转化微生物如巴斯德毕赤酵母中多亚基蛋白如抗体的高滴度和高纯度生成的多拷贝方案
阅读：787发布：2021-10-10
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1.一种鉴定生成更高产量的所需多亚基复合物的宿主细胞的方法，其包括：
(a)提供一组宿主细胞，所述组包含各自包含为表达多亚基复合物的亚基而提供的基因的至少两种宿主细胞；
其中所述至少两种宿主细胞各自通过两种亲本细胞的交配或融合而生成，其中每种亲本细胞包含编码所述多亚基复合物的亚基的至少一个基因的一个或多个拷贝；
(b)培养每种所述宿主细胞以表达多亚基复合物，其中所述至少两种宿主细胞中的基因是为不同水平表达所述多亚基复合物的至少一个亚基而提供；
(c)测量每种所述宿主细胞生成的多亚基复合物的产量；和
(d)鉴定所述宿主细胞组中生成比另一种宿主细胞更高的产量的宿主细胞为生成更高产量的所需多亚基复合物的宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体，并且为表达多亚基复合物的亚基而提供的所述基因包含编码所述所需抗体的轻链和重链的基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述筛选的细胞组包括表达编码包含多亚基复合物的亚基的基因的不同拷贝数组合的宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达15个拷贝的细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达12个拷贝的细胞。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于另一亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达10个拷贝的细胞。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达8个拷贝的细胞。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达6个拷贝的细胞。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码为抗体的多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达10个拷贝的细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为二倍体酵母细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述二倍体酵母为毕赤酵母细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母细胞。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述二倍体酵母细胞为甲基营养型酵母、毕赤酵母属的酵母、巴斯德毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母或Pichia inositovera。
14.一种鉴定生成更高纯度的所需多亚基复合物的宿主细胞的方法，其包括：
(a)提供一组宿主细胞，所述组包含各自包含为表达多亚基复合物的亚基而提供的基因的至少两种宿主细胞；
其中所述至少两种宿主细胞各自通过两种亲本细胞的交配或融合而生成，其中每种亲本细胞包含编码所述多亚基复合物的亚基的至少一个基因的一个或多个拷贝；
(b)培养每种所述宿主细胞以表达多亚基复合物，其中所述至少两种宿主细胞中的基因是为不同水平表达所述多亚基复合物的至少一个亚基而提供；
(c)测量每种所述宿主细胞生成的多亚基复合物的纯度；和
(d)鉴定所述宿主细胞组中生成比另一种宿主细胞更高的纯度的宿主细胞为生成更高纯度的所需多亚基复合物的宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体，并且为表达多亚基复合物的亚基而提供的所述基因包含编码所述所需抗体的轻链和重链的基因。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过测量一条或多条糖基化抗体链的相对比例测定所述纯度。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一条或多条糖基化抗体链包括糖基重链变体。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述筛选的细胞组包括表达编码包含多亚基复合物的亚基的基因的不同拷贝数组合的宿主细胞。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达15个拷贝的细胞。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达12个拷贝的细胞。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达10个拷贝的细胞。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达8个拷贝的细胞。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达6个拷贝的细胞。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞组包括表达编码为抗体的多亚基复合物并且代表每个亚基相对于其它亚基的大体上所有可能的拷贝数组合的每个基因的多达10个拷贝的细胞。
25.根据权利要求14-24中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为二倍体酵母细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述二倍体酵母为毕赤酵母属细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述毕赤酵母属为巴斯德毕赤酵母细胞。
28.一种鉴定生成更高产量的所需多亚基复合物的宿主细胞的方法，其包括：
(a)提供一组宿主细胞，所述组包含各自包含不同拷贝数的为表达多亚基复合物的亚基而提供的一个或多个基因的至少两种宿主细胞：
(b)培养每种所述宿主细胞以表达多亚基复合物；
(c)测量每种所述宿主细胞生成的多亚基复合物的产量；和
(d)鉴定所述宿主细胞组中生成比另一种宿主细胞更高的产量的宿主细胞为生成更高产量的所需多亚基复合物的宿主细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体，并且为表达多亚基复合物的亚基而提供的所述基因包含编码所述所需抗体的轻链和重链的基因。
30.一种鉴定生成更高纯度的所需多亚基复合物的宿主细胞的方法，其包括：
(a)提供一组宿主细胞，所述组包含各自包含不同拷贝数的为表达多亚基复合物的亚基而提供的一个或多个基因的至少两种宿主细胞：
(b)培养每种所述宿主细胞以表达多亚基复合物；
(c)测量每种所述宿主细胞生成的多亚基复合物的纯度；和
(d)鉴定所述宿主细胞组中生成比另一种宿主细胞更高的纯度的宿主细胞为生成更高纯度的所需多亚基复合物的宿主细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体，并且为表达多亚基复合物的亚基而提供的所述基因包含编码所述所需抗体的轻链和重链的基因。
32.根据权利要求31所述的方法，其中通过测量一条或多条糖基化抗体链的相对比例测定所述纯度。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述一条或多条糖基化抗体链包括糖基重链变体。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为二倍体酵母细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述二倍体酵母细胞为甲基营养型酵母、毕赤酵母属的酵母、巴斯德毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母或Pichia inositovera。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述宿主细胞组通过含不同拷贝数的编码所述多亚基复合物的一个或多个亚基的基因的单倍体细胞交配或融合而生成，从而所述交配生成含不同拷贝数的编码所述多亚基复合物的亚基的基因的二倍体细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中为表达多亚基复合物的亚基而提供的所述基因整合至所述单倍体细胞的基因组中。
38.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为多倍体酵母细胞。
39.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为四倍体酵母细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述二倍体酵母细胞为甲基营养型酵母、毕赤酵母属的酵母、巴斯德毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母或Pichia inositovera。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述宿主细胞组通过含不同拷贝数的编码所述多亚基复合物的一个或多个亚基的基因的二倍体细胞交配或融合而生成，从而所述交配生成含不同拷贝数的编码所述多亚基复合物的亚基的基因的四倍体细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中为表达多亚基复合物的亚基而提供的所述基因整合至所述二倍体细胞的基因组中。
43.根据前述任何权利要求所述的方法，其中所述经鉴定的宿主细胞用于研发生产培养物。
44.根据前述任何权利要求所述的方法，其中所述宿主细胞为真核细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述真核细胞为酵母细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述亲本细胞各自为单倍体、二倍体或多倍体酵母细胞。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述酵母细胞为甲基营养型酵母。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述甲基营养型酵母为毕赤酵母属。
49.根据权利要求48所述的方法，其中毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母为巴斯德毕赤酵母。
50.根据权利要求48所述的方法，其中毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母选自：安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和Pichia inositovera。
51.根据权利要求48所述的方法，其中为表达多亚基复合物的亚基而提供的所述基因整合到选自pGAP、3’AOX TT、PpURA5、OCH1、AOX1、HIS4、GAP、ARG和HIS4TT基因座的一个或多个基因组座位中。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码多亚基复合物的所述亚基的所述基因中的至少一个在诱导型或组成型启动子的控制下表达。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述诱导型启动子选自GAP、CUP1、AOX1和FLD1启动子。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码多亚基复合物的所述亚基的所述基因中的至少一个在选自以下的启动子的控制下表达：AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5和Pyk启动子、源自其中的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为二倍体或四倍体细胞。
56.根据任何前述权利要求所述的方法，其中从所述细胞或从培养基中纯化所述所需多亚基复合物。
57.根据权利要求56所述的方法，其中从所述细胞的细胞内组分、细胞质、核质或膜纯化所述所需多亚基复合物。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述宿主细胞将所述所需多亚基复合物分泌至培养基中。
59.根据权利要求58所述的方法，其中从所述培养基中纯化所述所需多亚基复合物。
60.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物为单特异性或双特异性抗体。
61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少两种宿主细胞包含不同拷贝数的编码所述多亚基复合物的亚基的基因。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述组中至少一种宿主细胞包含编码多亚基复合物的至少一个亚基的所述基因的至少2个拷贝。
63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组中至少一种宿主细胞包含编码多亚基复合物的至少一个亚基的基因，所述基因的表达受与驱动所述组中不同宿主细胞中的相应基因的表达的启动子不同的启动子驱动。
64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组中至少一种宿主细胞包含含一个以上编码多亚基复合物的亚基的序列的多顺反子基因。
65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含与IL-6、TNF-α、CGRP、PCSK9或NGF特异性结合的抗体。
66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含人抗体或人源化抗体或其片段。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述人源化抗体为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或牛来源。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述人源化抗体为兔来源。
69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含单价、二价或多价抗体。
70.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组中的至少一种所述宿主细胞中为表达所述多亚基复合物的亚基而提供的至少一个所述基因经优化在所述宿主细胞中表达。
71.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体并且通过测量所述宿主细胞生成的非糖基化、含在具有预计表观流体动力学半径的抗体复合物中和／或特异性结合所述所需抗体的靶标的所需抗体的分数来评估所述所需抗体的纯度。
72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体并且通过测定所述宿主细胞生成的扣除经糖基化、含在除具有预计表观流体动力学半径的复合物外的抗体复合物中和／或不能与所述所需抗体的靶标特异性结合的任何产物相关变体的所需抗体的量来评估所述所需抗体的产量。
73.一种重组生成所需多亚基复合物的方法，其包括：
(a)提供包含编码多亚基复合物的每个亚基的一个或多个基因的宿主细胞，通过根据前述权利要求中任一项所述的方法鉴定所述宿主细胞为生成更高产量和／或纯度的所需多亚基复合物的宿主细胞；和
(b)培养所述宿主细胞以表达所述多亚基复合物。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体。
75.根据权利要求74所述的方法，进一步包括纯化所述所需抗体。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述宿主细胞产生至少100mg／L、至少
150mg／L、至少200mg／L、至少250mg／L、至少300mg／L、介于100和300mg／L之间、介于100和500mg／L之间、介于100和1000mg／L之间、至少1000mg／L、至少1250mg／L、至少1500mg／L、1750mg／L、2000mg/L或更高的抗体滴度。
77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定20代。
78.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定50代。
79.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定100代。
80.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定500代。
81.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定1000代。
82.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所述多亚基复合物的至少一个亚基的基因拷贝整合到两个或更多个基因座中。
83.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所述多亚基复合物的至少一个亚基的基因拷贝整合到三个或更多个基因座中。
84.根据权利要求82或83所述的方法，其中每个基因座含有给定亚基的不超过5个拷贝。
85.根据权利要求82或83所述的方法，其中每个基因座含有给定亚基的不超过4个拷贝。
86.根据权利要求82或83所述的方法，其中每个基因座含有给定亚基的不超过3个拷贝。
87.一种宿主细胞，其根据权利要求1-86中任一项所述的方法鉴定为生成更高产量和／或纯度的所需多亚基复合物的宿主细胞，其中所述宿主细胞通过两种亲本细胞的交配或融合而生成，其中每种亲本细胞包含编码所述多亚基复合物的亚基的至少一个基因的一个或多个拷贝。
88.根据权利要求77所述的宿主细胞，其中各自编码所述多亚基复合物的亚基的两个不同基因的每一个的至少一个拷贝整合到所述宿主细胞两条同源染色体的同一基因座中。
89.根据权利要求87或88所述的宿主细胞，其为毕赤酵母属的二倍体或四倍体细胞。
90.根据权利要求89所述的宿主细胞，其为巴斯德毕赤酵母细胞。
91.一种二倍体或四倍体酵母培养物，其源自根据权利要求87-90中任一项所述的宿主细胞。
92.根据权利要求87-91中任一项所述的宿主细胞，其中为表达所述所需多亚基复合物而提供的基因中的至少一个整合到所述宿主细胞的基因组中。
93.根据权利要求87-92中任一项所述的宿主细胞，其中为表达所述所需多亚基复合物而提供的基因中的至少一个含在一个或多个染色体外元件、质粒或人工染色体中。
94.根据权利要求87-93中任一项所述的宿主细胞，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体。
95.根据权利要求94所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含比为表达所述所需抗体的重链而提供的基因的拷贝更多的为表达所述所需抗体的轻链而提供的基因的拷贝。
96.根据权利要求94所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含比为表达所述所需抗体的轻链而提供的基因的拷贝更多的为表达所述所需抗体的重链而提供的基因的拷贝。
97.根据权利要求94所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含与为表达所述所需抗体的重链而提供的基因的拷贝数相等的为表达所述所需抗体的轻链而提供的基因的拷贝数。
98.根据权利要求94所述的宿主细胞，其包含编码所述所需抗体的轻链的基因的1-10个拷贝和编码所述所需抗体的重链的基因的1-10个拷贝。
99.根据权利要求94所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞中编码所述所需抗体的重链的基因的拷贝数和编码所述所需抗体的轻链的基因的拷贝数各自为：2和2、2和3、3和3、
3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。
100.根据权利要求94所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞中编码所述所需抗体的重链的基因的拷贝数和编码所述所需抗体的轻链的基因的拷贝数各自为：2和1、3和1、4和
1、5和1、6和1、7和1、8和1、9和1、10和1、1和2、2和2、3和2、4和2、5和2、6和2、7和
2、8和2、9和2、10和2、1和3、2和3、3和3、4和3、5和3、6和3、7和3、8和3、9和3、10和3、1和4、2和4、3和4、4和4、5和4、6和4、7和4、8和4、9和4、10和4、1和5、2和5、3和5、4和5、5和5、6和5、7和5、8和5、9和5、10和5、1和6、2和6、3和6、4和6、5和6、6和6、7和6、8和6、9和6、10和6、1和7、2和7、3和7、4和7、5和7、6和7、7和7、8和7、
9和7、10和7、1和8、2和8、3和8、4和8、5和8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、1和
9、2和9、3和9、4和9、5和9、6和9、7和9、8和9、9和9、10和9、1和10、2和10、3和10、
4和10、5和10、6和10、7和10、8和10、9和10、10和10。
101.根据权利要求87-100中任一项所述的宿主细胞，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定20代。
102.根据权利要求87-100中任一项所述的宿主细胞，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定50代。
103.根据权利要求87-100中任一项所述的宿主细胞，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定100代。
104.根据权利要求87-100中任一项所述的宿主细胞，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定500代。
105.根据权利要求87-100中任一项所述的宿主细胞，其中编码所需多亚基复合物的基因的拷贝数和／或所述所需多亚基复合物的产量稳定1000代。
106.根据权利要求87-105中任一项所述的宿主细胞，其中编码所述多亚基复合物的至少一个亚基的基因拷贝整合到两个或更多个基因座中。
107.根据权利要求87-105中任一项所述的宿主细胞，其中编码所述多亚基复合物的至少一个亚基的基因拷贝整合到三个或更多个基因座中。
108.根据权利要求106或107所述的宿主细胞，其中每个基因座含有给定亚基的不超过5个拷贝。
109.根据权利要求104或105所述的宿主细胞，其中每个基因座含有给定亚基的不超过4个拷贝。
110.根据权利要求106或107所述的宿主细胞，其中每个基因座含有给定亚基的不超过3个拷贝。
111.根据权利要求91所述的酵母培养物，其在生产培养基中生长。
112.根据权利要求111所述的培养物，其中所述生产培养基为基本培养基。
113.根据权利要求112所述的培养物，其中所述基本培养基缺乏选择剂。
114.根据权利要求112所述的培养物，其中所述基本培养基缺乏预先形成的氨基酸或其它复合生物分子。
115.根据权利要求91所述的培养物，其生长至高细胞密度。
116.根据权利要求115所述的培养物，其中所述高细胞密度为至少50g／L。
117.根据权利要求115所述的培养物，其中所述高细胞密度为至少100g／L。
118.根据权利要求115所述的培养物，其中所述高细胞密度为至少300g／L。
119.根据权利要求115所述的培养物，其中所述高田包密度为至少400g／L。
120.根据权利要求115所述的培养物，其中所述高细胞密度为至少500g／L。
121.根据权利要求115所述的培养物，其中所述高细胞密度为至少750g／L。
122.根据权利要求91所述的培养物，其中培养所述酵母细胞至少20次倍增并且在所述至少20次倍增后维持所述所需多亚基复合物的高水平表达。
123.根据权利要求91所述的培养物，其中培养所述酵母细胞至少50次倍增并且在所述至少50次倍增后维持所述所需多亚基复合物的高水平表达。
124.根据权利要求91所述的培养物，其中培养所述酵母细胞至少100次倍增并且在所述至少100次倍增后维持所述所需多亚基复合物的高水平表达。
125.根据权利要求122-124中任一项所述的培养物，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体。
126.一种培养基，其含有源自根据权利要求1-86中任一项所述的方法生成的细胞的稳定二倍体毕赤酵母培养物，其中所述培养基包含至少约50mg／L、100mg／L、500mg／L或1000mg／L、1500mg／L或更高表达水平的所述所需多亚基复合物。
127.一种培养基，其含有源自根据权利要求1-86中任一项所述的方法生成的向培养基中表达所述所需多亚基复合物的细胞的稳定二倍体巴斯德毕赤酵母培养物，其中所述培养物中所述二倍体细胞的细胞密度为至少约50g／L、100g／L、300g／L、400g／L、
500g／L、700g／L或更高。
128.根据权利要求126或127所述的培养基，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体。
129.根据前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述所需多亚基复合物的至少一个亚基包含分泌信号。
130.根据权利要求129所述的方法或组合物，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体。
131.根据权利要求129或130所述的方法或组合物，其中所述分泌信号包含选自以下的多肽：鸡溶菌酶(CLY)信号肽、CLY-L8、酿酒酵母转化酶(SUC2)信号肽、MF-α(Prepro)、MF-α(Pre)-apv、MF-α(Pre)-apv-SLEKR、MF-α(Prepro)-(EA)3、αF信号肽、KILM1信号肽、阻抑性酸性磷酸酶(PHO1)信号肽、黑曲霉GOX信号肽、西方许旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAM1)信号肽、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽、无前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽、ISN信号肽、IFN信号肽、HGH信号肽、植物血球凝集素(PHA)、蚕溶菌酶、人溶菌酶(LYZ1)、1型激活素受体、II型激活素受体、巴斯德毕赤酵母免疫球蛋白结合蛋白(PpBiP)、人抗体3D6轻链前导序列及其任何组合。
132.根据前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述亲本细胞各自为单倍体、二倍体或多倍体酵母细胞。
133.一种重组生成所需多亚基复合物的方法，其包括：
(a)提供包含编码所述所需多亚基复合物的每个亚基的基因的2-10个拷贝的宿主细胞；和
(b)培养所述宿主细胞以表达编码所述所需多亚基复合物的每个亚基的所述基因，其中所述宿主细胞通过两种亲本细胞的交配或融合而生成，其中每种亲本细胞包含编码所述多亚基复合物的一个或多个亚基的基因的一个或多个拷贝。
134.一种重组生成所需多亚基复合物的方法，其包括：
(a)提供包含编码所述所需多亚基复合物的每个亚基的基因的2-10个拷贝的宿主细胞；和
(b)培养所述宿主细胞以表达编码所述所需多亚基复合物的每个亚基的所述基因。
135.根据权利要求133或134所述的方法，其中各自编码所述多亚基复合物的亚基的两个不同基因的每一个的至少一个拷贝整合到所述宿主细胞两条同源染色体的同一基因座中。
136.根据权利要求133-135中任一项中所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体。
137.根据权利要求133-136中任一项中所述的方法，其中所述宿主细胞为真核细胞。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述真核细胞为酵母细胞。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述酵母细胞为甲基营养型酵母。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述甲基营养型酵母为毕赤酵母属。
141.根据权利要求140所述的方法，其中毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母为巴斯德毕赤酵母。
142.根据权利要求140所述的方法，其中毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母选自安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和Pichia inositovera。
143.根据权利要求140所述的方法，其中为表达所述多亚基复合物的亚基而提供的所述基因的至少一个整合到选自pGAP基因座和HIS4TT基因座的一个或多个基因组座位中。
144.根据权利要求133-143中任一项所述的方法，其中编码所述所需多亚基复合物的所述基因中的至少一个在诱导型或组成型启动子的控制下表达。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述诱导型启动子选自GAP、AOX1、CUP1和FLD1启动子。
146.根据权利要求133-145中任一项所述的方法，其中编码所述所需抗体轻链和／或重链的所述基因中的至少一个在选自以下的启动子的控制下表达：AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5和Pyk启动子、源自其中的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
147.根据权利要求133-146中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为二倍体或四倍体细胞。
148.根据权利要求133-147中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞向培养基中分泌所述所需抗体。
149.根据权利要求133-148中任一项所述的方法，其中所述所需抗体为单特异性或双特异性抗体。
150.根据权利要求133-149中任一项所述的方法，其中所述所需抗体与IL-6、TNF-α、CGRP、PCSK9或NGF特异性结合。
151.根据权利要求133-150中任一项所述的方法，其中所述所需抗体为人抗体或人源化抗体或其片段。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述人源化抗体为兔来源。
153.根据权利要求133-152中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含单价、二价或多价抗体。
154.根据权利要求133-153中任一项所述的方法，其中编码所述所需多亚基复合物的亚基的基因的至少一个所述拷贝经优化在所述宿主细胞中表达。
155.根据权利要求133-154中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物包含所需抗体并且编码所述所需抗体的轻链的基因的拷贝数大于或等于编码所述所需抗体的重链的基因的所述拷贝数。
156.根据权利要求133-155中任一项所述的方法，其生成所述所需多亚基复合物的产量比含有编码所述所需多亚基复合物的亚基的每个基因的单个拷贝的菌株更高。
157.根据权利要求133-156中任一项所述的方法，其生成所述所需多亚基复合物的纯度比含有编码所述所需多亚基复合物的亚基的每个基因的单个拷贝的菌株更高。
158.根据权利要求157所述的方法，其中所需多亚基复合物包含所需抗体并且通过测量糖基化重和／或轻链多肽的质量占重和／或轻链多肽总质量的百分比测定所述纯度。
159.根据权利要求133-158中任一项所述的方法，其中所述所需多亚基复合物的至少一个亚基包含分泌信号。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述分泌信号包含选自以下的多肽：
鸡溶菌酶(CLY)信号肽、CLY-L8、酿酒酵母转化酶(SUC2)信号肽、MF-α(Prepro)、MF-α(Pre)-apv、MF-α(Pre)-apv-SLEKR、MF-α(Prepro)-(EA)3、αF信号肽、KILM1信号肽、阻抑性酸性磷酸酶(PHO1)信号肽、黑曲霉GOX信号肽、西方许旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAM1)信号肽、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽、无前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽、ISN信号肽、IFN信号肽、HGH信号肽、植物血球凝集素(PHA)、蚕溶菌酶、人溶菌酶(LYZ1)、1型激活素受体、II型激活素受体、巴斯德毕赤酵母免疫球蛋白结合蛋白(PpBiP)、人抗体3D6轻链前导序列及其任何组合。
转化微生物如巴斯德毕赤酵母中多亚基蛋白如抗体的高滴
度和高纯度生成的多拷贝方案
[0001] 相关申请的公开
[0002] 本申请要求2011年8月19日提交的标题为“MULTI-COPY STRATEGY FORHIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS
ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS”的 美 国 序 列No.61/525,307(代理人案号67858.730200)的权益，并且是标题为“HIGH-PURITY
PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS”并于2012年5月8日提交的美国序列No.13／466,795(代理人案号75820.711001)的部分继续申请，其各自据此通过引用整体并入。
ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS”的 美 国 序 列No.61/525,307(代理人案号67858.730200)的权益，并且是标题为“HIGH-PURITY
PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS”并于2012年5月8日提交的美国序列No.13／466,795(代理人案号75820.711001)的部分继续申请，其各自据此通过引用整体并入。
[0003] 本申请包括于2012年8月16日创建的名称为“67858o730201.txt”并且大小为43,651个字节的文件中，经EFS-Web，以ASCII格式提交的序列表，其据此通过引用整体并入。
[0004] 领域
[0005] 本公开通常涉及在转化细胞中生成异源蛋白的方法。具体而言，本公开提供了生成可能或可能不被分泌的多亚基蛋白，包括抗体和其它多亚基蛋白例如激素和受体的改进方法，产量更高而且不需要的副产物生成减少。在示例性实施方案中，所述转化细胞为酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0006] 背景
[0007] 常规抗体是由两条相同轻链和两条相同重链构成的四聚体蛋白。特定类型的纯净人抗体可能难以或不可能从天然来源纯化足够量用于许多目的。因此，生物技术和制药公司已经转向基于重组DNA的方法以大规模制备抗体。功能性抗体的生成通常不仅牵涉两个多肽的合成，而且还牵涉许多翻译后事件，包括N端分泌信号序列的蛋白水解加工；多肽恰当折叠并组装成四聚体；二硫键的形成；并且通常包括特异性N连接糖基化。所有这些事件均在真核细胞分泌途径，真核细胞独有的细胞器官复合体中发生。
[0008] 此类复合蛋白的重组合成通常已依赖高等真核细胞的培养物以用培养的极常用的哺乳动物细胞生成生物活性材料。然而，相对于微生物发酵方法，基于哺乳动物组织培养的生产系统招致费用和并发症明显增加。另外，源自哺乳动物细胞培养的产物可能需要另外的安全测试以确保在培养中使用的培养细胞或动物源产物，例如血清中没有可能存在的哺乳动物病原体(包括病毒)。
[0009] 先前的工作已经帮助建立了巴斯德毕赤酵母作为有成本效益的平台，以生成可能适合研究、诊断和治疗使用的功能性抗体。见共有美国专利7,935,340和7,927,863，其各自通过引用整体并入本文。在文献中也已知设计并优化巴斯德毕赤酵母发酵以表达重组蛋白的方法，包括优化细胞密度、肉汤体积、底物给料速度和每个反应期的长度。见Cregg，J.M.编辑，2007，Pichia Protocols(第2版)中Zhang等，“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations”，Methods in Molecular Biology，第389卷，Humana Press，Totowa，N.J.，第43-63页。
[0010] 虽然可由培养的细胞生成重组多亚基蛋白，但是也可能生成不需要的副产物。例如，培养的细胞可生成所需多亚基蛋白，连同游离单体、具有不正确化学计量的复合物或具有不需要或异常糖基化的蛋白。所需多亚基蛋白的纯化可增加生产成本，并且纯化中牵涉的步骤可降低活性复合物的总产量。而且，即使在纯化之后，也可能存在引起关注的量的不需要副产物。例如，可能存在施用后增加免疫反应风险的量的糖基化副产物，而异常复合物或聚集物可能降低比活性并且也可能具潜在免疫原性。
[0011] 概述
[0012] 本公开提供了为了以更高产量，重组生成多亚基蛋白(例如抗体、激素和受体)和其它多亚基复合物而提供的物质的改进方法和组成。这些多亚基多肽可包含可能相同或不同的2个或更多个亚基(即，均聚或杂聚多肽)。在示例性实施方案中，使用本文公开的方法可增加此类多亚基蛋白的分泌或细胞内产量至少50％、至少100％或更高(相对于常规方法)。
[0013] 本公开还提供了为了重组生成抗体和其它多亚基蛋白而提供的物质的改进方法和组成，不需要的副产物生成减少。在示例性实施方案中，不需要的副产物可为糖基化蛋白，例如糖基化抗体重链，其相对丰度与初始丰度水平(相对于常规方法)相比，使用本文公开的方法可降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或降到不可检测的水平。其相对丰度可能如此降低的示例性不需要的副产物可包括表观分子量与所需多亚基复合物不同的一个或多个种类。例如，表观分子量可受化学计量法、折叠、复合物组装和／或糖基化的差异影响。例如，此类不需要的副产物可使用尺寸排阻色谱法和／或凝胶电泳检测，并且可具有比所需多亚基复合物更高或更低的表观分子量。在示例性实施方案中，可在还原条件下检测不需要的副产物。在其它示例性实施方案中，可在非还原条件下检测不需要的副产物。
[0014] 在示例性实施方案中，本公开还提供了为了以更高产量重组生成抗体和其它多亚基复合物而提供的物质的改进方法和组成。在示例性实施方案中，可使用本文公开的方法增加产量至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或更高(相对于常规方法)。
[0015] 在示例性实施方案中，在其中可生成多亚基蛋白的宿主细胞可为酵母，例如毕赤酵母物种如巴斯德毕赤酵母或另一种甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)，或酵母物种例如酿酒酵母(S.cerevisiae)，或另一种酵母例如裂殖酵母(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe))。在本发明中可利用的甲基营养型酵母的其它实例包括安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)(在本领域中也称为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha))、季也蒙毕赤酵母(pichia guillermordii)、甲醇毕赤酵母(Pichia
methanolica)、Pichia inositovera、Ogataea nitratoaversa和博伊丁假丝酵母(Candida boidnii)。
methanolica)、Pichia inositovera、Ogataea nitratoaversa和博伊丁假丝酵母(Candida boidnii)。
[0016] 一方面，本公开提供了鉴定生成更高产量的所需抗体或其它所需多亚基复合物的宿主细胞的改进方法，其可包括：(a)提供一组宿主细胞，所述组包含各自包含为表达所述多亚基复合物的亚基(例如，所述所需抗体的轻链和重链)而提供的基因的至少两种宿主细胞；(b)在允许多亚基复合物表达的条件下培养每种所述宿主细胞，其中所述至少两种宿主细胞中的基因是为了不同水平表达所述所需多亚基复合物的至少一个亚基而提供；(c)测量每种所述宿主细胞生成的多亚基复合物的产量；和(d)鉴定所述宿主细胞组中生成比另一种宿主细胞更高的产量的宿主细胞为生成更高产量的所需多亚基复合物的宿主细胞。
[0017] 另一方面，本公开提供了鉴定生成更高纯度的所需抗体或其它所需多亚基复合物的宿主细胞的改进方法，其可包括：(a)提供一组宿主细胞，所述组包含各自包含为表达所述多亚基复合物的亚基(例如，所述所需抗体的轻链和重链)而提供的基因的至少两种宿主细胞；(b)在允许多亚基复合物表达的条件下培养每种所述宿主细胞，其中所述至少两种宿主细胞中的基因是为了不同水平表达所述所需多亚基复合物的至少一个亚基而提供；(c)测量每种所述宿主细胞生成的所述多亚基复合物的纯度；和(d)鉴定所述宿主细胞组中生成比另一种宿主细胞更高的纯度的宿主细胞为生成更高纯度的所需多亚基复合物的宿主细胞。
[0018] 宿主细胞可为真核细胞，例如酵母细胞如甲基营养型酵母(例如毕赤酵母属的酵母)。毕赤酵母属的示例性甲基营养型酵母包括巴斯德毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和Pichia inositovera。可通过交配，例如通过使各自含编码多亚基复合物的亚基的至少一个基因的一个或多个拷贝的两个单倍体酵母细胞交配产生宿主细胞。例如，可产生含有已知不同拷贝数的所述多亚基复合物的一个或多个亚基的多个单倍体细胞，以致单倍体细胞不同组合之间的交配可迅速产生一组二倍体细胞，各自含有预选拷贝数的编码多亚基复合物的每个亚基的基因。另外，可产生含有已知不同拷贝数的所述多亚基复合物的一个或多个亚基的多个二倍体细胞，以致二倍体细胞不同组合之间的交配可迅速产生一组四倍体细胞，各自含有预选拷贝数的编码多亚基复合物的每个亚基的基因。
[0019] 在一个优选实施方案中，毕赤酵母属的甲基营养型酵母为巴斯德毕赤酵母。宿主细胞可为二倍体或四倍体细胞。
[0020] 编码所需多亚基复合物的所述亚基，例如所述所需抗体轻链和／或重链的所述基因的至少一个，可在诱导型或组成型启动子的控制下表达，例如CUP1(受培养基中铜的水平诱导；见Koller等，Yeast2000；16：651-656.)、四环素诱导型启动子(见，例如，Staib等，Antimicrobial Agents And Chemotherapy，2008年1月，第146-156页)、硫胺诱导型启动子、AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5和Pvk启动子、源自其中的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
[0021] 编码所需多亚基复合物的所述亚基，例如所述所需抗体轻链和／或重链的所述基因的至少一个，可在诱导型或组成型启动子的控制下表达，例如CUP1、AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5和Pyk启动子、四环素诱导型启动子、硫胺诱导型启动子、源自其中的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
[0022] 宿主细胞可将所述所需多亚基复合物分泌到培养基中。可选地或另外，所述所需多亚基复合物可留在所述宿主细胞中并且可从中分离。
[0023] 所述宿主细胞可为二倍体、四倍体细胞或多倍体。
[0024] 所述方法可进一步包括从所述宿主细胞或从培养基中纯化所述多亚基复合物。
[0025] 可从所述宿主细胞的细胞内组分、细胞质、核质或膜纯化所述多亚基复合物。
[0026] 所需多亚基复合物可包含抗体，例如单特异性或双特异性抗体。抗体可为特异性结合任何抗原的抗体。
[0027] 所述多亚基复合物可包含人抗体或人源化抗体或其片段。
[0029] 所述人源化抗体可为兔来源。
[0030] 所述多亚基复合物可包含单价、二价或多价抗体。
[0031] 可通过蛋白A和／或蛋白G亲和从所述培养物中纯化所述抗体。
[0032] 所述组中至少一种所述真核细胞中为表达所述多亚基复合物的亚基而提供的至少一个基因可经优化在所述真核细胞中表达。
[0033] 所述组中的至少两种宿主细胞可包含不同拷贝数的编码所述多亚基复合物的亚基的基因，例如不同拷贝数的编码所需抗体重链和／或所述所需抗体轻链的基因。
[0034] 所述组中的至少一种宿主细胞可包含编码所述多亚基复合物的亚基的基因的至少两个拷贝，例如编码所需抗体重链和／或所述所需抗体轻链的基因的至少两个拷贝。
[0035] 所述组中的至少一种宿主细胞可包含编码所述所需多亚基复合物的亚基(例如所需抗体重链或所需抗体轻链)的基因，其表达受与驱动所述组中不同宿主细胞中的相应基因的表达的启动子不同的启动子驱动。
[0036] 所述组中的至少一种宿主细胞可包含含一个以上编码所述所需多亚基复合物的一个或多个亚基的序列的多顺反子基因。
[0037] 所需多亚基复合物可包含可与任何抗原特异性结合的所需抗体。示例非限制性实例包括IL-6、TNF-α、CGRP、PCSK9或NGF。
[0038] 所需多亚基复合物可包含任何类型的抗体。示例性抗体类型包括任何哺乳动物类的抗体，例如人、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛等。优选地，抗体为人抗体或可为兔来源的人源化抗体。所需抗体可为单价、二价或多价抗体。
[0039] 所述组中的至少一种所述宿主细胞中，为表达所需多亚基复合物的亚基(例如所需抗体的轻链和／或重链)而提供的至少一个所述基因可经优化在所述宿主细胞中表达(例如，通过选择优选密码子和／或通过密码子选择改变AT百分比)。
[0040] 如工作实例所示，在一些实施方案中，通过使用重链相对于轻链的拷贝更多，轻链相对于重链的拷贝更多或轻链和重链的拷贝数相等的宿主细胞表达，进一步优化抗体的产量和／或纯度。
[0041] 通过测量所述宿主细胞生成的非糖基化的、含在具有预计表观流体动力学半径和／或表观分子量(例如，通过尺寸排阻色谱法测得)的复合物中、具有预计电泳迁移率(例如，通过凝胶电泳如SDS-PAGE和任选Westem印迹检测)的所需多亚基复合物的分数，和／或测量多亚基复合物的比活性(例如，特异性结合所需抗体的靶标)，可评估所述所需多亚基复合物，例如所需抗体的纯度。
[0042] 所需多亚基复合物可为抗体，并且通过测定所述宿主细胞生成的扣除经糖基化、含在除具有预计表观分子量或流体动力学半径的复合物外的抗体复合物中和／或不能与所述所需抗体的靶标特异性结合的任何产物相关变体的所需抗体的量，可评估所述抗体的产量。
[0043] 另一方面，本公开提供了一种重组生成所需多亚基复合物，例如所需抗体的方法，包括：(a)提供包含编码所述所需抗体轻链和重链的基因的宿主细胞，其中通过本文所述的任何方法鉴定所述宿主细胞为生成更高产量和／或纯度的所需抗体的宿主细胞；和(b)在允许所述轻链和重链基因表达的条件下培养所述宿主细胞。所述方法可进一步包括纯化所述所需抗体。
[0044] 另一方面，本公开提供了一种重组生成所需多亚基复合物，例如所需抗体的方法，包括：(a)提供包含编码所述所需抗体轻链和重链的基因的多个拷贝的宿主细胞，相对于仅含编码所述所需抗体轻链和重链的所述基因的单个拷贝的等基因宿主细胞，所述宿主细胞生成更高产量和／或纯度的所需抗体；和(b)在允许所述轻链和重链基因表达的条件下培养所述宿主细胞。所述方法可进一步包括纯化所述所需抗体。
[0045] 所述方法可进一 步包括使用如标题 为“HIGH-PURITY PRODUCTION OFMULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS”并于2012年5月8日提交的共有美国申请序列no.13／466,795(代理人案号75820.711001)(其据此通过引用整体并入)中描述的方法和／或条件培养。例如，所述培养可包括向培养物中添加乙醇团注(ethanol bolus)，例如达最终浓度为约1％w／w。
[0046] 例如，本公开的一个方面提供了一种生成多亚基复合物的方法，包括：(a)提供包含真核细胞的培养物，所述真核细胞包含为表达所述多亚基复合物的亚基而提供的基因的多个拷贝；(b)向所述培养物中添加乙醇团注；和(c)培养所述培养物以生成所述多亚基复合物。
[0047] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，乙醇团注可增加稳定二硫键的形成。
[0048] 所述多亚基复合物可含有包含至少一个二硫键的一条或多条多肽。
[0049] 所述多亚基复合物可包含抗体。
[0050] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，所述方法可降低一种或多种产物相关变体的相对丰度。
[0051] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，所述方法可降低通过尺寸排阻色谱法或凝胶电泳检测的表观分子量比所述所需多亚基复合物更高或更低的产物相关变体的相对丰度。
[0052] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，所述方法可降低化学计量异常的复合物的相对丰度。
[0053] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，所述方法可降低二硫键异常的复合物的相对丰度。
[0054] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，所述方法可降低半胱氨酸还原的复合物的相对丰度。
[0055] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，所述方法可降低糖基化异常的复合物的相对丰度。
[0056] 所述方法可调节重链间二硫键的形成或稳定性。
[0057] 所述方法可调节连接轻链和重链的二硫键的形成或稳定性。
[0058] 相对于在没有乙醇团注时实现的相同方法，所述方法可降低一种或多种产物相关变体的相对丰度。
[0059] 所述产物相关变体可包含H1L1、H2L1和H4L4产物相关变体的一种或多种。
[0060] 相对于在没有所述乙醇团注时实现的相同方法，所述方法增加所述抗体的纯度。
[0061] 步骤(b)可在步骤(c)之前实现。
[0062] 步骤(b)可在步骤(c)之后实现。
[0063] 步骤(b)可与步骤(c)同时实现。
[0064] 步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度介于约0.01％和约4％(w／v)之间。
[0065] 步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度介于约0.01％和约4％之间，介于约0.02％和约3.75％之间，介于约0.04％和约3.5％之间，介于约0.08％和约3.25％之间，介于约0.1％和约3％之间，介于约0.2％和约2.75％之间，介于约0.3％和约2.5％之间，介于约0.4％和约2.25％之间，介于约0.5％和约1.5％之间，介于约0.5％和约2％之间，介于约0.6％和约1.75％之间，介于约0.7％和约1.5％之间或介于约0.8％和约1.25％之间。
[0066] 步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度可为至少约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.2％、0.3％、0.4％、0.6％、
0.6％、0.7％、0.8％或0.9％(w/v)。
0.6％、0.7％、0.8％或0.9％(w/v)。
[0067] 步骤(b)可导致所述培养物中的乙醇浓度可为至多约4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.8％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、
0.5％、0.4％、0.35％、0.3％、0.25％、0.2％或0.15％(w／v)。
0.5％、0.4％、0.35％、0.3％、0.25％、0.2％或0.15％(w／v)。
[0068] 步骤(b)可包括向所述培养物添加乙醇，向所述培养物添加包含乙醇的载体，向包含乙醇的培养基或载体添加所述细胞，或更换部分培养基。
[0069] 在介于1至20min的时间段内可向培养基添加所述乙醇团注。
[0071] 所述供氧可包括搅拌所述培养物。
[0072] 所述供氧可包括使所述培养物与包含氧的气体混合物接触。
[0074] 所述给料可包含至少一种可发酵碳源。
[0076] 所述方法可进一步包括在步骤(c)期间将乙醇浓度维持在介于上设定值与下设定值之间。
[0077] 所述下设定值可为约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％或0.9％(w／v)。
[0078] 所述上设定值可为约4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.8％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、I.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.35％、0.3％、
0.25％、0.2％或0.15％(w／v)。
0.25％、0.2％或0.15％(w／v)。
[0079] 所述上设定值可至多为约1.5％、1.4％、1.3、1.2％或1.1％(w／v)。
[0080] 所述方法可进一步包括在步骤(c)期间将乙醇浓度维持在设定值。
[0081] 所述设定值可为约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％(w／v)。
[0082] 步骤(c)可包括将所述培养物中的乙醇浓度维持在介于约0.01％和约4％之间，介于约0.02％和约3.75％之间，介于约0.04％和约3.5％之间，介于约0.08％和约3.25％之间，介于约0.1％和约3％之间，介于约0.2％和约2.75％之间，介于约0.3％和约2.5％之间，介于约0.4％和约2.25％之间，介于约0.5％和约2％之间，介于约0.6％和约1.75％之间，介于约0.7％和约1.5％之间或介于约0.8％和约1.25％之间。
[0083] 可通过由所述细胞控制乙醇的生成或通过向所述培养物添加乙醇维持所述培养物中的乙醇浓度。
[0084] 控制乙醇生成的步骤可包括控制以下一项或多项：葡萄糖浓度、氧可用性、搅拌强度、气体压力、供给的空气或其它气体混合物的流量、培养物粘度、培养物密度、供给的空气或其它气体混合物中的氧浓度和温度。
[0085] 步骤(a)和步骤(b)间隔的时间可小于约72h、小于约48h、小于约24h、小于约12h、小于约9h、小于约6h、小于约5h、小于约4h、小于约3h、小于约90min、小于约30min、小于约5min或小于约1min。
[0086] 步骤(b)和步骤(c)间隔的时间可小于约10h、小于约9h、小于约8h、小于约7h、小于约6h、小于约5h、小于约4h、小于约3h、小于约2h、小于约90min、小于约80min、小于约70min、小于约60min、小于约50min、小于约40min、小于约30min、小于约20min、小于约10min、小于约5min或小于约1min。
[0087] 通过向所述培养物中添加碳源，并且培养所述培养物直至碳源可能耗尽，可生成步骤(a)的培养物。
[0088] 所述碳源可包含以下的一种或多种：甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨糖醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露糖醇和棉子糖。
[0089] 可通过检测所述真核细胞代谢活性的降低测定碳源耗尽。
[0090] 可通过检测所述真核细胞氧消耗量的降低，通过检测培养物中pH的增大，通过检测湿细胞团块的稳定，或通过检测培养物中氨浓度的增大，鉴定所述真核细胞代谢活性的所述降低。
[0091] 可通过检测所述培养物中溶解氧的浓度增大鉴定所述真核细胞氧消耗量的所述降低。
[0092] 所述真核细胞可包括酵母细胞。
[0093] 所述酵母细胞可包括甲基营养型酵母。
[0094] 所述甲基营养型酵母可为毕赤酵母属。
[0095] 毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母可为巴斯德毕赤酵母。
[0096] 毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母可选自：安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和Pichia inositovera。
[0097] 为表达所述多亚基复合物而提供的基因可整合到一个或多个基因组座位(genomic loci)中。
[0098] 至少一个所述基因组座位可选自pGAP基因座、3’AOX TT基因座、PpURA5、OCH1、AOX1、HIS4、GAP、pGAP、3’AOX TT、ARG和HIS4TT基因座。
[0099] 编码多亚基复合物的所述亚基的至少一个基因可在诱导型或组成型启动子的控制下表达。
[0100] 所述诱导型启动子可选自AOX1、CUP1、四环素诱导型、硫胺诱导型和FLD1启动子。
[0101] 编码多亚基复合物的所述亚基的至少一个基因可在选自以下的启动子的控制下表达：CUP1、AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5和Pyk启动子、四环素诱导型启动子、硫胺诱导型启动子、源自其中的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子和禽类启动子。
[0102] 所述真核细胞可为二倍体、四倍体细胞或多倍体。
[0103] 所述方法可进一步包括从所述真核细胞或从培养基纯化所述多亚基复合物。
[0104] 可从所述真核细胞的细胞内组分、细胞质、核质或膜纯化所述多亚基复合物。
[0105] 所述真核细胞将所述多亚基复合物分泌到培养基中。
[0106] 可从所述培养基纯化所述多亚基复合物。
[0107] 所述多亚基复合物可包含单特异性或双特异性抗体。
[0108] 所述多亚基复合物可包含人抗体或人源化抗体或其片段。
[0109] 所述人源化抗体可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或牛来源。
[0110] 所述人源化抗体可为兔来源。
[0111] 所述多亚基复合物可包含单价、二价或多价抗体。
[0112] 可通过蛋白A和／或蛋白G亲和从所述培养物中纯化所述抗体。
[0113] 所述组中至少一种所述真核细胞中为表达所述多亚基复合物的亚基而提供的至少一个基因可经优化在所述真核细胞中表达。
[0114] 所述多亚基复合物可包含抗体并且通过测量所述真核细胞生成的可能含在具有预计表观流体动力学半径的抗体复合物中、可能含在具有预计分子量的抗体复合物中和／或特异性结合所述抗体的靶标的抗体的分数，可评估所述抗体的纯度。
[0115] 所述多亚基复合物可包含抗体并且通过测定所述真核细胞生成的扣除可能经异常糖基化、含在除具有预计表观流体动力学半径的复合物外的抗体复合物中、含在具有预计分子量的抗体复合物中和／或不能与所述抗体的靶标特异性结合的任何产物相关变体的抗体的量，可评估所述抗体的产量。
[0116] 可通过非还原SDS-PAGE测定所述抗体复合物的分子量。
[0117] 所述多亚基复合物可包含抗体，所述方法可进一步包括纯化所述抗体。
[0118] 所述培养细胞可生成至少100mg／L、至少150mg／L、至少200mg／L、至少250mg／L、至少300mg／L、介于100和300mg／L之间、介于100和500mg／L之间、介
于100和1000mg／L之间、至少1000mg／L、至少1250mg／L、至少1500mg／L、至少约
1750mg／L、至少约2000mg／L、至少约10000mg／L或更高的上清液抗体滴度。
于100和1000mg／L之间、至少1000mg／L、至少1250mg／L、至少1500mg／L、至少约
1750mg／L、至少约2000mg／L、至少约10000mg／L或更高的上清液抗体滴度。
[0119] 可由一个以上的基因拷贝表达所述多亚基复合物的一个或多个亚基。
[0120] 所述多亚基复合物可包含可由编码所述抗体轻链的基因的1-10个拷贝和编码所述抗体重链的基因的1-10个拷贝表达的抗体。
[0121] 为表达所述多亚基复合物而提供的基因可整合到所述细胞的基因组中。
[0122] 染色体外元件、质粒或人工染色体上可含有为表达所述多亚基复合物而提供的基因。
[0123] 所述细胞可包含比为表达所述抗体重链而提供的基因的拷贝更多的为表达所述抗体轻链而提供的基因的拷贝。
[0124] 所述细胞中编码所述抗体重链的基因的拷贝数和编码所述抗体轻链的基因的拷贝数各自可以为：2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。
[0125] 所述细胞中编码所述抗体重链的基因的拷贝数和编码所述抗体轻链的基因的拷贝数各自可以为：2和1、3和1、4和1、5和1、6和1、7和1、8和1、9和1、10和1、1和2、2和2、3和2、4和2、5和2、6和2、7和2、8和2、9和2、10和2、1和3、2和3、3和3、4和3、5和3、6和3、7和3、8和3、9和3、10和3、1和4、2和4、3和4、4和4、5和4、6和4、7和
4、8和4、9和4、10和4、1和5、2和5、3和5、4和5、5和5、6和5、7和5、8和5、9和5、10和5、1和6、2和6、3和6、4和6、5和6、6和6、7和6、8和6、9和6、10和6、1和7、2和7、3和7、4和7、5和7、6和7、7和7、8和7、9和7、10和7、1和8、2和8、3和8、4和8、5和8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、1和9、2和9、3和9、4和9、5和9、6和9、7和9、8和9、
9和9、10和9、1和10、2和10、3和10、4和10、5和10、6和10、7和10、8和10、9和10、10和10。
4、8和4、9和4、10和4、1和5、2和5、3和5、4和5、5和5、6和5、7和5、8和5、9和5、10和5、1和6、2和6、3和6、4和6、5和6、6和6、7和6、8和6、9和6、10和6、1和7、2和7、3和7、4和7、5和7、6和7、7和7、8和7、9和7、10和7、1和8、2和8、3和8、4和8、5和8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、1和9、2和9、3和9、4和9、5和9、6和9、7和9、8和9、
9和9、10和9、1和10、2和10、3和10、4和10、5和10、6和10、7和10、8和10、9和10、10和10。
[0126] 步骤(c)的培养物可在生产培养基中生长。
[0127] 所述生产培养基可为基本培养基。
[0128] 所述基本培养基缺乏选择剂。
[0129] 所述基本培养基缺乏预先形成的氨基酸或其它复合生物分子。
[0130] 生产培养基可为复合培养基。
[0131] 复合培养基可包含酵母提取物、大豆蛋白胨或其它植物蛋白胨的一种或多种。
[0132] 步骤(c)的培养物可生长至高细胞密度。
[0133] 所述高细胞密度可为至少50g／L。
[0134] 所述高细胞密度可为至少100g／L。
[0135] 所述高细胞密度可为至少300g／L。
[0136] 所述高细胞密度可为至少400g／L。
[0137] 所述高细胞密度可为至少500g／L。
[0138] 所述高细胞密度可为至少750g／L。
[0139] 可培养所述酵母细胞至少20次倍增并且在所述至少20次倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
[0140] 可培养步骤(c)的细胞至少50次倍增并且在所述至少50次倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
[0141] 可培养步骤(c)的细胞至少100次倍增并且在所述至少100次倍增后维持所述多亚基复合物的高水平表达。
[0142] 所述多亚基复合物的至少一个亚基可包含分泌信号。
[0143] 所述多亚基复合物可包含抗体。
[0144] 主题方法可产生至少100mg／L、至少150mg／L、至少200mg／L、至少250mg／L、至少300mg／L、介于100和300mg／L之间、介于100和500mg／L之间、介于100和1000mg／L之间或超过1000mg／L，例如高达1200mg／L、高达10，000mg／L或更高的上清液抗体滴度。
[0145] 另一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其通过前述任何方法鉴定为生成更高产量和／纯度的所需多亚基复合物，例如所需抗体的宿主细胞。宿主细胞可为毕赤酵母属的二倍体或四倍体细胞，例如巴斯德毕赤酵母细胞。另一方面，本公开提供了一种源自上述宿主细胞的二倍体或四倍体酵母培养物。为表达所述所需多亚基复合物的亚基例如所需抗体的轻链和重链而提供的基因，可整合到所述宿主细胞的基因组中。在染色体外元件、质粒或人工染色体上可含有为表达所述所需多亚基复合物的亚基例如所需抗体的轻链和重链而提供的基因。所需多亚基复合物为抗体时，宿主细胞可包含比为表达重链而提供的基因的拷贝更多的为表达轻链而提供的基因的拷贝。在示例性实施方案中，宿主细胞可包含编码轻链的基因的1-10个拷贝和编码重链的基因的1-10个拷贝。所述宿主细胞中编码重链的基因的拷贝数和编码轻链的基因的拷贝数各自可以为：2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。图37中列举了重链和轻链基因拷贝数的另外的示例性组合，其列举了具有多达10个拷贝的重链和／或轻链基因的组合，包括具有标识H2xL1、H3xL1、H4xL1、H5xL1、H6xL1、H7xL1、H8xL1、H9xL1、H10xL1、H1xL2、H2xL2、H3xL2、H4xL2、H5xL2、H6xL2、H7xL2、H8xL2、H9xL2、H10xL2、H1xL3、H2xL3、H3xL3、H4xL3、H5xL3、H6xL3、H7xL3、H8xL3、H9xL3、H10xL3、H1xL4、H2xL4、H3xL4、H4xL4、H5xL4、H6xL4、H7xL4、H8xL4、H9xL4、H10xL4、H1xL5、H2xL5、H3xL5、H4xL5、H5xL5、H6xL5、H7xL5、H8xL5、H9xL5、H10xL5、H1xL6、H2xL6、H3xL6、H4xL6、H5xL6、H6xL6、H7xL6、H8xL6、H9xL6、H10xL6、H1xL7、H2xL7、H3xL7、H4xL7、H5xL7、H6xL7、H7xL7、H8xL7、H9xL7、H10xL7、H1xL8、H2xL8、H3xL8、H4xL8、H5xL8、H6xL8、H7xL8、H8xL8、H9xL8、H10xL8、H1xL9、H2xL9、H3xL9、H4xL9、H5xL9、H6xL9、H7xL9、H8xL9、H9xL9、H10xL9、H1xL10、H2xL10、H3xL10、H4xL10、H5xL10、H6xL10、H7xL10、H8xL10、H9xL10、H10xL10的菌株。例如，可将指定数量的重链和轻链基因拷贝串联整合到单个基因座或多个基因座中(其中任一个或全部可能含有一个以上的拷贝)。任选地，每个基因组座位可含有不多于三个或四个串联整合基因拷贝，从而提高增殖和／或抗体生成期间的拷贝数稳定性。
[0146] 培养最常牵涉为细胞提供能源、氧和营养素。在文献中也已知设计并优化巴斯德毕赤酵母发酵以表达重组蛋白的方法，包括优化细胞密度、肉汤体积、底物给料速度和每个反应期的长度。见Cregg，J.M.编辑，2007，Pichia Protocols(第2版)中Zhang等，“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations”，Methods in Molecular Biology，第389卷，Humana Press，Totowa，N.J.，第43-63页。可为培养物提供包含氧的气体混合物，例如有或无氧补充的空气。可在培养基中培养酵母培养物，培养基可为基本培养基，可能缺乏选择剂和／或可能缺乏预先形成的氨基酸或其它复合生物分子。培养基也可为复合培养基(例如，含酵母提取物和／或植物蛋白胨)。培养基可包括氮源(例如，甲胺氯、NH4SO4、酵母提取物、大豆蛋白胨、其它植物蛋白胨等)。示例性-5的基本培养基包括基本葡萄糖培养基(MD)(1.34％酵母氮源(YNB)(无氨基酸)、4×10 ％生物素和2％葡萄糖)、缓冲型基本甘油复合培养基(BMGY)(1％酵母提取物、2％蛋白胨、
1％甘油、1.34％YNB(无氨基酸)、4×10-5％生物素和100mM磷酸氢二钾(pH6.0))。培养基可包括一种或多种盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如磷酸氢二钾、Tris或HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如，添加以抑制污染物的生长和／或维持选择标记)、微量元素和葡萄糖和另一能源。在将为本领域技术人员所知的适当浓度下，也可包括任何补充和代替。
1％甘油、1.34％YNB(无氨基酸)、4×10-5％生物素和100mM磷酸氢二钾(pH6.0))。培养基可包括一种或多种盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如磷酸氢二钾、Tris或HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如，添加以抑制污染物的生长和／或维持选择标记)、微量元素和葡萄糖和另一能源。在将为本领域技术人员所知的适当浓度下，也可包括任何补充和代替。
[0147] 培养物可生长至高细胞密度，例如至少50g／L、至少100g/L、至少300g／L、至少400g／L、至少500g/L或至少700g／L。这些培养物密度为说明性而非限制性，并且本领域的普通技术人员可容易地测定适合的培养物密度。
[0148] 可培养酵母细胞至少20次倍增并且在所述至少20次倍增后维持所述抗体的高水平表达。
[0149] 可培养酵母细胞至少50次倍增并且在所述至少50次倍增后维持所述抗体的高水平表达。
[0150] 可培养酵母细胞至少100次倍增并且在所述至少100次倍增后维持所述抗体的高水平表达。
[0151] 另一方面，本公开提供了一种培养基，其含有根据前述任何方法生成的稳定二倍体毕赤酵母培养物，其中所述培养基可包含至少约50mg／L、100mg／L、500mg／L、750mg／L、1000mg／L、1250mg／L、1500mg／L、1750mg／L、2000mg/L或更高表达水平的所述所需抗体。这些产量值为说明性而非限制性。任选地，例如使用上文Zhang等(2007)描述的方法和一般途径可优化产量。例如，可通过改变温度、pH、培养基组成(例如，碳源、碳源浓度、两种或更多种碳源的混合物、氮源和浓度、盐浓度和营养素，包括KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、硫酸钾、柠檬酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠、微量金属(例如氯化钴)、硫酸铜、碘化钠、硫酸锰、钼酸钠、硼酸、氯化锌、硫酸亚铁、维生素(例如生物素)、肌醇、硫胺、蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白氨基酸、尿素、磷酸铵或其它铵离子、L-精氨酸-盐酸盐)、时间、培养物密度、氧化和影响产量的其它因素优化产量。例如，在某些情况下可通过将温度维持在所需设定值，例如介于约15℃和约30℃之间，例如介于约17℃和约25℃之间的设定值，提高所需多亚基复合物的产量、表达和／或纯度。不期望受理论限制，假设控制温度可通过折叠和翻译后加工途径帮助细胞内移行，和／或可降低细胞蛋白酶的活性。同样，在某些情况下可通过将培养基的pH维持在所需设定值，例如介于pH3至pH8，例如介于pH4和pH7之间的设定值，提高所需多亚基复合物的产量、表达和／或纯度。
[0152] 另一方面，本公开提供了一种培养基，其含有源自根据前述任何方法产生的向培养基中表达所述所需抗体的细胞的稳定二倍体巴斯德毕赤酵母培养物，其中所述培养物中所述二倍体细胞的细胞密度可为至少约50g／L、100g／L、300g／L、400g/L、500g／L、700g／L或更高。这些培养物密度为说明性而非限制性，并且本领域的普通技术人员可容易地测定适合的培养物密度。
[0153] 所述抗体或其它多亚基蛋白的至少一个亚基可包含分泌信号，例如鸡溶菌酶(CLY)信号肽、CLY-L8、酿酒酵母转化酶(SUC2)信号肽、MF-α(Prepro)、MF-α(Pre)-apv、MF-α(Pre)-apv-SLEKR、MF-α(Prepro)-(EA)3、αF信号肽、KILMI信号肽、阻抑性酸性磷酸酶(PHO1)信号肽、黑曲霉(A，niger)GOX信号肽、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)葡糖淀粉酶基因(GAM1)信号肽、无前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽、ISN信号肽、IFN信号肽、HGH信号肽、植物血球凝集素(PHA)、蚕溶菌酶、人溶菌酶(LYZ1)、1型激活素受体、II型激活素受体、巴斯德毕赤酵母免疫球蛋白结合蛋白(PpBiP)、人抗体3D6轻链前导序列及其任何组合。
[0154] 可通过使各自含编码所述抗体或其它多亚基蛋白的一个或多个亚基的基因的一个或多个拷贝的两个单倍体酵母细胞交配产生宿主细胞。
[0156] 图1提供了获得含特别指定拷贝数的编码所需抗体轻链和／或重链的基因的单倍体菌株，并且使单倍体菌株交配以获得由特别指定拷贝数的轻链和重链基因表达所需抗体的一组二倍体菌株的示例性方法的概述。
[0157] 图2用图表说明了与H3xL3菌株相比，来自含拷贝数增加的编码Ab-A轻链和重链的基因的选定二倍体菌株的相对全抗体产量。将H3xL3产量设为100％，相对全肉汤抗体滴度通常随抗体总拷贝数增加而增加，顺序为H3xL4、H3xL3、H4xL4、H4xL6、H5xL4、H5xL5和H5xL7。
[0158] 图3用图表说明了与H3xL3菌株相比，来自含拷贝数增加的编码Ab-B轻链和重链的基因的菌株的相对全肉汤抗体产量。将H3xL3产量设为100％，相对全肉汤抗体滴度通常随抗体拷贝数增加而增加，顺序为H3xL3、H3xL4、H4xL3、H4xL5和H4xL6。
[0159] 图4用图表说明了与H3xL3菌株相比，来自含拷贝数增加的编码Ab-C轻链和重链的基因的菌株的相对全肉汤抗体产量。将H3xL3产量设为100％，相对全肉汤抗体滴度通常随抗体拷贝数增加而增加，顺序为Ab-C-H3xL4、Ab-C-H4xL3、Ab-C-H4xL4、Ab-C-H4xL5、Ab-C-H5xL5、Ab-C-H5xL4、Ab-C-H5xL6和Ab-C-H6xL5。
[0160] 图5A-E示出了通过HPLC测定，由H4xL4和H4xL6菌株生成的Ab-A的蛋白-A捕获洗脱物的纯度。在15.5min时迁移的产物相关变体的水平(通过整合总面积的百分比测量)，降低5倍以上(从H4xL4中的8.81降低到H4xL6中的1.58％)。
[0161] 图6A-E示出了通过HPLC测定，由H4xL3和H4xL5菌株生成的Ab-B的蛋白-A捕获洗脱物的纯度。在15.5min时迁移的产物相关变体的水平(通过整合总面积的百分比测量)，降低约59％(从H4xL3中的6.26％降低到H4xL5中的2.54％)。
[0162] 图7A-E示出了通过HPLC测定，由HexL3和H5xL5菌株生成的Ab-C的蛋白-A捕获洗脱物的纯度。在15.2-16.1min时迁移的产物相关变体的水平(通过整合总面积的百分比测量)，降低约39％(从H3xL3中的6.55％降低到H5xL5中的4.00％)。
[0163] 图8示出了由H4xL4和H4xL6菌株生成的Ab-A的染色SDS-PAGE凝胶。观察到的“低迁移率产物相关变体”(箭头)在来自具有较高轻链拷贝数的菌株的制剂中丰度较低。
[0164] 图9示出了由H4xL5和H4xL6菌株生成的蛋白-A纯化Ab-B的染色SDS-PAGE凝胶。如同Ab-A一样，观察到的“低迁移率产物相关变体”(箭头)在来自具有较高轻链拷贝数的菌株的制剂中丰度较低。
[0165] 图10示出了由H3xL3和H5xL5菌株生成的蛋白-A纯化Ab-C的染色SDS-PAGE凝胶。如同Ab-A和Ab-B一样，观察到的“低迁移率产物相关变体”(箭头)在来自具有较高抗体链拷贝数的菌株的制剂中丰度较低。
[0166] 图11显示鉴定低迁移率产物相关变体为与人Fc有关的糖基化蛋白(通过其被凝集素柱选择性富集和受抗Fc抗体特异性识别证明)。抗体制剂(“载料”)与凝集素树脂结合并洗脱(“凝集素洗脱物”)。SDS-PAGE(图11A)展示了低迁移率产物相关变体受凝集素柱的选择性富集。用抗HuFc抗体进行的Westem印迹(图11A)检测了低迁移率产物相关变体，表明其含有至少部分人Fc序列。本文将这种产物相关变体称为“糖基-重链变体”。另外，相对于菌株H4xL3，在来自菌株H4xL5的抗体制剂中这种产物相关变体的量明显减少。
[0167] 图12A-D和13A-D展示，通过HPLC观察到的产物相关变体(保留时间约15.5min)在凝集素柱洗脱物中选择性富集，表明糖基-重链变体是这种产物相关变体的组成部分。由H4xL3和H4xL5菌株制备抗体Ab-B。
[0168] 图14示出了用于将Ab-A或Ab-B的抗体重链序列靶向整合到pGAP基因座(基因座#1)中的构建体的图谱。
[0169] 图15示出了用于将Ab-A或Ab-B的抗体轻链序列靶向整合到pGAP基因座(基因座#1)中的构建体的图谱。
[0170] 图16示出了用于将Ab-A或Ab-B的抗体重链序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的构建体的图谱。
[0171] 图17示出了用于将Ab-A或Ab-B的抗体轻链序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的构建体的图谱。
[0172] 图18示出了用于将Ab-C的抗体重链序列靶向整合到AOX1TT基因座(基因座#1)中的构建体的图谱。
[0173] 图19示出了用于将Ab-C的抗体轻链序列靶向整合到AOX1TT基因座(基因座#1)中的构建体的图谱。
[0174] 图20示出了用于将Ab-C的抗体重链序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的构建体的图谱。
[0175] 图21示出了用于将Ab-C的抗体轻链序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的构建体的图谱。
[0176] 图22说明了在单个基因座整合的抗体拷贝数与通过Southern印迹可检测的预计片段大小之间的关系。
[0177] 图23和24示出了分别用于检测经编码Ab-A链的基因转化的多个分离株中，抗体重链基因和轻链基因的拷贝数的Southern印迹。
[0178] 图25-27示出了用于确认通过使转化单倍体菌株交配产生的一组二倍体菌株中，pGAP(图25-26)和HIS4TT(图27)基因座上存在的编码Ab-A重链和轻链的基因的拷贝数的Southern印迹。
[0179] 图28A-B示出了分别用于检测经编码Ab-B链的基因转化的多个分离株中，抗体重链基因和轻链基因的拷贝数的Southern印迹。
[0180] 图29-31示出了确认通过使转化单倍体菌株交配产生的一组二倍体菌株中，pGAP(图29-30)和HIS4TT(图31)基因座上存在的编码Ab-B重链和轻链的基因的拷贝数的Southern印迹。
[0181] 图32-33示出了分别用于检测经编码Ab-C链的基因转化的多个分离株中，抗体重链和轻链基因的拷贝数的Southern印迹。
[0182] 图34-36示出了确认通过使转化单倍体菌株交配产生的一组二倍体菌株中，3’AOX TT(图34-35)和HIS4TT(图36)基因座上存在的编码Ab-C重链和轻链的基因的拷贝数的Southern印迹。
[0183] 图37说明了根据本发明的实施方案可使用的轻链和重链基因拷贝数的示例性、非限制性组合。
[0184] 图38示出了编码Ab-A轻链和重链的多核苷酸序列及其编码的多肽，以及其中所含的CDR序列。
[0185] 图39示出了编码Ab-B轻链和重链的多核苷酸序列及其编码的多肽，以及其中所含的CDR序列。
[0186] 图40示出了编码Ab-C轻链和重链的多核苷酸序列及其编码的多肽。
[0187] 详述
[0188] 本公开提供了产生并鉴定能够生成增高产量的所需异源多亚基复合物和／或生成具有提高纯度的所需异源多亚基复合物的宿主细胞的方法。在一个优选实施方案中，异源多亚基复合物是由两个重链亚基和两个轻链亚基构成的抗体或抗体片段，例如人源化抗体。优选的宿主细胞包括酵母，并且特别优选的酵母包括甲基营养型酵母菌株，例如巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母)、季也蒙毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、Pichia inositovera等(见，例 如，美 国 专利 4,812,405、4,818,700、4,929,555、5,736,383、5,955,349、5,888,768和6,258,559，其各自通过引用整体并入)。可通过本领域已知的方法产生宿主细胞。例如，可通过使含不同拷贝数的单独亚基基因的细胞交配(优选其拷贝数在交配之前已知)，产生含不同基因拷贝数组合的一组二倍体或四倍体酵母细胞。
[0189] 申请人已经意外发现，培养物可维持高稳定拷贝数的编码所需多亚基复合物的基因。工作实例证明细胞维持多达6或7个拷贝的抗体重链和轻链编码基因。即使在长期培养时间内，这些细胞也可稳定地表达所需抗体。另外，即使在长期培养时间之后，细胞也可维持所需多亚基复合物的高产量和高表达。
[0190] 在一个优选实施方案中，宿主细胞可包含编码异源蛋白亚基的一个或多个基因的一个以上的拷贝。例如，亚基基因的多个拷贝可串联整合到一个或多个染色体基因座中。优选在培养期间将串联整合的基因拷贝保持在稳定拷贝数以生成多亚基复合物。例如，在下述实例中，对于含轻链和重链抗体基因的3-4个串联整合拷贝的巴斯德毕赤酵母菌株而言，基因拷贝数通常稳定。
[0191] 优选将编码异源蛋白亚基的一个或多个基因整合到宿主细胞的一个或多个染色体基因座中。任何适合染色体基因座均可用于整合，包括基因间序列、启动子序列、编码序列、终止序列、调控序列等。巴斯德毕赤酵母中可用的示例性染色体基因座包括PpURA5、OCH1、AOX1、HIS4和GAP。编码基因也可整合到一个或多个随机染色体基因座中，而不能靶向。在优选实施方案中，染色体基因座选自pGAP基因座、3’AOX TT基因座和HIS4TT基因座。在另外的示例性实施方案中，在一个或多个染色体外元件，例如一个或多个质粒或人工染色体中可含有编码异源蛋白亚基的基因。
[0192] 在示例性实施方案中，多亚基蛋白可包含2、3、4、5、6或更多个不同亚基。另外，在每种多亚基蛋白中每个亚基可出现一次或多次。例如，多亚基蛋白可为多特异性抗体，例如包含两条不同轻链和两条不同重链的双特异性抗体。可通过使含有不同拷贝数的单独亚基基因的细胞交配快速产生含有不同基因拷贝数组合的一组二倍体或四倍体酵母细胞。然后可评估组内每种菌株的抗体生成以基于特征，例如相对于所需副产物所需多亚基蛋白的产量或所需多亚基蛋白的纯度鉴定菌株供将来使用。
[0193] 亚基可由单顺反子基因、多顺反子基因或其任何组合表达。每个多顺反子基因可包含相同亚基的多个拷贝，或可包含每个不同亚基的一个或多个拷贝。
[0194] 在公开申请，包括U.S.20080003643、U.S.20070298500和U.S.20060270045，以及在Higgins，D.R.和Cregg，J.M.编辑，1998.Pichia Protocols.Methods in Molecular Biology.Humana Press，Totowa，N.J.，和Cregg，J.M.编辑，2007，Pichia Protocols(第2版)，Methods in Molecular Biology.Humana Press，Totowa，N.J.中公开了可用于操纵巴斯德毕赤酵母的示例性方法(包括培养、转化和交配的方法)，其各自通过引用整体并入。
[0195] 可利用的示例性表达盒由甘油醛脱氢酶基因(GAP基因)启动子构成，与编码分泌信号的序列融合，后面是待表达的基因序列，后面是来自巴斯德毕赤酵母醇氧化酶I基因(AOX1)的编码巴斯德毕赤酵母转录终止信号的序列。Zeocin抗性标记基因可提供通过选择对较高水平的Zeocin有抗性的转化体，富集含有菌株中的表达载体的多个整合拷贝的菌株的方式。类似地，G418或卡那霉素(Kanamycin)抗性标记基因可用于提供通过选择对较高水平的遗传霉素(Geneticin)或卡那霉素有抗性的转化体，富集含有菌株中的表达载体的多个整合拷贝的菌株的方式。
[0196] 可利用的宿主菌株包括营养缺陷型巴斯德毕赤酵母或其它毕赤酵母菌株，例如met1、lys3、ura3和ade1或其它营养缺陷型相关基因中有突变的菌株。优选的突变不能以任何可估量的频率产生回复突变体并且优选为部分或甚至更加优选完全缺失突变体。优选地，通过使营养缺陷型菌株的互补组交配产生原养型二倍体或四倍体菌株。
[0197] 单倍体巴斯德毕赤酵母菌株的转化和巴斯德毕赤酵母生殖周期的遗传操纵可如上文Pichia Protocols(1998，2007)中所述进行。
[0198] 转化之前，可通过在与靶基因组座位同源的区域(例如，GAP启动子序列)中的限制酶裂解使每个表达载体线性化以指示载体整合到宿主细胞的靶基因座中。然后可通过电穿孔或其它方法，将每种载体的样品单独转化到所需菌株的培养物中，并且可借助于选择标记，例如营养缺陷型的抗生素抗性或互补作用选择成功的转化体。在选择条件下挑取分离株，划单一菌落，然后通过对从每个菌株提取的基因组DNA进行Southern印迹或PCR测定，检查确认编码多亚基复合物(例如，所需抗体)亚基的基因的拷贝数。任选地，例如可通过FACS、Western印迹、菌落转移和免疫印迹及本领域已知的其它方法确认预计亚基基因产物的表达。任选地，可再次转化单倍体分离株以引入附加的异源基因，例如在不同基因座整合的相同亚基的附加拷贝和／或不同亚基的拷贝。然后使单倍体菌株交配以产生能够合成多蛋白复合物的二倍体菌株(或更高倍数性的菌株)。可通过Southern印迹、PCR和本领域已知的其它检测方式确认每个预计亚基基因的存在。所需多蛋白复合物为抗体时，也可通过菌落转移／免疫印迹法(Wung等Biotechniques21808-812(1996)和／或通过FACS确认其表达。
[0199] 任选地重复该转化方案以使异源基因靶向第二基因座，所述异源基因可为靶向第一基因座的相同基因或不同基因。当待整合到第二基因座中的构建体编码与第一基因座编码的序列相同或高度相似的蛋白时，可改变其序列以降低不需要整合到第一基因座中的可能性。例如，相对于整合到第一基因座中的序列，待整合到第二基因座中的序列可能有启动子序列、终止序列、密码子使用的差异和／或其它可容许的序列差异。
[0200] 为使巴斯德毕赤酵母单倍体菌株交配，可将待杂交的每种菌株一起在交配板上成斑(patched)。例如，通过在适合其生长的板上划取待交配的每种菌株方便地同时进行多次交配，并且可将配偶体划在第二块板上(优选地，板为富集培养基例如YPD)。通常，在30℃下培育1或2天后，以十字形方式将来自两块板的细胞复制接种在交配板上，产生交叉阴影图案，每对菌株共同接种并且有机会在一对原始划线的交叉点交配。然后培育交配板(例如，在30℃下)以刺激菌株之间开始交配。约两天之后，可划取交配板上的细胞、成斑或复制接种到对所需二倍体菌株有选择性的培养基上(例如，交配菌株具有互补自养作用时，可使用漏失或基本培养基板)。可培养这些板(例如，在30℃下)适合的时间(例如，约3天)以允许所需二倍体菌株的选择性生长。可挑取出现的菌落并且划单一菌落以分离并纯化每种二倍体菌株。
[0201] 用于本发明方法中的表达载体可进一步包括酵母特定序列，包括用于鉴定转化酵母菌株的可选营养缺陷型或药物标记。药物标记可进一步用于扩增酵母宿主细胞中载体的拷贝数，例如通过在浓度升高的药物中培养一群细胞，从而选择表达抗性基因的水平升高的转化体。
[0202] 在一个示例性实施方案中，编码异源蛋白亚基的一个或多个基因与诱导性启动子偶联。适合的示例性启动子包括醇氧化酶1基因启动子、甲醛脱氢酶基因(FLD；见美国出版物No.2007/0298500)和本领域已知的其它诱导性启动子。酵母在最常见的碳源，例如葡萄糖、甘油或乙醇上生长期间，醇氧化酶1基因启动子受牢固阻抑，但是在甲醇上生长期间受高度诱导(Tschopp等，1987；Stroman，D.W等的美国专利No.4,855,231)。为生成外源蛋白，最初可使菌株在阻抑性碳源上生长以生成生物质，然后转移到作为唯一(或主要)碳源和能源的甲醇上以诱导外源基因的表达。这种调节系统的一个优点是，可通过在阻抑条件下生长，保存经表达产物对细胞有毒的外源基因转化的巴斯德毕赤酵母菌株。
[0203] 在另一示例性实施方案中，一个或多个异源基因可与在适当条件下表达水平可上调的受调控启动子偶联。示例性的受调控启动子包括CUP1启动子(受培养基中铜的水平诱导)、四环素诱导型启动子、硫胺诱导型启动子、AOX1启动子和FLD1启动子。
[0204] 虽然本公开大量描述了抗体的生成，但是本文所述方法也易于适用于其它多亚基复合物。不期望受理论限制，据信多亚基复合物的产量和纯度可极大地受亚基浓度和化学计量的影响，其依次受负责生成每种亚基的基因的表达水平影响。本文公开的方法可容易地用于提高包含两个或更多个不同亚基的任何重组多亚基复合物的产量和／或纯度。另外，本方法不限于生成多蛋白复合物，也可易于适用于核糖核蛋白(RNP)复合物，包括端粒酶、hnRNP、核糖体、snRNP、信号识别粒子、原核和真核核糖核酸酶P复合物和含有多种不同蛋白和／或RNA亚基的任何其它复合物。可通过本领域已知的方法生成表达多亚基复合物的宿主细胞。例如，可通过使含不同拷贝数的单独亚基基因的细胞交配(优选其拷贝数在交配之前已知)，产生含不同基因拷贝数组合的一组二倍体或四倍体酵母细胞。
[0205] 定义
[0206] 应理解，本发明不限于描述的特定方法学、方案、细胞系、动物种类或属和试剂，因为这些可改变。还应理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
[0207] 如本文所使用，除非上下文另外明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指物。因此，例如，提到“一个细胞”包括多个此类细胞并且提到“所述蛋白质”包括提到一种或多种蛋白质及其本领域技术人员所知的等效物，等等。除非另外明确指出，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。
[0208] 团注添加(Bolus addition)：在本公开中，“团注添加”通常指接触培养细胞(例如，在培养基中)的物质(乙醇)浓度的急剧变化。例如，可向培养细胞中单次添加、连续一次以上添加和/或在一段时间内(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、90或120min内)输注所述物质。也可通过部分或完全更换培养基添加所述物质，例如通过浓缩细胞(使用离心、过滤、沉淀或其它方法)，去除部分或全部培养基并且添加所述物质，或通过将细胞添加到含所述物质的培养基中。所述物质可与载体混合(例如，培养基、水、盐水等)。例如，乙醇团注添加可包括向培养基添加量足以产生所需浓度的纯或浓乙醇(例如，100％、95％、70％、50％、60％、40％、30％、20％等)。再如，可将细胞添加到含乙醇的培养基中，例如通过向含乙醇的培养基中添加含细胞的接种物。
[0209] 团注浓度(Bolus concentration)：在本发明中，“团注浓度”通常指由于团注添加物质(例如，乙醇)产生的浓度。
[0210] 能交配的酵母物种：在本发明中这是为了广泛涵盖可在培养中生长的任何二倍体或四倍体酵母。这些酵母物种可呈单倍体、二倍体或其它多倍体形式存在。给定倍数性的细胞可在适当条件下呈该形式增殖无限代。二倍体细胞也可产生孢子以形成单倍体细胞。通过二倍体菌株的进一步交配或融合，连续交配可产生四倍体菌株。本发明考虑到了单倍体酵母以及(例如)通过交配或融合(例如，球状质体融合)产生的二倍体或其它多倍体酵母细胞的用途。
[0211] 在本发明的一个实施方案中，能交配的酵母是酵母(Saccharomycetaceae)科的成员，其包括Arxiozyma属、Ascobotryozyma属、固囊酵母属(Citeromyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、德克酵母属(Dekkera)、假囊酵母属(Eremothecium)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、Kazachstania属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Kodamaea属、路德酵母属(Lodderomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、Saturnispora属、Tetrapisispora属、有孢圆酵母属(Torulaspora)、拟威尔氏酵母属(Williopsis)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)。在本发明中可能有用的其它酵母类型包括耶氏酵母属(Yarrowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、黑粉酵母属(Filobasium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、布勒掷孢酵母属(Bullera)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)和拟线黑粉酵母属(Filobasidella)。
[0212] 在本发明的优选实施方案中，能交配的酵母是毕赤氏酵母属的成员或是另一种甲基营养生物。在本发明的另一优选实施方案中，毕赤氏酵母属能交配的酵母是下列物种之一：巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤酵母和多形汉逊氏酵母(安格斯毕赤酵母)。在本发明的特别优选的实施方案中，毕赤氏酵母属能交配的酵母是物种巴斯德毕赤氏酵母。
[0213] 单倍体酵母细胞：在其正常基因组(染色体组)中每个基因具有单个拷贝的细胞。
[0214] 多倍体酵母细胞：具有其正常基因组(染色体组)一个以上拷贝的细胞。
[0215] 二倍体酵母细胞：在其正常基因组中基本上每个基因都有两个拷贝(等位基因)的细胞，通常通过两个单倍体细胞的融合(交配)过程形成。
[0216] 四倍体酵母细胞：在其正常基因组中基本上每种基因都有四个拷贝(等位基因)的细胞，通常通过两个二倍体细胞的融合(交配)过程形成。四倍体可以携带两个、三个或四个不同的表达盒。在酿酒酵母中可通过将纯合异宗配合的a／a与α／α二倍体进行选择性交配，而在毕赤氏酵母中可通过将单倍体连续交配获得营养缺陷型二倍体，获得这些四倍体。例如，可将[inet his]单倍体与[ade his]单倍体交配获得二倍体[his]；并且可将[met arg]单倍体与[ade arg]单倍体交配获得二倍体[arg]；然后可将二倍体[his]与二倍体[arg]交配获得四倍体原养型。本领域技术人员应理解，提到的二倍体细胞的优点和用途也可适用于四倍体细胞。
[0217] 酵母交配：两个酵母细胞融合形成单个酵母细胞的过程。融合细胞可为单倍体细胞或具更高倍数性的细胞(例如，使两个二倍体细胞交配产生四倍体细胞)。
[0218] 减数分裂：二倍体酵母细胞进行减数分裂形成四个单倍体孢子产物的过程。然后每个孢子可发芽并形成单倍体无性生长细胞系。
[0219] 选择标记：选择标记是赋予接受(例如通过转化事件)该基因的细胞以生长表型(物理生长特征)的基因或基因片段。选择标记允许该细胞在未接受该选择标记基因的细胞不能生长的条件下，在选择性生长培养基中存活并生长。选择标记基因通常分成几类，包括：正选择标记基因，例如赋予细胞对抗生素或其它药物，将两种温度敏感性(“ts”)突变体杂交或转化ts突变体时的温度的抗性的基因；负选择标记基因，例如赋予细胞在不含没有该生物合成基因的所有细胞需要的特殊营养素的培养基中生长的能力的生物合成基因，或使细胞不能像不含野生型基因的细胞般生长的诱变生物合成基因等等。适合的标记包括但不限于ZEO、NEO(G418)、LYS3、MET1、MET3a、ADE1、ADE3、URA3等。
[0220] 整合：遗传元件(通常为异源遗传元件)共价连接到生物染色体中。
[0221] 串联整合：遗传元件的两个或更多个拷贝整合到染色体中的相邻位置。所述两个或更多个拷贝不一定有取向；例如，对于转录基因而言，一些拷贝可从沃森链(Watson strand)转录而其它拷贝从克里克链(Crick strand)转录。
[0222] 宿主细胞：在本公开的上下文中，术语宿主细胞指含有异源基因的细胞(例如，真核细胞如毕赤酵母细胞)。例如，异源基因可以是为了表达所需多亚基复合物的亚基而提供，是蛋白质折叠(例如，伴侣蛋白)、表达或分泌中牵涉的基因和／或另一所需基因。异源基因可整合到真核细胞的基因组中或含在染色体外元件例如质粒或人工染色体中。
[0223] 表达载体：这些DNA载体含有利于操纵靶宿主细胞中的外源蛋白表达的元件。为了方便，首先在细菌宿主(例如大肠杆菌(E.coli))中进行对序列的操纵和用于转化的DNA的生成，并且载体通常将包括利于此类操纵的序列，包括细菌复制起点和适当的细菌选择标记。选择标记编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中将不能存活。典型选择基因编码如下性质的蛋白质：(1)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，(2)补充营养缺陷型的缺陷，或(3)供给不能由复合培养基获得的重要营养素。例如，在Burke，D.、Dawson，D.和Stearns，T.(2000).Methods in yeast genetics：a Cold Spring Harbor Laboratory course inanual.Plainview，N.y：Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了用于酵母转化的示例性载体和方法，其通过引用整体并入本文。
[0224] 用于本发明方法的表达载体还可包括酵母特定序列，包括用于鉴定经转化酵母菌株的可选择营养缺陷型或药物标记。药物标记还可用于选择扩增酵母宿主细胞中的载体拷贝数。
[0225] 目标多肽编码序列通常与为了在酵母细胞中表达多肽而提供的转录和翻译调控序列可操作地连接。这些载体组分可包括但不限于下列一项或多项：增强子元件、启动子和转录终止序列。还可包括用于分泌多肽的序列，例如信号序列等。因为表达载体常常整合到酵母基因组中，所以酵母复制起点可任选。
[0226] 虽然任选，但是在本发明的一个实施方案中，多亚基复合物的一个或多个亚基与为了将表达的多肽分泌到培养基中而提供的分泌序列可操作地连接或融合，这可利于收获和纯化异源多亚基复合物。甚至更加优选，分泌序列是为了多肽从宿主细胞(例如，酵母二倍体细胞)的优化地分泌而提供，例如通过选择优选密码子和／或通过密码子选择改变AT百分比。在本领域中已知，分泌效率和／或稳定性可受分泌序列的选择影响并且最优分泌序列在不同蛋白质之间可以不同(见，例如，Koganesawa等，Protein Eng.2001年9月；14(9)：705-10，其通过引用整体并入本文)。在本领域中已知许多可能适合的分泌信号并且可容易地测试其对特定异源多亚基复合物产量和／或纯度的影响。任何分泌序列均可能使用，包括酵母和其它物种的分泌蛋白中存在的分泌序列以及工程化分泌序列。可利用的示例性分泌序列包括：鸡溶菌酶(CLY)信号肽(MRSLLILVLCFLPLAALG(SEQ ID NO：31))、CLY-L8(MRLLLLLLLLPLAALG(SEQ ID NO：32))、酿酒酵母转化酶(SUC2)信号肽(MLLQAFLFLLAGFAAKISA(SEQ ID NO：33))、MF-α(Prepro)(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLE KR(SEQ ID NO：34))、MF-α(Pre)-apv(MRFPSIFTAVLFAASSALA-A PV(SEQ ID NO：35))、MF-α(Pre)-apv-SLEKR(MRFPSIFTAVLFAAS SALA-APVSLEKR(SEQ ID NO：36))、MF-α(Prepro)-(EA)3(MRFPSI FTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR-EAEAEA(SEQ ID NO：37))、αF 信 号 肽 (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPA EAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSL EKR(SEQ ID NO：38))、KILM1 信 号 肽 (MTKPTQVLVRSVSILFFIT LLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR(SEQ ID NO：39))、阻 抑 性 酸 性 磷 酸 酶(PHO1) 信 号 肽 (MFSPILSLEIILALATLQSVFA(SEQ ID NO：40))、黑 曲 霉 GOX信 号 肽(MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR(SEQ ID NO：41))、西方许 旺 酵母 (Schwanniomyces occidentalis)葡糖 淀 粉酶 基 因(GAM1)信 号 肽(MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA(SEQ ID NO：42))、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS RGVFRR(SEQ ID NO：43))、无前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO：44))、ISN信号肽(MALWM RLLPLLALLALWGPDPAAA(SEQ ID NO：45))、IFN 信 号 肽 (MKYT SYILAFQLCIVLGSLGCDLP(SEQ ID NO：46))、HGH 信 号肽(MAA DSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA(SEQ ID NO：47))、植物血球凝集素(PHA)(MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG(SEQ ID N O：48))、蚕 溶 菌酶 (MQKLIIFALVVLCVGSEA(SEQ ID NO：49))、人溶菌酶(LYZ1)(MKALIVLGLVLLSVTVQG(SEQ ID NO：50))、1型激活素受体(MVDGVMILPVLIMIALPSPS(SEQ ID NO：51))、II型激活素受体(MGAAAKLAFAVFLISCSSG(SEQ ID NO：52))、巴斯德毕赤酵母免疫球蛋白结合蛋白(PpBiP)(MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVV VPFAKPVRA(SEQ ID NO：53))、和人抗体3D6轻链前导序列(MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO：54))。见Hashimoto等，Protein Engineering第11卷2号，第75-77页，1998年；
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Raemaekers 等，Eur J Biochem.1999 年 10 月 1 日；265(1)：394-403；Koganesawa 等，Protein Eng.(2001)14(9)：705-710；Daly等，Protein Expr Purif.2006年4月；46(2)：
456-67；Damasceno等，APPl Microbiol Biotechnol(2007)74：381-389；和Felgenhauer等，Nucleic Acids Res.1990年8月25日；18(16)：4927，其各自通过引用整体并入本文。
多亚基复合物也可分泌到培养基中而不与分泌信号可操作地连接或融合。例如，已经证明，当在巴斯德毕赤酵母中表达时，即使不与分泌信号连接或融合，一些异源多肽也分泌到培养基中。另外，可使用本领域已知的方法从宿主细胞纯化多亚基复合物(例如，如果复合物分泌较差，可优选)。
Oka等，Biosci Biotechnol Biochem.1999年11月；63(11)：1977-83；Gellissen等，FEMS Yeast Research5(2005)1079-1096；Ma 等，Hepatology.2005 年 12 月；42(6)：1355-63；
Raemaekers 等，Eur J Biochem.1999 年 10 月 1 日；265(1)：394-403；Koganesawa 等，Protein Eng.(2001)14(9)：705-710；Daly等，Protein Expr Purif.2006年4月；46(2)：
456-67；Damasceno等，APPl Microbiol Biotechnol(2007)74：381-389；和Felgenhauer等，Nucleic Acids Res.1990年8月25日；18(16)：4927，其各自通过引用整体并入本文。
多亚基复合物也可分泌到培养基中而不与分泌信号可操作地连接或融合。例如，已经证明，当在巴斯德毕赤酵母中表达时，即使不与分泌信号连接或融合，一些异源多肽也分泌到培养基中。另外，可使用本领域已知的方法从宿主细胞纯化多亚基复合物(例如，如果复合物分泌较差，可优选)。
[0227] 可从培养物中回收包含所需多亚基复合物的培养基或细胞。任选地，分泌的蛋白质可纯化。例如，可使用机械、化学、酶和／或渗透方法(例如，用液氮冷冻、使用均化器、球状质体化、超声处理、在玻璃珠的存在下搅拌、使用洗涤剂等)溶解包含所需多亚基复合物的细胞。可使用本领域已知的方法浓缩、过滤、透析所需多亚基复合物等。例如，可基于其分子质量(例如，尺寸排阻色谱法)、等电点(例如，等电聚焦)、电泳迁移率(例如，凝胶电泳)、疏水作用色谱(例如，HPLC)、电荷(例如，离子交换色谱法)、亲和力(例如，在为抗体的情况下，与蛋白A、蛋白G和／或所需抗体结合的表位的结合)和／或糖基化状态(例如，通过凝集素结合亲和力检测)纯化所需多亚基复合物。可进行多个纯化步骤以获得所需水平的纯度。在一个示例性实施方案中，所需多亚基复合物可包含免疫球蛋白恒定结构域并且可使用蛋白A或蛋白G亲和、尺寸排阻色谱法纯化，并且没有与凝集素结合(以去除糖基化形式)。任选地，可添加A蛋白酶抑制剂，例如苯甲基磺酰氟以抑制纯化期间的蛋白水解降解。
[0228] 当置于和另一核酸序列的功能性关系中时，核酸“可操作地连接”。例如，如果信号序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白，与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”指相连DNA序列邻近，并且在分泌前导序列的情况下邻近且位于阅读框中。然而，增强子不一定邻近。相连是通过便利限制性位点处的连接或经本领域技术人员熟悉的PCR／重组法实现(Technology；Invitrogen，Carlsbad，California)。如果不存在此类位点，则依照常规实践可使用合成的寡核苷酸适配子或连接子。所需核酸(包括含可操作连接序列的核酸)也可通过化学合成生成。
[0229] 启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′)(通常在约100-1000bp内)的非翻译序列，它控制与之可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子分为几类：诱导型、组成型和阻抑型启动子(其响应于阻抑物的缺乏提高转录水平)。诱导型启动子可响应于培养条件的某些变化(例如营养素的存在或缺乏或温度的变化)而提高受它控制的DNA的转录水平。
[0230] 酵母启动子片段也可用作将表达载体同源重组和整合到酵母基因组相同位点的位点；可选地，使用选择标记作为同源重组的位点。在Cregg等，(1985)Mol.Cell.Biol.5：3376-3385中描述了毕赤氏酵母的转化，其通过引用整体并入本文。
[0231] 来自毕赤氏酵母的适合启动子的实例包括CUP1(受培养基中铜的水平诱导)、四环素诱导型启动子、硫胺诱导型启动子、AOX1启动子(Cregg等，(1989)Mol.Cell.Biol.9：1316-1323)、ICL1启动子(Menendez等，(2003)Yeast20(13)：1097-108)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP)(Waterham等，(1997)Gene186(1)：37-44)和FLD1启动子(Shen等，(1998)Gene216(1)：93-102)。GAP启动子是强组成型启动子而CUP1、AOX和FLD1启动子是诱导型。每个前述参考文献通过引用整体并入本文。
[0232] 其它酵母启动子包括ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5、Pyk和源自其中的嵌合启动子。另外，在本发明中可使用非酵母启动子，例如哺乳动物、昆虫、植物、爬行动物、两栖动物、病毒和禽类启动子。最通常的情况下，启动子将包括哺乳动物启动子(对表达基因可能为内源性)或将包括为在酵母系统中有效转录而提供的酵母或病毒启动子。
[0233] 不但可直接重组生成目标多肽，而且可作为与异源多肽(例如信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N端具有特异性裂解位点的其它多肽)的融合多肽。一般而言，信号序列可为载体的组分，或者它可为插入载体的多肽编码序列的一部分。优先选择的异源信号序列是受到宿主细胞内可用的标准途径之一识别和加工的信号序列。酿酒酵母α因子前原信号(pre-pro signal)已经证明在多种重组蛋白从巴斯德毕赤氏酵母的分泌中有效。其它酵母信号序列包括α交配因子信号序列、转化酶信号序列和源自分泌的其它酵母多肽的信号序列。另外，这些信号肽序列可经工程化以在二倍体酵母表达系统中增强分泌而提供。其它目标分泌信号还包括哺乳动物信号序列，其可能对于所分泌的蛋白质异源，或者可能对于所分泌的蛋白质而言是天然序列。信号序列包括前肽(pre-peptide)序列，而且在有些情况下可包括原肽(propeptide)序列。本领域已知许多此类信号序列，包括在免疫球蛋白链中发现的信号序列，例如K28前毒素原(preprotoxin)序列、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信号序列、人Ig重链、人Ig轻链等等。例如，见Hashimoto等，Protein Eng11(2)75(1998)；和Kobayashi等Therapeutic Apheresis2(4)257(1998)，其各自通过引用整体并入本文。
[0234] 可通过在载体中插入转录激活子序列来提高转录。这些激活子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，其作用于启动子以提高其转录。转录增强子相对不依赖于取向和位置，已经发现位于转录单位的5′端和3′端，内含子以及自身编码序列中。可将增强子剪接到表达载体中，位于编码序列的5′端或3′端，但是优选位于启动子的5′位点。
[0235] 用于真核宿主细胞的表达载体还可含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区中翻译终止密码子的3′端获得。这些区域含有转录成mRNA非翻译部分中的多聚腺苷酸片段的核苷酸区段。
[0236] 采用标准连接技术或PCR／重组方法来构建含一种或多种以上所列组分的适合载体。以期望的形式将分离的质粒或DNA片段裂解、剪裁并重新连接或者通过重组方法生成所需质粒。为了分析确认所构建质粒中的正确序列，使用连接混合物转化宿主细胞，并且在适当的情况下通过抗生素抗性(例如氨苄青霉素或Zeocin)选择成功的转化体。由转化体制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析和／或测序。
[0237] 作为限制性切割和连接片段的替代方法，可使用基于an位点和重组酶的重组方法将DNA序列插入载体中。例如，Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58：913-949描述了此类方法；并且为本领域技术人员所知。此类方法利用由λ噬菌体和大肠杆菌编码的重组蛋白的混合物介导的分子间DNA重组。重组发生在相互作用的DNA分子上的特异性附着(att)位点之间。关于att位点的描述，见Weisberg和Landy(1983)Site-Specific Recombination in Phage Lambda，in Lanbda II，Weisberg编辑(Cod Spring Hatbor,N.y：Cold Spring Harbor Press)，第211-250页。转换重组位点两侧的DNA区段，以致重组后，att位点是由每种亲本载体提供的序列构成的杂交序列。重组可发生在具有任何拓扑结构的DNA之间。每个前述参考文献均通过引用整体并入本文。
[0238] 可通过将目标序列连接到适当载体中；通过使用特异性引物生成含att B位点的PCR产物；生成克隆到含有att位点的适当载体中的cDNA文库等等将an位点引入目标序列。
[0239] 单顺反子和多顺反子基因。单顺反子基因编码含仅翻译一种蛋白质的遗传信息的RNA。多顺反子基因编码含翻译一种以上蛋白质的遗传信息的mRNA。多顺反子基因中编码的蛋白质可具有相同或不同序列或其组合。双顺反子或二顺反子指编码两种蛋白质的多顺反子基因。多顺反子基因任选包括一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)元件以利于非帽子依赖性翻译开始，所述元件可位于可以独立于和nRNA分子5′末端结合的5′-帽子结构驱动下游蛋白质编码区域翻译的位置。可使用任何已知IRES序列(例如，病毒、真核或人工来源)。例如，如Thompson等(2001)PNAS98：12972-12977中所述，可使用基因间区域中的蟋蟀麻痹病毒IRES序列。任选地，IRES功能可通过遗传改变加强，例如通过引起eIF2激酶GCN2的组成型表达或破坏两个破坏(相同)的起始tRNA(met)基因。
[0240] 如本文所使用，折叠指多肽和蛋白质的三维结构，其中氨基酸残基之间的相互作用起到了稳定结构的作用。虽然非共价相互作用在决定结构时很重要，但是目标蛋白通常具有由两个半胱氨酸残基形成的分子内和／或分子间共价二硫键。对于天然存在的蛋白质和多肽或其衍生物和变体而言，正确折叠通常是产生最佳生物学活性的排列，而且可以通过测定法方便监测活性，例如配体结合、酶促活性等。
[0241] 在一些情况下，例如当所需产物源自合成时，基于生物学活性的测定法的意义将降低。可根据物理性质、能量因素、建模研究等来确定此类分子的正确折叠。
[0242] 可通过引入编码增强折叠和二硫键形成的一种或多种酶(即折叠酶、伴侣蛋白等)的序列进一步修饰表达宿主。可使用如本领域已知的载体、标记等在酵母宿主细胞中组成性或诱导性表达此类序列。优选地，通过靶向方法学将包括足以实现所需表达模式的转录调控元件在内的序列稳定整合到酵母基因组中。
[0243] 例如，真核PDI不但是蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的有效催化剂，而且还展示出伴侣蛋白活性。PDI的共表达可利于具有多个二硫键的活性蛋白的生成。同样感兴趣的是BIP(免疫球蛋白重链结合蛋白)、亲环素等的表达。在本发明的一个实施方案中，可由通过交配产生的酵母菌株表达多亚基复合物，其中每一种单倍体亲本菌株表达一种不同的折叠酶，例如一种菌株可能表达BIP，而另一种菌株可能表达PDI或其组合。
[0244] 术语“所需蛋白”或“靶蛋白”可以互换使用，通常指异源多亚基蛋白，例如本文所述的人源化抗体或其结合部分。
[0245] 术语“抗体”包括任何含多肽链的分子结构，所述分子结构具有适合且识别表位的特定形状，其中一种或多种非共价结合相互作用稳定了分子结构与表位之间的复合物。原型抗体分子为免疫球蛋白，而且认为来自所有来源例如人、啮齿类动物、兔、牛、绵羊、猪、犬、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等的所有类型的免疫球蛋白、IgG、IgM、IgA、IgE、TgD等都是“抗体”。根据本发明用作原材料生成抗体的优选来源为兔。已经描述了许多抗体编码序列；并且通过本领域众所周知的方法可产生其它抗体编码序列。其实例包括嵌合抗体、人抗体和其它非人哺乳动物抗体、人源化抗体、单链抗体(例如scFv)、骆驼抗体、纳米抗体、IgNAR(源自鲨鱼的单链抗体)、小模块免疫药物(SMIP)和抗体片段例如Fab、Fab′、F(ab′)2等。见Streltsov V A等，Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype，Protein Sci.2005年11月；14(11)：2901-9.Epub2005年9月30日；Greenberg A S等，A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks，Nature.1995 年 3月 9 日；374(6518)：168-73；Nuttall S D 等，Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks，and use as a scaffold for the display of protein loop libraries，Mol Immunol.2001年8月；38(4)：313-26；
Hamers-Castennan C等，Naturally occurring antibodies devoid of light chains，Nature.1993 年 6 月 3 日；363(6428)：446-8；Gill D S 等，Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds，Curr Opin Biotechnol.2006 年 12 月；
17(6)：653-8.Epub2006年10月19日。前述每个参考文献均通过引用整体并入本文。
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17(6)：653-8.Epub2006年10月19日。前述每个参考文献均通过引用整体并入本文。
[0246] 例如，可以通过基因工程生成抗体或抗原结合片段。在这种技术中，正如其它方法一样，使抗体生成细胞对所需抗原或免疫原敏化。使用由抗体生成细胞分离的信使RNA作为模板以使用PCR扩增制备cDNA。通过将扩增得到的免疫球蛋白cDNA的适合区段插入表达载体中，生成每个都含有保留了最初抗原特异性的一个重链基因和一个轻链基因的载体文库。通过合并重链基因文库和轻链基因文库构建组合文库。这导致了共表达重链和轻链(组装抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆文库。将携带这些基因的载体共转染到宿主细胞中。在经转染宿主中诱导抗体基因合成时，重链和轻链蛋白自我组装，生成可以通过抗原或免疫原筛选检测的活性抗体。
[0247] 目标抗体编码序列包括由天然序列编码的序列，以及因遗传密码简并性，由与公开的核酸及其变体的序列不同的核酸编码的序列。变体多肽可包括氨基酸(aa)取代、添加或缺失。氨基酸取代可为保守性氨基酸取代或是为了消除非必需氨基酸的取代，例如为了改变糖基化位点或为了通过取代或缺失一个或多个并非功能所必需的半胱氨酸残基而将错误折叠降至最低。变体可设计成保留或具有提高的蛋白质特定区域(例如功能结构域、催化氨基酸残基等)的生物学活性。变体还包括本文公开的多肽的片段，特别是生物学活性片段和／或与功能结构域对应的片段。已知用于对克隆基因进行体外诱变的技术。本发明还包括已经使用普通分子生物学技术修饰而提高其对蛋白水解降解作用的抗性或优化了溶解性质或使之更适于作为治疗剂的多肽。
[0248] 可通过将从一个物种的抗体生成细胞获得的轻链和重链可变区(VL和VH)与从另一个物种得到的轻链和重链恒定区合并在一起，通过重组方法生成嵌合抗体。通常，嵌合抗体利用啮齿类或兔可变区和人恒定区，以便生成人结构域为主的抗体。此类嵌合抗体的生成在本领域是众所周知，而且可通过标准方法来实现(例如美国专利No.5,624,659中所述，其通过引用整体并入本文)。进一步考虑到，本发明嵌合抗体的人恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgG10、IgG11、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18或IgG19恒定区。
[0249] 人源化抗体经工程化含有甚至更多人样免疫球蛋白结构域，而且只并入了动物源性抗体的互补决定区。这是通过仔细检查单克隆抗体可变区超变环的序列并使之适合人抗体链的结构而完成的。虽然表面上复杂，但是实际上该过程简单直接。见，例如美国专利No.6,187,287，其通过引用全部并入本文。先前在出版的美国专利No.7935340中已经描述了使抗体人源化的方法，其公开内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，必须确定是否需要另外的兔骨架残基来维持活性。在一些情况下，人源化抗体仍需保留一些关键的兔骨架残基以使亲和力或活性丧失最小化。在这些情况下，必须将来自人生殖系序列的单个或多个骨架氨基酸变回到原始兔氨基酸，以便具有所需活性。用实验方法测定这些变化以鉴定哪些兔残基是保持亲和力和活性所必须的。
[0250] 除完整免疫球蛋白(或其重组对应物)外，还可合成包含表位结合位点的免疫球蛋白片段(例如Fab′、F(ab′)2或其它片段)。可利用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或最小免疫球蛋白。例如，可通过合成融合的轻链可变区和重链可变区来生成用于本发明的“Fv”免疫球蛋白。对抗体的组合同样感兴趣，例如包含两种不同Fv特异性的双链抗体。在本发明的另一实施方案中，SMIP(小分子免疫药物)、骆驼抗体、纳米抗体和IgNAR为免疫球蛋白片段所涵盖。
[0251] 可在翻译后修饰免疫球蛋白及其片段，例如添加效应部分例如(化学连接子)、可检测部分(例如荧光染料、酶、毒素、底物、生物发光物质、放射性物质、化学发光部分等)或特异性结合部分(例如链霉亲和素、亲和素或生物素)等，它们可用于本发明的方法和组合物。下文提供了另外的效应分子的实例。
[0252] 产物相关变体：除所需产物(例如，所需多亚基复合物)外，存在于所需产物的制剂中并且与所需产物有关的产物。示例性产物相关变体包括截短或延长的肽，糖基化与所需糖基化不同的产物(例如，如果需要非糖基化产物，则将任何糖基化产物视为产物相关变体)，有化学计量异常、组装不正确、二硫键异常、折叠异常或不完全、聚集、蛋白酶裂解或其它异常的复合物。示例性的产物相关变体可表现出以下一项或多项的改变：分子质量(例如，通过尺寸排阻色谱法检测)、等电点(例如，通过等电聚焦检测)、电泳迁移率(例如，通过凝胶电泳检测)、磷酸化状态(例如，通过质谱法检测)、电荷质量比(例如，通过质谱法检测)、蛋白水解片段的质量或同一性(例如，通过质谱法或凝胶电泳检测)、疏水性(例如，通过HPLC检测)、电荷(例如，通过离子交换色谱法检测)、亲和力(例如，在为抗体的情况下，通过与蛋白A、蛋白G和／或所需抗体结合的表位的结合检测)和糖基化状态(例如，通过凝集素结合亲和力检测)。当所需蛋白为抗体时，术语产物相关变体可包括糖基-重链变体和／或半抗体种类(描述如下)。
[0253] 示例性的产物相关变体包括含异常二硫键的变体形式。例如，大多数IgG1抗体分子被总计16个链内和链间二硫桥键稳定，二硫桥键稳定了重链和轻链中IgG结构域的折叠，而链间二硫桥键稳定了重链和轻链之间的缔合。其它抗体类型同样含稳定链内和链间二硫键的特征。进一步地，一些抗体(包括本文公开的Ab-A和Ab-B)含有称为不规范二硫键的附加二硫键。因此，由于缺乏对附加亚基的稳定共价键和／或二硫键，所以异常的链间二硫键可导致异常的复合物化学计量。另外，异常的二硫键(无论链间还是链内)可降低抗体的结构稳定性，这可导致活性降低、稳定性降低、形成聚集物的倾向增加和／或免疫原性增加。可用多种方法检测含异常二硫键的产物相关变体，包括非还原变性SDS-PAGE、毛细管电泳、cIEX、质谱法(任选经化学修饰在游离半胱氨酸中产生质量偏移)、尺寸排阻色谱法、HPLC、光散射变化和本领域已知的任何其它适合方法。见，例如，The Protein Protocols Handbook2002年，第五部分，581-583，DOI：10.1385／1-59259-169-8：581。
[0254] 半抗体、半抗体种类或H1L1指包括单条重链和单条抗体轻链，但是缺乏对第二抗体重链和轻链的共价键的蛋白复合物。两个半抗体可在相同条件下保持非共价缔合(这可产生与全抗体类似的特性，例如通过尺寸排阻色谱法测定的表观分子量)。类似地，H2L1指包括两条抗体重链和单条抗体轻链，但是缺乏对第二抗体轻链的共价键的蛋白复合物；这些复合物也可与另一条抗体轻链非共价缔合(并且同样产生与全抗体类似的特性)。与全抗体一样，半抗体种类和H2L1种类可在还原条件下离解成单条重链和轻链。可在非还原SDS-PAGE凝胶上检测半抗体种类和H2L1种类为以低于全抗体的表观分子量迁移的种类，例如H1L1在全抗体约一半的表观分子量(例如，约75kDa)下迁移。
[0255] 糖基-重链变体指有时存在于抗体制剂中并且至少含有部分Fc序列的糖基化产物相关变体。糖基-重链变体的特征在于，通过SDS-PAGE(相对于正常重链)可观察到的电泳迁移率降低，凝集素结合亲和力降低，与抗Fc抗体的结合降低和通过尺寸排阻色谱法测定，含糖基-重链变体的抗体复合物的表观分子量更高。见2011年8月31日提交的美国临时申请序列No.61/525,307(代理人案号67858.730200)，其通过引用整体并入本文。
[0256] 术语“稳定表达或长时间表达所需分泌型异源多肽的多倍体酵母”指在阈值表达水平下，通常为至少50-500mg／L(培养约90h后)并且优选本质上更高，分泌所述多肽至少几天到一周，更优选至少一个月，还更优选至少1-6个月并且甚至更加优选一年以上的酵母培养物。
[0257] 术语“分泌所需量的重组多肽的多倍体酵母培养物”指稳定或长时间地分泌至少50-500mg/L并且更加优选500-1000mg／L或更多的培养物。
[0258] 如果根据遗传密码翻译多核苷酸序列产生多肽序列(即，多核苷酸序列“编码”多肽序列)，则多核苷酸序列与多肽序列“对应”，如果两个序列编码同一多肽序列，则一个多核苷酸序列与另一核苷酸序列“对应”。
[0259] DNA构建体的“异源”区域或结构域是在较大DNA分子中，发现在自然界中不与较大分子缔合的DNA可识别区段。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，基因两侧通常是在源生物基因组中不在哺乳动物基因组DNA两侧的DNA。异源区域的另一实例是编码序列本身在自然界中不存在的构建体(例如，基因组编码序列含有内含子的eDNA或密码子与天然基因不同的合成序列)。等位变异或天然存在的突变事件不会产生如本文所定义的DNA的异源区域。
[0260] “编码序列”是对应或编码蛋白质或肽序列的密码子框内序列(由遗传密码来看)。如果序列或其互补序列编码相同氨基酸序列，则两个编码序列相互对应。与适当调控序列缔合的编码序列可经转录并翻译为多肽。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3′端。“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且引发下游(3′方向)编码序列转录的DNA调控区。启动子序列通常含有用于结合影响编码序列转录的调控分子(例如，转录因子)的附加位点。当RNA聚合酶结合细胞中的启动子序列并将编码序列转录为mRNA，然后mRNA依次翻译为编码序列所编码的蛋白质时，编码序列受启动子序列的“控制”或与启动子序列“可操作地连接”。
[0261] 使用载体向生物体或宿主细胞中引入外源物质，例如DNA、RNA或蛋白质。典型载体包括重组病毒(对于多核苷酸而言)和脂质体(对多肽而言)。“DNA载体”为复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一多核苷酸区段可附于其上以致引起所附区段的复制。“表达载体”是DNA载体，其含有将指导适当宿主细胞的多肽合成的调控序列。这通常意味着结合RNA聚合酶并引发mRNA的转录的启动子，以及核糖体结合位点和指导mRNA翻译为多肽的起始信号。向表达载体的恰当位点和正确阅读框内并入多核苷酸序列，接着用载体转化适当宿主细胞，使得能够生成所述多核苷酸序列编码的多肽。
[0262] 多核苷酸序列的“扩增”是在体外生成特定核酸序列的多个拷贝。扩增的序列通常呈DNA形式。在下列综述文章中描述了进行此类扩增的多种技术，其各自通过引用整体并入本文：Van Brunt1990，Bio／Technol.，8(4)：291-294；和Gill和Ghaemi，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2008年3月；27(3)：224-43。聚合酶链式反应或PCR是核酸扩增的原型，并且本文PCR的使用应视为其它适合扩增技术的示例。
[0263] 现很好理解大多数脊椎动物(包括哺乳动物)中抗体的一般结构(Edelnan，G M.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，190：5(1971))。常规抗体由分子量约23，000道尔顿的两条相同多肽轻链(“轻链”)和分子量53，000-70,000的两条相同重链(“重链”)组成。4条链呈“Y”构型通过二硫键连接，其中轻链托住从“Y”构型开口处开始的重链。将“Y”构型的“分支”部分指定为Fab区；将“Y”构型的茎干部分指定为FC区。氨基酸序列取向为从“Y”构型顶部的N末端到每条链底部的C末端。N末端具有对诱导它的抗原有特异性的可变区，并且长度为约100个氨基酸，在轻链和重链及抗体之间稍有不同。
[0264] 每条链中可变区与恒定区连接，恒定区延伸链的剩余长度并且在特定类别的抗体中不会随抗体的特异性(即，诱导它的抗原)而变化。已知5大类决定免疫球蛋白分子类别的恒定区(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE对应于γ、μ、α、δ和ε重链恒定区)。恒定区或类别决定抗体的后续效应功能，包括激活补体(Kabat，E.A.，Structural Concepts inImmunology and Immunochemistry，第2版，第413-436页，Holt，Rinehart，Winston(1976))和其它细胞反应(Andrews，D.W.等，Clinical Immunobiology，第1-18页，W.B.Sanders(1980)；Koh1，S.等，Immunology，48：187(1983))；而可变区决定将与之反应的抗原。轻链分为κ或λ。每个重链类别可与κ或λ轻链配对。轻链和重链相互共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤或B细胞生成时，两条重链的“尾”部通过共价二硫键相互键合。
[0265] 表述“可变区”或“VR”指抗体每对轻链和重链中直接牵涉于使抗体与抗原结合的结构域。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，后面是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在其另一端有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
[0266] 表述“互补决定区”、“超变区”或“CDR”指在抗体轻链或重链的可变区中发现的一个或多个超变或互补决定区(CDR)(见Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，(1987))。这些表述包括如Kabat等定义的超变区(″Sequences of Proteins of Immunological Interest,″Kabat E.等，US Dept.of Health and Human Services，1983)或抗体三维结构中的超变环(Chothia和Lesk，J Mol.Biol.196901-917(1987))。每条链中的CDR保持紧密靠近骨架区并且，和来自另一条链的CDR一起，有助于形成抗原结合位点。在CDR中有已经作为选择性决定区(SDR)描述的选择氨基酸，其表示抗体-抗原相互作用中CDR使用的关键接触残基(Kashmiri，S.，Methods，36：25-34(2005))。
[0267] 表述“骨架区或“FR”指抗体轻链和重链可变区中的一个或多个骨架区(见Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，(1987))。这些表述包括置于抗体轻链和重链可变区中的CDR之间的那些氨基酸序列区域。
[0268] 表述“稳定拷贝数”指宿主细胞在长时间内(例如至少一天、至少一周或至少一个月或更长)或在更多增殖代数(例如，至少30、40、50、75、100、200、500或1000代或更多)大体上维持基因(例如抗体链基因)的拷贝数。例如，在给定时间点或世代数，培养物中至少50％，并且优选至少70％、75％、85％、90％、95％或更多的细胞可维持与原始细胞相同的基因拷贝数。在一个优选实施方案中，宿主细胞含有所需多亚基复合物(例如，抗体)的每个亚基的稳定拷贝数。
[0269] 表述“稳定表达”指宿主细胞在长时间内(例如至少一天、至少一周或至少一个月或更长)或在更多增殖代数(例如，至少30、40、50、75、100、200、500或1000代或更多)维持基因或蛋白质(例如抗体)的相似表达水平。例如，在给定时间点或世代数，基因或蛋白质的生产率或产量可为初始生产率的至少50％，并且优选至少70％、75％、85％、90％、95％或更高。在一个优选实施方案中，宿主细胞稳定表达所需多亚基复合物(例如，抗体)。
实施例
实施例
[0270] 提出下列实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的全面公开和描述，并非旨在限制视为本发明的内容的范围。已经做出努力确保关于所用数字(例如，量、温度、浓度等)的精确性，但是应容许一些实验误差和偏差。除非另外指出，份为重量份，分子量为平均分子量，温度按摄氏度计；并且压力为大气压或接近大气压。
[0271] 实施例1
[0272] 通过改变重链和轻链基因拷贝数增加抗体产量
[0273] 该实施例证明，通过改变重链和轻链基因的拷贝数可大大增加巴斯德毕赤酵母中生成的重组抗体的产量。具体而言，该实施例证明，本方法允许产生此类菌株的靶向交配。生成各自由不同拷贝数的重链和轻链基因表达人源化抗体的一组二倍体巴斯德毕赤酵母菌株，并测试所述菌株以鉴定产生更高抗体产量的基因拷贝数组合。图1提供了用于有效生成一组二倍体菌株的方法的概述(下面实施例4中提供了详细方法)。简言之，用在与分泌信号融合的启动子控制下编码重链或轻链基因的基因转化单倍体菌株。为指导整合到巴斯德毕赤酵母基因组内的特定遗传基因座中，使质粒线性化于靶基因座的同源序列中。在该实施例中，虽然也可使用其它基因座，但是将构建体整合到pGAP、3’AOX TT和HIS4TT基因座中。通过Southern印迹鉴定含抗体链基因的多个串联整合拷贝的转化体，并且选择含规定拷贝数的轻链或重链基因的单倍体菌株供将来使用。任选地，将相同抗体链基因的附加拷贝整合到单倍体菌株的第二基因座中。这些单倍体菌株的交配有效产生含规定数量的呈不同组合的轻链和重链基因的二倍体菌株。交配后，通过Southern印迹检验二倍体菌株中的基因拷贝数。
[0274] 使用这些方法，生成含编码3种人源化抗体Ab-A和Ab-B和Ab-C的重链和轻链基因的二倍体巴斯德毕赤酵母菌株。图38(Ab-A)、图39(Ab-B)和图40(Ab-C)中示出了抗体多肽和多核苷酸序列。Ab-A、Ab-B和Ab-C是源自3种不同兔抗体的人源化抗体。Ab-C对不同于Ab-A和Ab-B的抗原有特异性。
[0275] 下面表1、2和3中总结了二倍体菌株。每个菌株标识的前缀表示生成的抗体，并且H和L后面的数字分别指整合的重链和轻链基因拷贝数。例如，菌株代号Ab-A-H3xL4标示表达Ab-A并且含有重链基因的3个拷贝和轻链基因的4个拷贝的菌株。纵列标出的pGAP、3’AOX TT和HIS4TT表示在各个基因座整合的基因拷贝数。每个基因座两次列出以反映整合到同源染色体中(一个源于每个亲本单倍体菌株)。
[0276] 如实施例5中所述，在引起抗体生成和分泌的条件下在生物反应器中培养所选二倍体菌株。每条抗体链均受GAP启动子的控制，在将一些葡萄糖转化为乙醇的条件下(低氧利用率)，通过将甘油碳源转变成葡萄糖碳源上调其表达。每个抗体链基因与分泌序列的框内融合引起表达的抗体分泌到培养基中。在生长约90h(T90)时收获培养基并且如实施例6所述，通过高效液相色谱法(HPLC)测定抗体产量。
[0277] 在下表1最右边列中示出了T90时所选Ab-A表达菌株的相对抗体产量，并且在图2中用图表说明。H3xL3菌株用作参考并将其表达产量设为100％。全肉汤抗体滴度通常随抗体拷贝数增加，顺序为Ab-A-H3xL4、Ab-A-H3xL3、Ab-A-H4xL4、Ab-A-H4xL6、Ab-A-H5xL4、Ab-A-H5xL5和Ab-A-H5xL7。所有这3种Ab-A-H5菌株的产量均超过两种Ab-A-H4菌株的产量，所述Ab-A-H4菌株的产量超过两种Ab-A-H3菌株的产量。对于给定重链拷贝数而言，总产量也随轻链拷贝数增加而增加，除H3xL4的产量比H3xL3的产量低约13％外。
[0278] 从表达Ab-B的菌株获得相似产量结果，将其示于下面表2最右边列中并且在图3中用图表说明。H3xL3菌株用作参考并将其表达产量设为100％。如同Ab-A一样，Ab-B的产量通常随抗体拷贝数增加，顺序为Ab-B-H3xL3、Ab-B-H3xL4、Ab-B-H4xL3、Ab-B-H4xL5和Ab-B-H4xL6。所有这3种Ab-B-H4菌株的产量均超过两种Ab-B-H3菌株的产量。
[0279] 如下面表3最右边列中所示和图4中用图表所说明那样，增加抗体拷贝数也通常使抗体Ab-C的产量增加。抗体产量通常随抗体拷贝数增加，顺序为Ab-C-H3xL4、Ab-C-H4xL3、Ab-C-H4xL4、Ab-C-H4xL5、Ab-C-H5xL5、Ab-C-H5xL4、Ab-C-H5xL6 和Ab-C-H6xL5。在具有5个重链拷贝或更多的菌株间，产量增加相对适度。另外，相对于Ab-C-H6xL5和Ab-C-H5xL6菌株，Ab-C-H6xL6菌株在产量上展现出大幅降低，以致该菌株的产量与Ab-C-H4xL4菌株相当。
[0280] 表1.表达Ab-A的二倍体巴斯德毕赤酵母菌株的汇总。将规定拷贝数的编码Ab-A重链(Hc)和轻链(Lc)的基因整合到标示的染色体基因座中。标示相同基因组座位的列标题指同源染色体。培养并测定所选菌株以确定分泌到培养基中的抗体的产量(最右边列)。在图2中用图表说明了这些结果。
[0281]
[0282] NT：未在生物反应器中测试
[0283] 表2.表达Ab-B的二倍体巴斯德毕赤酵母菌株的汇总。将规定拷贝数的编码Ab-B重链(Hc)和轻链(Lc)的基因整合到标示的染色体基因座中。标示相同基因组座位的列标题指同源染色体。培养并测定所选菌株以确定分泌到培养基中的抗体的产量(最右边列)。在图3中用图表说明了这些结果。
[0284]
[0285] NT：未测试
[0286] 表3.表达Ab-C的二倍体巴斯德毕赤酵母菌株的汇总。将规定拷贝数的编码Ab-C重链(Hc)和轻链(Lc)的基因整合到标示的染色体基因座中。标示相同基因组座位的列标题指同源染色体。培养并测定所选菌株以确定分泌到培养基中的抗体的产量(最右边列)。在图4中用图表说明了这些结果。
[0287]
[0288] 这些结果证明，通过改变重链和轻链基因的拷贝数可大大增加3种不同抗体的产量。而且，结果证明通过使含规定拷贝数的重链基因的单倍体菌株与含有规定拷贝数的轻链基因的单倍体菌株交配，可产生含有不同(规定)拷贝数的重链和轻链基因的一组菌株。在所示菌株中，产量可超过两倍(例如，比较图2，菌株H3xL4和H5xL7)。虽然含较低基因拷贝数的菌株不包括在该实施例中，但是预计相对于此类菌株，改善幅度甚至更高。而且，虽然拷贝数超过最佳值，产量可能降低，但是通过进一步增加基因拷贝数超过举例说明的拷贝数，可能得到进一步改善。
[0289] 实施例2
[0290] 通过改变重链和轻链基因拷贝数增加抗体纯度
[0291] 该实施例证明，通过改变重链和轻链基因的拷贝数可大大增加巴斯德毕赤酵母中生成的重组抗体的纯度。通过使含规定拷贝数的重链基因的单倍体菌株与含有规定拷贝数的轻链基因的单倍体菌株交配，产生含有不同(规定)拷贝数的重链和轻链基因的菌株。在比较的菌株间，所需副产物的总产降低约20％。另外，证明在比较的菌株间单种丰度最高的副产物的产量降低达约82％。
[0292] 通过从培养基蛋白-A纯化分泌的抗体，接着使用实施例6中描述的方法进行HPLC测定抗体纯度。将样品维持在预期天然条件下以保存组装的抗体复合物，允许检测影响组装复合物的异常(例如不正确的化学计量、不当组装、聚集、蛋白酶裂解和其它畸变)。通过测量在相应于预期抗体的峰值中观察到的总信号比例测定总体纯度(保留时间约
16.7min)。示出了来自菌株Ab-A-H4xL4(图5A和图5B中的放大视图)和Ab-A-H4xL6(图
5C和图5D中的放大视图)的Ab-A制剂的示例性HPLC图。量化每条轨迹4个区域的总检
测信号，4个区域对应主峰之前的洗脱(保留时间0-14.6min)、主要产物变体峰值(保留时间15.5min)、预期抗体峰值(保留时间16.7min)和预期抗体峰值之后的洗脱(18-22min)(图5E)。来自Ab-A-H4xL4的抗体制剂的纯度约83.7％，并且来自菌株Ab-A-H4xL6的抗体制剂的纯度约87.0％。通过这种测量，通过增加轻链基因的拷贝数降低总体杂质水平约
20％(从16.3％到13％)。通过增加轻链基因的拷贝数使主要产物变体峰值(保留时间
15.5min)的丰度从8.81％显著降低到1.58％(降低82％)。
16.7min)。示出了来自菌株Ab-A-H4xL4(图5A和图5B中的放大视图)和Ab-A-H4xL6(图
5C和图5D中的放大视图)的Ab-A制剂的示例性HPLC图。量化每条轨迹4个区域的总检
测信号，4个区域对应主峰之前的洗脱(保留时间0-14.6min)、主要产物变体峰值(保留时间15.5min)、预期抗体峰值(保留时间16.7min)和预期抗体峰值之后的洗脱(18-22min)(图5E)。来自Ab-A-H4xL4的抗体制剂的纯度约83.7％，并且来自菌株Ab-A-H4xL6的抗体制剂的纯度约87.0％。通过这种测量，通过增加轻链基因的拷贝数降低总体杂质水平约
20％(从16.3％到13％)。通过增加轻链基因的拷贝数使主要产物变体峰值(保留时间
15.5min)的丰度从8.81％显著降低到1.58％(降低82％)。
[0293] 通过对Ab-B制剂的HPLC分析获得类似结果。示出了来自菌株Ab-B-H4xL3(图6A和图6B中的放大视图)和Ab-B-H4xL5(图6C和图6D中的放大视图)的抗体制剂的示例性HPLC图。来自Ab-B-H4xL3的抗体制剂的纯度约90.05％，并且来自菌株Ab-B-H4xL5的抗体制剂的纯度约92.18％。通过这种测量，通过增加轻链基因的拷贝数降低杂质水平约21％(从约10％到约7.8％)。如同Ab-A一样，主要产物变体峰值的保留时间为约15.5min。通过增加轻链基因的拷贝数使这种主要变体的丰度降低约59％(从6.26％到2.54％)(图6E)。
[0294] 也通过HPLC分析Ab-C制剂的纯度。示出了来自菌株Ab-C-H3xL3(图7A和图7B中的放大视图)和Ab-C-H5xL5(图7C和图7D中的放大视图)的抗体制剂的示例性HPLC图。主要产物变体峰值的保留时间为15.2-16.1min。通过增加轻链和重链基因的拷贝数使这种主要变体的丰度降低约39％(从6.55％到4.00％)(图7E)。
[0295] Ab-A(图8)、Ab-B(图9)和Ab-C(图10)制剂中的产物变体也显现在蛋白质凝胶上。因为样品经受了变性和还原条件，所以这种方法可检测出影响单独抗体链构造的异常，但是预计不会检测出其它类型的异常(例如，具有不适当的化学计量、聚集、蛋白酶裂解、不适当的二硫键或其它组装误差的复合物)。可通过如实施例7所述的蛋白-A亲和色谱法纯化抗体，然后通过SDS-PAGE溶解并且用考马斯蓝染色。如所预计，主条带对应于预测分子量的重链和轻链(图8中通过载有纯参考抗体的带标记“参考”确认)。在每种样品中可容易地观察到单种主要产物相关变体(图8、9和10，箭头标记出“低迁移率产物相关变体”)。相对于重链，低迁移率产物相关变体的电泳迁移率降低。在来自含有更高拷贝数轻链的菌株的抗体制剂中，特别是与Ab-A-H4xL4菌株相比在来自Ab-A-H4xL6菌株的Ab-A制剂中(图8)，与Ab-B-H4xL5菌株相比在来自Ab-B-H4xL6菌株的Ab-B制剂中(图9)和与Ab-C-H3xL3菌株相比在来自Ab-C-H5xL5菌株的Ab-C制剂中，这种产物相关变体的量明显减少。
[0296] 因此，对于3种不同抗体而言，检测杂质的两种互补方法(HPLC和SDS-PAGE)均证明，抗体轻链的拷贝数增加导致抗体纯度升高。进一步的实验(如以下实施例3所述)证明糖基化重链变体(“糖基-重链变体”)是通过两种方法检测到的主要产物相关变体的组成部分。
[0297] 实施例3
[0298] 通过改变重链和轻链基因拷贝数减少糖基化重链变体的生成
[0299] 该实施例表征了前述实施例中在重组抗体制剂中观察到的丰度最高的产物相关变体。具体地，证实产物相关变体是含有人Fc的至少一部分的糖基化多肽(“糖基-重链变体”)。证实糖基-重链变体的生成在轻链基因拷贝数增加的菌株中减少。因为糖蛋白可能比非糖基化形式更具免疫原性，所以操纵宿主细胞减少其生成可能对某些预期用途特别有益。
[0300] 通过其与含凝集素的树脂的特异性结合证明前述实施例中描述的低迁移率产物相关变体为糖蛋白。使用实施例8中描述的方法，通过SDS-PAGE和Western印迹从两种Ab-B制剂(来自H4xL5和H4xL3菌株)纯化糖蛋白并进行分析。图11A示出了利用考马斯蓝染色，通过SDS-PAGE对负载材料(左图，“载料”)和凝集素柱洗脱物(右图，“凝集素洗脱物”)的分析。在凝集素柱洗脱物中检测到3条主要条带：低迁移率产物相关变体(箭头)及轻链和重链多肽。与负载材料(图11A，左图)相比，低迁移率产物相关变体(箭头)在凝集素柱洗脱物中(图11A，右图)高度富集。这些结果表明，低迁移率产物相关变体为糖蛋白。另外，对轻链和重链多肽的共纯化强烈表明，低迁移率产物相关变体与这些多肽物理上相关。图11B示出了用偶联了辣根过氧物酶的抗HuFc抗体(GoatAntiHuFC-HRP，以1：
10,000)，通过Western印迹对负载材料(左图，“载料”)和凝集素柱洗脱物(右图，“凝集素洗脱物”)的进一步表征。如所预计，这种抗体特异性结合人重链多肽中所含的Fc序列(图11B，下方条带)。特异性检测低迁移率产物相关变体(图11B，箭头)，表明其含有重链Fc序列的至少一部分。而且，来自低迁移率产物相关变体的Western信号在凝集素柱洗脱物中高度富集，确认凝集素富集条带和含Fc的条带相同。因此，我们断定低迁移率产物相关变体是至少含有重链的Fc部分的糖蛋白，可能与含轻链和重链的复合物相关，本文将其称为“糖基-重链变体”。
10,000)，通过Western印迹对负载材料(左图，“载料”)和凝集素柱洗脱物(右图，“凝集素洗脱物”)的进一步表征。如所预计，这种抗体特异性结合人重链多肽中所含的Fc序列(图11B，下方条带)。特异性检测低迁移率产物相关变体(图11B，箭头)，表明其含有重链Fc序列的至少一部分。而且，来自低迁移率产物相关变体的Western信号在凝集素柱洗脱物中高度富集，确认凝集素富集条带和含Fc的条带相同。因此，我们断定低迁移率产物相关变体是至少含有重链的Fc部分的糖蛋白，可能与含轻链和重链的复合物相关，本文将其称为“糖基-重链变体”。
[0301] 还证实相对于Ab-B-H4xL3，在来自菌株Ab-B-H4xL5的制剂中，糖基-重链变体的相对丰度降低。在经考马斯染色的凝胶上比较由每种菌株制备的经蛋白-A纯化的抗体(图11A，左图)并且糖基-重链变体的丰度在H4xL5制剂中明显降低。和这些结果一致，相对于凝集素柱洗脱物中的(H4xL3制剂)，H4xL5制剂中糖基-重链变体的丰度也明显降低(图
11A，右图)。当用抗HuFc抗体检测糖基-重链变体时，观察到相同结果(图11B)。这些结果表明，通过改变抗体链基因的拷贝数可调整糖基-重链变体的生成。
11A，右图)。当用抗HuFc抗体检测糖基-重链变体时，观察到相同结果(图11B)。这些结果表明，通过改变抗体链基因的拷贝数可调整糖基-重链变体的生成。
[0302] 然后使用下面实施例8中描述的方法，通过HPLC分析经凝集素纯化的Ab-B制剂。在凝集素纯化之前，对于来自H4xL3(图12A和图12B中的放大视图)和H4xL5(图13A和
图13B中的放大视图)菌株的制剂而言，主峰对应于预期抗体(保留时间约16.7min)。在两种制剂中，观察到的丰度最高的产物相关变体的保留时间约15.5min。凝集素纯化后，该产物相关变体高度富集并且在来自H4xL3(图12C和图12D中的放大视图)和H4xL5(图
13C和图13D中的放大视图)菌株的制剂中变得占优势。因为产物相关变体在凝集素柱洗脱物中高度富集，所以我们断定使用还原蛋白质凝胶观察到的糖基-重链形式是保留时间为15.5min的产物相关变体的组成部分。
图13B中的放大视图)菌株的制剂而言，主峰对应于预期抗体(保留时间约16.7min)。在两种制剂中，观察到的丰度最高的产物相关变体的保留时间约15.5min。凝集素纯化后，该产物相关变体高度富集并且在来自H4xL3(图12C和图12D中的放大视图)和H4xL5(图
13C和图13D中的放大视图)菌株的制剂中变得占优势。因为产物相关变体在凝集素柱洗脱物中高度富集，所以我们断定使用还原蛋白质凝胶观察到的糖基-重链形式是保留时间为15.5min的产物相关变体的组成部分。
[0303] 下面表4中示出了图12和图13中预期峰和糖基-重链峰中所含总质量的分数。凝集素纯化之前(“载料”柱)对抗体制剂的比较提供了对抗体纯度和糖基-重链形式优势的定量评价。H4xL5制剂中糖基-重链形式的相对丰度(2.7％)不到H4xL3制剂中(6％)的一半。
[0304] 表4.通过HPLC对来自H4xL3和H4xL5菌株的制剂中Ab-B纯度的定量评价。示出了对于来自每种菌株的制剂而言，用凝集素柱纯化之前(“载料”)和之后(“凝集素洗脱物”)抗体制剂中，“糖基形式”(保留时间约15.5min)和“主峰”(保留时间16.7min，对应于预期抗体)中所含蛋白质总质量的百分数。
[0305]
[0306] 总之，这些结果表明通过改变重链和轻链基因拷贝数可改变糖基化重链的比例。因此，如果需要，操纵轻链和重链基因拷贝数可实现对糖基化抗体生成的减少，并且这可通过所选单倍体菌株的直接交配完成。
[0307] 实施例4
[0308] 生成含不同拷贝数的抗体基因的细胞组的方法
[0309] 该实施例描述了用于生成一组经转化的酵母细胞并且使经转化的细胞交配生成由不同数量的基因拷贝表达多亚基蛋白的一组二倍体细胞的方法，所述酵母细胞包含可变拷贝数的编码异源多亚基蛋白的每个亚基的基因。图1中示出了菌株生成方法学的概述。
[0310] 重链和轻链的巴斯德毕赤酵母表达载体的构建
[0311] 商业上合成轻链和重链片段并亚克隆到pGAP表达载体中(图14、15、18和20)。pGAP表达载体使用GAP启动子驱动免疫球蛋白链的表达。另外，这种载体含有常见元件例如细菌复制起点和抗生素抗性的表达盒。对于Ab-A和Ab-B而言，GAP启动子序列(长度约
500个碱基对)用于靶向整合到该基因座中。载体包括一个拷贝的卡那霉素抗性基因，其在巴斯德毕赤酵母中赋予对抗生素G418的抗性。对于Ab-C而言，AOX1转录终止序列(长度约350个碱基对)用于靶向整合到该基因座中。载体包括一个拷贝的Shble基因，其赋予TM TM
对抗生素Zeocin (腐草霉素)的抗性。G418和Zeocin 提供了选择含有整合到其基因组中的所需表达载体的菌株的方式。最后，对于Ab-A、Ab-B和Ab-C而言，用于第二轮整合的载体包括660个碱基对的巴斯德毕赤酵母基因组序列，其围绕用于靶向整合到该基因座中的HIS4转录终止子(图13、14、16和17)。对于Ab-A和Ab-B而言，用于第二轮转化的载体包括一个拷贝的Shble基因。对于Ab-C而言，用于第二轮转化的载体包括一个拷贝的卡那霉素抗性基因。
500个碱基对)用于靶向整合到该基因座中。载体包括一个拷贝的卡那霉素抗性基因，其在巴斯德毕赤酵母中赋予对抗生素G418的抗性。对于Ab-C而言，AOX1转录终止序列(长度约350个碱基对)用于靶向整合到该基因座中。载体包括一个拷贝的Shble基因，其赋予TM TM
对抗生素Zeocin (腐草霉素)的抗性。G418和Zeocin 提供了选择含有整合到其基因组中的所需表达载体的菌株的方式。最后，对于Ab-A、Ab-B和Ab-C而言，用于第二轮整合的载体包括660个碱基对的巴斯德毕赤酵母基因组序列，其围绕用于靶向整合到该基因座中的HIS4转录终止子(图13、14、16和17)。对于Ab-A和Ab-B而言，用于第二轮转化的载体包括一个拷贝的Shble基因。对于Ab-C而言，用于第二轮转化的载体包括一个拷贝的卡那霉素抗性基因。
[0312] 表达载体转化到巴斯德毕赤酵母的单倍体metl和lys3宿主菌株中
[0313] 通过电穿孔，接着用来自Pichia Protocols，第2版(Methods in Molecular Biology，Cregg，JM编辑，2007.Humana Press，Totowa，NJ)的改进方案转化巴斯德毕赤酵- -母细胞。经转化的菌株源自JC231(Lys)或JC239(Met)。用每种宿主菌株的巴斯德毕赤酵母菌落接种3-mLYPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)培养物并使其在30℃振荡下生长过夜。然后用这些培养物接种2L Thomson摇瓶中的400-mLYPD培养物，起始OD600为0.01。当OD600达到1.0-2.0时收获细胞并且重新悬浮在100mL含0.2M HEPES(pH8.0)和0.025M DTT的YPD培养基中。在30℃下培育细胞30min，然后使用1M冷山梨糖醇使体积达到400mL。在400mL1M冷山梨糖醇中洗涤细胞一次，接着在30mL冷山梨糖醇中洗涤3次，之后重新悬浮在最终体积1mL的1M冷山梨糖醇中。
[0314] 为了优先将Ab-A或Ab-B整合到GAP启动子中，在转化之前使用AvrII限制性内切核酸酶使每个载体(图14-15)线性化于GAP启动子序列中以指导载体整合到巴斯德毕赤酵母基因组的GAP启动子基因座中。为了优先将Ab-C整合到AOX1转录终止子中，使用BsiWI(对重链而言)或PvuII(对轻链而言)使每个载体(图18-19)线性化于3’AOXTT序列中。对于Ab-A和Ab-B而言，在含有G418的YPDS(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡TM
萄糖、2％琼脂、1M山梨糖醇)琼脂板上选择成功转化体。对于Ab-C而言，在含Zeocin 的YPDS琼脂板上选择成功转化体。这称为第一次基因座整合。对于Ab-A和Ab-C而言，使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集含更高拷贝的重链或轻链的克隆。简言之，在约5mL PBS中刮转化板。用对重链或轻链有特异性的荧光检测抗体将细胞染色。即使目标基因与分泌信号融合，通过FACS也可检测出阳性细胞，这显然是由于一些蛋白质至少瞬时保留在细胞表面。分选前20-40％的染色细胞并用于接种25mL BYED(3％酵母提取物、4％无水葡萄糖、
1.34％酵母氮源、0.004％生物素和100mM磷酸氢二钾)摇瓶培养物。在30℃振荡下生长过TM
夜之后，收获细胞、染色并使用FACS二次富集。在含G418(对Ab-A而言)或Zeocin (对Ab-C而言)的YPD板上划取前10-20％的染色细胞的单个菌落。对于Ab-B省略了FACS富集测定。
萄糖、2％琼脂、1M山梨糖醇)琼脂板上选择成功转化体。对于Ab-C而言，在含Zeocin 的YPDS琼脂板上选择成功转化体。这称为第一次基因座整合。对于Ab-A和Ab-C而言，使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集含更高拷贝的重链或轻链的克隆。简言之，在约5mL PBS中刮转化板。用对重链或轻链有特异性的荧光检测抗体将细胞染色。即使目标基因与分泌信号融合，通过FACS也可检测出阳性细胞，这显然是由于一些蛋白质至少瞬时保留在细胞表面。分选前20-40％的染色细胞并用于接种25mL BYED(3％酵母提取物、4％无水葡萄糖、
1.34％酵母氮源、0.004％生物素和100mM磷酸氢二钾)摇瓶培养物。在30℃振荡下生长过TM
夜之后，收获细胞、染色并使用FACS二次富集。在含G418(对Ab-A而言)或Zeocin (对Ab-C而言)的YPD板上划取前10-20％的染色细胞的单个菌落。对于Ab-B省略了FACS富集测定。
[0315] 不同拷贝数的构建体串联整合到靶基因座中(图22中有说明)。通过Southern印迹分析测定单倍体菌株的重链和轻链基因的拷贝数。简言之，用裂解整合位点两侧的序列的限制性酶消化基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳溶解，转移到膜上并且与由整合序列组成的探针杂交。限制性片段的大小随整合的拷贝数线性增长(见图22)。如果整合前基因组限制性片段的大小为Y且整合序列的长度为X，则整合N个拷贝后片段大小将为Y+NX。使用该关系，由检测片段的长度测定每个转化体的拷贝数。
[0316] 然后使具有所需拷贝数的单倍体菌株交配并选择其在两种营养缺陷型标志(即，Lys和Met)缺乏时，在BYNB(1.34％酵母氮源、2.5％琼脂、2％葡萄糖、0.1M磷酸氢二钾pH6.0)琼脂板上生长的能力。然后通过Southern印迹分析所得二倍体克隆以确认重链和轻链基因的拷贝数。通过在装有1mL含4％酵母提取物的BSM(基本盐培养基、10g／L二水柠檬酸钠、36.4g／L磷酸二氢铵、18.2g／L硫酸钾、12.8g／L磷酸二氢钾、3.7g／L七水硫酸镁、40g／L葡萄糖、40g／L酵母提取物、4.35mL／L PTM1溶液，pH6.0)的深孔板中生长48h，进一步表征表达全长单克隆抗体的二倍体克隆。然后使用生物膜层干涉技术蛋白-A生物传感器(Octet，ForteBio)量化上清液中的抗体浓度。
[0317] 为整合到第二基因组座位中，按照上述方案使用含预定拷贝数的重链或轻链的单倍体菌株制备能用于转化的感受态细胞。为优先整合到HIS4TT基因座中，使用Sca1限制性内切核酸酶使每个表达载体(图16-17和20-21)线性化于HIS4TT整合序列中以指导整TM合到该基因座中。对Ab-A和Ab-B而言，在含Zeocin 的YPDS琼脂板上选择成功转化体。
对Ab-C而言，在含G418的YPDS琼脂板上选择成功转化体。使用Southern印迹测定整合到HIS4TT基因座上的重链和轻链基因的拷贝数。使单倍体菌株交配，并且如上所述选择二倍体菌株。进行最后的Southern印迹以确认每个整合基因座处重链和轻链基因的拷贝数。
使用蛋白A生物传感器监测表达来选择克隆(Octet，ForteBio)。
对Ab-C而言，在含G418的YPDS琼脂板上选择成功转化体。使用Southern印迹测定整合到HIS4TT基因座上的重链和轻链基因的拷贝数。使单倍体菌株交配，并且如上所述选择二倍体菌株。进行最后的Southern印迹以确认每个整合基因座处重链和轻链基因的拷贝数。
使用蛋白A生物传感器监测表达来选择克隆(Octet，ForteBio)。
[0318] Southern印迹
[0319] 通过Southern印迹分析测定单倍体菌株的重链和轻链基因的拷贝数。从YPD琼脂板选择单个菌落并用于接种3-mL YPD培养物。在30℃下振荡培育培养物过夜直至饱和。使用MasterPure酵母DNA纯化试剂盒(Epicentre)，按照生产商的方案从1.8mL的各培养物提取基因组DNA。对于pGAP基因座而言，用Cla I消化1μg的DNA并且在0.8％TAE琼脂糖凝胶上分离。电泳之后，凝胶用变性缓冲液(0.5M NaOH；1.5M NaCl)处理45min并用中和缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA)处理30min。然后通过毛细管作用将DNA转移到带正电的尼龙膜(BioRad)上并且使用紫外交联剂固定。在41℃下使用地高辛(DIG)标记的与pGAP序列对应的DNA探针使膜杂交过夜。在高度严格条件下洗涤膜并且使用高效DIG标记和检测试剂盒(Roche Applied Science)检测。通过使膜暴露于X-射线胶片使杂交条带显现。
[0320] 按照上述步骤，做一些修改，使用Southern印迹测定在3’AOX TT或HIS4TT基因座整合的重链和轻链基因的拷贝数。对于AOX1转录终止基因座而言，HindIII限制性内切核酸酶用于基因组DNA消化，并且与3’AOX TT序列对应的DIG标记探针用于杂交。对于HIS4TT基因座而言，SspI限制性内切核酸酶用于基因组DNA消化，并且与HIS4TT序列对应的DIG标记探针用于杂交。
[0321] 使用前述方法学，获得含不同拷贝数的单独亚基的一组转化体，例如标记为H3、H4、H5和H6，分别含3、4、5和6个拷贝的抗体重链的菌株和标记为L3-L7，分别含3-7个拷贝的抗体轻链的菌株。使这些转化体交配获得含不同拷贝数的轻链和重链基因的二倍体，并且通过Southern印迹任选地再次确认基因拷贝数。从而生成含已知、不同拷贝数的轻链和重链基因的二倍体细胞。任选地，使用生物膜层干涉技术蛋白-A生物传感器选择表达目标抗体的克隆以监测表达(0ctet，ForteBio)。通常生产所得单倍体和／或二倍体菌株的冷冻原料，并且使转化体增殖以评估成熟抗体的产量、产率和纯度。
[0322] 生成含不同拷贝数的编码Ab-A的轻链和重链基因的一组巴斯德毕赤酵母菌株[0323] 使用上述方法生成表达含可变拷贝数的轻链和重链基因的Ab-A的一组巴斯德毕赤酵母菌株。总计生成13个含2-5个拷贝的重链基因和2-7个拷贝的轻链基因的二倍体-菌株。最初，生成含规定拷贝数的轻链和重链基因的单倍体菌株(各单倍体菌株为Lys 或-
Met)，然后利用这些单倍体菌株之间的交配生成含已知拷贝数的轻链和重链基因的二倍体原养型菌株。每个表达盒由甘油醛脱氢酶基因(GAP基因)启动子构成，启动子与编码分泌信号的序列融合，后面是要表达的基因序列，后面是由单独的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶I基因(AOX1)或组合HIS4TT序列编码巴斯德毕赤酵母转录终止信号的序列(图14-21中有说明)。
Met)，然后利用这些单倍体菌株之间的交配生成含已知拷贝数的轻链和重链基因的二倍体原养型菌株。每个表达盒由甘油醛脱氢酶基因(GAP基因)启动子构成，启动子与编码分泌信号的序列融合，后面是要表达的基因序列，后面是由单独的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶I基因(AOX1)或组合HIS4TT序列编码巴斯德毕赤酵母转录终止信号的序列(图14-21中有说明)。
[0324] 为含有整合到pGAP基因座中的编码Ab-A重链的基因的转化体指定标识Hc47-Hc60。用裂解pGAP基因座两侧位点的限制性酶消化纯化的基因组DNA，并且使用Southern印迹(使用标记的pGAP序列)测定如上所述每个菌株中整合的拷贝数(图23)。
泳道1和最右边两个泳道含标记的DNA梯带(在印迹的左边写出了片段大小)。泳道2-15分别对应菌株Hc47-Hc60。印迹右边的标记A-C分别指示来自含1-3个拷贝的整合序列的菌株的片段预期尺寸。在菌株Hc58和Hc51中检测到的片段表明，这些菌株分别含2个和
3个拷贝的重链基因。选择菌株Hc58和Hc51进行交配。
泳道1和最右边两个泳道含标记的DNA梯带(在印迹的左边写出了片段大小)。泳道2-15分别对应菌株Hc47-Hc60。印迹右边的标记A-C分别指示来自含1-3个拷贝的整合序列的菌株的片段预期尺寸。在菌株Hc58和Hc51中检测到的片段表明，这些菌株分别含2个和
3个拷贝的重链基因。选择菌株Hc58和Hc51进行交配。
[0325] 类似地，生成一组单倍体巴斯德毕赤酵母菌株，其含有不同基因组拷贝数的编码Ab-A轻链的基因，也整合到pGAP基因座中。为菌株指定标识Lc1-Lc27。用裂解pGAP基因座两侧位点的限制性酶消化纯化的基因组DNA，并且使用Southern印迹(使用标记的pGAP序列)测定每个菌株中整合的拷贝数(图24)。泳道1和22含标记的DNA梯带(在印迹的左边写出了片段大小)。泳道2-21和23-29分别对应菌株Lc1-Lc27。印迹右边的标记A-F分别指示来自含1-5个拷贝和5个拷贝以上的整合序列的菌株的片段预期尺寸。在菌株Lc17、Lc7和Lc27中检测到的片段表明，这些菌株分别含2、3和4个拷贝的轻链基因。
选择菌株Lc17、Lc7和Lc27进行交配。
选择菌株Lc17、Lc7和Lc27进行交配。
[0326] 为进一步增加所述组中可用重链和轻链基因的拷贝数，向第二基因座中整合附加基因拷贝。因此通过将来自两个整合基因座的拷贝数加起来计算特异性整合基因的总拷贝数。具体地，在已经含有在pGAP基因座整合的3个拷贝的Ab-A重链基因的菌株中，向HIS4TT基因座整合编码Ab-A重链的基因的附加拷贝，从而引入重链基因的1或2个附加拷贝，总计4或5个拷贝。类似地，在已经含有在pGAP基因座整合的3个拷贝的Ab-A轻链基因的菌株中，向HIS4TT基因座整合编码Ab-A轻链的基因的附加拷贝，从而引入轻链基因的1-4个附加拷贝，总计4-7个拷贝。
[0327] 然后使含重链和轻链基因的菌株交配生成二倍体菌株。总计生成13个含2-5个拷贝的重链基因和2-7个拷贝的轻链基因的不同菌株。对于每个二倍体菌株而言，用菌株标识指示重链和轻链基因的拷贝数(例如，Ab-B-H4xL5指示4个拷贝的重链基因和5个拷贝的轻链基因)并且在以上表1中标示了从中表达基因的基因座。
[0328] 通过交配生成每个二倍体菌株的多个分离株，并且在选择特定分离株做进一步分析之前，通过Southern印迹检验拷贝数。图25示出了pGAP基因座的Southern印迹以检验Ab-A-H3xL3、Ab-A-H3xL4、Ab-A-H2xL3和Ab-A-H2xL2菌株候选物的基因拷贝数(分别为泳道2-6、7-11、12-15和16-19)，并且星号指示选择供进一步使用的候选物。泳道1含标记的DNA梯带(在印迹的左边写出了片段大小)。印迹右边的标记A、C和E分别指示来自含2-4个拷贝的轻链基因的菌株的片段预期尺寸，而标记B和D分别指示来自含2或3个拷贝的重链基因的菌株的片段预期尺寸。图26示出了为检验表1所示菌株的分离株在pGAP基因座处的基因拷贝数的Southern印迹，并且星号指示选择供进一步使用的分离株。印迹右边的标记A、C和E分别指示来自含1-3个拷贝的重链基因的菌株的片段预期尺寸，而标记B和D分别指示来自含2或3个拷贝的轻链基因的菌株的片段预期尺寸。类似地，图27示出了为检验预计含有整合在HIS4TT基因座的抗体基因的菌株在该基因座处的基因拷贝数的Southern印迹(标示于表1中)。印迹右边的标记A指示来自含内源HIS4TT基因座的
片段预期尺寸，标记B、D、F和G分别指示来自含1-4个拷贝的轻链基因的菌株的片段预期尺寸，而标记C和E分别指示来自含1或2个拷贝的重链基因的菌株的片段预期尺寸。
片段预期尺寸，标记B、D、F和G分别指示来自含1-4个拷贝的轻链基因的菌株的片段预期尺寸，而标记C和E分别指示来自含1或2个拷贝的重链基因的菌株的片段预期尺寸。
[0329] 生成含不同拷贝数的编码Ab-B的轻链和重链基因的一组巴斯德毕赤酵母菌株[0330] 使用对Ab-A描述的基本上相同的方法生成编码Ab-B重链和轻链的基因(靶向pGAP基因座)的单倍体菌株。Southern印迹(使用pGAP序列探针)鉴定分别含2和3个拷贝的Ab-B重链基因的菌株Hc3和Hc4(图28A)和分别含2-5个拷贝的Ab-B轻链基因的
菌株Lc5、Lc11、Lc12和Lc9(图28B)。在图28A中，印迹右边的标记A、C、E和G分别指示含0-3个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B重链基因的片段预期尺寸，并且在图28B中，印迹左边的标记A、B、D、F、H和I分别指示含0-5个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B轻链基因的片段预期尺寸。星号表示选择用于进一步交配的单倍体菌株。
菌株Lc5、Lc11、Lc12和Lc9(图28B)。在图28A中，印迹右边的标记A、C、E和G分别指示含0-3个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B重链基因的片段预期尺寸，并且在图28B中，印迹左边的标记A、B、D、F、H和I分别指示含0-5个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B轻链基因的片段预期尺寸。星号表示选择用于进一步交配的单倍体菌株。
[0331] 为进一步增加所述组中可用重链基因的拷贝数，在已经含有在pGAP基因座整合的3个拷贝的Ab-B重链基因的菌株中，向HIS4TT基因座整合编码Ab-B重链的基因的附加拷贝，从而引入重链基因的1或2个附加拷贝，总计4或5个拷贝。类似地，在已经含有在pGAP基因座整合的3个拷贝的Ab-B轻链基因的菌株中，向HIS4TT基因座整合编码Ab-B轻链的基因的附加拷贝，从而引入轻链基因的1-4个附加拷贝，总计4-7个拷贝。
[0332] 然后使含重链和轻链基因的菌株交配生成二倍体菌株。总计生成14个含2-5个拷贝的重链基因和2-7个拷贝的轻链基因的不同菌株。对于每个二倍体菌株而言，用菌株标识指示重链和轻链基因的拷贝数(例如，H4xL5指示4个拷贝的重链基因和5个拷贝的轻链基因)并且在以上表2中标示了从中表达基因的基因座。通过图29-30(pGAP探针)和图31(HIS4TT探针)中所示Southern印迹再次确认二倍体菌株中的基因拷贝数。生成每个二倍体菌株的多个分离株，并且图29-31中的星号指示选择供进一步使用的分离株。在图29中，印迹右边的标记A、C和E分别指示含1-3个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B重链基因的片段预期尺寸，并且标记B、D、F和G分别指示含2-5个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B轻链基因的片段预期尺寸。在图30中，印迹右边的标记A、B、C和E分别指示含0-3个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B重链基因的片段预期尺寸，并且标记A和D分别指示含0-3个拷贝的整合到pGAP基因座的Ab-B轻链基因的片段预期尺寸。在图31中，标记A、C和E分别指示含0-2个拷贝的整合到HIS4TT基因座的Ab-B重链基因的片段预期尺寸，并且标记A、B、D、F和G分别指示含0-4个拷贝的整合到HIS4TT基因座的Ab-B轻链基因的片段预期尺寸。
[0333] 生成含不同拷贝数的编码Ab-C的轻链和重链基因的一组巴斯德毕赤酵母菌株[0334] 使用对Ab-A和Ab-B描述的基本上相同的方法生成表达含可变拷贝数的轻链和重链基因的Ab-C的一组巴斯德毕赤酵母菌株。Southern印迹(使用3’AOX TT序列探针)鉴定分别含1、2、3和4个拷贝的Ab-C重链基因的单倍体菌株Hc19、Hc25、Hc13和Hc17(图32)和分别含1-6个拷贝的Ab-C轻链基因的菌株Lc7、Lc6、Lc11、Lc19、Lc15和Lc17(图
33)。图32中，印迹右边的标记A、B、C和D分别指示含1-4个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C重链基因的片段预期尺寸。图33中，印迹右边的标记A、B、C、D、E和F分别指示含1-6个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C轻链基因的片段预期尺寸。星号指示选择用于进一步交配的单倍体。
33)。图32中，印迹右边的标记A、B、C和D分别指示含1-4个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C重链基因的片段预期尺寸。图33中，印迹右边的标记A、B、C、D、E和F分别指示含1-6个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C轻链基因的片段预期尺寸。星号指示选择用于进一步交配的单倍体。
[0335] 为进一步增加所述组中可用重链和轻链基因的拷贝数，向第二基因座中整合附加基因拷贝。因此通过将来自两个整合基因座的拷贝数加起来计算特异性整合基因的总拷贝数。具体地，在已经含有在AOX1转录终止基因座整合的3或4个拷贝的Ab-C重链基因的菌株中，向HIS4TT基因座整合编码Ab-C重链的基因的附加拷贝，从而引入重链基因的1或2个附加拷贝，总计5或6个拷贝。类似地，在已经含有在AOX1转录终止基因座整合的3或
4个拷贝的Ab-C轻链基因的菌株中，向HIS4TT基因座整合编码Ab-C轻链的基因的附加拷贝，从而引入轻链基因的2个附加拷贝，总计5或6个拷贝。
4个拷贝的Ab-C轻链基因的菌株中，向HIS4TT基因座整合编码Ab-C轻链的基因的附加拷贝，从而引入轻链基因的2个附加拷贝，总计5或6个拷贝。
[0336] 然后使含重链和轻链基因的单倍体交配生成二倍体菌株。总计生成9个含3-6个拷贝的重链基因和3-6个拷贝的轻链基因的不同菌株。对于每个二倍体菌株而言，用菌株标识指示重链和轻链基因的拷贝数(例如，Ab-C-H4xL5指示4个拷贝的重链基因和5个拷贝的轻链基因)并且在以上表3中标示了从中表达基因的基因座。通过图34-35(3’AOX TT探针)和图36(HIS4TT探针)中所示Southern印迹再次确认二倍体菌株中的基因拷贝数。生成每个二倍体菌株的多个分离株，并且图34-36中的星号指示选择供进一步使用的分离株。在图34中，印迹右边的标记B和D分别指示含3或4个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C重链基因的片段预期尺寸，并且标记A、C和E分别指示含3-5个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C轻链基因的片段预期尺寸。在图35中，印迹右边的标记A、C和E分别指示含2-4个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C重链基因的片段预期尺寸，并且标记B和D分别指示含3和4个拷贝的整合到AOX1转录终止基因座的Ab-C轻链
基因的片段预期尺寸。在图36中，标记A指示含0个拷贝的整合到HiS4TT基因座的Ab-C重链或轻链基因的片段预期尺寸，标记B指示含2个拷贝的整合到HIS4TT基因座的Ab-C轻链基因的片段预期尺寸，并且标记C指示含2个拷贝的整合到HIS4TT基因座的Ab-C重链基因的片段预期尺寸。
基因的片段预期尺寸。在图36中，标记A指示含0个拷贝的整合到HiS4TT基因座的Ab-C重链或轻链基因的片段预期尺寸，标记B指示含2个拷贝的整合到HIS4TT基因座的Ab-C轻链基因的片段预期尺寸，并且标记C指示含2个拷贝的整合到HIS4TT基因座的Ab-C重链基因的片段预期尺寸。
[0337] 使用稍有不同的方法构建Ab-C-H3xL3表达菌株。转化之前，使用AvrII将每个表达载体(图18-19)线性化于pGAP序列中以指导载体整合到GAP启动子基因座中。然后分别用线性化重链或轻链载体，按照来自Pichia Protocols，第2版(Methods in Molecular Biology，Cregg，JM，编辑2007.Humana Press，Totowa，NJ)的改进方案通过电穿孔单独转- - TM化单倍体巴斯德毕赤酵母JC231(Lys)或JC239(Met)细胞。在含Zeocin 的YPDS琼脂
板上选择成功转化体。为生成表达全长Ab-C的二倍体克隆文库，汇集单倍体转化体菌落，混合在一起并且涂在交配培养基琼脂板上。将这些在30℃下培育24h。然后从交配板上刮取细胞并且在BYNB琼脂板上划线以选择二倍体克隆。通过菌落转移／免疫印迹法评估每个二倍体克隆表达全长抗体的能力(Wung等Biotechniques21808-812(1996))。简言之，通过使膜接触所述板，将所述克隆生成的分泌抗体转移到硝酸纤维素膜上。使用采用山羊抗人F(ab’)2HRP(辣根过氧物酶)检测抗体的Western印迹方案加工过滤器。使用化学发光检测，使表达提高水平的Ab-C的菌落在膜上显现。将这些菌落的很大一部分挑选到装有300μL BYPD(1％酵母氮源、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.1M磷酸氢二钾pH6和50μg／mL TM
Zeocia )的96深孔板中。使培养物在30℃持续振荡下生长60h。通过标准酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定所得上清液。由此，选择具有Ab-C高表达的单个二倍体克隆。随后按照上述方法对最终的克隆进行Southern印迹分析以测定重链和轻链基因的拷贝数。
板上选择成功转化体。为生成表达全长Ab-C的二倍体克隆文库，汇集单倍体转化体菌落，混合在一起并且涂在交配培养基琼脂板上。将这些在30℃下培育24h。然后从交配板上刮取细胞并且在BYNB琼脂板上划线以选择二倍体克隆。通过菌落转移／免疫印迹法评估每个二倍体克隆表达全长抗体的能力(Wung等Biotechniques21808-812(1996))。简言之，通过使膜接触所述板，将所述克隆生成的分泌抗体转移到硝酸纤维素膜上。使用采用山羊抗人F(ab’)2HRP(辣根过氧物酶)检测抗体的Western印迹方案加工过滤器。使用化学发光检测，使表达提高水平的Ab-C的菌落在膜上显现。将这些菌落的很大一部分挑选到装有300μL BYPD(1％酵母氮源、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.1M磷酸氢二钾pH6和50μg／mL TM
Zeocia )的96深孔板中。使培养物在30℃持续振荡下生长60h。通过标准酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定所得上清液。由此，选择具有Ab-C高表达的单个二倍体克隆。随后按照上述方法对最终的克隆进行Southern印迹分析以测定重链和轻链基因的拷贝数。
[0338] 实施例5
[0339] 在生物反应器中表达抗体的方法
[0340] 该实施例描述了在生物反应器中生成抗体做进一步表征或使用的方法。
[0341] 首先，使用研究细胞库，使用由下列营养素(％w／v)构成的培养基：酵母提取物3％、无水葡萄糖4％、YNB1.34％、生物素0.004％和100mM磷酸氢二钾，扩增接种物。为生成发酵罐的接种物，在30℃和300rpm下，在振荡培育箱中扩增细胞库约24h。然后将10％接种物添加到装有1L无菌生长培养基的Labfors2.5L工作体积容器中。生长培养基由下列营养素构成：硫酸钾18.2g／L、磷酸二氢铵36.4g／L、磷酸氢二钾12.8g／L、七水硫酸镁3.72g／L、二水柠檬酸钠10g／L、甘油40g／L、酵母提取物30g／L、PTM1微量金属4.35mL／L和防沫剂2041.67mL／L。PTM1微量金属溶液由下列组分构成：五水硫酸铜
6g／L、碘化钠0.08g／L、水合硫酸锰3g/L、二水钼酸钠0.2g／L、硼酸0.02g／L、氯化钴0.5g／L、氯化锌20g／L、七水硫酸亚铁65g／L、生物素0.2g／L和硫酸5mL／L。
6g／L、碘化钠0.08g／L、水合硫酸锰3g/L、二水钼酸钠0.2g／L、硼酸0.02g／L、氯化钴0.5g／L、氯化锌20g／L、七水硫酸亚铁65g／L、生物素0.2g／L和硫酸5mL／L。
[0342] 生物反应器工艺控制参数设置如下：1000rpm搅拌、气流每分钟1.35标准立升、温度28℃并且使用氢氧化铵控制pH(为6)。未提供氧补充。
[0343] 使发酵培养物生长约12-16h，直至溶解氧峰值指示，最初的甘油消耗完。在溶解氧峰值后，使培养物饥饿约3h。在该饥饿期后，向反应器添加乙醇团注以达到1％乙醇(w／v)。使发酵培养物平衡15-30min。在乙醇团注30min后开始加料并且设为40min固定速率1mL／min，然后通过乙醇传感器，使用乙醇传感探头(Raven Biotech)在该轮剩余时间将乙醇浓度保持在1％控制给料泵。给料由下列组分构成：酵母提取物50g／L、一水葡萄糖500g／L、七水硫酸镁3g／L和PTM1微量金属12mL／L。任选地，还向给料中添加了二水柠檬酸钠(0.5g／L)。总发酵时间为约90h(T90)。
[0344] 然后使用分析高压液相色谱法(HPLC)测定抗体产量并且用蛋白A亲和柱拟合。纯化的抗体样品用于通过求HPLC峰中280nm(A280)下的吸光度的积分确定标准曲线。
[0345] 实施例6
[0346] 通过HPLC测定抗体产量和纯度的方法
[0347] 为分析蛋白-A纯化的抗体制剂的纯度，使用尺寸排阻高压液相色谱法(SE-HPLC)。简言之，使用具有紫外检测仪器的Agilent(Santa Clara，CA)1200系列HPLC。
对于样品分离而言，使用来自Tosoh Bioscience(King of Prussia，PA)，连接有TSKgel Guard SWx16×40mM的TSKge1GS3000SWx17.8×300mM柱。使用100mM磷酸钠、200mM氯化钠pH6.5作为等度模式(isocratic mode)下流量为0.5mL／nin的流动相并且监测紫外
215nm下的吸光度。注射样品之前，使柱平衡直至达到稳定基线。使用流动相将样品稀释到浓度为1mg／mL并注射30μL体积。为监测柱性能，使用BioRad(Hercules，CA)凝胶过滤标准。
对于样品分离而言，使用来自Tosoh Bioscience(King of Prussia，PA)，连接有TSKgel Guard SWx16×40mM的TSKge1GS3000SWx17.8×300mM柱。使用100mM磷酸钠、200mM氯化钠pH6.5作为等度模式(isocratic mode)下流量为0.5mL／nin的流动相并且监测紫外
215nm下的吸光度。注射样品之前，使柱平衡直至达到稳定基线。使用流动相将样品稀释到浓度为1mg／mL并注射30μL体积。为监测柱性能，使用BioRad(Hercules，CA)凝胶过滤标准。
[0348] 实施例7
[0349] 通过蛋白-A亲和力纯化抗体的方法
[0350] 为表征巴斯德毕赤酵母表达的抗体，进行蛋白A纯化。简言之，用相同体积的平衡缓冲液(20mM组氨酸pH6)稀释约20mL来自收获的发酵肉汤的0.2μ澄清上清液。从该稀释肉汤，装载20mL到经预平衡的1mL HiTrap MabSelect Sute柱上(GE，Piscataway，NJ)。随后使用30个柱体积的平衡缓冲液洗涤柱。使用不连续梯度将柱上结合的抗体洗脱到100％洗脱缓冲液中(100mM柠檬酸pH3.0)。收集1mL成分并且立即使用100μL的2M Tris缓冲液pH8.0中和。通过测量280nM下的吸光度测定含蛋白质的成分并且汇集含蛋白质的成分。
[0351] 实施例8
[0352] 通过SDS-PAGE、Western印迹和凝集素柱纯化表征杂质的方法
[0353] SE-HPLC允许我们测定受不同菌株中轻链与重链表达比例调节的产物相关变体的量。为表征这种产物相关变体的特性，我们进行了western印迹分析并且使用亲和凝集素柱进行纯化。简言之，对于western印迹分析，在具有NuPAGE还原剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)的LDS上样缓冲液中制备5μg样品，在70C下加热10min。然后将4μg当量的样品装载到4-12％BisTris梯度凝胶上并且使用MES电泳缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，通过电泳分离。然后使用I-Blot(Invitrogen，Carlsbad，CA)将凝胶中分离的蛋白质印记到硝酸纤维素膜上并且使用封闭液(在DPBS-T中的10％奶粉溶液[DPBS溶液含0.1％吐温-20(Tween-20)(Invitrogen，Carisbad，CA)])封闭60min。然后用山羊抗人FC过氧化物酶偶联抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc，West Grove，PA)，使用在封闭液中的1：10,000稀释物探测封闭膜30min。然后在DPBS0.1％吐温溶液中洗条印迹5min，总共4次。为显影，使用ECL高级化学发光试剂(Amersham／GE，Piscataway,NJ)并且使用CCD相机(Alpha Innotech／Cell Biosciences，Santa Clara，CA)拍摄图像。
[0354] 为进一步表征产物相关变体，我们使用琼脂糖结合的雪花莲(Galanthusnivalis)凝集素(Vector Laboratories，Inc，Burlingame，CA)。雪花莲凝集素是与含甘++ ++
露糖的蛋白质结合而对于结合不需要Ca 或Mn 的小分子量蛋白质。对于结合，通过再悬浮-离心，用14mL的DBS洗涤2mL树脂4次。洗涤后，使珠粒再次悬浮于DPBS中达到最终
50％浆料浓度并且将400μL添加到含1.5-4mg蛋白质的蛋白-A纯化抗体样品中。然后在室温下连续搅拌，用抗体培育琼脂糖结合的凝集素2.5h。在这次培育结束时，离心样品，收集上清液并且标记为“流通液”。然后将珠粒转移到空的Bio-Rad滴注柱上(Hercules，CA)并且使用DPBS通过重力洗涤。总计使用6mL洗涤，此次使用0.5mL并监测280nm吸光度。使用0.2M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脱结合的蛋白质。然后通过SDS-PAGE和使用抗人Fc特异性试剂的WesteRN印迹及SE-HPLC分析样品、载料和洗脱的蛋白质。使用含4％-12％聚丙烯酰胺梯度的预制聚丙烯酰胺凝胶( Bis-Tris Gels)，使用 MES
SDS电泳缓冲液和 LDS样品缓冲液(全部来自于Invitrogen，Carlsbad，Ca.)，
依照生产商的说明进行SDS-PAGE。装载之前，使用 样品还原剂(Invitrogen，
Carlsbad，Ca.)，依照生产商的说明还原样品。
露糖的蛋白质结合而对于结合不需要Ca 或Mn 的小分子量蛋白质。对于结合，通过再悬浮-离心，用14mL的DBS洗涤2mL树脂4次。洗涤后，使珠粒再次悬浮于DPBS中达到最终
50％浆料浓度并且将400μL添加到含1.5-4mg蛋白质的蛋白-A纯化抗体样品中。然后在室温下连续搅拌，用抗体培育琼脂糖结合的凝集素2.5h。在这次培育结束时，离心样品，收集上清液并且标记为“流通液”。然后将珠粒转移到空的Bio-Rad滴注柱上(Hercules，CA)并且使用DPBS通过重力洗涤。总计使用6mL洗涤，此次使用0.5mL并监测280nm吸光度。使用0.2M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脱结合的蛋白质。然后通过SDS-PAGE和使用抗人Fc特异性试剂的WesteRN印迹及SE-HPLC分析样品、载料和洗脱的蛋白质。使用含4％-12％聚丙烯酰胺梯度的预制聚丙烯酰胺凝胶( Bis-Tris Gels)，使用 MES
SDS电泳缓冲液和 LDS样品缓冲液(全部来自于Invitrogen，Carlsbad，Ca.)，
依照生产商的说明进行SDS-PAGE。装载之前，使用 样品还原剂(Invitrogen，
Carlsbad，Ca.)，依照生产商的说明还原样品。
[0355] 以上对本发明的各说明性实施方案的描述并非意图穷举或将本发明限于公开的明确形式。虽然为了说明的目的，本文描述了本发明的特定实施方案和实施例，但是正如相关领域的技术人员将认识到那样，在本发明范围内各种等效修改是可能的。本文提供的本发明的教导可应用于除上述实施例外的其它目的。
[0356] 可按不同于在前面的描述和实施例中特别描述的方式实践本发明。根据以上教导，本发明的许多修改和改变是可能的，并且因此在所附权利要求的范围内。
[0357] 根据以上详细描述可对本发明做这些和其它变化。一般而言，在下列权利要求中，不得将使用的术语视为将本发明限于在说明书和权利要求中公开的特定实施方案。相应地，本发明不受公开内容限制，但是相反本发明的范围完全由下列权利要求决定。
[0358] 在2006年5月19日提交的美国临时专利申请no.60/801,412中公开了关于获得抗原特异性B细胞无性系种群的方法的某些教导，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0359] 在2008年5月21日提交的对应国际公布No.WO／2008／144757，标题为“Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies”的国际公布No.PCT/US2008/064421中公开了关于兔源性单克隆抗体的人源化和维持抗原结合亲和力的优选序列修饰的某些教导，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0360] 在2006年5月8日提交的美国专利申请no.11/429,053(美国专利申请公布No.US2006/0270045)中公开了关于使用能交配的酵母生成抗体或其片段及其相应方法的某些教导，其公开内容通过引用整体并入本文。
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