用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法
阅读：894发布：2023-02-13
专利汇可以提供用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因 生物 的方法。采用分子生物学技术构建包含有标记基因和外源基因两个相邻且转录方向相同的表达框的转基因表达质粒；采用显微注射法将转基因质粒与辅助质粒一起导入到生物的基因组内，培育成外源基因能够稳定遗传和表达的 转基因生物 ；根据转基因生物中标记基因表达量的信息预测外源基因表达量，并筛选获得该外源基因表达量对应的生物个体或品种。本发明可简单、快捷、省 力 地从大量的转基因生物中筛选出高效表达外源基因的转基因生物个体或品种，为建立高效的 生物反应器 提供了理想的筛选手段。，下面是用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法专利的具体信息内容。
1.一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
1)采用分子生物学技术构建包含有标记基因和外源基因两个表达框的转基因表达质粒，标记基因和外源基因两个表达框的相邻间隔小于30bp且转录方向相同；
2)采用显微注射法将步骤1)得到的转基因质粒与为转基因质粒中转座子提供转座酶的辅助质粒一起导入到家蚕的基因组内，培育成外源基因能够稳定遗传和表达的转基因家蚕；
3)得到的转基因家蚕中的标记基因表达量和外源基因表达量具有显著相关性，根据转基因家蚕中标记基因表达量的信息进行预测和筛选，预测外源基因表达量，并筛选获得该外源基因表达量对应的家蚕个体或品种。
2.根据权利要求1所述的一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法，其特征在于：所述的转基因表达质粒中标记基因和外源基因两个表达框的前后次序任意。
3.根据权利要求1所述的一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法，其特征在于：所述的标记基因采用EGFP标记基因。
4.根据权利要求1所述的一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法，其特征在于：所述的外源基因采用萤火虫荧光素酶基因或海肾荧光素酶基因。
5.根据权利要求1所述的一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法，其特征在于：所述的转基因质粒与辅助质粒的混合比例为1:0.5～1:1。
用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法
技术领域
背景技术
[0002] 利用分子生物学技术将外源基因插入到生物体基因组内，使外源基因能够稳定遗传和表达，这种技术称为转基因技术，对应的生物称为转基因生物。如果外源基因的表达产物是蛋白质，而且是在一个封闭的系统，如乳腺、膀胱、丝腺等系统中表达，这种转基因生物称为生物反应器。
[0003] 在大多数的转基因研究中，外源基因一般都是随机的插入到宿主基因组中，分布在基因间隔区、基因内含子、基因外显子等区域。不同插入位点的外源基因其表达量会有差异，这种现象被称为位置效应。因此，要想筛选、获得外源基因大量表达的转基因生物，就必须对大量的转基因个体进行qRT-PCR、Western等分子生物学鉴定，以确定优秀个体，筛选的工作量大，耗时长，这已成了开发和利用转基因生物的制约环节。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因生物的方法，利用两个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性的特点，根据标记基因表达量预测外源基因表达量并进一步筛选转基因生物，简单有效，这可以快速地从大量的转基因个体中筛选出高效表达外源基因的转基因个体或品种，为加快构建高效的生物反应器奠定基础。
[0005] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0006] 1)采用分子生物学技术构建包含有标记基因和外源基因两个表达框的转基因表达质粒，标记基因和外源基因两个表达框的相邻间隔小于30bp且转录方向相同；
[0007] 2)采用显微注射法将步骤1)得到的转基因质粒与为转基因质粒中转座子提供转座酶的辅助质粒一起导入到生物的基因组内，培育成外源基因能够稳定遗传和表达的转基因生物；
[0008] 3)得到的转基因生物中的标记基因表达量和外源基因表达量具有显著相关性，根据转基因生物中标记基因表达量的信息进行预测和筛选，预测外源基因表达量，并筛选获得该外源基因表达量对应的生物个体或品种。
[0009] 优选地，所述的转基因表达质粒中标记基因和外源基因两个表达框的前后次序任意。
[0010] 优选地，所述的标记基因采用EGFP标记基因。
[0011] 优选地，所述的外源基因采用萤火虫荧光素酶基因(Fluc)或海肾荧光素酶(Rluc)基因。
[0012] 优选地，所述的宿主采用家蚕。
[0013] 优选地，所述的转基因质粒与辅助质粒的混合比例为1:0.5～1:1。
[0014] 本发明具有的有益效果是：
[0015] 本发明利用两个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性的特点，可用标记基因的表达水平来预测与之相邻的外源基因表达水平。这种方法相比传统的转基因生物外源基因表达水平检测，具有简便、省时、省钱的优势。因为标记基因的检测手法多，技术成熟，所以它可以快速、高效的从大量的转基因个体中筛选出高效表达外源基因的转基因生物，提高转基因生物筛选效率，为建立高效的生物反应器提供了理想的筛选手段。
具体实施方式
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0017] 本发明的实施例如下：
[0018] 实施例1：
[0019] 本实施例构建了一个外源基因在前、标记基因在后，且以piggyBac转座子为基础的转基因质粒pBSer1Fluc-A3EGFP，转基因质粒中，由家蚕中部丝腺特异性表达的胶蛋白1基因(Ser1) 启动子启动萤火虫荧光素酶(Fluc)外源基因的表达框，由肌动蛋白A3启动子启动绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的表达框，其中家蚕中部丝腺特异性表达的丝胶蛋白1基因(Ser1) 启动子截取了575bp长度的近端启动子，萤火虫荧光素酶(Fluc)外源基因表达框和绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因表达框的相邻间隔为25bp。
[0020] 将pBSer1Fluc-A3EGFP转基因质粒与为piggyBac转座子提供转座酶的辅助质粒一起溶解在pH7.6磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液中pBSer1Fluc-A3EGFP质粒和辅助质粒按1:0.5比率混合，两种质粒的注射总浓度为0.4μg/μl。
[0021] 然后采用显微注射法将混合质粒导入家蚕产卵后8小时内的受精卵内，注射总体积为 10nl左右。注射后的蚕卵在25℃温度、85％湿度、12h光照的条件下饲养至成虫，自交得到 G1代。在G1代小蚕期，利用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出表达EGFP标记基因的阳性家蚕，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。G1 代转基因家蚕饲养至五龄第三天时，共取7个转基因家蚕蛾区，由于piggyBac转座子插入基因组的随机性，7个转基因家蚕蛾区被鉴定证明具有不同插入位点，每个蛾区取3条蚕的中部丝腺作为3个生物学重复。
[0022] 采用荧光定量PCR技术，以Rp49为内参基因检测2个顺序排列表达框中的外源基因 Fluc和标记基因EGFP的转录水平，相关性统计分析结果表明7个转基因家蚕品种的Fluc和 EGFP转录水平的相关关系达到极显著水平，具体结果为：决定系数R2＝0.8382，相关系数 r＝0.9155，概率值P＜0.01。该数据证明转基因生物中2个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性，即使外源基因插入位点不同，因为标记基因和外源基因两个表达框紧密相邻，所以外源基因Fluc的转录水平依然与标记基因EGFP的转录水平存在极显著相关。
[0023] 实施例最后对转基因蚕根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断EGFP标志基因表达量，预测Fluc外源基因表达量，筛选获得了Fluc外源基因表达量对应的家蚕个体。
[0024] 实施例进一步对另一次相同的转基因实验的8个G2代转基因家系，根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断了EGFP标志基因表达量，预测了Fluc外源基因表达量。首先确定了标记基因EGFP转录水平最高的品种为ZY153，实验再用8个G2代转基因家系的其他个体，实际检测了Fluc标志基因表达水平，结果比较证明这个品种的外源基因Fluc的转录水平确是最高的，即使采用高水平表达的Rp49为内参基因，其相对转录水平仍达到3.3％。实施例证明可以利用标记基因EGFP表达量预测外源基因Fluc表达量，并进一步筛选得到外源基因Fluc表达量最高的转基因家蚕品种。
[0025] 虽然从mRNA到蛋白质有一个转录后修饰的过程，但因为同一基因的转录后修饰过程是一样的，所以对同一基因而言，选择了转录水平最高的品种，也就是选择了蛋白表达水平最高的品种。
[0026] 实施例2：
[0027] 本实施例构建了一个外源基因在前、标记基因在后，且以piggyBac转座子为基础的转基因质粒pBSer1Fluc-A3EGFP，转基因质粒中，由家蚕中部丝腺特异性表达的胶蛋白1基因(Ser1) 启动子启动萤火虫荧光素酶(Fluc)外源基因的表达框，由肌动蛋白A3启动子启动绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的表达框，其中家蚕中部丝腺特异性表达的丝胶蛋白1基因(Ser1) 启动子截取了4000bp长度的近端启动子，外源基因表达框和标记基因表达框的相邻间隔为 25bp。
[0028] 将pBSer1Fluc-A3EGFP转基因质粒与为piggyBac转座子提供转座酶的辅助质粒一起溶解在pH7.6磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液中pBSer1Fluc-A3EGFP质粒和辅助质粒按1:0.6比率混合，两种质粒的注射总浓度为0.4μg/μl。
[0029] 然后采用显微注射法将混合质粒导入家蚕产卵后8小时内的受精卵内，注射总体积为 10nl左右。注射后的蚕卵在25℃、85％湿度、12h光照的条件下饲养至成虫，自交得到G1 代。在G1代小蚕期，利用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出表达EGFP标记基因的阳性家蚕，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。G1代转基因家蚕饲养至五龄第三天时，共取5个转基因家蚕蛾区，由于piggyBac转座子插入基因组的随机性，5个转基因家蚕蛾区被鉴定证实具有不同插入位点，每个蛾区取3条蚕的中部丝腺作为3个生物学重复。采用荧光定量PCR技术，以Rp49为内参基因检测2个顺序排列表达框中的外源基因Fluc和标记基因EGFP的转录水平，相关性统计分析结果表明5个转基因家蚕品种的Fluc和EGFP转录水平的相关关系达到极显著水平，具体结果为：决定系数 R2＝0.9871，相关系数r＝0.9935，显著性值P＜0.01。该数据同实施例1相同，再次证明了转基因生物中2个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性，即使外源基因插入位点不同，因为标记基因和外源基因两个表达框紧密相邻，所以外源基因Fluc的转录水平依然与标记基因EGFP的转录水平存在极显著相关。
[0030] 实施例最后对转基因蚕根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断EGFP标志基因表达量，预测Fluc外源基因表达量，筛选获得了Fluc外源基因表达量对应的家蚕个体。
[0031] 实施例进一步对另一次相同的转基因实验的6个G2代转基因家系，根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断了EGFP标志基因表达量，预测了Fluc外源基因表达量。首先确定了标记基因EGFP转录水平最高的品种为ZY148，实验再用6个G2代转基因家系的其他个体，实际检测了Fluc标志基因表达水平，结果比较证明这个品种的外源基因Fluc的转录水平确是最高的，以Rp49为内参基因，其相对转录水平达到2.1％。实施例证明可以利用标记基因EGFP表达量预测外源基因Fluc表达量，并进一步筛选得到外源基因Fluc表达量最高的转基因家蚕品种。
[0032] 本实施例的原理同实施例1。
[0033] 实施例3：
[0034] 本实施例构建了一个外源基因在后、标记基因在前，且以piggyBac转座子为基础的转基因质粒pBA3EGFP-Fib-L-Rluc，转基因质粒中，由家蚕后部丝腺特异性表达的丝素蛋白轻链(Fib-L) 启动子启动海肾荧光素酶(Rluc)外源基因的表达框，由肌动蛋白A3启动子启动绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的表达框，其中家蚕后部丝腺特异性表达的丝素蛋白轻链(Fib-L)启动子截取了690bp长度的近端启动子，外源基因表达框和标记基因表达框的相邻间隔为30bp。
[0035] 将pBA3EGFP-Fib-L-Rluc转基因质粒与为piggyBac转座子提供转座酶的辅助质粒一起溶解在pH7.6磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液中pBA3EGFP-Fib-L-Rluc质粒和辅助质粒按1:1比率混合，两种质粒的注射总浓度为0.4μg/μl。
[0036] 然后采用显微注射法将混合质粒导入家蚕产卵后8小时内的受精卵内，注射总体积为 10nl左右。注射后的蚕卵在25℃、85％湿度、12h光照的条件下饲养至成虫，自交得到G1 代。在G1代小蚕期，利用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出表达EGFP标记基因的阳性家蚕，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。G1代转基因家蚕饲养至五龄第三天时，共取6个转基因家蚕蛾区，由于piggyBac转座子插入基因组的随机性，6个转基因家蚕蛾区被鉴定证明具有不同插入位点，每个蛾区取3条蚕的后部丝腺作为3个生物学重复，采用荧光定量PCR技术，以GAPDH为内参基因检测2个顺序排列表达框中的外源基因Rluc和标记基因EGFP的转录水平，相关性统计分析结果表明6个转基因家蚕品种的Rluc和EGFP转录水平的相关关系达到极显著水平，具体结果为：具体结果为 R2＝0.8161，r＝0.9034，P＜0.01。该数据进一步证明，即使外源基因改成Rluc，但转基因生物中2个紧密相邻的、表达框同向的外源基因表达量具有显著相关性这个特性没有变化，即使外源基因插入位点不同，因为标记基因和外源基因两个表达框紧密相邻，所以外源基因Rluc 的转录水平依然与标记基因EGFP的转录水平存在极显著相关。
[0037] 实施例最后对转基因蚕根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断EGFP标志基因表达量，预测Fluc外源基因表达量，筛选获得了Fluc外源基因表达量对应的家蚕个体。
[0038] 实施例进一步对另一次相同的转基因实验的9个G2代转基因家系，根据EGFP荧光强弱进行检测，以此判断了EGFP标志基因表达量，预测了Rluc外源基因表达量。首先确定了标记基因EGFP转录水平最高的品种为ZWB8，实验再用9个G2代转基因家系的其他个体，实际检测了Rluc标志基因表达水平，结果比较证明这个品种的外源基因Rluc的转录水平确是最高的，以GAPDH为内参基因其相对转录水平达到5％。实施例证明可以利用标记基因 EGFP表达量预测外源基因Fluc表达量，并进一步筛选得到外源基因Rluc表达量最高的转基因家蚕品种。
[0039] 本实施例的原理同实施例1。
[0040] 综上所述，本发明的结果证明了即使外源基因插入位点不同，在标记基因和外源基因两个表达框紧密相邻的条件下，外源基因Fluc或Rluc的转录水平与标记基因EGFP的转录存在极显著相关。因此，可以利用标记基因来预测外源基因的转录水平，从而简化了从大量转基因品种中筛选高效表达外源基因品种的程序，具有简便、省时、省钱的优势，为建立高效的生物反应器提供了理想的筛选手段。
[0041] 在所有转基因生物中，基因表达模式是相同的，都是在启动子作用下被转录表达，具有共同性。本实验证明外源基因不论是Fluc基因，还是Rluc基因，其转录水平都与标记基因EGFP的转录水平存在极显著相关性。可以预见只要是外源基因与标记基因处于邻近且同向的状态，两者的基因表达水平一定也存在极显著相关性；而且这种相关性在采用红色荧光蛋白基因(DsRed)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)等其他标记基因时也一定存在。
[0042] 实施例中的piggyBac(PB)转座子首次在鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系 TN-368中发现。之后，在地中海果蝇(Ceratitis capitata)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和家蚕(Bombyx mori L.)等昆虫中利用PB转座系统均取得了转基因实验的成功。研究还证明PB转座子是一个广谱的转座系统，已经在酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、真涡虫(Girardia tigrina)、斑马鱼(Danio rerio)、鸡、牛、猪、水稻和人细胞等，从无脊椎动物到有脊椎动物等多种生物中成功实现转基因。由此可见，虽然实施例采用的物种是家蚕，但本发明也同样适用于其他物种，具有显著的技术效果。
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
生物反应器热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈