技术领域
[0001] 本
发明主要涉及骨-软骨界面损伤修复技术，尤其涉及一种双相组织工程支架。
背景技术
[0002] 创伤、分离性骨软骨炎、髌骨
软化症等所致的骨-软骨界面缺损在运动医学领域非常常见，骨软骨界面由软骨下骨、矿化的
纤维软骨及未矿化的纤维软骨三层结构构成。损伤后很难恢复到正常的三层组织结构，修复部位
力学性能较差，如何提高骨-软骨界面缺损后的修复
质量对于临床工作者来说是一个重大挑战。
[0003] 目前外科手术
治疗如微骨折、异体及自体移植等在一定程度上可以改进缺失修复的质量，但仍有明显的局限性需要解决，如缺损部位纤维组织的异常生长、传染
疾病、免疫排斥、供体短缺及供体部位
疼痛退变等，这些都对传统手术造成严重的不良影响。因此，除了提高手术技巧外，寻找一种新的有效的治疗方法促进骨软骨界面损伤修复是迫切和必要的。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服
现有技术的不足，提供一种制备简单、使用方便、能减少去细胞时间、可提高修复质量的双相组织工程支架。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种双相组织工程支架，包括由上至下依次叠放整合的骨支架和软骨支架，所述骨支架的一端设置为
骨固定包页部，骨支架的另一端横向切设有多片延伸至骨固定包页部的骨类书页片，各所述骨类书页片之间设有骨分化细胞片；所述软骨支架的一端设置为软骨固定包页部，软骨支架的另一端横向切设有多片延伸至软骨固定包页部的软骨类书页片，各所述软骨类书页片之间设有软骨分化细胞片；所述骨支架最底部的骨类书页片与软骨支架最顶部的软骨类书页片连接。
[0006] 作为上述技术方案的进一步改进：所述骨支架最底部的骨类书页片与软骨支架最顶部的软骨类书页片相互横向插接，该骨类书页片与软骨类书页片之间设有所述骨分化细胞片。
[0007] 所述骨支架最底部的骨类书页片与软骨支架最顶部的软骨类书页片之间涂附有纤维蛋白胶。
[0008] 所述骨支架和软骨支架沿边沿通过缝线缝制为一体。
[0009] 所述缝线设置为可降解手术缝线。
[0010] 所述骨支架和软骨支架的四周相互平齐。
[0011] 所述骨类书页片和软骨类书页片的上下表面均设有多肽涂层。
[0012] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的双相组织工程支架，包括由上至下依次叠放整合的骨支架和软骨支架，骨支架的一端设置为骨固定包页部，骨支架的另一端横向切设有多片延伸至骨固定包页部的骨类书页片，各骨类书页片之间设有骨分化细胞片；软骨支架的一端设置为软骨固定包页部，软骨支架的另一端横向切设有多片延伸至软骨固定包页部的软骨类书页片，各软骨类书页片之间设有软骨分化细胞片；骨支架最底部的骨类书页片与软骨支架最顶部的软骨类书页片连接。本发明的双相组织工程支架，能将体外构建的骨-软骨组织工程
复合体移植到骨软骨界面损伤部位用以修复组织缺损，在缺损部位可以再生一个正常的组织梯度结构，这样就可提高骨软骨界面损伤的修复质量；类书页结构的支架不仅可以保留组织的结构和基质成分，还利于细胞的迁移、增殖及分化，因而可以促进缺损组织的再生与愈合，而且还可以有效地
加速组织的去细胞过程，减少去细胞时间；可以根据修复部位的组织形状将双相书页组织工程支架修建成适当的形状后置于缺损部位便于缝合固定，其制备简单、使用方便。
附图说明
[0013] 图1是本发明的主视结构示意图。
[0014] 图2是本发明的俯视结构示意图。
[0015] 图3是本发明中骨支架的主视结构示意图。
[0016] 图中各标号表示：1、骨支架；11、骨固定包页部；12、骨类书页片；13、骨分化细胞片；2、软骨支架；21、软骨固定包页部；22、软骨类书页片；23、软骨分化细胞片；4、纤维蛋白胶；5、缝线；6、多肽涂层。
具体实施方式
[0017] 以下将结合
说明书附图和具体
实施例对本发明做进一步详细说明。
[0018] 如图1至图3所示，本发明双相组织工程支架的一种实施例，包括由上至下依次叠放整合的骨支架1和软骨支架2，骨支架1的一端设置为骨固定包页部11，骨支架1的另一端横向切设有多片延伸至骨固定包页部11的骨类书页片12，各骨类书页片12之间设有骨分化细胞片13；软骨支架2的一端设置为软骨固定包页部21，软骨支架2的另一端横向切设有多片延伸至软骨固定包页部21的软骨类书页片22，各软骨类书页片22之间设有软骨分化细胞片23；骨支架1最底部的骨类书页片12与软骨支架2最顶部的软骨类书页片22连接。本发明的双相组织工程支架，能将体外构建的骨-软骨组织工程复合体移植到骨软骨界面损伤部位用以修复组织缺损，在缺损部位可以再生一个正常的组织梯度结构，这样就可提高骨软骨界面损伤的修复质量；类书页结构的支架不仅可以保留组织的结构和基质成分，还利于细胞的迁移、增殖及分化，因而可以促进缺损组织的再生与愈合，而且还可以有效地加速组织的去细胞过程，减少去细胞时间；可以根据修复部位的组织形状将双相书页组织工程支架修建成适当的形状后置于缺损部位便于缝合固定，其制备简单、使用方便。
[0019] 本实施例中，骨支架1最底部的骨类书页片12与软骨支架2最顶部的软骨类书页片22相互横向插接，该骨类书页片12与软骨类书页片22之间设有骨分化细胞片13。该结构中，骨支架1最底部的骨类书页片12与软骨支架2最顶部的软骨类书页片22相互横向插接，形成了反向互补交叉，这样设置大大提稿各相之间的整合连接性能，防止了发生各相的错位移动。
[0020] 本实施例中，骨支架1最底部的骨类书页片12与软骨支架2最顶部的软骨类书页片22之间涂附有纤维蛋白胶4。该纤维蛋白胶4的设置进一步提高了各相之间的整合力。
[0021] 本实施例中，骨支架1和软骨支架2沿边沿通过缝线5缝制为一体。该缝线5的设置同样是为了使各相之间连接更为稳定可靠。
[0022] 本实施例中，缝线5设置为可降解手术缝线。可降解手术缝线在修复后，能自动降解，不需要进行拆线，提高了方便性。
[0023] 本实施例中，骨支架1和软骨支架2的四周相互平齐。这样设置，使得该双相组织工程支架形成了矩形体结构，便于实施。
[0024] 本实施例中，骨类书页片12和软骨类书页片22的上下表面均设有多肽涂层6。通过多肽涂层6的表面改性处理，能促进各类细胞片的生长。
[0025] 本发明双相组织工程支架的构建原理如下：1、骨、软骨组织样本获取。
[0026] 获取同种异体或异种骨与纤维软骨，切割成长方体。
[0027] 2、制备骨、软骨组织书页支架。
[0028] 2.1、骨组织脱
钙：骨组织置于广口瓶中，
有机酸脱钙液完全浸泡样本，37℃，每周取出样本，更换新脱钙液，直至完成脱钙。用物理检测方法判定是否脱钙完全，当骨
块外观趋于透明，易弯曲，用1mL
注射器针头可轻松插入样本，表明脱钙已完全。
[0029] 2.2 、“书页”多层组织薄片技术制备支架：将完全脱钙的骨块、软骨组织，用5％NaHCO3漂洗3次，每次5min，PBS液漂洗3次，每次5min。设置
冰冻
温度－22℃。将组织块切割成长方体，将组织块平放在冰冻切片机组织支承器上，滴加少量OCT冰冻切片
包埋剂，并将骨片压平，滴加OCT包埋剂将组织块完全包埋，迅速将样本置入冰冻切片机冰冻固定。将组织支承器固定在切片机持承器上，样本长轴延长线与刀片垂直。将切片厚度设置为30-150μm，按微调按钮将标本调整到接近刀片的
位置，缓慢顺
时针方向旋转手动旋钮，刀片行进至组织块上端1/4处，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定的切片厚度，再次顺时针方向旋转手动旋钮至刀片行进到骨块上端1/4处，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定切片厚度，如此反复进行，可获得一端切开，一端带柄的 “书页”状组织支架。支架每页厚度30-150μm，不少于10页，两种书页支架的最终大小均一样。将切好的书页状支架置于去离子
水中漂洗3次，每次5min，去除OCT包埋剂。
[0030] 2.3、骨、软骨支架去细胞处理：样本以4℃ PBS冲洗3次，每次10min，
滤纸吸除样本表面水分；将样本用纱布包裹，置入液氮冰冻，10min，取出后立即行37℃水浴，10 min，反复交替3个循环；冻融循环后的书页支架置于含2%的十二烷基
硫酸钠（SDS）溶液中，置于摇床上，振荡4h，37℃；样本取出后PBS振荡漂洗，12h，4℃；将样本置于0.1％Triton X-100-1.5MKCL溶液中，12小时，4℃；将样本置于10mM Tris 漂洗3h， PBS漂洗，3h，4℃；标本置于
0.25%胰蛋白酶, 24h， PBS漂洗 24h, 37℃；标本置于核酸酶液（含DNA酶deoxyribonuclease I， 500 U/mL，RNA酶ribonuclease A，1 mg/mL），12h，37℃；样本取出后PBS漂洗24h，样本放-80℃
冰箱保存。
[0031] 2.4、骨、软骨支架表面涂层改性：将骨、软骨书页支架置于浸渍液中进行表面改性处理，所述浸渍液为多肽溶于PBS缓冲液后配制得到，表面改性处理完成后取出得到表面改性后的支架，无菌条件下冻干备用。
[0032] 2.5、将向骨、软骨方向分化的骨髓间充质干细胞片分别种植于相应的表面改性后的支架中：将骨髓间充质干细胞以每平方厘米1×104的细胞
密度种植于培皿，在37℃、5％CO2 饱和湿度
培养箱内进行培养，每隔 2-3天常规换液。向骨方向诱导分化培养基：高糖DMEM, 10% FBS, 100 nM 地塞米松，50 μM 维生素C, 10 mM 甘油
磷酸钠(β-GP)，诱导2 周后形成细胞片，再将细胞片分别种植于骨书页支架的各层。向软骨方向诱导分化培养基：高糖DMEM，10% FBS，10 ng/mlTGF-β3，100 nM 地塞米松，50 μM 维生素C, 10 mM 甘油磷酸钠(β-GP) ，诱导2 周后形成细胞片，再将细胞片分别种植于软骨书页支架的各层。支架在接种干细胞片前先用钴60消毒后再用相应诱导培养液浸泡6h。
[0033] 2.6、将种植了细胞片的支架反向互补交叉进行
叠加构建骨-软骨双相组织工程支架复合体：将种植了干细胞片的骨、软骨支架，采用“书页”反向互补交叉的原理，制造双相（骨、软骨）2层复合支架，上层为一本骨多层薄片，再反向互补交叉一本软骨多层薄片，形成骨-软骨双相组织工程支架复合体，在不同相结合部位涂纤维蛋白胶以促进不同相的整合。
[0034] 2.7、用可降解手术缝线将双相组织缝合在一起：完成支架整合后，使用可降解手术缝线将双相不同支架缝合在一起，避免支架错开。
[0035] 虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或
修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。
