扫描共焦显微术中的改进以及与之相关的改进
阅读：606发布：2021-06-13
专利汇可以提供扫描共焦显微术中的改进以及与之相关的改进专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于将光束输入到从扫描共焦显微系统的共焦扫描头（102）延伸到 显微镜 （104）的光路中以照射安装在显微镜中的样本的 选定 区域的组件（100）和方法。所述组件包括光输入端，用于接收来自 光源 的光束；射束引导装置（8、12），用于根据样本的选定区域的形状来控制光束的路径；以及射束 耦合器 （16），用于将光束选择性地耦合到从共焦扫描头（102）到显微镜（104）的光路中，其中由射束引导装置来控制射束方向以便照射选定区域。本发明还描述了一种包括这种组件的扫描共焦显微系统，以及校准该系统的方法。此外，公开了一种用于在两个路径之间选择性地切换光束的光 开关 。，下面是扫描共焦显微术中的改进以及与之相关的改进专利的具体信息内容。
1.一种光开关，用于在路径之间选择性地切换光束，其包括用于接收来自光源的光束的光输入端；至少两个输出路径，每个输出路径导向相应的光输出端；用于选择性地插入光束中以将光束引导到选定的输出路径的平面反射镜；用于改变反射镜的定向的驱动器；
以及在通过光开关的每个光路中提供的光中继器，以减少对于开关中的角度失准的敏感性，其中每个中继器被安排为将输入到开关的光转移到相应的选定输出路径，并且将输入射束聚焦到输入端与输出端之间接近于反射镜的点，其中所述中继器包括在光输入端处的聚焦透镜和在每个光输出端处的相应的准直透镜，其中所述反射镜能够在两个终点止动装置之间切换，并且控制装置耦合到驱动器以在反射镜的在所述终点止动装置之间的行程的第一部分期间加速反射镜并且在其行程的第二部分期间减速反射镜。
2.根据权利要求1所述的光开关，其中在输入端和输出端的每个处提供一对消色差透镜。
3.根据权利要求1或2所述的光开关，其中所述驱动器包括直接驱动DC电机。
4.根据权利要求1或2所述的光开关，其中所述光开关包括用于生成指示反射镜的定向的信号的旋转编码器。
5.根据权利要求1或2所述的光开关，其中所述反射镜能够在两个终点止动装置之间切换，并且控制装置耦合到驱动器以在反射镜的在所述终点止动装置之间的行程的第一部分期间加速反射镜并且在其行程的第二部分期间减速反射镜。
6.根据权利要求1或2所述的光开关，其中通过驱动器使得所述反射镜相对于每个终点止动装置偏置。
7.根据权利要求1或2所述的光开关，其中所述反射镜能够在第一位置与第二位置之间进行切换，其中在第一位置处光束不入射到所述反射镜，而在第二位置处光束被所述反射镜转向。
扫描共焦显微术中的改进以及与之相关的改进
技术领域
[0001] 本发明涉及扫描共焦显微术，更特别地涉及对安装在扫描共焦显微系统中的样本的一个或多个区域的选择性照明（illustration）。
背景技术
[0002] 共焦显微镜通常用于观察半透明显微物体的内部细节，特别是在生物应用中，其通常采用荧光照明。这种显微镜的基本特征是利用通过小孔（pinhole）聚焦的光照射样本并且结合对通过相同小孔返回的光的观察，结果是检测到的光基本上与该小孔在样本内的特定像平面相关，而不是与样本上方或下方的平面相关。这样能够在该样本内获得准确的深度分辨率。通常，将激光器用于在小孔处提供非常紧聚焦的强光束。
[0003] 如上所述，这种系统给出了有关该样本中仅一个点的信息。然而，利用两个可选的和全然不同的方法能够扩展这种原理，从而提供该样本的扩展像（image）。在第一种方法中，称作‘扫描光斑（scanning spot）’，在感兴趣的区域上对小孔进行光学扫描，记录返回的强度，以便重建样本的像。在第二种方法中，平行照射许多小孔，以同时给出整个感兴趣区域的信息。一种这样的配置是‘Nipkow盘（disk）’，其中将小孔设置在盘中，然后使该盘旋转以给出该区域的多次扫描的覆盖。这种方法特别适合应用于对活细胞的高速成像，这是目前生物学中相当受关注的课题。然而，本发明与各种形式的共焦扫描有关，但尤其涉及采用多个小孔的共焦扫描。
[0005] 漂白特定的区域使该区域被‘标记’－使其与其他本来不可区分开的相邻区域区分开，从而允许该区域在移动和显影时被追踪。这种‘光致漂白后的荧光恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching）’（或者FRAP）允许细胞内的传送机能被监视。通常，扩散过程将使漂白斑在一时间段之后恢复，该时间段是由扩散的速率决定的。对于粘性低的媒质，这一过程会非常快，在微秒数量级。
[0006] 目标照射（targeted illumination）的第二个实例是光催化（photoactivation）。一些染料在被非常强的光源催化时会改变其荧光色。同样，这使某一区域被‘标记’并且允许传送机能被研究。
[0007] 扫描光斑共焦系统非常适于目标照射应用。单个扫描光斑覆盖了样本的所有部分，所以在光斑位于感兴趣区域上方的同时提高激光功率产生了目标照射。尽管这种方法较慢且低效，但是一些年来目标照射已经可用在扫描光斑系统中。
发明内容
[0009] 本发明提供了一种用于将光束输入到从扫描共焦显微系统的共焦扫描头延伸到显微镜的光路中以照射安装在显微镜中的样本的选定区域的组件，其中所述组件包括：
[0010] － 光输入端，用于接收来自光源的光束；
[0011] － 射束（beam）引导装置，用于根据样本的选定区域的形状来控制光束的路径；以及
[0012] － 射束耦合器，用于将光束选择性地耦合到从共焦扫描头到显微镜的光路中，其中由射束引导装置来控制射束方向以便照射选定区域。
[0013] 特别地，光束的强度可足以漂白样本选定区域的荧光部分或者以其它方式改变其光学属性，使得例如FRAP或者光催化实验能够进行。
[0014] 该显微系统的安排（其中来自该组件的光束被选择性地输入到共焦头所使用的相同端口中）是有益的，因为这允许耦合（切换）装置被设置在显微镜外。因此，能够在无需进入显微镜内部或者无需在显微镜内容纳附加部件的情况下实现本发明。
[0015] 为了留有足够空间供该组件插在共焦扫描头与显微镜端口之间，该组件可以包括光中继器（optical relay），用以将在共焦扫描头与显微镜之间的光路上形成的样本像从该组件的显微镜侧中继（relay）到该组件的扫描共焦头侧。因此共焦扫描头的工作基本上不会因引入该组件而受到影响。
[0016] 优选的是，该光中继器包括在光路中限定了孔的挡板（baffle），用以减少杂散光的透射（transmission）。
[0017] 可以在射束耦合器与显微镜之间提供场镜（field lens）以会聚光束。
[0018] 射束耦合器可以包括反射元件，该反射元件能被选择性地插入在共焦扫描头与显微镜之间的光路中，以促进透射的光束注射（inject）到光路中。反射元件可以采用反射镜（mirror）的形式。有利的是，反射元件可以是分束器，以允许样本在该组件的照射期间被观察。
[0020] 优选的是，将前、后望远镜透镜安装在各自的可旋转支架上，以允许将每个支架上安装的透镜选择性地插入光束路径中。
[0021] 该组件还可以包括用于调整输入到该组件中的光束的方向和横向位移的装置。为此，可以安装输入射束准直器（collimator），以便允许改变其定向（orientation）以实现这些调整。在优选实施例中，该准直器具有与每一端相邻的圆柱形外表面，并且与这些表面中的每个表面相接触地提供两个螺纹调整器（adjuster）。所述调整器的轴优选基本上平行，并且适当操纵所述调整器以允许根据需要对光束路径进行调整。以平行配置（而不是以垂直调整器对）提供所述调整器使它们能够被安装成使得都能够由用户从该组件的一侧接近。
[0022] 在优选实施例中，射束引导装置包括两个枢转地（pivotably）安装的反射镜，它们的枢转轴（pivotal axes）基本上相互垂直，以允许在两个正交方向（即在该样本平面中的x和y方向）上改变射束的方向。此外，可以提供透镜以将射束的这些角偏转转变为平行射束位移。
[0023] 该引导装置可操作来将射束朝着样本上的一个或多个离散点引导，或者操纵射束以使得基本上均匀地照射预定区域。
[0024] 优选的是，提供将枢转地安装的反射镜之一成像到另一个反射镜上的装置，例如光中继器。在一个实施例中，该中继器包括两个透镜对。
[0025] 可以在该枢转地安装的反射镜之间的光路中提供附加的反射镜，以减少其占用的空间的长度。特别地，附加的反射镜可以包括相互正交配置的一对平面反射镜，以便使入射在它们之一上的射束的方向反转。将它们安装为使得能够沿着平行于入射射束的线调整它们的位置，以提供聚焦调整。
[0026] 在优选配置中，提供瞄准透镜以将射束引导装置所引起的光束的角偏转转变为平行射束位移。可以如此安装瞄准透镜，以使得能够利用例如两个相互正交的螺纹调整器相对于通过它的光路横向调整其位置。这使得该组件所输入的光束与来自共焦头的观察射束对准（alignment）。
[0027] 可以在该组件的显微镜侧的像平面中的光路中选择性地插入目标（target），以辅助该组件的校准。
[0028] 还提供了一种显微系统，其包括本文中所描述的显微镜、照相机、共焦扫描头、光输入组件，以及与该组件相耦合的光源，其中该系统包括用于控制射束引导装置和光源这二者的控制器，以便照射样本的选定区域。
[0030] 这可以用于以适当恒定的速度在样本上移动所引导的光束，使得对选定区域的照射基本上均匀。而且，这可以简化所需步进的计算。
[0031] 该控制器可以以大于该系统照相机分辨率的分辨率计算步进，从而提供射束的更平滑、更准确的运动。优选的是，该分辨率大约是60倍或更大。
[0032] 控制器中可以包括存储器，其配置为将用于控制光源的指令集与用于控制射束引导装置的指令集分开存储，使得这两个指令集能够相互独立地更新。
[0033] 在优选实施例中，该控制器可操作来并行处理用于控制光源的指令和用于控制射束引导装置的指令。该控制器可以包括FPGA，其被编程为计算将被输出到引导装置和光源的控制参数。特别地，其可以配置为并行运行计算这些参数的程序。这相对于使用两个或更多独立处理器提高了控制参数之间的同步性，因为这些程序能够根据公共时钟在FPGA上运行。
[0036] 在一种实施方案中，反射镜能够在第一位置与第二位置之间切换，在第一位置处光束未入射在反射镜上，而是直接穿过该开关到达共焦头输入端，在第二位置处光束转向透射到光束输入组件的光输入端。
[0037] 有利的是，可以在通过光开关的每个光路中提供光中继器，以降低对于开关的角度失准的敏感性。该中继器把输入到开关组件的光转移（transfer）到其输出端，并且将所输入的射束聚焦到输入端与输出端之间的点。优选的是，该点接近于该开关的反射镜（当处于第二位置时）。
[0038] 该中继器可以是位于开关组件的输入端和两个输出端处的透镜的形式。优选的是，在输入端和输出端中的每一个处提供一对消色差透镜（例如Edmund X08-050）。
[0039] 优选的是，反射镜能够在两个止端（end stop）之间切换并且控制装置与驱动器耦合，以使反射镜在其止端之间的行程（travel）的第一部分期间加速并且在其行程的第二部分期间减速。
[0040] 可以在单点共焦扫描显微系统中采用该组件，但是其特别针对多点共焦扫描显微系统。
[0041] 根据另一个方面，本发明提供了一种校准包括本文所述的光输入组件的显微系统的方法，包括以下步骤：
[0042] （a）根据预定的射束引导装置设置来依次照射至少六个点中的每个点；
[0043] （b）利用照相机记录每个点的位置；
[0045] （d）将像素位置(x, y)和射束引导装置设置(u, v)对输入到以下方程中：
[0046]
[0047] 以及根据所得到的联立方程来计算系数a1,1到a6,2。
[0048] 本发明还提供了一种照射安装在包括共焦扫描头和显微镜的扫描共焦显微系统中的样本的选定区域的方法，所述方法包括以下步骤：
[0049] （a）接收来自光源的光束；
[0050] （b）根据样本的选定区域的形状来控制光束的路径；以及
[0052] 现在，参照示意附图来描述本发明的实施例，其中：
[0053] 图1是根据本发明实施例的共焦显微系统的框图；
[0054] 图2是根据本发明实施例的照射模式下的光输入组件（或者目标照射模块）的光学元件的示意透视图；
[0055] 图3是类似于图2的示图，其示出了校准模式下的组件；
[0056] 图4到8是与图2中所示模块的选定光学元件相关的光线图；
[0057] 图9是构成图2的光输入组件一部分的电动望远镜组件；
[0058] 图10和11是构成图9的望远镜组件一部分的电动透镜架（lens mount）的相对侧的透视图；
[0059] 图12和13是构成图2的光输入组件一部分的电动分束器组件的透视图，其分别示出了将分束器插入光束中和从光束中移除；
[0060] 图14A到C、15、16A、16B和17A到17B示出了说明调整光输入组件光学器件以处理望远镜透镜的任何失准的光线图；
[0061] 图18和19是构成图2的光组件一部分的输入射束调整机构的透视图；
[0062] 图20A和20B以及图21是分别是图示出构成图2的光输入组件一部分的f-theta透镜的调整的两个光线图和透视图；
[0063] 图22是图示出与图2的光输入组件的射束引导装置相关联的光中继器的光线图；
[0064] 图23和24分别是图1的系统的光开关的光线图和透视图；
[0065] 图25是图示出图1所示的系统的目标照射方面的电子部件的框图；
[0066] 图26是与图25的控制单元相关的框图；
[0067] 图27是图2所示的光输入组件的射束引导装置的透视图；
[0068] 图28和29是图示出图27的射束引导装置的控制的示图；
具体实施方式
[0070] 图1图示了根据本发明实施例的扫描共焦显微系统的框图。其包括体现了本文中所描述的光束输入组件的目标照射模块。以下将该模块也称作“FRAP模块”。
[0071] 在图1的系统中，目标照射模块位于共焦头102与显微镜104之间。照相机106能够通过共焦头102和模块100观察安装在显微镜中的样本。激光引擎108与光开关110耦合，该光开关可操作来将来自激光引擎的激光引导到共焦头102或者模块100。
[0072] 根据用户输入通过PC 112和同步器114来控制该系统的这些部件并且使它们同步。PC与共焦头102、照相机106和同步器相耦合，而同步器又与模块100、激光引擎108和光开关110相耦合。
[0073] FRAP模块
[0074] FRAP模块的功能是将紧聚焦的并且准确定位的高功率激光辐射注射到显微镜视场中用户选定的目标上，同时允许以普通共焦方式在非常短的时间之后观察该目标。该模块是接近共焦头尺寸和形状的盒体，其介于共焦头与显微镜的输出端口之间。图2到8中示出了图示FRAP模块的光学元件的示图。
[0075] 图2示出了当FRAP模块处于样本照射模式时从光输入端到显微镜的、通过该模块的射束路径，其特征标记如下：
[0076] 1 具有准直器的单模输入光纤
[0077] 2 输入调整筒（barrel）端
[0078] 3 第一折叠反射镜
[0079] 4 扩束器的第一透镜（负）
[0080] 5 扩束器的第二透镜（正）
[0081] 6 第二折叠反射镜
[0082] 7 中性滤光器（衰减器）
[0083] 8 X检流计反射镜
[0084] 9 第一检流计中继透镜
[0085] 10 屋脊型（roof）反射镜对
[0086] 11 第二检流计中继透镜
[0087] 12 Y检流计反射镜
[0088] 13 第三折叠反射镜
[0089] 14 f-theta透镜
[0090] 15 第四折叠反射镜
[0091] 16 注射反射镜（分束器）
[0092] 17 样本像平面
[0093] 18 C架凸缘位置（显微镜耦合）
[0094] 19 场镜
[0095] 20 到显微镜的输出射束
[0096] 在典型的共焦显微系统中，显微镜输出端口的像平面非常接近于显微镜的主体，并且因此使共焦头与该输出端口紧密耦合。因此，供注射FRAP射束的空间受限。该FRAP模块通过用于将样本像从该模块的前面中继到后面的光学器件来解决这个问题，从而使共焦头实际上以相同的方式工作，但是在中继器的前面获得了用于注射光学器件的空间。
[0097] 图3中示出了中继透镜相对于图2所示的FRAP模块的元件的位置。在该图中，描绘了校准模式下的模块，其采用下面进一步描述的校准目标或反射镜21。图3的其他特征如下：
[0098] 22 第一主中继透镜
[0099] 23 中央中继挡板（孔径）
[0100] 24 第二主中继透镜
[0101] 25 中继样本像平面（在共焦头内）
[0102] 该中继器仅需处理来自显微镜的非常严格的焦距比（f-number），并且具有相对小的孔的挡板23被放置在中继器的中心以消除任何杂散光，特别是来自FRAP激光系统的杂散光。FRAP模块的其他部分包括激光束调节和导引（steering）光学器件。
[0103] 图4通过显微镜光学器件的简化表示而图示了当FRAP模块处于观察模式时来自样本像平面25的光线路径。透镜26表示显微镜镜筒透镜（tube lens），而透镜27表示显微镜复合物镜。
[0104] FRAP模块的基本光学系统包括：具有准直器的输入光纤1，用以提供准直输入射束；通过检流计运动来驱动的两个可枢转（pivotable）反射镜8、12，用以使射束在水平方向（X）和垂直方向（Y）上偏转（deflect），以便将射束引导到期望位置；‘f-theta’透镜14，用以将这些角偏转转变为平行射束位移，同时将射束聚焦成小光斑；以及电动注射反射镜16，其更似于上述的光开关，以便将FRAP射束注射到显微镜输出端口。
[0105] 概念上，操作如下：切换注射反射镜16以注射激光束；同时，激活（activate）光开关110以将激光源转向FRAP输入光纤；移动检流计以将光束导引到期望目标；然后打开激光器。在FRAP操作已经完成之后，就立刻将注射反射镜和光开关反射镜返回到其原始位置，从而允许以普通方式观察样本。注意，检流计非常快速地工作，因此利用编程控制可以瞄准样本的扫描区域而不仅仅是单独的光斑。
[0106] 然而，为了最有效地起作用，该光学系统具有多个改进。如上所述，基本系统投送聚焦在像平面中的期望目标上并且平行于显微系统的光轴传播的输出光束。这种平行称作‘远心性’。然而，对于大多数显微镜而言，最佳的耦合需要略微的不平行，通常是会聚的。因此可以将弱‘场镜’19添加到FRAP模块前面来产生所需的会聚。
[0107] 同样的问题通常也存在于已经安装了场镜的共焦头。因此，可以将场镜从共焦头移除并且用位于FRAP模块前面的适当场镜来代替它。
[0108] 将场镜从共焦头移除略微移动了其焦点，因此为了补偿以及提供保护使之免于污染，可以用平面玻璃窗来代替该特定透镜。然而，难以接近共焦头中的该位置并且不方便的是该位置接近于焦平面，因此可以改为将玻璃窗放置在共焦头与FRAP模块之间耦合的C架中。出于类似的原因，优选地将新的场镜放置在FRAP模块与显微镜之间耦合的C架中。这是特别适当的，因为场镜及其C架这二者对于所安装的显微镜模型都是唯一的。
[0109] 未安装或者安装了错的场镜的实际结果是，当把目标从视场的中心移开时，激光束实际上可能未击中（miss）或者部分未击中显微镜的后孔径。略微不那么严重的是，光束可能偏心到达，造成样本处的FRAP射束倾斜并且目标区域随着样本Z深度改变而在视场中显著移动。当光束没有定心（centre）于物镜后部时观察出现了类似的问题。观察射束应当与FRAP射束同时定心。通过利用与显微镜耦合的C架的倾斜（slope）调整整个共焦头的指向来对观察射束进行定心。然而，出于稳定性的原因，优选使FRAP模块硬安装（hard-mount）到共焦头，因此对于FRAP模块来说需要独立的瞄准机构。这通过利用两个螺钉调整使f-theta透镜14向侧面移动从而在不影响观察的情况下调整FRAP射束的指向来实现。
[0110] 非远心性的第二个原因在于检流计反射镜8、12与f-theta透镜14之间的关系。该透镜仅能对单偏转中心有效地起作用，但是如果有两个检流计，则存在由于反射镜的显著物理间隔而移位的两个这样的中心。针对该问题的一种解决方案是将一个检流计反射镜成像到另一个检流计反射镜上。这样，这两个反射镜呈现在相同的平面中。我们不希望影响激光束的其他属性，因此利用位于检流计之间的光中继器9、11来完成该成像，这使射束其它方面未改变。
[0111] 检流计之间的光中继器具有非常长的路径，所以为了节省了空间，它已经被折叠。折叠需要横向位移以避免输入与输出射束之间的冲突，因此这利用90度的“屋脊型”反射镜对10来实现。这提供了引入系统聚焦调整的机会以确保激光光斑能够聚焦在样本像平面中。简单的螺钉驱动滑片（slide）允许中继透镜之间的路径长度改变以便实现聚焦。
[0112] 通过改变FRAP模块输入端处的射束直径实现了三个激光光斑尺寸的选择。因为这是一种受高斯衍射限制的光学系统，所以更大的输入射束直径引起更小的聚焦光斑尺寸。最初，通过适当选择光纤末端的准直器透镜的焦距能够确定输入射束尺寸。例如，这可以是0.7mm。
[0113] 利用电动扩束器4、5，光束直径可以自动变化。这些扩束器实际上是能够扩大或者缩小射束直径的伽利略望远镜。将前、后望远镜透镜分别安装在三位置旋转选择器上，以给出两个可选的透镜或者‘无透镜’的选择。组合在一起，这些透镜提供了一种直通配置、一种3倍的扩束器和一种3倍的缩束器（beam contractor）。
[0114] 将每个透镜对安装在使用与光开关模块中采用的相同电机相对于止端而驱动的轴上。额外注意保持该透镜组件对称，以使得透镜准确地并且可再现地定心。组织止端偏置以开始在聚焦方向上显示（bear）倾斜，其是最不重要的。磁性制动器使该组件在更不重要的直通配置中摆脱重力或者其他偏心力。
[0115] 即使在注意了望远镜定心之后，激光束也未必到达中心。为此，输入光纤的准直器筒能够在横向位移和指向方向上调整。为此提供了可从模块外接近的四螺钉调整。射束扩展望远镜的定心（centration）不足主要影响了FRAP模块出口处的射束指向并且f-theta透镜对于此目的而言是不适当的。
[0116] 本发明人已经确定了，至少在考虑输出指向的范围内，能够调整输入指向以便补偿射束扩展中的任何定心一致性的缺失。采取了细致的反复的程序来正确地对准四个输入调整器螺钉，以使得全部三种射束配置在显微镜物镜的后面重合。这种调整对于维护工程师而言难以使用，因为目前需要单独的照相机作为对准的辅助工具。通过提供与模块一体的光纤可以克服这个问题，以使得无需重新对准。可替换地，可以提供测试软件和简单的光学折返附件，以允许利用系统自身的照相机来更容易地对系统进行重新对准。
[0117] 使用激光源控制FRAP射束功率相对粗略，因此可以提供3路切换衰减器（3-way switched attenuator）7形式的附加控制。其工作类似于光束扩展透镜，但是无需这种可再现性，因为衰减器不具有光学中心。例如，可以使用1个和2个OD衰减器，或者更优选的是2个和4个OD衰减器。
[0118] 在检流计命令电压和样本像平面中激光光斑的位置之间的确切关系当然取决于许多确立因素（build factor）。实际上，未必需要这两者之间固定的物理关系：而是，目标位置优选应当与根据观察到的样本像（WYSIWYG）指定的位置一致。这也必须使用观察光学器件。然而，其没有在第一级包含显微镜，这是因为FRAP和观察系统在FRAP模块前面的像平面变得共同。因此，可以通过将目标放置在该像平面处来校准该系统，例如使用电动的向下翻转（flip-down）目标21。优点是无需用户配合来进行校准，并且他的样本不会受到校准过程的影响。
[0119] 通过观察系统可以同时观察到我们的内部目标、目标上的激光光斑，而不是FRAP。这要求注射反射镜16实际上为分束器，以便允许辐射被返回。在原型中，已经使用了50:50的分束器，但是优选的是90:10的分束器。这保持了FRAP的高效率，同时仍获得足够的返回来进行校准。
[0120] 目前，校准目标是反射镜21。其优点是健壮和可靠，但缺点是会返回与FRAP激光波长相同的光。这有可能正是共焦头旨在阻挡的波长。在实际中，能够检测到足够的穿透以实现校准，不过为了确保万无一失，也可以在需要时替换荧光屏。这可以是透明荧光塑料，也可以是不透明薄膜。在任一情况下，颜色以日光荧光（day-glo）橙为宜。荧光目标的缺点是其向所有方向进行发射，并且可以使激光束散射，从而导致返回光斑变得相当模糊，除此之外，荧光的长期寿命有限，这也可能会带来问题。
[0121] 校准包括通过观察系统来记录由预设的检流计驱动值列表生成的光斑图案（pattern）。然后能够计算适当的数学变换，以将检流计坐标转换为照相机坐标，或者反之亦然。将要考虑的典型因素包括X和Y偏移以及比例因子、轴旋转以及非正交性。除了关心设计检流计电压与光斑位移之间的线性关系之外，观察系统本身可以表现出一定的非线性光学畸变（桶形畸变），并且在校准过程中希望有二阶非线性项以在瞄准过程中给出子像素准确度。
[0122] 轴旋转可以包含在软件校准过程中，而非提供机械调整。然而，仍然存在的问题是FRAP单元能够围绕观察轴旋转。有利的是，优先对准X扫描矢量很大程度上促进了光栅扫描。
[0123] 校准可能随时间而改变，因此可能需要重新校准。在正常使用中，可能预期X和Y偏移发生漂移，因为检流计具有明显的温度系数。然而，比例因子和高阶项应当保持相对稳定，并且旋转参数将仅受该系统的基本物理扰动的影响。仅在仪器启动时进行完整的重新校准就足够了，并且在任何FRAP实验之前，仅应重新测量X和Y偏移。这可能仅需要花费大约1秒钟来执行。因此，该系统应足够稳定以在典型实验的整个持续时间内保持其对准准确。然而，这可能依赖于使该系统适当地加热，并且环境温度在合理控制下。
[0124] 如最初所述的，FRAP光学系统大，不方便。因此，在优选实施例中，已经使用四个平面反射镜3、6、13、15，非常仔细地将其折叠，从而适于非常类似于共焦头的尺寸和形状的体积。所有电机的局部驱动电子设备以及单独地检流计可以被包含在该模块内，并且所生成的热量，特别是由检流计生成的热量可能需要壳体上的散热片来散热。这些电机可能与光开关电机相同，并且以类似方式驱动（但是注意3路选择器上的磁制动器）。
[0125] 该模块的辅助装置（service）－光纤、电能和控制信号－可以全部安排为从后面显现。在该模块的前面，存在着指示FRAP系统可能是激光激活（laser-active）的LED，以及还存在着为了安全原因遮挡激光束的手动快门控制。该组件具有三个可调调平脚（levelling feet）。注意，这些是出于安装目的而使用的便利特征，并且能够在安装完成之后解除。然而，可以采用它们来稳定该FRAP模块的任何旋转趋向。
[0126] 所有的辅助装置调整是可以从外部进行的，并且包括：四个输入调整器以及对该单元的显微镜端的聚焦调整；以及f-theta透镜的调整螺钉，一个在上、一个在后。
[0127] 图5是主观察中继器的示意性光线图。如果是1:1的中继器，则第一和第二透镜22、24这二者都具有相同的焦距f。在各重要方面，间隔为2f的透镜共同将与输入透镜相距f的样本像平面17处的光场复制到与输出透镜相距f的中继样本像平面25。
[0128] 图6是主观察中继器的实施方式的光线图。实际上，（球形表面）透镜的像差限制了就准确成像而言可获得的折射度，结果是使用简单的透镜，该中继器必须具有长焦距以便保持良好的像。利用透镜对22、24来代替每个单独透镜，分担了表面之间的折射，以便缩短该中继器并且又保持良好的成像。每个透镜本身是消色差对，除了校正色差之外，还趋向于改善像质量。虽然如此，像质量主要取决于远心输入射束所呈现的数值孔径。这能够在中继器输入端的上游进行控制，或者可替换地能够由挡板23限定的中心孔径来控制，如图所示。该孔径还可以用于限制杂散光通过中继器传播。
[0129] 图7是扩束望远镜的光线图。右侧进入的窄平行射束（0.7mm直径）被扩展到是以前的3倍，成为左侧的输出平行射束。透镜4和5分别具有-25mm和75mm的焦距，并且被放置成使得其焦点基本上重合。这些透镜是用于颜色校正和改善像质量的消色差透镜。
[0130] 图8是可替换的缩束望远镜的光线图。右侧进入的窄平行射束（0.7mm直径）收缩到是以前的1/3，成为左侧的输出平行射束。透镜4a和5a分别具有75mm和-25mm的焦距，并且被放置成使得其焦点基本上重合。同样，这些透镜是用于颜色校正和改善像质量的消色差透镜。
[0131] 图9到11中图示了用于操纵望远镜的电动伸缩组件，其特征被表示为如下：
[0132] 4、5；4a、5a 望远镜透镜对
[0133] 6 折叠反射镜
[0134] 26 DC电机
[0135] 27 旋转编码器
[0137] 31 夹板（clamp plate）
[0138] 32 透镜架
[0139] 33 磁体
[0140] 34 止端
[0141] 35 止端销
[0142] 36 夹板
[0143] 37 V形底槽
[0144] 尽管提供了被设计成使射束重合的输入对准方法，但是扩束望远镜透镜的定心对于实现显微镜物镜后孔径处三个激光束尺寸的重合仍是至关重要的。如果任何望远镜透镜的横向位置误差过大，则所生成的指向误差会太大以至于不能容纳在实际调整范围内。因此，透镜安装的对称性非常重要，尤其是每个架上的每对透镜（4、4a；5、5a）的光学中心应当相对于旋转轴等距。
[0145] 架32被设计成将定心误差减到最小。具体讲，透镜和轴杆的安装表面都是通过在无需改变机床设置的情况下从同侧进行研磨来加工的。这种策略充分利用了研磨机的固有准确度。例如，通常情况是沿着该架的垂直轴向下钻孔，以便容纳电机轴。这需要使工件转动，可能会引起额外的设置误差，并且无论怎样都会仅由于钻头偏移而引起偏心孔。取而代之，在优选实施例中V形底槽37被研磨成容纳该电机轴，利用板36将该轴夹在适当位置，从而保证透镜架极好的对称性。
[0146] 被设计成促进定心对称性的另一特征是止端销35。通过DC电机26中的精密（deliberate）转矩使该销抵靠子框架30保持在止端位置34（仅一个位置是可见的），从而限定了望远镜在其中是活动的两个位置。然后，对电机轴的反作用力使轴承在平行于透镜光轴的方向上偏置。因此，在最不敏感的聚焦方向上容纳了电机轴承的任何空转。如果代之以将透镜架的主体用作止端，那么对电机轴的反作用力将具有与光轴垂直的巨大分量，从而干扰定心。
[0147] 止端销35还有第二用途。能够将电机驱动到止端之间的中途位置，并且在这个位置，在射束中不存在透镜。这给出了1×的射束扩展选择，并且射束中没有望远镜。然而，电机没有制动装置，并且在重力或者任何其他不想要的力的影响下仍能够自由旋转离开该位置。然而，销35是由磁性钢制成的，并且在该中间位置时受到磁体33的吸引，从而形成了将电机近似保持在适当位置的微弱的制动作用。
[0148] 在该系统中所使用的射束是具有高斯横截面的单模激光束。在极大程度上，光学器件完全是受衍射限制的。公知的是，光不能聚焦成无穷小的光斑：光斑的尺寸受到衍射的限制。极限光斑尺寸是由光的波长结合聚焦光的会聚角来确定的。对于给定波长，利用较大会聚角获得较小光斑，反之亦然。如果简单的透镜将平行光束聚焦成大约1焦距以外的光斑，则会聚角将随着平行射束的直径而增大。因此在这种系统中，假设其仍然受衍射限制，大直径输入射束会产生小聚焦光斑，反之亦然。在高斯激光束的情况下，文献表明，光斑尺寸与会聚角的关系如下公式：
[0149] r/ f =θ=λ / (π * w0)
[0150] 此处r是平行射束半径，f是透镜焦距，θ是会聚角半径，λ是波长，并且w0是光2
斑半径。无论如何，半径是指高斯射束轮廓的1/e半径。
斑半径。无论如何，半径是指高斯射束轮廓的1/e半径。
[0151] 图12和13示出了根据本发明实施例的高速电动分束器组件，其中分别在光束中插入和移除了分束器。
[0152] 分束器16是1.1mm厚、对角线（across）长16mm的正方形玻璃，在其第一表面上涂敷了具有大约90％反射率和10％透射率的介电涂层。后表面涂覆有抗反射涂层，以使得虚反射减少到可接受的程度。该分束器以45度插入主观察射束（图12）中，其将大部分目标照射射束注射到显微镜中。然而，当插入校准反射镜21时，一部分射束被反射回来通过该分束器。大约9％被透射回来通过共焦头到达照相机，从而允许该系统校准激光束的瞄准。
[0153] 为了进行普通观察，分束器能够旋转离开射束，其中其对所观察像的质量或者强度没有影响（图13）。在某些情况下，目标照射的作用可能非常短暂，因此从目标照射转变为普通观察的速度非常重要。利用具有用于监视其旋转的旋转编码器27的DC电机26来驱动分束器在下止端28与上止端29之间的旋转。为了非常快地进行操作，以全电流驱动电机，从而产生最大的加速度，直到分束器已经旋转到其交替位置的中途为止。此时，观察射束非常清晰以供观察。接着，使驱动电流反向以产生最大减速度。因此，在等于先前的加速周期的周期之后，旋转速度非常低。相对小的残余反向驱动电流于是确保了分束器到达其止端，而没有由于与止端的高速碰撞而造成严重损害的风险。
[0154] 可以利用目录中的光学部件来构建本文中所述的模块光学器件的实施例（并且已经实验成功）：来自Edmund Optics的透镜；来自Comar的介电反射镜；以及来自Thor的吸收性中性滤光片。模块的主要供应商是新加坡的QiOptiq（以前是Thales）。然而，涉及这种特定应用的目录部件的一些潜在缺陷表明使用定制（custom）光学部件是优选的。目录部件的主要缺陷如下。未针对为系统所指定的波长范围对透镜进行上色（chromatically）优化，并且通用表面形状引起了射束的一定椭圆畸变和模糊。透镜中所使用的玻璃的光谱范围不允许将来扩展到UV，而且涂层在该范围的端点处不是非常有效。适当形式的90:10分束器不容易获得，并且反射镜和分束器可能表现出偶然的点缺陷，这会在场中的不同点处显著影响射束质量。
[0155] 因此，优选地配置定制光学器件来解决这些可能的缺陷。可以选择良好透射UV（至少350nm）的玻璃。可以严格规定所有部件的表面质量。反射和AR涂层全都可以相当有效地覆盖期望范围，并且透镜具有被优化成使射束的椭圆畸变和一般退化最小化的形状。可以用反射滤光片取代中性滤光片（衰减器）。
[0156] 3个扩展激光束的对准
[0157] 全部三个不同尺寸的激光束应当穿过显微镜物镜的后光学孔径的中心。这确保了到达样本的照射锥体在该位置平行于光轴，并且还保证了最大量的光进入物镜。f-theta透镜14用于瞄准来自目标照射模块的输出射束；然而，这种一次调整必须能够满足全部三个射束尺寸选择，因此重要的是全部三个射束在物镜后面重合。在最佳构建的系统中，将是如此情形。然而，望远镜的定心误差使得通过直接组件方法实现是不切实际的。然而，使用输入激光束调整器中可用的全部4个自由度，可以找到基本上在物镜后面实现射束重合的单一输入路径。利用如下的标准光学器件能够证明这一点。
[0158] 在这里提出的适当远心光学系统中，场镜19保证了后物镜孔径相对于处于17的样本像成像于无限远。通过系统逆向工作，f-theta透镜14将该无限远共轭（infinite conjugate）聚焦到Y检流计反射镜12上，由其中继到X检流计反射镜8。因此，X检流计位于物镜后孔径的像处，其作为目标。因此，如果激光束在X检流计反射镜处重合，则它们在物镜后面重合。
[0159] 能够通过望远镜组件逆向工作来观察检流计在哪里再成像。这对于三种射束扩展可能是不同的，并且每种变化分别如图14A到C所示，其中为了便于理解大致地夸大了射束扩展。
[0160] 图14A到C所示的反向光线轨迹指示X检流计反射镜8的中心的虚像的位置，如下：
[0161] 38 利用图14A中的3×扩束器的虚像位置
[0162] 39 利用图14B中的1/3×缩束器的虚像位置
[0163] 40 利用图14C中的1×光束扩展（无望远镜）的虚像位置
[0164] 图15示出了来自图14A到C所示的虚焦点38、39和40的光线轨迹。图16A示出了望远镜透镜4的1mm偏移对于图15的光线轨迹的影响，图16B提供了图16A的局部放大视图。能够看出，图16A和16B中像点40发生了离轴移动，并且因此像点38、39和40不再位于一条直线上。图17A和B示出了使物体移动的校正效果，从而使38、39和40再次共线。
[0165] 为了使激光束在X检流计处重合，能够看到激光束实际上将穿过这三个虚焦点38、39和40。换句话说，在输入端处，应当瞄准激光器，以使得在没有任何扩束器的情况下，其经过点38、39和40。当然，这仅仅在三个点位于一条直线上的情况下才是可能的。不幸的是，能够看到如果任何一个透镜由于某种原因发生了横向位移（如图16A和B所例示的），则这些点将不会位于一条直线上，并且因此不能实现瞄准。
[0166] 然而，通过调整X检流计上的目标点能够使情况恢复。在附图中，这等同于使物体移动，这又使全部三个像移动。横向放大率对于三种不同射束扩展而言是不同的，因此像光斑38、39和40以不同速率移动。因为一般而言，像的纵向间隔与放大率不成正比，因此光斑的相对对准也改变。这使得可以使三个光斑重新共线（如图17A和B中所示）。
[0167] 在所示实例中，需要使物体移动5mm来补偿透镜4的1mm移动。幸运的是，可能希望实现大约0.2mm的定心一致性，因此1mm的目标移动应当是合适的。注意，尽管在检流计处重合，但是目前激光束偏心大约1mm。然而，通过使f-theta透镜也调整1mm能够很容易补偿这种偏心。
[0168] 注意，尽管目前激光束在物镜后面重合，但是它们很可能在样本像平面17处不再重合。然而，因为X和Y检流计反射镜将光束引向样本像平面中的任意期望位置，所以能够通过软件校正单独射束来校正该问题。
[0169] 即使望远镜透镜完全定心，仍有使激光器与望远镜的光轴准确对准的问题。在不可避免的定心误差的情况下，问题变为瞄准激光器以穿过3个虚焦点。利用例如图18和19所示的输入射束调整机构能够使用反复的调整方法，其中特征被表示如下：
[0170] 41 激光束准直器筒
[0171] 42 夹紧和回位弹簧
[0172] 43 壳体壁内侧
[0173] 44 推销引导组件
[0174] 45 调整螺钉（总共4个）
[0175] 46 球形末端铜推销（总共4个）
[0176] 首先，将所有调整装置设为其额定中心：4个输入调整器45、X和Y检流计、聚焦调整和f-theta横向调整装置。这确保了激光束干净利落地近似沿着光轴穿过该系统。接着，观察相对于样本像平面17无限远的目标照射模块的激光输出端。最容易的是通过使用聚焦在无限远的数字照相机观察C架18处的输出端来进行观察。
[0177] 现在注意由1×扩束器（无望远镜，中间（medium）射束）生成的光斑以及由1/3×缩束器（小射束）生成的光斑的位置，并且观察到它们相互位移。仅调整两个远端输入调整螺钉（相对于望远镜），从而使小光斑与中间光斑重合。这需要一定的反复，因为调整也会影响中间光斑。
[0178] 现在观察中间光斑和大光斑（来自3×扩束器）的位置。仅利用近端输入调整螺钉来调整它们重合。调整近端螺钉也会影响中间和小光斑的重合，并且将有必要重复整个程序直到全部三个光斑会聚到同一中心。重要的是，当使小光斑和中间光斑对准时，仅调整远端螺钉，并且当使大光斑和中间光斑对准时，仅应当调整近端螺钉。另外，对准可以发散，而不是会聚以重合。在光斑已经达到重合之后，能够利用f-theta透镜调整使它们都定心于显微镜物镜的后孔径中。
[0179] 乍看起来，远端螺钉似乎与近端螺钉完全执行相同的功能，即改变输入角度，但是实际上，反复调整通常具有使激光束向侧面移动的效果。实际上，可以设计一种调整方法，其将这些调整改变为横向移动和角移动。
[0180] 还注意，无限远的小光斑对应于低射束发散度（divergence），并因此样本像平面17处的大光斑也是如此。类似的是，无限远的大光斑对应于17处的小光斑。
[0181] 在目标照射模块的输出端处能够采用数字照相机来实现这种调整。有用的替换方式是将凹面反射镜放置在与样本像平面17相距一倍焦距处，从而将无限远聚焦到样本像平面17。这允许将系统照相机用于调整。使用两倍焦距并且背面为平面反射镜的凸透镜很容易模拟这种反射镜。
[0182] f-theta透镜14具有三个分立的功能：其将检流计反射镜处的射束的角偏差转变为模块输出端处的平行位移（在C架凸缘18附近）；其将激光束聚焦在样本像平面17处；以及其能够被调整以引导输出射束的方向，以使得射束直接穿过显微镜物镜的后孔径的中心。该最后的功能的原理如图20A和20B所示。在图20A中，f-theta透镜14定心在激光束上，并且因此除了期望聚焦效果之外，激光束未偏转地穿过透镜。在图20B中，该透镜已经垂直向下位移，从而引起输出射束向下偏转。明显的是，这种动作能够被扩展到引起水平偏转，从而在输出射束的指向上获得两个正交自由度。
[0183] 图21示出了促进在两个正交方向上调整f-theta透镜位置的调整机构，其特征被表示如下：
[0184] 60 壳体
[0185] 61 回位弹簧
[0186] 62 水平调整螺钉
[0187] 63 垂直调整螺钉
[0188] 图2中由透镜9和11形成的检流计中继器的目的是将X检流计反射镜8成像到Y检流计反射镜12上。这具有使两个反射镜表现出共处一处（co-locate）的效果。因此，该系统仅具有一个偏转中心而不是两个，从而使f-theta透镜的工作容易得多。
[0189] 省略该中继器的实际结果是对于所有检流计偏转而言，不能保证输出射束穿过显微镜物镜的后孔径中心。使用中继器而不是仅单个透镜的原因是使得激光束的平行性在该子系统的出口处未改变。
[0190] 该中继器是具有标准1f:2f:1f间隔的1:1中继器，但是其优选地利用透镜对来实现，以减少折射过程中的像差，如图22所示。
[0191] ‘屋脊型’配置中的平面反射镜对10使该系统折叠，从而使其在物理上变短。然而，其还用作系统聚焦调整装置。当横向位移（图22中的左－右）时，输出射束的平行性从会聚经过平行变为发散。这影响了样本像平面17处的射束聚焦，并且对于大多数关键应用而言，可以使光束准确地聚焦，即利用生成最小光斑的3×扩束器。其他射束选择的聚焦不是如此准确，但这不那么重要。可以通过简单的螺钉滑动机构来驱动该屋脊型对。
[0192] 光开关
[0193] 光开关（如图1中的110所示）的功能是使激光束任意地从普通共焦头观察通道转移到FRAP通道中。该开关位于激光源108中或者接近于激光源108，并且其输出端通过带包层（armoured）单模光纤与共焦头102和FRAP模块100耦合。
[0194] 在6线和3线激光源的情况下，该光开关模块实际上安装在激光源模块内部，并且其输入端直接与激光束耦合，因为这是最有效的布置。然而，在5线组合器的情况下，因为空间问题，该开关安装在外部，并且其输入端通过端接在准直器每一端的另一单模光纤与激光器耦合。
[0195] 图23示意性地描绘了该开关的光学元件（为了说明将射束宽度夸大了），同时图24示出了该开关的实施方案的结构。特征被表示如下：
[0196] 26’ DC电机
[0197] 27’ 旋转编码器
[0198] 50 输入透镜
[0199] 51 输出透镜（当没有反射镜时）
[0200] 52 电动平面反射镜（所示的是插入的情况）
[0201] 53 可替换输出透镜（当插入反射镜时）
[0202] 54 输入透镜上的聚焦环
[0203] 55 壳体
[0204] 56 用于对准准直输出光纤的显微操纵器
[0205] 该开关本身实质上是电机驱动的平面‘标记’反射镜52，其使射束从其针对共焦通道的普通直通路径通过90度偏转到FRAP通道。普通的准直器筒终端连同用于对准的显微操纵器56将光耦合到每个输出光纤中。
[0206] 在该基本配置中，为了实现良好的可再现透射效率，该开关反射镜角必须能够敏锐地再现。根本原因是此时激光束通常具有低于0.5毫弧度的发散度，并且紧密耦合到光纤中需要将角对准保持在大约该角的1/10内。通过提高反射镜区域中的发散度来解决这个问题。为此，在输入端处使用聚焦透镜50并且在每个输出端处使用准直透镜51、53。特别是对于直通模式下的共焦观察而言，透射效率需要非常高，并且因为来自激光源的输入激光束的确切特性略微不确定以及透镜的焦距无法精确控制，所以在输入透镜上存在着螺钉动作聚焦调整装置54。
[0207] 电机26’是具有旋转编码器27’的直接驱动DC型电机，其在大约90度间隔的两个止端之间操作反射镜。驱动控制是放置在本地的电子卡，其具有微处理器来控制和监视加速度。工作原理是全速加速45度，然后是相等并且相反的减速，以使得反射镜相对缓和地到达其止端，而不会反弹太多。然后，有效的保持电流使反射镜相对于适当的止端偏置。注意，该力还使轴承偏置为可再现的配置，从而消除侧向轴承间隙。保持电流的大小对于FRAP输出配置中的反射镜角度的可再现性是很关键的。
[0208] 用户需要要求从FRAP模式到观察模式的优化切换，并且因为从射束中移除反射镜比将其准确放置在止端上可能更快，所以将FRAP通道与该90度配置耦合。所需的切换时间在50毫秒以下，但是电机能够在10毫秒以下清除射束。返回切换时间不那么重要并且在20-30毫秒范围内。
[0209] 需要光开关来将来自自由空间激光器或者准直单模光纤的单模激光辐射耦合到两个可替换输出端之一，每个输出端都是准直单模光纤。这种系统中用以获得良好转移效率的对准条件通常是非常严格的。例如，来自市售单模激光器的典型光束具有大约1毫弧度的发散度，并且为了保持良好的耦合效率，射束与准直光纤的对准必须为该角度的大约1/10或者大约30弧度秒。在机械系统中保持这种准确度是困难的：例如，30弧度秒的射束偏差对应于长度为10mm的旋转反射镜中的仅0.5微米的偏转。
[0210] 通过提高激光束的发散度，能够提高角度失准的容差。然而，与这种提高相关联的是，由于单模激光束的受衍射限制的性质而必须降低射束直径。因此，不能无度地提高射束发散度，否则射束横向定位的容差将变得难以控制。
[0211] 因为市售单模激光束和准直光纤似乎在大约1mm的直径附近调整，所以已经设计出一种光学方案，其提高光开关内的相关发散度，但是为了方便使其在输入端和输出端处未改变。输入透镜50和输出透镜51共同构成了中继器，其将输入相对未改变地转移到输出，但是将该开关内的射束聚焦在接近于反射镜的点。这减少了对于该开关内的角度失准的敏感度，从而使电动反射镜52的机械设计容易得多，这样当输出端通过透镜53转向时，能够保持良好的效率，而不用顾及反射镜位置的任何微小误差。
[0212] 输出光纤对准仍然不变，因此仍需要灵敏的机构，例如在直接输出端上所示的并且通常也存在于可替换的输出端上的4调整显微操纵器56。在‘直通’耦合效率是最重要的应用中，为了对其进行优化，并且补偿构造尺寸的任何变化，可以在简单的螺钉聚焦机构54内包含输入透镜。
[0213] 取代上述的光开关配置，可以利用基于铁电偏振旋转器和偏振分束器的开关来实现其功能。可替换地，能够采用具有45度反射镜的压电激励精密球形滑片（piezo-actuated precision ball slide）。
[0214] 电子器件
[0215] 现在描述用于在三个轴上控制样本周围的激光束的硬件实施方式。可以在感兴趣的区域周围以预定义的形状或者徒手（freehand）操作（FRAP）来引导光束。还陈述了对X、Y轴和激光器接通/断开的并行控制，以及非常具体的形状图。
[0216] 系统说明
[0217] 该系统的主要部件是控制单元（同步器114）、光学单元70（其包括目标照射模块100）、激光器108和PC 112（参见图25）。还可以由同步器来控制该显微镜系统的其他部件。
[0218] 该控制单元包括以下硬件（参见图26）：
[0219] ·与PC的接口，在Cypress FX2 USB微处理器设备72（USB2.0接口）周围。
[0220] ·由Spartan 3 FPGA设备74驱动的图案绘制引擎（FRAP）。
[0221] ·用于驱动两个检流计而增加的双DAC 76。
[0222] ·将能够读回检流计位置的串行4通道ADC 78。
[0223] ·用于控制七个光开关（未示出）的附加硬件。
[0224] ·激光器控制硬件80。
[0225] ·用于存储激光器（LASER）事件的SRAM 82。
[0226] ·用于存储检流计（GALVO）矢量（运动）的SRAM 84。
[0227] ·用于存储实验状态（STATES）的SRAM 86。
[0228] 在该系统的工作过程中：
[0229] 1. 用户在其PC屏幕上限定他希望在生物样本周围“利用激光束绘制”的形状。
[0230] 2. 将该区域“转变”（在应用软件中）为检流计矢量、激光器事件和控制（CONTROL）命令。该检流计矢量提供移动检流计电机（检流计）所需的DAC值。激光器事件提供激光束的通/断（ON/OFF）图案。
[0231] 3. 将以上信息下载（利用USB2.0）到控制单元。
[0232] 4. 遵循该控制命令的FPGA通过移动检流计电机同时接通/断开激光束来绘制图案。
[0233] FX2 uProcessor（u处理器）72在PC 112与控制单元114之间提供桥接。其还负责运行存储在状态存储器86内的实验。典型的实验将包括在样本的不同区域中绘制不同图案。
[0234] 将检流计矢量存储在检流计存储器84内，将激光器事件存储在激光器存储器82内，并且将控制命令存储在命令存储器88内。
[0235] FPGA 74从外部存储器读取矢量和激光器事件，然后驱动检流计并且使激光引擎同步。
[0236] 绘制图案
[0237] 激光束分别落到安装在具有X和Y控制电机90和92的两个检流计中的两个反射镜8、12上（参见图27）。通过独立地移动这两个反射镜，能够在两个轴上控制激光束的反射。
[0238] 理论上，使激光束连续接通能够准确地绘出任意形状。实际上这是不可能的，因为电机具有阻止其立刻改变方向的惯性。例如，考虑绘制方形；图28中的粗线94是激光束的理论路径，细线96是在驱动两个电机的情况下射束遵循的实际路径。检流计不能在点A、B、C和D处立刻改变方向，并且这就是射束路径与粗线不相同的原因。
[0239] 克服这个问题的一种方式是在超过了理想线的点（A、B、C、D）处断开激光束，并且在其返回到理想路径上时接通激光束。因此在图29中的虚线98处，激光束断开，并且当检流计处于理想位置时再次接通。
[0240] FPGA
[0241] FPGA 74的主要功能是驱动两个电机和激光器通/断事件。同时其用作用数据填充检流计和激光器存储器的桥接器（bridge），并且最重要的是在工作（图案绘制）过程中使（命令结构引擎）两个主要的引擎（检流计、激光器）同步。
[0242] 图30表示了与FPGA相关联的主要功能块，并且在以下进行描述。
[0243] 检流计引擎
[0244] 检流计引擎120通过设置双DAC 76的值来控制两个检流计电机。当其运行时，其从外部存储器读取矢量并且将这些值提供给DAC。当其读取了全部矢量（针对特定图案）时，其生成至微处理器72的中断信号。每个矢量需要三个字。因此，检流计引擎必须在其更新DAC之前三次读取外部检流计存储器。
[0245] 检流计存储器结构
[0246] 检流计存储器84用于存储X和Y矢量。首先，微处理器72用矢量来填充检流计存储器，然后，在FRAP周期期间，检流计引擎120读取矢量并且以预定义值来加载DAC 76。
[0247] 需要三个字来描述一组X和Y移动。第一字是该矢量的步进（step）数量。X和Y检流计将执行相同数量的步进和不同数量的DAC水平。第二和第三字限定了X和Y检流计的DAC水平的数量以及符号。
[0248] 存储器结构能够从任意的存储位置开始。用户能够通过使用命令结构中的指针指令（加载指针X）来限定起始地址（针对特定的FRAP周期）。这样，检流计存储器能够包含不同的FRAP区域，因此用户能够通过加载相应的指针来选择对哪个区域进行FRAP。
[0249] 激光引擎
[0250] 激光引擎122控制8个激光器的通/断状态。该引擎从外部存储器（激光器存储器82）读取事件，并且其相继地执行这些事件。激光引擎必须在其能够接通/断开激光器之前从激光器存储器读取两个字。
[0251] 激光器存储器结构
[0252] 激光器存储器82与检流计存储器84在物理上不同，并且用于存储激光器事件。微处理器将这些事件存储在激光器存储器中，然后激光引擎加载这些事件并且相应地接通/断开激光器。该激光器存储器具有以下结构：
[0253] ·停止操作的位模式（数据结尾），如果不存在则其照常继续进行。
[0254] ·在激光器事件之间定时的定时器。
[0255] ·控制激光器通/断状态的位模式。
[0256] 存储器接口
[0257] 存储器接口块124负责在FPGA 74与微处理器72之间的连接。该过程负责：
[0258] ·对检流计存储器84的存取
[0259] ·对激光器存储器82的存取
[0260] ·对状态存储器86（该存储器用于存储复杂实验的状态）的存取
[0261] ·对命令存储器88（其是FPGA存储器的内部存储器，将在后面进行讨论）的存取[0262] 命令结构引擎
[0263] 当微处理器启动FRAP周期（绘制图案）时，命令结构引擎块126接管对操作的控制。首先，其读取存储（通过PC下载）在内部RAM（命令存储器88）中的命令，然后相继地执行这些指令。存在七个能够用于使激光器与检流计引擎120、122同步的命令。
[0264] GALVONOW
[0265] GALVONOW命令将值加载到检流计X (DAC)以及将值加载到检流计Y (DAC)。这两个检流计都将到达绝对位置。用户能够添加所需的延迟（DELAY）以留出检流计的设置时间。该延迟命令应当总是在GALVONOW命令与STARTFRAP命令之间使用。
[0266] LASERNOW
[0267] LASERNOW命令用于启用或者禁用激光线（laser line）。该命令控制AOTF激光器启用。FPGA仅仅在FRAP周期期间驱动激光器启用。其它时间由微处理器驱动激光器启用。
[0268] LOAD POINTER X（加载指针X）
[0269] 该命令将把存储器（检流计）地址指针提供给检流计引擎。当执行STARTFRAP命令时，检流计引擎将读取（从外部检流计存储器）从该位置开始的矢量。
[0270] LOAD POINTER LASER（加载指针激光器）
[0271] 该命令类似于LOADPOINTERX。将指针加载到激光引擎。当执行STARTFRAP时，激光引擎将从该位置读取数据（从外部激光器存储器）。
[0272] START FRAP（开始FRAP）
[0273] 该命令将启动FRAP周期。检流计引擎将在其停止之前执行来自检流计存储器的多个矢量（将‘矢量的数量’存储在该命令中）。
[0274] STOP FRAP（停止FRAP）
[0275] 应当在命令结构存储器块结束时并且在START FRAP命令之后立刻使用该命令。这两个命令共同启动和终止FRAP周期。
[0276] DELAY（延迟）
[0277] 该命令将在执行FRAP周期的过程中添加延迟。其能够被用于在GALVONOW命令执行之后留出检流计电机的设置时间，以及还用于激光器与检流计引擎之间的同步。
[0278] 实例：
[0279] 以下的实例是典型图案周期，并且其示范了内部命令结构存储器块的使用。
[0280]
[0281] FPGA实施方式
[0282] 执行的速度
[0283] FPGA的体系结构允许并行执行两个主要过程，检流计和激光引擎。因为它们独立工作，所以它们能够实现高速操作。因此检流计能够每10us更新一次，同时激光引擎能够在100ns之内从通状态变为断状态。
[0284] 下载过程中的灵活性
[0285] 激光器和检流计引擎的独立外部存储器允许用户非常快地仅修改矢量或者激光器事件，即如果用户希望绘制相同的形状/图案，但是仅改变激光器事件，则他不必重新下载图案的矢量。他能够仅更新激光器存储器。因此，用户的获益是非常快的操作。
[0286] cFRAP过程中的灵活性
[0287] 使用GALVONOW命令，用户能够将检流计移动到屏幕的任意点。因此，为了在生物样本周围绘制方框，必须下载激光器事件、检流计矢量和命令存储器。然后，微处理器启动FRAP周期（图案绘制）。如果样本移动，并且希望重新绘制其周围的区域，则不必重新填充上述存储器。仅使用GALVONOW命令更新图案的起始位置，并且启动FRAP周期。这允许其中用户/应用软件能够非常快地监视和FRAP任何生物样本的cFRAP。
[0288] 命令结构中的延迟命令
[0289] 该设计中的两个主要引擎彼此独立地工作，因此在启动过程中必须使其同步。因此，尽管存在来自检流计引擎的用于启动激光引擎的内部信号，但是在该设备内仍然存在必须在工作过程中进行补偿的传播延迟。这是利用延迟命令来实现的。该延迟命令不仅为检流计电机给出了移动到（在GALVONOW期间）指定位置的足够时间，而且用户能够消除该系统的传播延迟时间。因此，利用一个命令就消除了检流计/系统惯性和FPGA的传播延迟时间。
[0290] 检流计校准软件
[0291] 本文中描述的显微系统包含两个光学系统。一个系统（共焦头）用于对样本进行成像；另一个（FRAP模块）照射样本的选定区域。所希望的是照射由样本像（WYSIWYG）指定的样本区域，因此希望具有一种使这两个光学系统中的坐标相关的方法。
[0292] 通常，可以将线性模型用于坐标变换。例如，其可以解决偏移、缩放和旋转。然而，光学器件中还存在其他畸变，例如枕形或者筒形畸变。显著的未建模的畸变导致了光学系统的不良对准。其影响是该系统不可能准确地照射样本的特定区域。
[0293] 本发明人已经研发了一种使光学系统准确地对准的非线性模型。在该模型中，根据以下方程，二阶多项式将像点（x,y）扭转为检流计点（u,v）：
[0294]
[0295] 参数a1,1和a1,2控制u和v坐标的零点偏移；参数a2,1到a3,2控制轴的线性缩放和旋转；其他的二阶参数基本解决了观察系统和照明系统这二者的光学器件中线性度的任何轻微偏差。具有不同系数的类似方程组将产生相反的坐标变换。
[0296] 通过记录该观察系统中在预选的检流计坐标处被照射的最少六个点的位置，能够求解联系这些系数值的联立方程。利用多于六个点，优选是均匀分布在视场周围的点，能够应用公知的线性最小二乘法拟合方法来生成这些系数的最佳拟合值。
[0297] 校准步骤
[0298] 1 将分束器16和校准反射镜插入观察射束中。
[0299] 2 将开关反射镜52插入激光束中以将射束引导到目标照射模型。
[0300] 3 将检流计反射镜旋转到至少6个预设电驱动条件之一。
[0301] 4 如果需要则接通激光束，并且利用系统照相机来记录激光光斑的像。
[0302] 5 确定光斑中心的像素位置（例如利用其重心或者高斯峰值拟合）。
[0303] 6 针对近似均匀分布在视场周围的至少另外5个预设检流计位置重复步骤2到5。
[0304] 7 使用标准数学技术求解系数a的联立方程。对于精确确定的情况（6个位置）使用消去（elimination）；对于超定的（overdetermined）情况，这是优选的（多于6个位置），使用最小二乘法（求解‘标准方程’）。
[0305] 可以理解，本文中所提及的透镜包括组合使用多个透镜或者用于相同用途的多元透镜（multicomponent lens）。
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