胚胎干细胞培养方法
阅读：72发布：2021-12-11
专利汇可以提供胚胎干细胞培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及细胞培养的方法，包括提供包裹在支持基质中的多潜能胚胎干细胞以形成支持基质结构，在维持培养基中维持位于三维培养物中的被包裹的细胞，以及可选的在分化培养基中分化位于三维培养物中的被包裹的细胞。本发明进一步涉及通过使用被包裹的细胞的筛选方法。，下面是胚胎干细胞培养方法专利的具体信息内容。
1.细胞培养的方法，其包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干(ES)细胞以形成支持基质结构， 和，
(b)通过在维持培养基中维持被包裹在三维培养物中的细胞而维持培 养。
2.权利要求1的方法，其中维持培养在没有饲养细胞和没有饲养细胞 条件培养基的情况下进行。
3.权利要求1或权利要求2的方法，进一步包括在适合细胞分化的条件 下在分化培养基中分化包裹在三维培养物中的细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述维持和分化阶段在同一容器中进行。
5.权利要求3或权利要求4的方法，其中提供对分化的刺激。
6.权利要求5的方法，其中对分化的刺激包括对胚状体形成的刺激。
7.权利要求6的方法，其中对胚状体形成的刺激是消除或减少与抑制 分化的物质的接触；和/或添加或增加与促进胚状体形成的物质的接触。
8.权利要求3至7任一项的方法，其中提供分化为外胚层、内胚层或 中胚层谱系的刺激。
9.权利要求3至7任一项的方法，其中提供分化为中胚层骨骼谱系的 刺激。
10.权利要求3至7任一项的方法，其中提供对骨形成分化或软骨形成 分化的刺激。
11.细胞培养的方法，包括：
(a)提供包裹在支持基质中的单个胚胎干细胞或多个胚胎干细胞以形 成支持基质结构，
(b)在适合胚胎干细胞维持的条件下通过在维持培养基中维持在三维 培养物中包裹的一个或多个细胞而维持培养，
(c)在适合骨形成分化的条件下通过在分化培养基中分化在三维培养 物中的被包裹的细胞而进行骨形成分化。
12.权利要求11的方法，其中所述被包裹的细胞的骨形成分化包括：
(i)在分化培养基中温育在三维培养物中被包裹的胚胎干细胞，并提供 对胚状体形成的刺激，然后，
(ii)在分化培养基中温育(i)中产生的被包裹的细胞，并提供对骨形成分 化的刺激。
13.权利要求11的方法，其中所述被包裹的细胞的骨形成分化包括：
(i)在分化培养基中温育在三维培养物中的被包裹的胚胎干细胞，然后，
(ii)在分化培养基中温育(i)中产生的被包裹的细胞，并提供对骨形成分 化的刺激。
14.权利要求11的方法，其中所述被包裹的细胞的骨形成分化包括：在 分化培养基中温育被包裹的胚胎干细胞，并提供对骨形成分化的刺激。
15.权利要求11至14任一项的方法，其中所述胚胎干细胞是人、非人 灵长类动物、马、犬、牛、猪、山羊、绵羊、鱼、啮齿动物、鼠或鸟类来 源的。
16.前述任一项权利要求的方法，其中提供包裹在每个支持基质结构中 的多个细胞。
17.前述任一项权利要求的方法，其中提供包裹在每个支持基质结构中 的单个细胞。
18.前述任一项权利要求的方法，其中在步骤(a)中提供多个支持基 质结构。
19.前述任一项权利要求的方法，其中支持基质结构为小珠的形式。
20.包裹在支持基质中的人胚胎干细胞用于评估试验刺激对细胞维持 和/或分化的影响的用途。
21.包裹在支持基质中的人胚胎干细胞用于评估培养基和/或培养条件 对细胞维持和/或分化的影响的用途。
22.权利要求1的方法，其还包括在存在试验化合物的情况下在维持培 养基中温育被包裹的细胞，和评估试验化合物对细胞维持和/或分化的影响。
23.权利要求1的方法，其还包括在存在试验刺激的情况下在适合细胞 维持和/或分化的培养基和条件下温育被包裹的细胞，和评估试验刺激对细 胞分化的影响。
24.权利要求1的方法，其还包括在存在试验培养基和/或试验条件的 情况下温育被包裹的细胞，和评估试验培养基和/或试验条件对细胞维持和/ 或分化的影响。
25.权利要求24的方法，其中给细胞提供试验刺激，并评估试验刺激 对细胞维持和/或分化的影响。
26.权利要求22至25任一项的方法，其中在步骤(a)中在每个支持 基质结构中包裹多个细胞。
27.权利要求22至25任一项的方法，其中在步骤(a)中在每个支持 基质结构中包裹单个细胞。
28.权利要求22至27任一项的方法，其中在培养容器的阵列中提供被 包裹的细胞。
29.权利要求28的方法，其中培养容器的阵列是多孔或多管阵列。
30.权利要求22至29任一项的方法，其中在步骤(a)中在每个培养 容器中提供多个被包裹的细胞。
31.权利要求22至30任一项的方法，其中在步骤(a)中在每个培养 容器中提供多个支持基质结构。
32.权利要求22至29任一项的方法，其中在步骤(a)中在每个培养 容器中存在单个的被包裹的细胞。
33.权利要求22至32任一项的方法，其中所述支持基质结构为小珠的 形式。
34.权利要求20至33任一项的用途或方法，其中通过选自下组的一种 或多种方法来评估对细胞维持和/或分化的影响：显微镜检查、一种或多种 阶段特异性抗原的检测以及基因表达的检测。
35.前述任一项权利要求的方法，其中所述支持基质由水凝胶组成或包 含水凝胶。
36.前述任一项权利要求的方法，其中所述支持基质由藻酸盐组成或包 含藻酸盐。
37.权利要求36或权利要求37的方法，其中支持基质还包含明胶。
38.权利要求35至37任一项的方法，其中支持基质进一步包含选自下 组的一种或多种材料：明胶、层粘连蛋白、BioglassTM、羟基磷灰石、细胞 外基质、细胞外基质蛋白、生长因子、来自另一种细胞培养物的提取物、 来自成骨细胞培养物的提取物。
39.前述任一项权利要求的方法或用途，其还包括冰冻被包裹的细胞。
40.权利要求1至19中任一项或权利要求39的方法，其还包括从支持 基质中释放一个或多个细胞。
41.通过权利要求40的方法获得的一个或多个细胞。
42.可通过或通过权利要求1至19任一项的方法得到的一个或多个被 包裹的细胞。
43.通过权利要求1的方法得到的一个或多个被包裹的人胚胎干细胞。
44.通过权利要求3至19任一项的方法得到的一个或多个被包裹的多 能细胞。
45.可通过或通过权利要求3至19任一项的方法得到的一个或多个被 包裹的形成骨的细胞、形成软骨的细胞或形成心肌的细胞。
46.可通过或通过权利要求3至19任一项的方法得到的一个或多个被 包裹的终末分化细胞。
47.权利要求42至46任一项的被包裹的细胞或权利要求41的细胞作 为药物的用途。
48.权利要求45的一个或多个被包裹的形成骨的细胞作为治疗需要骨 重建的疾病或病症的药物的用途。
49.权利要求45的一个或多个被包裹的形成骨的细胞作为治疗选自下 组的疾病或病症的药物的用途：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、 成骨不全、Paget′s病、纤维性结构不良、与听力丧失有关的骨疾病、低磷 酸酯酶症、骨髓瘤骨病、骨硬化症、骨过度使用损伤、骨的运动损伤、牙 周(齿龈)疾病、和成形外科如治疗性颌面外科、或整容外科。
50.权利要求45的一个或多个被包裹的形成软骨的细胞作为治疗选自 下组的疾病或病症的药物的用途：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、整 容成形外科、类风湿性和骨关节炎。
51.权利要求45的一个或多个被包裹的形成骨的细胞在制备用于治疗 需要骨重建的疾病或病症的药物中的用途。
52.权利要求45的一个或多个被包裹的形成骨的细胞在制备用于治疗 选自下组的疾病或病症的药物中的用途：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌 症、骨癌、成骨不全、Paget′s病、纤维性结构不良、与听力丧失有关的骨 疾病、低磷酸酯酶症、骨髓瘤骨病、骨硬化症、骨过度使用损伤、骨的运 动损伤、和牙周(齿龈)疾病。
53.权利要求45的一个或多个被包裹的形成软骨的细胞在制备用于治 疗选自下组的疾病或病症的药物中的用途：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨 修复、成形外科、整容成形外科、类风湿性和骨关节炎。
54.治疗受试者的方法，包括向受试者施用权利要求42至46任一项的 被包裹的细胞。
55.治疗需要骨重建的疾病或病症的方法，包括向受试者施用一个或多 个权利要求45的被包裹的形成骨的细胞。
56.治疗选自下组的疾病或病症的方法，包括施用一个或多个权利要求 45的包裹的形成骨的细胞：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、 成骨不全、Paget′s病、纤维性结构不良、与听力丧失有关的骨疾病、低磷 酸酯酶症、骨髓瘤骨病、骨硬化症、骨过度使用损伤、骨的运动损伤、和 牙周(齿龈)疾病。
57.治疗选自下组的疾病或病症的方法，包括向受试者施用一个或多个 权利要求45的被包裹的细胞：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、类风 湿性和骨关节炎。
58.选自治疗性或整容外科的成形外科方法，包括向受试者施用一个或 多个权利要求45的被包裹的细胞。
59.选自治疗性或整容外科的成形外科方法，其包括向受试者施用权利 要求45的被包裹的一个或多个形成骨的细胞或一个或多个形成软骨的细 胞。
60.药物组合物，其包括权利要求42至46任一项的一个或多个被包裹 的细胞和药学上可接受的载体或稀释剂。
61.权利要求60的药物组合物，其被配制为通过注射或通过内窥镜检 查法施用。
62.由一个或多个权利要求42至46任一项的被包裹的细胞得到的骨或 软骨组织。
63.细胞支架，其具有种植于其上或灌输于其中的权利要求42至46任 一项的被包裹的细胞。
64.预装填的施用装置，如注射器，其含有权利要求62或权利要求63 的药物组合物。
技术领域
本发明涉及培养多潜能细胞以促进细胞受控的自我更新的方法。本发 明进一步提供从多潜能细胞扩增和分化均一的细胞群体的集成方法。此外， 本发明提供筛选方法以识别影响多潜能细胞，如胚胎干细胞生长和分化的 条件、培养基和刺激因素。
背景技术
术语“干细胞”描述的是能够形成多种组织类型细胞的细胞。存在不同类 型的干细胞。当精子使卵受精时，形成单个全能细胞，这个全能细胞具有 形成整个生物体的能力。在受精后的第一个小时，这一细胞分裂为完全相 同的全能细胞。受精后大约四天并经过几个周期的细胞分裂之后，这些全 能干细胞开始特化。当全能细胞变得更加特化时，它们随之被称为“多潜能 的(pluripotent)”。多潜能细胞能够分化为身体中的每种细胞类型，但是不 能形成胎盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能干细胞的分化潜能 不是“全体”的，因此不将这种细胞称为“全能”，而且它们不是胚胎。多潜 能干细胞进一步特化为多能(multipotent)干细胞，其专用于分化为为特定 功能特化的特定种系的细胞。多能细胞能够分化为它们所源自的组织中含 有的细胞类型；例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小 板。
多潜能干细胞，如胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖干(EG)细胞以及多 能干细胞，如脐带干细胞和成人干细胞因其自我更新的能力和可塑性能力 而是被提议为用于组织工程的有力工具。多潜能干细胞，如胚胎干细胞， 能够在体外被诱导分化为中胚层、外胚层和内胚层细胞谱系的多能细胞。 中胚层谱系的细胞，如成骨细胞、软骨细胞和心肌细胞分别在形成骨的、 成软骨和成肌补充物的影响下产生。现在，多潜能干细胞，如胚胎干细胞 和多能细胞的医药用途受限于缺少关于组织样结构形成的知识和自发分化 为不同细胞谱系的倾向；甚至这种多谱系潜能可以表现为形成异位组织的 风险。对于临床应用，高纯度的均一细胞群体可能是必需的。
为有效的使用多潜能细胞进行临床治疗，首要的是提供足够数量的用 于相关临床应用的细胞。未分化的胚胎干细胞是产生关键分化细胞类型的 有希望的来源；但是对于许多未分化细胞群体，现有的培养方法或者不适 合扩增，或者不能提供有效产量的分化细胞。
现有的维持人胚胎干(hES)细胞的方法需要使用饲养层、饲养条件培 养基(feeder-conditioned media)或在培养基中供应人或动物细胞提取物以 扩增人胚胎干细胞和防止自发分化。如计划在随后将细胞用于人类治疗， 该方法是不适合的。人胚胎干细胞的临床应用需要在标准化的、受良好控 制的无动物产品的环境(因此被称为“无外源物(xeno-free)”的培养环境， 其降低传输疾病的风险)中培养细胞的方法。此外，需要在不存在饲养层 或支持细胞的情况下培养人胚胎干细胞的方法以降低饲养细胞或源自饲养 细胞的污染物污染人胚胎干细胞治疗产品的风险。理论上，生产足够数量 的人胚胎干细胞的方法应该是标准化的和可调控的。至今还没有这样的方 法，并且使用传统方法分离和维持人胚胎干细胞是非常需要技术的过程， 不适于临床应用(1)。因此需要开发改良的培养方法以用于扩增和在需要 时接着分化人胚胎干细胞。
转变未分化的鼠胚胎干细胞(mES)为更分化的细胞类型的方法是已知 的。但是，使用已有的二维平板或培养瓶(flask)培养方案，该过程是分 段的，涉及高维持费用，对样本具有破坏性并且结果非常易变。
传统上，在二维培养物中胚胎干细胞培养方案涉及三个截然不同的阶 段，首先胚胎干细胞维持(即自我更新，也称为扩增，以形成干细胞集落)， 然后是导致胚状体(EB)形成的初始分化，随后是进一步的谱系特异性分 化。每个阶段都需要熟练的操作和阶段特定的方案。
对于胚胎干细胞维持，最初是分离胚胎干细胞细胞，然后在饲养层上 进行共培养。随后发现可使用条件培养基替代饲养层(2；3)，并且对于鼠胚 胎干细胞，当以纯化形式供应LIF(由饲养细胞分泌的营养因子)时，其能 够维持多潜能性(4)。
通过监测Octamer结合因子3/4(表示为Oct-4)的表达评测胚胎干细 胞的多潜能。Oct-4是限于早期胚胎、生殖系细胞和未分化胚胎干细胞(胚 胎性癌)、胚胎生殖干细胞和胚胎干细胞的Pit-Oct-Unc(POU)家族转录调 控因子(5)。Oct-4在体内的表达是发展内细胞团(ICM)细胞的多潜能能 力所必需的(6)，在体外其被化学稳态地控制以维持多潜能性(7)。
在传统的分化方法中，经过形成胚状体(EB)的阶段，源自内细胞团 (ICM)的胚胎干细胞分化为各种细胞类型。胚状体的形成，即胚胎干细胞 的初始分化可以通过各种刺激启动，例如移除饲养细胞、消除与LIF的接 触(对于鼠胚胎干细胞)或消除与饲养条件培养基的接触。被开发用于胚 胎性癌(EC)细胞的胚状体(EB)悬浮方法(8)通过形成全部三个胚层： 中胚层、外胚层和内胚层导致形成多重分化结构，其类似于植入后的胚胎 组织(9)。在悬浮培养的2到4天中，在ICM表面形成外胚层，其形成称 为“简单胚状体”的结构。在分化的第4天左右，具有基底层的柱状上皮发育， 并且形成中央空腔。这些结构被称为“囊状胚状体(cystic EB)”，并且通过 在体外继续培养，出现内胚层和中胚层细胞(10)。
外胚层细胞是多能的，能够分化为神经组织、上皮和牙齿组织。内胚 层细胞是多能的，能够分化为胃肠道、呼吸道和内分泌腺。中胚层细胞是 多能的，能够分化为造血和骨骼谱系，后者包括形成心肌(cardiomyogenic)、 形成软骨(chondrogenic)和形成骨(osteogenic)的细胞。在中胚层，已知 形成心脏的分化是最初的和主要的分化过程。通常认为形成心脏的分化会 阻止和延迟其它分化过程，例如形成软骨和形成骨的分化。
通过在二维培养物中功能性成骨细胞的分化已经实现了形成骨的分 化，即在体外形成矿化的小结，其显示体内形成的交织的骨的形态上、超 微结构上和生化上的特征。然而，在培养瓶和有孔平板中进行的二维培养 只能使少量细胞分化到能够使它们的细胞外基质组织成与骨类似的结构的 程度(11-13)。此外，二维培养是分段的，劳动密集的并且在所包括的不 同培养步骤期间需要操作者的“判断”。
通过在培养物中分化有功能的软骨细胞已经实现了成软骨分化，即在 体外形成软骨小结，其显示体内形成的软骨细胞的形态、超微结构和生化 特征。现在，已经进行了很多诱导胚胎干细胞体外分化为软骨生成谱系的 尝试。据报道通过在胚状体(EB)分化期间加入各种成软骨补充物，如BMP-2 和BMP-4(Kramer等人，(2000).Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro：activation by BMP-2 and BMP-4 Mech.Dev.92， 193-205)、TGF-b3(Kawaguchi等人.，(2005).Osteogenic and chondrogenic differentiation of embryonic stem cells in response to specific growth factors Bone 36，758-769.)、地塞米松(Tanaka等人，(2004).Chondrogenic differentiation of murine embryonic stem cells：effects of culture conditions and dexamethasone J.Cell Biochem.93，454-462.)可诱导胚胎干细胞的成软骨分 化。作为其它的途径，据报道通过供应IGF-I，TGF-b3，BMP-4和PDGF在源 自FACS分选的中胚层先祖细胞的胚状体培养物中获得肉眼可见的软骨形 成(Nakayama等人，(2003).Macroscopic cartilage formation with embryonic stem-cell-derived mesodermal progenitor cells J.Cell Sci.116，2015-2028.)。然 而，尽管对于胚胎干细胞的成软骨分化已有大量成功的方法，但是已建立 的这些方法需要形成胚状体。从胚胎干细胞形成软骨已经在二维培养系统 中实现。为将胚胎干细胞用于软骨组织工程，必须开发明确的和有效的方 案，用于指导在集成和不涉及操作者决定的三维培养系统中体外分化为软 骨生成谱系。
静置培养，如传统用于胚胎干细胞维持、培养和分化的二维方法，具 有几个限制，例如缺少混合、缺乏控制选项和需要频繁的喂饲。在二维培 养细胞的试验中，与细胞外基质和其它细胞的正常三维关系被扭曲，其导 致反常的细胞行为并因此产生错误的结论。搅拌的悬浮培养系统具有可量 测性和相对简单这些吸引人的优点，这会影响特定阶段和类型的干细胞的 生存力和利用率(14)。然而，在悬浮细胞的搅动培养中，由于搅动所产 生的动荡和剪切力将导致细胞损伤。现正在开发使用生物反应器培养细胞 的方法，以提供具有受控培养条件的动态培养系统，其能够在三维环境中 扩增细胞。分析更天然的三维设定中的细胞相互作用可提供更接近活体内 条件的条件(15；16)。将生物反应器用于人胚胎干细胞培养已有记载，并且 已提供了一些初步的证据表明动态、三维的条件将为培养胚胎干细胞形成 胚状体提供合适的环境(17)。
Chang等人(18)在二十世纪六十年代开创了生物包裹法，Lim等人(19) 最终包裹异种移植物胰岛细胞用于移植到大鼠中以改善糖尿病。藻酸盐包 裹的应用主要限于成体细胞。Magyar等人(20)将鼠胚胎干细胞包裹在1.1％ 藻酸盐微型小珠中，然后在组织培养平板上二维培养，即静置培养。这导 致形成“盘状”群体，其进一步在小珠中分化以产生囊状胚状体，随后形成含 有自发搏动区域的胚状体。当Magyar等人将胚胎干细胞包裹于1.6％藻酸盐 微型小珠中并三维培养时，发现在桑椹胚样阶段分化被抑制，因此小珠中 没有形成囊状胚状体；虽然当将胚胎干细胞集落从小珠中释放出来并二维 培养时，它们能够进一步分化为具有搏动的心肌细胞的囊状胚状体。已有 人尝试将鼠胚胎干细胞包裹于藻酸盐小珠中以从鼠胚胎干细胞产生胚状 体，但是未能产生足够的成软骨分化(21)。已将包裹在藻酸盐小珠中的 间充质干细胞(MSC)三维培养，其中细胞小珠被置于静置培养瓶培养物 中并用生长培养基覆盖从而实现产生透明软骨的成软骨分化，虽然发现在 藻酸盐培养物中充质干细胞的增殖能力被抑制(22)。已经证明了三维培 养中的成软骨分化，其使用接种在藻酸盐或琼脂糖水凝胶中和在多孔明胶 支架(Surgifoam)中的人脂肪来源的成体干(hADAS)细胞(32)。
从干细胞大规模生产分化细胞需要整合胚胎干细胞培养中的各个步 骤。现有的从多潜能细胞，如胚胎干细胞形成分化细胞的方法是分段的， 劳动密集的并且需要高水平的训练，其不可避免的会引入操作者与操作者 之间的差异；而且，这些方法在二维培养物中进行，其没有模拟体内存在 的三维环境。这不符合临床应用的要求，因为现有的维持培养和分化的方 法不能产生临床相关的细胞数量。
因此，需要改良干细胞培养的方法以扩增和集成扩增和分化干细胞， 如胚胎干细胞。该方法对于未分化多潜能细胞有效的维持生长和分化以及 对外胚层、中胚层和内胚层谱系部分分化的多能细胞的进一步分化是必须 的。对于临床的骨组织工程应用，需要能够形成“骨小结(bone nodules)” (骨样组织)或其它组织类型的方法。根据本发明，这能够在三维培养中 实现，其中使用包裹在支持基质中的单个或多个细胞。
单个细胞或克隆的培养，以及单个克隆随后的扩增和分化被称为“克隆 形成能力”。已知当来源于无性繁殖的胚胎干细胞被移植到小鼠中时其在体 内分化，但是到目前为止，在体外培养单个未分化胚胎干细胞的尝试都被 证明是不成功的(23；24)。在这些已报道的研究中，二维培养单个细胞，该 细胞没有最终分化为成熟细胞。
现在，没有可用于筛选细胞培养环境对单个多潜能或多能细胞的影响 的方法。因此需要识别细胞培养条件、培养基和试验化合物(例如合成的 化学个体或天然来源的材料，如条件培养基、生长因子)对个体细胞的影 响的方法。此外，同时进行大量这种筛选实验的能力使得能够进行大量工 艺参数(化学制品、浓度、组合)的大量筛选。
发明详述
本发明提供细胞培养的方法，其包括：
(a)提供包裹(encapsulate)在支持基质中的人胚胎干(ES)细胞以形 成支持基质结构，和，
(b)通过在维持培养基中维持位于三维(3D)培养物中的被包裹的细胞 来维持培养。
在本发明的培养方法中，所提供的胚胎干细胞可以是包裹在支持基质 结构中的多个个体细胞和/或细胞聚集体，或者是包裹在支持基质结构中用 于无性扩增的单个细胞。
用于维持细胞生长以增加支持基质结构中细胞数量(即扩增，其中细 胞通过细胞分裂进行自我更新)的维持培养基的选择取决于所使用细胞的 类型以及它们对生长的需求。任何支持细胞生长，且理想的是具有最小的 或没有细胞分化的培养基都适合在本发明的方法中用作维持培养基。本领 域已知多种合适的维持培养基。
在优选的实施方式中，维持培养不包括在维持培养基中使用饲养细胞、 条件培养基或者人或动物的细胞提取物，因此维持培养是在不存在饲养细 胞和不存在饲养细胞条件培养基的情况下进行的。
现有的培养人胚胎干细胞的方法需要使用饲养细胞以支持未分化状态 的人胚胎干细胞的维持或者使用条件培养基(1)。另外，在现有的方法中， 细胞需要经常传代以除去自发分化的人胚胎干细胞。此外，如果将所产生 的人胚胎干细胞用于临床治疗，培养条件可能需要源自动物的产品，而这 样的产品有传输疾病的风险。研究者正致力于开发适于大规模生产的维持 和扩增人胚胎干细胞的方法以为临床应用提供足够数量的人胚胎干细胞或 其分化衍生物。本发明人开发了令人惊奇的简单方法，其显示复制了胚胎 植入前的早期胚胎的物理环境，并且能够长时间培养未分化状态的被包裹 的人胚胎干细胞，而不需要传代。令人惊奇的是，发明人发现通过使用本 发明的方法人胚胎干细胞可以在不存在饲养细胞的情况下于非条件培养基 中在多至130天的时间内维持未分化。发明人假设在本发明方法中包裹人 胚胎干细胞的支持基质所提供的物理环境消除了对饲养细胞支持或使用条 件培养基的需求。本发明的方法适于为治疗应用标准化、调控和扩大人胚 胎干细胞的生产。
适合人胚胎干细胞的维持培养基包括补充有20％v/v KNOCKOUTTM SR，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自Gibco Invitrogen， Life Technologies，Paisley，UK)，0.1mM 2-巯基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich， Dorset，UK)和4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGF-2) (157个氨基酸)(R&D Systems，Oxon，UK)的DMEM/F12培养基。补充有4 ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF)的VitroHESTM(Vitrolife AB，Kungsbacka，Sweden，http://www.vitrolife.com)也是适合培养人胚胎干细 胞的培养基，这两种培养基通常都与饲养细胞共同使用，但是在本发明的 细胞被包裹的培养方法中，可以在不伴随使用饲养层的情况下使用这些培 养基。可以用条件培养基和另加的生长因子进行未包裹的人胚胎干细胞的 无饲养层培养。然而，Xu等人(2005)(25)已经显示含有KNOCKOUTTM SR 的非条件培养基(unconditioned media)能够激活未包裹的人胚胎干细胞中 的BMP信号传导活性，其程度超过MEF条件培养基，因此现在无法获得 成分明确的用于未包裹的人胚胎干细胞的无饲养层的维持培养基。
使用特异细胞信号分子在无饲养层环境中维持未包裹的人胚胎干细胞 仅能够实现相对短的时间(Sato等人(2004)Nat.Med.，10，55-63)。令人惊奇 的是，在本发明的方法中，将人胚胎干细胞维持于未分化状态不需要特异 信号分子。然而，当该研究继续识别改善未分化状态的人胚胎干细胞的维 持和扩增的分子时，能够在本发明的方法中使用这些分子以进一步增强包 裹的人胚胎干细胞培养的体外环境。
在本发明的方法中，包裹的胚胎干细胞能够在非条件培养基中生长。 在(1)中综述了现在用于维持未包裹人胚胎干细胞的各种培养基和生长因 子组合的详情。这些培养基可以被用于或被改进以用于本发明的方法中， 其中没有饲养细胞且不需要培养基被条件化。
在优选的方面，本发明提供细胞培养的方法，其包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)通过在适合细胞维持的条件下在维持培养基中维持位于三维培养 物中的被包裹细胞而维持培养，
(c)在适合细胞分化的条件下在分化培养基中分化在三维培养物中的 被包裹的细胞。
用于分化多潜能人胚胎干细胞的分化培养基的选择取决于使用的细胞 类型、它们对生长的需求和分化所需的刺激因素。任何支持分化的培养基 都适合用作本发明方法中的分化培养基。实际上，分化培养基在成分上可 以与维持培养基类似，但是分化培养基不含有维持培养基中所含的用于抑 制分化的一种或多种物质。适合人胚胎干细胞的分化培养基包括培养基 [Alpha-Modified Eagles Medium(αMEM)，10％(v/v)胎牛血清，100单位/mL 青霉素和100μg/mL链霉素]。通过向维持培养基中加入分化的刺激因素， 例如生长因子可以产生分化培养基。
适合在三维培养物中的被包裹的多潜能干细胞或被包裹的多能干细胞 维持和/或分化的条件包括对于所用细胞类型的标准培养条件，例如，对于 胚胎干细胞培养，合适的条件包括使用胚胎干细胞维持和/或分化培养基和 例如37℃和5％CO2的环境条件。
使用本发明的维持(扩增)和/或分化方法，集落或组织的形成是在三 维培养中进行的，其可以是静态的，例如在组织培养皿中或者在悬浮液中， 例如在烧瓶或生物反应器中。在三维培养中可以形成有组织的结构和更大 量的细胞，因为其条件更接近于符合体内情况中的物理环境。在三维培养 物中细胞三维生长。
通过使用低剪切、高混合的“动态”环境可以实现适合用于进行本发明细 胞培养方法的三维悬浮培养条件。这使得足够的营养物和气体能够渗入到 所使用的支持基质结构中。为三维培养提供低剪切、高混合的动态环境的 合适的生物反应器包括NASA HARV生物反应器(Synthecon，USA)、 European Space Agency生物反应器(Fokker，Netherlands)、RWV生物反应 器(Synthecon，USA)或其它模拟微重力或灌注系统，例如气升式生物反应器。 对于涉及形成骨的分化的方法，NASA HARV生物反应器是合适的。
合适的维持和培养方法被作为集成(integrated)的方法进行，其中在 单个，即同一个容器中连续进行维持和分化步骤。维持和分化方法的集成 方法在烧瓶或生物反应器中的悬浮培养物中适当进行。在维持生长阶段， 一个或多个被包裹的多潜能胚胎干细胞分裂，细胞数量增加，因此在支持 基质结构中形成细胞集落，随后被包裹的细胞分化形成进一步分化的或终 末分化的细胞，所有这些都在三维基质结构中。本发明的方法中，接着可 以维持进一步分化的或终末分化的细胞，其使得细胞分裂从而增加细胞数 量和在支持基质结构中形成细胞集落。
使用完全集成的方法使得能够进行从未分化细胞的扩增到通过由增加 或减少培养基中的关键信号分子触发的定时的和受控制的分化的连续改 变。使用本发明方法导致的对细胞操作的需求降低限制了细胞与可能影响 细胞生存力的潜在污染物和环境的接触。此外，以实时方式监控细胞培养 条件使得能够建立临床产品所需的标准。
在维持生长中，一些细胞在几个循环的细胞分裂后出现自发分化，特 别是在条件没有抑制分化的时候。适合细胞分化的条件可以包括使多潜能 胚胎干细胞分化为多能细胞的刺激因素。胚胎干细胞分化为多能细胞的刺 激因素可以是胚状体形成的刺激因素，例如消除或减少与抑制分化的物质 的接触；和/或添加或增加与促进胚状体形成的物质的接触。适合细胞分化 的条件包括使多能细胞进一步分化的刺激因素；例如，其能够在胚胎干细 胞分化的刺激因素之前、同时或之后被提供。本发明的涉及分化的方法可 以在没有提供胚状体形成的刺激因素的情况下进行，相反适合分化的条件 简单的包括分化为，例如外胚层、内胚层或中胚层细胞系的刺激因素。
分化的刺激因素可以是分化为外胚层、内胚层或中胚层谱系的刺激因 素。如下所列，合适的刺激因素是本领域已知的，并且在例如参考文献(1) 中被论述。
优选的，分化的刺激因素是分化为中胚层骨骼谱系细胞的刺激因素， 例如形成骨的或形成软骨的分化的刺激因素。
形成骨的分化的刺激因素可以是向培养基中提供的补充物，例如抗坏 血酸、β-磷酸甘油或地塞米松中的一种或多种。
成软骨分化的刺激因素可以是向培养基中提供的补充物，例如一硫代 甘油(MTG)和IGF-1，TGFβ1，BMP 2或BMP 4。
维持和分化步骤持续的时间取决于所培养的细胞类型以及细胞培养的 目的。发明人已经证明通过使用本发明的方法，被包裹的人胚胎干细胞可 以在没有常规用于维持多潜能的饲养细胞或条件培养基的情况下在未分化 情况下维持130天。在维持培养中，可能期望在需要时培养被包裹的人胚 胎干细胞多至130天或更长时间以提供增加数量的未分化细胞。因此，本 发明提供能够用于长期维持培养被包裹的人胚胎干细胞的方法，例如超过8 天，如约14，21，28，35，42，49，56天，多至130天和更多。
在集成的维持和分化方法中，步骤(b)中被包裹细胞的初始维持培养 应该达到足够长的时间以形成细胞簇，例如1到6天，优选2到5天，最 优选3或4天。分化培养可以多至40天。本发明的一些培养方法包括在存 在胚状体形成刺激因素的情况下的初始分化时期，随后是在存在将多能细 胞分化为更加分化的细胞谱系，如成骨细胞或软骨细胞的刺激因素的情况 下的进一步分化时期。合适地，初始分化时期为3到7天，优选4到6天， 最优选约5天。当进行进一步的分化时，进一步分化时期通常为14到28 天，合适的约20到22天，如21天。
对于根据本发明方法的被包裹的胚胎干细胞的形成骨的分化，初始维 持时期一般为2到4天，如3天；初始分化时期通常为4到6天，如5天； 进一步分化时期为14到28天，如20，21或22天；这些培养时间通常适于 实现骨诱导和三维骨形成。
使用包括分化阶段的本发明的方法，被包裹的多能细胞能够分化为更 加分化的细胞，例如终末分化的细胞。为将多能细胞分化为更加分化或终 末分化的细胞适宜使用细胞分化条件实现，所述条件包括多能细胞进一步 分化的刺激因素。
本发明的方法还被用于在体外维持和/或分化被包裹在支持基质中的单 个细胞，从而例如提供均一集落或组织。因此，在本发明的一些实施方式 中，在步骤(a)中支持基质结构为单个胚胎干细胞被包裹在支持基质中以 形成支持基质结构。
可以将胚胎干细胞包裹在支持基质中，以提供含有单个细胞的支持基 质结构，例如小珠。随后，被包裹的单个细胞可以生长为细胞集落，可选 的形成胚状体结构，最终，部分分化的细胞可以分化为预期的细胞谱系。 这对于获得源自无性繁殖的细胞群体是有用的，这些细胞群体对于为临床 应用提供纯均一细胞群体是有用的。而且，这对于筛选目的是有用的，因 为它使得能够检测三维胚状体的形成、胚胎干细胞的细胞分裂，或者研究 微环境对单个多潜能细胞的影响。还可以研究单个胚胎干细胞向分化的成 熟细胞类型的分化，从而证明胚胎干细胞在体外的多潜能性潜力。
可选的，在步骤(a)中将多个细胞包裹于支持基质结构中。这些可以 以多个单独的细胞或细胞聚集体(即块/集落)或其混合物存在。这些方面 对于为诸如组织工程应用、研究或临床应用产生大量分化细胞特别有用， 但是也能够用于筛选目的。
通常，在本发明的细胞培养方法中，在步骤(a)中提供多个支持基质 结构。
本发明提供用于胚胎干细胞维持、可选的胚状体形成和分化的集成的 三维培养方法。源自胚胎干细胞的中胚层细胞能够分别在形成心肌的、形 成软骨的或形成骨的刺激因素的影响下分化为形成心肌的、形成软骨的或 形成骨的细胞。
使用本发明的方法，已在三维培养中实现形成骨的分化，导致形成“骨 小结(骨样组织)”，或者在三维培养中能够实现用于临床骨组织工程应用 的其它组织类型。本发明的方法可以为培养系统的自动化进行调整，从而 提供低维持费用、高效的系统用于产生分化细胞。例如，这些方法可以被 用于从鼠胚胎干细胞或hES(人胚胎干)细胞生产形成心肌的、形成软骨的 或形成骨的细胞。
因此，在可选的实施方式中，本发明的培养方法对于胚胎干细胞的形 成骨的分化特别有效，特别优选的细胞培养方法包括：
(a)提供包裹在支持基质中的单个胚胎干细胞或多个胚胎干细胞以形 成支持基质结构，
(b)在适合胚胎干细胞维持的条件下，在维持培养基中维持位于三维培 养物中的一个或多个被包裹的细胞，
(c)在适合形成骨的分化的条件下通过在分化培养基中分化位于三维 培养物中的被包裹的细胞进行形成骨的分化。
胚胎干细胞优选鼠或人胚胎干细胞，但是本发明的形成骨的分化方法 适用于人、非人灵长类、马、犬、牛、猪、山羊、绵羊、鱼、啮齿动物、 鼠或鸟来源的胚胎干细胞。
优选的支持基质包含藻酸盐，特别优选含有藻酸盐和明胶的那些支持 基质。优选支持基质结构为小珠形式。本方法可以在静置的悬浮培养物中 进行，但是优选在例如由生物反应器，如NASA HARV生物反应器所提供 的低剪切、高混合的动态环境中进行。
如上述其它培养基一样，通常用于二维培养胚胎干细胞的维持培养基 适合在本方法中使用。合适的条件为37℃，5％CO2。维持培养进行1到6 天，优选2到4天，更优选约3天。
被包裹的细胞的形成骨的分化是通过下列进行的：
(i)在分化培养基中培养位于三维培养物中的被包裹的胚胎干细胞并 提供胚状体形成的刺激因素，然后，
(ii)在分化培养基中培养(i)中产生的被包裹的细胞并提供形成骨的 分化的刺激因素。
例如，分化培养基可以是通常在二维培养中用于胚胎干细胞形成骨的 分化的任何培养基。在适合胚状体形成和随后形成骨的分化的条件中使用 的分化培养基可以是不同的。对于鼠细胞，胚状体形成的刺激因素可以是 消除与LIF的接触，或者当以共培养形式进行维持阶段时，消除与分泌LIF 的细胞的接触。
为进行形成骨的分化以形成骨小结，步骤(i)中的温育一般进行约1 到6天，优选约2到5天，最优选约3到4天，步骤(ii)中的温育一般进 行21到28天，优选20到22天，例如21天。
在本发明的分化方法中，形成胚状体的步骤不总是必需的，因此，在 一些实施方式中省略了与胚状体形成的刺激因素接触，在这方面被包裹的 细胞的形成骨的分化适当地是通过下列进行的：
(i)在分化培养基中温育在三维培养物中的被包裹的胚胎干细胞，然后，
(ii)在分化培养基中温育(i)中产生的被包裹的细胞并提供形成骨的 分化的刺激因素。
合适的，在步骤(i)中胚胎干细胞与分化培养基接触约1到6天，优 选约2到5天，最优选约3或4天，并且在步骤(ii)中提供形成骨的分化 的刺激因素之后，培养一般进行21到28天，优选20到22天，例如21天。
可选的，可以通过在分化培养基中培养被包裹的细胞并提供形成骨的 分化的刺激因素进行被包裹的细胞的形成骨的分化。
在此情况中，细胞可以在存在形成骨的分化的刺激因素的情况下于分 化培养基中培养21到28天。
可以使用已知的形成骨的分化的体外诱导物，优选在步骤(ii)中以进 一步分化多能细胞。简要的，血清、抗坏血酸盐(抗坏血酸)、或L-抗坏血 酸-2-磷酸盐(长效抗坏血酸类似物)，β-磷酸甘油和地塞米松中的每一种已 知作为形成骨的分化的体外诱导物起作用。在现有技术中，血清、抗坏血 酸盐和地塞米松是小结形成所绝对需要的，而β-磷酸甘油促进或增强矿化 (26)。唯一特异于成骨细胞的形态学特征以矿化的细胞外基质的形式位于细 胞外。在体外骨节的形成被细分为三个阶段：(i)增殖，(ii)ECM分泌/ 成熟和(iii)矿化(mineralisation)。
本发明的方法可以以工业化规模进行以生产特异的分化细胞类型。例 如，从包裹在藻酸盐或基于藻酸盐的小珠中的胚胎干细胞和在生物反应器 中进行培养开始，可以实现骨形成。这个自动、集成的过程是有效的、易 于控制的并且与现有技术中的二维方法和三维方法相比明显减少了形成骨 组织所耗费的时间。
将一个或多个胚胎干细胞包裹在支持基质中，例如以形成小珠，导致 产生有益于胚胎干细胞维持、分化，可选通过胚状体形成，和进一步分化， 例如形成骨的分化的环境。本发明的方法使该过程自动化、可控制、最优 化和强化，从而能够生产临床应用所需的临床相关数量的细胞，例如形成 骨的细胞。
本发明的形成骨的方法适用于任何来源的多潜能细胞，例如人、非人 灵长类、马、犬、牛、猪、山羊、绵羊、鱼、啮齿动物、鼠或鸟来源的多 潜能细胞。
通过对本发明的维持人胚胎干细胞的方法进行调整可提供筛选方法以 评估细胞环境(培养条件、培养基、试验刺激因素、化合物)对维持生长 和/或分化的影响。因此，本发明提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞在 评估试验化合物或刺激因素对细胞维持和/或分化的影响中的用途。本发明 还进一步提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞在评估培养基和/或条件对 细胞维持和/或分化的影响中的应用。
还提供识别能够调控人胚胎干细胞维持和/或分化的化合物的方法，其 包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)在存在试验化合物的情况下在维持培养基中培养被包裹的人胚胎 干细胞，
(c)评估试验化合物对人胚胎干细胞维持和/或分化的影响。
使用本发明的筛选方法有可能识别通过抑制多潜能或多能细胞分化促 进细胞维持的化合物，和识别促进分化的化合物。试验化合物或化合物的 混合物可以是天然产生的或化学合成的。
此外提供识别能够调控人胚胎干细胞分化的刺激因素的方法，其包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)在存在试验刺激因素的情况下在适于细胞维持和/或分化的培养基 和条件中温育被包裹的人胚胎干细胞，
(c)评估试验刺激因素对人胚胎干细胞分化的影响。
使用本发明的方法能够识别抑制或促进分化的刺激因素，例如化合物 和/或条件。
另一方面，本发明提供评估培养基和/或条件对人胚胎干细胞维持和/或 分化的影响的方法，其包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)在存在试验培养基和/或试验化合物的情况下温育被包裹的人胚胎 干细胞，
(c)评估试验培养基和/或试验条件对人胚胎干细胞维持和/或分化的影 响。
本方法可用于优化培养条件以增强细胞维持、抑制分化或促进分化。 在本评估方法中，可选地在存在试验化合物/刺激因素的情况下温育细胞， 并评估试验化合物/刺激因素对细胞维持/分化的影响。
进行筛选方法以在步骤(a)中在每个支持基质结构中包裹多个细胞， 或者在步骤(a)中在每个支持基质结构中包裹单个细胞。
在本发明优选的筛选方法中，例如以小珠的形式使用被包裹的单个细 胞，其中每个小珠含有单个细胞，例如胚胎干细胞。通过分开培养含有单 个细胞的小珠，合适地在多孔的平板(其可以是阵列形式，例如多孔平板， 如96孔平板)或微型生物反应器中。可以同时进行多重筛选以评估和优化 培养基和条件，以及筛选化学合成的化合物、多种生长因子、细胞外基质 蛋白等对细胞生长和分化的影响。
可以设定筛选方法，使得在一组培养容器中提供被包裹的细胞，例如 作为多孔或多室阵列。优选在步骤(a)中，每个培养容器中存在多个被包 裹的细胞，这可以通过提供含有多个细胞的单个支持基质结构，如小珠实 现，或者更优选的通过在步骤(a)中在每个培养容器中提供大量支持基质 结构实现。在这第二个途径中，每个支持基质结构，如小珠可以含有单个 细胞或多个细胞。在可选的筛选方法中，每个培养容器中存在一个被包裹 的细胞。
使用本发明所述的方法可以在受控制的环境中快速培养单个的人胚胎 干细胞。这使得能够并行的高通量筛选许多不同的培养环境，或在相同的 培养环境中并行的高通量筛选许多不同的细胞类型。适宜地在单个培养容 器，如多孔板的孔中加入5到20个小珠，每个小珠含有单个人胚胎干细胞。 因为小珠中的单个细胞不会直接与附近小珠中包裹的单个细胞接触，所以 每个小珠构成单独的生长环境。在单个孔中放置多个小珠能够进行时间研 究分析，因为每个小珠将面临相同的条件。在多孔平板中培养使得能够对 多种条件进行筛选，并且便于结果的统计分析。使用机器人技术推进该过 程的自动化，例如通过喂饲培养物。小珠中单个细胞的包裹确保了在饲喂 或其它操作期间单个培养物不会被打扰。
本发明的筛选方法可以在培养容器中的二维培养物(静态或悬浮液) 中进行，或者在生物反应器，如HARV生物反应器中的三维培养物中进行。 使用具有微通道的微型生物反应器能够对三维培养物进行恒定的灌注的饲 喂，从而便于进行更加精细的筛选试验和自动化。本发明的筛选方法可以 以高通量的形式进行。
对于本发明的筛选用途和方法，试验化合物、试验刺激因素、培养基 和/或条件对细胞维持和/或分化的影响可以通过选自下组的一种或多种方 法进行评估：显微镜检查、一种或多种阶段特异性抗原的检测、基因表达 水平的检测，例如通过RT-PCR或使用DNA或RNA微阵列。
用于包裹的支持基质具有渗透性，能够容许营养物、代谢物和生长因 子的扩增和质量传递。一个或多个包裹在支持基质中的细胞可以以小珠， 如一般的球形小珠的形式提供。“包裹”表示一个或多个细胞被完全包埋在支 持基质中。小珠的形状不是特别相关，只要其尺寸，如表面积与体积的比 例使得营养物、代谢物、细胞因子等能够容易的扩散进入/出小珠，达到包 埋在小珠中的一个或多个细胞。
特别优选支持基质结构，如小珠由在培养期间保持完整的支持基质材 料构成，其中培养时间可以是3到4个月或更长时间以用于维持；或者如 同在形成骨的分化培养方法的实例中那样多至30到40天。将一个或多个 包裹在支持基质中的细胞置于三维培养容器，如RWV生物反应器(Synthesis， USA)或其它模拟微重力或灌注的(perfused)生物反应器中，然后在没有 明显损伤的情况下在维持和/或分化培养基中长期培养。
优选支持基质材料由水凝胶材料组成或包含水凝胶材料，例如形成凝 胶的多糖，如琼脂糖或藻酸盐(通常为约0.5到约2％w/v的范围，优选为 约0.8到约1.5％w/v，更优选约0.9到1.2％v/v)。基质可以单独由藻酸 盐组成，或可以包含更多的成分，如明胶(通常为约0.05到约1％w/v，优 选为约0.08到约0.5％v/v)。包含明胶可以帮助获得相同的小珠大小，和 帮助维持结构完整。这是重要的，因为藻酸盐水凝胶会在长期培养后失去 Ca2+阳离子，这将削弱小珠的结构完整性。藻酸盐支持基质小珠中包含明胶 使得能够进行细胞介导的收缩和支架材料的包装。
藻酸盐是从褐海藻中提取的水溶性线性多糖，其由交替单元的1-4连 接的α-L-葡萄糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸残基组成。藻酸盐可和大部分二价 和多价阳离子形成凝胶，但Ca2+是最常用的。钙阳离子参与G-块(G- blocks)之间的链间结合，形成凝胶形式的三维网络。G-块之间的结合区 通常表示为“蛋-盒模型(egg-box model)”(27)。
我们发现藻酸盐和基于藻酸盐的支持基质，合适的是以小珠的形式(如 藻酸盐加明胶小珠)，特别适合在本发明的方法中使用，因为它们在所用 的培养条件中保持其完整性。
可以用各种信号(如层粘连蛋白、胶原或生长因子)改良支持基质以 提高所需的细胞性能。因此，支持基质可以包含一种或多种选自下组的材 料：层粘连蛋白，BioglassTM，羟基磷灰石，细胞外基质，细胞外基质蛋白，生 长因子；来自其它细胞培养物的提取物，以及对于形成骨的分化而言，来自 成骨细胞培养物的提取物。
在二维培养中细胞外基质(ECM)已被用作刺激因素以实现胚胎干细 胞的形成骨的分化(Hausemann & Pauken，2003，Differentiation of embryonic stem cells to osteoblasts on extracellular matrix，10th Annual Undergraduate research Poster Symposium，Arizona State University： http://lifesciences.asu.edu/ubep2003/participants/hausmann)。本领域已知大量 能够刺激多潜能干细胞，如胚胎干细胞分化的生长因子，例如骨形态发生 蛋白4(BMP4)，其增强中胚层形成和骨形成，Nakayama等人.(2003)J Cell Sci 116(10)：2015.(http://jcs.biologists.org/cgi/reprint/116/10/2015)；视黄酸， 其刺激中胚层形成，hedgehog蛋白，例如sonic hedgehog，其刺激中胚层向 骨祖细胞分化以及骨形态发生蛋白BMP 1-3和5-9，其刺激骨诱导。
藻酸钙或基于藻酸钙的支持基质有利于形成骨的培养和分化。钙离子 在小珠的形成中被用作螯合剂，可以提供钙的本地来源以对形成骨的矿化 提供帮助。
在单个细胞被包裹以形成每个小珠具有单个细胞的小珠，然后培养形 成集落的方法中，特别优选使用含有明胶的藻酸盐作为用于包裹的支持基 质材料，以形成支持基质结构，例如形成小珠。
合适的，含有单个细胞的小珠的直径为大约20到150微米，优选约40 到约100微米。含有多个细胞的小珠的直径通常为约2.0到约2.5毫米，优 选约2.3毫米。
在发明的一些方面，优选所用的支持基质易于被溶解以释放细胞，不 需使用胰蛋白酶处理。在希望除去支持基质以释放细胞时，水凝胶基质， 例如藻酸盐和基于藻酸盐的基质是有利的，因为通过使用柠檬酸钠和氯化 钠溶液很容易将它们溶解。
可以将一个或多个细胞包裹在生物相容性材料中，从而使获得的被包 裹的细胞(如形成骨的细胞)能够直接施用给受试患者，而不需要从包裹 材料中收获细胞。为了这个目的，使用藻酸盐或基于藻酸盐的支持基质包 裹细胞是有利的，因为藻酸盐材料是生物相容性的，并且藻酸盐是FDA批 准的。被包裹的细胞，特别是包裹在藻酸盐或基于藻酸盐的材料中那些， 可以通过例如注射或内窥镜检查法直接施用给患者。
本发明的方法或用途可进一步包括冰冻被包裹的细胞用于储存。被包 裹的细胞可以使用标准方案进行冰冻，并且可以在其培养用的维持或分化 培养基中冰冻。适合用于冰冻被包裹的细胞的方法包括使用Stensvaag等人. (2004)Cell Transplantation 13(1)：35-44所述的缓慢冰冻程序在二甲基亚砜 (DMSO)中低温贮藏。
本发明的方法进一步包括从支持基质中释放一个或多个细胞。本发明 因此提供如此获得的一个或多个细胞。当使用藻酸盐或基于藻酸盐的基质 进行包裹时，可通过藻酸盐溶解实现细胞的释放。与会影响长期培养物中 细胞性能的标准酶促方法，如胰蛋白酶处理相比，这种温和的溶解方法更 具优势。
本发明还提供可以通过或通过本发明的细胞培养方法获得的一个或多 个被包裹的细胞；该被包裹的细胞可以是多能的，如形成骨的、形成软骨 的或形成心肌的细胞，或者是终末分化的，如成熟的成骨细胞或软骨细胞。
进一步提供本发明的被包裹的细胞作为药物的用途。通过本发明方法 获得的被包裹的形成骨的细胞在骨重建(bone reconstruction)，例如在治疗 性颌面外科(maxifacial surgery)或在整容外科(cosmetic surgery)中是有 用的。本发明还提供被包裹的形成骨的细胞作为治疗选自下组的疾病或病 症的药物的用途：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、成骨不全 (osteogenesis imperfecta)、Paget′s病、纤维性结构不良(fibrous dysplasia)、 与听力丧失有关的骨疾病、低磷酸酯酶症、骨髓瘤骨病、骨硬化症、骨过 度使用损伤(over-use injury to bone)、骨的运动损伤、牙周(齿龈)疾病。
进一步提供本发明的被包裹的形成软骨的细胞作为用于治疗选自下组 的疾病或病症的药物的用途：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、整容 成形外科。软骨疾病包括特别在关节软骨中的类风湿性关节炎和骨关节炎； 所述紊乱包括先天或遗传性缺陷，例如需要通过鼻和鼻中隔软骨的面部重 建进行治疗的那些。
还进一步提供本发明的一个或多个被包裹的形成骨的细胞在制备用于 治疗选自下组的需要骨重建的疾病或病症的药物中的用途，例如下列的疾 病或病症：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、成骨不全、Paget′s 病、纤维性结构不良、与听力丧失有关的骨疾病、低磷酸酯酶症、骨髓瘤 骨病、骨硬化症、骨过度使用损伤、骨的运动损伤、牙周(齿龈)疾病。
另外提供被包裹的一个或多个形成软骨的细胞在制备用于治疗选自下 组的疾病或病症的药物中的用途：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、 成形外科、整容成形外科、类风湿性和骨关节炎。
在另一方面，本发明提供治疗受试者的方法，其包括施用本发明的被 包裹的细胞。本发明的被包裹的形成骨的细胞可以被施用给受试者以治疗 需要骨重建的疾病或病症：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、 成骨不全、Paget′s病、纤维性结构不良、与听力丧失有关的骨疾病、低磷 酸酯酶症、骨髓瘤骨病、骨硬化症、骨过度使用损伤、骨的运动损伤、牙 周(齿龈)疾病。本发明的被包裹的形成软骨的细胞可以被施用给受试者 以治疗选自下组的疾病或病症：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、类 风湿性和骨关节炎。
本发明还提供成形外科的方法，其可以是治疗性的或整容外科 (cosmetic surgery)，包括施用本发明的一个或多个被包裹的细胞，优选被 包裹的形成骨或形成软骨的细胞。
可以配制本发明的被包裹的细胞以提供药物组合物，其含有一个或多 个被包裹的细胞和药学上可接受的载体或稀释剂。优选药物组合物被配制 用于通过注射或内窥镜检查法施用。
从本发明的被包裹的细胞得到的骨或软骨组织也在本发明范围中，其 适宜地在细胞支架上或细胞支架中提供。被包裹的细胞可以接种到细胞支 架上，和/或灌输入细胞支架中，所述细胞支架随后被移植以使细胞在体内 原位生长。该支架在骨和软骨组织的成形外科中特别有用。
附图说明
图1和2：用Oct4的抗体染色的免疫荧光
130天的石蜡包埋/切片的人胚胎干细胞(hESC)聚集体显示Oct-4的 阳性免疫染色。(嵌入的小图——阴性和阳性对照)
图3和4：用抗-TRA-1-81染色的免疫荧光
石蜡包埋/切片的130天的人胚胎干细胞聚集体的免疫染色显示对该抗 体的强免疫反应性，表明保留了多潜能性。(嵌入的小图——阴性和阳性 对照)
图5和6：用抗-SSEA-4染色的免疫荧光
未分化的人胚胎干细胞聚集体，显示SSEA-4抗体的阳性免疫染色。(嵌 入的小图——阴性和阳性对照)
图7：RT-PCR分析
RT-PCR分析显示在175天和260天的人胚胎干细胞聚集体中多潜能 标记物Oct4和Nanog的表达。泳道A是175天龄的人胚胎干细胞聚集体， 泳道B是260天龄的人胚胎干细胞聚集体，泳道C是阴性对照。GAPDH 的表达被用作内对照。
图8：包裹在水凝胶小珠(1.1％w/v藻酸盐，0.1％v/v明胶)中的单 个鼠胚胎干(mES)细胞在静态三维培养物中在M2培养基中生长10天。 比例尺为50μm。单个胚胎干细胞进行分裂，在大约10天时形成细胞的小 集落。
图9：整合的维持和形成骨的分化策略的示意图。步骤为：
a)在藻酸盐加明胶的微型小珠中包裹未分化的鼠胚胎干细胞，然后导 入三维生物反应器中；
b)在维持培养基(M2)中培养3天以增加鼠胚胎干细胞数量，并形成 合适的细胞群，以使得形成三维多先祖细胞(multiprogenitors)；
c)在EB形成培养基(M1)中培养5天；
d)在形成骨的培养基(Buttery)中培养21天以使得进行骨诱导和三维 骨形成。
图10：藻酸盐小珠中的组织形态。藻酸盐小珠保持其球形，细胞群集 变得明显：(a)第3天(比例尺长度＝1000μm)；(b)第7天(比例尺长度＝500 μm)；(c)第21天(刻度尺长度＝500μm)。在各个时间的苏木精/曙红染色 的水凝胶薄切片显示组织发育：(d)第3天(比例尺长度＝20μm)；(e)第8 天(比例尺长度＝20μm)；(f)第22天(比例尺长度＝20μm)。
图11：由存活/死亡染色表示的藻酸盐小珠中细胞的存活能力(嵌入 的小图)(绿色表示活细胞，红色表示死细胞；比例尺长度＝100μm)。 通过使用针对代谢活动的MTS分析(▲；n＝24)，和碱性磷酸酶分析(●；n＝ 6)和用于矿化组织形成的茜素红定量(■；n＝6)评估三维培养物中每个小珠 的生物化学表现。误差棒代表标准误差。*/#：显著增加/降低(p＜0.05)。
图12：对被包裹的鼠胚胎干细胞的表征。免疫细胞化学证实在第3天 维持未分化状态：(a)DAPI(蓝色)和CD9(红色)，(b)DAPI(蓝色)，(c)Oct-4 (绿色)，。当三维培养物在EB形成培养基中生长时(第3-8天)，在第8 天明显可见中胚层组织的产生：(d)DAPI(蓝色)和Flk-1(绿色)。嵌入的 小图表示从在组织培养平板(二维)上培养的鼠胚胎干细胞中获得的阴性 对照。比例尺长度＝20μm。
图13：对矿化组织形成的表征。(a)Balb/c小鼠骨茜素红S阳性对照 和，(b)Balb/c小鼠von Kossa阳性对照。通过(c)茜素红S和(d)von Kossa 染色证明在第22天藻酸盐小珠中的矿化组织形成。苏木精/曙红染色的藻酸 盐小珠的正中切开显示第29天在水凝胶核心的组织形成(e-f)。在第29天 检测同一切片的骨形成，显示更加明显的茜素红S(g)和von Kossa(h)染色。 在第29天进行的免疫细胞化学证实终末分化的成骨细胞的存在：(i)用DAPI 染色的(蓝色)和骨钙素免疫染色(绿色)的第29天的切片，并且嵌入的 小图(j)显示以同样方式染色的Balb/c小鼠骨阴性对照；(k)更高放大倍 率的用DAPI染色的(蓝色)和对骨钙素免疫染色的(绿色)第29天的切 片，嵌入的小图(l)显示Balb/c小鼠骨阳性对照；(m)用DAPI染色的(蓝 色)和对OB-钙粘蛋白的免疫染色的(绿色)第29天的切片，嵌入的小 图显示：(n)Balb/c小鼠骨阳性对照，和(o)Balb/c小鼠骨阴性对照；(p)用 DAPI染色的(蓝色)和对胶原-I的免疫染色的(绿色)第29天的切片， 嵌入的小图显示：(q)Balb/c小鼠骨阳性对照，和(r)Balb/c小鼠骨阴性对照。 (a-f)的比例尺长度为100μm，(g-j)的为20μm。
图14：在骨形成期间在第15天(d15)、第22天(d22)和第29天 (d29)对骨形成标记物的基因表达分析。L＝100bp DNA梯度。RT-ve＝第 29天在没有逆转录酶的情况下用GapDH引物的RT-阴性对照。-ve＝用水 替代模板的用GapDH引物的PCR阴性对照。+ve＝使用MC-3T3-E1细胞 在骨形成培养基中培养10天的阳性对照。
图15：使用微型计算机X线断层摄影术(微型CT)评估组织矿化。在 第29天评估藻酸盐小珠的骨聚集体矿化程度。(a-b)假颜色(false colour)， 随机选择的单个藻酸盐小珠在第29天的三维区域再现(3D sector reconstruction)。嵌入的小图代表使用Balb/c小鼠大腿骨的假颜色阳性对照。 假颜色图像的着色显示从最高(黄色)到紫色到最低(黑色)的衰减水平， 其分别表示硬到软组织。(c)显示第29天藻酸盐小珠的灰度传递图像(红 色箭头指示矿化聚集体周围的软组织)。嵌入的小图显示使用没有任何细 胞的藻酸盐小珠的阴性对照灰度传递图像(虚线表示小珠边沿)。(d)假颜 色，第29天藻酸盐小珠的二维横切面。比例尺长度＝100μm。
实施例
实施例1：在藻酸盐小珠中包裹人胚胎干细胞
1.1细胞培养
1.1.1饲养层
原代鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
简要的，在雌性小鼠(Swiss MF1品系)怀孕的第13天通过进度表I 处死方法(schedule I killing)将其处死。然后取出胚胎，并除去他们的内脏。 在胰蛋白酶/EDTA溶液(0.1MPBS中的0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA， 不含钙或镁；Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK)中仔细切碎胚 胎尸体，将其在培养瓶中接种于补充有10％v/v热灭活FBS、0.1mM MEM 非必需氨基酸溶液、100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素(均得自Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK)的高葡萄糖DMEM中。当细胞达 到铺满时，收集成纤维细胞，将其冰冻于含有60％v/v高葡萄糖DMEM、 20％v/v热灭活FBS(均得自Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK) 和20％v/v二甲基亚砜Hybri-Max(DMSO)(Sigma-Aldrich，Dorset，UK)的 MEF冰冻培养基中。为培养人胚胎干细胞，优选不超过三或四代的MEF。
在除青霉素和链霉素外其它与上述相同的培养基中，于明胶包被的培 养容器表面培育解冻的MEF细胞。在用作饲养层之前，用丝裂霉素C消除 MEF细胞的有丝分裂活性。然后用胰蛋白酶(0.1MPBS中的0.05％胰蛋白 酶/0.53mM EDTA，不含钙或镁；Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley， UK)处理灭活的细胞，并或者将其冷冻，或者转移到6孔平板中作为人胚 胎干细胞生长的饲养层。在MEF冰冻培养基中冰冻MEF(方案来自WiCell Research Institute Inc，Madison，July 2000)。
人胚胎干细胞的培养
1.1.2.1未分化细胞的培养
将灭活的原代MEF细胞接种至少一天，然后将未分化的人胚胎干细胞 在上述培养基中解冻。第二天，解冻未分化的人H1细胞(WiCell Research Institute Inc，Madison)，将其接种于MEF细胞上，采用供应商建议的方案 培育未分化状态的细胞。培养基由补充有20％v/v KNOCKOUTTM SR、2 mM L-谷氨酸盐、0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK)、0.1mM 2-巯基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich， Dorset，UK)和4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGF-2)(157 个氨基酸)(R&D Systems，Oxon，UK)的DMEM/F12培养基组成。每两天喂饲 细胞。
这些细胞的生长率比小鼠胚胎干细胞的生长率慢很多。由于灭活的 MEF细胞在培养物中7-10天会死亡，因此每7-10天将人胚胎干细胞转 移到新的饲养层上。细胞解冻后，需要花费约4-6周获得亚铺满的培养孔， 然后将细胞分板。只有当细胞处于集落中时，他们才生长并保持它们的未 分化状态。单个细胞不生长。偶尔，一些集落进行自发分化。
1.2在藻酸盐小珠(alginate bead)中包裹人胚胎干细胞
1.2.1包裹过程
用胰蛋白酶消化未分化的、4-5天的人胚胎干细胞，然后在室温下重 悬于1.1％(w/v)低粘性褐藻酸*(Sigma，UK)和0.1％(v/v)猪明胶(Sigma，UK) (均溶解在PBS中，pH7.4)溶液中。低粘性褐藻酸是基本由具有1→4连接的 无水-β-D-甘露糖醛酸残基组成的直链、亲水、胶态聚糖醛酸。采用Pharmacia 蠕动泵[Amersham Biosciences，UK(Model P-1)]，以×20的流速、30mm的落 差[(对管道进行高压灭菌，然后用1M NaOH灭菌30分钟并用无菌PBS洗 三次)]，使细胞-凝胶溶液通过蠕动泵(peristaltic pump)，用25口径的针 (Becton Dickinson，UK)将其滴入无菌、室温的CaCl2溶液中[于蒸馏水中的 100mM氯化钙(CaCl2)(Sigma，UK)和10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙 烷磺酸)(HEPES)(Sigma，UK)，pH7.4]。凝为胶体的细胞-凝胶溶液立刻与 CaCl2溶液接触，形成球形小珠(膨胀后直径2.3mm)。室温下将小珠在轻轻 搅动的CaCl2溶液中保持6-10分钟。将小珠在PBS中洗三次，然后放入 维持培养基中。
在人胚胎干细胞维持培养基中培养包裹在藻酸盐小珠中的未分化人胚 胎干细胞，所述人胚胎干细胞维持培养基为补充有20％v/v KNOCKOUTTM SR、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自Gibco Invitrogen， Life Technologies，Paisley，UK)、0.1mM 2-巯基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich， Dorset，UK)和4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGF-2)(157 个氨基酸)(R&D Systems，Oxon，UK)的DMEM/F12培养基。生长的条件为湿 润孵箱中、37℃，5％CO2，小珠在标准的塑料组织培养皿中于静态条件下进 行培养。每3-4天饲喂细胞。使用附有彩色CoolPix 950数码相机(Nikon， Kingston-upon-Thames，UK)的倒置显微镜(Olympus，Southall，UK)评估和记 录结构和形态学上的任何改变。小珠既含有人胚胎干细胞的聚集体，也含 有单个人胚胎干细胞，单个人胚胎干细胞在小珠中形成集落。
在维持培养基中130天后，于PBS中洗小珠两次，然后将其溶解以释 放细胞/集落。
1.2.2藻酸盐小珠的溶解
将用于溶解小珠的无菌解聚缓冲液[(Ca2+耗尽的)(50mM二水合柠檬 酸三钠(Fluka，UK)，77mM氯化钠(BDH Laboratory Supplies，UK)和10 mM HEPES)](20)加入到用PBS洗过的小珠中15-20分钟，同时轻轻搅动。 溶液于400g下离心10分钟，用PBS洗涤沉淀物，然后再于300g下离心3 分钟。
1.3组织学
1.3.1石蜡包埋
室温下用4％多聚甲醛(PFA)固定来自小珠的130天龄的人胚胎干细 胞聚集体一小时，然后保持在0.1％叠氮化钠中以进行短期或长期保存 (4℃)。脱水过程前，将人胚胎干细胞聚集体置于PBS中15分钟。随后经过 依次提高乙醇浓度的程序除去所有的水。然后用纯二甲苯完全替换乙醇以 除去所有痕量乙醇。然后在室温下用石蜡饱和的二甲苯替换二甲苯过夜。 然后将在石蜡饱和的二甲苯中的人胚胎干细胞聚集体置于烤箱(60℃)中20 分钟。然后用液体石蜡完全替换二甲苯。然后包埋样本，切片(4μm)，室 温下过夜以粘附于VectabondedTM(Vector Laboratories，UK)载玻片上。
1.3.2免疫细胞化学
通过在二甲苯中沉浸、逐渐降低的乙醇浓度、然后用自来水沉浸，从 切片除去石蜡。然后，将切片浸入二水合柠檬酸三钠缓冲液(10mM，pH6.0) 中进行高温灭菌，然后冷却和干燥，以取回(retrieve)抗原。随后用3％(v/v) 封闭山羊或兔血清(Vector Laboratories)在室温下在作为一级稀释剂(primary diluent)的PBS中的0.05％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma)，0.01％(w/v) NaN3(Sigma)中温育样本30分钟。
为进行免疫荧光染色，根据制造商的方案使用胚胎干细胞标记物样本 试剂盒(Chemicon，International；Cat.no.SCR002)。所使用的单克隆抗体为： 抗-SSEA-4，抗-TRA-1-60和抗-TRA-1-81(试剂盒中提供)。对于Oct-4抗体 (Santa Cruz Biotechnology)，用在一级稀释剂中稀释的一级抗体(1∶300) 于4℃温育样本过夜，随后洗两次，用在二级稀释剂中稀释的二级抗体(山 羊抗-兔1∶300)(Santa Cruz，International)在室温于黑暗中温育1小时，第二 稀释剂由PBS中0.05％(w/v)BSA组成。随后，在PBS中洗样本两次，用 VectashieldTM固定。在IX70荧光倒置显微镜(Olympus，Southall，UK)下观察 制品。
1.3.2.1阴性对照
如在间接二层荧光标记中那样，可以通过省去一级抗体以检测所使用 的二级抗体的背景荧光，获得阴性对照样本。随后可以用这些数据准确解 释阳性样本。阴性对照可用于将标记物定位在荧光直方图上，从而识别阴 性群体的确切位置，和估计单克隆或多克隆抗体与细胞表面抗原非特异性 结合的数量。
阳性对照
对于阳性对照，人胚胎干细胞在MEF上生长，然后用胚胎干细胞标记 物试剂盒免疫染色。使用阳性对照识别单克隆和多克隆抗体与阳性样本上 细胞表面抗原的特异性结合。
RNA提取和逆转录
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Life Technologies，UK)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，UK)从藻酸盐小珠中形成的175天和260天人胚胎干 细胞聚集体中提取总RNA。使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) (Invitrogen，UK)在20μl终体积中从1μg总RNA合成cDNA。使用寡(dt)20 引发(prime)进行RT反应，其能够用不同位点的基因特异引物PCR扩增 同一cDNA。在没有cDNA模板的情况下进行阴性对照。使用Primer Express 2软件(Applied Biosystems，UK)设计引物。
RT-PCR序列如下：
基因 引物序列(5’-3’) 退火温度 (℃) 扩增子大小 (bp) Oct4 F：TCTGCAGAAAGAACTCGAGCAA R：AGATGGTCGTTTGGCTGAACAC 54 127 Nanog F：TGCAGTTCCAGCCAAATTCTC R：CCTAGTGGTCTGCTGTATTACATTAAGG 55 91 GAPDH F：GTTCGACAGTCAGCCGCATC R：GGAATTTGCCATGGGTGGA 54 182
对于持家mRNA，使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，因为据显示 在分化的胚胎干细胞培养物中GAPDH mRNA比其他持家mRNA序列更稳 定。通过BLAST(http://www.ncbi.nl m.nih.gov/BLAST/)检验引物退火位点和 扩增子序列与其他人DNA和cDNA序列的相似性。发现配对的引物退火位 点和扩增子序列对于目标人序列是唯一的。
在50μl PCR反应混合物中，MgCl2和dNTP的终浓度分别为3和10 mM。在Mastercyclerep(Eppendorf AG，Germany)中进行DNA扩增：双链 DNA变性和AmpliTaq Gold DNA聚合酶的活化在94℃进行10分钟，然后 在94℃进行40个循环的模板变性(5秒)，在55℃进行引物退火(对于 Oct4和GAPDH；对于Nanog为55℃)和在72℃进行引物延伸(30秒)。 在3％(w/v)琼脂糖凝胶上分离PCR产物，通过溴化乙锭荧光显像，使用100 bp梯度(Fermentas)估计产物的大小。
使用与计算机连接的Fluor-S MultiImager系统(Bio-Rad，UK)捕捉溴化 乙锭染色的凝胶的数码图象，该系统由所附的平板式紫外光扫描器和CCD 相机组成。使用Bio-Rad Quantity One软件(Bio-Rad，UK)分析图象，该软件 可检测单个条带并减去背景噪音，获得完全由基因特异性扩增的产物产生 的强度值。
RT-PCR分析(图7)显示在175天和260天的人胚胎干细胞聚集体中多 潜能标记物Oct4和Nanog的表达。泳道A是175天龄的人胚胎干细胞聚集 体，泳B是260天龄的人胚胎干细胞聚集体，泳道C是阴性对照。使用 GAPDH表达作为内对照。这些结果显示在超过100天的阶段中人胚胎干细 胞聚集体仍然保留了人胚胎干细胞的多潜能性而没有传代。这些结果也支 持先前对多潜能标记物的免疫细胞化学观测结果。
结论和讨论
获得的结果证明人胚胎干细胞能够在不存在饲养细胞且不存在饲养细 胞条件培养基的情况下保持未分化状态至少130天。人胚胎干细胞包裹过 程提供了物理环境，该物理环境使得不再需要这种饲养细胞支持。所开发 的该过程使得能够采用类似于小鼠胚胎干细胞培养方法的方法培养人胚胎 干细胞。本发明所开发的用于人胚胎干细胞的培养程序使得能够实现人胚 胎干细胞分化方案，该方案基于现已用小鼠胚胎干细胞验证过的方案，但 至今仍由于无法获得数量足够用于这些实验的未分化胚胎干细胞而没有在 人胚胎干细胞中进行研究。所开发的人胚胎干细胞培养系统为用于开发使 用人胚胎干细胞的治疗性产品的标准化可调节系统提供了有用的平台。
实施例2：单个鼠胚胎干(mES)细胞的分化
将单个的鼠胚胎干细胞包裹在水凝胶小珠(直径40-100μm)中，然后 在维持培养基M2[Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)，10％(v/v) 胎牛血清，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺(均由 Invitrogen，UK提供)，0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma，UK)和1000单位/mL EsgroTM(LIF)(Chemicon，UK)]中生长10天。单个胚胎干细胞进行分裂，10 天左右形成小的细胞集落(图8)。通过用已确定的种系特异性信号进行刺 激可以使这些细胞分化为不同种系的成熟细胞。例如，对于形成骨的分化， 采用下述的方案。
实施例3：比较方法，传统的二维鼠胚胎干细胞常规维持和传代(参 考文献2和3)
E14Tg2a鼠胚胎干(mES)细胞系在设定为37℃和5％CO2(h3 7/5) 的湿润孵箱中在0.1％明胶包被的组织培养容器上常规传代。未分化的鼠胚 胎干细胞(＜p20)每2或3天进行传代，并且每天喂饲新鲜的M2培养基 [Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)，10％(v/v)胎牛血清，100单位 /mL青霉素和100μg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺(均由Invitrogen，UK提供)， 0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma，UK)和1000单位/mL EsgroTM(LIF)(Chemicon， UK)]。为分离鼠胚胎干细胞，在吸出培养基后向鼠胚胎干细胞中加入需要 量的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(TE)(Invitrogen，UK)3-5分钟 (h37/5)，然后用预热的PBS洗一次。
二维胚状体形成
胚状体(embryoid body)形成涉及悬浮培养前鼠胚胎干细胞的精心制 备，这已经有详细的记载(8；9；24；28-30)。然而，本发明用E14Tg2a细胞系确 定了悬浮前正确条件的经验测定。单层培养物中的细胞应为～80％铺满，其 为2或3天的培养物，并且在形态学上未分化的与已分化的比值很高。像正 常一样用胰蛋白酶处理鼠胚胎干细胞，但是在胰蛋白酶作用2-3分钟而不 是5分钟后可见100-200个细胞的细胞团。细胞随后在室温下以300g离心3 分钟(22℃，(RT))。在M2培养基中生长2或3天后，铺满的T75培养瓶中通常 产生大约5-7x106个细胞，将其重新悬浮于30mL的M1培养基 [Alpha-Modified Eagles Medium(αMEM)，10％(v/v)胎牛血清，100单位/mL 青霉素和100μg/mL链霉素]中，然后均匀散布在两个90mm直径的细菌学等 级的培养皿(Bibby Sterilin，UK)中。为通过这种方法正确形成胚状体，10- 20个细胞的细胞团是必需的，因为单个细胞悬浮液或数千个细胞的大细胞 团会导致错误的三维聚集体。在胚状体形成(h37/5)的第三天更换培养基， 因此必需的生长因子已经耗尽(如L-谷氨酰胺)，且有毒代谢物已经开始积 聚(如氨)。在培养的第5天，通过从细菌学平板中抽吸而收获胚状体，然后 以66g离心4分钟。吸出培养基，用预热的PBS替换以洗去痕量血清。细胞再 次以66g离心4分钟，吸出PBS。洗3-5分钟(h37/5)后向胚状体中加入1mL 的TE。然后加入预热的M1培养基(1mL)以停止胰蛋白酶消化作用，将细 胞重新悬浮于需要的培养基中作为用于骨小结形成分析的单个细胞悬浮 液。
二维骨小结分析
如以前所述(31)的标准的骨小结(bone nodule)形成分析是使用M1 培养基进行的，其从第8天到第29天不断补入βadex[10mM β-磷酸甘油， 50μg/ml抗坏血酸和1μM的地塞米松(终浓度)]。将解聚的胚状体(dEB)在塑 料组织培养容器或载玻片上培养21天(h37/5)，每2或3天更换培养基。dEB 的铺板密度为每平方厘米5.208×103个细胞，每25个细胞1μL培养基。
实施例4：鼠胚胎干细胞的藻酸盐小珠包裹
将未分化的鼠胚胎干细胞(mESC)包裹于1.1％(w/v)低粘性褐藻酸和 0.1％(v/v)猪明胶的水凝胶小珠(d＝2.3mm)中。在50mL水平的方向比率容 器(aspect ratio vessel)(HARV)生物反应器中培养大约600个小珠，每 个小珠中含有10,000个鼠胚胎干细胞。设定生物反应器培养物的转动速度 为17.5rpm，在含有白血病抑制因子(LIF)的维持培养基中培养3天，然 后替换为胚状体形成培养基，培养5天，接着用含有2-磷酸-L-抗坏血酸(50 μg/mL)，β-磷酸甘油(10mM)和地塞米松(1μM)的形成骨的培养基再培养21 天。29天后观察到培养物中每个小珠的细胞数量增长了84倍，并且在藻酸 盐小珠中形成了矿化的(mineralised)基质。骨生成通过von Kossa和茜素 红S染色、碱性磷酸酶活性、骨钙素(osteocalcin)的免疫细胞化学，OB -钙粘蛋白和I型胶原、RT-PCR和微计算机X线断层摄影术(微CT)进行 评估。这些发现提供了一种简单、集成的生物学方法，用于从鼠胚胎干细 胞可再生地生产具有潜在临床应用的三维(3D)矿化组织。
材料和方法
鼠胚胎干细胞培养和胚状体形成
E14Tg2a细胞的培养和胚状体的形成如先前所述的进行(32)。简要的， 每2-3天传代未分化的鼠胚胎干细胞(＜p20)，并且每天用维持培养基进行 喂饲，维持培养基由补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS；Invitrogen)、100单 位/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺 (Invitrogen)、0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma，UK)、和1000单位/mL LIF (Chemicon，Chandlers Ford，UK)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM；Invitrogen，Paisley，UK)组成。分裂胚状体，将细胞团(10-20个 细胞)置于由alpha-Modified Eagle’s Medium(αMEM；Invitrogen)、10％(v/v) FCS(Invitrogen)、100单位/mL青霉素(Invitrogen)、和100μg/mL链霉素 (Invitrogen)组成的胚状体分化培养基中悬浮5天。
矿化组织和骨小结分析
如先前所述，使用补充有50μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸(Sigma)、10mM β-磷酸甘油(Sigma)和1μM地塞米松(Sigma)的α-MEM(Invitrogen)从第8天 到第29天的培养物中在保持在37℃和5％CO2条件下的塑料组织培养容 器中或载玻片上进行矿化组织的形成(13)。铺板密度为5.2×103个细胞 /cm2，每2或3天更换培养基。
包裹和生物反应器培养
未分化的鼠胚胎干细胞以1.56×106个细胞/mL悬浮于无菌的1.1％ (w/v)低粘性褐藻酸(Sigma)，0.1％(v/v)猪明胶(Sigma)磷酸盐缓冲盐溶液 (PBS；pH7.4)中。将细胞-凝胶溶液通过蠕动泵(Model P-1；Amersham Biosciences，Amersham，UK)，然后使用25-口径将其从30mm滴入100mM CaCl2，10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙烷磺酸)的无菌溶液(HEPES；pH 7.4)(均得自Sigma)中。在室温下凝胶化6-10分钟所形成的小珠为球形(膨 胀后直径＝2.3mm)。包裹的鼠胚胎干细胞在水平的方向比率容器生物反应 器(Cellon，Bereldange，LUX)中在维持培养基中培养3天，每天更换培养基。 每个反应器含有600个小珠，在培养的第0-21天以17.5rpm旋转，在培 养的第22-29天以20rpm旋转。提高旋转速度以抵消藻酸盐小珠中矿化组 织的形成，其导致小珠变得更重。从第3天直到第8天，用胚状体分化培 养基(αMEM，如先前所述)喂饲生物反应器培养物，该培养基在第6天补 满，然后在第8天如早先所述的用形成骨的补充物进行骨形成的诱导(每2 -3天补满)。
存活/死亡分析
悬浮细胞或藻酸盐小珠在室温下于暗处用PBS中的4μM EthD-1和2 μM钙黄绿素AM溶液(Invitrogen)温育30分钟，然后用PBS洗涤。死亡细 胞被用作阴性对照。
细胞样本处理
将在Flaskette载玻片(Nalgene，Hereford，UK)上生长的对照二维细胞 培养物于4％(w/v)多聚甲醛(PFA；BDH Laboratory Supplies)中固定20分 钟，然后在PBS中洗涤。在室温下将藻酸盐小珠于4％(v/v)多聚甲醛(PFA； 由BDH Laboratory Supplies，Poole，UK)中固定30分钟，然后在浓度逐渐增 加的乙醇中脱水，用二甲苯(BDH Laboratory Supplies)处理，接着用石蜡 包埋。将包埋的样本连续切片(4μm)至VectabondTM-包被的载玻片(Vector Laboratories，Orton Southgate，UK)上。对于免疫细胞化学，在通过加热取回 抗原前，将脱水的切片浸入10mM二水合柠檬酸三钠缓冲液(pH6.0； Sigma)中。Balb/c小鼠骨骼用与藻酸盐小珠相同的方式进行加工，用作对 照。
组织学
通过常规的苏木精/曙红染色检测含水的二维细胞培养物或在藻酸盐小 珠中生长的细胞的脱石蜡切片的组织学。
茜素红S和von Kossa染色
如别处所述，含水(hydrated)二维细胞培养物和石蜡切片用茜素红S 或von Kossa着色剂染色(33)。Von Kossa染色的切片用核坚牢红复染色， 连续脱水，在二甲苯中清除，然后在DPX中固定。Balb/c小鼠骨被用作对 照，用与藻酸盐小珠相同的方式对其进行加工。
免疫细胞化学
将含水二维细胞培养物或石蜡切片浸入10mM二水合柠檬酸三钠缓 冲液(pH6.0；Sigma)中，然后高压灭菌以取回抗原，随后在室温下用0.2％ (v/v)Triton-X-100(BDH Laboratory Supplies)温育45分钟。如表1中所示， 样本依次用下列温育：a)在作为一级稀释剂的PBS中的0.01％(w/v)NaN3 (Sigma)中，于室温下用在0.05％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma)中的3％ (v/v)封闭山羊或兔血清(Vector Laboratories)温育30分钟；b)与在一级稀释 剂中稀释的针对若干干细胞和成骨细胞标记物的一级抗体于4℃温育过夜； c)与在二级稀释剂[PBS中的0.05％(w/v)BSA]中的二级抗体在室温下于 暗处温育1小时。然后用PBS洗涤样本，再用含有1.5μg/mL 4′，6联脒-2- 苯基吲哚(DAPI)的VectashieldTM(Vector Laboratories)固定。Balb/c小鼠骨 被用作对照，用与藻酸盐小珠相同的方式对其进行加工。
逆转录-PCR
使用总RNA分离试剂盒(Qiagen Ltd，Crawley，UK)提取总RNA。使用1 μg总RNA、随机引物和具有Rnase抑制剂的AMV逆转录酶(Promega，UK) 进行单链cDNA的合成。PCR反应缓冲液由1xAmplitaq Gold缓冲液，2mM MgCl2，200μM dNTPs，1.25单位的Amplitaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，Warrington，UK)和500nM的每种引物(Invitrogen)组成。如先前 所述(32)，使用2μL(来自20μL)的cDNA进行RT-PCR分析；引物序 列如表1中所列。使用MC-3T3-E1细胞的阳性对照在形成骨的培养基中培 养10天。移除逆转录酶作为阴性对照。
表1：
抗原 一级 二级 封闭血清1 封闭血清2 Oct-4 1∶80兔多克隆(Santa Cruz Biotech，Calne， UK) 1∶80山羊抗兔FITC (Chemicon，Chandlers Ford，UK) 3％正常山羊血 清(Vector Laboratories，UK) 不适用 CD9 1∶750大鼠单克隆 (Research Diagnostics， Concord，MA，USA) 1∶80山羊抗大鼠若 丹明.(Chemicon) 3％正常山羊血 清(Vector Laboratories) 1.5％正常小鼠 血清(Serotec， Kidlington，UK) Flk-1 1∶200小鼠单克隆 (Santa Cruz biotech) 1∶80兔抗小鼠FITC (Dako，High Wycombe，UK) 3％正常兔血清 (Vector Laboratories) 1.5％正常小鼠 血清(Serotec) OB-钙粘 蛋白 1∶50山羊多克隆 (Santa Cruz Biotech) 1∶100兔抗山羊FITC (Sigma) 3％正常兔血清 (Vector Laborato ries) 不适用 骨钙素 1∶50山羊多克隆 (Santa Cruz biotech) 1∶100兔抗山羊FITC (Sigma) 3％正常兔血清 (Vector Laboratories) 不适用 I型胶原 1∶50兔多克隆(Santa Cruz biotech) 1∶100山羊抗兔FITC (Chemicon) 3％正常山羊血 清(Vector Laborato ries) 不适用 基因 FWD 5’-3’ RVS 5’-3’ 长度(bp) PCR条件 Gapdh CATCACCATCTTC CAGGAGC ATGCCAGTGAGCT TCCCGTC 474 94℃下10分钟， 35个循环的：94 ℃ 30秒、60 ℃ 40秒、72℃ 60秒和72℃ 10 分钟。 Cbfa-1 CAGTTCCCAAGCA TTTCATCC TCAATATGGTCGC CAAACAG 444 94℃ 10分钟， 36个循环的：94 ℃ 60秒，45℃ 60秒，72℃ 60 秒和72℃ 10分 钟。 胶原I GAACGGTCCACGA TTGCATG GGCATGTTGCTAG GCACGAAG 167 94℃下10分 钟，30个循环的： 94℃ 60秒，60 ℃ 60秒，72 ℃ 60秒和72℃ 7分钟。
胶原II CTGCTCATCGCCG CGGTCCTA AGGGGTACCAGG TTCTCCATC 432(剪接A，早 期发育) 225(剪接B，成 熟软骨) 94℃下10分 钟，30个循环的： 94℃ 60秒，60 ℃ 60秒，72 ℃ 60秒 & 72℃ 下7分钟 骨钙素 (OCN) CGGCCCTGAGTCT GACAAA ACCTTATTGCCCT CCTGCTT 193 94℃ 10分钟， 30个循环的：94 ℃ 60秒，60 ℃ 60秒，72℃ 60秒和72℃ 7 分钟。
MTS分析
采用CellTiter 96AQueous One Solution Reagent分析(Promega， Southampton，UK)评估整个培养期间的代谢活动。使用生长于培养瓶培养物 (二维)或包裹于藻酸盐小珠(三维)中的已知数量的鼠胚胎干细胞产生 标准曲线。进行阴性对照(无细胞)。所有的试验都在三个不同的场合、 一式两份地进行，并且对于每个试验，都一式四份地进行测定。简要的， 二维培养的鼠胚胎干细胞在37℃于24孔平板中用200μL的无酚红维持培 养基和40μL的MTS试剂温育2小时。只有二维反应通过加入50μL的10％ (v/v)十二烷基硫酸钠(SDS)停止。类似的，随机选择三个藻酸盐小珠，将其 放入24孔平板的不同孔中，然后在37℃用300μL的无酚红维持培养基和 60μL的MTS试剂温育4小时。从每个反应中取100μL转移入96孔平板 中，然后使用MRX II平板读数器(Dynex Technologies，Worthing，UK)于450 nm读数。
DNA定量
使用DNA特异性染料Hoechst 33258(Sigma)测定用蛋白酶K消化的样 本的总DNA含量，以其作为评估藻酸盐小珠中细胞数量的间接方法。简要 的，小珠在室温下于解聚缓冲液(20)中溶解20分钟，然后以400g离心 10分钟，收集细胞沉淀，用PBS洗涤。沉淀在液氮中速冻，然后在-80℃ 下保存直到进行分析。为进行DNA分析，沉淀在37℃下于含有50μg/mL 蛋白酶K(Sigma)的100mM磷酸氢二钾(Sigma)溶液中消化过夜。热灭活蛋 白酶K并且以12,000g离心10分钟之后，将100μL上清液与100μL的 Hoescht 33258溶液(2μg/mL)混合。最后，使用MFX微滴定平板荧光计 (Dynex Technologies)以365nm激发波长、460nm发射波长对100μL试样 读数。使用高度聚合的小牛胸腺DNA(Sigma)产生校准曲线。在培养的第 0天和第29天，样品一式两份的用于三个独立的试验。
矿化的定量茜素红分析
被包裹的鼠胚胎干细胞的矿化的茜素红S(ARS)分析在整个培养过程 中通过改造Gregory等人的方法(34)进行定量。简要的，将100个小珠用 10％(v/v)甲醛固定30分钟，然后在解聚缓冲液(20)中溶解20分钟。通 过以400g离心10分钟回收细胞沉淀，然后以与二维培养物相同的方式将 其染色。
碱性磷酸酶(ALPase)活性
通过在37℃于暗处用150μL的碱性磷酸酶缓冲液(pNPP；Sigma)和 150μL的磷酸对硝基酚溶液温育细胞或小珠30分钟检测培养于培养瓶培养 物中或包裹于藻酸盐小珠(n＝6)中的鼠胚胎干细胞的碱性磷酸酶活性。 通过向每孔中加入100μL的0.5N NaOH溶液终止反应，然后从每个反应中 取100μL转移到96孔平板的孔中，使用MRX II平板读数器(Dynex Technologies)于410nm读数。
成像
使用配置有CoolPix 950数码相机(Nikon，Kingston-upon-Thames，UK) 的IX70倒置显微镜(Olympus，Southall，UK)或配置有Axiocam(Zeiss)的 BX60竖式(Olympus)显微镜获取图象。图象没有进行人工增强；但是使用 Adobe Photoshop 7.0对图象进行采集(crop)。存活/死亡的染色样本在30 分钟的制备过程中使用Bio-Rad MRC600共焦显微镜(Bio-Rad/Zeiss， Welwyn-Garden-City，UK)成像，然后使用COMOS软件(Bio-Rad，UK)处 理。
微型-CT
使用设定为70kV、160μA并相应校准的Phoenix x-ray v|tome|x计算机 X线断层摄影机(Phoenix x-ray 3D Imaging System，Fareham，UK)进行微型 -CT分析以再现(reconstruct)在藻酸盐小珠中形成的三维矿化聚集体。使 用一个检测器获取图像，并在360°内旋转，每个截面相隔6.75μm。使用最 初由Siemens，Germany开发的Sixtos软件产生三维再现。使用不含被包裹 的细胞的藻酸盐小珠的阴性对照，和使用Balb/c小鼠pup骨碎片的阳性对 照。
统计分析
将结果表示为平均值±平均值的标准差(SEM)，并使用方差分析 (ANOVA)对结果进行分析。在P＜0.05时认为具有统计学显著性。
结果
对来自包裹于藻酸盐小珠中和培养于HARV生物反应器中的鼠胚胎干 细胞的三维矿化组织进行形态、表型(表面和分子)以及功能性(矿化程 度)的评估。作为对照，我们根据传统的在培养瓶(二维)培养物中形成 骨小结的方案培养鼠胚胎干细胞，重复先前已显示的结果(31)，从而证 实发生了形成骨的分化(数据未显示)。
被包裹的鼠胚胎干细胞的形态学表征
将分散的未分化鼠胚胎干细胞包裹于平均直径为2.3mm的藻酸盐水凝 胶小珠中(大约每个小珠10,000个细胞)。在维持培养基中培养3天后， 一开始分散在藻酸盐小珠中的鼠胚胎干细胞形成了细胞个数为4-10个细 胞、直径在20-50μm之间的集落(图1a)。这些集群是为球形、盘形或梭 形，在小珠各处平均分布，但是很少位于紧邻小珠外表面的地方(图1a)。 在第3天除去LIF、然后在EB形成培养基中培养5天之后，大部分集落表 现出一致的外观，并显示在藻酸盐基质内离散的“口袋(pockets)”中细胞数 量和整体大小都有所增加(图1b)，集落的大小范围在直径50-400μm。到 培养的第22天，集落已经非常紧密地堆积。大部分大集落位于小珠中心(图 1c)，在外围可以见到不含任何细胞材料的区域。培养29天后，集落的直 径超过了500μm。
细胞生长和代谢活动
随着集落大小增加，被包裹的鼠胚胎干细胞的细胞生存力并未随着培 养时间而明显降低。在第3天，出现有限的细胞死亡迹象，其表现为少许 红色细胞(图2)；但多数细胞开始形成离散的、存活的集落。虽然集落大 小随着培养时间而增加，但是在培养的最初3周集落的数量没有明显的增 加，尽管事实上生存力非常高(图2)。最终，培养29天后，明显可见的 存活集落在数量上多于第22天时，也比他们在培养更早期时更大。通过检 测单个小珠中DNA量进行评估的第0天时每个小珠中具有代谢活性的、未 分化的鼠胚胎干细胞的数量为每个小珠中10,287±228个细胞(平均值±SE； n＝2，每个重复试验分析150个小珠)。在HARV生物反应器中培养29天后， 每个小珠中有859,716±13,492个细胞(平均值±SE；n＝6)，其表明从培养 开始增加了84倍。代谢活性的改变显示出与培养的阶段、所使用的培养基 类型和喂饲的时间有关。从第0天到第3天，小珠培养于维持培养基中， 每个小珠的代谢活动保持不变(图2)。在第3天，用胚状体形成培养基替 换维持培养基，如图2所示，可以观察到每个小珠的代谢活性明显增加(p ＜0.05)。在第8天，加入分化培养基，如图2所示，每个小珠的代谢活动 到第15天略有降低，仅在到第29天明显增加(p＜0.05)。但是，由于到培 养的第29天藻酸盐小珠中细胞的数量增加了84倍，因此每个细胞的代谢 活性没有增加。
ALPase活性和矿化的量被用于指示形成骨的培养基中骨形成期间(培 养的第15天到第29天)的形成骨的分化。在培养的第15天和第29天之 间ALPase活性降低了3倍(p＜0.05)(图2)。相反，如图2所示，每个小珠 中矿化的量(基于410nm的吸光率)明显增加(p＜0.05)，从第15天的0.0021 ±0.0003增加到第29天的0.0999±0.0035(平均值±SE)。吸光率读数被标 准化为每个小珠的，但是实际读数是在每次读数使用100个小珠的矿化量 获得的。
未分化鼠胚胎干细胞和胚状体的表征
在培养的第3天Oct-4(细胞核中)和CD9(在细胞表面上)的表达证明在 维持培养基中的最初3天的培养期间被包裹的鼠胚胎干细胞保持未分化表 型(图3a-c)。此外，在胚状体形成阶段，被包裹的鼠胚胎干细胞在第8天 显示表达Flk-1，一种中胚层标记物(图3d)。
三维矿化组织形成
通过检测藻酸盐小珠的一系列切片，详细了解在培养的形成骨阶段(第 15-29天)由被包裹的鼠胚胎干细胞在藻酸盐水凝胶中形成的三维矿化组 织的性质。图4a-h表明，如深茜素红S和von Kossa染色所示，三维矿化 组织早在第22天就已明显形成，并在藻酸盐小珠中进一步发展至第29天。 显然，样本含有高比例的矿化组织，其渗透到整个切片。在培养的第22天 和第29天之间观察到染色强度的变化。尤其是在骨形成中期(第22天)， 茜素红S染色的组织在颜色上为均一的红色(图4c-d)，但没有达到小鼠 骨阳性对照中所示的红/黑程度。此外，第22天的样本含有直径范围为1 00 到300μm的组织，其中矿化区域的宽度在50-100μm。相反，在骨形成阶段 的末期(第29天)，如苏木素/曙红染色所示，藻酸盐小珠含有更大的组织 聚集体(图4e-f)；最大的组织切片的尺寸大于500×500μm。如生存力 染色所证实，所形成的组织的某些区域表现出坏死，但是大部分都是存活 的(图2)。此外，所产生的组织趋向于占据小珠的中心，并且高度整齐， 具有柱形细胞的边缘(图4e)。最后，在第29天(图4g-h)，所形成的 矿化组织达到如阳性对照(图4a-b)中所示的红/黑茜素红S染色强度。
还通过免疫细胞化学通过评估骨特异性标记物OB-钙粘蛋白、I型胶 原和骨钙素的表达研究藻酸盐水凝胶中矿化组织的形成。在培养的第15、 22和29天检测标志成骨细胞(35)的OB-钙粘蛋白的表达(图4i-k)， 其在所形成的组织的大块区域中普遍分布。大部分的染色局限在组织的边 缘，在这里细胞组织成柱状形式。在OB-钙粘蛋白染色阳性的同一组织样 本的矿化切片外围检测到骨钙素染色(图4m)。最后，还检测到I型胶原， 虽然与小鼠骨阳性对照相比水平较低，并且仅在第29天可见(图4p)，这 可能是由于所使用的多克隆抗体的灵敏度较低。通过分析基因表达证实免 疫细胞化学结果。尤其是，RT-PCR证明(图5)在第15、22和29天小 珠中Cbfa-l和I型胶原表达。在第15、22和29天发现IIA型胶原(其为短 暂的胚胎形式(21))和骨钙素表达；在第29天小珠中骨钙素的表达显示 与阳性对照(MC-3T3-E1细胞)类似的强度。
通过微型-CT分析评估组织矿化。由置于维持培养基中的不含被包裹的 鼠胚胎干细胞的藻酸盐小珠组成的阴性对照的微型-CT图象产生具有非常 小反差的图像，这表明缺乏能够衰减X-射线的致密材料(图6)。相反， 在藻酸盐小珠中由鼠胚胎干细胞形成的矿化组织提供合适的反差。除致密 的骨聚集体外，在第15、22天(数据未显示)和第29天(图6)，通过微 型-CT还检测到藻酸盐小珠的表面“外壳”，其描画出藻酸盐小珠外周的轮 廓。小珠外壳含有低水平的致密材料(紫色)，小珠本身中的矿化骨聚集 体在它们的中心显示高水平的衰减(黄色)，并且随着与骨聚集体核心距 离的增加，衰减降低。对小鼠大腿骨的阳性对照成像以比较矿化的程度(图 6)。对随机选择的藻酸盐小珠进行完整的扫描从而提供藻酸盐小珠中矿化 组织区域的三维再现。在第15天，没有看见矿化组织聚集体，但是到第22 天，可以看见14个直径小于50μm的离散的小聚集体。但是在第29天， 大小范围从50到250μm的44±7(平均值±SE；n＝2)个矿化组织聚集体 (图6)已存在。如图4所示这些矿化聚集体被软组织包围，其在图6(红色 箭头)中可被微弱的识别为围绕矿化聚集体的较暗区域。
讨论
胚胎干细胞的培养被高维持费用所阻碍，这是其维持是分段的过程， 需要经专门训练的操作者，和取决于操作者的决定。现在，鼠胚胎干细胞 在组织培养塑料容器上以单层培养，其所处的微环境由于分批型培养、频 繁的使用者介入和培养区域的快速耗尽而有所变化。最近，其它研究者也 已经强调传统胚胎干细胞培养的问题，并且提供了完整的解决方法(36)。 在本报告中，我们证实了新的生物过程，藉此未分化的鼠胚胎干细胞在完 整过程中在藻酸盐小珠中形成三维矿化组织，其使用HARV生物反应器， 不需要介入和培养操作。
在鼠胚胎干细胞培养的维持阶段，维持多潜能性和细胞生存力是必需 的，其通过存在LIF实现(4)。因此，必须保证LIF渗透藻酸盐小珠，其 被认为是“半固体”，且钙分布和多糖单元的排列都不均匀。小珠中存在钙和 藻酸盐梯度，该梯度从表面外壳(最高浓度)向小珠中心(弱胶凝区域) 展开(37)。这些浓度梯度可以解释为什么集落似乎在离小珠外壳500μm 处生长。所制备的藻酸盐小珠可渗透分子量为68kDa的蛋白(38)，可以 允许例如LIF的扩散(39；40)。通过在氯化钙溶液中进行凝胶作用6到10分 钟，每批制备600个小珠。藻酸盐的凝胶作用是反应-扩散过程，其中钙 和藻酸盐越过组成恒定(constant constituting)的边界相互扩散以形成名为 Ca++-藻酸盐凝胶网络的稳定结构。有理由认为小珠上的表面外壳始终形成 (因为所有小珠保持完整)，因此与氯化钙溶液接触时间较短的小珠形成 钙-藻酸盐梯度的时间较少，在小珠的中心具有更大的弱凝胶的区域(37)。
在胚状体形成培养基中培养5天后，藻酸盐小珠中集落大小显著增加， 在一些情况下直径达到400μm，而生存力没有明显降低。集落均匀生长于 小珠内离散的“口袋”中，据报道这更有益于生长(37)。即使我们包裹了未 分化的鼠胚胎干细胞，并且使用传统的悬浮方法没有形成胚状体，但在培 养3-8天期间Flk-1抗原在培养物中的表达证明发育出了中胚层(23；41)。
在骨生成早期(第15天)OB-钙粘蛋白的表达表明在三维培养物中存 在成骨细胞(42)。这些成骨细胞在第15天是存活的(酯酶活性)而且具 有代谢活性(脱氢酶活性)。在培养期间代谢活性变化不定。在形成骨的 分化开始时(第8天)，每个小珠的代谢活性高，在第15天达到低点，其 与ALPase活性达到最高水平而矿化接近其最低水平相关。随着骨生成进展 (15到29天)，观察到(每个小珠的)ALPase活性降低，矿化增强，这 与成骨细胞分化和生长的其它模型中所显示的一致(43)。除其它功能外， 骨骼组织中ALPase活性被认为增加局部无机磷酸盐水平，破坏羟基磷灰石 晶体生长抑制剂和帮助磷酸盐转运(44)。骨生成后期可能是成骨细胞被 捕获到分泌的基质中，并显著降低其代谢活动从而将资源转向矿化的阶段。 在22和29天ALPase活性的降低，矿化的增长以及每个细胞的低代谢活性 表明该阶段细胞表型可能为成熟成骨细胞的表型。在骨生成结束时(第29 天)检测到骨钙素、OB-钙粘蛋白和I型胶原蛋白的事实进一步证实了这 一点。Shimko等人(45)诱导鼠胚胎干细胞朝骨分化而没有胚状体形成， 导致的矿化如他们自己所承认的不被认为是常规的骨生成。他们报导骨钙 素和I型胶原的产生都被延迟，且ALPase活性与正常骨生成不一致。相反， 我们的数据证明发生了常规的三维骨生成，表现为ALPase的水平降低和表 达骨特异性蛋白，OB-钙粘蛋白在早至第15天即表达。
在胚胎骨中骨钙素的表达是短暂的，但是它是成人骨中最丰富的蛋白 之一，并以钙依赖的方式与羟磷灰石结合(46；47)。交织(woven)的骨表现 为不规则的胶原纤维束，巨大和众多的骨细胞，以及以不规则分布的小片 出现的延迟、杂乱的钙化(48)。本研究中，在第22和29天骨钙素以环形和 在三维组织聚集体边缘存在，这与微型-CT结果一致。这些观察结果提示藻 酸盐小珠中矿化组织由磷灰石晶体的浓缩(骨发育)形成，并且可能位于 骨样前沿的前缘(成人板层骨)。我们的数据推知细胞大部分为具有增殖 能力的成骨细胞(49)，并且已经堆积羟磷灰石。一般认为多能祖细胞分化为 成熟的骨细胞依照增殖、细胞外基质形成和矿化的阶段进行，其伴有见于 成熟骨小结中的少量凋亡(50)。
RT-PCR分析进一步证实存在末期分化的矿化骨组织，其具有骨生成的 终点的明显表型，该表型为表达Cbfa-l，I型胶原和骨钙素的有丝分裂活跃 的成熟成骨细胞(49；51)。在鼠胚胎干细胞的形成骨的分化期间表达胚胎II 型胶原(剪接变体A)是正常的(21；52)，并且类似的，也曾报道骨钙素在形 成骨的分化的第7天至第21天表达(53)，相当于本研究中的第15天至 第29天。缺少任何成熟的II型胶原(剪接变体B)表达表明不存在成人软 骨，及骨组织主要由I型胶原组成。
将这一方法改编用于人胚胎干细胞很可能导致其临床应用。尤其，对 于手术操作，例如腰椎骨脱离，其需要松质骨移植物以修补3-4mm的松解 术(54)，含有来自10，000个胚胎干细胞的44±7(平均值±SE，n＝2) 个矿化聚集体的单个藻酸盐小珠(直径＝2.3mm)可以提供足够的材料用 于修补这一缺陷。此外，可能直接注射充满矿化组织的藻酸盐凝胶进入到 缺损区域中(55-57)。本方法提供了不同于传统胚胎干细胞培养的引人注目 的有益的可选方法，消除了提供大规模三维组织用于临床应用的瓶颈。总 之，我们提供了一种用于从未分化鼠胚胎干细胞产生三维矿化组织的简单、 集成的方法，其最小限度的依赖操作者的介入，提供可重复的结果，易于 扩大规模和在线监控。
实施例5：被包裹的细胞的低温保存
使用Stensvaag等人(2004)记载的方法(59)，在冷冻步骤前逐渐增加 DMSO浓度。将低温试管进一步过度冷却至-7.5d℃，然后成核。其后，样 本以0.25℃/分钟的速率冷却，然后储存在液氮中。使用共焦显微镜定量 (CLSM)技术和NITS分析评估被包裹的细胞的生存力。
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多潜能干细胞，如胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖干(EG)细胞以及多 能干细胞，如脐带干细胞和成人干细胞因其自我更新的能力和可塑性能力 而是被提议为用于组织工程的有力工具。多潜能干细胞，如胚胎干细胞， 能够在体外被诱导分化为中胚层、外胚层和内胚层细胞谱系的多能细胞。 中胚层谱系的细胞，如成骨细胞、软骨细胞和心肌细胞分别在形成骨的、 成软骨和成肌补充物的影响下产生。现在，多潜能干细胞，如胚胎干细胞 和多能细胞的医药用途受限于缺少关于组织样结构形成的知识和自发分化 为不同细胞谱系的倾向；甚至这种多谱系潜能可以表现为形成异位组织的 风险。对于临床应用，高纯度的均一细胞群体可能是必需的。
为有效的使用多潜能细胞进行临床治疗，首要的是提供足够数量的用 于相关临床应用的细胞。未分化的胚胎干细胞是产生关键分化细胞类型的 有希望的来源；但是对于许多未分化细胞群体，现有的培养方法或者不适 合扩增，或者不能提供有效产量的分化细胞。
现有的维持人胚胎干(hES)细胞的方法需要使用饲养层、饲养条件培 养基(feeder-conditioned media)或在培养基中供应人或动物细胞提取物以 扩增人胚胎干细胞和防止自发分化。如计划在随后将细胞用于人类治疗， 该方法是不适合的。人胚胎干细胞的临床应用需要在标准化的、受良好控 制的无动物产品的环境(因此被称为“无外源物(xeno-free)”的培养环境， 其降低传输疾病的风险)中培养细胞的方法。此外，需要在不存在饲养层 或支持细胞的情况下培养人胚胎干细胞的方法以降低饲养细胞或源自饲养 细胞的污染物污染人胚胎干细胞治疗产品的风险。理论上，生产足够数量 的人胚胎干细胞的方法应该是标准化的和可调控的。至今还没有这样的方 法，并且使用传统方法分离和维持人胚胎干细胞是非常需要技术的过程， 不适于临床应用(1)。因此需要开发改良的培养方法以用于扩增和在需要 时接着分化人胚胎干细胞。
转变未分化的鼠胚胎干细胞(mES)为更分化的细胞类型的方法是已知 的。但是，使用已有的二维平板或培养瓶(flask)培养方案，该过程是分 段的，涉及高维持费用，对样本具有破坏性并且结果非常易变。
传统上，在二维培养物中胚胎干细胞培养方案涉及三个截然不同的阶 段，首先胚胎干细胞维持(即自我更新，也称为扩增，以形成干细胞集落)， 然后是导致胚状体(EB)形成的初始分化，随后是进一步的谱系特异性分 化。每个阶段都需要熟练的操作和阶段特定的方案。
对于胚胎干细胞维持，最初是分离胚胎干细胞细胞，然后在饲养层上 进行共培养。随后发现可使用条件培养基替代饲养层(2；3)，并且对于鼠胚 胎干细胞，当以纯化形式供应LIF(由饲养细胞分泌的营养因子)时，其能 够维持多潜能性(4)。
通过监测Octamer结合因子3/4(表示为Oct-4)的表达评测胚胎干细 胞的多潜能。Oct-4是限于早期胚胎、生殖系细胞和未分化胚胎干细胞(胚 胎性癌)、胚胎生殖干细胞和胚胎干细胞的Pit-Oct-Unc(POU)家族转录调 控因子(5)。Oct-4在体内的表达是发展内细胞团(ICM)细胞的多潜能能 力所必需的(6)，在体外其被化学稳态地控制以维持多潜能性(7)。
在传统的分化方法中，经过形成胚状体(EB)的阶段，源自内细胞团 (ICM)的胚胎干细胞分化为各种细胞类型。胚状体的形成，即胚胎干细胞 的初始分化可以通过各种刺激启动，例如移除饲养细胞、消除与LIF的接 触(对于鼠胚胎干细胞)或消除与饲养条件培养基的接触。被开发用于胚 胎性癌(EC)细胞的胚状体(EB)悬浮方法(8)通过形成全部三个胚层： 中胚层、外胚层和内胚层导致形成多重分化结构，其类似于植入后的胚胎 组织(9)。在悬浮培养的2到4天中，在ICM表面形成外胚层，其形成称 为“简单胚状体”的结构。在分化的第4天左右，具有基底层的柱状上皮发育， 并且形成中央空腔。这些结构被称为“囊状胚状体(cystic EB)”，并且通过 在体外继续培养，出现内胚层和中胚层细胞(10)。
外胚层细胞是多能的，能够分化为神经组织、上皮和牙齿组织。内胚 层细胞是多能的，能够分化为胃肠道、呼吸道和内分泌腺。中胚层细胞是 多能的，能够分化为造血和骨骼谱系，后者包括形成心肌(cardiomyogenic)、 形成软骨(chondrogenic)和形成骨(osteogenic)的细胞。在中胚层，已知 形成心脏的分化是最初的和主要的分化过程。通常认为形成心脏的分化会 阻止和延迟其它分化过程，例如形成软骨和形成骨的分化。
通过在二维培养物中功能性成骨细胞的分化已经实现了形成骨的分 化，即在体外形成矿化的小结，其显示体内形成的交织的骨的形态上、超 微结构上和生化上的特征。然而，在培养瓶和有孔平板中进行的二维培养 只能使少量细胞分化到能够使它们的细胞外基质组织成与骨类似的结构的 程度(11-13)。此外，二维培养是分段的，劳动密集的并且在所包括的不 同培养步骤期间需要操作者的“判断”。
通过在培养物中分化有功能的软骨细胞已经实现了成软骨分化，即在 体外形成软骨小结，其显示体内形成的软骨细胞的形态、超微结构和生化 特征。现在，已经进行了很多诱导胚胎干细胞体外分化为软骨生成谱系的 尝试。据报道通过在胚状体(EB)分化期间加入各种成软骨补充物，如BMP-2 和BMP-4(Kramer等人，(2000).Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro：activation by BMP-2 and BMP-4 Mech.Dev.92， 193-205)、TGF-b3(Kawaguchi等人.，(2005).Osteogenic and chondrogenic differentiation of embryonic stem cells in response to specific growth factors Bone 36，758-769.)、地塞米松(Tanaka等人，(2004).Chondrogenic differentiation of murine embryonic stem cells：effects of culture conditions and dexamethasone J.Cell Biochem.93，454-462.)可诱导胚胎干细胞的成软骨分 化。作为其它的途径，据报道通过供应IGF-I，TGF-b3，BMP-4和PDGF在源 自FACS分选的中胚层先祖细胞的胚状体培养物中获得肉眼可见的软骨形 成(Nakayama等人，(2003).Macroscopic cartilage formation with embryonic stem-cell-derived mesodermal progenitor cells J.Cell Sci.116，2015-2028.)。然 而，尽管对于胚胎干细胞的成软骨分化已有大量成功的方法，但是已建立 的这些方法需要形成胚状体。从胚胎干细胞形成软骨已经在二维培养系统 中实现。为将胚胎干细胞用于软骨组织工程，必须开发明确的和有效的方 案，用于指导在集成和不涉及操作者决定的三维培养系统中体外分化为软 骨生成谱系。
静置培养，如传统用于胚胎干细胞维持、培养和分化的二维方法，具 有几个限制，例如缺少混合、缺乏控制选项和需要频繁的喂饲。在二维培 养细胞的试验中，与细胞外基质和其它细胞的正常三维关系被扭曲，其导 致反常的细胞行为并因此产生错误的结论。搅拌的悬浮培养系统具有可量 测性和相对简单这些吸引人的优点，这会影响特定阶段和类型的干细胞的 生存力和利用率(14)。然而，在悬浮细胞的搅动培养中，由于搅动所产 生的动荡和剪切力将导致细胞损伤。现正在开发使用生物反应器培养细胞 的方法，以提供具有受控培养条件的动态培养系统，其能够在三维环境中 扩增细胞。分析更天然的三维设定中的细胞相互作用可提供更接近活体内 条件的条件(15；16)。将生物反应器用于人胚胎干细胞培养已有记载，并且 已提供了一些初步的证据表明动态、三维的条件将为培养胚胎干细胞形成 胚状体提供合适的环境(17)。
Chang等人(18)在二十世纪六十年代开创了生物包裹法，Lim等人(19) 最终包裹异种移植物胰岛细胞用于移植到大鼠中以改善糖尿病。藻酸盐包 裹的应用主要限于成体细胞。Magyar等人(20)将鼠胚胎干细胞包裹在1.1％ 藻酸盐微型小珠中，然后在组织培养平板上二维培养，即静置培养。这导 致形成“盘状”群体，其进一步在小珠中分化以产生囊状胚状体，随后形成含 有自发搏动区域的胚状体。当Magyar等人将胚胎干细胞包裹于1.6％藻酸盐 微型小珠中并三维培养时，发现在桑椹胚样阶段分化被抑制，因此小珠中 没有形成囊状胚状体；虽然当将胚胎干细胞集落从小珠中释放出来并二维 培养时，它们能够进一步分化为具有搏动的心肌细胞的囊状胚状体。已有 人尝试将鼠胚胎干细胞包裹于藻酸盐小珠中以从鼠胚胎干细胞产生胚状 体，但是未能产生足够的成软骨分化(21)。已将包裹在藻酸盐小珠中的 间充质干细胞(MSC)三维培养，其中细胞小珠被置于静置培养瓶培养物 中并用生长培养基覆盖从而实现产生透明软骨的成软骨分化，虽然发现在 藻酸盐培养物中充质干细胞的增殖能力被抑制(22)。已经证明了三维培 养中的成软骨分化，其使用接种在藻酸盐或琼脂糖水凝胶中和在多孔明胶 支架(Surgifoam)中的人脂肪来源的成体干(hADAS)细胞(32)。
从干细胞大规模生产分化细胞需要整合胚胎干细胞培养中的各个步 骤。现有的从多潜能细胞，如胚胎干细胞形成分化细胞的方法是分段的， 劳动密集的并且需要高水平的训练，其不可避免的会引入操作者与操作者 之间的差异；而且，这些方法在二维培养物中进行，其没有模拟体内存在 的三维环境。这不符合临床应用的要求，因为现有的维持培养和分化的方 法不能产生临床相关的细胞数量。
因此，需要改良干细胞培养的方法以扩增和集成扩增和分化干细胞， 如胚胎干细胞。该方法对于未分化多潜能细胞有效的维持生长和分化以及 对外胚层、中胚层和内胚层谱系部分分化的多能细胞的进一步分化是必须 的。对于临床的骨组织工程应用，需要能够形成“骨小结(bone nodules)” (骨样组织)或其它组织类型的方法。根据本发明，这能够在三维培养中 实现，其中使用包裹在支持基质中的单个或多个细胞。
单个细胞或克隆的培养，以及单个克隆随后的扩增和分化被称为“克隆 形成能力”。已知当来源于无性繁殖的胚胎干细胞被移植到小鼠中时其在体 内分化，但是到目前为止，在体外培养单个未分化胚胎干细胞的尝试都被 证明是不成功的(23；24)。在这些已报道的研究中，二维培养单个细胞，该 细胞没有最终分化为成熟细胞。
现在，没有可用于筛选细胞培养环境对单个多潜能或多能细胞的影响 的方法。因此需要识别细胞培养条件、培养基和试验化合物(例如合成的 化学个体或天然来源的材料，如条件培养基、生长因子)对个体细胞的影 响的方法。此外，同时进行大量这种筛选实验的能力使得能够进行大量工 艺参数(化学制品、浓度、组合)的大量筛选。
发明详述
本发明提供细胞培养的方法，其包括：
(a)提供包裹(encapsulate)在支持基质中的人胚胎干(ES)细胞以形 成支持基质结构，和，
(b)通过在维持培养基中维持位于三维(3D)培养物中的被包裹的细胞 来维持培养。
在本发明的培养方法中，所提供的胚胎干细胞可以是包裹在支持基质 结构中的多个个体细胞和/或细胞聚集体，或者是包裹在支持基质结构中用 于无性扩增的单个细胞。
用于维持细胞生长以增加支持基质结构中细胞数量(即扩增，其中细 胞通过细胞分裂进行自我更新)的维持培养基的选择取决于所使用细胞的 类型以及它们对生长的需求。任何支持细胞生长，且理想的是具有最小的 或没有细胞分化的培养基都适合在本发明的方法中用作维持培养基。本领 域已知多种合适的维持培养基。
在优选的实施方式中，维持培养不包括在维持培养基中使用饲养细胞、 条件培养基或者人或动物的细胞提取物，因此维持培养是在不存在饲养细 胞和不存在饲养细胞条件培养基的情况下进行的。
现有的培养人胚胎干细胞的方法需要使用饲养细胞以支持未分化状态 的人胚胎干细胞的维持或者使用条件培养基(1)。另外，在现有的方法中， 细胞需要经常传代以除去自发分化的人胚胎干细胞。此外，如果将所产生 的人胚胎干细胞用于临床治疗，培养条件可能需要源自动物的产品，而这 样的产品有传输疾病的风险。研究者正致力于开发适于大规模生产的维持 和扩增人胚胎干细胞的方法以为临床应用提供足够数量的人胚胎干细胞或 其分化衍生物。本发明人开发了令人惊奇的简单方法，其显示复制了胚胎 植入前的早期胚胎的物理环境，并且能够长时间培养未分化状态的被包裹 的人胚胎干细胞，而不需要传代。令人惊奇的是，发明人发现通过使用本 发明的方法人胚胎干细胞可以在不存在饲养细胞的情况下于非条件培养基 中在多至130天的时间内维持未分化。发明人假设在本发明方法中包裹人 胚胎干细胞的支持基质所提供的物理环境消除了对饲养细胞支持或使用条 件培养基的需求。本发明的方法适于为治疗应用标准化、调控和扩大人胚 胎干细胞的生产。
适合人胚胎干细胞的维持培养基包括补充有20％v/v KNOCKOUTTM SR，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自Gibco Invitrogen， Life Technologies，Paisley，UK)，0.1mM 2-巯基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich， Dorset，UK)和4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGF-2) (157个氨基酸)(R&D Systems，Oxon，UK)的DMEM/F12培养基。补充有4 ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF)的VitroHESTM(Vitrolife AB，Kungsbacka，Sweden，http://www.vitrolife.com)也是适合培养人胚胎干细 胞的培养基，这两种培养基通常都与饲养细胞共同使用，但是在本发明的 细胞被包裹的培养方法中，可以在不伴随使用饲养层的情况下使用这些培 养基。可以用条件培养基和另加的生长因子进行未包裹的人胚胎干细胞的 无饲养层培养。然而，Xu等人(2005)(25)已经显示含有KNOCKOUTTM SR 的非条件培养基(unconditioned media)能够激活未包裹的人胚胎干细胞中 的BMP信号传导活性，其程度超过MEF条件培养基，因此现在无法获得 成分明确的用于未包裹的人胚胎干细胞的无饲养层的维持培养基。
使用特异细胞信号分子在无饲养层环境中维持未包裹的人胚胎干细胞 仅能够实现相对短的时间(Sato等人(2004)Nat.Med.，10，55-63)。令人惊奇 的是，在本发明的方法中，将人胚胎干细胞维持于未分化状态不需要特异 信号分子。然而，当该研究继续识别改善未分化状态的人胚胎干细胞的维 持和扩增的分子时，能够在本发明的方法中使用这些分子以进一步增强包 裹的人胚胎干细胞培养的体外环境。
在本发明的方法中，包裹的胚胎干细胞能够在非条件培养基中生长。 在(1)中综述了现在用于维持未包裹人胚胎干细胞的各种培养基和生长因 子组合的详情。这些培养基可以被用于或被改进以用于本发明的方法中， 其中没有饲养细胞且不需要培养基被条件化。
在优选的方面，本发明提供细胞培养的方法，其包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)通过在适合细胞维持的条件下在维持培养基中维持位于三维培养 物中的被包裹细胞而维持培养，
(c)在适合细胞分化的条件下在分化培养基中分化在三维培养物中的 被包裹的细胞。
用于分化多潜能人胚胎干细胞的分化培养基的选择取决于使用的细胞 类型、它们对生长的需求和分化所需的刺激因素。任何支持分化的培养基 都适合用作本发明方法中的分化培养基。实际上，分化培养基在成分上可 以与维持培养基类似，但是分化培养基不含有维持培养基中所含的用于抑 制分化的一种或多种物质。适合人胚胎干细胞的分化培养基包括培养基 [Alpha-Modified Eagles Medium(αMEM)，10％(v/v)胎牛血清，100单位/mL 青霉素和100μg/mL链霉素]。通过向维持培养基中加入分化的刺激因素， 例如生长因子可以产生分化培养基。
适合在三维培养物中的被包裹的多潜能干细胞或被包裹的多能干细胞 维持和/或分化的条件包括对于所用细胞类型的标准培养条件，例如，对于 胚胎干细胞培养，合适的条件包括使用胚胎干细胞维持和/或分化培养基和 例如37℃和5％CO2的环境条件。
使用本发明的维持(扩增)和/或分化方法，集落或组织的形成是在三 维培养中进行的，其可以是静态的，例如在组织培养皿中或者在悬浮液中， 例如在烧瓶或生物反应器中。在三维培养中可以形成有组织的结构和更大 量的细胞，因为其条件更接近于符合体内情况中的物理环境。在三维培养 物中细胞三维生长。
通过使用低剪切、高混合的“动态”环境可以实现适合用于进行本发明细 胞培养方法的三维悬浮培养条件。这使得足够的营养物和气体能够渗入到 所使用的支持基质结构中。为三维培养提供低剪切、高混合的动态环境的 合适的生物反应器包括NASA HARV生物反应器(Synthecon，USA)、 European Space Agency生物反应器(Fokker，Netherlands)、RWV生物反应 器(Synthecon，USA)或其它模拟微重力或灌注系统，例如气升式生物反应器。 对于涉及形成骨的分化的方法，NASA HARV生物反应器是合适的。
合适的维持和培养方法被作为集成(integrated)的方法进行，其中在 单个，即同一个容器中连续进行维持和分化步骤。维持和分化方法的集成 方法在烧瓶或生物反应器中的悬浮培养物中适当进行。在维持生长阶段， 一个或多个被包裹的多潜能胚胎干细胞分裂，细胞数量增加，因此在支持 基质结构中形成细胞集落，随后被包裹的细胞分化形成进一步分化的或终 末分化的细胞，所有这些都在三维基质结构中。本发明的方法中，接着可 以维持进一步分化的或终末分化的细胞，其使得细胞分裂从而增加细胞数 量和在支持基质结构中形成细胞集落。
使用完全集成的方法使得能够进行从未分化细胞的扩增到通过由增加 或减少培养基中的关键信号分子触发的定时的和受控制的分化的连续改 变。使用本发明方法导致的对细胞操作的需求降低限制了细胞与可能影响 细胞生存力的潜在污染物和环境的接触。此外，以实时方式监控细胞培养 条件使得能够建立临床产品所需的标准。
在维持生长中，一些细胞在几个循环的细胞分裂后出现自发分化，特 别是在条件没有抑制分化的时候。适合细胞分化的条件可以包括使多潜能 胚胎干细胞分化为多能细胞的刺激因素。胚胎干细胞分化为多能细胞的刺 激因素可以是胚状体形成的刺激因素，例如消除或减少与抑制分化的物质 的接触；和/或添加或增加与促进胚状体形成的物质的接触。适合细胞分化 的条件包括使多能细胞进一步分化的刺激因素；例如，其能够在胚胎干细 胞分化的刺激因素之前、同时或之后被提供。本发明的涉及分化的方法可 以在没有提供胚状体形成的刺激因素的情况下进行，相反适合分化的条件 简单的包括分化为，例如外胚层、内胚层或中胚层细胞系的刺激因素。
分化的刺激因素可以是分化为外胚层、内胚层或中胚层谱系的刺激因 素。如下所列，合适的刺激因素是本领域已知的，并且在例如参考文献(1) 中被论述。
优选的，分化的刺激因素是分化为中胚层骨骼谱系细胞的刺激因素， 例如形成骨的或形成软骨的分化的刺激因素。
形成骨的分化的刺激因素可以是向培养基中提供的补充物，例如抗坏 血酸、β-磷酸甘油或地塞米松中的一种或多种。
成软骨分化的刺激因素可以是向培养基中提供的补充物，例如一硫代 甘油(MTG)和IGF-1，TGFβ1，BMP 2或BMP 4。
维持和分化步骤持续的时间取决于所培养的细胞类型以及细胞培养的 目的。发明人已经证明通过使用本发明的方法，被包裹的人胚胎干细胞可 以在没有常规用于维持多潜能的饲养细胞或条件培养基的情况下在未分化 情况下维持130天。在维持培养中，可能期望在需要时培养被包裹的人胚 胎干细胞多至130天或更长时间以提供增加数量的未分化细胞。因此，本 发明提供能够用于长期维持培养被包裹的人胚胎干细胞的方法，例如超过8 天，如约14，21，28，35，42，49，56天，多至130天和更多。
在集成的维持和分化方法中，步骤(b)中被包裹细胞的初始维持培养 应该达到足够长的时间以形成细胞簇，例如1到6天，优选2到5天，最 优选3或4天。分化培养可以多至40天。本发明的一些培养方法包括在存 在胚状体形成刺激因素的情况下的初始分化时期，随后是在存在将多能细 胞分化为更加分化的细胞谱系，如成骨细胞或软骨细胞的刺激因素的情况 下的进一步分化时期。合适地，初始分化时期为3到7天，优选4到6天， 最优选约5天。当进行进一步的分化时，进一步分化时期通常为14到28 天，合适的约20到22天，如21天。
对于根据本发明方法的被包裹的胚胎干细胞的形成骨的分化，初始维 持时期一般为2到4天，如3天；初始分化时期通常为4到6天，如5天； 进一步分化时期为14到28天，如20，21或22天；这些培养时间通常适于 实现骨诱导和三维骨形成。
使用包括分化阶段的本发明的方法，被包裹的多能细胞能够分化为更 加分化的细胞，例如终末分化的细胞。为将多能细胞分化为更加分化或终 末分化的细胞适宜使用细胞分化条件实现，所述条件包括多能细胞进一步 分化的刺激因素。
本发明的方法还被用于在体外维持和/或分化被包裹在支持基质中的单 个细胞，从而例如提供均一集落或组织。因此，在本发明的一些实施方式 中，在步骤(a)中支持基质结构为单个胚胎干细胞被包裹在支持基质中以 形成支持基质结构。
可以将胚胎干细胞包裹在支持基质中，以提供含有单个细胞的支持基 质结构，例如小珠。随后，被包裹的单个细胞可以生长为细胞集落，可选 的形成胚状体结构，最终，部分分化的细胞可以分化为预期的细胞谱系。 这对于获得源自无性繁殖的细胞群体是有用的，这些细胞群体对于为临床 应用提供纯均一细胞群体是有用的。而且，这对于筛选目的是有用的，因 为它使得能够检测三维胚状体的形成、胚胎干细胞的细胞分裂，或者研究 微环境对单个多潜能细胞的影响。还可以研究单个胚胎干细胞向分化的成 熟细胞类型的分化，从而证明胚胎干细胞在体外的多潜能性潜力。
可选的，在步骤(a)中将多个细胞包裹于支持基质结构中。这些可以 以多个单独的细胞或细胞聚集体(即块/集落)或其混合物存在。这些方面 对于为诸如组织工程应用、研究或临床应用产生大量分化细胞特别有用， 但是也能够用于筛选目的。
通常，在本发明的细胞培养方法中，在步骤(a)中提供多个支持基质 结构。
本发明提供用于胚胎干细胞维持、可选的胚状体形成和分化的集成的 三维培养方法。源自胚胎干细胞的中胚层细胞能够分别在形成心肌的、形 成软骨的或形成骨的刺激因素的影响下分化为形成心肌的、形成软骨的或 形成骨的细胞。
使用本发明的方法，已在三维培养中实现形成骨的分化，导致形成“骨 小结(骨样组织)”，或者在三维培养中能够实现用于临床骨组织工程应用 的其它组织类型。本发明的方法可以为培养系统的自动化进行调整，从而 提供低维持费用、高效的系统用于产生分化细胞。例如，这些方法可以被 用于从鼠胚胎干细胞或hES(人胚胎干)细胞生产形成心肌的、形成软骨的 或形成骨的细胞。
因此，在可选的实施方式中，本发明的培养方法对于胚胎干细胞的形 成骨的分化特别有效，特别优选的细胞培养方法包括：
(a)提供包裹在支持基质中的单个胚胎干细胞或多个胚胎干细胞以形 成支持基质结构，
(b)在适合胚胎干细胞维持的条件下，在维持培养基中维持位于三维培 养物中的一个或多个被包裹的细胞，
(c)在适合形成骨的分化的条件下通过在分化培养基中分化位于三维 培养物中的被包裹的细胞进行形成骨的分化。
胚胎干细胞优选鼠或人胚胎干细胞，但是本发明的形成骨的分化方法 适用于人、非人灵长类、马、犬、牛、猪、山羊、绵羊、鱼、啮齿动物、 鼠或鸟来源的胚胎干细胞。
优选的支持基质包含藻酸盐，特别优选含有藻酸盐和明胶的那些支持 基质。优选支持基质结构为小珠形式。本方法可以在静置的悬浮培养物中 进行，但是优选在例如由生物反应器，如NASA HARV生物反应器所提供 的低剪切、高混合的动态环境中进行。
如上述其它培养基一样，通常用于二维培养胚胎干细胞的维持培养基 适合在本方法中使用。合适的条件为37℃，5％CO2。维持培养进行1到6 天，优选2到4天，更优选约3天。
被包裹的细胞的形成骨的分化是通过下列进行的：
(i)在分化培养基中培养位于三维培养物中的被包裹的胚胎干细胞并 提供胚状体形成的刺激因素，然后，
(ii)在分化培养基中培养(i)中产生的被包裹的细胞并提供形成骨的 分化的刺激因素。
例如，分化培养基可以是通常在二维培养中用于胚胎干细胞形成骨的 分化的任何培养基。在适合胚状体形成和随后形成骨的分化的条件中使用 的分化培养基可以是不同的。对于鼠细胞，胚状体形成的刺激因素可以是 消除与LIF的接触，或者当以共培养形式进行维持阶段时，消除与分泌LIF 的细胞的接触。
为进行形成骨的分化以形成骨小结，步骤(i)中的温育一般进行约1 到6天，优选约2到5天，最优选约3到4天，步骤(ii)中的温育一般进 行21到28天，优选20到22天，例如21天。
在本发明的分化方法中，形成胚状体的步骤不总是必需的，因此，在 一些实施方式中省略了与胚状体形成的刺激因素接触，在这方面被包裹的 细胞的形成骨的分化适当地是通过下列进行的：
(i)在分化培养基中温育在三维培养物中的被包裹的胚胎干细胞，然后，
(ii)在分化培养基中温育(i)中产生的被包裹的细胞并提供形成骨的 分化的刺激因素。
合适的，在步骤(i)中胚胎干细胞与分化培养基接触约1到6天，优 选约2到5天，最优选约3或4天，并且在步骤(ii)中提供形成骨的分化 的刺激因素之后，培养一般进行21到28天，优选20到22天，例如21天。
可选的，可以通过在分化培养基中培养被包裹的细胞并提供形成骨的 分化的刺激因素进行被包裹的细胞的形成骨的分化。
在此情况中，细胞可以在存在形成骨的分化的刺激因素的情况下于分 化培养基中培养21到28天。
可以使用已知的形成骨的分化的体外诱导物，优选在步骤(ii)中以进 一步分化多能细胞。简要的，血清、抗坏血酸盐(抗坏血酸)、或L-抗坏血 酸-2-磷酸盐(长效抗坏血酸类似物)，β-磷酸甘油和地塞米松中的每一种已 知作为形成骨的分化的体外诱导物起作用。在现有技术中，血清、抗坏血 酸盐和地塞米松是小结形成所绝对需要的，而β-磷酸甘油促进或增强矿化 (26)。唯一特异于成骨细胞的形态学特征以矿化的细胞外基质的形式位于细 胞外。在体外骨节的形成被细分为三个阶段：(i)增殖，(ii)ECM分泌/ 成熟和(iii)矿化(mineralisation)。
本发明的方法可以以工业化规模进行以生产特异的分化细胞类型。例 如，从包裹在藻酸盐或基于藻酸盐的小珠中的胚胎干细胞和在生物反应器 中进行培养开始，可以实现骨形成。这个自动、集成的过程是有效的、易 于控制的并且与现有技术中的二维方法和三维方法相比明显减少了形成骨 组织所耗费的时间。
将一个或多个胚胎干细胞包裹在支持基质中，例如以形成小珠，导致 产生有益于胚胎干细胞维持、分化，可选通过胚状体形成，和进一步分化， 例如形成骨的分化的环境。本发明的方法使该过程自动化、可控制、最优 化和强化，从而能够生产临床应用所需的临床相关数量的细胞，例如形成 骨的细胞。
本发明的形成骨的方法适用于任何来源的多潜能细胞，例如人、非人 灵长类、马、犬、牛、猪、山羊、绵羊、鱼、啮齿动物、鼠或鸟来源的多 潜能细胞。
通过对本发明的维持人胚胎干细胞的方法进行调整可提供筛选方法以 评估细胞环境(培养条件、培养基、试验刺激因素、化合物)对维持生长 和/或分化的影响。因此，本发明提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞在 评估试验化合物或刺激因素对细胞维持和/或分化的影响中的用途。本发明 还进一步提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞在评估培养基和/或条件对 细胞维持和/或分化的影响中的应用。
还提供识别能够调控人胚胎干细胞维持和/或分化的化合物的方法，其 包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)在存在试验化合物的情况下在维持培养基中培养被包裹的人胚胎 干细胞，
(c)评估试验化合物对人胚胎干细胞维持和/或分化的影响。
使用本发明的筛选方法有可能识别通过抑制多潜能或多能细胞分化促 进细胞维持的化合物，和识别促进分化的化合物。试验化合物或化合物的 混合物可以是天然产生的或化学合成的。
此外提供识别能够调控人胚胎干细胞分化的刺激因素的方法，其包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)在存在试验刺激因素的情况下在适于细胞维持和/或分化的培养基 和条件中温育被包裹的人胚胎干细胞，
(c)评估试验刺激因素对人胚胎干细胞分化的影响。
使用本发明的方法能够识别抑制或促进分化的刺激因素，例如化合物 和/或条件。
另一方面，本发明提供评估培养基和/或条件对人胚胎干细胞维持和/或 分化的影响的方法，其包括：
(a)提供包裹在支持基质中的人胚胎干细胞以形成支持基质结构，
(b)在存在试验培养基和/或试验化合物的情况下温育被包裹的人胚胎 干细胞，
(c)评估试验培养基和/或试验条件对人胚胎干细胞维持和/或分化的影 响。
本方法可用于优化培养条件以增强细胞维持、抑制分化或促进分化。 在本评估方法中，可选地在存在试验化合物/刺激因素的情况下温育细胞， 并评估试验化合物/刺激因素对细胞维持/分化的影响。
进行筛选方法以在步骤(a)中在每个支持基质结构中包裹多个细胞， 或者在步骤(a)中在每个支持基质结构中包裹单个细胞。
在本发明优选的筛选方法中，例如以小珠的形式使用被包裹的单个细 胞，其中每个小珠含有单个细胞，例如胚胎干细胞。通过分开培养含有单 个细胞的小珠，合适地在多孔的平板(其可以是阵列形式，例如多孔平板， 如96孔平板)或微型生物反应器中。可以同时进行多重筛选以评估和优化 培养基和条件，以及筛选化学合成的化合物、多种生长因子、细胞外基质 蛋白等对细胞生长和分化的影响。
可以设定筛选方法，使得在一组培养容器中提供被包裹的细胞，例如 作为多孔或多室阵列。优选在步骤(a)中，每个培养容器中存在多个被包 裹的细胞，这可以通过提供含有多个细胞的单个支持基质结构，如小珠实 现，或者更优选的通过在步骤(a)中在每个培养容器中提供大量支持基质 结构实现。在这第二个途径中，每个支持基质结构，如小珠可以含有单个 细胞或多个细胞。在可选的筛选方法中，每个培养容器中存在一个被包裹 的细胞。
使用本发明所述的方法可以在受控制的环境中快速培养单个的人胚胎 干细胞。这使得能够并行的高通量筛选许多不同的培养环境，或在相同的 培养环境中并行的高通量筛选许多不同的细胞类型。适宜地在单个培养容 器，如多孔板的孔中加入5到20个小珠，每个小珠含有单个人胚胎干细胞。 因为小珠中的单个细胞不会直接与附近小珠中包裹的单个细胞接触，所以 每个小珠构成单独的生长环境。在单个孔中放置多个小珠能够进行时间研 究分析，因为每个小珠将面临相同的条件。在多孔平板中培养使得能够对 多种条件进行筛选，并且便于结果的统计分析。使用机器人技术推进该过 程的自动化，例如通过喂饲培养物。小珠中单个细胞的包裹确保了在饲喂 或其它操作期间单个培养物不会被打扰。
本发明的筛选方法可以在培养容器中的二维培养物(静态或悬浮液) 中进行，或者在生物反应器，如HARV生物反应器中的三维培养物中进行。 使用具有微通道的微型生物反应器能够对三维培养物进行恒定的灌注的饲 喂，从而便于进行更加精细的筛选试验和自动化。本发明的筛选方法可以 以高通量的形式进行。
对于本发明的筛选用途和方法，试验化合物、试验刺激因素、培养基 和/或条件对细胞维持和/或分化的影响可以通过选自下组的一种或多种方 法进行评估：显微镜检查、一种或多种阶段特异性抗原的检测、基因表达 水平的检测，例如通过RT-PCR或使用DNA或RNA微阵列。
用于包裹的支持基质具有渗透性，能够容许营养物、代谢物和生长因 子的扩增和质量传递。一个或多个包裹在支持基质中的细胞可以以小珠， 如一般的球形小珠的形式提供。“包裹”表示一个或多个细胞被完全包埋在支 持基质中。小珠的形状不是特别相关，只要其尺寸，如表面积与体积的比 例使得营养物、代谢物、细胞因子等能够容易的扩散进入/出小珠，达到包 埋在小珠中的一个或多个细胞。
特别优选支持基质结构，如小珠由在培养期间保持完整的支持基质材 料构成，其中培养时间可以是3到4个月或更长时间以用于维持；或者如 同在形成骨的分化培养方法的实例中那样多至30到40天。将一个或多个 包裹在支持基质中的细胞置于三维培养容器，如RWV生物反应器(Synthesis， USA)或其它模拟微重力或灌注的(perfused)生物反应器中，然后在没有 明显损伤的情况下在维持和/或分化培养基中长期培养。
优选支持基质材料由水凝胶材料组成或包含水凝胶材料，例如形成凝 胶的多糖，如琼脂糖或藻酸盐(通常为约0.5到约2％w/v的范围，优选为 约0.8到约1.5％w/v，更优选约0.9到1.2％v/v)。基质可以单独由藻酸 盐组成，或可以包含更多的成分，如明胶(通常为约0.05到约1％w/v，优 选为约0.08到约0.5％v/v)。包含明胶可以帮助获得相同的小珠大小，和 帮助维持结构完整。这是重要的，因为藻酸盐水凝胶会在长期培养后失去 Ca2+阳离子，这将削弱小珠的结构完整性。藻酸盐支持基质小珠中包含明胶 使得能够进行细胞介导的收缩和支架材料的包装。
藻酸盐是从褐海藻中提取的水溶性线性多糖，其由交替单元的1-4连 接的α-L-葡萄糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸残基组成。藻酸盐可和大部分二价 和多价阳离子形成凝胶，但Ca2+是最常用的。钙阳离子参与G-块(G- blocks)之间的链间结合，形成凝胶形式的三维网络。G-块之间的结合区 通常表示为“蛋-盒模型(egg-box model)”(27)。
我们发现藻酸盐和基于藻酸盐的支持基质，合适的是以小珠的形式(如 藻酸盐加明胶小珠)，特别适合在本发明的方法中使用，因为它们在所用 的培养条件中保持其完整性。
可以用各种信号(如层粘连蛋白、胶原或生长因子)改良支持基质以 提高所需的细胞性能。因此，支持基质可以包含一种或多种选自下组的材 料：层粘连蛋白，BioglassTM，羟基磷灰石，细胞外基质，细胞外基质蛋白，生 长因子；来自其它细胞培养物的提取物，以及对于形成骨的分化而言，来自 成骨细胞培养物的提取物。
在二维培养中细胞外基质(ECM)已被用作刺激因素以实现胚胎干细 胞的形成骨的分化(Hausemann & Pauken，2003，Differentiation of embryonic stem cells to osteoblasts on extracellular matrix，10th Annual Undergraduate research Poster Symposium，Arizona State University： http://lifesciences.asu.edu/ubep2003/participants/hausmann)。本领域已知大量 能够刺激多潜能干细胞，如胚胎干细胞分化的生长因子，例如骨形态发生 蛋白4(BMP4)，其增强中胚层形成和骨形成，Nakayama等人.(2003)J Cell Sci 116(10)：2015.(http://jcs.biologists.org/cgi/reprint/116/10/2015)；视黄酸， 其刺激中胚层形成，hedgehog蛋白，例如sonic hedgehog，其刺激中胚层向 骨祖细胞分化以及骨形态发生蛋白BMP 1-3和5-9，其刺激骨诱导。
藻酸钙或基于藻酸钙的支持基质有利于形成骨的培养和分化。钙离子 在小珠的形成中被用作螯合剂，可以提供钙的本地来源以对形成骨的矿化 提供帮助。
在单个细胞被包裹以形成每个小珠具有单个细胞的小珠，然后培养形 成集落的方法中，特别优选使用含有明胶的藻酸盐作为用于包裹的支持基 质材料，以形成支持基质结构，例如形成小珠。
合适的，含有单个细胞的小珠的直径为大约20到150微米，优选约40 到约100微米。含有多个细胞的小珠的直径通常为约2.0到约2.5毫米，优 选约2.3毫米。
在发明的一些方面，优选所用的支持基质易于被溶解以释放细胞，不 需使用胰蛋白酶处理。在希望除去支持基质以释放细胞时，水凝胶基质， 例如藻酸盐和基于藻酸盐的基质是有利的，因为通过使用柠檬酸钠和氯化 钠溶液很容易将它们溶解。
可以将一个或多个细胞包裹在生物相容性材料中，从而使获得的被包 裹的细胞(如形成骨的细胞)能够直接施用给受试患者，而不需要从包裹 材料中收获细胞。为了这个目的，使用藻酸盐或基于藻酸盐的支持基质包 裹细胞是有利的，因为藻酸盐材料是生物相容性的，并且藻酸盐是FDA批 准的。被包裹的细胞，特别是包裹在藻酸盐或基于藻酸盐的材料中那些， 可以通过例如注射或内窥镜检查法直接施用给患者。
本发明的方法或用途可进一步包括冰冻被包裹的细胞用于储存。被包 裹的细胞可以使用标准方案进行冰冻，并且可以在其培养用的维持或分化 培养基中冰冻。适合用于冰冻被包裹的细胞的方法包括使用Stensvaag等人. (2004)Cell Transplantation 13(1)：35-44所述的缓慢冰冻程序在二甲基亚砜 (DMSO)中低温贮藏。
本发明的方法进一步包括从支持基质中释放一个或多个细胞。本发明 因此提供如此获得的一个或多个细胞。当使用藻酸盐或基于藻酸盐的基质 进行包裹时，可通过藻酸盐溶解实现细胞的释放。与会影响长期培养物中 细胞性能的标准酶促方法，如胰蛋白酶处理相比，这种温和的溶解方法更 具优势。
本发明还提供可以通过或通过本发明的细胞培养方法获得的一个或多 个被包裹的细胞；该被包裹的细胞可以是多能的，如形成骨的、形成软骨 的或形成心肌的细胞，或者是终末分化的，如成熟的成骨细胞或软骨细胞。
进一步提供本发明的被包裹的细胞作为药物的用途。通过本发明方法 获得的被包裹的形成骨的细胞在骨重建(bone reconstruction)，例如在治疗 性颌面外科(maxifacial surgery)或在整容外科(cosmetic surgery)中是有 用的。本发明还提供被包裹的形成骨的细胞作为治疗选自下组的疾病或病 症的药物的用途：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、成骨不全 (osteogenesis imperfecta)、Paget′s病、纤维性结构不良(fibrous dysplasia)、 与听力丧失有关的骨疾病、低磷酸酯酶症、骨髓瘤骨病、骨硬化症、骨过 度使用损伤(over-use injury to bone)、骨的运动损伤、牙周(齿龈)疾病。
进一步提供本发明的被包裹的形成软骨的细胞作为用于治疗选自下组 的疾病或病症的药物的用途：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、整容 成形外科。软骨疾病包括特别在关节软骨中的类风湿性关节炎和骨关节炎； 所述紊乱包括先天或遗传性缺陷，例如需要通过鼻和鼻中隔软骨的面部重 建进行治疗的那些。
还进一步提供本发明的一个或多个被包裹的形成骨的细胞在制备用于 治疗选自下组的需要骨重建的疾病或病症的药物中的用途，例如下列的疾 病或病症：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、成骨不全、Paget′s 病、纤维性结构不良、与听力丧失有关的骨疾病、低磷酸酯酶症、骨髓瘤 骨病、骨硬化症、骨过度使用损伤、骨的运动损伤、牙周(齿龈)疾病。
另外提供被包裹的一个或多个形成软骨的细胞在制备用于治疗选自下 组的疾病或病症的药物中的用途：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、 成形外科、整容成形外科、类风湿性和骨关节炎。
在另一方面，本发明提供治疗受试者的方法，其包括施用本发明的被 包裹的细胞。本发明的被包裹的形成骨的细胞可以被施用给受试者以治疗 需要骨重建的疾病或病症：骨质疏松症、骨断裂、骨折、骨癌症、骨癌、 成骨不全、Paget′s病、纤维性结构不良、与听力丧失有关的骨疾病、低磷 酸酯酶症、骨髓瘤骨病、骨硬化症、骨过度使用损伤、骨的运动损伤、牙 周(齿龈)疾病。本发明的被包裹的形成软骨的细胞可以被施用给受试者 以治疗选自下组的疾病或病症：关节炎、软骨疾病或紊乱、软骨修复、类 风湿性和骨关节炎。
本发明还提供成形外科的方法，其可以是治疗性的或整容外科 (cosmetic surgery)，包括施用本发明的一个或多个被包裹的细胞，优选被 包裹的形成骨或形成软骨的细胞。
可以配制本发明的被包裹的细胞以提供药物组合物，其含有一个或多 个被包裹的细胞和药学上可接受的载体或稀释剂。优选药物组合物被配制 用于通过注射或内窥镜检查法施用。
从本发明的被包裹的细胞得到的骨或软骨组织也在本发明范围中，其 适宜地在细胞支架上或细胞支架中提供。被包裹的细胞可以接种到细胞支 架上，和/或灌输入细胞支架中，所述细胞支架随后被移植以使细胞在体内 原位生长。该支架在骨和软骨组织的成形外科中特别有用。
附图说明
图1和2：用Oct4的抗体染色的免疫荧光
130天的石蜡包埋/切片的人胚胎干细胞(hESC)聚集体显示Oct-4的 阳性免疫染色。(嵌入的小图——阴性和阳性对照)
图3和4：用抗-TRA-1-81染色的免疫荧光
石蜡包埋/切片的130天的人胚胎干细胞聚集体的免疫染色显示对该抗 体的强免疫反应性，表明保留了多潜能性。(嵌入的小图——阴性和阳性 对照)
图5和6：用抗-SSEA-4染色的免疫荧光
未分化的人胚胎干细胞聚集体，显示SSEA-4抗体的阳性免疫染色。(嵌 入的小图——阴性和阳性对照)
图7：RT-PCR分析
RT-PCR分析显示在175天和260天的人胚胎干细胞聚集体中多潜能 标记物Oct4和Nanog的表达。泳道A是175天龄的人胚胎干细胞聚集体， 泳道B是260天龄的人胚胎干细胞聚集体，泳道C是阴性对照。GAPDH 的表达被用作内对照。
图8：包裹在水凝胶小珠(1.1％w/v藻酸盐，0.1％v/v明胶)中的单 个鼠胚胎干(mES)细胞在静态三维培养物中在M2培养基中生长10天。 比例尺为50μm。单个胚胎干细胞进行分裂，在大约10天时形成细胞的小 集落。
图9：整合的维持和形成骨的分化策略的示意图。步骤为：
a)在藻酸盐加明胶的微型小珠中包裹未分化的鼠胚胎干细胞，然后导 入三维生物反应器中；
b)在维持培养基(M2)中培养3天以增加鼠胚胎干细胞数量，并形成 合适的细胞群，以使得形成三维多先祖细胞(multiprogenitors)；
c)在EB形成培养基(M1)中培养5天；
d)在形成骨的培养基(Buttery)中培养21天以使得进行骨诱导和三维 骨形成。
图10：藻酸盐小珠中的组织形态。藻酸盐小珠保持其球形，细胞群集 变得明显：(a)第3天(比例尺长度＝1000μm)；(b)第7天(比例尺长度＝500 μm)；(c)第21天(刻度尺长度＝500μm)。在各个时间的苏木精/曙红染色 的水凝胶薄切片显示组织发育：(d)第3天(比例尺长度＝20μm)；(e)第8 天(比例尺长度＝20μm)；(f)第22天(比例尺长度＝20μm)。
图11：由存活/死亡染色表示的藻酸盐小珠中细胞的存活能力(嵌入 的小图)(绿色表示活细胞，红色表示死细胞；比例尺长度＝100μm)。 通过使用针对代谢活动的MTS分析(▲；n＝24)，和碱性磷酸酶分析(●；n＝ 6)和用于矿化组织形成的茜素红定量(■；n＝6)评估三维培养物中每个小珠 的生物化学表现。误差棒代表标准误差。*/#：显著增加/降低(p＜0.05)。
图12：对被包裹的鼠胚胎干细胞的表征。免疫细胞化学证实在第3天 维持未分化状态：(a)DAPI(蓝色)和CD9(红色)，(b)DAPI(蓝色)，(c)Oct-4 (绿色)，。当三维培养物在EB形成培养基中生长时(第3-8天)，在第8 天明显可见中胚层组织的产生：(d)DAPI(蓝色)和Flk-1(绿色)。嵌入的 小图表示从在组织培养平板(二维)上培养的鼠胚胎干细胞中获得的阴性 对照。比例尺长度＝20μm。
图13：对矿化组织形成的表征。(a)Balb/c小鼠骨茜素红S阳性对照 和，(b)Balb/c小鼠von Kossa阳性对照。通过(c)茜素红S和(d)von Kossa 染色证明在第22天藻酸盐小珠中的矿化组织形成。苏木精/曙红染色的藻酸 盐小珠的正中切开显示第29天在水凝胶核心的组织形成(e-f)。在第29天 检测同一切片的骨形成，显示更加明显的茜素红S(g)和von Kossa(h)染色。 在第29天进行的免疫细胞化学证实终末分化的成骨细胞的存在：(i)用DAPI 染色的(蓝色)和骨钙素免疫染色(绿色)的第29天的切片，并且嵌入的 小图(j)显示以同样方式染色的Balb/c小鼠骨阴性对照；(k)更高放大倍 率的用DAPI染色的(蓝色)和对骨钙素免疫染色的(绿色)第29天的切 片，嵌入的小图(l)显示Balb/c小鼠骨阳性对照；(m)用DAPI染色的(蓝 色)和对OB-钙粘蛋白的免疫染色的(绿色)第29天的切片，嵌入的小 图显示：(n)Balb/c小鼠骨阳性对照，和(o)Balb/c小鼠骨阴性对照；(p)用 DAPI染色的(蓝色)和对胶原-I的免疫染色的(绿色)第29天的切片， 嵌入的小图显示：(q)Balb/c小鼠骨阳性对照，和(r)Balb/c小鼠骨阴性对照。 (a-f)的比例尺长度为100μm，(g-j)的为20μm。
图14：在骨形成期间在第15天(d15)、第22天(d22)和第29天 (d29)对骨形成标记物的基因表达分析。L＝100bp DNA梯度。RT-ve＝第 29天在没有逆转录酶的情况下用GapDH引物的RT-阴性对照。-ve＝用水 替代模板的用GapDH引物的PCR阴性对照。+ve＝使用MC-3T3-E1细胞 在骨形成培养基中培养10天的阳性对照。
图15：使用微型计算机X线断层摄影术(微型CT)评估组织矿化。在 第29天评估藻酸盐小珠的骨聚集体矿化程度。(a-b)假颜色(false colour)， 随机选择的单个藻酸盐小珠在第29天的三维区域再现(3D sector reconstruction)。嵌入的小图代表使用Balb/c小鼠大腿骨的假颜色阳性对照。 假颜色图像的着色显示从最高(黄色)到紫色到最低(黑色)的衰减水平， 其分别表示硬到软组织。(c)显示第29天藻酸盐小珠的灰度传递图像(红 色箭头指示矿化聚集体周围的软组织)。嵌入的小图显示使用没有任何细 胞的藻酸盐小珠的阴性对照灰度传递图像(虚线表示小珠边沿)。(d)假颜 色，第29天藻酸盐小珠的二维横切面。比例尺长度＝100μm。
实施例
实施例1：在藻酸盐小珠中包裹人胚胎干细胞
1.1细胞培养
1.1.1饲养层
原代鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
简要的，在雌性小鼠(Swiss MF1品系)怀孕的第13天通过进度表I 处死方法(schedule I killing)将其处死。然后取出胚胎，并除去他们的内脏。 在胰蛋白酶/EDTA溶液(0.1MPBS中的0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA， 不含钙或镁；Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK)中仔细切碎胚 胎尸体，将其在培养瓶中接种于补充有10％v/v热灭活FBS、0.1mM MEM 非必需氨基酸溶液、100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素(均得自Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK)的高葡萄糖DMEM中。当细胞达 到铺满时，收集成纤维细胞，将其冰冻于含有60％v/v高葡萄糖DMEM、 20％v/v热灭活FBS(均得自Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK) 和20％v/v二甲基亚砜Hybri-Max(DMSO)(Sigma-Aldrich，Dorset，UK)的 MEF冰冻培养基中。为培养人胚胎干细胞，优选不超过三或四代的MEF。
在除青霉素和链霉素外其它与上述相同的培养基中，于明胶包被的培 养容器表面培育解冻的MEF细胞。在用作饲养层之前，用丝裂霉素C消除 MEF细胞的有丝分裂活性。然后用胰蛋白酶(0.1MPBS中的0.05％胰蛋白 酶/0.53mM EDTA，不含钙或镁；Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley， UK)处理灭活的细胞，并或者将其冷冻，或者转移到6孔平板中作为人胚 胎干细胞生长的饲养层。在MEF冰冻培养基中冰冻MEF(方案来自WiCell Research Institute Inc，Madison，July 2000)。
人胚胎干细胞的培养
1.1.2.1未分化细胞的培养
将灭活的原代MEF细胞接种至少一天，然后将未分化的人胚胎干细胞 在上述培养基中解冻。第二天，解冻未分化的人H1细胞(WiCell Research Institute Inc，Madison)，将其接种于MEF细胞上，采用供应商建议的方案 培育未分化状态的细胞。培养基由补充有20％v/v KNOCKOUTTM SR、2 mM L-谷氨酸盐、0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自Gibco Invitrogen，Life Technologies，Paisley，UK)、0.1mM 2-巯基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich， Dorset，UK)和4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGF-2)(157 个氨基酸)(R&D Systems，Oxon，UK)的DMEM/F12培养基组成。每两天喂饲 细胞。
这些细胞的生长率比小鼠胚胎干细胞的生长率慢很多。由于灭活的 MEF细胞在培养物中7-10天会死亡，因此每7-10天将人胚胎干细胞转 移到新的饲养层上。细胞解冻后，需要花费约4-6周获得亚铺满的培养孔， 然后将细胞分板。只有当细胞处于集落中时，他们才生长并保持它们的未 分化状态。单个细胞不生长。偶尔，一些集落进行自发分化。
1.2在藻酸盐小珠(alginate bead)中包裹人胚胎干细胞
1.2.1包裹过程
用胰蛋白酶消化未分化的、4-5天的人胚胎干细胞，然后在室温下重 悬于1.1％(w/v)低粘性褐藻酸*(Sigma，UK)和0.1％(v/v)猪明胶(Sigma，UK) (均溶解在PBS中，pH7.4)溶液中。低粘性褐藻酸是基本由具有1→4连接的 无水-β-D-甘露糖醛酸残基组成的直链、亲水、胶态聚糖醛酸。采用Pharmacia 蠕动泵[Amersham Biosciences，UK(Model P-1)]，以×20的流速、30mm的落 差[(对管道进行高压灭菌，然后用1M NaOH灭菌30分钟并用无菌PBS洗 三次)]，使细胞-凝胶溶液通过蠕动泵(peristaltic pump)，用25口径的针 (Becton Dickinson，UK)将其滴入无菌、室温的CaCl2溶液中[于蒸馏水中的 100mM氯化钙(CaCl2)(Sigma，UK)和10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙 烷磺酸)(HEPES)(Sigma，UK)，pH7.4]。凝为胶体的细胞-凝胶溶液立刻与 CaCl2溶液接触，形成球形小珠(膨胀后直径2.3mm)。室温下将小珠在轻轻 搅动的CaCl2溶液中保持6-10分钟。将小珠在PBS中洗三次，然后放入 维持培养基中。
在人胚胎干细胞维持培养基中培养包裹在藻酸盐小珠中的未分化人胚 胎干细胞，所述人胚胎干细胞维持培养基为补充有20％v/v KNOCKOUTTM SR、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自Gibco Invitrogen， Life Technologies，Paisley，UK)、0.1mM 2-巯基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich， Dorset，UK)和4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGF-2)(157 个氨基酸)(R&D Systems，Oxon，UK)的DMEM/F12培养基。生长的条件为湿 润孵箱中、37℃，5％CO2，小珠在标准的塑料组织培养皿中于静态条件下进 行培养。每3-4天饲喂细胞。使用附有彩色CoolPix 950数码相机(Nikon， Kingston-upon-Thames，UK)的倒置显微镜(Olympus，Southall，UK)评估和记 录结构和形态学上的任何改变。小珠既含有人胚胎干细胞的聚集体，也含 有单个人胚胎干细胞，单个人胚胎干细胞在小珠中形成集落。
在维持培养基中130天后，于PBS中洗小珠两次，然后将其溶解以释 放细胞/集落。
1.2.2藻酸盐小珠的溶解
将用于溶解小珠的无菌解聚缓冲液[(Ca2+耗尽的)(50mM二水合柠檬 酸三钠(Fluka，UK)，77mM氯化钠(BDH Laboratory Supplies，UK)和10 mM HEPES)](20)加入到用PBS洗过的小珠中15-20分钟，同时轻轻搅动。 溶液于400g下离心10分钟，用PBS洗涤沉淀物，然后再于300g下离心3 分钟。
1.3组织学
1.3.1石蜡包埋
室温下用4％多聚甲醛(PFA)固定来自小珠的130天龄的人胚胎干细 胞聚集体一小时，然后保持在0.1％叠氮化钠中以进行短期或长期保存 (4℃)。脱水过程前，将人胚胎干细胞聚集体置于PBS中15分钟。随后经过 依次提高乙醇浓度的程序除去所有的水。然后用纯二甲苯完全替换乙醇以 除去所有痕量乙醇。然后在室温下用石蜡饱和的二甲苯替换二甲苯过夜。 然后将在石蜡饱和的二甲苯中的人胚胎干细胞聚集体置于烤箱(60℃)中20 分钟。然后用液体石蜡完全替换二甲苯。然后包埋样本，切片(4μm)，室 温下过夜以粘附于VectabondedTM(Vector Laboratories，UK)载玻片上。
1.3.2免疫细胞化学
通过在二甲苯中沉浸、逐渐降低的乙醇浓度、然后用自来水沉浸，从 切片除去石蜡。然后，将切片浸入二水合柠檬酸三钠缓冲液(10mM，pH6.0) 中进行高温灭菌，然后冷却和干燥，以取回(retrieve)抗原。随后用3％(v/v) 封闭山羊或兔血清(Vector Laboratories)在室温下在作为一级稀释剂(primary diluent)的PBS中的0.05％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma)，0.01％(w/v) NaN3(Sigma)中温育样本30分钟。
为进行免疫荧光染色，根据制造商的方案使用胚胎干细胞标记物样本 试剂盒(Chemicon，International；Cat.no.SCR002)。所使用的单克隆抗体为： 抗-SSEA-4，抗-TRA-1-60和抗-TRA-1-81(试剂盒中提供)。对于Oct-4抗体 (Santa Cruz Biotechnology)，用在一级稀释剂中稀释的一级抗体(1∶300) 于4℃温育样本过夜，随后洗两次，用在二级稀释剂中稀释的二级抗体(山 羊抗-兔1∶300)(Santa Cruz，International)在室温于黑暗中温育1小时，第二 稀释剂由PBS中0.05％(w/v)BSA组成。随后，在PBS中洗样本两次，用 VectashieldTM固定。在IX70荧光倒置显微镜(Olympus，Southall，UK)下观察 制品。
1.3.2.1阴性对照
如在间接二层荧光标记中那样，可以通过省去一级抗体以检测所使用 的二级抗体的背景荧光，获得阴性对照样本。随后可以用这些数据准确解 释阳性样本。阴性对照可用于将标记物定位在荧光直方图上，从而识别阴 性群体的确切位置，和估计单克隆或多克隆抗体与细胞表面抗原非特异性 结合的数量。
阳性对照
对于阳性对照，人胚胎干细胞在MEF上生长，然后用胚胎干细胞标记 物试剂盒免疫染色。使用阳性对照识别单克隆和多克隆抗体与阳性样本上 细胞表面抗原的特异性结合。
RNA提取和逆转录
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Life Technologies，UK)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，UK)从藻酸盐小珠中形成的175天和260天人胚胎干 细胞聚集体中提取总RNA。使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) (Invitrogen，UK)在20μl终体积中从1μg总RNA合成cDNA。使用寡(dt)20 引发(prime)进行RT反应，其能够用不同位点的基因特异引物PCR扩增 同一cDNA。在没有cDNA模板的情况下进行阴性对照。使用Primer Express 2软件(Applied Biosystems，UK)设计引物。
RT-PCR序列如下：
基因 引物序列(5’-3’) 退火温度 (℃) 扩增子大小 (bp) Oct4 F：TCTGCAGAAAGAACTCGAGCAA R：AGATGGTCGTTTGGCTGAACAC 54 127 Nanog F：TGCAGTTCCAGCCAAATTCTC R：CCTAGTGGTCTGCTGTATTACATTAAGG 55 91 GAPDH F：GTTCGACAGTCAGCCGCATC R：GGAATTTGCCATGGGTGGA 54 182
对于持家mRNA，使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，因为据显示 在分化的胚胎干细胞培养物中GAPDH mRNA比其他持家mRNA序列更稳 定。通过BLAST(http://www.ncbi.nl m.nih.gov/BLAST/)检验引物退火位点和 扩增子序列与其他人DNA和cDNA序列的相似性。发现配对的引物退火位 点和扩增子序列对于目标人序列是唯一的。
在50μl PCR反应混合物中，MgCl2和dNTP的终浓度分别为3和10 mM。在Mastercyclerep(Eppendorf AG，Germany)中进行DNA扩增：双链 DNA变性和AmpliTaq Gold DNA聚合酶的活化在94℃进行10分钟，然后 在94℃进行40个循环的模板变性(5秒)，在55℃进行引物退火(对于 Oct4和GAPDH；对于Nanog为55℃)和在72℃进行引物延伸(30秒)。 在3％(w/v)琼脂糖凝胶上分离PCR产物，通过溴化乙锭荧光显像，使用100 bp梯度(Fermentas)估计产物的大小。
使用与计算机连接的Fluor-S MultiImager系统(Bio-Rad，UK)捕捉溴化 乙锭染色的凝胶的数码图象，该系统由所附的平板式紫外光扫描器和CCD 相机组成。使用Bio-Rad Quantity One软件(Bio-Rad，UK)分析图象，该软件 可检测单个条带并减去背景噪音，获得完全由基因特异性扩增的产物产生 的强度值。
RT-PCR分析(图7)显示在175天和260天的人胚胎干细胞聚集体中多 潜能标记物Oct4和Nanog的表达。泳道A是175天龄的人胚胎干细胞聚集 体，泳B是260天龄的人胚胎干细胞聚集体，泳道C是阴性对照。使用 GAPDH表达作为内对照。这些结果显示在超过100天的阶段中人胚胎干细 胞聚集体仍然保留了人胚胎干细胞的多潜能性而没有传代。这些结果也支 持先前对多潜能标记物的免疫细胞化学观测结果。
结论和讨论
获得的结果证明人胚胎干细胞能够在不存在饲养细胞且不存在饲养细 胞条件培养基的情况下保持未分化状态至少130天。人胚胎干细胞包裹过 程提供了物理环境，该物理环境使得不再需要这种饲养细胞支持。所开发 的该过程使得能够采用类似于小鼠胚胎干细胞培养方法的方法培养人胚胎 干细胞。本发明所开发的用于人胚胎干细胞的培养程序使得能够实现人胚 胎干细胞分化方案，该方案基于现已用小鼠胚胎干细胞验证过的方案，但 至今仍由于无法获得数量足够用于这些实验的未分化胚胎干细胞而没有在 人胚胎干细胞中进行研究。所开发的人胚胎干细胞培养系统为用于开发使 用人胚胎干细胞的治疗性产品的标准化可调节系统提供了有用的平台。
实施例2：单个鼠胚胎干(mES)细胞的分化
将单个的鼠胚胎干细胞包裹在水凝胶小珠(直径40-100μm)中，然后 在维持培养基M2[Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)，10％(v/v) 胎牛血清，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺(均由 Invitrogen，UK提供)，0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma，UK)和1000单位/mL EsgroTM(LIF)(Chemicon，UK)]中生长10天。单个胚胎干细胞进行分裂，10 天左右形成小的细胞集落(图8)。通过用已确定的种系特异性信号进行刺 激可以使这些细胞分化为不同种系的成熟细胞。例如，对于形成骨的分化， 采用下述的方案。
实施例3：比较方法，传统的二维鼠胚胎干细胞常规维持和传代(参 考文献2和3)
E14Tg2a鼠胚胎干(mES)细胞系在设定为37℃和5％CO2(h3 7/5) 的湿润孵箱中在0.1％明胶包被的组织培养容器上常规传代。未分化的鼠胚 胎干细胞(＜p20)每2或3天进行传代，并且每天喂饲新鲜的M2培养基 [Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)，10％(v/v)胎牛血清，100单位 /mL青霉素和100μg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺(均由Invitrogen，UK提供)， 0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma，UK)和1000单位/mL EsgroTM(LIF)(Chemicon， UK)]。为分离鼠胚胎干细胞，在吸出培养基后向鼠胚胎干细胞中加入需要 量的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(TE)(Invitrogen，UK)3-5分钟 (h37/5)，然后用预热的PBS洗一次。
二维胚状体形成
胚状体(embryoid body)形成涉及悬浮培养前鼠胚胎干细胞的精心制 备，这已经有详细的记载(8；9；24；28-30)。然而，本发明用E14Tg2a细胞系确 定了悬浮前正确条件的经验测定。单层培养物中的细胞应为～80％铺满，其 为2或3天的培养物，并且在形态学上未分化的与已分化的比值很高。像正 常一样用胰蛋白酶处理鼠胚胎干细胞，但是在胰蛋白酶作用2-3分钟而不 是5分钟后可见100-200个细胞的细胞团。细胞随后在室温下以300g离心3 分钟(22℃，(RT))。在M2培养基中生长2或3天后，铺满的T75培养瓶中通常 产生大约5-7x106个细胞，将其重新悬浮于30mL的M1培养基 [Alpha-Modified Eagles Medium(αMEM)，10％(v/v)胎牛血清，100单位/mL 青霉素和100μg/mL链霉素]中，然后均匀散布在两个90mm直径的细菌学等 级的培养皿(Bibby Sterilin，UK)中。为通过这种方法正确形成胚状体，10- 20个细胞的细胞团是必需的，因为单个细胞悬浮液或数千个细胞的大细胞 团会导致错误的三维聚集体。在胚状体形成(h37/5)的第三天更换培养基， 因此必需的生长因子已经耗尽(如L-谷氨酰胺)，且有毒代谢物已经开始积 聚(如氨)。在培养的第5天，通过从细菌学平板中抽吸而收获胚状体，然后 以66g离心4分钟。吸出培养基，用预热的PBS替换以洗去痕量血清。细胞再 次以66g离心4分钟，吸出PBS。洗3-5分钟(h37/5)后向胚状体中加入1mL 的TE。然后加入预热的M1培养基(1mL)以停止胰蛋白酶消化作用，将细 胞重新悬浮于需要的培养基中作为用于骨小结形成分析的单个细胞悬浮 液。
二维骨小结分析
如以前所述(31)的标准的骨小结(bone nodule)形成分析是使用M1 培养基进行的，其从第8天到第29天不断补入βadex[10mM β-磷酸甘油， 50μg/ml抗坏血酸和1μM的地塞米松(终浓度)]。将解聚的胚状体(dEB)在塑 料组织培养容器或载玻片上培养21天(h37/5)，每2或3天更换培养基。dEB 的铺板密度为每平方厘米5.208×103个细胞，每25个细胞1μL培养基。
实施例4：鼠胚胎干细胞的藻酸盐小珠包裹
将未分化的鼠胚胎干细胞(mESC)包裹于1.1％(w/v)低粘性褐藻酸和 0.1％(v/v)猪明胶的水凝胶小珠(d＝2.3mm)中。在50mL水平的方向比率容 器(aspect ratio vessel)(HARV)生物反应器中培养大约600个小珠，每 个小珠中含有10,000个鼠胚胎干细胞。设定生物反应器培养物的转动速度 为17.5rpm，在含有白血病抑制因子(LIF)的维持培养基中培养3天，然 后替换为胚状体形成培养基，培养5天，接着用含有2-磷酸-L-抗坏血酸(50 μg/mL)，β-磷酸甘油(10mM)和地塞米松(1μM)的形成骨的培养基再培养21 天。29天后观察到培养物中每个小珠的细胞数量增长了84倍，并且在藻酸 盐小珠中形成了矿化的(mineralised)基质。骨生成通过von Kossa和茜素 红S染色、碱性磷酸酶活性、骨钙素(osteocalcin)的免疫细胞化学，OB -钙粘蛋白和I型胶原、RT-PCR和微计算机X线断层摄影术(微CT)进行 评估。这些发现提供了一种简单、集成的生物学方法，用于从鼠胚胎干细 胞可再生地生产具有潜在临床应用的三维(3D)矿化组织。
材料和方法
鼠胚胎干细胞培养和胚状体形成
E14Tg2a细胞的培养和胚状体的形成如先前所述的进行(32)。简要的， 每2-3天传代未分化的鼠胚胎干细胞(＜p20)，并且每天用维持培养基进行 喂饲，维持培养基由补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS；Invitrogen)、100单 位/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺 (Invitrogen)、0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma，UK)、和1000单位/mL LIF (Chemicon，Chandlers Ford，UK)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM；Invitrogen，Paisley，UK)组成。分裂胚状体，将细胞团(10-20个 细胞)置于由alpha-Modified Eagle’s Medium(αMEM；Invitrogen)、10％(v/v) FCS(Invitrogen)、100单位/mL青霉素(Invitrogen)、和100μg/mL链霉素 (Invitrogen)组成的胚状体分化培养基中悬浮5天。
矿化组织和骨小结分析
如先前所述，使用补充有50μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸(Sigma)、10mM β-磷酸甘油(Sigma)和1μM地塞米松(Sigma)的α-MEM(Invitrogen)从第8天 到第29天的培养物中在保持在37℃和5％CO2条件下的塑料组织培养容 器中或载玻片上进行矿化组织的形成(13)。铺板密度为5.2×103个细胞 /cm2，每2或3天更换培养基。
包裹和生物反应器培养
未分化的鼠胚胎干细胞以1.56×106个细胞/mL悬浮于无菌的1.1％ (w/v)低粘性褐藻酸(Sigma)，0.1％(v/v)猪明胶(Sigma)磷酸盐缓冲盐溶液 (PBS；pH7.4)中。将细胞-凝胶溶液通过蠕动泵(Model P-1；Amersham Biosciences，Amersham，UK)，然后使用25-口径将其从30mm滴入100mM CaCl2，10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙烷磺酸)的无菌溶液(HEPES；pH 7.4)(均得自Sigma)中。在室温下凝胶化6-10分钟所形成的小珠为球形(膨 胀后直径＝2.3mm)。包裹的鼠胚胎干细胞在水平的方向比率容器生物反应 器(Cellon，Bereldange，LUX)中在维持培养基中培养3天，每天更换培养基。 每个反应器含有600个小珠，在培养的第0-21天以17.5rpm旋转，在培 养的第22-29天以20rpm旋转。提高旋转速度以抵消藻酸盐小珠中矿化组 织的形成，其导致小珠变得更重。从第3天直到第8天，用胚状体分化培 养基(αMEM，如先前所述)喂饲生物反应器培养物，该培养基在第6天补 满，然后在第8天如早先所述的用形成骨的补充物进行骨形成的诱导(每2 -3天补满)。
存活/死亡分析
悬浮细胞或藻酸盐小珠在室温下于暗处用PBS中的4μM EthD-1和2 μM钙黄绿素AM溶液(Invitrogen)温育30分钟，然后用PBS洗涤。死亡细 胞被用作阴性对照。
细胞样本处理
将在Flaskette载玻片(Nalgene，Hereford，UK)上生长的对照二维细胞 培养物于4％(w/v)多聚甲醛(PFA；BDH Laboratory Supplies)中固定20分 钟，然后在PBS中洗涤。在室温下将藻酸盐小珠于4％(v/v)多聚甲醛(PFA； 由BDH Laboratory Supplies，Poole，UK)中固定30分钟，然后在浓度逐渐增 加的乙醇中脱水，用二甲苯(BDH Laboratory Supplies)处理，接着用石蜡 包埋。将包埋的样本连续切片(4μm)至VectabondTM-包被的载玻片(Vector Laboratories，Orton Southgate，UK)上。对于免疫细胞化学，在通过加热取回 抗原前，将脱水的切片浸入10mM二水合柠檬酸三钠缓冲液(pH6.0； Sigma)中。Balb/c小鼠骨骼用与藻酸盐小珠相同的方式进行加工，用作对 照。
组织学
通过常规的苏木精/曙红染色检测含水的二维细胞培养物或在藻酸盐小 珠中生长的细胞的脱石蜡切片的组织学。
茜素红S和von Kossa染色
如别处所述，含水(hydrated)二维细胞培养物和石蜡切片用茜素红S 或von Kossa着色剂染色(33)。Von Kossa染色的切片用核坚牢红复染色， 连续脱水，在二甲苯中清除，然后在DPX中固定。Balb/c小鼠骨被用作对 照，用与藻酸盐小珠相同的方式对其进行加工。
免疫细胞化学
将含水二维细胞培养物或石蜡切片浸入10mM二水合柠檬酸三钠缓 冲液(pH6.0；Sigma)中，然后高压灭菌以取回抗原，随后在室温下用0.2％ (v/v)Triton-X-100(BDH Laboratory Supplies)温育45分钟。如表1中所示， 样本依次用下列温育：a)在作为一级稀释剂的PBS中的0.01％(w/v)NaN3 (Sigma)中，于室温下用在0.05％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma)中的3％ (v/v)封闭山羊或兔血清(Vector Laboratories)温育30分钟；b)与在一级稀释 剂中稀释的针对若干干细胞和成骨细胞标记物的一级抗体于4℃温育过夜； c)与在二级稀释剂[PBS中的0.05％(w/v)BSA]中的二级抗体在室温下于 暗处温育1小时。然后用PBS洗涤样本，再用含有1.5μg/mL 4′，6联脒-2- 苯基吲哚(DAPI)的VectashieldTM(Vector Laboratories)固定。Balb/c小鼠骨 被用作对照，用与藻酸盐小珠相同的方式对其进行加工。
逆转录-PCR
使用总RNA分离试剂盒(Qiagen Ltd，Crawley，UK)提取总RNA。使用1 μg总RNA、随机引物和具有Rnase抑制剂的AMV逆转录酶(Promega，UK) 进行单链cDNA的合成。PCR反应缓冲液由1xAmplitaq Gold缓冲液，2mM MgCl2，200μM dNTPs，1.25单位的Amplitaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，Warrington，UK)和500nM的每种引物(Invitrogen)组成。如先前 所述(32)，使用2μL(来自20μL)的cDNA进行RT-PCR分析；引物序 列如表1中所列。使用MC-3T3-E1细胞的阳性对照在形成骨的培养基中培 养10天。移除逆转录酶作为阴性对照。
表1：
抗原 一级 二级 封闭血清1 封闭血清2 Oct-4 1∶80兔多克隆(Santa Cruz Biotech，Calne， UK) 1∶80山羊抗兔FITC (Chemicon，Chandlers Ford，UK) 3％正常山羊血 清(Vector Laboratories，UK) 不适用 CD9 1∶750大鼠单克隆 (Research Diagnostics， Concord，MA，USA) 1∶80山羊抗大鼠若 丹明.(Chemicon) 3％正常山羊血 清(Vector Laboratories) 1.5％正常小鼠 血清(Serotec， Kidlington，UK) Flk-1 1∶200小鼠单克隆 (Santa Cruz biotech) 1∶80兔抗小鼠FITC (Dako，High Wycombe，UK) 3％正常兔血清 (Vector Laboratories) 1.5％正常小鼠 血清(Serotec) OB-钙粘 蛋白 1∶50山羊多克隆 (Santa Cruz Biotech) 1∶100兔抗山羊FITC (Sigma) 3％正常兔血清 (Vector Laborato ries) 不适用 骨钙素 1∶50山羊多克隆 (Santa Cruz biotech) 1∶100兔抗山羊FITC (Sigma) 3％正常兔血清 (Vector Laboratories) 不适用 I型胶原 1∶50兔多克隆(Santa Cruz biotech) 1∶100山羊抗兔FITC (Chemicon) 3％正常山羊血 清(Vector Laborato ries) 不适用 基因 FWD 5’-3’ RVS 5’-3’ 长度(bp) PCR条件 Gapdh CATCACCATCTTC CAGGAGC ATGCCAGTGAGCT TCCCGTC 474 94℃下10分钟， 35个循环的：94 ℃ 30秒、60 ℃ 40秒、72℃ 60秒和72℃ 10 分钟。 Cbfa-1 CAGTTCCCAAGCA TTTCATCC TCAATATGGTCGC CAAACAG 444 94℃ 10分钟， 36个循环的：94 ℃ 60秒，45℃ 60秒，72℃ 60 秒和72℃ 10分 钟。 胶原I GAACGGTCCACGA TTGCATG GGCATGTTGCTAG GCACGAAG 167 94℃下10分 钟，30个循环的： 94℃ 60秒，60 ℃ 60秒，72 ℃ 60秒和72℃ 7分钟。
胶原II CTGCTCATCGCCG CGGTCCTA AGGGGTACCAGG TTCTCCATC 432(剪接A，早 期发育) 225(剪接B，成 熟软骨) 94℃下10分 钟，30个循环的： 94℃ 60秒，60 ℃ 60秒，72 ℃ 60秒 & 72℃ 下7分钟 骨钙素 (OCN) CGGCCCTGAGTCT GACAAA ACCTTATTGCCCT CCTGCTT 193 94℃ 10分钟， 30个循环的：94 ℃ 60秒，60 ℃ 60秒，72℃ 60秒和72℃ 7 分钟。
MTS分析
采用CellTiter 96AQueous One Solution Reagent分析(Promega， Southampton，UK)评估整个培养期间的代谢活动。使用生长于培养瓶培养物 (二维)或包裹于藻酸盐小珠(三维)中的已知数量的鼠胚胎干细胞产生 标准曲线。进行阴性对照(无细胞)。所有的试验都在三个不同的场合、 一式两份地进行，并且对于每个试验，都一式四份地进行测定。简要的， 二维培养的鼠胚胎干细胞在37℃于24孔平板中用200μL的无酚红维持培 养基和40μL的MTS试剂温育2小时。只有二维反应通过加入50μL的10％ (v/v)十二烷基硫酸钠(SDS)停止。类似的，随机选择三个藻酸盐小珠，将其 放入24孔平板的不同孔中，然后在37℃用300μL的无酚红维持培养基和 60μL的MTS试剂温育4小时。从每个反应中取100μL转移入96孔平板 中，然后使用MRX II平板读数器(Dynex Technologies，Worthing，UK)于450 nm读数。
DNA定量
使用DNA特异性染料Hoechst 33258(Sigma)测定用蛋白酶K消化的样 本的总DNA含量，以其作为评估藻酸盐小珠中细胞数量的间接方法。简要 的，小珠在室温下于解聚缓冲液(20)中溶解20分钟，然后以400g离心 10分钟，收集细胞沉淀，用PBS洗涤。沉淀在液氮中速冻，然后在-80℃ 下保存直到进行分析。为进行DNA分析，沉淀在37℃下于含有50μg/mL 蛋白酶K(Sigma)的100mM磷酸氢二钾(Sigma)溶液中消化过夜。热灭活蛋 白酶K并且以12,000g离心10分钟之后，将100μL上清液与100μL的 Hoescht 33258溶液(2μg/mL)混合。最后，使用MFX微滴定平板荧光计 (Dynex Technologies)以365nm激发波长、460nm发射波长对100μL试样 读数。使用高度聚合的小牛胸腺DNA(Sigma)产生校准曲线。在培养的第 0天和第29天，样品一式两份的用于三个独立的试验。
矿化的定量茜素红分析
被包裹的鼠胚胎干细胞的矿化的茜素红S(ARS)分析在整个培养过程 中通过改造Gregory等人的方法(34)进行定量。简要的，将100个小珠用 10％(v/v)甲醛固定30分钟，然后在解聚缓冲液(20)中溶解20分钟。通 过以400g离心10分钟回收细胞沉淀，然后以与二维培养物相同的方式将 其染色。
碱性磷酸酶(ALPase)活性
通过在37℃于暗处用150μL的碱性磷酸酶缓冲液(pNPP；Sigma)和 150μL的磷酸对硝基酚溶液温育细胞或小珠30分钟检测培养于培养瓶培养 物中或包裹于藻酸盐小珠(n＝6)中的鼠胚胎干细胞的碱性磷酸酶活性。 通过向每孔中加入100μL的0.5N NaOH溶液终止反应，然后从每个反应中 取100μL转移到96孔平板的孔中，使用MRX II平板读数器(Dynex Technologies)于410nm读数。
成像
使用配置有CoolPix 950数码相机(Nikon，Kingston-upon-Thames，UK) 的IX70倒置显微镜(Olympus，Southall，UK)或配置有Axiocam(Zeiss)的 BX60竖式(Olympus)显微镜获取图象。图象没有进行人工增强；但是使用 Adobe Photoshop 7.0对图象进行采集(crop)。存活/死亡的染色样本在30 分钟的制备过程中使用Bio-Rad MRC600共焦显微镜(Bio-Rad/Zeiss， Welwyn-Garden-City，UK)成像，然后使用COMOS软件(Bio-Rad，UK)处 理。
微型-CT
使用设定为70kV、160μA并相应校准的Phoenix x-ray v|tome|x计算机 X线断层摄影机(Phoenix x-ray 3D Imaging System，Fareham，UK)进行微型 -CT分析以再现(reconstruct)在藻酸盐小珠中形成的三维矿化聚集体。使 用一个检测器获取图像，并在360°内旋转，每个截面相隔6.75μm。使用最 初由Siemens，Germany开发的Sixtos软件产生三维再现。使用不含被包裹 的细胞的藻酸盐小珠的阴性对照，和使用Balb/c小鼠pup骨碎片的阳性对 照。
统计分析
将结果表示为平均值±平均值的标准差(SEM)，并使用方差分析 (ANOVA)对结果进行分析。在P＜0.05时认为具有统计学显著性。
结果
对来自包裹于藻酸盐小珠中和培养于HARV生物反应器中的鼠胚胎干 细胞的三维矿化组织进行形态、表型(表面和分子)以及功能性(矿化程 度)的评估。作为对照，我们根据传统的在培养瓶(二维)培养物中形成 骨小结的方案培养鼠胚胎干细胞，重复先前已显示的结果(31)，从而证 实发生了形成骨的分化(数据未显示)。
被包裹的鼠胚胎干细胞的形态学表征
将分散的未分化鼠胚胎干细胞包裹于平均直径为2.3mm的藻酸盐水凝 胶小珠中(大约每个小珠10,000个细胞)。在维持培养基中培养3天后， 一开始分散在藻酸盐小珠中的鼠胚胎干细胞形成了细胞个数为4-10个细 胞、直径在20-50μm之间的集落(图1a)。这些集群是为球形、盘形或梭 形，在小珠各处平均分布，但是很少位于紧邻小珠外表面的地方(图1a)。 在第3天除去LIF、然后在EB形成培养基中培养5天之后，大部分集落表 现出一致的外观，并显示在藻酸盐基质内离散的“口袋(pockets)”中细胞数 量和整体大小都有所增加(图1b)，集落的大小范围在直径50-400μm。到 培养的第22天，集落已经非常紧密地堆积。大部分大集落位于小珠中心(图 1c)，在外围可以见到不含任何细胞材料的区域。培养29天后，集落的直 径超过了500μm。
细胞生长和代谢活动
随着集落大小增加，被包裹的鼠胚胎干细胞的细胞生存力并未随着培 养时间而明显降低。在第3天，出现有限的细胞死亡迹象，其表现为少许 红色细胞(图2)；但多数细胞开始形成离散的、存活的集落。虽然集落大 小随着培养时间而增加，但是在培养的最初3周集落的数量没有明显的增 加，尽管事实上生存力非常高(图2)。最终，培养29天后，明显可见的 存活集落在数量上多于第22天时，也比他们在培养更早期时更大。通过检 测单个小珠中DNA量进行评估的第0天时每个小珠中具有代谢活性的、未 分化的鼠胚胎干细胞的数量为每个小珠中10,287±228个细胞(平均值±SE； n＝2，每个重复试验分析150个小珠)。在HARV生物反应器中培养29天后， 每个小珠中有859,716±13,492个细胞(平均值±SE；n＝6)，其表明从培养 开始增加了84倍。代谢活性的改变显示出与培养的阶段、所使用的培养基 类型和喂饲的时间有关。从第0天到第3天，小珠培养于维持培养基中， 每个小珠的代谢活动保持不变(图2)。在第3天，用胚状体形成培养基替 换维持培养基，如图2所示，可以观察到每个小珠的代谢活性明显增加(p ＜0.05)。在第8天，加入分化培养基，如图2所示，每个小珠的代谢活动 到第15天略有降低，仅在到第29天明显增加(p＜0.05)。但是，由于到培 养的第29天藻酸盐小珠中细胞的数量增加了84倍，因此每个细胞的代谢 活性没有增加。
ALPase活性和矿化的量被用于指示形成骨的培养基中骨形成期间(培 养的第15天到第29天)的形成骨的分化。在培养的第15天和第29天之 间ALPase活性降低了3倍(p＜0.05)(图2)。相反，如图2所示，每个小珠 中矿化的量(基于410nm的吸光率)明显增加(p＜0.05)，从第15天的0.0021 ±0.0003增加到第29天的0.0999±0.0035(平均值±SE)。吸光率读数被标 准化为每个小珠的，但是实际读数是在每次读数使用100个小珠的矿化量 获得的。
未分化鼠胚胎干细胞和胚状体的表征
在培养的第3天Oct-4(细胞核中)和CD9(在细胞表面上)的表达证明在 维持培养基中的最初3天的培养期间被包裹的鼠胚胎干细胞保持未分化表 型(图3a-c)。此外，在胚状体形成阶段，被包裹的鼠胚胎干细胞在第8天 显示表达Flk-1，一种中胚层标记物(图3d)。
三维矿化组织形成
通过检测藻酸盐小珠的一系列切片，详细了解在培养的形成骨阶段(第 15-29天)由被包裹的鼠胚胎干细胞在藻酸盐水凝胶中形成的三维矿化组 织的性质。图4a-h表明，如深茜素红S和von Kossa染色所示，三维矿化 组织早在第22天就已明显形成，并在藻酸盐小珠中进一步发展至第29天。 显然，样本含有高比例的矿化组织，其渗透到整个切片。在培养的第22天 和第29天之间观察到染色强度的变化。尤其是在骨形成中期(第22天)， 茜素红S染色的组织在颜色上为均一的红色(图4c-d)，但没有达到小鼠 骨阳性对照中所示的红/黑程度。此外，第22天的样本含有直径范围为1 00 到300μm的组织，其中矿化区域的宽度在50-100μm。相反，在骨形成阶段 的末期(第29天)，如苏木素/曙红染色所示，藻酸盐小珠含有更大的组织 聚集体(图4e-f)；最大的组织切片的尺寸大于500×500μm。如生存力 染色所证实，所形成的组织的某些区域表现出坏死，但是大部分都是存活 的(图2)。此外，所产生的组织趋向于占据小珠的中心，并且高度整齐， 具有柱形细胞的边缘(图4e)。最后，在第29天(图4g-h)，所形成的 矿化组织达到如阳性对照(图4a-b)中所示的红/黑茜素红S染色强度。
还通过免疫细胞化学通过评估骨特异性标记物OB-钙粘蛋白、I型胶 原和骨钙素的表达研究藻酸盐水凝胶中矿化组织的形成。在培养的第15、 22和29天检测标志成骨细胞(35)的OB-钙粘蛋白的表达(图4i-k)， 其在所形成的组织的大块区域中普遍分布。大部分的染色局限在组织的边 缘，在这里细胞组织成柱状形式。在OB-钙粘蛋白染色阳性的同一组织样 本的矿化切片外围检测到骨钙素染色(图4m)。最后，还检测到I型胶原， 虽然与小鼠骨阳性对照相比水平较低，并且仅在第29天可见(图4p)，这 可能是由于所使用的多克隆抗体的灵敏度较低。通过分析基因表达证实免 疫细胞化学结果。尤其是，RT-PCR证明(图5)在第15、22和29天小 珠中Cbfa-l和I型胶原表达。在第15、22和29天发现IIA型胶原(其为短 暂的胚胎形式(21))和骨钙素表达；在第29天小珠中骨钙素的表达显示 与阳性对照(MC-3T3-E1细胞)类似的强度。
通过微型-CT分析评估组织矿化。由置于维持培养基中的不含被包裹的 鼠胚胎干细胞的藻酸盐小珠组成的阴性对照的微型-CT图象产生具有非常 小反差的图像，这表明缺乏能够衰减X-射线的致密材料(图6)。相反， 在藻酸盐小珠中由鼠胚胎干细胞形成的矿化组织提供合适的反差。除致密 的骨聚集体外，在第15、22天(数据未显示)和第29天(图6)，通过微 型-CT还检测到藻酸盐小珠的表面“外壳”，其描画出藻酸盐小珠外周的轮 廓。小珠外壳含有低水平的致密材料(紫色)，小珠本身中的矿化骨聚集 体在它们的中心显示高水平的衰减(黄色)，并且随着与骨聚集体核心距 离的增加，衰减降低。对小鼠大腿骨的阳性对照成像以比较矿化的程度(图 6)。对随机选择的藻酸盐小珠进行完整的扫描从而提供藻酸盐小珠中矿化 组织区域的三维再现。在第15天，没有看见矿化组织聚集体，但是到第22 天，可以看见14个直径小于50μm的离散的小聚集体。但是在第29天， 大小范围从50到250μm的44±7(平均值±SE；n＝2)个矿化组织聚集体 (图6)已存在。如图4所示这些矿化聚集体被软组织包围，其在图6(红色 箭头)中可被微弱的识别为围绕矿化聚集体的较暗区域。
讨论
胚胎干细胞的培养被高维持费用所阻碍，这是其维持是分段的过程， 需要经专门训练的操作者，和取决于操作者的决定。现在，鼠胚胎干细胞 在组织培养塑料容器上以单层培养，其所处的微环境由于分批型培养、频 繁的使用者介入和培养区域的快速耗尽而有所变化。最近，其它研究者也 已经强调传统胚胎干细胞培养的问题，并且提供了完整的解决方法(36)。 在本报告中，我们证实了新的生物过程，藉此未分化的鼠胚胎干细胞在完 整过程中在藻酸盐小珠中形成三维矿化组织，其使用HARV生物反应器， 不需要介入和培养操作。
在鼠胚胎干细胞培养的维持阶段，维持多潜能性和细胞生存力是必需 的，其通过存在LIF实现(4)。因此，必须保证LIF渗透藻酸盐小珠，其 被认为是“半固体”，且钙分布和多糖单元的排列都不均匀。小珠中存在钙和 藻酸盐梯度，该梯度从表面外壳(最高浓度)向小珠中心(弱胶凝区域) 展开(37)。这些浓度梯度可以解释为什么集落似乎在离小珠外壳500μm 处生长。所制备的藻酸盐小珠可渗透分子量为68kDa的蛋白(38)，可以 允许例如LIF的扩散(39；40)。通过在氯化钙溶液中进行凝胶作用6到10分 钟，每批制备600个小珠。藻酸盐的凝胶作用是反应-扩散过程，其中钙 和藻酸盐越过组成恒定(constant constituting)的边界相互扩散以形成名为 Ca++-藻酸盐凝胶网络的稳定结构。有理由认为小珠上的表面外壳始终形成 (因为所有小珠保持完整)，因此与氯化钙溶液接触时间较短的小珠形成 钙-藻酸盐梯度的时间较少，在小珠的中心具有更大的弱凝胶的区域(37)。
在胚状体形成培养基中培养5天后，藻酸盐小珠中集落大小显著增加， 在一些情况下直径达到400μm，而生存力没有明显降低。集落均匀生长于 小珠内离散的“口袋”中，据报道这更有益于生长(37)。即使我们包裹了未 分化的鼠胚胎干细胞，并且使用传统的悬浮方法没有形成胚状体，但在培 养3-8天期间Flk-1抗原在培养物中的表达证明发育出了中胚层(23；41)。
在骨生成早期(第15天)OB-钙粘蛋白的表达表明在三维培养物中存 在成骨细胞(42)。这些成骨细胞在第15天是存活的(酯酶活性)而且具 有代谢活性(脱氢酶活性)。在培养期间代谢活性变化不定。在形成骨的 分化开始时(第8天)，每个小珠的代谢活性高，在第15天达到低点，其 与ALPase活性达到最高水平而矿化接近其最低水平相关。随着骨生成进展 (15到29天)，观察到(每个小珠的)ALPase活性降低，矿化增强，这 与成骨细胞分化和生长的其它模型中所显示的一致(43)。除其它功能外， 骨骼组织中ALPase活性被认为增加局部无机磷酸盐水平，破坏羟基磷灰石 晶体生长抑制剂和帮助磷酸盐转运(44)。骨生成后期可能是成骨细胞被 捕获到分泌的基质中，并显著降低其代谢活动从而将资源转向矿化的阶段。 在22和29天ALPase活性的降低，矿化的增长以及每个细胞的低代谢活性 表明该阶段细胞表型可能为成熟成骨细胞的表型。在骨生成结束时(第29 天)检测到骨钙素、OB-钙粘蛋白和I型胶原蛋白的事实进一步证实了这 一点。Shimko等人(45)诱导鼠胚胎干细胞朝骨分化而没有胚状体形成， 导致的矿化如他们自己所承认的不被认为是常规的骨生成。他们报导骨钙 素和I型胶原的产生都被延迟，且ALPase活性与正常骨生成不一致。相反， 我们的数据证明发生了常规的三维骨生成，表现为ALPase的水平降低和表 达骨特异性蛋白，OB-钙粘蛋白在早至第15天即表达。
在胚胎骨中骨钙素的表达是短暂的，但是它是成人骨中最丰富的蛋白 之一，并以钙依赖的方式与羟磷灰石结合(46；47)。交织(woven)的骨表现 为不规则的胶原纤维束，巨大和众多的骨细胞，以及以不规则分布的小片 出现的延迟、杂乱的钙化(48)。本研究中，在第22和29天骨钙素以环形和 在三维组织聚集体边缘存在，这与微型-CT结果一致。这些观察结果提示藻 酸盐小珠中矿化组织由磷灰石晶体的浓缩(骨发育)形成，并且可能位于 骨样前沿的前缘(成人板层骨)。我们的数据推知细胞大部分为具有增殖 能力的成骨细胞(49)，并且已经堆积羟磷灰石。一般认为多能祖细胞分化为 成熟的骨细胞依照增殖、细胞外基质形成和矿化的阶段进行，其伴有见于 成熟骨小结中的少量凋亡(50)。
RT-PCR分析进一步证实存在末期分化的矿化骨组织，其具有骨生成的 终点的明显表型，该表型为表达Cbfa-l，I型胶原和骨钙素的有丝分裂活跃 的成熟成骨细胞(49；51)。在鼠胚胎干细胞的形成骨的分化期间表达胚胎II 型胶原(剪接变体A)是正常的(21；52)，并且类似的，也曾报道骨钙素在形 成骨的分化的第7天至第21天表达(53)，相当于本研究中的第15天至 第29天。缺少任何成熟的II型胶原(剪接变体B)表达表明不存在成人软 骨，及骨组织主要由I型胶原组成。
将这一方法改编用于人胚胎干细胞很可能导致其临床应用。尤其，对 于手术操作，例如腰椎骨脱离，其需要松质骨移植物以修补3-4mm的松解 术(54)，含有来自10，000个胚胎干细胞的44±7(平均值±SE，n＝2) 个矿化聚集体的单个藻酸盐小珠(直径＝2.3mm)可以提供足够的材料用 于修补这一缺陷。此外，可能直接注射充满矿化组织的藻酸盐凝胶进入到 缺损区域中(55-57)。本方法提供了不同于传统胚胎干细胞培养的引人注目 的有益的可选方法，消除了提供大规模三维组织用于临床应用的瓶颈。总 之，我们提供了一种用于从未分化鼠胚胎干细胞产生三维矿化组织的简单、 集成的方法，其最小限度的依赖操作者的介入，提供可重复的结果，易于 扩大规模和在线监控。
实施例5：被包裹的细胞的低温保存
使用Stensvaag等人(2004)记载的方法(59)，在冷冻步骤前逐渐增加 DMSO浓度。将低温试管进一步过度冷却至-7.5d℃，然后成核。其后，样 本以0.25℃/分钟的速率冷却，然后储存在液氮中。使用共焦显微镜定量 (CLSM)技术和NITS分析评估被包裹的细胞的生存力。
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