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肽交联生物活性聚合物材料

阅读：863发布：2020-05-15

专利汇可以提供肽交联生物活性聚合物材料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种用于制备肽交联生物活性聚合物材料的方法，其包括使羟基官能化小分子与氨基酸反应以生成氨基酸官能化单体，使氨基酸官能化单体与脲键前驱体反应以生成基于氨基酸的聚(酯脲)，以及使基于氨基酸的聚(酯脲)与基于肽的交联剂反应以生成肽交联生物活性聚合物材料。，下面是肽交联生物活性聚合物材料专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种根据下式的基于肽的交联剂
其中PEP是具有20个或更少氨基酸的肽。
2.根据权利要求1所述的基于肽的交联剂，其中PEP是选自由骨涎蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、成骨生长肽以及骨形态发生蛋白-2组成的组的肽。
3.一种制备生物活性肽交联聚合物材料的方法，其包括以下步骤：
a.使羟基官能化小分子与氨基酸反应以生成氨基酸官能化单体，
b.使氨基酸官能化单体与脲键前驱体反应以生成氨基酸聚(酯脲)，
c.以及使基于氨基酸的聚(酯脲)与基于肽的交联剂反应以生成生物活性肽交联聚合物材料，其中基于肽的交联剂具有以下结构，
其中PEP是具有20个或更少氨基酸的肽。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述羟基官能化小分子是任何少于二十个碳且具有至少两个端羟基基团的有机分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述羟基官能化小单体是羟基官能化的二醇或三醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述羟基官能化小单体是1,6-己二醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述氨基酸有以下结构
其中R是或
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述基于肽的交联剂具有以下结构：
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述氨基酸是除丝氨酸以外的任何氨基酸。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述脲键前驱体是光气或三光气。
11.根据权利要求9所述的方法，其中PEP是选自由骨涎蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、成骨生长肽以及骨形态发生蛋白-2组成的组的成员。

说明书全文

肽交联生物活性聚合物材料

发明领域

[0001] 本发明一般涉及生物活性聚合物材料。在具体实施方案中，本发明涉及用于体内再生医学应用的生物活性聚合物材料。在其它实施方案中，本发明涉及用于体内用途的肽交联聚合物材料，并且在具体实施方案中涉及在体内提供生物活性的肽交联的基于氨基酸的聚(酯脲)（PEU）材料。在其它实施方案中，本发明提供肽交联氨基酸PEU材料，所述肽交联氨基酸PEU材料提供成骨诱导活性。在其它实施方案中，本发明提供由肽交联氨基酸PEU材料形成的特定支架结构。

发明背景

[0002] 已经以各种方式将合成的可降解聚合物用于再生医学和整形外科应用。然而，它们普遍缺乏承重手术治疗所必须的机械性能。在文献中发现很多实例，在所述文献中已经成功地将可降解聚合物应用于整形外科应用，包括聚(乳酸)、聚己内酯和聚(富马酸二羟丙酯)；然而，关于这些聚合物的最大报道的机械性能在3.0–3.5GPa范围内。作为对比，长骨中骨干内骨密质沿骨轴方向的弹性模量约为18GPa。普遍认为聚(乳酸)没有足够的机械性能来经受承重应用。本领域需要可吸收的生物材料，所述生物材料具有用于再生医学和整形外科应用的高模量。

[0003] 理想的是，支架的机械性能必须适合于承重部位的再生骨。单独的聚合物要达到那些数字是不可能的。研究人员已经通过复合和混合方法增加了可降解材料的机械性能，但是对于设计具有足够的机械性能且保持全部降解完全的能力的聚合物材料仍旧是一个挑战。包括共价交联在内的机械加强聚合物的传统方法通常限制或防止所需的生物降解。一个策略是利用天然存在的氨基酸作为单体前体的结构单元。然而，不管它们的生物起源，传统的聚（α-氨基酸）具有限制它们的合成效用的独特的物理、化学和生物降解性能。然而，本文描述的聚(酯脲)材料是在正确的方向的重要步骤，因为它们都很牢固且可降解。

[0004] 临床引入新材料的显著限制包括以下发现：全合成材料缺乏细胞特异性受体且难以限定的血清吸附性能，所述血清吸附性能取决于吸附层数量和性能可能会有很大的差别。合成聚合物化学的最新进展已能够合成设计用以诱导特定细胞功能以及引导细胞-细胞相互作用的聚合物材料。例如，已经利用粘着受体结合肽、糖蛋白和系留生长因子(tethered growth factor)来衍生聚合物，以增强生物-合成介面上的相互作用。所提出的其它解决方案包括在聚合物中掺杂蛋白质或多肽或用模仿细胞外基质或生长因子的共价系留肽修饰聚合物。其中一个实例是成骨生长肽（OGP）。OGP是在血清中发现的μmol/L浓度的天然存在的14-mer肽生长因子。作为可溶性肽，OGP调节在成骨细胞系细胞中的增殖、分化和基质矿化作用。将OGP的活性部分，OGP（10-14）区从肽切割，并将其结合于OGP受体上，所述OGP受体激活多个信号通路，包括MAP激酶、Src和RhoA通路。当静脉内施用于动物时，OGP和OGP（10-14）促进增加骨密度且刺激愈合，这表明在骨组织工程学应用中的潜在应用。

[0005] 尽管已取得了进展，但本领域仍需要在整形手术和其它再生医学应用中有用的新类别的聚合物材料，所述材料赋予特定成骨信号基序且具有适于它们的目标应用的适合的机械性能。发明概述

[0006] 在一个实施方案中，本发明提供了根据下式的基于肽的交联剂：其中PEP是具有20个或更少氨基酸的肽。

[0007] 在其它实施方案中，本发明提供了根据段落【0006】的基于肽的交联剂，其中PEP是选自由骨涎蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、成骨生长肽以及骨形态发生蛋白-2组成的组的肽。

[0008] 在其它实施方案中，本发明提供了用于制备肽交联生物活性聚合物材料的方法，其包括以下步骤：a.使羟基官能化小分子与氨基酸反应以生成氨基酸官能化的单体，
b.使氨基酸官能化单体与脲键前驱体反应以生成基于氨基酸的聚(酯脲)，
c.以及使基于氨基酸的聚(酯脲)与基于肽的交联剂反应以生成肽交联生物活性聚合物材料，其中基于肽的交联剂具有以下结构：
其中PEP是具有20个或更少氨基酸的肽。

[0009] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】中的方法，其中羟基官能化小分子是任何少于二十个碳且具有至少两个端羟基基团的有机分子。

[0010] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】或【0009】中的方法，其中羟基官能化小分子是羟基官能化的二醇或三醇。

[0011] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】至【0010】的任一段落中的方法，其中羟基官能化小分子是1,6-己二醇。

[0012] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】至【0011】的任一段落中的方法，其中所述氨基酸具有以下结构：其中R是
或

[0013] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】至【0012】的任一段落中的方法，其中所述基于肽的交联剂有以下结构：

[0014] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】至【0013】的任一段落中的方法，其中氨基酸是除丝氨酸以外的任何氨基酸。

[0015] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】至【0014】的任一段落中的方法，其中脲键前驱体是光气或三光气。

[0016] 在其它实施方案中，本发明提供了如段落【0008】至【0015】的任一段落中的方法，其中PEP是选自由骨涎蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、成骨生长肽以及骨形态发生蛋白-2组成的组的成员。附图简述

[0017] 图1是制备肽交联的基于氨基酸的聚(酯脲)的一般反应方案；

[0018] 图2提供用以测量聚（1-PHE-6）和聚（1-LEU-6）的屈服强度（YS）和拉伸强度（TS）的Instron试验的图；

[0019] 图3提供MC3t3-E1成骨细胞和原代小鼠成纤维细胞的WST-1增殖测定；

[0020] 图4显示了用Masson三色法(Masson’s Tribrome)染色的组织学染色切片的100倍放大倍率的数字图像；并且

[0021] 图5显示了如在4周和12周时从Masson三色法分析收集到的各测量值的定量组织学分析的图。说明性实施方案详述

[0022] 本发明提供肽交联机械坚固性和生物活性聚合物材料。在其它实施方案中，本发明提供可用于有用的应用的肽交联的基于氨基酸的聚(酯脲)（PEU）材料。在其它实施方案中，本发明提供肽交联氨基酸PEU材料，所述肽交联氨基酸PEU材料提供成骨诱导活性。在其它实施方案中，本发明提供由肽交联氨基酸PEU材料形成的特定支架结构。

[0023] 本发明提供适合于制备本发明的肽交联聚合物材料的具体反应方案。使羟基官能化小分子，特别是二醇或三醇，与氨基酸反应，这导致端官能化具有基于氨基酸的物质的分子，生成文中所称的氨基酸官能化单体。然后使用三光气或双光气或光气将脲键引入氨基酸端官能化单体以生成聚(酯脲)（PEU）。然后使PEU与基于肽的交联剂交联以生成肽交联的基于氨基酸的PEU材料。

[0024] 实际上羟基官能化小单体可选自任何少于二十个碳且具有至少两个端羟基基团的有机分子。在其它实施方案中，羟基官能化化合物可具有3至8个羟基官能团。这些基团可来自糖分子、碳水化合物和支链的二醇。

[0025] 在具体实施方案中，选择的分子是端羟基官能化己烷、1,6己二醇。

[0026] 实际上氨基酸可选自任何氨基酸，条件是丝氨酸因为羟基在侧链上而不适合。

[0027] 可以本领域技术人员所熟知的多种方法来实现羟基官能化分子与氨基酸生成氨基酸官能化单体的反应。通常，在超过水的沸点的温度上的缩合反应足以能够使反应开始，其中所述水包含相对于羟基基团稍摩尔过量（～2.1eq.）的酸。对于质子化氨基酸上的胺以及确保在更高的转化率下不发生反式酰胺化反应来说，甲苯磺酸的存在是必要的。

[0028] 为了将脲键引入到所得到的氨基酸官能化单体，采用光气、二光气或三光气。发现二光气（液体）和三光气（固态晶体）比光气更合适，因为普遍认为它们是比光气更安全的替代物，光气为有毒气体。

[0029] 也可以本领域技术人员所熟知的多种方法实现氨基酸功能化单体与三光气、二光气或光气生成基于氨基酸的PEU的反应。通常，需要大量摩尔过量（相对于胺浓度～10-50摩尔过量）以驱动生成更高分子质量的反应。

[0030] 采用肽交联剂来交联基于氨基酸的PEU。可从具有下面示出的一般结构的那些中选择肽交联剂：其中实际上PEP选自任何具有20个或更少氨基酸的肽，且具有所需的生物活性（骨传导性、骨诱导性、粘连性、抗炎性、血管生成性、神经刺激性）。应当认识到赖氨酸基团（K）键合至PEP的每一端。在具体实施方案中，PEP选自由骨涎蛋白（KRSR，序列GGGKRSR）、玻连蛋白、纤连蛋白（RGD，序列GRGDS）、成骨生长肽（OGP，序列ALKRQGRTLYGFGG）、成骨生长肽亚基（OGP[10-14]，序列YGFGG）以及骨形态发生蛋白-2（BMP-2，序列KIPKASSVPTELSAISTLYL）组成的组。值得注意的是，肽（PEP）的两端均利用赖氨酸（K）进行端官能化。

[0031] 通过在固相合成法期间，在目标肽（即：PEP）的N-末端和C-末端上置入赖氨酸氨基酸残基来形成肽交联剂。在固相合成法期间，利用Aloc单元预衍生赖氨酸侧链氨基酸。在从树脂上切割之前，将不断增长的肽的N末端乙酰化。这样得到恰好具有两个乙烯基基团（两端各一个）的官能化的基于肽的交联剂。

[0032] 使基于氨基酸的PEU与肽交联剂反应，以生成肽交联的基于氨基酸的PEU。可混合0.1至5.0摩尔%之间的肽交联剂，而不减少基础PEU聚合物的机械性能。无法通过实验确定复合材料中交联剂的准确位置。在肽交联过程期间，原位自由基的形成无疑导致了聚合物骨架中的断链。虽然通常预期会迅速失去机械性能，但在此实例中不会发生这种情况，因为交联剂的摩尔分数低且初始分子量高。

[0033] 图1示出根据本发明的具体实施例的一般反应方案。应当认识到，已经通过使用“K”代替大多数赖氨酸结构而简化了基于肽的交联剂化学式。该交联剂特有以下结构：

[0034] 在具体实施方案中，二醇是1,6-己二醇。通过在135℃下与甲苯磺酸（TosOH2.5当量）和甲苯混合20小时，使二醇与如图1所示的2.1当量的氨基酸反应。氨基酸将二醇的羟基基团用氨基酸取代，以提供所示的氨基酸官能化单体。然后，通过与混合了碳酸钠、水和三氯甲烷的三光气反应，将脲键引入该氨基酸官能化单体。如图1所示，这生成基于氨基酸的PEU。

[0035] 然后，使基于氨基酸的PEU与基于肽的交联剂交联，所述基于肽的交联剂具有所需的在每个末端均用赖氨酸基团修饰的肽。采用的所需的肽是成骨生长肽[10-14]（OGP[10-14]是ALKRQGRTLYGFGG的亚单位）。使基于氨基酸的PEU与基于肽的交联剂、光引发剂Irgacure2959和六氟-2-丙醇混合。然后，可将所得交联聚合物粉碎成小块，并在约1200psi至1800psi压力以及约130℃至180℃温度下熔融压片，以形成所需的支架。所得肽交联的基于氨基酸的PEU示于图1中。

[0036] 该实施方案的肽交联的基于氨基酸的PEU的优点是所具有的机械性能（弹性模量=6.1GPa）几乎是聚(乳酸)的两倍（弹性模量=2.9GPa）。肽交联的基于氨基酸的PEU聚合物的普遍生物相容性和再吸收性示于体内鼠皮下实验中。虽然不是临床骨科模型，它是证明这些新一类的生物材料的效用的重要步骤。已经示出，肽交联的基于氨基酸的PEU促进聚合物结构和宿主之间的整合。

[0037] 本发明的交联的基于氨基酸的PEU可用于制备支架、多孔性支架、纤维、织带和网孔。

[0038] 鉴于上述情况，应当明白，本发明通过提供在结构和功能上以多种方式改进的肽交联的基于氨基酸的聚(酯脲)，显著提高了现有技术。虽然在文中详细公开了本发明的具体实施方案，应当明白，本发明并不局限于此或由此因为本领域技术人员很容易理解本发明的变化。应当从以下权利要求理解本发明的范围。实施例

[0039] 本发明描述了开发一类新的交联的、机械性强劲的用于整形手术应用的聚合物材料的努力。除了赋予特定成骨信号基序之外，该方法包括加强机械性能。为了机械加强聚合物和刺激特定生物活性，本发明包含基于OGP的交联剂。合成肽交联苯丙氨酸和亮氨酸基聚(酯脲)（PEU）均聚物，并利用0.5%和1.0%的OGP（10-14）系链。此外，聚(酯脲)的半结晶度提供其中可调整机械性能、化学稳定性和生物降解率的非化学方法。该实施例详细描述了证明聚(酯脲)材料的加强的模量、生物相容性和再吸收性的化学、机械、体外和体内数据。进一步地，此处的数据凸显了许多机会，即社会将发现这些材料在再生医学的应用。材料

[0040] 除非另外列出，所有溶剂和试剂均从Sigma-Aldrich购买且直接使用。芴甲氧羰基（FMOC）保护的氨基酸和预加载的王树脂(Wang-resin)从CEM公司购买。α最小必须培养基（α-MEM）和极端培养基(ultra culture media)从Lonza购买。所有其它细胞培养试剂均从Invitrogen公司购买。所有试剂按原样使用。双-L-苯胺和双-L-亮氨酸酯的二对甲苯磺酸盐的合成

[0041] 如图 1所示，利用如在 Pang X等人，Synthesis,Characterization and Biodegradation of Functionalized Amino Acid-based Bioanalogous Polymers.,Biomaterials2010;31:3745中讨论的方法制备双-L-苯胺和双-L-亮氨酸酯的二对甲苯磺酸盐，其通过引用并入本文。简言之，在配有迪安-斯塔克(Dean Stark)分水器和磁力搅拌棒的250mL三颈烧瓶中混合L-亮氨酸（1.31g，10mmol）、1,6-己二醇（0.48g，4mmol）、对甲苯磺酸（1.92g,10mmol），和甲苯（20mL）。用氮气吹扫该体系30分钟，然后将反应混合物在氮气中在135℃下加热20小时。使反应混合物冷却至室温环境温度，并通过真空过滤分离粗产物。用25mL水将有机残留物重结晶4次，得到2.26g（82%）化合物1，即双-L-亮氨酸1 13
酯的二对甲苯磺酸盐，其为白色粉末。用 H-NMR,、C-NMR和熔点测量来表征产物。

[0042] 双-L-亮氨酸己烷-1,6-二酯的二对甲苯磺酸盐（单体 1，1-LEU-6）：1
mp:186-188℃；H-NMR（300MHz,DMSO）:0.90（d,12H）1.34（s,4H）1.45-1.80（m,8H）2.29
13
（s,6H）3.99（t,2H）4.15（d,4H）7.13（d,4H）7.49（d,4H）8.31（s, 活性 H）; C-NMR（75MHz,DMSO）:169.91，145.34，137.35，129.10，125.48，65.52，50.62，27.76，24.75，
23.79，23.13，21.92，20.79。

[0043] 双-L-苯丙氨酸己烷-1,6-二酯的二对甲苯磺酸盐（单体2，1-PHE-6）：1
mp:215-217℃;H-NMR（300MHz,DMSO）:0.90-1.15（m,4H）1.38（s,4H）1.25-1.50（m,4H）
2.23（s,6H）2.91-3.09（m,2H）3.10-3.21（m,2H）4.01（t,4H）4.30（t,2H）7.11（d,4H）
13
7.19-7.40（m,10H）7.49（（d,4H）8.43（s,活性H）; C-NMR（75MHz,DMSO）:169.06,145.
00,138.12,134.70,129.32，128.55，128.21，127.54，125.53，65.45，53.34，36.20，27.63，
24.70，20.82。
1-LEU-6和1-PHE-6界面缩聚

[0044] 图1给出了聚(酯脲)合成的一般方案。在配有顶置式机械搅拌器和温度计的500mL三颈烧瓶中混合单体1-LEU-6（6.89g，10mmol）、碳酸钠（3.18g，30mmol）和水（150mL）。将混合物在40℃温水浴中加热30分钟。移去水浴并用冰盐浴代替。当内部温度下降至0℃左右时，将预先制备的三光气溶液（1.035g，3.30mmol在30mL三氯甲烷中）在快速机械搅拌下迅速（5秒钟）加入反应体系。使反应进行30分钟，然后将额外等分的三光气（共0.108g，0.330mmol）溶于三氯甲烷（5mL）中，每10分钟将1mL等分的三光气加至反应体系中。加完三光气后，将有机相在热水中沉淀，过滤，并真空干燥，以得到白色固体（3.2g，1 13
74.5%产率）。通过 H-NMR、C-NMR、FT-IR光谱、SEC、TGA和DSC来表征产物。在表1中列出聚合物的分子量以及热性能。

[0045] 聚（1-LEU-6）：FT-IR（cm-1）:1740[-C（CO）-O-],1648,1542[-NH-C1
（O）-NH-],3283[-NH-C（O）-NH-];H-NMR（300MHz,DMSO）:0.91（d,12H）1.20-2.00（m,14H）
13
4.21（t,4H）4.45（d,2H）5.35-5.80（m,活性H）; C-NMR（75MHz,DMSO）:174.64，157.08，
65.00，51.60，65.00，51.00，42.31，28.20，25.29，24.74，22.61，22.12。

[0046] 聚（1-PHE-6）:FT-IR（cm-1）:1736[-C（CO）-O-],1649,1553[-NH-C1
（O）-NH-],3384[-NH-C（O）-NH-];H-NMR（300MHz,DMSO）:0.91（d,12H）1.20-2.00（m,14H）
13
4.21（t,4H）4.45（d,2H）5.35-5.80（m,活性H）; C-NMR（75MHz,DMSO）:174.64，157.08，
65.00，51.60，65.00，51.00，42.31，28.20，25.29，24.74，22.61，22.12。

[0047] 表1：基于氨基酸的PEU的表征数据概述表1.基于氨基酸的聚(酯脲)的表征数据概述
样品 MW MW/Mn Tg Tm Td G’(GPa)
聚(1-LEU-6) 76,800 2.12 57 126 275 4.4±0.9
聚(1-PHE-6) 84,000 2.42 107 153 335 6.1±1.1
肽交联剂

[0048] 使用（Aloc）KYGFGGK（Aloc）序列，通过固相FMOC化学法来合成对称的乙烯基官能化OGP[10-14]。在标准条件（45分钟，95%三氟乙酸（TFA）、2.5%三异丙基硅烷（TIPS）、2.5%水（按体积计））下从树脂切割肽，并将其在冷乙醚中沉淀。在两个研碎循环后，在去离子水中析出肽（分子量（MW）截止值100g/mol，纤维素膜，Pierce），并用基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）来验证分子量（FW（+H）924.50g/mol，预期值924.44g/mol）。
分子量表征

[0049] 通过尺寸排阻色谱（SEC）来确定数均（Mn）和重均（Mw）分子量以及分子量分布（Mw/Mn）。设备配有保护柱和一组50 、100 、104 ，和线性（50-104 ）Styragel5μm柱，Waters486可调UV/vis检测器，以及Waters410示差折光仪。所有分析均使用RI检测器在1mL/min流速下进行。在50℃下将DMF用作洗脱剂。利用普适校准曲线来确定每个聚合物各自的分子量和分子量分布，所述曲线是在用聚苯乙烯标准品（Polymer Laboratories）校准后，通过将ln-（[η]/Mn）（其是固有粘度除以数均分子量的自然对数）作为洗脱体积的函数作图而获得的。
热表征

[0050] 通过热重分析仪（TA instruments，Q50TGA）在氮气中、20℃/min扫描速度下30℃至500℃的温度范围内确定聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）材料的降解温度（Td）。由示差扫描量热仪（TA instruments，Q2000DSC）以10℃/min的扫描速度表征聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）材料的热转变。交联支架的制造

[0051] 通过压缩成型制造工艺来制备聚合物塞子。将聚合物材料～1g、相应量的肽交联剂和光引发剂Irgacure2959溶于20mL六氟-2-丙醇中。用365nm紫外光照射澄清溶液45分钟。将溶剂在通风橱内在室温下蒸发24小时，接着在80℃下真空干燥24小时。将复合材料碾碎成小块，并在设计温度（聚（1-LEU-6）130℃，聚（1-PHE-6）180℃）下，使用具有
1800psi压力的Carver液压单元模型3912熔融压片。将聚合物嵌段冷却至室温，在适合温度（聚（1-LEU-6）80℃，聚（1-PHE-6）130℃）下真空退火24小时。将最终的聚合物嵌段切成直径0.5cm的小的圆塞，用于测试。将所有塞子在-20℃温度的氮气气氛下储存以备后用。
机械表征

[0052] 动态力学分析（DMA）：在环境温度下，以样品尺寸40x2.0x0.2mm，利用TA Q800动态力学分析（DMA）仪来确定聚（1-PHE-6）、0.5%OGP聚（1-PHE-6）和1.0%OGP聚（1-PHE-6）的杨氏模量（Young’s moduli）数据。应变率为1.5%/秒。使用小应变（<0.15%），用线性状态的切线斜率确定杨氏模量。使用TA Universal Analysis 软件报告应力应变数据。用Origin8将数据作图，并使用线性状态回归分析计算杨氏模量值。从四次单独测量来确定杨氏模量值和标准偏差。

[0053] Instron：使用Instron3365万能材料试验机来测量聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）的弹性模量和拉伸性能。标距长度为20mm且十字头速度设为30mm/min。样品长40mm、宽4mm、厚0.2mm。使用Instron Bluehill 软件报道应力应变数据。用Origin8将数据作图，使用屈服点之前的线性状态回归分析计算弹性模量值。提供的结果是6次单独测量的平均值。使用屈服点之前的数据曲线切线斜率计算弹性模量。
体外细胞培养和表征

[0054] 从保存在阿克伦综合医疗中心(Akron General Medical Center)，Calhoun研究实验室(Calhoun Research Laboratory)的男婴包皮环切组织样品分离的储存用培养物中获得原代人包皮成纤维细胞。从Riken获得MC3T3-E1成骨细胞。成纤维细胞保存在有高葡萄糖(Gibco，11965)的DMEM中，而MC3T3-El成骨细胞保存在MEM Alpha(Gibco A10490;Invitrogen，Carlsbad，CA)中。每个培养基补充有10%胎牛血清（FBS）（Sigma，F6178）（St.Louis，MO）和1%青霉素-链霉素-两性霉素（10,000U:10,000μg:25μg）（Lonza BioWhittaker,BW17-745E;Fisher Scientific,Waltham,MA）。将细胞维持在37℃和5%二氧化碳：95%空气的培养箱内。在准备形态学和增殖实验时，使用2.5%的胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）（Invitrogen，15090-046）从烧瓶释放细胞，并使用0.4%台盼蓝5
（Gibco，15250）在血细胞计数器上计数，用于活力和浓度测定。在6孔板中，在10 细胞/ml浓度的成纤维细胞存在下，以利用1.0%OGP系链的聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）聚合物塞子进行初步形态学评估。48小时后，用Olympus CKX41倒置显微镜（Center Valley,PA）观察细胞，并用Qimaging软件和Micropublisher Real Time Viewing（RTV）5.0电荷-耦合设备（CCD）色冷相机（QImaging,Princeton,NJ）捕捉数字图像。

[0055] 使用WST-1活力测定（Dojindo Molecular Technologies，W201-10；Rockville，MD）来测量细胞增殖。简言之，通过异丙醇冲洗使PLA、聚（1-LEU-6）或聚（1-PHE-6）基聚合5
物且利用0.5%或1.0%OGP系链的塞子灭菌，并将其应用于包含4x10 个成纤维细胞或MC3T3细胞的6孔板。孵育48小时后，将聚合物转移至96孔板(小心不要破坏聚合物表面的细胞)，并用Tyrode’s Hepes缓冲液冲洗。加入WST-1测定溶液，与聚合物一起孵育2小时，将得到的反应溶液转移至洁净的孔中，在450nm下读取吸光度。
动物手术

[0056] 关于处理、保护、维护和手术过程的所有动物协议均由阿克伦综合医疗中心动物保护和使用委员会机构审查和批准。将称重＞250克的共计16只雄性Sprague Dawley大鼠（Harlan Laboratories,Indianapolis,IN）按照基础聚合物型、聚（1-PHE-6）或聚（1-LEU-6）分组，每组8只动物。通过皮下注射混有0.04mg/kg阿托品的10-12mg/kg布托啡诺来预麻醉所有动物。用100%氧气中的3%异氟烷吸入麻醉诱导，随后在手术过程中将动物维持在100%中的1-1.5%异氟烷下。

[0057] 用无菌手术刀片在背上开创4个切口，在距脊椎横向约1cm处的左边和右边各两个，彼此间隔约2cm。用止血钳在皮下袋(subcutaneous pocket)前后方向打通隧道。将用环氧乙烷灭菌的聚合物薄塞插入每个袋，并用Michel夹闭合皮肤切口。在四个皮下空间内，每只动物接收（1）PLA；（2）聚（1-LEU-6）或聚（1-PHE-6）；以及，利用（3）0.5%或（4）1.0%OGP系链的聚（1-LEU-6）或聚（1-PHE-6）。每只动物的位置1-4是随机的，同时保持对照和测试材料的对角分布，以解释背部位置的可变性。插入手术4或12周后，对来自每组的四只动物实施安乐死并收集含有聚合物的组织（2cm x2cm）、保存在福尔马林中，准备用于组织学评估。
组织学和组织形态学

[0058] 切下组织切片（5μm）（Leica RM2235测微计），用苏木精和曙红（Ventana ST5020自动染色仪，苏木精7211和曙红71204）染色来显示正常的组织结构，Mallory三色法（Ventana NEXES特殊染色剂，三色II染色试剂盒860-013）用于胶原蛋白沉淀和细胞浸润，以及用茜素红检测钙矿化作为骨细胞活性的证据。对于茜素红S染色，在环境温度下用pH4.2的40mM茜素红S溶液将组织切片染色10分钟，用蒸馏水冲洗5次且在1xPBS中洗涤15分钟。将组织切片用苏木精复染、用乙醇脱水、在二甲苯中冲洗，然后用封片胶(permamount)封片。用Olympus BX51光学显微镜检查所有切片以识别皮下区域中聚合物的位置，并用Qimaging相机和软件来捕捉数字图像。使用BioQuant Nova优质图像分析软件（v.6.75.10；Nashville，TN）在三色部分的40X数字图像上分析组织形态学特征。将包围
2 2
且包含聚合物的结缔组织的总面积（μm）描述为感兴趣区（ROI）。将单独区域测量（μm）定义为从结缔组织囊延伸到包含聚合物的区域的组织区域，指示聚合物降解。在ROI内，选
2
择阈值以确定红染色区和测量胶原蛋白沉淀/细胞浸润的总像素区域（μm）的视频计数矩阵。计算降解和细胞浸润相对于各自的总面积ROI的百分比。在聚合物周围的5个随机位置测量结缔组织囊的宽度且取平均值。在ROI内和附近对巨细胞和血管数目进行计数。
统计数据

[0059] 统计学上，使用单向方差分析（ANOVA）和线性判别相关性来评估用于比较聚合物结构的组织形态学数据。除非另有说明，报道平均值和标准误差。实施T检验以识别个体比较差异。使用单向方差分析（ANOVA）和95%置信度的比较性Tukey检验进行所有其他测量的统计分析。除非另有说明，报道平均值和标准偏差。将平均值的标准偏差用作对每种测量技术相关的标准不确定度的估计。合成和表征

[0060] 通过引用并入本文的Katsarava等人，Amino Acid-based Bioanalogous polymers.,Synthesis and Study of Regular Poly（ester amide）s based on Bis（alpha-amino acid）Alpha,Omega-alkyne Diesters,and Aliphatic Dicarboxylic Acids.,J Polym Sci Part A:Polym Chem1998;37:391讨论了通过活性缩聚，而不使用二异氰酸酯进行均聚-PEU(homo-PEU)的合成。在这一过程中，活性碳酸盐（如：二对硝基苯基碳酸盐）与双（α-氨基酸）-α,ω-亚烷基二酯的二对甲苯磺酸盐相互作用。可以通过改变组合物单体的分子量以及聚合度来调整分子量。本实验采用合成基础PEU材料的改良版的方法，如图1中所示将其描述为x-氨基酸-y，其中x和y是链中的碳原子数。亮氨酸（LEU）和苯丙氨酸（PHE）基于氨基酸的PEU使用1,6-己二醇，并表示为1-LEU-6和1-PHE-6。测量聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）的分子量、分子量分布和热性质（表1）。在环境温度下，聚（1-PHE-6）不溶于传统有机溶剂，但溶于六氟-2-丙醇以及四氯己烷：苯酚的3:1混合物。当熔融处理聚（1-LEU-6）时，Tg保持不变但未观察到熔融峰，表明不存在结晶度。这表明可以用适当的处理方法抑制聚合物结晶度。聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）材料的降解温度（Td）超过100℃，高于熔融温度，表明两种材料的熔融处理受热降解作用影响有限。这些特性提供处理技术如成型和熔融处理，以用于制造支架。
机械性能

[0061] 在表2中报道由Instron和动态力学分析方法表征的PEU塞子的机械性能，其有代表性地分别报告了杨氏模量和弹性模量。Instron数据明确显示，聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）二者的数值（分别为4.4和6.1GPa）超过已发表的聚（L-乳酸）的数值（PLLA，2.9GPa）和聚（e-己内酯）的数值（PCL，280MPa）。为了最大化精确度和提供额外信息，将Instron测试用于测量屈服强度（YS）和拉伸强度（TS）。聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）分别具有～470%和510%的TS值（图2）。使用Instron3365万能材料测试机测量聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）的弹性模量和拉伸性能。标距长度为20mm且十字头速度设为30mm/min。
样品长40mm、宽4mm、厚0.2mm。给出的结果是六次单独测量的平均值。使用屈服点之前的数据曲线切线斜率计算弹性模量。在环境温度（约23℃）下，以样品尺寸40x2.0x0.2mm，使用TA Q800动态力学分析仪（DMA）确定聚（1-PHE-6）、0.5%OGP聚（1-PHE-6）和1.0%OGP聚（1-PHE-6）的杨氏模量数据。应变率为每秒1.5%。使用小应变（<0.15%），用线性状态切线斜率确定杨氏模量。由四次单独测量确定杨氏模量值和标准偏差值。

[0062] TS的绝对值不取决于测试样品的尺寸，它使我们的结果可以外推到更大的结构。然而，它受到其它因素影响，包括样品制备、缺陷和温度。拉伸强度与压缩强度相反并且数值也可完全不同。DMA数据得到的聚（1-PHE-6）弹性模量值为3.05±0.24GPa并且显示了弹性模量随着OGP交联剂水平的增加而成比例增加（表2）。应力应变曲线（图3）的线性状态用来计算聚（1-PHE-6）均聚物以及0.5%和1.0%OGP交联材料的杨氏模量。虽然未经优化，这些数据都显著高于目前临床上可用的可降解聚合物。

[0063] 表2：肽交联PEU的机械性能概述表2：肽交联聚(酯脲)的机械性能概述
体外增殖和生物相容性

[0064] 对原代人类包皮成纤维细胞和MC3T3-E1成骨细胞进行生物相容性和生物降解性的最初体外筛查筛选。在1.0%OGP[10-14]系链的聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）存在下，细胞接种后成纤维细胞形态呈现贴壁状态（图像未示出）。细胞未显示细胞毒性和细胞凋亡特征。进行WST-1增殖测定，以证实具有分别利用0.5%和1.0%OGP系链的聚（1-LEU-6）或聚（1-PHE-6）和聚合物的细胞活性和增殖率（图3）。与Greenberg Z等人，Structural and Functional-Characterization of Osteogenic Growth Peptide from Human Serum–Identity with Rat and Mouse Homologs,J.Clin.Endocrinol.Metlab 1995,80:2330中提出的双相、浓度依赖性增殖效应一致，未官能化的均聚物（PLLA，聚（1-LEU-6）或聚（1-PHE-6））未表现出细胞类型依赖性增殖活性。然而，相对于对应的成纤维细胞中的减少趋势，在0.5%和1.0%OGP官能化材料中成骨细胞增加的增殖趋势表明，该肽对于受体是生物可利用的，并且我们采用生物活性浓度方案。聚(乳酸)（PLA）、聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）对照的双向ANOVA对比未显示在成纤维细胞的增殖作用中的显著差异。与聚合*物对照（P<0.05）相比，关于含0.5%OGP的聚（1-LEU-6）和含1.0%OGP的聚（1-PHE-6）显著增加了成骨细胞增殖。因此，似乎除了提供机械增强之外，交联OGP肽对细胞表面受体是生物可利用的并且对信号起始有效。
通过组织图像分析的体外生物相容性和降解性

[0065] 在证明对细胞活力没有明显影响后，皮下植入塞子模型可用于评估生物降解、细胞浸润、囊厚度、炎症反应和血管数量。在尸检收集组织时，未发现纤维化、肉芽肿发硬、坏疽或细菌感染的证据。植入4周后，在聚（1-LEU-6）或聚（1-PHE-6）均聚物的组织切片中几乎未见到降解的证据（图4—在植入4周后（A行）和12周后（B行）移除组织。C行：B行中显示的12周组织切片的系列切片，经茜素红染色）。在PLLA控制测量（图6A）中，两种均聚物降解速率无统计学差异。然而当与OGP交联时，两组聚合物显示出在12周进一步增殖的显著的降解水平。降解的这种增加归因于OGP交联剂赋予的聚合物塞子中额外的自由体积以及由于肽而增加的吸收进基体材料的水。

[0066] 图5提供对以下的代表性分析：生物降解（A）(通过测量聚合物空间中组织迁移区域)、细胞浸润（B）、囊厚度（C）、免疫反应（D）(多数巨细胞表现的)以及血管化（E）(通过相关血管计数)。由以下指示统计显著性（P＜0.05）：1=与PLA对比；2=与基础聚合物对比；3=4周对比12周结果；4=0.05%OGP对比1.0%OGP；以及5=聚（1-PHE-6）对比聚（1-LEU-6）。
根据组织切片中含有植入物的ROI中的红三色染色剂像素数来定量细胞浸润百分比。红染色剂包括细胞核（主要为淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞）和胶原蛋白的存在。除了1%OGP交联聚（1-LEU-6）相对于PLLA在12周的暗示趋势之外，各数据集细胞浸润量显示几乎没有显著性（图5B）。区域内细胞迁移和胶原蛋白产生相对较低的百分比表明，对植入材料存在极少的炎症和纤维化反应。

[0067] 在两组数据集中，关于囊的形成可以看到有前景的趋势（图5C）。而对于PLLA、聚（1-LEU-6）和聚（1-PHE-6）均聚物，在第4周的整体厚度数据相似，OGP交联聚（1-PHE-6）材料的囊厚度未明显地增加，而包含0.5%和1.0%OGP的聚（1-PHE-6）在12周显示相对于PLLA较少囊的形成。普遍小的囊厚度（均＜500um）证实没有任何显著纤维化或肉芽肿反应。

[0068] 计数巨细胞数目，作为异物组织响应的指标。PLLA和（1-LEU-6）的巨细胞计数相似，然而相对于对照，1.0%OGP交联聚（1-PHE-6）材料确实诱导增加的巨细胞数（图5D）。这可表明1%OGP的肽浓度太高，然而尽管巨细胞数更大，整体数量均相对较小（均＜20）。由于皮下植入位置、缺乏孔隙和干细胞源以及随访时间范围(follow-up time frame)，预计不会发现由茜素红染色剂（图5，C行）的钙矿化指示。

[0069] 与其他测试组比较，生物降解伴有在聚（1-PHE-6）组中更高的血管数量(图5E)。之前在OGP文献中尚未报道血管分布的影响。由于血管形成的增加并未伴随炎性细胞浸润的显著增加，血管的募集和迁移似乎可促进聚合物的生物降解。

[0070] 通过证明与聚合物材料接触的完整组织无不良反应，体内生物相容性研究确证了体外结果。聚合物周围的囊形成类似于对于PLA一般观察到的情况。与聚（1-LEU-6）比较，具有0.5%和1.0%OGP的聚（1-PHE-6）聚合物表现与生物降解和组织并入聚合物材料的量的显著有利的相互作用（与其他测试组比较）。

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肽交联生物活性聚合物材料

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