1.技术领域

本发明涉及一种制定中草药、中成药、中药保健品色谱指纹图谱的方法，具 体地说是利用色谱分离和分析技术，对所得到的数据进行特殊的处理，以制定出 兼容性良好的中药色谱指纹图谱。本发明还涉及中药天麻指纹图谱的制定。

2.背景技术

中药指纹图谱技术所采用的手段有色谱技术、光谱技术、核磁共振技术及生 物技术等，其中以色谱技术最为常用和可靠。当前，由于高效液相色谱仪器的普 及，其已经成为中药指纹图谱制定中的核心设备。

由于中药指纹图谱能够客观的、全面的反应药物的内在质量，在评价中药的 真伪优劣时能够发挥重要作用，体现中药成分复杂的特点，所以，国家规定所有 中药注射液的原料药材及其半成品和成品，都必须制定相应的指纹图谱。随着中 药材GAP生产基地的建设和饮片批准文号管理制度的实施，以及人们对中药知 识产权的重视程度的提高，都极大地刺激了对中药指纹图谱的需求。

中药指纹图谱的制定包括下列几个环节：

(1)样品采集

采集10批有代表性的样品，对所采集的样品要做到定品种、定产地、定采 收季节、定药用部位和定加工方法。

(2)色谱分析

对所采集的样品，根据实验结果，采取适当的方法制备成样品供试液，并选 用适当的标准对照品，进行色谱条件的优选。将选得的适当分离方法，用于10 批样品的测定，并进行重现性、精密度、稳定性、加样回收等方法学研究。

(3)数据处理

对以上10批样品经适当方法进行分离分析所得到的数据进行处理，形成共 有模式。

以上环节中，样品采集和色谱分析基本上有章可循，针对不同样品采用不同 方法，而数据处理这一环节是制约中药指纹图谱发展和普及的瓶颈技术。

目前，尚无得到公认的可用于中药指纹图谱数据处理的软件或方法。现有的 几种软件都存在着数据导入繁琐、结果可信度不大、同类但不同厂家生产的色谱 仪器所产生的数据之间不兼容，即用根据Agilent HPLC仪产生的数据制定的指 纹图谱，在用以鉴别样品时，也必须用Agilent HPLC仪来产生数据，而且要保 证两台仪器的相关参数完全一致才能进行。这种对不同仪器产生的数据的不兼容 性，引来了很多知名专家的强烈质疑，并一直阻碍着中药指纹图谱的发展。因为 这多少意味着，为了推广中药指纹图谱技术，最好全国所有单位，无论大小，都 使用同一厂家同一型号的仪器。这种仪器垄断目前是不可能的，也不利于将来可 能的国产色谱仪器的开发生产。

因此，开发出一种兼容性良好、可操作性强、易于普及推广、能够获得国际 认可的指纹图谱数据处理方法已成当务之急。

3.发明目的

本发明是为了解决中药指纹图谱的通用性问题，并对用标准中药指纹图谱来 评价目标样品的真伪和品质优劣方法做出规范。本发明的另一目的是为了制定中 药材天麻的HPLC指纹图谱。

4.发明内容

本发明的目的在于提供一种通用的中药色谱指纹图谱的制定方法。其特征在 于其特殊的数据处理方法和样品评价方法，以用来对各种类型的色谱仪器产生的 色谱数据进行处理，制定出在同类型仪器(如高效液相色谱仪或气相色谱仪或高 效毛细管电泳色谱仪)但不同厂家或型号的产品(如Agilent1100，Waters 515， Shimadzu 10A或未来的国产什么品牌)之间兼容性能良好的中草药、中成药或 中药保健品的标准色谱指纹图谱，或根据标准指纹图谱对目标样品进行真伪及优 劣的判别。

本发明的另一目的是根据中药指纹图谱制定的样品采集要求，按照上述发明 的数据处理方法，制定了中药材天麻的HPLC指纹图谱。

本发明关于中药指纹图谱的制定是由如下几个环节组成的：

(1)样品采集

根据中药指纹图谱制定的样品采集要求，对所要研究的中药材样品，选定品 种、产地、药用部位、采收季节、加工方式，采集有代表性的10批次以上样品。 对中成药或中药口服液的中间体或成品，收集10批样品，供实验之用。

(2)色谱数据的采集

查阅文献，根据样品中所含有的化学成分的性质，选用合适的色谱仪器 (HPLC或GC或HPCE)，包括合适的检测器。按照色谱分离方法学研究的一般 做法，对样品提取溶剂(特殊样品可用极性大小迥异的两种溶剂分段提取，以制 备两张指纹图谱)、提取方式、提取时间进行优选。如用的是紫外检测器，则要 选择合适的波长，这可结合样品图谱中的色谱峰多少、响应值大小、分离度好坏 等方面的因素综合考虑。若有标准对照物，可用其作为样品供试液制备及色谱方 法优选的参照物。一般首选梯度洗脱的方法(GC用程序升温的方法)，以使得 保留性能不同的组分先后都能被洗脱。每针要运行足够的时间(一般为60分钟 左右)，以保证保留时间大的组分的色谱峰能够被图谱记录。其中要提供一张120 分钟的全谱。要对系统适应性、样品稳定性、方法重现性、标准物质的加样回收 率进行考察。用优选的方法，对各样品供试液进行色谱分析，得到各组数据。其 中要剔除不符合《中国药典》有含量规定的样品和相应峰面积离群的样品。

(3)数据的处理

用第一个峰面积大于总峰面积5％的分离较好的非溶剂峰(保留时间较后 续参选峰小)作为基准1，称其为基准峰或参比峰，后续峰面积大于5％总峰面 积的峰称为参选峰，逐个除以基准峰，得到指纹图谱保留时间比率的一组数据， 对各样品的相应的保留时间比率求平均数和方差。

用基准峰的峰高作为1，后续参选峰逐个除以基准峰高，得到指纹图谱峰 高比率的一组数据，对各样品的相应的峰高比率求平均数和方差。

本发明的重要特点之一是上述中药色谱指纹图谱制定中的数据处理技术。

(4)中药色谱指纹图谱的制定

标准的中药色谱指纹图谱应当包括：原植物学名，包括拉丁名，产地，原药 材的照片，样品供试液的制备，标准对照品溶液的制备，进样体积，色谱条件(包 括色谱柱、柱温、波长、流动相、梯度洗脱条件或程序升温条件)，相关图谱(包 括具有代表性的样品色谱图谱和对照品色谱图谱)，用于评判目标样品真伪优劣 的两组数据，即用来判定目标样品真伪的保留时间比率平均数和方差及用来评价 目标样品品质优劣的峰高比率的平均数和方差。此外，还要附加使用说明及知识 产权的申明。

(5)中药指纹图谱在对目标样品真伪优劣评价时的应用

首先，对目标样品进行具有代表性的取样，平行三份。按照标准指纹图谱提 供的方法制备样品供试液和对照品溶液，用与其相同的色谱条件进行色谱分析， 对于色谱仪器，同类即可，不要求同一厂家。选取其中任一样品供试液，连续进 样五次，以考察系统适应性。将所得到的图谱与标准图谱比对，以确定参比峰和 参选峰。用对照品来确定参比峰与参选峰是否顺序与标准图谱一致。将三份样品 的参比峰与参选峰的保留时间比率及峰高比率分别进行平均。所得到的保留时间 比率的平均数与标准指纹图谱提供的保留时间比率的平均数两组数据进行相关 分析(可用Excel或SPSS软件处理)，其相似度应该大于或等于0.99。因为不 同的色谱峰反映的是中药中所含化学成分的信息，不同的化学成分，由于其极性 大小不同，其在固定相上的容量因子k值就不同，从而在色谱柱上得以分离，表 现为在不同的保留时间出现色谱峰。因此，化合物色谱峰的保留时间常被用来对 其进行定性鉴别。利用目标样品的保留时间的比率与标准图谱的保留时间比率进 行相关分析，从其相似度大小可知前者是否来自后者所代表的某一集合，即目标 样品的真伪。本法用保留时间的比率来进行相关分析，这样就克服了不同仪器由 于压力、死体积、比例阀或混匀效率的差异而带来的色谱峰保留时间的较大变化。 主要由流动相和固定相种类及温度决定的保留时间在不同的仪器上会发生成比 例的整体变化，这样，用保留时间的比率进行比较，就消除了这种由机器带来的 误差，从而使得不同仪器产生的数据之间的比较成为可行。

将三份样品的相应峰高比率的平均数与标准指纹图谱的峰高比率数据进行 相关分析。因为不同来源样品，其中化学成分的含量变化较大，所以对其相似度 作适当的放宽，但相似度要大于0.9。之所以用峰高比率来代替峰高或峰面积或 峰面积百分数，是因为不同仪器所匹配的色谱工作站使用的单位不同，积分方式 不同，手动进样和自动进样之间也有误差，最终导致数据大小相差很大，无法比 较。同时，在某型号仪器上制定的分离很好的色谱峰，到另外一台仪器上可能达 不到基线分离，所以峰面积百分数也会产生误差。用峰高比率就很好地解决了指 纹图谱在不同仪器上的适用性问题。可根据峰高比率与标准指纹图谱相应数据的 大小的比较，来判定中药品质的优劣。具体方法如下：

根据Beer-Lambert定律，一定浓度的某一物质，在一定波长的紫外光照射下， 其吸收值是一定的，即响应值是一定的。因此，可以假设参比峰与对照品峰的响 应因子为1。在制定标准指纹图谱时，先计算出每毫克对照品相当于多少峰面积， 推知参比峰所对应的假定的参比物的平均量。在评价目标样品时，也同样计算出 参比物的假定量，并与标准指纹图谱的平均量进行比较，从而得知其量的多少。 用目标样品中参比物的假定量除以标准图谱的平均量，用其倍数乘以各参选峰的 比率，所得数据与标准指纹图谱相应的数据进行比较，就能够知道其质量的优劣。

这其中，真伪判别是首要的，因此，在运用指纹图谱来评价目标样品的质量 时，应该遵从保留时间优先的原则。

此处公布的利用标准指纹图谱来对目标样品进行真伪和优劣的评价的方法， 也是本发明的重要特色之一。

本发明的另一项内容是天麻药材指纹图谱的研究，具体如下：

取10批天麻样品的干燥60目粉末，各取0.5g，置10mL容量瓶中，加60％ 甲醇溶液约9mL，超声提取50min，放冷至室温，用上述甲醇溶液定容至刻度， 摇匀，静置2h，上层液体3000转/min离心15min，上清液用0.45μm的微孔滤 膜过滤，滤液直接进样，进样量5μL。色谱条件是C18柱，柱温25℃，吸收波 长为226nm，流动相A为0.1％磷酸水溶液，B为0.1％磷酸甲醇溶液，梯度洗脱， 0～15min，B％为0～2％；15～60min，B％为2～45％；60～65min，B％为45～0％。 相关图谱参见说明书附图，相关数据如下表所示：

          天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表( X±SD)

          参比峰   参选峰1   参选峰2    参选峰3    参选峰4    参选峰5

平均数    1        1.20045   2.114194   2.624787   2.760324   2.995108

SD        0        0.012101  0.037116   0.049847   0.052631   0.057884

          天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表( X±SD)

          参比峰   参选峰1    参选峰2    参选峰3    参选峰4   参选峰5

平均数    1        0.207245   0.893879   1.197732   0.844632  0.705542

SD        0        0.075612   0.20124    0.129653   0.085216  0.068497

5.具体实施方式

实施例

                天麻药材指纹图谱的制定及对样品的评价

【植物来源】本品为兰科植物天麻Gastrodia elata.B1.的干燥根茎(见图1)。

【样品采集】2003年11月8日至12日，赴天麻主产地之一，安徽省金寨县燕 子河乡等10个乡镇，采集了10批新鲜天麻的根茎，时值当地天麻的采收季节。

【样品加工】将上述采集的10批样品，分别抢水洗去泥沙，置沸水上加盖隔水 蒸制2h。取出，晒至八成干时切片，晒干。

【参照物溶液的制备】精密称取天麻素对照品适量，加甲醇制成1mL含0.507mg 的溶液，作为对照品溶液。

【样品供试液的制备】将上述各样品饮片，置烘箱内60℃干燥4h，取出，放冷 至室温后，粉碎，过60目筛，四分法取样。准确称取上述样品0.5g，置10mL 容量瓶中，加60％甲醇溶液9mL，超声提取50min，取出，放冷至室温，60％甲 醇溶液定容至刻度，摇匀，静置2h，上层液体离心15min，3000转/min。取上 清液用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液直接进样，进样量5μL。

【色谱条件】仪器：Agilent1100四元泵全自动进样液相色谱仪。色谱柱： Lichrospher C18柱，5μm，250×4.6mm；柱温：25℃。流动相A：0.1％磷酸 水溶液；流动相B：0.1％磷酸甲醇溶液，梯度洗脱，0～15min，B％为0～2％； 15～60min，B％为2～45％；60～65min，B％为45～0％。流速：1mL·min-1；DAD 检测器，检测波长为226nm。参比波长：360nm。化学工作站：A08.03，斜率： 5；峰宽：0.05min；最小峰面积：5mAU·s；最小峰高：1mAU。理论板数按 天麻素峰计算应不低于3500。

参照中国药典2000年版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合指纹图谱的 要求进行测定。

【图谱】所产生的相关图谱参见附图中的图2和图3。

【色谱峰的选择】将天麻药材各样品图谱中保留时间最小的，峰面积大于5％总 峰面积，分离较好的色谱峰作为参比峰或称基准峰，此处实为天麻素的色谱峰。 后续峰面积大于总峰面积的5％的色谱峰作为参选峰。参比峰与参选峰顺次编号， 参比峰定为1号峰。大于5％总峰面积的色谱峰个数不会超过20个。

【数据处理】平均保留时间比率数据的获得：将参比峰的保留时间作为1，其余 参选峰的保留时间逐个除以参比峰的保留时间，所得到的比率按照编号顺次列入 表内，计算每个样品相应编号峰的平均保留时间比率及方差，如下表所示：

         天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表( X±SD)

          参比峰    参选峰    参选峰     参选峰    参选峰      参选峰

          1         2         3          4          5          6

平均数    1         1.20045   2.114194   2.624787   2.760324   2.995108

 SD       0         0.012101  0.037116   0.049847   0.052631   0.057884

平均峰高比率数据的获得：将参比峰的峰高作为1，其余参选峰的峰高逐个 除以参比峰的峰高，所得到的比率按照编号顺次列入表内，计算每个样品相应编 号峰的平均峰高比率及方差，如下表所示：

        天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表( X±SD)

         参比峰    参选峰     参选峰    参选峰     参选峰     参选峰

          1        2          3         4          5          6

平均数    1        0.207245   0.893879  1.197732   0.844632   0.705542

SD        0        0.075612   0.20124   0.129653   0.085216   0.068497

至此，天麻药材标准指纹图谱的研制已经完成。

综上所述，完整的中药色谱指纹图谱应该包括下列几个方面：

(1)物名称(包括拉丁名)和药用部位；

(2)材产地和加工方法；

(3)相关图谱：原药材的照片、标准品的色谱图、具有代表性的样品的色 谱图；

(4)样品供试液及对照品溶液的制备方法及进样体积；

(5)色谱条件：色谱柱、柱温、波长、流动相、流速、HPLC的梯度洗脱 条件或GC的程序升温条件、运行时间；

(6)标准数据：平均保留时间比率加方差及平均峰高比率加方差；

(7)使用说明及知识产权申明。

为了证明上述用Agilent1100HPLC仪制定的天麻药材的指纹图谱的通用性， 特安排用常见的另外两种HPLC仪器进行了验证，即Waters515和Shimadzu10A HPLC仪。

用Shimadzu10A HPLC仪进行的验证：

样品供试验液的制备及色谱条件同天麻指纹图谱所提供的方法，进行色谱分 析。得到的样品及标准品色谱图参见图4和图5。对所得到的数据按照本发明所 制定的方法处理后如下：

                    样品保留时间比率数据表

            参比峰  参选峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰

峰号

            1       2         3         4         5         6

保留时间

            1       1.135075  1.941408  2.332722  2.448788  2.621612

比    率

          天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表( X±SD)

          参比峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰

          1         2         3         4         5         6

平均数    1         1.20045   2.114194  2.624787  2.760324  2.995108

SD        0         0.012101  0.037116  0.049847  0.052631  0.057884

所得到样品保留时间比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱保留时间平均 比率在Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.998754。

                   样品峰高比率的数据表

          参比峰   参选峰   参选峰    参选峰    参选峰     参选峰

峰号

          1        2         3         4         5         6

峰高比率  1        0.106817  0.789209  1.178913  0.643444  0.650626

          天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表( X±SD)

          参比峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰

          1         2         3         4         5         6

平均数    1         0.207245  0.893879  1.197732  0.844632  0.705542

SD        0         0.075612  0.20124   0.129653  0.085216  0.068497

所得到样品峰高比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率在 Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.982696。

用Waters HPLC仪进行的验证如下：

样品供试验液的制备及色谱条件同天麻指纹图谱所提供的方法，用 Waters515HPLC泵，Millennium色谱工作站进行色谱分析。得到的样品色谱图参 见图6。对所得到的数据按照本发明所制定的方法处理后如下：

                    样品保留时间比率数据表

          参比峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰

峰号

          1         2         3         4         5        6

保留时间

          1         1.141998  2.007957  2.428077  2.54142  2.749207

比    率

          天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表( X±SD)

          参比峰    参选峰    参选峰     参选峰    参选峰    参选峰

          1         2         3          4         5         6

平均数    1         1.20045   2.114194   2.624787  2.760324  2.995108

SD        0         0.012101  0.037116   0.049847  0.052631  0.057884

所得到样品保留时间比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱保留时间平均 比率在Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.999668。

                    样品峰高比率的数据表

            参比峰  参选峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰

峰号

            1       2         3         4         5         6

峰高比率    1       0.068525  0.672982  1.460918  1.103939  0.969475

          天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表( X±SD)

          参比峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰    参选峰

            1       2         3         4         5         6

平均数      1       0.207245  0.893879  1.197732  0.844632  0.705542

SD          0       0.075612  0.20124   0.129653  0.085216  0.068497

所得到样品峰高比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率在 Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.967993。

6.本发明的积极效果

以上实验证明，本发明所制定的中药色谱指纹图谱在同类不同厂家的仪器之 间有很好的适应性，为通用指纹图谱。这种兼容性不仅对现有仪器设备打破可能 产生的垄断有利，也为将来国产仪器的研究开发留下了一条技术后路。按照本发 明的方法，可以对某种中药的指纹图谱制定后印刷销售，也可制成软盘或光盘或 在线销售。

通用性和易于推广普及是本发明的最大特点。