一种防治松材线虫的生物毒素及制备方法
专利汇可以提供一种防治松材线虫的生物毒素及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种防治松材 线虫 的 生物 毒素及制备方法，属生物 农药 技术领域。本生物毒素的生产菌株Pseudohalonectria adversaria(ZD1)已于2003年5月26日保藏在中国 微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0931。ZD1通过液体和麦粒固体培养后，从代谢产物中提取有效的 水 溶和脂溶性物质制备成杀线虫生物毒素。本发明对松材线虫有良好的毒杀效果，具良好的应用开发前景。，下面是一种防治松材线虫的生物毒素及制备方法专利的具体信息内容。
1、一种防治松材线虫的生物毒素，由生产菌株及辅料按液体和麦粒固体培养后提 取制备，其特征在于该生物毒素的生产菌株为Pseudohalonectria adversaria ZD1，ZD1 菌株已于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC NO.0931。
2、一种防治松材线虫的生物毒素的制备方法，由液体发酵和固体发酵制备，其特 征在于：
2.1麦粒固体培养基配方为：0.2-1％碳酸钙、1-3％大豆粉、0.2-1％硫酸氨、0.5-3％ 过磷酸钙、小麦麦粒92-96％；
2.2麦粒固体发酵制备生物杀线虫毒素的方法是，将长满菌丝的麦粒挖出，冻干； 用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸提，浸提后浓缩，得总粗提物，将粗提物溶 于少量二甲亚砜，再用一定浓度的吐温-20溶液溶解，得杀松材线虫生物制剂乳浊液； 在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，吐温-20的终浓度不超过0.3％。
技术领域：
本发明涉及一种防治松材线虫的生物毒素及制备方法，属生物农药技术领域
背景技术：
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)病是松属树种的特大毁灭性灾害，属国际重 要检疫对象，列为森林病虫害之首，被称为“无烟的森林火灾”。自1982年在南京中 山陵林区首次发现松材线虫病害以来，现已在江苏、安徽、广东、浙江、山东、台湾 和香港等多省区扩散蔓延，给我国的松林资源及生态环境、自然景观造成严重破坏， 并对广大适生区的松林构成严重威胁。因目前世界上尚无有效防治药剂，该病又被称 为“松树癌症”。由于该病已逼近黄出风景区，为保护黄山奇景，国家与安徽省投资近 6000万元，以建立“黄山松材线虫预防体系工程”。该病在广东省发生后曾一度疏于检 疫控制，造成再次扩大蔓延。
目前国内外对松材线虫尚无有效的药剂及防治方法，一般情况下，发生了松材线 虫后都是采用保守控制方法，即将感病松树砍伐并烧毁，以切断传播。而对植物寄生 根结线虫和胞囊线虫有效的生物制剂，对松材线虫则根本没有活性。寻找对松材线虫 有效的防治方法和药剂，已经迫在眉睫。
发明内容：
本发明的目的就是选择对松材线虫具良好杀虫活性的真菌菌株，将菌株按常规液 体发酵和本发明麦粒固体发酵培养后，从代谢产物中提取杀松材线虫有效成份制备成 生物毒素，以期找到对松材线虫有效的防治药剂和方法。
本发明采用的真菌是Pseudohalonectria adversaria(ZD1)，保藏单位：中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2003 年5月26日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.0931。P.adversaria(ZD1)属于水生真菌， 系本发明人从大量水生真菌菌株中筛选出的一株对松材线虫具有良好杀线虫活性的菌 株。
本发明人通过研究发现Pseudohalonectria属的真菌对松材线虫都具有良好的杀虫 效果，从Pseudohalonectria属中筛选确定了一株性状最好的菌株Pseudohalonectria adversaria(ZD1)开展进一步研究。本发明将ZD1菌株通过液体发酵和麦粒固体发酵 后，提取具有杀松材线虫活性的代谢产物，制备成生物杀线虫毒素。
本发明真菌P.adversaria(ZD1)培养方法(以下为重量百分比)：
液体培养基配方为1-4％大豆；1-5％葡萄糖；1-2％淀粉；0.1-0.5％酵母浸膏；0.2-1％ 氯化钠；0.02-0.1％磷酸二氢钾；0.02-0.1％硫酸镁；0.1-0.6％碳酸钙，余下为水。
麦粒固体培养基配方为0.2-1％碳酸钙；1-3％大豆粉；0.2-1％硫酸氨；0.5-3％过磷 酸钙；小麦麦粒92％-96％。
本发明分为液体发酵提取水溶性杀线虫生物毒素和麦粒固体发酵提取脂溶性杀线 虫生物毒素两种方法。
液体发酵提取杀线虫生物毒素的制备方法：
1、将ZD1的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基， 18-26℃下培养6-12天，获得试管种；
2、将试管种接种到250ml三角瓶(每瓶装70ml)液体培养基中，培养基配方为 前述液体培养基配方，于20-30℃下摇床培养，转速为200-300rpm，培养时间5-8 天。
3、将含菌丝的发酵液放入离心机中，3600转离心20分钟，过滤后得水溶性杀松 材线虫生物毒素。
麦粒固体发酵提取杀松材线虫生物毒素的制备方法：
1、试管种培养方法与前述液体发酵生产方法1相同；
2、采用前述麦粒固体培养基配方。将小麦用清水浸泡24小时后，捞起放入沸水 中煮，以煮熟但皮不破为适。捞起滤水与辅料混合后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装 700ml，120℃灭菌30分钟后，接入试管种，于22-26℃培养15-20天，直到菌丝长满。
3、将已长满菌丝的麦粒挖出，冻干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸 提，浸提后浓缩，得总粗提物。将粗提物溶于少量二甲亚砜(DMSO)，再用一定浓度 的吐温-20(Tween-20)溶液溶解，得脂溶性杀松材线虫生物毒素乳浊液。在该乳浊液 中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
用液体发酵培养提取的主要是水溶性杀线虫生物毒素，而用麦粒固体发酵生产提 取的主要是脂溶性杀线虫生物毒素。
本发明产品对松材线虫的药效试验
药效试验1：
1、试验用药剂：按液体培养方法生产杀线虫生物毒素；以未接种的培养基3600 转离心20分钟后过滤作为对照。
2、松材线虫制备：在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml， 高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养4至7天。待菌丝铺满三角瓶 后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将 线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。
3、试验方法：取直径6cm培养皿，灭菌后加入2ml试验用药剂，然后加入20μl， 线虫悬浮液(300条)，置25℃培养，定时用解剖镜检查线虫的死活，在生理刺激下线 虫无反应则确定为线虫死亡，根据死亡率计算出生物杀线虫毒素的药效。
以未接菌的培养基的浸提液作对照，每处理重复三次。
4、试验结果
表1 液体发酵生物毒素对松材线虫杀虫效果 处理 12小时 24小时 48小时 死虫数 死亡率 (％) 药效 (％) 死虫数 死亡率 (％) 药效 (％) 死虫数 死亡率 (％) 药效 (％) 药剂1 245 81.6 81.3 257 85.6 85.6 262 87.3 87 药剂2 244 81.3 81 254 84.6 84.3 257 85.6 85.3 药剂3 209 69.6 69.3 258 86 85.6 268 89.3 89 平均 233 77.5 77.2 256 85.4 85 262 87.4 87.1 对照 1 1 1
结果表明：本发明产品水溶性生物杀线虫毒素对松材线虫有良好的杀虫效果，其12 小时平均死亡率达77.5％，最高达81.6％；48小时平均死亡率达87.4％，最高达89.3％， 48小时平均药效达87.1％。
药效试验2：
1、试验用药剂：麦粒固体培养基配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；0.5％硫酸氨； 0.5％过磷酸钙；小麦麦粒95％。按前述麦粒固体发酵提取杀松材线虫生物毒素的制备 方法制备试验用药剂。
对照药剂：按前述麦粒固体发酵生产方法，但麦粒固体培养基中不接入试管种。
2、松材线虫制备与药效试验1相同。
3、试验方法与药效试验1相同。
4、试验结果
表2 粒麦固体发酵生物毒素对松材线虫杀虫效果 处理 12小时 24小时 36小时 死虫数 死亡率 (％) 药效 (％) 死虫数 死亡率 (％) 药效 (％) 死虫数 死亡率 (％) 药效 (％) 药剂(平均) 16 5.3 5.3 27 9 9 294 98 98 对照 0 0 0
结果表明：本发明脂溶性生物毒素对松材线虫有良好的杀虫效果，与水溶性物质相 比，其药效产生较慢，在12小时和24小时药效不显著，36小时药效显著并超过水溶 性生物毒素，死亡率达98％，显示其良好的应用开发前景。
具体实施方式：
实施例一：
将Pseudohalonectria adversariaZD1的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养 基配方为PDA培养基，20℃下培养9天，获得试管种。
再将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装70ml)液体培养基中，培养基配方 为2％大豆；2％葡萄糖；0.5％淀粉；0.2％酵母浸膏；0.4％氯化钠；0.05％磷酸二氢钾； 0.05％硫酸镁；0.2％碳酸钙，余下为水；于22℃下摇床培养，转速为250rpm，培养时 间8天。
再将含菌丝的发酵液放入离心机离心，转速为3600转，时间为20分钟，过滤后 得水溶性杀松材线虫生物毒素。
实施例二：
试管种培养方法与实施例一相同。
将试管种接种到麦粒固体培养基上，培养基配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；0.5％ 硫酸氨；0.5％过磷酸钙；小麦麦粒95％。将小麦麦粒用清水浸泡24小时后，捞起放入 煮沸的水中煮，以煮熟但皮不破为适，捞起滤水后与辅料混合后装入1000ml的三角瓶 中，每瓶装700ml，120℃灭菌30分钟后，接种后置于22℃培养20天。
然后将固体培养的菌株挖出，冻干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸提， 浸提后浓缩，得总粗提物。将粗提物溶于少量二甲亚砜(DMSO)，再用一定浓度的吐 温-20(Tween-20)溶液溶解，得杀松材线虫生物制剂乳浊液。在该乳浊液中，二甲亚 砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
实施例三：
基本同实施例二，不同之处是培养基配方，其配方为0.5％碳酸钙；1％大豆粉；0.5％ 硫酸氨；2％过磷酸钙；小麦麦粒96％。
实施例四：
基本同实施例二，不同之处是培养基配方，其配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；1％ 硫酸氨；3％过磷酸钙；小麦麦粒92％。
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