＝0.003)。对FAS重复相同的分析，并且发现XG-102 90μg不次于地塞米松滴眼液(差异：0.053前房细胞等级，95％CI-0.215-0.321p＜0.001)。
[0900] 在第7天或第14天在XG-102 90μg与地塞米松之间和XG-102 900μg与地塞米松之间在的前房细胞等级方面没有统计学显著差异。在第7天或第14天或在第28天在XG-102 90μg与地塞米松之间和XG-102 900μg与地塞米松之间的前房闪烁等级方面没有统计学显著差异。
[0901] 随时间进行的眼睛炎症评价通过清除的眼睛炎症进行评估。后者定义为具有等级为0的合计眼部炎症得分的受试者的比例，所述等级为0的合计眼部炎症得分定义为前房细胞等级＝0和前房闪烁等级＝0。这一结果在第7、14天和第28天进行评价，比较XG-102900μg与地塞米松和XG-102 90μg与地塞米松。关于对FAS进行的分析，与通常的护理组相比，对于分配到XG-102 900μg组的患者，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为
0.76(95％CI 0.25-2.28)，在手术后第14天为1.25(95％CI 0.47-3.32)，并且在手术后第
28天为1.13(95％CI 0.49-2.60)。关于分配到XG-102 90μg组的患者，与通常的护理组相比，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.52(95％CI 0.15-1.83)，在手术后第14天为0.85(95％CI 0.30-2.40)，并且在手术后第28天为1.24(95％CI 0.54-2.87)。
0.76(95％CI 0.25-2.28)，在手术后第14天为1.25(95％CI 0.47-3.32)，并且在手术后第
28天为1.13(95％CI 0.49-2.60)。关于分配到XG-102 90μg组的患者，与通常的护理组相比，在手术后第7天具有清除的炎症的机率为0.52(95％CI 0.15-1.83)，在手术后第14天为0.85(95％CI 0.30-2.40)，并且在手术后第28天为1.24(95％CI 0.54-2.87)。
[0902] 安全性评价
[0903] 暴露的程度
[0904] 本研究室双盲研究。在安全性分析中通过剂量组包括随机化的并且对其开始结膜下注射的所有患者。仅分析治疗出现的AEs，即，在开始研究治疗的结膜下注射后发生的AEs。如果提前终止研究治疗滴眼液(即，在第21天之前)，考虑的患者按照研究流程继续随访到第28天。研究治疗的结膜下注射总共施用给145名患者，其中47名患者施用XG-10290μg，48名患者施用XG-102 900μg，并且50名分配到地塞米松组的患者施用NaCL0.9％。
对于开始研究治疗的结膜下注射的所有患者，施用研究治疗的总量(即250μL)。
对于开始研究治疗的结膜下注射的所有患者，施用研究治疗的总量(即250μL)。
[0905] 患者对研究治疗滴眼液的暴露显示在下表中。考虑所述研究治疗滴眼液，在三个研究组中，本研究流程要求的对滴注研究治疗滴眼液的总体依从性＞90％。与分配到地塞米松组的患者(依从性为91％)相比，分配到XG-102治疗组中的患者具有略高的对滴注研究治疗滴眼液的依从性(对于XG-102 90μg和XG-102 900μg组分别为95％和94％)。五十名患者接受地塞米松滴眼液，平均持续20天(6-21天，最少-最多)，最大累积的剂量是81滴(81x0.05mg＝4.05mg)。
[0906]
[0907] 脚注：对于提前终止研究治疗滴眼液的患者，依从性计算为：使用的/计划的*100，其中计划的＝4*(从开始到退出的天数)。
[0908] 对于按照流程计划使用研究治疗滴眼液的患者，依从性计算为：((81-未使用的滴眼液瓶数)/81)*100。
[0909] 不利事件
[0910] 剂量组不利事件总结：
[0911] 报告的不利事件(严重的和不严重的)的总结按剂量组显示在图64中。关于报告AE的患者的数目，在XG-102 90μg与地塞米松组之间和XG-102 900μg与地塞米松组之间没有统计学显著差异。对于分配到XG-102 90μg的患者，对于分配到该组中的47名患者中有31名患者(66％)共报告78次AEs，并且对于分配到XG-102 900μg的患者，48名患者中有32名患者(67％)共报告69次AEs。对于分配到地塞米松组的患者，50名患者中有29名患者(58％)共报告55次AEs。在施用研究治疗后24小时内经历AE的患者的百分数在三个研究治疗组之间是相似的(即，对于XG-102 90μg、XG-102 900μg和地塞米松组’分别为34％、27％和30％)。
[0912] 报告的AEs按照严重性和剂量组的分布显示在下表中。研究者认为大部分(约70％)报告的AEs对于这三个剂量组是“轻度的”。
[0913]
[0914] 数据是事件数目(％报告的事件)
[0915] 导致研究治疗滴眼液的中断的AEs的总结性概况按剂量组显示在下表中：
[0916]
[0917] 数据是事件数目(报告的事件的％)
[0918] 对于分配到XG-102 90μg剂量组的患者，11次事件(在该剂量组中全部报告的AEs的14％)导致研究治疗的提前取消，而在XG-102 900μg和地塞米松剂量组中，研究治疗滴眼液分别由于8次事件(在该剂量组中全部报告的AEs的12％)和3次事件(在该剂量组中全部报告的AEs的6％)而中断。
[0919] 研究者评估(以不知情方式)每次报告的AE与任一种研究治疗的关系。如果研究者在回答该问题时记为‘可能的’或‘很可能的’，则认为事件与研究治疗相关。另外，研究者必须指明认为所述事件与哪种研究治疗(即XG-102或地塞米松)相关-见下表。对于在XG-102 90μg中的患者有18次事件，对于在XG-102 900μg中的患者有13次事件，以及对于在地塞米松组中的患者有15次事件被研究者(不知情评估)认为AEs与研究药物治疗可能或很可能相关(见下表)。研究者认为报告的SAEs无一与任一种研究治疗可能或很可能相关。
[0920]
[0921] 数据是事件数目。N＝每组患者数目，#＝数目，μg＝微克，％＝百分数。
[0922] 不利事件的展示：
[0923] 如果研究者在e-CRF上回答‘与研究治疗相关’的问题时记为‘可能的’或‘很可能的’，则认为报告的事件与研究治疗相关。在图65中可以找到关于随机分到三个研究组中的每一个中的至少2％的患者报告的AEs的总结(由MedDRA SOC和PT term评分)。
[0924] 不利事件的分析
[0925] 总之，关于报告AE的患者的数目，在XG-102剂量组与地塞米松剂量组之间没有统计学显著差异。对于分配到XG-102 90μg的患者，分配到该组的47名患者中有31名患者(66％)共报告78次AEs，并且对于分配到XG-102 900μg的患者，48名患者中有32名患者(67％)共报告69次AEs。对于分配到地塞米松组的患者，50名患者中有29名患者(58％)共报告55次AEs。在施用研究治疗后24小时内经历AE的患者的百分数在三个研究治疗组之间是相似的(即，对于XG-102 90μg、XG-102 900μg和地塞米松组’分别为34％、27％和30％)。
[0926] 最常报告的AEs是在SOC′眼睛病症(SOC ′EYE DISORDERS)中。在该SOC内，对于分配到XG-102 90μg的26名(55％)患者报告49次事件，对于分配到XG-102 900μg的24名(50％)患者报告43次事件，并且对分配到地塞米松的患者中有16名(32％)患者报告30次事件。关于在该SOC中报告事件的患者数目，在XG-102 90μg与地塞米松组之间没有统计学显著差异(p＝0.025)。与分配到XG-102 900μg或地塞米松剂量组的患者相比，分配到XG-102 90μg的患者最常报告指示炎症的事件(如‘眼睛炎症’、‘角膜水肿’、‘眼睑水肿’)。分配到XG-102 900μg组的患者更常报告眼睛疼痛，并且当与地塞米松组相比时，报告这一事件的患者数目的差异是统计学显著的(p＝0.029)。在SOC‘研究’中，分配到XG-102 90μg的患者(23％)更常报告‘增加的眼内压’，与此相比，对于XG-102900μg和地塞米松组分别为10％和14％。报告这一事件的患者数目(XG-102 90μg与地塞米松之间)的差异不是统计学显著的。11名分配到XG-102 90μg的患者、8名分配到XG-102 900μg的患者和3名分配到地塞米松的患者由于AE中断研究治疗滴眼液。图65显示了不论随机化分组至少2％的患者发生的AEs(由MedDRA SOC和优选项目(Preferred Term(PT))分类)的总结。
[0927] 严重不利事件
[0928] 图66列出了考虑的严重不利事件。总共对9名患者报告了9次SAEs-即，4名随机分到XG-102 90μg剂量组的患者，3名随机分到XG-102 900μg剂量组的患者，和2名随机分到地塞米松剂量组的患者。共有一次SAE(对于随机分到XG-102 90μg剂量组的患者)是在施用研究治疗的结膜下注射后前24小时内报告的。研究者认为报告的SAEs无一与研究治疗相关。对于所有报告的SAEs的‘严重性原因’是‘住院治疗’。图66显示了报告的SAEs的总结。
[0929] 临床实验室评价
[0930] 对于本研究进行的血液学和化学测定显示在下表中。所有的实验室检测都在当地进行。
[0931]
[0932] 安全性结论
[0933] 综上所述，在进行复杂眼睛手术的患者中，XG-102 90μg和XG-102 900μg是良好耐受的。11名随机分到XG-102 90μg的患者、8名随机分到XG-102 900μg的患者和3名随机分到地塞米松的患者提前终止研究治疗滴眼液。提前退出研究治疗的原因主要是由于持久的眼睛炎症，在研究者的观点看来，这必须加强抗炎治疗。对于考虑的患者，开始使用开放标记的抗炎眼睛治疗的治疗。
[0934] 在本研究中没有报告致死性事件。共有9名患者报告了9次SAEs，并且这些事件中无一被认为与研究治疗相关。
[0935] 考虑报告的AEs总数，在报告AE的患者数目方面，在XG-102剂量组与地塞米松组之间没有统计学显著性差异。对于分配到XG-102 90μg的患者，47名分配到该组的患者中31名患者(66％)共报告78次AEs，对于分配到XG-102 900μg的患者，48名患者中有32名患者(67％)共报告69次AEs。对于分配到地塞米松组的患者，50名患者中有29名患者(58％)共报告55次AEs。在施用研究治疗后24小时内经历AE的患者的百分数在三个研究治疗组之间是相似的(即，对于XG-102 90μg、XG-102 900μg和地塞米松组’分别为
34％、27％和30％)。与XG-102 900μg和地塞米松组相比，分配到XG-102 90μg组的患者中经历指示眼睛炎症的AE的患者数目更高，这表明XG-102 90μg在复杂眼睛手术继发性的眼睛炎症治疗中可能有效性较小。与XG-102 90μg和地塞米松组相比，分配到XG-102
900μg组的患者中经历指示眼睛疼痛的AE的患者数目更高。对于XG-102 90μg组中的两名患者，在研究治疗的结膜下注射液的注射后不到24小时报告了眼睛疼痛-对于这些患者中的一名，手术后没有开止痛剂治疗。对于这些患者中的一名，在35天后再次报告眼睛疼痛为AE，在此时，该患者报告具有升高的IOP。
34％、27％和30％)。与XG-102 900μg和地塞米松组相比，分配到XG-102 90μg组的患者中经历指示眼睛炎症的AE的患者数目更高，这表明XG-102 90μg在复杂眼睛手术继发性的眼睛炎症治疗中可能有效性较小。与XG-102 90μg和地塞米松组相比，分配到XG-102
900μg组的患者中经历指示眼睛疼痛的AE的患者数目更高。对于XG-102 90μg组中的两名患者，在研究治疗的结膜下注射液的注射后不到24小时报告了眼睛疼痛-对于这些患者中的一名，手术后没有开止痛剂治疗。对于这些患者中的一名，在35天后再次报告眼睛疼痛为AE，在此时，该患者报告具有升高的IOP。
[0936] 对于XG-102 900μg组中的三名患者(即，患者FR-02-0013，FR-03-003和FR-05-0060)，在研究治疗的结膜下注射液的注射后不到24小时报告了眼睛疼痛，并且对于这些患者中的一名(即，患者FR-02-0013)，在五天后再次报告眼睛疼痛为AE。对于在同一剂量组中的四名患者(即，患者FR-04-0108，FR-05-0127，FR-05-0152和FR-05-0155)，在同时结膜下注射研究治疗后＞24消失报告眼睛疼痛。对于这些患者中的三名，与其他AEs一起报告眼睛疼痛(即，患者FR-02-0113，FR-05-0127和FR-05-0155)。地塞米松组的一名患者(即FR-03-0087)在同时结膜下注射研究治疗后＞24消失报告了眼睛疼痛。这一事件与另一种AE同时报告。鉴于进行复杂的手术，眼睛疼痛还可能与手术后缝合线的存下有关。
[0937] 总结
[0938] 依从性：对于开始结膜下注射研究治疗的所有患者，施用总量(即250μL)。在三个研究治疗组中，对于所述研究治疗滴眼液的整体依从性＞90％。
[0939] 安全性：在报告不利事件的患者数目方面，在任一个XG-102剂量组与地塞米松组之间不存在统计学显著性差异。对于分配到XG-102 90μg的患者，47名分配到该组的患者中有31名患者(66％)共报告78次不利事件，并且对于分配到XG-102 900μg的患者，48名患者中有32名患者(67％)共报告69次不利事件。对于分配到地塞米松组的患者，50名患者中有29名患者(58％)共报告55次不利事件。在施用研究治疗后24小时内经历不利事件的患者的百分数在三个研究治疗组之间是相似的(即，对于XG-102 90μg、XG-102900μg和地塞米松组’分别为34％、27％和30％)。与XG-102 900μg和地塞米松组相比，更多分配到XG-102 90μg组的患者经历指示眼睛炎症的不利事件，这可能提示XG-102
90μg在复杂眼睛手术继发性的眼睛炎症治疗中可能有效性较小(与900μg和地塞米松剂量组相比)。与XG-102 90μg和地塞米松组相比，分配到XG-102 900μg组的患者中经历指示眼睛疼痛的不利事件的患者数目更高。眼睛疼痛可能与手术后缝合线的存在有关。分配到XG-102 90μg的患者(23％)更常报告‘增加的眼内压’，与此相比，对于XG-102 900μg和地塞米松组分别为10％和14％。报告这一事件的患者数目(XG-102 90μg与地塞米松之间)的差异不是统计学显著的。
90μg在复杂眼睛手术继发性的眼睛炎症治疗中可能有效性较小(与900μg和地塞米松剂量组相比)。与XG-102 90μg和地塞米松组相比，分配到XG-102 900μg组的患者中经历指示眼睛疼痛的不利事件的患者数目更高。眼睛疼痛可能与手术后缝合线的存在有关。分配到XG-102 90μg的患者(23％)更常报告‘增加的眼内压’，与此相比，对于XG-102 900μg和地塞米松组分别为10％和14％。报告这一事件的患者数目(XG-102 90μg与地塞米松之间)的差异不是统计学显著的。
[0940] 研究者认为所报告的全部不利事件(AE)中的大部分(约70％)是“轻度的”。总之，对于在XG-102 90μg中的患者报告的18次事件，对于在XG-102 900μg中的患者报告的13次事件，以及对于在地塞米松组中的患者报告的15次事件被研究者(不知情评估)认为AEs与研究药物治疗可能或很可能相关。在本研究中没有报告致死性事件。共有9名患者报告了9次SAEs，并且这些事件中无一被认为与研究治疗相关。
[0941] XG-102的定量在32名患者的亚组中进行。在结膜下注射研究治疗后1小时获得血液样品。对由所有获得的样品(不管所分配的级联组)，分析XG-102浓度，该浓度低于＜10ng/ml的定量下限(LLOQ)。
[0942] 按照我们的非劣性定义，作为单次结膜下注射施用的XG-102 900μg和XG-10290μg在进行复杂眼睛手术的患者中的手术后眼内炎症的治疗中都不次于每天滴注4次持续21天的地塞米松滴眼液治疗，如通过前房细胞等级评估的。
[0943] 总体上，XG-102 90μg和XG-102 900μg是良好耐受的。报告的不利事件中无一指示XG-102不可耐受的或不可逆转的副作用。在XG-102 90μg中报告的增加的指示眼睛炎症的事件数量表明该剂量在治疗复杂眼内手术后的患者中的手术后眼内炎症方面有效性较小。这还可能得到在XG-102 90μg组中由于持久性的眼睛炎症引入挽救药物疗法的患者的百分数加强证实。在施用研究治疗的结膜下注释后1小时评估的XG-102血浆定量证明不存在XG-102系统性排泄(systemic passage)。
[0944] 实施例28：XG-102对p-38(Mapk14)缺乏小鼠中的体内肝癌的作用
[0945] Mapk14，还称为p-38，是公知的细胞增殖和肿瘤发生的负向调节剂。在本研究f/f Δli* f/f f/f Δli* Δli*中，使用Mapk14 和Mapk14 小鼠以及Mapk14 Jun 和Mapk14 Jun 小鼠。
Δli* Δli* Δli* f/f
“Mapk14 ”和“Mapk14 Jun ”在此处分别意指多IC-处理的Mx-cre/Mapk14 小鼠和f/f f/f
Mx-cre缺失的Mapk14 Jun 小鼠，由此分别通过Mx-cre过程导致Mapk14“缺失”和Jun-/- -/- -/-
缺失，即，分别为“Mapk14 ”小鼠和“Mapk14 Jun ”小鼠。
Δli* Δli* Δli* f/f
“Mapk14 ”和“Mapk14 Jun ”在此处分别意指多IC-处理的Mx-cre/Mapk14 小鼠和f/f f/f
Mx-cre缺失的Mapk14 Jun 小鼠，由此分别通过Mx-cre过程导致Mapk14“缺失”和Jun-/- -/- -/-
缺失，即，分别为“Mapk14 ”小鼠和“Mapk14 Jun ”小鼠。
[0946] XG-102以20mg/kg的剂量每周两次腹膜内施用，以研究其对二乙基亚硝胺(DEN)-诱导的肝细胞和肝肿瘤细胞的过度增殖的作用(参见Hui L.等人，p38a
suppresses normal and cancer cell proliferation by antagonizing the JNK-c-Jun pathway(p38a通过拮抗JNK-c-Jun途径而抑制正常细胞和癌症细胞的增殖).Nature Genetics，2007；39：741-749)。PBS用作对照。具体地，在DEN处理之前，用PBS或XG-102(每f/f Δli*
kg体重20mg)注射Mapk14 和Mapk14 小鼠。然后通过在DEN处理后48小时的Ki67
染色分析小鼠中肝细胞的增殖并定量。
suppresses normal and cancer cell proliferation by antagonizing the JNK-c-Jun pathway(p38a通过拮抗JNK-c-Jun途径而抑制正常细胞和癌症细胞的增殖).Nature Genetics，2007；39：741-749)。PBS用作对照。具体地，在DEN处理之前，用PBS或XG-102(每f/f Δli*
kg体重20mg)注射Mapk14 和Mapk14 小鼠。然后通过在DEN处理后48小时的Ki67
染色分析小鼠中肝细胞的增殖并定量。
[0947] 图67在左图中显示XG-102(在该图中称作“D-JNKI1”)或PBS治疗的Mapk14f/f和Δli*Mapk14 小鼠中肝细胞的增殖(Ki67-阳性细胞的定量)。在PBS条件下(对照)，由于不存-/- Δli*
在Mapk14(p38)对细胞增殖和肿瘤发生的负向调节作用，因此，Mapk14 细胞(Mapk14 )+/+ f/f
比Mapk14 细胞(Mapk14 )增殖更强烈。施用XG-102通过XG-102(DJNKI1)的活性恢复-/-
了Mapk14的这种“无活性”(在Mapk14 细胞中)。
在Mapk14(p38)对细胞增殖和肿瘤发生的负向调节作用，因此，Mapk14 细胞(Mapk14 )+/+ f/f
比Mapk14 细胞(Mapk14 )增殖更强烈。施用XG-102通过XG-102(DJNKI1)的活性恢复-/-
了Mapk14的这种“无活性”(在Mapk14 细胞中)。
[0948] 在图67的右图中，显示了在XG-102(在该图中称作“D-JNKI1”)治疗的Mapk14f/f f/f +/+ +/+ Δli* Δli* -/- -/-Jun (意指Mapk14 Jun )和Mapk14 Jun 小鼠(意指Mapk14 Jun )中肝细
f/f
胞的增殖(Ki67-阳性细胞的定量)。这些结果是等价的并且模拟PBS条件下Mapk14 和Δli*
XG-102(DJNKI1)条件下Mapk14 的结果。因此，XG-102的活性“等价于”删除细胞系中的Jun基因。
f/f
胞的增殖(Ki67-阳性细胞的定量)。这些结果是等价的并且模拟PBS条件下Mapk14 和Δli*
XG-102(DJNKI1)条件下Mapk14 的结果。因此，XG-102的活性“等价于”删除细胞系中的Jun基因。
[0949] 综上所述，这些结果证实XG-102具有对癌细胞系的生长的作用(恢复Mapk14缺失诱导的过度生长)，并且这很可能受Jun调控。
[0950] 实施例29：XG-102对体内人肝癌细胞(植入的)的作用
[0951] 为了研究XG-102对体内人肝癌细胞的作用，将3X106个Huh7人肝癌细胞皮下注射到4周龄裸鼠的两胁区域。在Huh7注射后，裸鼠每周用5mg/kg的XG-102腹膜内治疗两次。每周测量肿瘤体积两次。在异种移植后4周将小鼠处死。
[0952] 如图68所示，在裸鼠中皮下注射人肝细胞癌后每周两次腹膜内施用的XG-102以5mg/kg的剂量显著减少肿瘤的生长。
[0953] 实施例30：1mg/kg XG-102在携带正位HEP G2人肝癌的Swiss裸鼠中的抗肿瘤活性
[0954] 本研究的目的是在携带正位Hep G2人肝癌肿瘤的SWISS裸鼠模型中确定1mg/kg XG-102的抗肿瘤活性。
[0955] 20只健康的雌性SWISS裸鼠从Charles River(L′Arbresles，France)获得。动物实验按照欧洲动物实验伦理指南(European ethical guidelines of animal experimentation)和英国关于实验瘤形成的动物福利的指南进行。动物保持在处于控制的温度(23±2℃)、湿度(45±5％)、光周期(12h光/12h暗)和换气条件的房间
中。动物保持在SPF条件下，并且继续监控室温和湿度。空气调节系统设定程序为每小时14次换气，没有回流。新鲜的外部空气通过一系列的滤器，然后平均扩散到每个房间中。在实验室中维持高压(20±4Pa)，以防止污染或病原体在小鼠群落中的散播。所有在SPF条件下工作的人员在他们进入动物饲养区时都遵循特定的卫生和着装指导。动物笼养在聚碳酸酯笼子(UAR，Epinay sur Orge，France)中，所述笼子被配置提供食物和水。使用的标准笼面积是800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌木屑(SERLAB，Cergy-Pontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自SERLAB(Cergy-Pontoise，France)。无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
中。动物保持在SPF条件下，并且继续监控室温和湿度。空气调节系统设定程序为每小时14次换气，没有回流。新鲜的外部空气通过一系列的滤器，然后平均扩散到每个房间中。在实验室中维持高压(20±4Pa)，以防止污染或病原体在小鼠群落中的散播。所有在SPF条件下工作的人员在他们进入动物饲养区时都遵循特定的卫生和着装指导。动物笼养在聚碳酸酯笼子(UAR，Epinay sur Orge，France)中，所述笼子被配置提供食物和水。使用的标准笼面积是800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌木屑(SERLAB，Cergy-Pontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自SERLAB(Cergy-Pontoise，France)。无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
[0956] 对于XG-102施用，在无菌水(WFI，Aguettant)中制备10mM(对应38.22mg/ml)的储液。制备用于每个治疗日的等分试样，并且保存在约-80℃。在每个治疗日将该储液用WFI稀释至0.2mg/ml并且在2-4℃保存最多24小时。储液的稳定性在约-80℃超过100天；用于动物给药的稀释的制剂在2-4℃的稳定性为24小时。经稀释的制剂保持放置在冰上直到使用时，并且将未使用的稀释的物质丢弃。XG-102的治疗剂量以1mg/kg/inj注射。注射在D10，D14，D18，D22，D41，D45，D49和D53([Q4Dx4]x2)天进行。XG-102物质通过小鼠尾静脉以5ml/kg静脉内(IV)注射。注射体积按照小鼠最近的个体体重进行调整。
[0957] 肿瘤细胞系和培养基从Oncodesign购买和提供：
[0958]细胞系 类型 物种 来源 参考文献
Hep G2 人肝癌 人 ATCC* 4
Hep G2 人肝癌 人 ATCC* 4
[0959] *American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)，Manassas，Virginia，USA。
[0960] Hep G2细胞系在1975年由患有肝细胞癌的15岁阿根廷男孩的肿瘤组织建立(ADEN D.P.等人，Nature，282：615-616，1979)。肿瘤细胞作为贴壁的单层在37℃在潮湿的气氛(5％CO2，95％空气)中生长。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(Ref BE12-702F，Lonza，Verviers，Belgium)并补充有10％FBS(Ref DE14-801E，Lonza)的RPMI 1640。对于实验应用，通过用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Ref 02-007E，Cambrex)处理5分钟将细胞从培养瓶上解离下来，稀释在不含钙或镁的Hanks’培养基(Ref BE10-543F，Cambrex)中并且通过加入完全培养基而中和。在血细胞计数器中计数细胞，并且通过0.25％台盼蓝排除法评估它们的存活力。使用 支原体检测试剂盒( Mycoplasma DetectionKit(Ref LT07-318，Lonza))按照供应商的使用说明进行支原体(Mycoplasma)检测。
测定是选择性的生化检测，其研究支原体酶的活性。存活的支原体被裂解，
并且酶与 底物反应，催化ADP向ATP的转化。通过测量在加入
底物之前和之后样品中的ATP水平，可以获得比例，该比例指示支原体的存在或不存在。
支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较(Internal Standard
Operating Procedure No TEC-007/002，数目未显示但是记录在案)。
测定是选择性的生化检测，其研究支原体酶的活性。存活的支原体被裂解，
并且酶与 底物反应，催化ADP向ATP的转化。通过测量在加入
底物之前和之后样品中的ATP水平，可以获得比例，该比例指示支原体的存在或不存在。
支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较(Internal Standard
Operating Procedure No TEC-007/002，数目未显示但是记录在案)。
[0961] 实验设计：
[0962] 在肿瘤诱导前二十四小时，将20只雌性SWISS裸鼠用γ-源(2.5Gy，Co60，INRA，Dijon，France)照射。在D0，对20只雌性SWISS裸鼠正位诱导Hep G2肿瘤。在麻醉下，通过在无菌条件下的正中切口将动物腹部打开。将混悬在50μl RPMI 1640培养基中的一千万(107)个Hep G2肿瘤细胞注射到肝的被膜下区域。然后将腹腔用5-0缝合线以2层缝合。
[0963] 在D10，在治疗开始前，将小鼠按照它们的体重随机分成2组，每组10只小鼠。每组的体重彼此之间没有统计学差异(方差分析)。组1的小鼠在D10，D14，D18，D22，D41，D45，D49和D53([Q4Dx4]x2)接受5ml/kg/inj.的一次静脉内(IV)赋形剂注射，而组2的小鼠在D10，D14，D18，D22，D41，D45，D49和D53([Q4Dx4]x2)接受1mg/kg/inj.的一次静脉内(IV)XG-102注射：
[0964]组 动物数 治疗 剂量 途径治疗时间方案
1 8 赋形剂 - IV [Q4Dx4]x2
2 7 XG-102 1 IV [Q4Dx4]x2
1 8 赋形剂 - IV [Q4Dx4]x2
2 7 XG-102 1 IV [Q4Dx4]x2
[0965] 将存活的小鼠在D185处死。
[0966] 在整个研究过程中每天监测小鼠的行为和存活。在整个研究过程中对所有小鼠每周监测体重两次。在细胞注射、IV治疗和处死前，使用异氟烷 (Centravet，Bondoufle，France)麻醉动物。在实验过程中，如果发生下述中的任一项，则通过颈脱位法将动物在异氟烷 麻醉下处死：
[0967] ·痛苦迹象(恶病质，虚弱，难以运动或进食)，
[0968] ·化合物中毒(背部弓起，惊厥)，
[0969] ·连续3天减轻20％重量或任一天减轻25％体重。
[0970] 在每种情形进行尸体解剖。当小鼠看上去濒死时，将它们处死并进行尸体剖检。采集肝脏并且称重。
[0971] 绘制小鼠的体重曲线用于体重分析。平均体重变化(MBWC)：计算治疗的动物以克为单位的平均体重变化(在第X天的体重减去在D10的体重)。
[0972] 功效参数表示为百分数(T/C％)。T将是用药物治疗的动物的中值存活时间，C是用赋形剂治疗的对照动物的中值存活时间。当T/C百分数超过125时，存活系统表示某种程度的成功。T/C％如下述表示：T/C％＝[T/C]x100。绘制小鼠的存活曲线。每个治疗组的平均存活时间计算为死亡天数的平均值。每个治疗组的中值存活时间计算为死亡天数的中值。利用时序(Kaplan-Meier)检验比较存活曲线。使用 软件(AbacusConcept，Berkeley，USA)用Bonferroni/Dunn检验(ANOVA比较)进行体重和MBWC的统计学分析。认为＜0.05的p值是显著的。所有组都与自身进行比较。
[0973] 在图69中，显示了携带正位注射的HEP G2肿瘤的小鼠的平均体重和平均体重变化曲线。按照在D10和D41重复两次的Q4Dx4治疗时间表，对小鼠用XG-102以1mg/kg/inj静脉内(IV)治疗。如图69所示，对于体重没有明显的差异发生，这表明XG-102是良好耐受的。相应地，在图70中，显示了各自的统计学数据。
[0974] 图71显示小鼠长期存活曲线，其中显示了每组存活到处死日(D185)的小鼠的比例。将小鼠按照在D10和D41重复两次的Q4Dx4治疗时间方案用XG-102以所示的剂量进行治疗。这些数据清楚地显示用XG-102治疗的小鼠的延长的存活。相应地，统计学数据显示在下(用HepG2肿瘤异种移植并用XG-102治疗的小鼠的存活分析)：
[0975]
[0976]组 Chi df p 显著性
XG-102 1mg/kg 5.1550 1 0.0232 S
XG-102 1mg/kg 5.1550 1 0.0232 S
[0977] 小鼠存活时间表示为作为T/C(％)值(治疗组与未治疗的荷瘤对照组的死亡天数中值之间的比例)的中值存活时间。将赋形剂治疗组视为参比，使用时序检验进行统计学分析。
[0978] 综合考虑，这些数据表明施用XG-102延长用HepG2肿瘤异种移植的小鼠的存活时间。
[0979] 实施例31：在携带正位HEP G2人肝癌的Swiss裸鼠中XG-102的抗肿瘤活性(剂量/反应)
[0980] 本研究的目的是在携带正位Hep G2人肝癌肿瘤的SWISS裸鼠模型中确定XG-102的抗肿瘤活性(剂量/反应)。
[0981] 32只健康的雌性SWISS裸鼠获自Charles River(L′Arbresles，France)。动物实验按照欧洲动物实验伦理指南(European ethical guidelines of animal experimentation)和英国关于实验瘤形成的动物福利的指南进行。动物保持在处于控制的温度(23±2℃)、湿度(45±5％)、光周期(12h光/12h暗)和换气条件的房间
中。动物保持在SPF条件下，并且继续监控室温和湿度。空气调节系统设定程序为每小时14次换气，没有回流。新鲜的外部空气通过一系列的滤器，然后平均扩散到每个房间中。在实验室中维持高压(20±4Pa)，以防止污染或病原体在小鼠群落中的散播。所有在SPF条件下工作的人员在他们进入动物饲养区时都遵循特定的卫生和着装指导。动物笼养在聚碳酸酯笼子(UAR，Epinay sur Orge，France)中，所述笼子被配置提供食物和水。使用的标准笼面积是800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌木屑(SERLAB，Cergy-Pontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自SERLAB(Cergy-Pontoise，France)。无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
中。动物保持在SPF条件下，并且继续监控室温和湿度。空气调节系统设定程序为每小时14次换气，没有回流。新鲜的外部空气通过一系列的滤器，然后平均扩散到每个房间中。在实验室中维持高压(20±4Pa)，以防止污染或病原体在小鼠群落中的散播。所有在SPF条件下工作的人员在他们进入动物饲养区时都遵循特定的卫生和着装指导。动物笼养在聚碳酸酯笼子(UAR，Epinay sur Orge，France)中，所述笼子被配置提供食物和水。使用的标准笼面积是800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌木屑(SERLAB，Cergy-Pontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自SERLAB(Cergy-Pontoise，France)。无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
[0982] 对于XG-102施用，用无菌水(WFI，Aguettant，France)制备浓度为1mg/ml的XG-102。然后将其用无菌水稀释成0.2和0.02mg/ml的浓度。所有这些步骤在注射到小鼠前一小时内进行。XG-102以0.1，1和5mg/kg/inj.注射。进行四次注射，每次间隔四天(Q4Dx4)。XG-102物质通过小鼠尾静脉以5ml/kg静脉内(IV)注射。注射体积按照小鼠最近的个体体重进行调整。
[0983] 肿瘤细胞系和培养基从Oncodesign购买和提供：
[0984]细胞系 类型 物种 来源 参考文献
HepG2 人肝癌 人 ATCC* 4
HepG2 人肝癌 人 ATCC* 4
[0985] *American Type Culture Collection，Manassas(美国典型培养物保藏中心)，Virginia，USA。
[0986] Hep G2细胞系在1975年由患有肝细胞癌的15岁阿根廷男孩的肿瘤组织建立(ADEN D.P.等人，Nature，282：615-616，1979)。肿瘤细胞作为贴壁的单层在37℃在潮湿的气氛(5％CO2，95％空气)中生长。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(Ref BE12-702F，Lonza，Verviers，Belgium)并补充有10％FBS(Ref DE14-801E，Lonza)的RPMI 1640。对于实验应用，通过用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Ref 02-007E，Cambrex)处理5分钟将细胞从培养瓶上解离下来，稀释在不含钙或镁的Hanks’培养基(Ref BE10-543F，Cambrex)中并且通过加入完全培养基而中和。在血细胞计数器中计数细胞，并且通过0.25％台盼蓝排除法评估它们的存活力。使用 支原体检测试剂盒(Mycoplasma Detection Kit(Ref LT07-318，Lonza))按照供应商的使用说明进行支原体(Mycoplasma)检测。 测定是选择性的生化检测，其研究支原体酶的活性。存
活的支原体被裂解，并且酶与 底物反应，催化ADP向ATP的转化。通过测量
在加入 底物之前和之后样品中的ATP水平，可以获得比例，该比例指示支原
体的存在或不存在。支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较
(Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002)。
活的支原体被裂解，并且酶与 底物反应，催化ADP向ATP的转化。通过测量
在加入 底物之前和之后样品中的ATP水平，可以获得比例，该比例指示支原
体的存在或不存在。支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较
(Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002)。
[0987] 实验设计：
[0988] 在肿瘤诱导前二十四小时，将32只雌性SWISS裸鼠用γ-源(2.5Gy，Co60，INRA，Dijon，France)照射。在D0，对32只雌性SWISS裸鼠正位诱导Hep G2肿瘤。在麻醉下，通过在无菌条件下的正中切口将动物腹部打开。将混悬在50μl RPMI 1640培养基中的7
一千万(10)个Hep G2肿瘤细胞注射到肝的被膜下区域。然后将腹腔用5-0缝合线以2层缝合。
一千万(10)个Hep G2肿瘤细胞注射到肝的被膜下区域。然后将腹腔用5-0缝合线以2层缝合。
[0989] 在D10，在治疗开始前，将小鼠按照它们的体重随机分组，分成4组，每组8只小鼠。每组的体重彼此之间没有统计学差异(方差分析)。组1的小鼠接受一次5ml/kg/inj.的赋形剂静脉内(IV)注射，每四天一次，重复四次(Q4Dx4)，组2的小鼠接受一次0.1mg/kg/inj.的XG-102静脉内(IV)注射，每四天一次，重复四次(Q4Dx4)，组3的小鼠接受一次1mg/kg/inj.的XG-102静脉内(IV)注射，每四天一次，重复四次(Q4Dx4)，并且组4的小鼠接受一次5mg/kg/inj.的XG-102静脉内(IV)注射，每四天一次，重复四次(Q4Dx4)：
[0990]组 动物数 治疗 剂量 途径治疗时间方案
1 8 赋形剂 - IV Q4Dx4
2 8 XG-102 0.1 IV Q4Dx4
3 8 XG-102 1 IV Q4Dx4
4 8 XG-102 5 IV Q4Dx4
1 8 赋形剂 - IV Q4Dx4
2 8 XG-102 0.1 IV Q4Dx4
3 8 XG-102 1 IV Q4Dx4
4 8 XG-102 5 IV Q4Dx4
[0991] 将存活的小鼠在D171处死。
[0992] 在整个研究过程中每天监测小鼠的行为和存活。在整个研究过程中对所有小鼠每周监测体重两次。在细胞注射、IV治疗和处死前，使用异氟烷 (Centravet，Bondoufle，France)麻醉动物。在实验过程中，如果发生下述中的任一项，则通过颈脱位法将动物在异氟烷 麻醉下处死：
[0993] ·痛苦迹象(恶病质，虚弱，难以运动或进食)，
[0994] ·化合物中毒(背部弓起，惊厥)，
[0995] ·连续3天减轻20％重量或任一天减轻25％体重。
[0996] 在每种情形进行尸体解剖。
[0997] 在D67，在随机化过程中，将每组随机选择的3只小鼠处死，用于观察宏观的发展。将每组其余的小鼠保持用于存活监测。在D171进行最后的处死。从处死的动物采集原发性肿瘤和肝脏，并称重。将每个肝固定在10％中性缓冲的福尔马林中。采集后四十八(48)小时，将它们包埋在石蜡 中并且用于病理学分析(anapathologicalanalysis)。为了通过组织学分析估测小鼠肝中的转移侵入，将石蜡-包埋的切片(5μm)在二甲苯中脱去石蜡并且通过在100％、95％和70％乙醇中连续温育而再水合。全部切片用苏木精和曙红(HE)(Ref.S3309，Dakocytomation，Trappes，France)染色用于组织学分析。将盖玻片用水性封固剂(Aquatex，Ref 1.08562，Merck)封固，并在光学显微镜(DMRB Leica)下观察切片。通过病理学专家分析组织学切片，以确定肝中的转移侵入。
[0998] 绘制小鼠的体重曲线用于体重分析。平均体重变化(MBWC)：计算治疗的动物以克为单位的平均体重变化(在第X天的体重减去在D10的体重)。
[0999] 功效参数表示为百分数(T/C％)。T将是用药物治疗的动物的中值存活时间，C是用赋形剂治疗的对照动物的中值存活时间。当T/C百分数超过125时，存活系统表示某种程度的成功。T/C％如下述表示：T/C％＝[T/C]x100。绘制小鼠的存活曲线。每个治疗组的平均存活时间计算为死亡天数的平均值。每个治疗组的中值存活时间计算为死亡天数的中值。利用时序(Kaplan-Meier)检验比较存活曲线。使用 软件(AbacusConcept，Berkeley，USA)用Bonferroni/Dunn检验(ANOVA比较)进行体重和MBWC的统计学分析。认为＜0.05的p值是显著的。所有组都与自身进行比较。
[1000] 图72显示了关于携带正位注射的HEP G2肿瘤的小鼠的平均体重和平均体重变化曲线的统计学数据。按照在D10和D41重复两次的Q4Dx4治疗时间表，对小鼠用XG-102静脉内(IV)治疗。如图72所示，对于体重没有明显的差异发生，这表明XG-102是良好耐受的。
[1001] 图73显示小鼠长期存活曲线，其中显示了每组存活到处死日(D171)的小鼠的比例。从计算中排除了在D67处死用于尸体解剖的小鼠。将小鼠按照在D10和D41重复两次的Q4Dx4治疗时间方案用XG-102以所示的剂量进行治疗。这些数据清楚地显示用XG-102治疗的小鼠的剂量依赖性方式的延长的存活。相应地，统计学数据显示在下(用HepG2肿瘤异种移植并用XG-102治疗的小鼠的存活分析)：
[1002]
[1003] 从计算中排除了在D67处死用于尸体解剖的小鼠。小鼠存活时间表示为作为T/C(％)值(治疗组与未治疗的荷瘤对照组的死亡天数中值之间的比例)的中值存活时间。＞125％的T/C％值表示抗肿瘤有效性。
[1004] 下表显示HepG2癌细胞向肝内的肿瘤发展。对在D171处死的小鼠HE染色后通过显微镜观察进行肝上肿瘤量的检测：
[1005]
[1006] 在图74中，通过显微镜评价在D67或在D67与最终处死之间处死的小鼠观察到的肿瘤侵入显示为直方图。将肿瘤的水平分类为4种图例所示的不同种类。
[1007] 实施例32：在携带皮下PC-3人前列腺肿瘤的Balb/c裸鼠中XG-102的抗肿瘤活性
[1008] 本研究的目的是在携带皮下PC-3人前列腺肿瘤的Balb/c裸鼠模型中确定XG-102的抗肿瘤活性(剂量/反应)。
[1009] 15只健康的雄性Balb/c裸鼠获自Charles River(L′Arbresles，France)。动物实验按照欧洲动物实验伦理指南(European ethical guidelines of animal experimentation)和英国关于实验瘤形成的动物福利的指南进行。动物保持在处于控制的温度(23±2℃)、湿度(45±5％)、光周期(12h光/12h暗)和换气条件的房间
中。动物保持在SPF条件下，并且继续监控室温和湿度。空气调节系统设定程序为每小时14次换气，没有回流。新鲜的外部空气通过一系列的滤器，然后平均扩散到每个房间中。在实验室中维持高压(20±4Pa)，以防止污染或病原体在小鼠群落中的散播。所有在SPF条件下工作的人员在他们进入动物饲养区时都遵循特定的卫生和着装指导。动物笼养在聚碳酸酯笼子(UAR，Epinay sur Orge，France)中，所述笼子被配置提供食物和水。使用的标准笼面积是800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌木屑(SERLAB，Cergy-Pontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自SERLAB(Cergy-Pontoise，France)。无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
中。动物保持在SPF条件下，并且继续监控室温和湿度。空气调节系统设定程序为每小时14次换气，没有回流。新鲜的外部空气通过一系列的滤器，然后平均扩散到每个房间中。在实验室中维持高压(20±4Pa)，以防止污染或病原体在小鼠群落中的散播。所有在SPF条件下工作的人员在他们进入动物饲养区时都遵循特定的卫生和着装指导。动物笼养在聚碳酸酯笼子(UAR，Epinay sur Orge，France)中，所述笼子被配置提供食物和水。使用的标准笼面积是800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌木屑(SERLAB，Cergy-Pontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自SERLAB(Cergy-Pontoise，France)。无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
[1010] 对于XG-102施用，用无菌水(WFI，Aguettant，France)制备浓度为0.2mg/ml的XG-102。然后将其用无菌水稀释成0.02mg/ml的浓度。所有这些步骤在注射到小鼠前一小时内进行。XG-102以0.1和1mg/kg/inj.注射。进行四次注射，每次间隔四天(Q4Dx4)。XG-102物质通过小鼠尾静脉以5ml/kg静脉内(IV)注射。如果尾巴在注射期间坏死，则使用腹膜内(IP)途径。注射体积按照小鼠最近的个体体重进行调整。
[1011] 肿瘤细胞系和培养基从Oncodesign购买和提供：
[1012]
[1013] *American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)，Manassas，Virginia，USA。
[1014] PC-3起源于62岁高加索男人的IV级前列腺癌的骨转移(VOLENEC F.J.等人，J Surg Oncol 1980；13(1)：39-44)。肿瘤细胞作为贴壁的单层在37℃在潮湿的气氛(5％CO2，95％空气)中生长。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(Ref BE12-702F，Lonza，Verviers，Belgium)并补充有10％FBS(Ref DE14-801E，Lonza)的RPMI 1640。对于实验应用，通过用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Ref02-007E，Cambrex)处理5分钟将细胞从培养瓶上解离下来，稀释在不含钙或镁的Hanks’培养基(Ref BE10-543F，Cambrex)中并且通过加入完全培养基而中和。在血细胞计数器中计数细胞，并且通过0.25％台盼蓝排除法评估它们的存活力。使用 支原体检测试剂盒( Mycoplasma DetectionKit(Ref LT07-318，Lonza))按照供应商的使用说明进行支原体(Mycoplasma)检测。
测定是选择性的生化检测，其研究支原体酶的活性。存活的支原体被裂解，
并且酶与 底物反应，催化ADP向ATP的转化。通过测量在加入
底物之前和之后样品中的ATP水平，可以获得比例，该比例指示支原体的存在或不存在。
支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较(Internal Standard
Operating Procedure No TEC-007/002)。
测定是选择性的生化检测，其研究支原体酶的活性。存活的支原体被裂解，
并且酶与 底物反应，催化ADP向ATP的转化。通过测量在加入
底物之前和之后样品中的ATP水平，可以获得比例，该比例指示支原体的存在或不存在。
支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较(Internal Standard
Operating Procedure No TEC-007/002)。
[1015] 实验设计：
[1016] 在肿瘤诱导前四十八小时，将15只雄性Balb/c裸鼠用γ-源(2.5Gy，Co60，INRA，Dijon，France)照射。在D0，将混悬在200μl RPMI培养基中的两千万(2x107)个PC-3细胞皮下注射到60只雄性Balb/c裸鼠的右胁中。
[1017] 当平均肿瘤体积达到80±38mm3时，将小鼠在开始治疗之前按照它们的肿瘤体积随机分组，分成3组，每组5只小鼠。每组的肿瘤体积彼此之间没有统计学差异(方差分析)。
[1018] 测试物质的治疗时间方案如下：组1的小鼠接受一次5ml/kg/inj.的赋形剂静脉内(IV)注射，每四天一次，重复四次(Q4Dx4)，组2的小鼠接受一次0.1mg/kg/inj.的XG-102静脉内(IV)注射，每四天一次，重复四次(Q4Dx4)，并且组3的小鼠接受一次1mg/kg/inj.的XG-102静脉内(IV)注射，每四天一次，重复四次(Q4Dx4)：
[1019]组 动物数 治疗 剂量(mg/kg/inj.) 途径 治疗时间方案
1 5 赋形剂 - IV Q4Dx4
2 5 XG-102 0.1 IV Q4Dx4
3 5 XG-102 1 IV Q4Dx4
3
1 5 赋形剂 - IV Q4Dx4
2 5 XG-102 0.1 IV Q4Dx4
3 5 XG-102 1 IV Q4Dx4
3
[1020] 当肿瘤达到最大体积2000mm时，将小鼠处死。
[1021] 在整个研究过程中每天监测小鼠的行为和存活。在整个研究过程中对所有小鼠每周监测体重和肿瘤体积两次。在细胞注射、IV治疗和处死前，使用Forene(Centravet，Bondoufle，France)麻醉动物。在实验过程中，如果发生下述中的任一项，则通过颈脱位法将动物在 麻醉下处死：
[1022] ●痛苦迹象(恶病质，虚弱，难以运动或进食)，
[1023] ●化合物中毒(背部弓起，惊厥)，
[1024] ●连续3天减轻20％重量或任一天减轻25％体重，
[1025] ●肿瘤体积大于2000mm3。
[1026] 在每种情形进行尸体解剖。
[1027] 绘制小鼠的体重曲线用于体重分析。当在至少一个组中记录超过40％的死亡小鼠时，终止曲线。平均体重变化(MBWC)：计算治疗的动物以克为单位的平均体重变化(在第X天的体重减去在D33的体重)。
[1028] 用下式计算肿瘤体积，其中长对应于最大肿瘤直径，宽对应于最小肿瘤直径：TV2
＝(长x宽 )/2。使用平均肿瘤体积(MTV)+/-SD绘制肿瘤生长曲线。当多于40％的小鼠死亡时，终止曲线。还绘制了个体肿瘤体积曲线。使用如下文所示在不同时间点计算的相对肿瘤体积(RTV)绘制相对肿瘤体积曲线。当多于40％的小鼠死亡时，终止曲线。RTV按下式计算：
＝(长x宽 )/2。使用平均肿瘤体积(MTV)+/-SD绘制肿瘤生长曲线。当多于40％的小鼠死亡时，终止曲线。还绘制了个体肿瘤体积曲线。使用如下文所示在不同时间点计算的相对肿瘤体积(RTV)绘制相对肿瘤体积曲线。当多于40％的小鼠死亡时，终止曲线。RTV按下式计算：
[1029] RTV＝(在DX的肿瘤体积)/(在D33的肿瘤体积)X 100
[1030] 使用Vivo 软件计算肿瘤体积倍增时间(DT)，肿瘤体积倍增时间(DT)定义为达到200％的MTV需要的时间。计算达到V的时间。体积V定义为从实验数据推论的且在肿瘤生长对数期内选择的目标体积。对每组的全部小鼠选择尽可能接近的体积V，从实验数据推论达到该体积V的时间。计算肿瘤生长抑制(T/C％)，肿瘤生长抑制(T/C％)定义为治疗组相对于赋形剂治疗组的中值肿瘤体积比例。按照NCI标准关于T/C％比例的有效标准为～42％(BISSERY M.C.等人，Bull.Cancer 1991，78：587-602)。所有的统计学分析使用Vivo 软件进行。治疗的毒性和有效性的统计学分析(BWC，MBWC，TV，
RTV，TTRV和DT)使用Bonferroni/Dunn检验(ANOVA比较)进行。所有组彼此相互比较。
RTV，TTRV和DT)使用Bonferroni/Dunn检验(ANOVA比较)进行。所有组彼此相互比较。
[1031] 在图75中，显示在抗肿瘤活性实验过程中携带PC-3肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积。在D33，3组(每组5只动物)用赋形剂和XG-102(0.1与1mg/kg/inj，Q4Dx4)治疗。这些数据表明，对于XG-102治疗，肿瘤体积以剂量依赖性方式随时间减小，因而，对于1mg/kg XG-102，效果更明显。
[1032] 实施例33：XG-102对携带正位HCT 116人结肠瘤的SCID小鼠中的肿瘤生长的作用
[1033] 本研究的目的是确定XG-102对在SCID小鼠中正位异种移植的HCT116人结肠瘤的生长的作用。
[1034] 80只健康的雌性SCID小鼠获自Charles River(L′Arbresles，France)。动物实验按照欧洲动物实验伦理指南(European ethical guidelines of animal experimentation)和英国关于实验瘤形成的动物福利的指南进行。动物保持在处于控制的温度(23±2℃)、湿度(45±5％)、光周期(12h光/12h暗)和换气条件的房间中。动物保持在SPF条件下，并且继续监控室温和湿度。空气调节系统设定程序为每小时14次换气，没有回流。新鲜的外部空气通过一系列的滤器，然后平均扩散到每个房间中。在实验室中维持高压(20±4Pa)，以防止污染或病原体在小鼠群落中的散播。所有在SPF条件下工作的人员在他们进入动物饲养区时都遵循特定的卫生和着装指导。动物笼养在聚碳酸酯笼子(UAR，Epinay sur Orge，France)中，所述笼子被配置提供食物和水。使用的标准笼面积是
800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌玉米芯草垫(LAB COB 12，SERLAB，CergyMPontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自DIETEX。
无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
800cm2，按照国际标准操作程序，每个笼子最多10只小鼠。动物的草垫是无菌玉米芯草垫(LAB COB 12，SERLAB，CergyMPontoise，France)，每周更换一次。动物食物购自DIETEX。
无菌控制的颗粒剂的形式是DIETEX。食物随意供应，放置在笼子上部金属盖上。水也是随意提供，由装有橡皮塞和吸管的水瓶提供。清洗水瓶，装满水，通过过滤除菌，并且每周更换两次。
[1035] 对于XG-102施用，将需要量的XG-102溶解在赋形剂中。制剂按照下文详述的步骤制备。考虑测试物质的纯度和肽含量(乘法系数是74.6％)计算并表示浓度。在XG-102解冻后，在无菌水(WFI，Batch 500 111 00 J，Aguettant，France)中制备10mM(对应38.22mg/ml)的储液，并且允许在室温平衡最少20分钟。制备用于每个治疗日的等分试样，并且保存在约-80℃。在每个治疗日进行从该储液到需要的浓度的稀释，并且在2-4℃最多保存24小时。储液的稳定性在约-80℃超过100天。用于动物给药的稀释的制剂在2-4℃的稳定性期间为24小时。经稀释的制剂保持放置在冰上直到使用时。将未使用的物质丢弃。XG-102以0.1和1mg/kg/inj每天注射一次，共十四次连续的施用(Q1Dx14)。物质施用途径是：以5ml/kg/inj.皮下(SC)注射，通过经由插管的口腔管饲法以5ml/kg/adm.经口(PO)施用。注射和施用的体积按照小鼠的日常个体体重进行调整。
[1036] 肿瘤细胞系和培养基从Oncodesign购买和提供：
[1037]
[1038] *American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)，Manassas，Virginia，USA。
[1039] HCT 116变体细胞系由男性患者的单一结肠癌的原代细胞培养物分离(BRATTAIN M.G.等人，Cancer Res.1981，41：1751M1756)。
[1040] 肿瘤细胞作为贴壁的单层在37℃在潮湿的气氛(5％CO2，95％空气)中生长。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(RefBE12-702F，Lonza，Verviers，Belgium)并补充有10％FBS(Ref DE14-801E，Lonza)的RPMI 1640。对于实验应用，通过用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Ref 02-007E，Cambrex)处理5分钟将细胞从培养瓶上解离下来，稀释在不含钙或镁的Hanks’培养基(Ref BE10-543F，Cambrex)中并且通过加入完全培养基而中和。在血细胞计数器中计数细胞，并且通过0.25％台盼蓝排除法评估它们的存活力。使用支原体检测试剂盒( Mycoplasma Detection Kit(RefLT07-318，Lonza))
按照供应商的使用说明进行支原体(Mycoplasma)检测。 测定是选择性的
生化检测，其研究支原体酶的活性。存活的支原体被裂解，并且酶与 底物反
应，催化ADP向ATP的转化。通过测量在加入 底物之前和之后样品中的ATP
水平，可以获得比例，该比例指示支原体的存在或不存在。支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control
Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较(Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002)。
按照供应商的使用说明进行支原体(Mycoplasma)检测。 测定是选择性的
生化检测，其研究支原体酶的活性。存活的支原体被裂解，并且酶与 底物反
应，催化ADP向ATP的转化。通过测量在加入 底物之前和之后样品中的ATP
水平，可以获得比例，该比例指示支原体的存在或不存在。支原体检测以来自细胞系培养物的上清一式两份进行测定，并且与阴性对照和阳性对照( Assay Control
Set Ref LT07-518，Lonza)进行比较(Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002)。
[1041] 实验设计：60
[1042] 在肿瘤诱导前二十四至四十八小时，将5只SCID小鼠用γ-源(1.8Gy，Co ，INRA，7
Dijon，France)照射。将混悬在200μl RPMI培养基中的一千万(10)个HCT 116细胞皮
3
下注射到5只雌性SCJD小鼠的右胁中。当肿瘤达到1000-2000mm时，将小鼠处死。将肿瘤从动物上手术切下，以获得新鲜的肿瘤块(20～30mg)用于在D0正位植入到75只小鼠的盲肠上。
Dijon，France)照射。将混悬在200μl RPMI培养基中的一千万(10)个HCT 116细胞皮
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下注射到5只雌性SCJD小鼠的右胁中。当肿瘤达到1000-2000mm时，将小鼠处死。将肿瘤从动物上手术切下，以获得新鲜的肿瘤块(20～30mg)用于在D0正位植入到75只小鼠的盲肠上。
[1043] 在肿瘤植入前二十四至四十八小时，将将75只SCID小鼠用γ-源(1.8Gy，Co60，INRA，Dijon，France)照射。手术在下午进行，在第7次XG-102治疗后最少延迟两小时。通过在无菌条件下的正中切口将麻醉动物的腹部打开。将盲肠从腹部取出并且在盲肠壁上制造小损伤。将肿瘤块放置在损伤处并用6/0缝合线固定。然后将腹腔用4/0缝合线以2层缝合。
[1044] 在D-7，在治疗开始前，将小鼠按照它们的体重随机分成5组，每组15只小鼠。每组的体重彼此之间没有统计学差异(方差分析)。按照下述治疗时间方案在D-7开始治疗：
[1045] ●组1的小鼠接受一次5ml/kg/inj.的XG-102赋形剂PO施用，每天一次，共十四次连续的施用(Q 1Dx14)，
[1046] ●组2的小鼠接受一次0.1mg//kg/inj.的XG-102PO施用，每天一次，共十四次连续的施用(Q1Dx14)，
[1047] ●组3的小鼠接受一次1mg//kg/inj.的XG-102PO施用，每天一次，共十四次连续的施用(Q1Dx14)，
[1048] ●组4的小鼠接受一次0.1mg//kg/inj.的XG-102SC注射，每天一次，共十四次连续的施用(Q1Dx14)，
[1049] ●组5的小鼠接受一次1mg//kg/inj.的XG-102SC注射，每天一次，共十四次连续的施用(Q1Dx14)：
[1050]组 动物数 治疗 途径 剂量(mg/kg/inj.) 治疗时间方案
1 15 赋形剂 po - Q1Dx14
2 15 XG-102 po 0.1 Q1Dx14
3 15 XG-102 po 1 Q1Dx14
4 15 XG-102 sc 0.1 Q1Dx14
5 15 XG-102 sc 1 Q1Dx14
1 15 赋形剂 po - Q1Dx14
2 15 XG-102 po 0.1 Q1Dx14
3 15 XG-102 po 1 Q1Dx14
4 15 XG-102 sc 0.1 Q1Dx14
5 15 XG-102 sc 1 Q1Dx14
[1051] 在整个研究过程中每天监测小鼠的行为和存活。在整个研究过程中对所有小鼠每周监测体重中肿瘤体积两次。在细胞注射、手术(正位肿瘤植入)和处死前，使用Forene(Centravet，Bondoufle，France)麻醉动物。
[1052] 在SC肿瘤扩增过程中，在整个研究中对所有小鼠每周监测肿瘤体积两次。
[1053] 小鼠在D26处死。对所有动物采集肝和肿瘤并称重。宏观评价肿瘤结节对肝的侵入。将肝和肿瘤固定在10％中性缓冲的福尔马林中。采集后四十八(48)小时，将它们包埋在石蜡 中并且用于组织学分析(anapathological analysis)。两个载玻片按照进入每个肿瘤核心的两个不同的部分编号。每个载玻片通过小鼠标识号识别。一个载玻片按位于其中心的肝编号。其通过小鼠标识号识别。为了确定Ki67标记的增殖指数，将石蜡-包埋的切片(5μm)在二甲苯(Ref.11699027，Labonord，Templemars，France)中脱去石蜡并且通过在100％、95％和70％乙醇(Ref.13099500，Labonord)中连续温育而再水合。在加入第一抗体之前，通过将组织在含有过氧化氢的溶液中在室温温育10分钟而抑制内源性过氧化物酶。使用生物素封闭系统来减少背景。在加入第一抗体之前，将切片用补充有3％山羊血清的在PBS(1X)中的3％牛血清白蛋白(BSA)在室温处理20分钟，以抑制交叉反应性。将组织切片用小鼠抗-人Ki-67克隆MIB-1单克隆抗体(Ref M7240，Dako cytomation；1∶100稀释，80μg/ml)在室温温育1小时。将不相关的生物素酰化的小鼠IgG1抗体(RefX0931，Dako cytomation，1∶120稀释，100μg/ml)用作阴性对照载玻片，确保反应的特异性。将切片进一步用与生物素偶联的二级山羊抗小鼠抗体(Ref.89904，Sigma)温育。然后，将组织切片用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶缀合物(Ref PK-6100，Vector Laboratories，1∶50稀释)在室温温育30分钟。DAB过氧化物酶底物(Ref SK-4100，Vector Laboratories)用作色原体来显现反应。切片用Mayer′s苏木精复染，以用于组织学研究。每次温育后，将切片用1X PBS洗涤两次。将盖玻片用水性封固剂封固，并且将切片在光学显微镜(DMRB Leica)下显现。
[1054] 为了通过组织学分析检测小鼠肝中的转移，激昂石蜡-包埋的切片(5μm)在二甲苯中脱去石蜡，并且通过在100％、95％和70％乙醇中连续温育而再水合。全部切片用苏木精和曙红(HE)(Ref.83309，Dakocytomation，Trappes，France)染色用于组织学分析。将盖玻片用水性封固剂(Aquatex，Ref 1.08562，Merck)封固，并在光学显微镜(DMRB Leica)下观察切片。通过有经验的病理学专家分析组织学切片，以确定肝中的转移侵入。
[1055] 绘制小鼠的体重曲线用于体重分析。当在至少一个组中记录超过40％的死亡小鼠时，终止曲线。平均体重变化(MBWC)：计算治疗的动物以克为单位的平均体重变化(在第X天的体重减去在D-7的体重)。
[1056] 计算肿瘤体重。肿瘤生长抑制(T/C％)定义为治疗组相对于赋形剂治疗组的中值肿瘤重量比例。按照NCI标准关于T/C％比例的有效标准为≤42％。为了半定量增殖指数(Ki-67染色)，将染色的肿瘤切片的数字图片进行不知情分析，并且分类为：没有染色的(等级0，对应没有染色面积)，低染色(等级1，对应少于10％的染色面积)，中等染色(等级2，对应10-30％的染色面积)和强染色(等级3，对应多于30％的染色面积)。拍摄代表性的照片。为了检测肝中的转移，测量平均肝重，并且在整个肝上宏观估测和在切片上通过组织学分析估测每个肝转移的数目。结果报告在表中。拍摄代表性的照片。所有的统计学分析使用Vivo 软件进行，治疗的毒性和有效性的统计学分析(MBWC，TV，体积V和达到V的时间，DT)使用Bonferroni/Dunn检验(ANOVA比较)进行。所有组彼此相互比较。
[1057] 将一千万(107)个HCT 116细胞SC注射到5只经照射的雌性SCID小鼠中。在注射之前，在细胞中没有检测到支原体，并且它们的存活力为99％。三十九天后，当平均肿瘤体积达到864±426mm3时，将小鼠处死。分离它们的肿瘤并且切除约20～30mg的小块。将这些小块在D0植入到75只治疗的动物的盲肠上。从D0到09，由于肿瘤植入导致的手术并发症诱导33％赋形剂治疗组的小鼠死亡。在治疗组中，死亡的百分数为40％，34％，47％和40％，没有剂量相关的效应。与赋形剂治疗的组相比XG-102没有显著改变致死性的事实表明治疗是被动物耐受的。并且，在治疗开始那天(D-7)和手术钳两天(D-2)之间，六次每天的治疗没有诱导任何显著的体重减轻，这再次表明XG-102是良好耐受的。在D-2，MBWC的分布在对赋形剂治疗组的+5.2±4.6％至以0.1mg/kg/adm.PO治疗的组的+7.1±4.6％之间。另外，手术后，在用赋形剂治疗的组与用不同剂量的XG-102治疗的那些之间没有观察到MBWC差异，即使当比较手术之前和之后的MBWC时，对所有组观察到由手术引起的显著减少。
[1058] 在D26处死的小鼠的平均肝重分为在赋形剂治疗组的0.82±0.17g与0.1mg/kg PO治疗的组的0.91±0.17g之间。它们没有显著差异。在赋形剂治疗组中，20％没有发展任意肝中的转移。如图76所示，这一对照组是这样的组：其中在肝中发展多于1次转移的小鼠的数目是最高的(40％)。在治疗组中，这一得分分布在1mg/kg PO治疗组的12.5％与0.1mg/kg PO治疗组或以1mg1kg SC治疗的组的25％之间。显著地，以1mg/kg PO治疗的组具有最高的无肝转移小鼠数目，这表明XG-102可能减弱HCT 116正位肿瘤的转移能力。
[1059] 实施例34：在大鼠(AMD模型)中评价XG-102减少光感受器光损伤的功效
[1060] 本研究的目的是研究XG-102对光诱导的光感受器细胞死亡的剂量作用。
[1061] 使用50只雄性大鼠(Sprague-Dawley(白化病大鼠)；约8周龄；200-250g(定购时))。在该实验模型中最常用大鼠。在研究之前检查动物，并且特别关注眼睛。动物在它们到达后保持对其观察两周。每天观察动物的疾病迹象。仅没有眼睛异常的健康动物被接2
受用于实验。将动物单独笼养在标准笼子(420x270x190mm)中。所有的动物笼养在相同的环境条件下。温度保持在22±2℃，相对湿度保持在55±10％。房间持续通风(每小时15次)。自动控制12小时光(200-300lx)和12小时暗的循环。连续控制并记录这些参数。
在整个研究中，动物具有自由获取事物和水的途径。它们用标准的干团块饮食喂饲。可从塑料瓶中随意获得自来水。
受用于实验。将动物单独笼养在标准笼子(420x270x190mm)中。所有的动物笼养在相同的环境条件下。温度保持在22±2℃，相对湿度保持在55±10％。房间持续通风(每小时15次)。自动控制12小时光(200-300lx)和12小时暗的循环。连续控制并记录这些参数。
在整个研究中，动物具有自由获取事物和水的途径。它们用标准的干团块饮食喂饲。可从塑料瓶中随意获得自来水。
[1062] 研究设计：
[1063] 四十八(48)只大鼠随机分成六(6)组，每组八只(8)动物。
[1064] 在诱导前那天将测试物质(XG-102：30mg/ml，3mg/ml，和0.3mg/ml)和赋形剂(0.9％NaCl)通过玻璃体内注射施用到右眼中。参比(苯基-N-叔丁基硝酮(PBN)(50mg/kg))和赋形剂在诱导前30分钟腹膜内注射，然后在12小时光暴露过程中注射3次，然后在诱导后一次。动物在恒定光(7000lux)下放置24小时。在光处理之前和在诱导后第9、16和23天记录视网膜电流图(ERG)。然后摘下眼镜用于组织学和外核层(ONL)厚度评估。
下表总结了治疗组动物的分配：
下表总结了治疗组动物的分配：
[1065]
[1066]
[1067] 五十(50)只中有四十八(48)只动物用于本研究。仅选择没有明显的眼睛缺陷的动物。然后，通过 软件中的随机功能进行治疗组的随机化。
[1068] 施用途径和方法
[1069] 对于玻璃体内注射，将动物通过肌内注射赛拉嗪/氯胺酮的混合物而麻醉。在右眼中注射测试物质(5μl)和赋形剂(5μl)。注射在手术显微镜下使用封固在50μl Hamilton上的33G-针在平坦部的颞上区域进行的。将填装的注射器封固到UltraMicroPump III中以获得微升范围的准确注射。参比和赋形剂使用封固在1ml-注射器上的30G-针以2.5ml/kg的剂量体积腹膜内注射。
[1071] 在开始本研究前然后在本研究结束时记录所有动物的体重。每天观察所有动物的一般行为和方面。
[1072] 在诱导前和在中断暴露后7、14和21天(即，第9、16和23天)记录黑暗-适应和麻醉的动物右眼的ERG。对于每个ERG测量潜伏时间(关于a-和b-波)和a-波与b-波振幅；潜伏时间表示为毫秒，并且a-波与b-波表示为在光暴露之前获得的基线值的百分数。在测量前15分钟滴注10μl (0.5％托吡卡胺)用于瞳孔扩张。
[1073] ERG参数：
[1074] ●颜色：白色最优。2
[1075] ●最大强度：2.6cd.s/m(0dB)；持续时间0.24ms；闪烁次数：1。
[1076] ●滤光片：50Hz。
[1077] ●阻抗阈值：90kΩ。
[1078] ONL厚度的测量：ERG检测之后，将动物通过过量戊巴比妥(pentobarbital)处死，并且摘出右眼，包埋在石蜡中。沿着垂直的最高线(vertical meridian)进行切片(5μm厚)，并用Trichrome-Masson染色。所述垂直的最高线包括视神经。使用标准显微镜(Leica)在下半视网膜中从视神经的500-3500μm每500μm进行ONL厚度(七个点)。
[1079] 结果用Microsoft 软件表示为单独和总结的数据表格形式。计算组平均值和标准差。使用统计学Mann与Whitney检验来评价配对组之间的差异。为了比较每个赋形剂组中的每个点，使用Friedman检验。
[1080] 结果
[1081] 在所有动物中，一般行为与外观都是正常的。
[1082] 动物体重都在基线的正常范围内：379±13g(平均数±SD；n＝48)。在处死日(第23天)，在测试物品和赋形剂之间没有观察到明显的差异。恰好在实验开始前(基线)和在处死日对每组记录的平均体重在正常范围内，体重增加约31±5％(平均数±SD；n＝48)。
[1083] 视网膜电流图
[1084] 为了研究对光感受器的保护作用，在光诱导的光变性模型中评价测试物质、赋形剂和参比物质。视网膜的功能状态通过视网膜电描记术进行评价。视网膜电描记术波的振幅针对基线值标准化并且表示为基线的百分数。图77显示了不同组恢复的时间过程。
[1085] 在测定中使用苯基-N-叔丁基硝酮作为参比，其是一种已经显示出保护白化病大鼠免受光诱导的光感受器死亡的合成的抗氧化剂。检测了三种XG-102剂量：1.5μg/眼(0.3mg/ml，低剂量)，15μg/眼(3mg/ml，中剂量)和150μg/眼(30mg/ml，高剂量)。a和b-波振幅的平均值(以％表示；平均数±SD)总结在下表中：
[1086]
[1087] §p＜0.05，通过Mann与Whitney检验，x相对于赋形剂。
[1088]
[1089] §p＜0.05，通过Mann与Whitney检验，x相对于赋形剂。
[1090] 还如图77中所示，与在基线的对照值相比，在通过腹膜内或玻璃体内注射用赋形剂注射的诱导组中的平均a-波振幅在第9、16和23天表现出减少。在第9天(p＜0.01)，第16天(p＜0.01)和第23天(p＜0.05)，a-波减少至小于对照值的50％。在第9天(p＜0.01)和第16天(p＜0.01)，b-波显著减少至小于对照值的50％。在第23天，减少不是统计学显著的。在用PBN治疗且暴露于损害光的组中，视网膜功能在很大程度上得到保持。与赋形剂相比，在第9天(p＜0.01)，第16天(p＜0.01)和第23天(p＜0.01)，a-波的恢复明显改善，并且分别为70.4％、79.6％和76.2％。类似地，b-波的恢复比赋形剂显著更强(p＜0.01)在第9、16和23天分别为100％、103.6％和102.4％。
[1091] 与赋形剂相比，用多达15μg/眼的不同剂量的玻璃体内XG-102治疗并且暴露于损害光的大鼠在第9、16和23天表现出很大程度的视网膜功能保持。对于低剂量和中剂量，a-波恢复在第16天分别为47.5％(p＜0.01)和51.1％(p＜0.01)，在第23天分别为48.3％(p＜0.01)和41.8％(p＜0.05)。类似地，b-波的恢复比赋形剂更强，并且对于低剂量和中剂量，在第9天分别为55.3％和60.6％，在第16天分别为61.7％和62.3％，在第23天分别为73.5％和56.5％。另一方面，高剂量(150μg/眼的组)XG-102没有表现出防止光损伤的作用。在第9、16和23天，a-波的恢复分别为23.6％，24.1％和23.7％，相对于赋形剂组的5.7％，13.2％和22.5％。类似地，在第9、16和23天，b-波的恢复分别为31.9％，38.9％和37.1％，相对于赋形剂组的15％，24.8％和30.6％。
[1092] ONL厚度
[1093] 为了评估治疗保护光感受器结构的能力，在停止暴露后21天(第23天)测量ONL的厚度。平均值总结在下表中：
[1094]
[1095]
[1096] §p＜0.05，通过Mann与Whitney检验，x相对于赋形剂(ivt，ip).
[1097] 在赋形剂处理的大鼠的眼睛中观察到ONL厚度减小。与未治疗的眼睛相比，在暴露后在赋形剂治疗的眼睛中观察到66％-69％的平均ONL厚度损失。与赋形剂组相比，施用PBN表现出显著的保护作用(ivt和ip，p＜0.001)。当大鼠用PBN治疗时，ONL得到保持。与正常条件下未治疗的眼睛(40.6±4.6μm，内部数据)相比，仅观察到小的减少(16％)。
在用低剂量和中剂量XG-102-治疗的大鼠中，ONL厚度的减小得到抑制(与赋形剂相比，p＜0.01)。使用高剂量XG-102没有观察到保护作用。在低剂量和中剂量XG-102-治疗的眼睛中观察到40％的平均ONL厚度损失。
在用低剂量和中剂量XG-102-治疗的大鼠中，ONL厚度的减小得到抑制(与赋形剂相比，p＜0.01)。使用高剂量XG-102没有观察到保护作用。在低剂量和中剂量XG-102-治疗的眼睛中观察到40％的平均ONL厚度损失。
[1098] 因此，在这些实验条件下，可以说明：
[1099] ●在赋形剂治疗的组中(2种施用途径：ivt，ip)，亮光暴露诱导视网膜功能降低和光感受器损失。暴露后23天，a-波恢复为18.6％(ip)和22.5％(ivt)；观察到69％(ip)和66％(ivt)的平均ONL厚度损失。
[1100] ●系统性施用(i.p.)PBN显著保护视网膜免受光损伤。PBN-治疗的组保持76.2％的a-波，并且仅观察到少量平均ONL厚度损失(16％)。
[1101] ●玻璃体内注射1.5与15μg/眼的XG-102显著保护视网膜免受光损伤。XG-102治疗的组保持48.3％和41.8％的a-波，并且观察到40％的平均ONL厚度损失。
[1102] 综上所述，按照统计学分析，玻璃体内注射XG-102(1.5与15μg/眼)有效保护视网膜功能。在这些实验条件下，结果表明通过IVT以1.5μg和15μg/眼剂量的XG-102保护视网膜的结构和功能免受急性光诱导的损伤。
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