长波长过氧化氢荧光探针
阅读：554发布：2023-02-06
专利汇可以提供长波长过氧化氢荧光探针专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及长 波长 过 氧 化氢 荧光 探针。本发明的探针可以与过氧化氢作用，且具有高灵敏性和选择性的特点，可在过氧化氢高灵敏性和高选择性的识别中应用，或者其可测定样品中过氧化氢的浓度。，下面是长波长过氧化氢荧光探针专利的具体信息内容。
1.化合物，其具有以下结构
其中：R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5和R6相同或不同。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-
10的烷基或烷氧基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-5的烷基或烷氧基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-3的烷基或烷氧基。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述直链或支链烷基为甲基、乙基、丙基、正戊基、2-甲基丁基、异丁基、或4-甲基庚基。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述直链或支链烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中：R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自氢原子、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基或丙氧基。
8.根据权利要求1所述的化合物，其为如下结构的化合物：
长波长过氧化氢荧光探针
技术领域
[0001] 本发明涉及检测过氧化氢的长波长荧光探针。本发明的探针可以与过氧化氢作用，且具有高灵敏性和选择性的特点，可在过氧化氢高灵敏性和高选择性的识别中应用，或者其可测定样品中过氧化氢的浓度。
背景技术
[0003] 这种物质有比较高的氧化性，会伤害细胞中的正常生物大分子如蛋白质和DNA等。过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内，可以将H2O2催化分解成H2O和O2，对人体无害。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。这是因为肝脏是人体中最大的化工厂，是动物体内最大的解毒器官，要进行大量的分解合成代谢，产生H2O2的速度很快，过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质。过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2。所以需要高浓度过氧化氢酶工作保护肝细胞。过氧化氢作为氧化应激的一个典型标志，其平衡对生理和病理有重要影响。细胞内过氧化氢的含量变化和许多疾病的发生具有直接的关系，比如，癌症、糖尿病、心血管疾病、神经萎缩性疾病等。
[0004] 因此，发展一种能够有效的定量测定生物体内的过氧化氢生物分子的含量的方法是必要的。在众多的测定技术中，荧光探针由于其独特的优点而受到广泛关注，包括高灵敏度、特异选择性以及实时原位成像分析等优点，因此设计并合成一个能够快速定量检测生物体内的过氧化氢分子的荧光探针对于学术研究和临床应用来说都是有价值的。
[0005] 目前，定量检测过氧化氢的方法有很多，主要包括：滴定、荧光分析法、化学发光法、比色定量分析法、发射光谱分析法、电化学方法、离子色谱法等。比起其他的方法，荧光探针有着其内在的优势，包括高灵敏度，特异性，实施简单，响应快速能实现实时检测，能应用于生物成像等。而在检测过氧化氢的荧光探针方面，荧光增强探针很多，但是比率探针非常少，比率探针与荧光增强探针相比因可以通过两个峰之间的比值来消除环境对探针检测的影响，所以有更大的应用价值。因此，发展一个有较大移动波长且能在生理条件下检测过氧化氢的荧光探针是非常有必要的。
发明内容
[0006] 本领域急需一种高灵敏性和高选择性测定过氧化氢的方法，从而能够有效检测特别是能够在样本中检测过氧化氢。为此，本发明提出了一种新颖的检测过氧化氢的方法，其所需探针可直接使用，不需要做进一步有机合成修饰，并能够高灵敏和高选择性识别过氧化氢。本发明涉及的探针可对过氧化氢的进行高灵敏性和高选择性测定。
[0007] 具体而言，本发明提供了一种识别过氧化氢的探针，其结构如下：
[0008]
[0009] 其中：R1，R2，R3，R4，R5和R6为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5和R6可以相同或不同。
[0010] 优选地，本发明中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-10的烷基或烷氧基。
[0011] 优选地，本发明中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-5的烷基或烷氧基。
[0012] 优选地，本发明中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-3的烷基或烷氧基。
[0013] 优选地，本发明中所述直链或支链烷基为甲基、乙基、丙基、正戊基、2-甲基丁基、异丁基、或4-甲基庚基。
[0014] 优选地，本发明中所述直链或支链烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基。
[0015] 优选地，本发明中R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自氢原子、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基或丙氧基。
[0016] 优选的，本发明的探针是：
[0018] 图1：纯探针(10μM)溶液与探针(10μM)溶液和过氧化氢(50μM)混合反应后的溶液两组溶液的吸收光谱。
[0020] 图3：探针对于不同浓度的H2O2有很好的响应值。测试体系均为纯水体系，含HEPES 10mM，pH＝7.4，CTAB 1mM，测试温度为25℃。探针浓度为10μM，过氧化氢的浓度依次为1、2、
4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200μM，加入后放置二十分钟测得。
4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200μM，加入后放置二十分钟测得。
[0021] 图4：探针在浓度为0-10μM时有很好的线性。测试体系均为纯水体系，含HEPES 10mM，pH＝7.4，CTAB 1mM，测试温度为25℃。探针浓度为10μM，过氧化氢的浓度依次为1、2、
4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200μM反应20分钟后放入荧光分光光度计进行检测所得。
4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200μM反应20分钟后放入荧光分光光度计进行检测所得。
[0022] 图5：在其它空白(NONE)、TBHP、KO2、NaClO、ONOO-、·OH、·TBHP、H2O2浓度为50μM或不存在时，探针(10μM)对过氧化氢的荧光响应值。测试体系均为纯水体系，含HEPES 10mM，pH＝7.4，CTAB 1mM，测试温度为25℃。
具体实施方式
[0023] 本发明提供了一种高灵敏和高选择性测定过氧化氢的荧光探针及其光谱性能。
[0024] 本发明的探针具有以下结构通式：
[0025] 其中：R1，R2，R3，R4，R5和R6为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5和R6可以相同或不同。优选地，本发明中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-10的烷基或烷氧基。
[0026] 优选地，本发明中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-5的烷基或烷氧基。
[0027] 优选地，本发明中所述直链或支链烷基、直链或支链烷氧基是C1-3的烷基或烷氧基。
[0028] 优选地，本发明中所述直链或支链烷基为甲基、乙基、丙基、正戊基、2-甲基丁基、异丁基、或4-甲基庚基。
[0029] 优选地，本发明中所述直链或支链烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基。
[0030] 优选地，本发明中R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自氢原子、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基或丙氧基。
[0031] 较优选地，本发明中R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自氢、甲基、乙基或丙基；最优选地，R1，R2，R3，R4，R5和R6均为H。
[0032] 下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。
[0033] 实施例1探针制备
[0035] 称取4-溴甲基苯硼酸频那醇酯380mg放入250mL烧瓶中，加入120mL乙腈，然后加入200mg的丁香醛，加热回流，6小时后停止反应。
[0036]
[0037] 将反应后的溶液滴加入液相色谱柱，用二氯甲烷：石油醚＝10：3的展开剂冲洗液相色谱柱得到较纯的产物。
[0038] 将通过色谱柱获得的产物放入圆底烧瓶中，加入尽可能少的二氯甲烷将其溶解，并在超声清洗机超十分钟，接着向溶液中慢慢滴加石油醚，边滴加边摇晃，待二氯甲烷溶液中有结晶态析出的时候停止滴加石油醚。然后取一漏斗和烧杯，将其固定住并与真空泵相连，将滤纸放入润湿，将物质滴加在滤纸上抽滤，抽干后用药匙将物质转移入圆底烧瓶中，加入二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪将溶液旋干，最后得到纯净物质。
[0039] 探针TCF-硼酯的合成及提纯：
[0040]
[0042] 反应停止后，观察溶液由反应前的浅黄色变成反应后的灰白色，用滴管将物质吸取，抽滤，用乙醇清洗并抽滤，得到较纯的探针TCF-硼酯。
[0043] 产品结构表征结果的分析：
[0044] 1H-NMR结果的分析：
[0045] 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(*10-6):1.30(s,12H),1.82(s,6H),3.87(s,6H),3.444(s,3H),5.06(s,2H),7.19(d,J＝16Hz,1H),7.27(s,2H),7.46(d,J＝8Hz,2H),7.67(d,J＝8Hz,2H),7.84(d,J＝16Hz,1H)。以上数据符合探针TCF-硼酯的结构式特征。
[0047] 13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(*10-6):19.03,25.16,25.72,56.49,56.77,74.30,84.12,99.76,107.69,115.11,127.66,130.48,134.76,140.48,141.24,148.30,153.77,
175.71,177.65。
175.71,177.65。
[0048] 实施例2：探针的吸收光谱和荧光发射光谱
[0049] 首先配制1mM的探针母液，并配制10mM的过氧化氢母液。在母液的基础上，配制50μM的探针溶液，再配制探针溶液含有过氧化氢(50μM)的混合溶液。比色管内的溶液体系均为纯水体系，含HEPES 10mM，pH＝7.4，CTAB 1mM。然后，将溶液分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测量吸收光谱和荧光发射光谱并做记录，测试温度为25℃。结果如图1和图2所示。
[0050] 紫外吸收光谱如图1所示，从谱图上看出纯探针在640nm处基本上没有吸收峰，但当过氧化氢加入以后，在640nm处产生了一个很强的吸收峰，吸收强度增强非常明显。
[0051] 荧光发射光谱如图2所示，从谱图上看到纯探针在660nm处基本没有峰，在加入过氧化氢以后，光谱图发生了很明显的变化，反应后的物质在660nm处的峰逐渐增高。
[0052] 实施例3：探针对过氧化氢的定量影响
[0053] 配制10μM的探针溶液，将其转移入比色管中，标定准确。取过氧化氢溶液加入比色管中，使过氧化氢的浓度最终为：1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200μM并将其摇晃均匀，测试体系均为纯水体系，含HEPES 10mM，pH＝7.4，CTAB
1mM，记录光谱图并保存。测试温度为25℃。放置反应十分钟后用荧光分光光度计测量其发射光谱，记录并保存。结果如图3和图4所示。
1mM，记录光谱图并保存。测试温度为25℃。放置反应十分钟后用荧光分光光度计测量其发射光谱，记录并保存。结果如图3和图4所示。
[0054] 探针浓度为10μM，伴随着过氧化氢浓度的逐渐增加，在660nm处的发射峰逐渐增高，如图3所示，探针对于不同浓度的过氧化氢有很好的响应值，如图4所示，在浓度为0到35μM时有很好的线性。这些结果都表示，我们的探针可以通过荧光的方法定量定性的检测过氧化氢并有一定的灵敏度。
[0055] 实施例4：关于探针选择性识别过氧化氢的研究
[0056] 配制10μM的探针溶液200mL，将探针溶液分别移入16个比色管中定容，将比色管按照顺序摆放在试管架上，分为前后两批，前面八个比色管，后面八个比色管，然后将空白，TBHP，KO2，NaClO，ONOO-，·OH，·TBHP，H2O2按照顺序分别加入试管中，前后两个为一组，使最后溶液的浓度为100μM。然后在后面的一排中加入过氧化氢，使过氧化氢的最终浓度为20μM。最前排的第一个为纯探针，后面的为只加入过氧化氢的溶液。放置十分钟，然后将所有的溶液按照从左到右的顺序放入荧光分光光度计中检测，记录数据并保存。然后再在紫外分光光度计中按照从左到右的顺序检测，记录数据并保存。测试体系均为纯水体系，含HEPES10mM，pH＝7.4，CTAB 1mM，记录光谱图并保存。测试温度为25℃。结果如图5所示。
[0057] 从图5可以看出，在其他干扰物加入到探针溶液中时，溶液的荧光值基本上没有变化，响应值不高，但是当加入过氧化氢，溶液就会有一个比较高的响应值。所以，探针对过氧化氢有比较好的选择性。因此，本发明的探针是一个对过氧化氢有高选择性的探针。
[0058] 虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
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