技术领域
[0001] 本
发明大体上涉及使用分泌靶蛋白的生物培养物大规模制造靶蛋白的领域，其中在多个
生物反应器的内含物的收集和纯化的同时在下游生物处理装置中合并多个生物反应器的内含物，由此显著节省制造的时间与成本。
背景技术
[0002] 使
用例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或其它类似细胞等
哺乳动物细胞大规模制造靶蛋白目前占现今所用所有重组制造方法的约四分之三。随着更多的靶蛋白、尤其是单克隆
抗体(MAB)的
专利到期，存在以下正在上升的未得到满足的需求：将买得起的、容易安装与操作并且调节挑战更少的制造系统。目前所用的系统无论其成本如何，都不提供这些优点。作为一实例，用于提供至少20％的单一MAB的世界市场的哺乳动物细胞制造设施可以花费超过$1亿用于cGMP生产。对此类巨大投资的要求一直以来使许多公司在这个制造领域之外，导致这些产品的全球垄断和价格控制。
[0003] 存在开发以可能的最低成本制造靶蛋白的方法的大量未得到满足的需求并且这可以通过各种概念的新颖组合来实现，包括：
[0004] a.使用更小的生物反应器，通过合并输出以符合cGMP批量的定义的CFR 21要求产生大批量，从而降低按比例扩大和验证的成本，降低污染失败的成本并且使用更小的制造设施；
[0005] b.消除以下高成本步骤：细胞分离、营养介质体积减少和冗长的色谱柱加载；
[0006] c.允许使用逐步或梯度洗脱来纯化；
[0007] d.在单一容器中在全自动条件下进行所有以上操作以允许无人值守式操作。
[0008] 本发明提供一种用于通过在新颖系统中合并所有以上关键要素来控制靶蛋白制造成本的新颖解决方案，所述新颖系统主要可以用于制造在营养介质中分泌的靶蛋白类型，更具体地说如单克隆抗体的大剂量产品，其中资金成本要求明显降低并且可能的操作成本最低，并且用于开发和制造新产品的周转时间最短。更一股地说，本发明可以用于汇集、收集并且纯化所表达的或在任何纯化阶段的任何重组物质。代表性实例将是汇集并浓缩在
蛋白质再折叠阶段的靶蛋白。
[0009] 所主张的新颖下游处理系统不是已知技术的明显结果；必须创建若干新颖步骤、
硬件组件和方法以使这个系统功能达到最佳。
发明内容
[0010] 药物生产批量大小根据CFR 21(联邦注册代码)定义为各成分的均匀混合物。“批量”或“批次”如WHO GMP准则(TRS 908附件4)中定义为“在单一工艺或一系列工艺中处理以使得其预计为均匀的所定义数量的起始材料、
包装材料或产品。有时可能必需将批量划分成多个次批量，然后一起引入这些次批量以形成最终均匀批量。在最终灭菌的情况下，通过
高压釜的容量确定批量大小。在连续
制造过程中，所述批量必须对应于所定义的生产部分，以其预期均匀性为特征。批量大小可以定义为固定数量或以固定时间间隔产生的量”。
[0011] 在制造更小的次批量并且将其汇集在一起的那些情况下，需要将它们合并在更大的容器中，在所述容器中，次批量可以混合为均匀混合物。然而，在许多情况下，更大的容器可以是禁止使用的，例如在
洁净室中，并且因此存在发明将允许在容器之间混合并且不需要在更大容器中混合整个内含物的系统的未得到满足的需求。
[0012] 混合多个容器的内含物的想法还提供许多重要的财务和调节优点。
[0013] 在合并更小的次批量以产生更大批量方面存在其它优点。药物制造科学教示我们改变批量的大小不是简单的练习。随着批量大小改变，混合动
力学以及在制造工艺中发生的任何反应的动力学也改变，并且因此，需要制造者进行研究以验证制造条件，从而确保特定的批量大小将始终如一地产生相同产品。因此，制造者需要投入大量的时间和金钱来验证不同批量大小，以符合其针对特定产品数量的需要。
[0014] 使用生物反应器生物制造例如蛋白质等产品面对甚至更大的挑战，因为生物反应器容器中的液体(营养介质和生物培养物)体积的改变显著改变了始终如一地产生产品所需的条件。具有显著重要性的因素包括容器的几何形状、
气化量、液体的量和搅动性质并且因此，除非实践制造工艺并且对制造工艺的各种参数进行适当校正，否则不可能预测制造工艺的行为。
[0015] 因为产品的制造者通常面对一次制造更大或更小批量的选择，所以所进行的最明显的练习是验证若干批量大小并且基于当前制造需要使用特定批量大小。不同批量大小的使用还需要制造可用的不同大小的器皿，和生物反应器的其它技术附接件，使维持若干经验证批量大小的成本极高。然而，因为靶蛋白制造最昂贵并且通常具有较短的存放期，因此制造者不可避免的不维持若干经验证批量大小。
[0016] 因为生物反应器主要采用液体内含物，所以它们更容易混合并且寻找以将符合FDA根据CFR 21针对单一批量的要求的方式混合若干生物反应器的内含物的解决方案将通过降低验证所需的批量的数量并且向制造者提供在制造设备中使用更少的变化形式随意生产不同批量大小的灵活性，显著降低制造成本。
[0017] 不存在教示关于使用小得多的混合器皿以连续方式合并若干生物反应器的内含物以构成单一批量的
现有技术。本发明不仅解决降低生产成本的这个关键障碍，而且教示商用级应用，其中可以使用用于
混合液体的低成本解决方案来处理成百上千升液体。本发明提供用于从若干生物反应器合并极大体积的营养介质的两步法；首先，将所有生物反应器倒入小型混合充实室中，所述充实室然后将液体引入到与生物反应器的大小相比小得多的容器中。并不打算固持而是打算连续地混合并且排放出营养介质和生物培养物，并且通过将活性靶蛋白结合到能够结合其的
树脂，仅保留活性靶蛋白。
[0018] 本发明提供靶蛋白的连续混合捕捉。传统上，在靶蛋白已经在生物反应器中表达之后，收集和纯化工艺目前需要分离细胞，减少营养介质的体积并且加载色谱柱。所有这些都是极其费时的步骤，引起所表达的靶蛋白的大量降解并且需要极大的资本投资。
[0019] 本发明组合所有工艺，更具体地说针对如单克隆抗体的靶蛋白，通过首先使用能够结合靶蛋白的色谱介质捕捉所表达的靶蛋白并且然后弃去营养介质和生物培养物；然后洗涤靶蛋白和色谱介质的复合物并且最后洗脱，从而使用其中排放有生物反应器的单式下游生物处理器获得靶蛋白的高度纯化形式。
[0020] 本发明利用许多能够大量结合靶蛋白的树脂的新近可用性。大多数现代树脂每毫升树脂将结合20mg到125mg的靶蛋白。这些树脂中的多数对靶蛋白具有高度特异性并且其中多数可以合并以通过简单的物理化学结合工艺从溶液中移出任何类型和数量的靶蛋白，所述结合工艺强到足以在从生物反应器去除营养介质的同时保持靶蛋白与树脂连接。所述技术在靶蛋白纯化领域中也有了巨大进展，其中我们现在具有更好的能力通过调节洗脱缓冲液的pH、离子强度或其它特征来破坏树脂与靶蛋白之间的结合，从树脂洗脱这些结合靶蛋白。这允许以高度浓缩的溶液形式从生物反应器移出靶蛋白，所述高度浓缩的溶液已准备好进一步纯化并且在一些情况下其甚至可以是供使用的最终产物。
[0021] 亲和色谱法是基于分子构象的分离技术，其常常利用应用特异性树脂。这些树脂具有连接到其表面的配体，其对有待分离的化合物具有特异性。最经常地，这些配体以类似于抗体-
抗原相互作用的方式起作用。配体与其靶化合物之间的这种“
锁与钥匙”配合使其具有高度特异性。
[0022] 许多膜产品是糖蛋白并且可以通过凝集素亲和色谱法纯化。可以使清洁剂溶解产品结合到已经改性以具有共价连接的凝集素的色谱树脂。
[0023] 免疫亲和色谱树脂采用抗体与靶蛋白的特异性结合以选择性地纯化靶蛋白。所述程序涉及将抗体固定到柱材料，所述柱材料然后选择性结合靶蛋白，而一切别的东西流动通过。
[0024] 树脂结合技术的一些现有技术
水平包括：
[0025] a.诺维信(Novozymes)的新专利双重亲和多肽技术平台用类似的但一次性技术替换蛋白A工艺步骤。
[0026] b.来自密理博公司(Millipore Corp.)的刺激
反应性聚合物能够复合并操控靶蛋白并且允许控制聚合物与靶蛋白复合物的可溶性，这导致在无离心机或蛋白A介质的情况下直接捕捉产物。
[0027] c.用于替换传统的蛋白A和离子交换的混合模式
吸附剂，用于提高选择性和能力并且降低滞留时间。这些具有新颖化学性质的介质包括疏
水电荷诱导色谱，例如MEP和来自帕尔公司(Pall Corp.)的Q与S HyperCel。
[0028] d.整料，包括呈单件均匀柱形式的色谱介质，例如来自BIA分离(BIA Separations)的
对流作用介质整体柱。
[0029] e.模拟移动床，包括多柱逆流色谱，例如来自塔邦生物系统(Tarpon Biosystems)的BioSMB。
[0030] f.蛋白G(多个供应商)。
[0031] g.IgG的单域骆驼衍生(骆驼科动物)的抗体，例如来自BAC的CaptureSelect。
[0032] h.新的无机配体，包括合成染料，例如来自普洛梅特生物科学(Prometic Biosciences)的Mabsorbent A1P和A2P。
[0033] i.扩展床吸附色谱系统，例如来自厄普弗朗特色谱(Upfront Chromatography)的Rhobust平台。
[0034] j.来自兹克罗分离(ZirChrom Separations)的超耐久
氧化锆结合亲和配体色谱介质。
[0035] k.来自泰克诺格(Tecnoge)的Fc受
体模拟配体。
[0036] l.来自奈莎膜技术(Nysa Membrane Technologies)的ADSEPT(先进分离技术)。
[0037] m.来自药物纯化技术(PurePharm Technologies)的膜亲和纯化系统。
[0038] n.来自普洛梅特生物科学、戴克斯(Dyax)等用于亲和色谱法的专
门设计的肽配体。
[0039] o.涂有蛋白A和蛋白G的
磁珠，例如来自茵维特罗根(Invitrogen)/戴诺(Dynal)。
[0040] p.得到罗氏(Roche)(基因泰克(Genentech))
许可的基于靶蛋白或MAb的表达为具有对色谱介质具有亲和力的可移动的部分(标签)(例如组
氨酸标签)的融合靶蛋白的新的亲和纯化方法。
[0041] q.开发过程中的蛋白A替代物，包括反胶束(脂质体)、液体营养介质萃取系统、结晶、固定化金属亲和色谱和新颖的膜色谱系统。
[0042] r.来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)的具有一次性组分的即插即用解决方案(例如，ReadyToProcess)、具有实验设计能力的工艺开发 和多柱连续捕捉。
[0043] 出人意料的是，虽然已经在设计可用以捕捉靶蛋白的树脂方面取得了重大进展，但是一直以来这些仅用于下游纯化处理。向靶蛋白和宿主细胞的粗混合物中添加树脂将无异于教示首先浓缩营养介质并且然后在所有杂质都在所述营养介质中的情况下将其加载到柱上的当前实践。
[0044] 以产生1mg/mL靶蛋白并且所用树脂的结合能力是50mg/mL的细胞系为目标，当操作1000L生物反应器时，这将需要20L树脂。适用于制造单克隆抗体的树脂的成本可在每升例如蛋白A$15-$20,000的范围内。因此，大多数制造者将宁可使用更小数量的树脂执行若干次批量的纯化。然而，考虑到这些可以使用数百次，使用成本容易摊销并且避免了制备次批量过程中的冗长乏味和调节障碍。
[0045] 可以根据本发明处理的生物组分描述在以下各段中并且包括(但不限于)来源于以下来源的细胞培养物：例如动物(例如，仓鼠、小鼠、猪、兔、狗、鱼、虾、
线虫和人类)、昆虫(例如蛾和蝴蝶)、
植物(例如，藻类、玉米、番茄、水稻、小麦、
大麦、苜蓿、
甘蔗、大豆、
马铃薯、莴苣、羽扇豆、
烟草、
油菜籽(芥花)、向日葵、芜菁、甜菜甘
蔗糖蜜、
种子、红花和花生)和人类。唯一的要求是所用生物培养物应该通过在营养介质中分泌靶蛋白来表达靶蛋白，与在一些情况下形成包涵体截然相反。
具体实施方式
[0046] 本发明提供一种将多个预验证较小规模的生物反应器连接到下游生物处理装置的方式，所述生物处理装置固持能够结合生物反应器的营养介质中的靶蛋白的色谱介质以备收集。营养介质和生物培养物允许进入下游生物处理装置，引起色谱介质向上漂浮并且由此建立扩展床色谱系统。在本发明中提供对经典扩展床色谱的显著改性，其中色谱树脂保持在整个容器中均匀分布的连续状态，容器例如圆筒，其固持营养介质、生物培养物和色谱介质。这种改性对下游生物处理装置的成功以及对无人值守式和自动地操作所述装置是至关重要的。
[0047] 随着营养介质和生物培养物上升到下游生物处理装置的顶部，这些物质流出而色谱介质固持在下游生物处理装置中，因为在下游生物处理装置中安装了
过滤器；过滤器的孔隙度小于色谱树脂的大小(一股来讲50微米到300微米)。通过靶蛋白的结合能力的先前实验准确计算色谱介质(例如蛋白A树脂)的数量，可以确保整个数量的靶蛋白结合到色谱介质。然而，充分地认识到需要一定的反应时间来发生结合，因此必须小心地控制营养介质从生物反应器进入下游生物处理装置的流速；用于校正流速的一种测试是测量到达下游生物处理装置的顶部并且倾析的营养介质中的重组产物浓度。连续监测靶蛋白的浓度将允许调节流速。一股来讲，流出的营养介质不应该含有超过进入浓度的1％的靶蛋白；对进入的营养介质进行
采样并且将其用作参考同时将离开装置的营养介质处理为测试顶目，判定这点。只有当进入和出去介质之间的浓度比是1∶100时，才允许营养介质流过；一股来讲，截止范围将是1∶100到2∶100，从而保存最大数量的靶蛋白并且提供最高的装置效率。
[0048] 在整个营养介质和生物培养物从多个生物反应器移出并且穿过下游生物处理装置之后，在底部出口密封生物反应器。通过装置底部的入口添加洗涤缓冲液洗涤下游生物处理装置中的靶蛋白-介质复合物并且允许从顶端流出直到移出预定层残渣为止。然后接着引入洗脱缓冲液以破坏介质与靶蛋白之间的结合，通过使洗脱缓冲液穿过底端并且收集通过上端的纯靶蛋白溶液或通过使色谱介质在下游生物处理装置中沉降下来并且使洗脱缓冲液穿过
压实的色谱介质床并且收集通过底端的纯靶蛋白溶液。
[0049] 以上发明以这样的方式操作，其中仅使用重力流，通过将下游生物处理装置的入口端口放置在生物反应器出口端口层的下方，将营养介质从生物反应器转移到下游生物处理装置。将生物反应器放置在下游生物处理装置周围并且使用相同长度的连接管可以均匀地维持遍及多个生物反应器的流速。显然，存在许多用于输送营养介质到下游生物处理装置的机械构件，并且这些机械构件包括使用同样可以适用的各种
泵。然而，重力的使用确保转移工艺期间靶蛋白的降解降到最低。
附图说明
[0050] 图1显示所主张的下游处理装置的截面侧视图。
[0051] 所主张的装置具有其最佳操作所需的许多独特并且特殊的特征。其包含圆筒1，充当营养介质的主要处理空间的圆柱形硬壁容器；和从多个生物反应器进入圆筒1的生物培养物2。圆筒1的体积在一些情况下出于一种原因是重要的并且在另一种情况下出于另一种原因是重要的。当对其进行操作以执行为扩展床色谱系统，从而捕捉并且纯化靶蛋白时，圆筒1的高度对于随着营养介质向上流过柱色谱树脂3有足够的
停留时间来说很重要。圆筒1的体积最佳是圆筒1中的色谱树脂3的体积的至少1.5倍到3倍。一股来讲，圆筒1的直径和其高度的最佳关系还将从靶蛋白与色谱树脂的结合效率的简单研究来建立；这些研究是特异性结合反应并且尽管树脂的结合能力可以是已知的，但是结合率将取决于许多因素，包括允许
接触的时间、营养介质的
温度和营养介质的搅动情况。应该意识到所主张的装置提供一种用于使靶蛋白结合到色谱树脂的扩展色谱柱；允许结合的时间越长，结合程度将越高；然而，柱高度的物理限制和如下文关于靶蛋白的纯化所论述的其它考虑因素将限制所用圆筒1的高度。
[0052] 通过提供多孔结构小于色谱树脂3个的直径的底部过滤器4将色谱树脂3滞留在圆筒1中；所述多孔结构一股来讲应该是50微米到300微米；请注意在典型色谱制备型柱中，使用通常需要施加压力或需要非常长的时间使缓冲液穿过色谱树脂床的非常细的过滤器。通过底盖5将底部过滤器4保持在适当的
位置，所述底盖可以移开以便完全cGMP清洁装置以及移出色谱介质3，所述色谱介质再使用。底盖5具有底部液体端口6，其一股来讲将在顶盖的中心中；底部液体端口6具有底部采样端口7，其又具有用于开始和停止营养介质的流动的底部采样端口控制
阀8和用于在采样之前去除生物培养物的过滤器9。底部液体端口6具有底部流量
控制阀10，并且连接到充实室11，所述充实室具有多个端口12和连接到充实室端口11中的每一个的控制阀13；充实室11能够连接到其它生物反应器和洗涤或洗脱缓冲液的来源并且还用于使洗涤缓冲液或洗脱缓冲液离开装置。
[0053] 圆筒1的顶侧还设置有用于保持色谱树脂3的顶部过滤器14；通过顶盖15将顶部过滤器14保持在适当的位置，所述顶盖具有至少一个上部液体端口16，其连接到上部采样端口17和用于开始并停止营养介质的采样的上部采样端口阀18和用于在采样之前去除生物培养物的过滤器19。上部液体端口16连接到上部
流量控制阀20，其然后排出营养介质并且还用于在填充柱模式纯化方案中引入洗脱缓冲液。
[0054] 在圆筒1的内部安装螺旋体21，其通过螺旋轴22连接到放置在圆筒1外部的
电动机23；轴22穿过安装在顶部过滤器14的中心中的密封
滚珠轴承24并且穿过顶盖15的中心中的孔；螺旋轴22的底部安置在嵌入在底部过滤器4中的螺旋轴插口25中；当螺旋体旋转时，这有助于防止螺旋体摆动。
[0055] 螺旋体18是所主张的发明的关键要素；其形状是圆锥形，其中较大的
叶片在底部并且较小的叶片在顶部。因为使用螺旋体的目的是提供液体向上的
层流运动，所以在底部与在顶部的叶片的直径比是关键。最佳地，底部叶片将
覆盖圆筒1的直径的约80％并且顶部叶片将是圆筒1的直径的约20％。当以介于1rpm到20rpm范围内的缓慢速度旋转时，其以保持营养介质层流的扫描移动引起营养介质从底部到顶部的温和运动。这通过保持营养介质均匀地悬浮在整个圆筒中产生新颖的色谱树脂
流化床。没有这种特征，树脂与靶蛋白之间的接触效率降到最低并且捕捉靶蛋白的效率降低。随着色谱树脂与靶蛋白变得饱和，这变得更加重要。这种创新元素提供一种完全饱和色谱树脂同时维持营养介质的快速流动的方法。
[0056] 维持圆筒中的
雷诺数(Reynolds number；Re)小于10,000很重要；这个数值由搅拌容器中的
密度、
粘度、搅动器的直径、搅动器的转速(rpm)这五种因素通过以下方程式确定：
[0057] Re＝[(ρND2)/μ]，其中ρ是密度并且μ是粘度；ND是速度，D是直径并且N是转速(RPM)[R.K.辛诺特(R.K.Sinnott)库尔森和理查森的化学工程(Coulson & Richardson′s Chemical Engineering)，第6卷：化学工程设计(Chemical Engineering Design)，第4版(巴特沃斯-海涅曼(Butterworth-Heinemann))第473页]。
[0058] 圆筒1具有用于保持营养介质在最佳温度的附加的加热或冷却构件26；值得注意的是，所主张的装置提供营养介质的连续流动但流速是较慢的速度并且因此有可能维持一定温度，给出与圆筒1的壁的热交换的标准系数。描述各种方法并且所述方法包括使用夹套圆筒1、用加热或冷却毯包裹圆筒1、当目的是加热内含物时使圆筒暴露于红外灯以及在本领域中普遍地可用的许多其它装置。
[0059] 所主张的装置竖直地放在支座27上，所述支座一股是环架但将研究适合于将所主张的装置牢牢地放置在竖直位置的任何其它构件。值得注意的是，所主张的发明采用将营养介质从生物反应器转移到所主张的装置的重力流方法；出于这个原因，
支撑构件26应该具有这样的机械性质，其将允许所主张的发明安置在低于生物反应器的最低部分的那一层，营养介质从生物反应器的最低部分移出并且转移到所主张的发明。
[0060] 以上在图中所描述的靶蛋白收集和纯化装置一股在生物反应器周期结束时使用，其中多个生物反应器同时连接到所主张的装置。每一个装置中所含色谱介质的量将通过靶蛋白的结合效率容易地计算。举例来说，蛋白A色谱介质显示30mg/mL到50mg/mL色谱介质的结合。假定在2,000L生物反应器中使用1,000L营养介质并且生产周期已经结束，CHO不再产生足够数量的靶蛋白的时刻。进一步假定重组细胞系的生产力是约1G/L；因此，在此情况下，将在营养介质溶液中移出并且纯化约1000G靶蛋白。
[0061] 在理论的
基础上，假定结合下端是30mg/mL，将需要约33L色谱介质来结合溶液中实质上所有的靶蛋白。应该注意到，虽然蛋白A对单克隆抗体具有相当大的特异性，但是有可能色谱介质的结合能力将由于营养介质中其它组分的结合而受损。这可以容易地通过以下加以研究：
抽取小体积的营养介质并且向其中添加递增量的所用色谱介质直到溶液中靶蛋白的浓度达到预定低值为止。这将称作滴定营养介质。
[0062] 本发明合并多个生物反应器的处理，举例来说，如上所述，每一个需要33L体积的蛋白A来纯化靶蛋白。假定合并五个生物反应器的内含物，这将需要165L色谱树脂并且考虑到应该是主要固持容器体积的至少两倍，将需要230L来处理5000L营养介质；合并5000L介质的传统系统将在5000L容器中合并单独的体积，这是一种昂贵的练习。实际上，在本发明中所需要的全部就是小于10％所述大小的容器。
[0063] 在以上实例中使用本发明，将允许营养介质从若干个生物反应器进入所主张的装置的主容器中，在所述容器中，随着营养介质从底部上升通过过滤盘，靶蛋白将结合到色谱树脂，所述过滤盘截留色谱介质以免离开容器；在顶部的另一个过滤器将介质截留在顶端。成功捕捉步骤的关键是允许流动营养介质处于允许最佳结合的速率。温和混合是本发明到关键并且这通过推动营养介质向上的螺旋叶片的新颖设计来提供。
[0064] 最佳处理将从营养介质移出实质上所有靶蛋白；为了确保这一点，本发明引入自动化系统，其控制安装在装置两端的流量控制阀；双重采样方法，其中对进入的营养介质和出去的营养介质连续采样并且使用进入的营养介质作为标准，容易计算流出所述装置并且弃去的营养介质中靶蛋白的数量。如果所排出的液体中靶蛋白的浓度上升，那么关闭阀门并且将营养介质截留在主容器中直到达到完全结合为止。假设大量营养介质流出，那么本发明中所述的自动化系统允许自动化操作，这是大规模商业制造的关键要求。
[0065] 本发明引入自动处理批量的系统，其中在营养介质的入口点和出口点这两个点连续地测量靶蛋白的浓度；使样品首先通过截留任何生物培养物的过滤器过滤以降低悬浮粒子的干扰。使用入口点的营养介质作为参考样品并且出口点的营养介质充当分光光度检测装置中的样品。检测技术在现有技术中普遍可获得并且不是所主张的。(M.H.西莫尼安(M.H.Simonian)，分光光度测定蛋白质浓度(Spectrophotometric determination of protein concentration)，细胞生物学实验室指南(Curr.Protocol.Cell Biol)，附录3b，2002)。使用在280nm A(280)和205nm A(205)测量的吸光度，通过与参考比较来计算蛋白质浓度；但在本发明中，目的不是测量浓度而是参考与标准之间的相对浓度。考虑到介质中将存在溶解的杂质和溶菌液和不纯蛋白质，可以使用A(280)和A(205)方法。可以使用
光谱荧光计或滤光荧光计来测量样品溶液的固有荧光发射；将这个值与参考溶液的发射进行比较以确定相对浓度。存在两种比色方法：布拉德福比色法(Bradford colorimetric method)，基于染料考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)与相关蛋白的结合；和劳里法(Lowry method)，其测量蛋白质样品中酪氨酰基残基的比色反应。然而，本发明不限制所用检测方法的类型；在不断发展的蛋白质检测科学的情况下，有可能设计包括分光光度法、荧光测定法、红外或激光的一连串试验，从而提供营养介质中靶蛋白浓度的相对测量结果。
[0066] 在整个营养介质已经穿过容器之后，使用洗涤缓冲液来替换营养介质以在连续的基础上洗掉色谱树脂，在此之后，以类似方式引入洗脱缓冲液以在穿过顶部液体端口的流出物中收集经纯化靶蛋白溶液。然而，若干种其它纯化方法可用于在同一装置设计内使用。其中一种需要使洗脱缓冲液停留在容器中持续一段时间以允许色谱介质与靶蛋白之间的结合完全分解并且然后去除穿过底部液体端口的洗脱缓冲液。或者，可以从底部液体端口排出洗涤缓冲液并且当洗脱缓冲液可以通过顶部液体端口引入时，使色谱树脂沉降下来作为填充柱，并且允许洗脱缓冲液以单一缓冲液形式或以梯度洗脱缓冲液形式穿过色谱树脂床，以收集洗脱缓冲液的各个部分并且合并含有最高浓度和最少杂质的部分，从而得到最终处理产物。
[0067] 在第一
实施例中，本发明提供一种符合U.S.FDA CFR 21定义合并若干个次批量以产生大的单一批量的方法，通过允许使用更小的生物反应器降低生产成本，降低较大批量变坏的
风险并且消除具有若干种大小的生物反应器以及用于混合若干个生物反应器的内含物的较大容器的资金成本。这种新颖方法使甚至小型公司都可能以最低的资金和运作成本开发并制造大商业规模批量。
[0068] 本发明排除了在产生较大数量的靶蛋白时安装较大生物反应器的需求。通过允许多个生物反应器的内含物在进入所主张的装置之前在充实室中混合来满足混合较小次批量以制造较大批量的调节遵从性；其次，随着多个生物反应器的整个内含物穿过含有固定数量的色谱树脂的所主张的装置，所捕捉的靶蛋白以更小的体积量构成单一批量并且由此减少了与处置大容器相关的问题。
[0069] 在第二实施例中，本发明提供一种在收集靶蛋白的过程中避免若干个步骤的方法，包括分离细胞、减小营养介质的体积并且加载色谱柱，所有这些实质上都增加了设备的资金成本、设备的运作成本、用于完成这些步骤和引起靶蛋白降解所需的冗长时间。在本发明中，含有宿主细胞和靶蛋白的营养介质用装置中所含的将结合所有或实质上所有带电或不带电分子物质的色谱介质或色谱介质的组合经历非特异性或特异性处理，这个步骤之后是通过用洗涤缓冲液简单地洗涤色谱介质-靶蛋白复合物，从所述复合物去除细胞和其它组分的残渣。
[0070] 本发明由此排除了在收集产物过程中的主要障碍，所述障碍涉及使用细滤器滤出不大于5μ的宿主细胞，从而截留例如中国仓鼠卵巢细胞等宿主细胞。当使用大体积介质时，这个工艺耗费非常长的时间，增加了过滤器、泵、容器和空间管理的巨大成本。这个步骤然后一股接着浓缩步骤，在浓缩步骤中，使用错流或微滤工艺，将营养介质的体积最多减少到其体积的十分之一，这耗费非常长的时间来完成并且再次增加了设备和人力的巨大成本并且在一些情况下引起靶蛋白降解。
[0071] 本发明将这两个步骤合并成一个简单步骤。争论是如果打算从含有宿主细胞的复合物混合物收集并浓缩靶蛋白，那么为何从混合物移出靶蛋白而不是去除以大得多的数量存在的其它组分不是更有效。将此视为逆向教示。
[0072] 在本发明中，采用靶蛋白的那些特有的特征以通过与色谱介质或色谱介质的混合物的非特异性结合而将它们与混合物的其余部分分离。显然，这样非特异性捕捉靶蛋白还将捕捉混合物的其它组分并且仅仅需要使用更大数量的色谱介质或可以具有对靶蛋白的特异性亲和力的特定类型的色谱介质。靶蛋白-色谱介质复合物的移出是比宿主细胞的移出或混合物体积的减少简单得多的工艺；将研究任何机械工艺，例如倾析、离心或甚至过滤。值得注意的是，所有工艺当中最慢的将是过滤但可以使用甚至非常大孔径的过滤器并且因为目的是收集滤液，不是洗脱液，所以大大降低了制造成本。
[0073] 在第三实施例中，本发明允许使用扩展床色谱系统在捕捉靶蛋白的相同容器中纯化靶蛋白。扩展床色谱系统允许所主张的装置的连续操作，提供自动化控制，从而以无人值守式操作获得捕捉和纯化的最高水平。
[0074] 本发明还可以使用混合床色谱介质，其可以含有离子色谱介质、疏水性色谱介质和亲和色谱介质，所有这些一起使用来优化收集效率。良好确立了离子色谱介质的使用由于电离的对数性质因而不允许完全捕捉产物；本发明中所用的色谱介质的组合允许靶蛋白的更完全回收。
[0075] 在第四实施例中，本发明允许使用标准柱纯化和梯度洗脱曲线以及逐步洗脱曲线纯化靶蛋白；在这个比较中，所主张的发明类似于常规色谱柱起作用，具有其所有的限制但是没有加载柱的冗长步骤。
[0076] 在第五实施例中，本发明教示用于将生物反应器的内含物转移到所主张的装置的重力流方法；这种方法使得对靶蛋白的
应力相比于按惯例使用
蠕动泵时大大减少，并且因此提高了生产产率。
[0077] 在第六实施例中，本发明教示在优选地包含圆锥螺旋体的装置中使用新颖混合组分，所述螺旋体推动液体内含物向上同时维持液体的层流，降低对靶蛋白的应力并且还有助于维持色谱介质的完整性；没有现有揭示内容使用混合系统用于色谱系统。
[0078] 上述实施例不以任何方式包含可能使用本发明的所有实施例并且本领域的普通技术人员将发现许多其它的特定针对于复杂工艺的应用或甚至应用于这类需要可能不是立即显现的那些工艺中。
[0079] 不存在关于使用色谱介质来收集靶蛋白的现有技术；阿罗拉(Arora)等人的在2007年12月11日颁布的美国专利7306934教示多孔固体离子交换晶片的用途，其用于固定生物分子，所述晶片包含含有+2价过渡金属阳离子的生物分子捕捉色谱介质的组合；其还教示一种分离性生物反应器，其包含
阳极和
阴极、多个反应室，所述反应室中的至少一些由多孔固体离子交换晶片(上述)形成，所述晶片具有生物分子捕捉色谱介质与离子交换色谱介质的组合并且具有固定在所述生物分子捕捉色谱介质上的基因工程化标记的生物分子，所述多孔固体离子交换晶片中的每一者内插在阳离子交换膜与阴离子交换膜之间，以及在阳极与阴极之间提供电势的机构。本发明显著不同于由阿罗拉教示的分离性生物反应器。首先，本发明并不需要使用
电极、具有+2价过渡阳离子的色谱介质或固定化
金属离子亲和色谱法。EDI(电去离子)的使用和标签的特殊使用以及用以去除捕捉的产物(主要酶)的
溶剂的限制性性质使得此专利的教示内容明显不同于本发明。此外，阿罗拉专利添加了硬件，这增加了处理产物纯化的成本，而本发明将若干个工艺组合成一个而无需添加任何新的成本要素。
[0080] 使用扩展床色谱来纯化靶蛋白的想法在现有技术中是已知的，例如美国专利7,608,583，其教示使用扩展床色谱来纯化胰岛素。本发明的新颖方面是将扩展床色谱原理与一种工艺组合，所述工艺合并多个生物反应器的内含物、捕捉并且纯化靶蛋白。然而，向传统色谱法提供多功能性需要若干种创新
修改，包括一种将柱中的色谱树脂截留在两个末端的方法、一种混合色谱柱中的内含物的构件和一组允许使用逐步和梯度洗脱的端口和控制件。
[0081] 本文所引用的所有参考文献，包括公开、专利
申请和专利特此以引用的方式并入，其引用程度就如同每一个参考文献单独地并且特定地指示为以引用的方式并入并且全文阐述于本文中一股。
[0082] 除非本文另外指示或明显与内容相矛盾，否则在描述本发明的内容中(尤其在所附
权利要求书的内容中)使用术语“一(a/an)”和“所述”和类似指示物应理解为涵盖单数与复数。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语(即，意指“包括(但不限于)”)。除非本文另外指示，否则本文中值范围的叙述仅打算充当个别提及属于所述范围内的每个独立值的速记方法，并且每个独立值并入本
说明书中，如同在本文中个别地叙述一股。除非本文另外指示或另外明显与内容相矛盾，否则本文所述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。除非另外主张，否则本文中所提供的任何和所有实例或例示性语言(例如，“例如”)的使用仅打算更好地阐明本发明并且不对本发明的范围施加限制。本说明书中的任何语言都不应该理解为指示实施本发明所必需的任何未主张要素。
[0083] 本发明的优选实施例描述于本文中，包括本
发明人已知的进行本发明的最佳模式。在阅读前文描述之后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。本发明人期望熟练的业内人士适当时采用此类变化，并且本发明人打算以不同于本文中特定描述的其它方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所引述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外明显与内容相矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合。
