技术领域
[0001] 本
发明涉及抗病育种技术领域，更具体的说是涉及一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法。
背景技术
[0002] 由咖啡锈菌(Hemileia vastatrix Berk.&Br.)引起的咖啡锈病是咖啡(Coffea arabica)生产上普遍发生的一种病害，严重威胁我国咖啡的产量和品质，每年造成咖啡的产量损失在15％～80％之间。该病在全世界咖啡生产区均有发生，主要危害咖啡
叶片、造成叶片脱落、植株衰弱、甚至死亡。由于咖啡锈病是气传病害，很难用
化学防治和
生物防治等手段根除，选育抗病品种是防治咖啡锈病最经济有效的方法。
[0003] 但是，目前对咖啡锈病的鉴定主要采用田间自然鉴定和接种鉴定的方法，通过田间自然发病或人工接种锈病夏孢子，发病后调查叶片病斑症状及产孢情况，据此进行分级，最后根据各种质病情级别评价其抗锈病的能
力，这种方法虽然简单、快速，但受田间
气候变化的影响较大，接种成功与否均难以控制，且调查时分级困难，鉴定结果的准确性也无法保证。获得抗锈病种质资源、挖掘抗病基因是抗锈育种的前提和
基础，而可靠的抗锈菌鉴定技术是实现这一目标的关键。为了提高抗锈病鉴定的准确性，在小麦、大豆上相继建立了离体叶片鉴定的方法，但在咖啡上，尚无锈病离体鉴定的方法与技术。
[0004] 因此，建立一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法，该方法采用经在离体咖啡嫩叶上接种纯化的锈菌单一生理小种，在可控的环境下观察锈菌夏孢子的生长情况，根据孢子的生长状况评价种质的抗锈病能力。该技术操作简单，易于应用，且离体接种鉴定摆脱了大田鉴定对季节的依赖性，使抗锈病鉴定能够根据研究者的需要随时开展，大大提高了工作效率。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 1、一种用于咖啡锈病抗性离体鉴定的锈菌夏孢子，其特征在于，所述锈菌夏孢子的制备方法如下：
[0008] 1)接种培养盒的制备：用浓度为70～75％的酒精浸泡海绵3～5分钟，后晾干，铺在塑料培养盒底部，用无菌
水将海绵浸湿；
[0009] 2)采集具有典型咖啡锈菌病斑的咖啡发病叶片，刮下锈菌夏孢子，并将所述锈菌夏孢子涂在感病品种Caturra或Matari的叶片背面，使所述锈菌夏孢子均匀分布，并喷上水雾至有水膜产生；然后将接种叶片背面朝上，置于所述接种培养盒内的海绵上，20～25℃暗培养40-50h，之后明暗交替培养35～40天；
[0010] 3)将所述接种叶片上出现的单个锈菌夏孢子堆，接种在新的Caturra或Matari叶片上，重复步骤2)和步骤3)2～3次，获得纯化的锈菌株系；
[0011] 4)取出产孢叶片，将所述锈菌夏孢子收集后放入胶囊，在
相对湿度为45-55％的干燥器内干燥，后5℃保存。
[0012] 进一步地，步骤2)中所述感病品种Caturra或Matari的叶片为刚刚展开，幼嫩柔软的叶片。刚刚展开，幼嫩柔软的叶片生长不够健壮而比较嫩弱，抵抗力差，容易感染上锈菌，利用幼嫩柔软的叶片作为感染基体，相较于成熟健壮的叶片，增加了接种成功率，并且缩短了感染时间，有利于加快纯化锈菌株系的筛选。
[0013] 进一步地，步骤2)中使所述锈菌夏孢子均匀分布在感病品种Caturra或Matari叶片背面的方法为利用毛笔轻刷。毛笔笔头柔软且分散，在叶片上刷动的时候不易损伤锈菌夏孢子，且能较快地使得锈菌夏孢子均匀分布在感病品种Caturra或Matari叶片背面。
[0014] 进一步地，步骤2)中在所述明暗交替培养期间，保持海绵湿润，在接种后3-4天吸干所述接种叶背面的水，并用
脱脂棉擦拭所述接种叶背面。
[0015] 咖啡锈菌潜育期要35天以上，在合适的培养条件下，35天～40天将产生大量咖啡锈菌夏孢子；咖啡锈菌夏孢子在遇水2小时开始萌发，48小时内大部分完成对寄主的侵染，之后交替培养是保证咖啡叶片保持鲜活，咖啡叶片在保鲜盒内水分充足的情况下能存活45-50天左右。接种后2天内咖啡锈菌夏孢子在有充足的水分条件下已完成萌发并成功侵染，接种后3-4天吸干水分对锈菌夏孢子侵染没有影响，而这时吸干水分，用脱脂棉擦拭能除去锈寄生属(Darluca)和轮枝孢属(Verticillium spp.)等
重寄生真菌，而这些重寄生真菌如果存在会对锈菌夏孢子造成危害。
[0016] 优选的，步骤4)中锈菌夏孢子收集方法为，利用解剖刀将锈菌夏孢子从产孢叶片上刮到
硫酸纸上，收集后再放入胶囊。
[0017] 所述锈菌夏孢子用于咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法，包括以下步骤：
[0018] 1)离体叶片的制备：采摘待鉴定种质的叶片，剪去叶柄使叶背面朝上，放入制备好的如
权利要求1所述的接种培养盒中；
[0019] 2)接种鉴定：将制备好的如权利要求1所述的锈菌夏孢子涂在离体叶片上，使所述锈菌夏孢子均匀分布，并喷上水雾至有水膜产生，在人工
培养箱中，20～25℃，暗培养40-50h，之后在明暗交替的环境下培养35～40天，后调查鉴定材料病斑类型、大小、病斑产孢情况。
[0020] 进一步地，步骤1)中所述待鉴定种质的叶片为刚展开幼嫩柔软的叶片。刚刚展开，幼嫩柔软的叶片生长不够健壮而比较嫩弱，抵抗力差，容易感染上锈菌，利用幼嫩柔软的叶片作为感染基体，相较于成熟健壮的叶片，增加了接种成功率，并且缩短了感染时间，有利于加快纯化锈菌株系的筛选。
[0021] 进一步地，步骤2)中使锈菌夏孢子均匀分布在离体叶片上的方法为用毛笔轻刷。毛笔笔头柔软且分散，在叶片上刷动的时候不易损伤锈菌夏孢子，且能较快地使得锈菌夏孢子均匀分布在感病品种Caturra或Matari叶片背面。
[0022] 进一步地，步骤2)中在所述明暗交替培养期间，保持海绵湿润，并在接种后3-4天吸干接种叶背面的水，并用脱脂棉擦拭所述接种叶背面。
[0023] 进一步地，将锈病抗性分为0-4级，所述抗性0级为叶片表面不产生任何病斑，抗性类型为免疫(I)；所述抗性1级为叶片表面有褪色斑或瘤痂出现，抗性类型为抗病(R)；所述抗性2级为叶片病斑的产孢面积占叶片病斑面积的50％以下，抗性类型为中抗(MR)；所述抗性3级为叶片病斑的产孢面积超过50％但少于95％，抗性类型为中感(MS)；所述抗性4级为病斑的产孢面积超过95％，抗性类型为感病(S)。
[0024] 本发明公开提供了一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法，至少有以下优点：
[0025] (1)采用离体接种鉴定评价咖啡种质的抗锈病水平，可以确保每份待鉴定种质材料的接种条件、接种压力和发病条件的高度一致，最大限度的降低因接种环境和发病环境不一致造成的实验误差，提高了鉴定结果的准确性。
[0026] (2)离体接种鉴定摆脱了大田鉴定对季节的依赖，使抗锈病鉴定能够根据研究者的需要随时开展，大大提高了工作效率。
[0027] (3)与
温室接种鉴定和大田接种鉴定相比，离体接种鉴定所需空间小，适合于大规模鉴定，管理成本和劳动强度大幅降低。
[0028] (4)离体接种鉴定操作简单，易于推广普及。
具体实施方式
[0029] 下面对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030] 实施例1：
[0031] 一种用于咖啡锈病抗性离体鉴定的锈菌夏孢子的制备方法，包括如下步骤：
[0032] 1)接种培养盒制备：用浓度为72％的酒精浸泡海绵4分钟，其中海绵厚1cm、长15cm、宽10cm，后晾干，铺在塑料培养盒底部，用无菌水将海绵浸湿；
[0033] 2)从
云南省盈江县咖啡主产区的大田内，采集具有典型咖啡锈菌病斑的咖啡发病叶片，用解剖刀轻轻刮下锈菌夏孢子，并将锈菌夏孢子涂在感病品种Matari刚刚展开，幼嫩柔软的叶片背面，用毛笔轻刷，使锈菌夏孢子均匀分布，并轻轻喷上水雾，至有水膜产生为止，然后将接种叶片背面朝上，置于培养盒内的海绵上，盖好
盖子，在人工培养箱22℃，暗培养48h，之后明暗交替培养37天，期间保持海绵湿润，并在接种后3天用吸水纸吸干接种叶背面的水，并用脱脂棉轻轻擦拭接种叶背面；
[0034] 锈菌是专性寄生菌，该方法能保持咖啡叶片存活45-50天左右，并且锈菌繁育在最适
温度时，产孢时间在35天以内；如果温度不是最适温度，产孢时间会变长；
[0035] 3)将接种叶片上出现的单个锈菌夏孢子堆，用解剖刀将锈菌夏孢子接种在新的Matari叶片上，重复步骤2)和步骤3)3次，获得纯化的锈菌株系；
[0036] 4)取出产孢叶片，用小刀轻轻将锈菌夏孢子刮在收集后放入胶囊，在相对湿度为50％的干燥器内干燥，后置于5℃
冰箱中储存备用。
[0037] 分别采摘Matari、Catimor7963、S.795和HDT种质刚展开幼嫩柔软的叶片，剪去叶柄叶背面朝上，放入制备好的接种培养盒中；将制备好的锈菌夏孢子用解剖刀涂在制备好的离体叶片上，用毛笔轻刷使锈菌夏孢子在离体叶片上均匀分布，并轻喷水雾至有水膜产生，盖好培养盒的盖子，放在人工培养箱中22℃暗培养48h，之后在明暗交替的环境下培养37天，期间保持海绵湿润，且在接种后3天吸干接种叶背面的水，并用脱脂棉擦拭接种叶背面。将Matari、Catimor7963、S.795和HDT种质病斑类型、大小、病斑产孢情况记录在表1中。
[0038] 同时对同一批种质材料抗性鉴定利用温室人工接种法进行鉴定，鉴定方法如下：
[0039] 选取Matari、Catimor7963、S.795和HDT种质咖啡品种盆栽苗，每个品种5株，用解剖刀将上述制备好的锈菌夏孢子涂在上述种质刚刚展开，幼嫩柔软的叶片背面，用毛笔轻刷，使锈菌夏孢子均匀分布，并轻轻喷上水雾，至有水膜产生为止，然后套上塑料袋，湿遮光处理48h，在温室中培育。在对照组感病品种Matari表现严重的锈病症状时调查各种质的锈病发生情况，并将Matari、Catimor7963、S.795和HDT种质病斑类型、大小、病斑产孢情况记录在表1中。
[0040] 表1：不同种质咖啡离体鉴定和室温人工鉴定结果
[0041]
[0042]
[0043] 由表1中的实验结果可知，离体鉴定与温室人工接种鉴定的比较，离体鉴定的结果与温室人工接种鉴定的结果可认为是一致的。
[0044] 实施例2：
[0045] 一种用于咖啡锈病抗性离体鉴定的锈菌夏孢子，所述锈菌夏孢子的制备方法如下：
[0046] 1)接种培养盒制备：用浓度为75％的酒精浸泡海绵5分钟，其中海绵厚1cm、长15cm、宽10cm，后晾干，铺在塑料培养盒底部，用无菌水将海绵浸湿；
[0047] 2)从云南省盈江县咖啡主产区的大田内，采集具有典型咖啡锈菌病斑的咖啡发病叶片，用解剖刀轻轻刮下夏孢子，并将锈菌夏孢子涂在感病品种Caturra刚刚展开，幼嫩柔软的叶片背面，用毛笔轻刷，使锈菌夏孢子均匀分布，并轻轻喷上水雾，至有水膜产生为止，然后将接种叶片背面朝上，置于培养盒内的海绵上，盖好盖子，在人工培养箱25℃，暗培养45h，之后明暗交替培养35天，期间保持海绵湿润，并在接种后4天用吸水纸吸干接种叶背面的水，并用脱脂棉轻轻擦拭接种叶背面；
[0048] 3)将接种叶片上出现的单个锈菌夏孢子堆，用解剖刀将锈菌夏孢子接种在新的Caturra叶片上，重复步骤2)和步骤3)2次，获得纯化的锈菌株系；
[0049] 4)取出产孢叶片，用小刀轻轻将锈菌夏孢子刮在收集后放入胶囊，在相对湿度为53％的干燥器内干燥，后置于5℃冰箱中储存备用。
[0050] 在云南省德宏热带农业科学研究所，农业部瑞丽咖啡种质资源圃中分别采摘Caturra、Matari、Catimor7963、Typica、PT和HDT种质刚展开幼嫩柔软的叶片，剪去叶柄叶背面朝上，放入制备好的接种培养盒中；将制备好的锈菌夏孢子用解剖刀涂在制备好的离体叶片上，用毛笔轻刷使锈菌夏孢子在离体叶片上均匀分布，并轻喷水雾至有水膜产生，盖好培养盒的盖子，放在人工培养箱中25℃暗培养45h，之后在明暗交替的环境下培养35天，期间保持海绵湿润，并在接种后4天吸干接种叶背面的水，并用脱脂棉擦拭接种叶背面。将Caturra、Matari、Catimor7963、Typica、PT和HDT种质病斑类型、大小、病斑产孢情况记录在表2中。
[0051] 同时对同一批种质材料抗性鉴定利用田间自然鉴定法进行鉴定，鉴定方法如下：
[0052] 在感病品种Matari表现严重的锈病症状时，在云南省德宏热带农业科学研究所咖啡种质资源圃调查Caturra、Matari、Catimor7963、Typica、PT和HDT各咖啡种质的锈病发生情况，并将Caturra、Matari、Catimor7963、Typica、PT和HDT种质病斑类型、大小、病斑产孢情况记录在表2中。
[0053] 表2：不同种质咖啡离体鉴定和自然鉴定结果
[0054]
[0055]
[0056] 由表2中的实验结果可知，离体鉴定与自然鉴定相较，离体鉴定的结果与自然鉴定的结果基本上是一致的。
[0057] 综上所述，本发明中的鉴定方法能够与温室接种鉴定和大田接种鉴定相比，离体接种鉴定所需空间小，时间短，适合于大规模鉴定，管理成本和劳动强度大幅降低；且离体接种鉴定操作简单，易于推广普及；此外离体接种鉴定摆脱了大田鉴定对季节的依赖，使抗锈病鉴定能够随时开展，大大提高了工作效率。
[0058] 本
说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0059] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种
修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
