已知肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor：在本发明中， 以下略作HGF)作为具有促进肝细胞增殖活性的蛋白质存在于各种动 物种之中，且据报道HGF具有不同的氨基酸序列。自大工原等人从急 性肝炎患者血浆中发现了人肝细胞生长因子(以下略作hHGF)(特开 平63-22526号公报)之后，喜多村等人阐明了hHGF蛋白质的氨基酸 序列以及其编码基因(cDNA)序列(特开平3-72883号公报)。另外 有文章报道了应用此cDNA的hHGF蛋白的生产方法和转化体(特开平 3-285693号公报)。在此背景下，有望实现hHGF蛋白的大规模生产 及作为医药产品的应用。
hHGF是一种糖蛋白，它是由非还原状态下分子量约为80-90KDa 或还原状态下分子量约为52-56KDa的α亚基和分子量约为30-36KDa 的β亚基构成的异二聚体。除具有肝细胞生长因子的活性之外，hHGF 还具有扩散因子(scatter factor；SF)活性、肾小管上皮细胞生长 因子活性、损伤组织修复因子活性、血管内皮细胞生长因子活性等多 种生物活性，且该蛋白有望作为肝脏疾病治疗药、肾脏疾病治疗药、 脑神经障碍治疗药、毛发生长促进剂、创伤治疗药、抗肿瘤治疗药等 进行开发。
关于HGF的药物制剂，WO90/10651公报、特开平6-247872号公 报以及特开平9-25241号公报均有报道。在上述WO90/10651公报中 报道了和HGF的比较缺失5个氨基酸残基的缺失型HGF(TCF)的水性 制剂，并指出白蛋白、人血清、明胶、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇等 能够稳定水溶液中的TCF。特开平6-247872号公报报道了通过将TCF 与碱性氨基酸等共存，制备出含有5-10mg/mL的高浓度TCF的注射 液。该刊物谈及了TCF在水溶液中的溶解性，并报道了含有高浓度TCF 的水溶液，其中使用了碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)作为注射剂的 “助溶剂”。
可是，HGF的水溶液制剂在中性pH时HGF的溶解性急剧降低，而 在低温或者室温保存数日时该制剂存在出现凝集、白色混浊、凝胶化 的问题。另外，该制剂的物理化学稳定性低，例如形成降解产物和聚 集体；并且作为药物制剂也不是很稳定，例如生物活性降低。因此从 生物活性的角度来说，该制剂不适合长期保存。再者，HGF的水溶液 制剂在振动搅拌后产生的发泡等可引起凝集、白色混浊、凝胶化，进 而长期保存、销售及搬运时会造成药物制剂的品质下降，药效减低。 因此HGF制剂以冻干制剂为佳。
特开平9-25241号公报报道了HGF(TCF)的冻干制剂，但是与本 发明不同，该公报中阐述了用柠檬酸盐作为缓冲液，以甘氨酸、丙氨 酸、山梨糖醇、甘露醇等作为稳定剂，制备长期稳定的高浓度HGF(TCF) 冻干制剂的方法。不过，该冻干制剂中由于将柠檬酸作为缓冲液，再 溶解后制剂的pH为酸性条件。其结果溶液的高渗透压高，并可导致 注射给药时产生疼痛、给药部位出现炎症反应和溶血现象等问题。
HGF作为具有极强生理活性的物质，作为医药使用时，需要为临 床提供极低浓度的药物制剂。据本发明者等人的研究，特开平9-25241 号公报记载的含有甘氨酸以及丙氨酸的HGF(TCF)冻干制剂中，由含有 高浓度HGF的水溶液制得的冻干制剂，保存时生成的聚集体少，而适 于临床应用的含有低浓度HGF(一般情况下，HGF的浓度不超过 5mg/mL，例如2mg/mL的程度。)的水溶液，在甘氨酸和丙氨酸存在 的情况下冻干所得的制剂在保存时出现了聚集体。因此，特开平9- 25241号公报上所记载的甘氨酸和丙氨酸作为高浓度HGF冻干时使用 的稳定剂很有效，但是作为低浓度HGF冻干时使用的稳定剂效果不 佳。因此需要开发出由低浓度HGF的水溶液制备不易生成聚集体，且 长期保存稳定性优良的冻干制剂的制备方法。

本发明的课题是提供可制备含低浓度HGF的水溶液的HGF冻干制 剂。更具体地说，本发明的课题是提供一种HGF冻干制剂，该HGF冻 干制剂具有优良的保存稳定性，再溶解时不出现凝集、白色混浊、凝 胶化等现象。另外，提供冻干时具有良好的结块形成性、且具有优良 的再溶解性的冻干制剂也是本发明的研究课题。除此以外，提供具有 注射剂适宜的pH和渗透压比的上述制剂也是本发明的研究课题。
本发明者等人为解决上述课题进行了悉心研究，结果表明将浓度 不超过5mg/mL的HGF，在稳定剂、氯化钠、以及缓冲剂存在的条件 下进行冻干，能够制备出结块形成性、溶解性、长期保存稳定性良好 的冻干制剂，并且在该冻干制剂制备过程中以及冻干制剂的保存过程 中不生成聚集体，以及该冻干制剂具有极高的稳定性。另外，发现由 此冻干制剂制备的水溶液不产生凝集、白色混浊、凝胶化等现象，以 及这种含低浓度HGF的水溶液在临床能够充分发挥药效。本发明是基 于以上发现而完成的。
即，本发明提供：
含有肝细胞生长因子、阻止肝细胞生长因子生成聚集体的稳定 剂、氯化钠、以及缓冲剂的冻干制剂，且该冻干制剂是从肝细胞生长 因子浓度不超过5mg/mL的水溶液制备得到的制剂；
含有肝细胞生长因子、阻止肝细胞生长因子生成聚集体的稳定 剂、氯化钠、以及缓冲剂的冻干制剂，且该冻干制剂可用于制备再溶 解后肝细胞生长因子的浓度不超过5mg/mL的水溶液；以及，
含有肝细胞生长因子、阻止肝细胞生长因子生成聚集体的稳定 剂、氯化钠、以及缓冲剂的冻干制剂，且该冻干制剂是从肝细胞生长 因子浓度不超过5mg/mL的水溶液中制备得到，以及该冻干制剂可用 于制备再溶解后肝细胞生长因子的浓度不超过5mg/mL的水溶液。
这些HGF冻干制剂在冻干时以及冻干后的长期保存过程中，不生 成HGF的聚集体，且具有优良的稳定性。另外，这些冻干制剂具有由 冻干制剂制备的水溶液不产生凝集、白色混浊、凝胶化等现象，甚至 在保存该水溶液时也难以生成聚集体的特征。
通常情况下，希望用于在小瓶中制备冻干制剂的水溶液与将得到 的冻干制剂在小瓶中溶解并制备的水溶液中含有同浓度的有效成 分。因此，优选将HGF浓度不超过5mg/mL的水溶液在小瓶中或在安 瓿瓶中冻干而制备本发明的制剂。并且，本发明的制剂在冻干前和/ 或再溶解后的水溶液的pH优选在注射剂适宜的5到6.5范围，再者， 本发明的制剂在冻干前和/或再溶解后的水溶液优选具有注射剂适宜 的渗透压，例如与生物体几乎等渗或注射剂允许的渗透压比(1～2)。
根据本发明的优选方案，本发明提供稳定剂是从精氨酸、赖氨 酸、组氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、硫酸化多糖类、 及它们的可药用盐构成的组中选出的上述HGF冻干制剂；稳定剂是从 精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、及它们的可药用盐构 成的组中选出的上述HGF冻干制剂；稳定剂是从精氨酸、赖氨酸、 组氨酸、及它们的可药用盐构成的组中选出的上述HGF冻干制剂；稳 定剂是从精氨酸、赖氨酸、及它们的可药用盐构成的组中选出的上述 HGF冻干制剂。这些稳定剂优选按冻干时和/或冻干后保存时可防止生 成HGF聚集体的充分有效的用量，在上述制剂中配合使用。
另外，根据本发明的其它优选方案，本发明提供磷酸盐作为缓冲 剂的上述HGF冻干制剂，进而还含有表面活性剂的上述HGF冻干制 剂；表面活性剂为非离子性表面活性剂的上述HGF冻干制剂；非离子 性表面活性剂为聚氧乙烯醚类表面活性剂的上述冻干制剂。
根据其它的观点，本发明提供将HGF浓度不超过5mg/mL的水溶 液进行冻干时所用的HGF稳定剂，它是从精氨酸、赖氨酸、组氨酸、 谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、硫酸化多糖类、及它们的可 药用盐构成的组中选出的稳定剂。优选从精氨酸、赖氨酸、组氨酸、 谷氨酸、天冬氨酸、及它们的可药用盐构成的组中选出的稳定剂，特 别优选从精氨酸、赖氨酸、及它们的可药用盐构成的组中选出的稳定 剂。这些稳定剂可防止HGF浓度不超过5mg/mL的水溶液在冻干时及 冻干后保存时HGF聚集体的生成。
其次，根据本发明，本发明还提供可由冻干含有上述稳定剂和HGF 浓度不超过5mg/mL的水溶液而得到的，用于制备再溶解后HGF浓度 不超过5mg/mL的水溶液的HGF冻干制剂。上述冻干制剂优选的制剂 可通过将含有稳定剂(优选从精氨酸、赖氨酸、及它们的可药用盐构 成的组中选出的稳定剂)、浓度不超过5mg/mL的HGF、氯化钠、以及 缓冲剂的水溶液在小瓶中进行冻干而得到。
实施发明的最佳方案
对于本发明的冻干制剂中所含HGF的种类没有特殊的限定。例 如，天然HGF可从已知为含有HGF的人或大鼠等哺乳动物来源的体液 和组织，或由能自发产生HGF的细胞中分离得到。但也可应用通过基 因重组手段将该生长因子的cDNA导入细胞而得到的重组HGF.作为生 成重组HGF的宿主，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、丝状菌、植物 细胞、昆虫细胞、动物细胞等。重组HGF的具体例子为，例如从上述 哺乳动物来源的胎盘，肝病患者的肝组织及血液，MRC-5细胞、IMR- 9细胞等纤维原细胞株获得，或按特开平3-285693号公报所记载的方 法，将含有编码hHGF的cDNA的表达载体导入CHO细胞等宿主的HGF 生成株等获得。
此外，作为HGF也可以应用具有信号序列的蛋白质等前体蛋白 质，在不损伤肝细胞增殖活性的范围内一部分氨基酸发生置换、缺 失、和/或插入的修饰蛋白，或缺失或置换了糖基的改变蛋白。作为 改变蛋白，例如记载于特开平2-288899号公报、WO90/10651号公报、 特开平3-130091号公报、特开平3-255096号及4-30000号公报、 Nature，342，440-443(1989)等。
作为本发明的冻干制剂优选应用的HGF，例如具有以下的物理化 学性质的蛋白因子。HGF优选人源的HGF，特别优选具有特开平3- 72883号公报和特开平4-89499号公报所记载氨基酸序列的HGF.
1)用SDS-PAGE(非还原条件下)测定的分子量约为76,000- 92,000，
2)具有肝细胞增殖活性，以及
3)对肝素具有很强的亲和性。
进一步优选的HGF，除具有上述物理化学性质外，还有以下性质：
4)80℃，10分钟加热处理，失去上述活性，以及
5)用胰蛋白酶进行消化处理或用胰凝乳蛋白酶进行消化处理，失 去上述活性。
在含有HGF、缓冲剂、和氯化钠三种成分的HGF冻干制剂(记载 于特开平6-247872号公报以及特开平9-25241号公报；HGF的浓度 为5～20mg/mL)中，如果为避免产生HGF的沉淀等问题而降低HGF 的含量，则在冻干步骤中存在不能得到良好的结块的问题。进而，将 上述三种成分构成的冻干制剂再溶解的水溶液发生凝集、白色混浊、 凝胶化，并因此存在不能具有很好的物理化学稳定性的问题。因此， 为了制备冻干后具有良好的结块形状、且可配制长期保存稳定性优良 的水溶液的冻干制剂，以改善结块形成性和在水溶液中的保存稳定性 为目的而加入添加剂是必须的。
本发明的冻干制剂由HGF浓度不超过5mg/mL的水溶液制备，和/ 或由冻干制剂制备的水溶液中HGF浓度不超过5mg/mL。该冻干制剂优 选制备成冻干前和/或再溶解后的水溶液具有与注射剂适宜的pH、与 生物体几乎等渗或具有注射剂所允许的渗透压比(1～2)。本发明的 冻干制剂具有保存稳定性优良的特征。此外还具有以下特征：通过冻 干步骤能够形成良好的冻干结块，将冻干制剂再溶解后的水溶液中没 有凝集、白色混浊、凝胶化等问题，因此具有很好的物理化学稳定性。 进而应用于临床时，能够充分发挥出预期的药理作用。
作为稳定剂，例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、 谷氨酸、天冬氨酸，肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、 硫酸角质素、硫酸葡聚糖等硫酸多糖类，及这些物质的可药用盐。作 为可药用盐，例如钠盐、钾盐等碱金属盐等。这些稳定剂可以两种以 上组合使用。作为优选的稳定剂，例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷 氨酸、天冬氨酸等。其中特别优选精氨酸、赖氨酸、组氨酸、或它们 的组合。稳定剂的添加量只要是能够保证HGF的保存稳定性的量，就 没有特别的限定，相对于HGF的重量，优选0.01～100倍的重量，最 优选0.1～30倍的重量。
缓冲剂只要具有调节冻干前及再溶解后的水溶液的pH，保持HGF 的溶解性的作用，就没有特别限制。例如，可应用磷酸缓冲液、柠檬 酸缓冲液、醋酸缓冲液等。缓冲剂优选使用磷酸缓冲液，特别优选使 用磷酸钠缓冲液。缓冲剂的添加量，例如相对于再溶解后的水量，为 1～100mM的程度。
氯化钠虽然能够提高冻干前及再溶解后的水溶液中HGF的溶解 度，但是添加到必要量以上时会导致渗透压升高。一般情况下，优选 按达到和生物体等渗的渗透压的量添加，特别优选注射剂的渗透压比 所允许的渗透压比1～2，例如优选相对于再溶解后的水量为140mM 的程度。
因为中性pH与HGF的等电点(pI＝7～8)重叠，HGF在中性pH 时存在溶解度急剧减低的问题。例如，含有140mM氯化钠的10mM磷 酸钠缓冲液(PBS；室温)的pH在7.0～7.5附近时，HGF的溶解度 稍低于1.0mg/mL，而在pH5.0附近HGF的溶解度在5mg/mL或以上， 并且HGF在pH低时溶解度变高。此外，当氯化钠的浓度为0.14M时， HGF的溶解度是1mg/mL的程度，0.3M或以上时，HGF以5mg/mL或以 上的浓度溶解。因此，为使HGF的溶解度上升，或可考虑将pH调至5 或以下的酸性条件，也可考虑将氯化钠浓度提高到0.3M或以上。优 选将本发明的制剂冻干前和/或再溶解后的水溶液的pH调节至弱酸性 范围、具体指pH4.0～6.5，优选调整pH为5.0～6.5。在这样的pH 范围里，能够抑制聚集体的生成。
在本发明的HGF冻干制剂中优选再添加表面活性剂。HGF易吸附 于玻璃和树脂等容器材质上，特别在低浓度时，HGF向容器的吸附会 导致给药药液中的药物含量的降低。通过加入表面活性剂，能够防止 再溶解后的HGF吸附于容器。作为表面活性剂，例如聚山梨醇酯80、 聚山梨醇酯20、HCO-40、HCO-60、普卢兰尼可(Pluronic)F-68、 聚乙二醇等非离子表面活性剂，也可以将它们两种以上组合应用。表 面活性剂最优选使用聚氧乙烯醚表面活性剂(聚山梨醇酯80等)。 表面活性剂的添加量，例如相对于再溶解后的水重量为0.001～2.0％ 的范围。
本发明的HGF冻干制剂可通过用通常方法冻干含有HGF的水溶液 来制备。例如将HGF、稳定剂、氯化钠、以及缓冲剂溶解于注射用蒸 馏水中，根据需要添加表面活性剂后，过滤除菌，分装在小瓶或者安 瓿瓶等容器进行冻干。本发明的HGF冻干制剂可以含有制剂化所必要 的其它的添加剂、例如抗氧化剂、防腐剂、赋形剂、镇痛剂等。作为 冻干的方法，例如由以下三个单元操作组成的方法 (Pharm.Tech.Japan，8(1)，75-87.1992)。
(1)常压下冷却冻结的冻结过程；
(2)减压下，升华干燥不被溶质限制的自由水的一次干燥过程；
(3)除去溶质固有的吸附水和结晶水的二次干燥过程；
但本发明的冻干制剂的制备方法并不仅限于上述方法。本发明的 冻干制剂在使用时，可加入注射用蒸馏水等溶剂进行溶解，但HGF的 浓度不要超过5mg/mL。
实施例
以下列举实施例详细说明本发明，但本发明并不限定于这些实施 例。
例1：低浓度HGF冻干制剂的制备(比较例)
用含有140mM氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸缓冲 液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，过滤除菌后，得 到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小瓶中填充2mL， 按表1所示的条件进行冻干，可得到低浓度HGF冻干制剂。表中的 “→”表示温度的变化。
表1
            冻结过程          一次干燥过程      二次干燥过程
温度(℃)    20→-40   -40     -40→-20  -20     -20→20   20
时间(Hr)        1       5        3       48         2     24
压力(mmHg  )  760      760     ＜1      ＜1       ＜1    ＜1
例2：低浓度HGF冻干制剂的制备(比较例)
用含有140mM氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸缓冲 液(pH6.5)加热溶解HGF，并使HGF终浓度为5mg/mL，过滤除菌后， 得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小瓶中填充 2mL，按表1所示的条件进行冻干，得到低浓度HGF冻干割剂。
例3：高浓度HGF冻干制剂的制备(比较例)
用含有140mM氯化钠、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸缓冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为10mg/mL，过滤 除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小 瓶中填充2mL，按表1所示的条件进行冻干，得到高浓度HGF冻干制 剂。
例4：低浓度HGF冻干制剂的制备(比较例)
用含有300mM氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的柠檬酸缓 冲液(pH5.0)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，过滤除菌后， 得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小瓶中填充 2mL，按表1所示的条件进行冻干，得到低浓度HGF冻干制剂。
例5：低浓度HGF冻干制剂的制备(比较例)
用含有300mM氯化钠、5％甘氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的柠檬酸缓冲液(pH5.0)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，过 滤除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每 小瓶中填充2mL，按表1所示的条件进行冻干，得到低浓度HGF冻干 制剂。
例6：低浓度HGF冻干制剂的制备(比较例)
用含有300mM氯化钠、5％丙氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的柠檬酸缓冲液(pH5.0)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，过 滤除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每 小瓶中填充2mL，按表1所示的条件进行冻干，得到低浓度HGF冻干 制剂。
例7：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
用含有140mM氯化钠、100mM精氨酸的10mM的磷酸缓冲液 (pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，过滤除菌后，得到 HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小瓶中填充2mL， 采用与例1冻干条件相同的条件进行冻干，得到低浓度HGF冻干制 剂。使用这一制剂时，将此制剂溶解于2mL注射用蒸馏水中制备得到 含有1mg/mL浓度的HGF，并具有注射剂所允许的pH以及渗透压比 (1.5；几乎等渗)的注射液。
例8：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
用含有140mM氯化钠、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸缓冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，过滤 除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小 瓶中填充2mL，采用与例1冻干条件相同的条件进行冻干，得到低浓 度HGF冻干制剂。
例9：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
用含有140mM氯化钠、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸缓冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为2mg/mL，过滤 除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小 瓶中填充2mL，采用与例1冻干条件相同的条件进行冻干，得到低浓 度HGF冻干制剂。
例10：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
用含有140mM氯化钠、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸缓冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为3mg/mL，过滤 除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小 瓶中填充2mL，采用与例1冻干条件相同的条件进行冻干，得到低浓 度HGF冻干制剂。
例11：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
用含有140mM氯化钠、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸缓冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为4mg/mL，过滤 除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小 瓶中填充2mL，采用与例1冻干条件相同的条件进行冻干，得到低浓 度HGF冻干制剂。
例12：低浓度冻干制剂的制备(比较例)
用含有140mM氯化钠、100mM精氨酸、0.01％聚山梨醇酯80的10mM 的磷酸缓冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为5mg/mL，过滤 除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶液的pH后，无菌条件下在每小 瓶中填充2mL，采用与例1冻干条件相同的条件进行冻干，得到低浓 度HGF冻干制剂。
例13：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用10mM的磷酸缓冲液(pH6.0)代替10mM的磷酸缓 冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，得到低浓度HGF 冻干制剂。
例14：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用10mM的磷酸缓冲液(pH5.5)代替10mM的磷酸缓 冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，得到低浓度HGF 冻干制剂。
例15：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用10mM的磷酸缓冲液(pH5.0)代替10mM的磷酸缓 冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，得到低浓度HGF 冻干制剂。
例16：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用10mM的磷酸缓冲液(pH7.2)代替10mM的磷酸缓 冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，得到低浓度HGF 冻干制剂。
例17：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用10mM的磷酸缓冲液(pH7.0)代替10mM的磷酸缓 冲液(pH6.5)溶解HGF，并使HGF终浓度为1mg/mL，得到低浓度HGF 冻干制剂。
例18：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用50mM的精氨酸代替100mM的精氨酸，得到低浓度 HGF冻干制剂。
例19：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用赖氨酸代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例20：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用组氨酸代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例21：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用谷氨酰胺代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例22：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用半胱氨酸代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例23：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用脯氨酸代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例24：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用谷氨酸钠代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例25：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用天冬氨酸钠代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例26：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用甘氨酸代替精氨酸，得到低浓度HGF冻干制剂。
例27：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
在例8中，用每小瓶5mL填充量代替每小瓶2mL填充量，得到低 浓度HGF冻干制剂。
例28：低浓度冻干制剂的制备(本发明)
用含有140mM氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸钠缓 冲液(pH6.5)中溶解硫酸葡聚糖钠使其终浓度至50mg/mL，并溶解 HGF使其终浓度至1mg/mL，过滤除菌后，得到HGF水溶液。调节此溶 液的pH后，无菌条件下在每小瓶中填充2mL，采用与例1冻干条件 相同的条件进行冻干，得到低浓度HGF冻干制剂。
试验例1：有关HGF溶解度的评价
(1)HGF溶解度的评价方法
在聚丙烯制试管中称量HGF，加入含有各种浓度的氯化钠以及稳 定剂、0.01％聚山梨醇酯80的10mM磷酸钠缓冲液后，立即把试管在 恒温保持24小时，使HGF溶解。溶解后立即进行离心分离 (15,000rpm、10分钟、恒温)，将HGF饱和溶液和未溶解的HGF完 全分离，并将上清作为试样。用低蛋白吸附性的滤膜Millipore GV (亲水性Durapore；0.22μm)过滤，用HPLC法(凝胶过滤法)定 量测定得到的饱和溶液中的HGF浓度，以计算HGF的饱和溶解度。
HPLC的分析条件
柱：TOSOH TSK G-3000SWXL(φ0.78×30cm)
流速：0.3mL/分钟
检测波长：OD 280nm
温度：30℃
流动相：0.3M NaCl，50mM磷酸钠，0.1％SDS，pH7.5
上样量：50μl
HGF的保留时间：24.0分钟
(2)pH对HGF溶解度的影响
用含有140mM氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的10mM的磷酸钠缓 冲液配制pH不同的溶液，在4℃以及20℃按(1)的方法检测HGF的 溶解度，其结果如表2所示。由结果可以看到，随着pH的降低，HGF 的溶解度缓慢增加，pH5.0或以下溶解度显著上升。并且在任何情况 下，随着温度上升，溶解度也相应增加。
表2
         20℃   4℃
pH7.5    0.8    0.4
pH7.0    1.8    1.0
pH6.0    2.3    1.3
pH5.0    5.9    4.2
(HGF的溶解度以mg/mL表示)
(3)氯化钠浓度对HGF溶解度的影响
配制含有不同浓度的氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的10mM磷酸 钠缓冲液(pH7.5)，在4℃以及20℃按(1)的方法检测HGF的溶解 度，其结果如表3所示。由结果可以看到，随着氯化钠浓度的上升， HGF的溶解度显著增加。并且在任何情况下，随着温度上升，溶解度 也相应增加。
表3
               20℃     4℃
未添           0.3      0.1
+140mM NaCl    0.8      0.4
+230mM NaCl    3.2      1.4
+300mM NaCl    8.5      4.0
+900mM NaCl    ＞190    -
(HGF的溶解度以mg/mL表示)
(4)各种稳定剂对HGF溶解度的影响
在此，研究了各种药品添加剂对HGF溶解度的影响。用含有不同 浓度的添加剂、140mM氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的磷酸钠缓冲 液(pH6.8～7.5)溶解HGF，并使HGF的终浓度为1mg/mL，得到HGF 水溶液。在96孔微量滴定板每孔分别加入200μL，4℃保存48小时 后，通过平板测定仪(plate reader)测定OD450nm，以求得HGF水 溶液的浊度。结果表明，随着HGF溶解度降低导致的HGF的凝集和沉 淀，溶液的浊度上升。
对于添加物，如20种L-氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸钠、谷氨酸钠、半胱 氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸)、7种糖类(甘露醇、果糖、海藻 糖、葡萄糖、山梨醇糖、蔗糖、乳糖)、三种高分子类(硫酸葡聚糖、 葡聚糖、PEG)、三种蛋白质(人血清白蛋白、酸性明胶、碱性明胶)、 三种表面活性剂(聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、HCO-40、HCO-60) 对HGF溶解度的影响进行研究的结果表明，下述物质对HGF溶解度的 保持具有稳定作用。
①氨基酸类：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸钠、天冬氨酸钠、谷 氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸(0.05M时具有效果)
②多糖类：硫酸葡聚糖(0.1％时具有效果)
对于有显著效果的氨基酸，配制含有不同浓度的氨基酸、140mM 氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，于4 ℃按(1)的方法检测HGF的溶解度，其结果如表4所示。
表4
                 饱和溶解度  渗透压比
无添加剂         1.0            1.0
+L-Arg   50mM    7.3            1.3
+L-Lys   50mM    4.5            1.3
+L-His   50mM    3.2            1.2  
+L-GluNa 50mM    2.2            1.3
+L-Arg   100mM   ＞10           1.6
+L-Lys   100mM   ＞10           1.6
+L-His   100mM   4.8            1.4
+L-GluNa 100mM   3.2            1.6
(HGF的溶解度以mg/mL表示)
试验例2
冻干前后的HGF水溶液的性状
为了测定冻干过程中HGF的物理稳定性的变化，将冻干前的HGF 水溶液以及冻干后直接用纯化水再溶解的HGF水溶液于4℃保存24 小时后，目测观察溶解后的溶液的性状(混浊)。同时也对冻干制剂 再溶解所需的时间以及渗透压比进行测定。其结果如表5所示。
对于实施例1及实施例22的冻干制剂，将冻干制剂再溶解后于 4℃保存24小时时，出现了白色混浊，而其它实施例的制剂的性状表 现稳定。
表5
制剂     冻干前的水溶液  再溶解后的水溶液    渗透压比
实施例1    白色混浊      即刻溶解、白色混浊    1.0
实施例4    澄清透明      即刻溶解、澄清透明    2.0
实施例5    澄清透明        难溶、澄清透明      4.0
实施例6    澄清透明        难溶、澄清透明      3.9
实施例8    澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.5
实施例19   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.6
实施例20   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.4
实施例21   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.3
实施例22   澄清透明        难溶、白色混浊      1.7
实施例23   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.3
实施例24   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.5
实施例25   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.5
实施例26   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.3
实施例28   澄清透明      即刻溶解、澄清透明    1.3
试验例3
冻干制剂溶解后的性状
将实施例中制备的冻干制剂冻干之后，立即于25℃、40℃、50℃ 保存1个月，然后测定再溶解所需的时间、再溶解后溶液的性状(混 浊)。用纯化水溶解冻干制剂，于室温进行性状评价。其结果如表6 所示。
于25℃保存时，对于实施例22的制剂，冻干制剂再溶解后立刻 产生白色混浊，而其它实施例的制剂的性状均表现稳定。于40℃以及 50℃保存时，实施例1、22、23、24和25的制剂溶解后立刻产生白 色混浊，而其它实施例的制剂的性状均表现稳定。
                                  表6
  制剂                             1个月的保存品
                   25℃                 40℃                50℃
实施例1    即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、白色混浊  即刻溶解、白色混浊
实施例4    即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、澄清透明  即刻溶解、澄清透明
实施例5       难溶、澄清透明       难溶、澄清透明      难溶、澄清透明
实施例6       难溶、澄清透明       难溶、澄清透明      难溶、澄清透明
实施例8    即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、澄清透明  即刻溶解、澄清透明
实施例19   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、澄清透明  即刻溶解、澄清透明
实施例20   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、澄清透明  即刻溶解、澄清透明
实施例21   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、澄清透明  即刻溶解、澄清透明
实施例22      难溶、白色浑浊        难溶、白色混浊      难溶、白色混浊
实施例23   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、白色混浊  即刻溶解、白色混浊
实施例24   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、白色混浊  即刻溶解、白色混浊
实施例25   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、白色混浊  即刻溶解、白色混浊
实施例26   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、澄清透明  即刻溶解、澄清透明
实施例28   即刻溶解、澄清透明    即刻溶解、澄清透明  即刻溶解、澄清透明
试验例4
冻干制剂中聚集体含量变化
对于实施例中制备的冻干制剂，测定冻干后(原始值)、以及25℃、 40℃、50℃保存1个月后的冻干制剂中聚集体含量与HGF含量的比。 在此使用了试验例1(1)的方法(凝胶过滤法)。其结果如表7以 及表8所示。
聚集体的保留时间：20.4分钟，21.8分钟
HGF的保留时间：24.0分钟
尽管观察到随着保存温度的上升，聚集体生成增加的倾向，但是 实施例8、19以及20的冻干制剂却极少生成聚集体，并且物理化学 性质稳定。由测定结果可知，添加精氨酸、赖氨酸以及组氨酸后，即 使高温保存，也仅生成很少的聚集体(聚集体生成率：40℃时约3％ 或以下，50℃时约5-9％或以下)，并且保存稳定性提高。此外，用 除了不含有精氨酸以外、由同样的成分和方法制备的实施例1的冻干 制剂作为比较例进行了同样的试验，结果表明随着温度的上升，聚集 体的生成大幅度增加。
再者，如表8中所示，通过将HGF浓度低浓度化(不超过5mg/mL)， 能够促进聚集体的生成并导致保存稳定性降低。如特开平9-25411 号公报记载，将甘氨酸和丙氨酸作为冻干制剂的稳定剂应用时，与高 浓度HGF冻干制剂(特开平9-25411号公报的实施例5和6： 20mg/mL)相比，可知低浓度HGF冻干制剂(实施例5、6和26：1mg/mL) 中聚集体生成被促进，以及保存稳定性降低。
另一方面，测定结果还表明，对于应用精氨酸、赖氨酸及组氨酸 作为冻干制剂的稳定剂的实施例8、19及20的冻干制剂，即使在低 浓度HGF冻干制剂(1mg/mL)中也显著抑制了聚集体的生成，并提高 了保存稳定性。
                    表7
制剂               1个月的保存品
           原始值   25℃    40℃    50℃
实施例1     0.48    5.50    24.27   40.63
实施例4     0.35    0.48    3.80    11.24
实施例5     0.31    0.69    4.40    9.58
实施例6     0.30    0.54    3.20    9.53
实施例8     0.30    0.11    0.18    0.60
实施例19    0.31    0.16    1.74    4.48
实施例20    0.31    0.18    0.28    0.88
实施例21    0.31    0.54    2.77    16.89
实施例22    -       -       -       -
实施例23    0.32    0.31    3.24    11.24
实施例24    0.32    2.19    4.90    6.39
实施例25    0.34    1.11    4.80    7.73
实施例26    0.36    0.33    6.21    22.66
实施例28    2.74    3.48    13.30   32.87
实施例1*  1.07    6.17
实施例5*  0.92    4.09
实施例6*  0.93    2.90
实施例9*  1.78    14.01
*引用于特开平9-25241号公报的表4和表6
           表8
    制剂      50℃保存1个月的冻干制剂的
                聚集体含量/HGF含量
[不含氨基酸的制剂]
实施例1(HGF 1mg/mL)      40.63
实施例4(HGF 1mg/mL)      11.24
实施例9*(HGF 10mg/mL)    14.01
实施例1*(HGF 20mg/mL)    6.1 7
[含有甘氨酸的制剂]
实施例5(HGF 1mg/mL)      9.58
实施例5*(HGF 20mg/mL)    4.09
[含有丙氨酸的制剂]
实施例6(HGF 1mg/mL)      9.53
实施例6*(HGF 20mg/mL)    2.90
*引用于特开平9-25241号公报的表4和表6
试验例5
冻干制剂中聚集体含量变化-pH对聚集体生成的影响
对于实施例8、13、14、16和17中制备的具有不同pH的冻干制 剂，立即测定冻干后(原始值)和50℃保存1个月、2个月、3个月 后的冻干制剂中含有的聚集体含量和HGF含量的比值。在此使用试验 例1(1)的方法(凝胶过滤法)。其结果如表9所示。
聚集体的保留时间：20.4分钟，21.8分钟
HGF的保留时间：24.0分钟
由测定结果可知，pH分别为7.0和7.2的实施例16和17的冻 干制剂在50℃保存时，随着时间的延续，聚集体的生成增多；而pH 在6.5或以下的实施例8、13和14的制剂中聚集体生成少，在弱酸 性pH区域可使稳定性提高。
                         表9
制剂                         50℃保存品
                 原始值  保存1个 月保存2个月  保存3个月
实施例14(pH5.5)  0.48    0.38    0.56         0.76
实施例13(pH6.0)  0.35    0.91    0.51         1.31
实施例8(pH6.5)   0.31    1.40    1.58         1.28
实施例17(pH7.0)  0.30    1.26    2.16         2.96
实施例16(pH7.2)  0.30    5.64    7.63         12.71
试验例6
冻干制剂的生物活性变化(比活性)
实施例1、8制得的冻干制剂在25℃、50℃保存2个月，或在 10℃、25℃保存1.5年。将其冻干制剂再溶解后的水溶液的生物活性 按下述生物活性测定的方法进行测定。其结果如表10所示。
生物活性的测定方法
培养人肝细胞株PL℃/PRF/5至对数生长期，确认细胞的生存率 后，制备成0.7×105细胞数/mL的细胞溶液。将HGF样品和标准品 添加到96孔试验板(assay plate)中，然后每孔添加100μL细胞溶 液，并按0.7×104细胞数/孔的量接种(n＝4)。在5％二氧化碳培养箱 中，37℃预培养20小时后，再加入[3H-胸苷]，继续培养6个小时。 培养结束后，用Pharmacia公司的Beta Plate System回收细胞，并 测定摄入细胞内的[3H]的量。用平行线检测法校验测定结果，并将HGF 样品的比活性除以标准品的比活性，以求得效价(％)。
实施例8中添加精氨酸的冻干制剂即使高温保存，生物活性也几 乎没有变化，具有稳定的生物活性。此外，用除不含精氨酸以外，由 同样成分和方法制备的实施例1的冻干制剂作为比较例进行相同的试 验，观察到随着保存温度的上升，生物活性大幅度降低。
                   表10
           2个月的保存品       1.5年的保存品
           25℃      50℃      10℃      25℃
实施例1    64.5％    10.2％    -         -
实施例8    87.1％    71.0％    72.6％    66.1％
产业上的实用性
本发明的冻干制剂可用于制备临床上有用的含有低浓度HGF的水 溶液，并且该制剂在冻干时及冻干后的保存时聚集体生成少，稳定性 优良。此外，该制剂还具有冻干时具有良好的结块形成性，再溶解性 优良的特征，进而可用于制备具有注射剂适宜的pH和渗透压比的制 剂。