技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，尤其是涉及一种
发酵培养过程中地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法。
背景技术
[0002] 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是从
土壤和
植物表面分离的一种革兰氏阳性的腐生性芽孢杆菌。作为一种GRAS(Generally recognized as safe)
微生物，其培养需求简单、耐热、酶系丰富、产酶量高等优良特性，显示了该菌种巨大的工业应用潜
力。
[0003] 地衣芽孢杆菌应用于工业化生产主要采取组成型表达机制在启动子的作用下持续合成自身的蛋白酶或
淀粉酶等，但组成型表达并不适合宿主外源基因的高效表达。而诱导型表达可以拓宽这一优良宿主的应用领域，适合不同蛋白产品的表达，另外，诱导型表达机制可使生长与表达可控，并可能使两者的效率最大化。在已经研究发现的芽孢杆菌内源诱导性表达调控机制中，木糖异构酶的启动子及其阻遏蛋白所组成的木糖诱导系统在表达效率，严谨性及经济性方面均更具优势。然而，传统诱导工艺对不同蛋白的诱导条件不具普遍性，只能通过蛋白产量进行条件摸索，况且当表达的蛋白不好检测时，这种摸索方法更加表现为周期长、效率低、进步缓慢。因此，通过对地衣芽孢杆菌木糖操纵子在不同条件下发酵过程中转录强度的动态考察，可以为地衣芽孢杆菌以木糖操纵子为元件表达不同蛋白提供科学的依据，从而制定发酵策略。
发明内容
[0004] 针对
现有技术存在的上述问题，本发明
申请人为了克服现有诱导条件优化存在的
缺陷，提供了一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，以满足实际生产的不同需求。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，采用RT-qPCR技术对不同条件下发酵过程中木糖启动子基因转录
水平进行实时检测，并据检测结果提出木糖诱导型地衣芽孢杆菌诱导产蛋白的方法。
[0007] 一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，所述方法包括以下步骤：
[0008] (1)将甘油管保藏的地衣芽孢杆菌接种至
种子培养基，培养至一定菌浓；
[0009] (2)按照3％的接种量将培养好的种子转接至发酵培养基；
[0010] (3)DNS法控制发酵过程
葡萄糖浓度在目标浓度范围内；
[0011] (4)发酵过程实时取样，提取总RNA，进行反转录、qPCR、分析转录水平以指导目的蛋白诱导工艺。
[0012] 步骤(1)中所述种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，
酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，接种量为200μL；所述培养条件为37℃，250r/min，；所述菌浓为OD600达到7±0.5；所述地衣芽孢杆菌为模式菌株Bacillus licheniformis 9945a。
[0013] 步骤(2)中所述发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨FP321 20，酵母粉FM408 10，玉米浆干粉5，K2HPO4·3H2O 9.12，KH2PO4 1.36，CaCl2 0.5，MgSO4·7H2O 0.5。
[0014] 步骤(3)中所述DNS法为控糖方法，具体过程为：发酵前，预先测定特定糖浓度的OD540值，以此为对照，以对照扣除测定的值即耗糖量，通过耗糖的值计算残糖，当培养基中存在木糖时，忽略木糖的消耗量，仍以此方法控制发酵过程中葡萄糖含量；所述目标浓度分别为：0、20、50、80、120、180、200g/L。DNS测定的糖浓度需最后经HPLC检测。
[0015] 步骤(4)中所述实时取样的样品应保藏于-70℃，待发酵结束立即提取RNA，反转录为cDNA后，以此为模板进行qPCR，进而获得发酵过程中木糖启动子的转录数据，分析转录水平以指导目的蛋白诱导工艺。
[0016] 所述cNDA浓度为200ng/μL，qPCR 10μL体系，cDNA加样量0.5μL，其余均按TaKaRa
说明书提供体系，通过Origin
软件对获得的数据进行处理、分析。
[0017] 将发酵过程制得的发酵液在12000r/min下冷冻离心10min，取100μL上清液，加入100μL浓度为10％的三氯乙酸，沉淀蛋白3h以上，12000r/min离心20min，取100μL上清液装液相小瓶，设置进样量10μL进样，采用示差检测器检测产物。
[0018] 本发明有益的技术效果在于：
[0019] 本发明所提供的诱导方法，可以从基因表达最
基础的层面指导木糖诱导型重组地衣芽孢杆菌产蛋白，提高目标基因的转录水平，满足实际生产的不同诱导需求。此外，该方法也可以应用于不同的宿主菌产不同蛋白的研究，具有良好的应用前景。
附图说明
[0020] 图1为
实施例1地衣芽孢杆菌发酵过程生长及糖耗曲线；
[0021] 图2为实施例1地衣芽孢杆菌木糖诱导启动子在不同时间点的转录水平；
[0022] 图3为实施例1地衣芽孢杆菌在不同葡萄糖浓度条件下发酵过程生长及糖耗曲线；
[0023] 图中：■—■：OD600；○—○：葡萄糖浓度；▲—▲：木糖浓度；A：50g/L；B：80g/L；C：120g/L；D：180g/L；E：200g/L；F：0g/L；生长曲线有菌体量下降的情况是补糖对发酵液稀释的结果。
[0024] 图4为实施例3地衣芽孢杆菌木糖诱导启动子在不同
温度下的转录水平图。
具体实施方式
[0025] 下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。下述实施例中：
[0026] (1)种子培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；
[0027] (2)发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨FP321 20，酵母粉FM408 10，玉米浆干粉5，K2HPO4·3H2O 9.12，KH2PO4 1.36，CaCl2 0.5，MgSO4·7H2O 0.5
[0028] (3)菌
密度OD600使用紫外分光光度计测定；
[0029] (5)DNS法：发酵前，预先测定特定糖浓度的OD540值，以此为对照，以对照扣除测定的值即耗糖量，通过耗糖的值计算残糖，当培养基中存在木糖时，忽略木糖的消耗量，仍以此方法控制发酵过程中葡萄糖含量；
[0030] (6)HPLC检测：将发酵液在12000r/min下冷冻离心10min，取100μL上清液，加入100μL浓度为10％的三氯乙酸，沉淀蛋白3h以上，12000r/min离心20min。取100μL上清液装液相小瓶，设置进样量10μL进样，采用示差检测器检测产物；
[0031] (7)RNA提取使用天根细菌/细胞总RNA提取
试剂盒；反转录、qPCR试剂均使用TaKaRa试剂盒。
[0032] 实施例1
[0033] 不同生长阶段诱导方法
[0034] 将甘油管保藏的地衣芽孢杆菌接种200μL至种子培养基，37℃，250r/min培养12h，此时OD600约7.0左右。
[0035] 活化好的种子转接3％至发酵培养基中，初始
碳源为30g/L葡萄糖和10g/L木糖，于37℃，250r/min进行培养。
[0036] 发酵过程中每隔2-4h取样测菌体量、残糖，DNS法控制葡萄糖浓度在20g/L左右，并留样至-70℃保藏。
[0037] 发酵结束后对在线采集的样品进行总RNA提取，将RNA反转录为cDNA，cNDA稀释至200ng/μL左右，以此为模板进行qPCR反应，qPCR体系为10μL，其中cDNA加样量0.5μL，其余均按TaKaRa说明书提供体系，qPCR反应使用BIO-RAD CFX96仪进行。
[0038] 同时，对在线采集的样品进行HPLC检测，以准确获知发酵过程中糖浓度的变化情况。
[0039] 根据所述方法获得地衣芽孢杆菌发酵过程生长及糖耗曲线图(图1)和木糖诱导启动子在不同时间段的转录水平图(图2)；由图1、2结果可见，以地衣芽孢杆菌为宿主的木糖诱导系统转录强度在菌体对数生长末期最强，由此得出，当实际生产需要维持较高菌体时，在对数生长末期小范围时间内诱导效果较好；当实际生产需要维持较高产量时，在对数生长末期较为宽泛的范围内持续诱导效果较好。
[0040] 实施例2
[0041] 不同葡萄糖浓度条件的诱导方法
[0042] 将甘油管保藏的地衣芽孢杆菌接种200μL至种子培养基，37℃，250r/min培养12h，此时OD600约7.0左右。
[0043] 活化好的种子转接3％至发酵培养基中，于37℃，250r/min进行培养。
[0044] 其中，(1)葡萄糖充足条件：初始碳源均为50g/L葡萄糖和10g/L木糖，选择每阶段合适时间点将葡萄糖浓度分别提升至目标浓度(0、20、50、80、120、180、200g/L)，1h后留样至-70℃保藏，其余时间段控制葡萄糖浓度充足即可；(2)葡萄糖缺乏条件：初始碳源为30g/L葡萄糖和10g/L木糖，于11、31、42、45h补加2％木糖，使初始葡萄糖自然耗尽即可。
[0045] 发酵结束后对在线采集的样品进行总RNA提取，将RNA反转录为cDNA，cNDA稀释至200ng/μL左右，以此为模板进行qPCR反应，qPCR体系为10μL，其中cDNA加样量0.5μL，其余均按TaKaRa说明书提供体系，qPCR反应使用BIO-RAD CFX96仪进行。
[0046] 同时，对在线采集的样品进行HPLC检测，以准确获知发酵过程中糖浓度的变化情况。
[0047] 根据所述方法，结合实例1获得地衣芽孢杆菌不同葡萄糖浓度条件下发酵过程生长及糖耗曲线图(图3)和木糖诱导启动子在不同葡萄糖浓度条件下的不同时间点的转录水平，如表1所示。
[0048] 表1
[0049]
[0050] 注：表中时间代表取样时间，a代表32h，b代表33h；c代表43h；d代表46h；c代表47h。
[0051] 由表1结果可见，当葡萄糖浓度在20-180g/L时，对木糖启动子的抑制效果一致，但当葡萄糖浓度达到200g/L时，菌体生长受到了抑制从而导致启动子转录水平下降；当葡萄糖含量极少或者没有，而木糖存在的情况下，启动子转录强度极高，是20g/L葡萄糖条件下培养7h的地衣芽孢杆菌木糖启动子转录水平的160多倍。
[0052] 由此得出，当实际生产需要维持较高的菌体量时，前期应在葡萄糖浓度充足的条件下持续生长；当实际生产需要维持较高的蛋白产量时，应控制在葡萄糖含量极少或缺乏的条件下进行诱导。
[0053] 实施例3
[0054] 不同温度条件的诱导方法
[0055] 将甘油管保藏的地衣芽孢杆菌接种200μL至种子培养基，37℃，250r/min培养12h，此时OD600约7.0左右。
[0056] 活化好的种子转接3％至发酵培养基中，做9个平行，均于37℃，250r/min进行培养。
[0057] 分别培养至目标时间(11、31、45h)，然后转至不同温度(分别为25、30、42℃)的摇床，剩余的摇瓶继续培养至目标时间，以此类推，变温后1h下摇瓶取样qPCR。发酵过程通过DNS法控制葡萄糖浓度在10-80g/L范围内。
[0058] 发酵结束后对在线采集的样品进行总RNA提取，将RNA反转录为cDNA，cNDA稀释至200ng/μL左右，以此为模板进行qPCR反应，qPCR体系为10μL，其中cDNA加样量0.5μL，其余均按TaKaRa说明书提供体系，qPCR反应使用qTOWER 2.0仪进行。同时，对在线采集的样品进行HPLC检测，以确保发酵过程中糖浓度的充足。
[0059] 根据所述方法，获得地衣芽孢杆菌木糖诱导启动子在不同温度条件下转录水平图(图4)和木糖诱导启动子在不同温度条件下1h取样前后的菌体量，如表2所示。
[0060] 表2
[0061]时间(h) OD600(25℃) OD600(30℃) OD600(42℃)
11 14.45 14.25 14.3
12 15.3 14.4 14.7
31 33.1 29.25 27
32 33.95 30.1 27.85
45 34.4 34.75 34.55
46 35.0 34.5 34.75
[0062] 表2结果可见变温后1h内菌体量变化不大，表明木糖诱导启动子转录变化是由温度变化引起的。图4结果可见，在25-42℃范围内，随着温度升高，启动子转录强度逐渐增加，表明在42℃条件下诱导效果较好。由此得出，当目的蛋白不耐高温时，可以适当降低诱导温度，以获取更高的蛋白产量；当目的蛋白耐高温时，可以在不影响菌体生长的基础上选择较高的诱导温度(42℃)，以获取更高的蛋白产量。
[0063] 结合以上实例，可以提出一种地衣芽孢杆菌生产不同蛋白的诱导方法，以满足实际生产对菌体生长和产品产量的不同需求。
[0064] 虽然，上文已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些
修改，比如将本发明应用于不同宿主菌，考察其本质的诱导方法；另如在本发明的基础上改变其他影响启动子特性的条件来考察诱导方法等等，由此对本发明作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
