发明领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，更具体地讲，涉及应用反义寡核苷酸控 制CD44的表达。

      发明背景

CD44是一族由许多种不同细胞表达的多形性膜糖蛋白。能够找到 CD44的细胞有许多，如循环淋巴细胞，它作为一种淋巴结归巢受体，上 皮细胞，它参与细胞和细胞间的相互粘附(1)。在肺、上支气管基底细胞、 肺泡巨噬细胞、肺泡淋巴细胞和活化的肺泡II型细胞上也可以找到 CD44，在这些细胞上它同样参与细胞和细胞间的相互粘附(2)。CD44 有一个高亲合力结合部位作为透明质酸盐(hyaluronan)的受体，CD44与 透明质酸盐的相互作用可使细胞锚定在某个部位(3)。

CD44在单个细胞中可表达为两种或两种以上的变异体，可能因为细 胞的需求不断变化。这些变异体的多形性变化源自对CD44 mRNA的可 变剪接，即CD44基因的各种编码序列(外显子)以不同的组合被转录(被 表达)。CD44剪接变异体的蛋白产物(同种型)在大小(从110KDa到大于 250KDa)和功能上差别很大。已知CD44蛋白的胞外功能区参与细胞和 细胞间的相互粘附以及与胞外基质成分包括透明质酸、纤连蛋白和胶原 蛋白等相结合，而CD44的胞内功能区与在依赖CD44的细胞迁移中起 重要作用的细胞锚定骨架蛋白相结合。CD44还被发现在造血和淋巴细 胞进入外周循环中起一定作用(4，5，6)。CD44的各种功能引起了人们极 大的兴趣，因为它们可以用来解释活化的淋巴细胞和转移性肿瘤细胞所 具有的相似的行为。这两种细胞都有相对较高水平的CD44的表达，而 且都有浸润性行为，能进行细胞迁移，其中包括可逆性粘附，能在淋巴 组织中集结和扩散，以及能释放入外周循环(6)。CD44与淋巴组织的关 系尤其有趣，因为淋巴细胞和转移性肿瘤细胞都是通过CD44的变异体 与特异性配体相结合，而这种配体要么存在于淋巴结的胞外基质上，要 么存在于淋巴组织中的树突状细胞或其它细胞的表面。并且，随着淋巴 细胞和肿瘤细胞在淋巴结中的生长和分化，它们都同步释放入外周循环 的输出淋巴管。释放时在淋巴细胞和肿瘤细胞之间，胞外基质成分和周 围细胞之间发生一系列复杂的相互作用，可能还需要粘附受体、蛋白水 解酶、生长因子和生长因子受体的参与。这些过程可能依赖对CD44分 子进行修剪，释放过程的特异性是由与CD44同种型相互作用的组织特 异性配体介导的。因此，CD44在恶性细胞中的表达是使肿瘤能够原位 生长、局部浸润和有转移倾向的一个重要因素(7，8，9)。

人基因组CD44基因座位于染色体11p13(10)。最近，人CD44基因 的大部分基因组结构已经搞清(11)。在大约60千碱基(Kb)的长度上，分 布着至少20个外显子。这些编码序列中有十个(外显子1-5和16-20) 是用于编码标准型CD44的。在外显子5和16之间，至少又有十个外显 子，它们常用来进行可变剪接(外显子6-15)。在人类，如同在其它物 种，CD44基因也编码许多可变剪接的蛋白，它们有不同的大小和功能。 到目前为止，已有数种CD44同种型被纯化和鉴定，其中有一种80-90 KDa的糖蛋白，称其为“标准型”或“造血型”同种型(CD44 S)；另一 种180KDa或分子量更大的糖蛋白，称其为“上皮型”或“变异型”同 种型(CD44v)。对编码标准型和上皮型同种型的cDNA克隆进行分离和鉴 定表明除了上皮型有额外的134个或更多个氨基酸以外，蛋白质序列是 一致的，而这些氨基酸是由至少十个编码胞外功能区的外显子(V1-V10) 编码的；此外，上皮型同种型的糖基化程度更高(12，27)。虽然现在已 经公认CD44标准型在控制细胞迁移上扮演着关键的角色，但还不知道 在大多数细胞类型中占优势的CD44可变剪接变异体的确切功能。

文献对CD44的表达，无论是以标准的还是以变异的形式，是否与 人类肿瘤转移力相关这个问题尚无定论。譬如，一篇1993年的文献指出 这种相关从未存在(13)。另一方面，人们已经知道表达CD44变异型同种 型水平最高的细胞似乎最易发生恶性转化。这些细胞生长失控，伴随着 CD44的表达以及可能有的其它粘附分子的表达可能使它们更具浸润性 和转移性。还有，大量的研究已经发现了恶性转化或肿瘤转移与CD44 变异型同种型表达之间的相关。例如，一篇1994年的文献提供证据表明 某些CD44变异体可能帮助介导了人神经胶质瘤细胞的粘附和转移(14， 15)。也有发现揭示子宫颈癌强烈表达由外显子V7和V8编码的表位，而 这些表位在正常宫颈上皮细胞上检测不到(16)。在另一项研究中，在结肠 肿瘤进展的特殊阶段有特异的CD44变异体的过度表达，且表达以前认 为与肿瘤转移相关的CD44v的结肠肿瘤预后不佳(17，18)。

在某些研究中，只有过度表达一些特殊的变异体才和癌症相关。例 如，含外显子V6序列的变异体在某些肿瘤进展的晚期阶段表达，而一些 不含外显子V6序列的CD44变异体在肿瘤发生的最早阶段和腺瘤的早期 表达。对胃腺癌的检查表明CD44v在所有的被检标本中均有表达，其中 肠型腺癌表达含外显子V5和V6的变异体，扩散型腺癌主要表达只含外 显子V5的变异体。正常的胃粘膜在胃小凹增生带和粘液上皮上有外显子 V5的表达(19)。外显子V11已被确认也有同样的表达方式，即与扩散型 癌组织相比它主要分布于分化良好的肠道肿瘤。正常的胃粘膜只有极低 水平的外显子V11的表达。在平均14个月的随访中，CD44的表达与肿 瘤复发、死亡率升高相关。

文献中已有提示：CD44的过度表达有长期的临床意义。一组病人， 其原位乳腺肿瘤的87％和附属淋巴结转移灶的100％阳性表达外显子 V6，整体的低生存率与CD44v表位的表达相关(20，21)。另一组病人 有相似的结果，但其关联随时间延长而减小。在一项对神经胶质瘤的研 究中，通过应用抑制CD44表达的CD44特异的反义寡核苷酸，两种细 胞系的浸润性被高度抑制，五种细胞系的浸润性被完全扼制(15)。

据我们所知，CD44的反义治疗从未应用于人的肺癌、黑色素瘤或 白血病，也从未确立一种或多种CD44变异体与上述任何肿瘤相关。至 于肺癌则问题更糟，因为肺癌至少有两种主要类型：小细胞性肺癌(SCLC) 和非小细胞性肺癌(NSCLC)。SCLC约占四分之一的病例，它表达神经内 分泌的标志物，通常很早就转移到淋巴结、脑、骨、肺和肝；NSCLC占 其它肺部肿瘤的大多数，包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞肺癌。NSCLC 的特点是有上皮样生长因子及其受体且局部浸润。1994年Penno及其同 事报道在非小细胞性肺部肿瘤及肺的鳞状上皮化生中，CD44标准型的 转录和翻译水平均很高，而在肺的小细胞性肿瘤和静止的肺泡II型细胞 中水平很低(2)。

黑素细胞和黑色素瘤细胞已被广泛地作为一种模型用来研究恶性转 化过程中发生的变化，包括寻找在恶变细胞中表达而在正常的黑素细胞 中不表达的基因。黑色素瘤细胞不象黑素细胞，它能够在缺少外源性生 长因子的情况下增殖。这种不依赖性显然反映细胞产生生长因子和细胞 因子作为自分泌性生长刺激因素(22)。

黑色素瘤细胞分泌许多生长因子，包括TGF-α、TGF-β、血小 板衍生生长因子的A链和B链、碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、IL -1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子以及MGSA。这些生长因子，或者 组成型表达，或者在各种细胞因子的诱导下表达，通过作为自分泌性生 长因子或通过调节宿主对肿瘤细胞的反应来促进已转化的黑色素瘤细胞 表型的发展(23，24)。

黑色素瘤细胞若要转移，必须与肿瘤原发灶分离，穿过宿主的基质 进入外周循环，借助血流四处播散，成功到达远端毛细血管床并在此粘 贴、外渗至人器官实质组织中，再增殖成次级生长灶。当肿瘤细胞产生 自分泌性生长因子或对宿主细胞产生的旁分泌性生长因子发生反应时， 肿瘤细胞就可以在远处生长。

约有95％的家族性恶性黑色素瘤和40％散发性黑色素瘤有前体病 灶。黑素细胞病灶有三种类型：先天性痣、获得性痣和发育不良性痣， 先天性痣和获得性痣都是正常的黑素细胞在局部的增殖。相反，发育不 良性痣是由一群异质性细胞组成，包括正常的黑素细胞和表现出色素沉 着增加、核多形性和有丝分裂不典型的黑素细胞，由于这个原因，发育 不良性痣的黑素细胞被认为代表了人恶性黑色素瘤的前体病灶。人黑色 素瘤可以分成三个阶段：i)基底生长期黑色素瘤；ii)垂直生长期黑色素 瘤；iii)转移性黑色素瘤。与正常人黑素细胞和黑素细胞前体病灶相比， 处于基底生长期和垂直生长期的原位黑色素瘤以及转移性黑色素瘤在生 物、生化和核型上有显著不同(23)。

人黑色素瘤提供了一个极其恰当的模型系统，因为从肿瘤进展的不 同阶段分离出的细胞均可在实验室里培养和研究。在下面所讨论的实验 中应用的人黑色素瘤Hs294T(ATCC)建自淋巴结转移灶，是一种高转移性 黑色素瘤细胞系(25)。应用Hs294T的实验，结合应用NSCLC的实验， 能够预见申请专利的治疗方法即对过度表达CD44的肿瘤进行治疗的总 体有效性。

   发明概述

本发明涉及将反义寡核苷酸应用于肺癌、黑色素瘤和白血病细胞以 控制CD44的表达。此处公开的一些优选的反义寡核苷酸在执行此项功 能时可达到的95％的有效性，其效应有序列特异性且对正常细胞无毒性 作用。

附图简述

附图里，其中相同的附注文字在许多图中均表示相同的含义。

图1是一条形图，表示用22种不同的寡核苷酸与两种不同的肺癌细 胞(NCI-H460和NCI-H661)孵育后对细胞生长的影响。在本申请中 有意义的寡核苷酸如下所示：

第1道-ICN-240(SEQ ID NO：1)

第3道-ICN-248(SEQ ID NO：2)

第6道-ICN-237(SEQ ID NO：3)

第11道-ICN-308(SEQ ID NO：4)

第13道-ICN-310(SEQ ID NO：5)

第17道-ICN-314(SEQ ID NO：6)

图2是一条形图，表示所选的寡核苷酸对癌细胞的细胞毒性作用。

图3A和3B是线图，表示所选的寡核苷酸的不同浓度对两种肺癌细 胞系细胞生长的影响。

图4A和4B是线图，表示所选的寡核苷酸其作用时间对两种肺癌细 胞系细胞生长的影响。

图5是一幅RT-PCR产物的琼脂糖凝胶的照片，显示未经处理的 肺癌细胞(NCI-460)以不同对引物扩增后CD44的基因表达情况，

第1道-P1(SEQ ID NO：9)+P2(SEQ ID NO：10)

第2道-P3(SEQ ID NO：11)+P4(SEQ ID NO：12)

第3道-P5(SEQ ID NO：13)+P6(SEQ ID NO：14)

第4道-P6(SEQ ID NO：14)+P7(SEQ ID NO：15)

第5道-pHE7

第6道-PCNA(增殖细胞核抗原)

第7道-100bp DNA梯形带

图6是用反义、有义和随机序列处理人肺癌细胞(NCI-H460)后， 其RT-PCR产物再作Southern印迹而得到的一张放射自显影照片。

Unt-未经处理的细胞

第1道-ICN-237(SEQ ID NO：3)

第2道-ICN-236(SEQ ID NO：7)

第3道-ICN-240(SEQ ID NO：1)

第4道-ICN-248(SEQ ID NO：2)

第5道-ICN-308(SEQ ID NO：4)

第6道-ICN-310(SEQ ID NO：5)

第7道-ICN-314(SEQ ID NO：6)

第8道-ICN-88(SEQ ID NO：8)

图7是以pHE7作内对照，用反义、有义和随机序列处理肺癌细胞 (NCI-H460)后，其“热”RT-PCR产物的荧光放射显影照片。

Unt-未经处理的细胞。

第1道-ICN-308(SEQ ID NO：4)

第2道-ICN-248(SEQ ID NO：2)

第3道-ICN-236(SEQ ID NO：7)

第4道-ICN-240(SEQ ID NO：1)

第5道-ICN-310(SEQ ID NO：5)

第6道-ICN-88(SEQ ID NO：8)

图8是以β-肌动蛋白作内对照7，用反义/有义和随机序列处理肺 癌细胞(NCI-H661)后，其RT-PCR产物作Southern印迹而得到的放 射自显影照片。

第1道-未经处理的细胞

第2道-ICN-237(SEQ ID NO：3)

第3道-ICN-240(SEQ ID NO：1)

第4道-ICN-236(SEQ ID NO：7)

第5道-ICN-308(SEQ ID NO：4)

第6道-ICN-88(SEQ ID NO：8)

图9是以β-肌动蛋白作内对照，用反义、有义和随机序列处理黑 色素瘤细胞(Hs294T)后，对其RT-PCR产物作Southern印迹而得到的 放射自显影照片。

第1道-未经处理的细胞

第2道-ICN-237(SEQ ID NO：3)

第3道-ICN-240(SEQ ID NO：1)

第4道-ICN-236(SEQ ID NO：7)

第5道-ICN-308(SEQ ID NO：4)

第6道-ICN-248(SEQ ID NO：2)

第7道-ICN-88(SEQ ID NO：8)

图10是一条形图，表示在裸鼠体内应用ICN-240(SEQ ID NO：1)后 对人白血病(NB4)的抑制。

图11A和11B是条形图，表示在用ICN-240(SEQ ID NO：1)和其 糖基化修饰形式ICN-967(SEQ ID NO：1)治疗后，对NB4和Daudi人白 血病细胞分别所起的抑制作用。

     发明详述

以下讨论讲述了各种寡核苷酸序列的制备和对它们作用于肺癌或/ 和黑色素瘤细胞的效果的检测。针对人CD44 cDNA的反义和有义寡核苷 酸是Stamenkovic等发表的序列中所标明的片段(26)。归结起来共有22 个核苷酸被合成和检测，从中又选出以下所列的作进一步评估： 参者号        序列                     位置(在CD44编码      SEQ ID NO

                                   序列中的碱基对序号) 反义寡核苷酸 ICN-240  5′ATTCGAAATG AAACAA          1620                 SEQ ID NO：1 ICN-248  5′TTTATCTTCT TCCAAGGCGA AGC  991                  SEQ ID NO：2 ICN-237  5′TTTATCTTCT TCCAAG          991                  SEQ ID NO：3 ICN-308  5′TTCCTCCCAG GAC             2038                 SEQ ID NO：4 ICN-310  5′AAATTTCCTC CCAG            2038                 SEQ ID NO：5 ICN-314  5′GGCAGGTTAT ATTCA           250                  SEQ ID NO：6 有义寡核苷酸 ICN-236  5′ATTTGAATAT AACCTGGCGA AGC  246                  SEQ ID NO：7 随机寡核苷酸 ICN-88   5′TGCCAGACTA TTGTCCCA        n/a                  SEQ ID NO：8

被测的所有序列均在一台DNA自动合成仪(Applied Biosystems 394 型)中合成，是以典型的氨基磷酸酯(phosphoroamidite)化学方法合成的由 磷酸二酯键连接的寡核苷酸。得到的寡核苷酸通过HPLC纯化，使用反 向半制备的C8柱(ABI)，以溶于0.1M乙酸三乙铵的5％乙腈和乙腈组成 线性样度。产物纯度利用HPLC分析性C18柱(Beckman)进行鉴定。

对22种寡核苷酸序列进行测试的细胞系是大细胞肺癌细胞系NCI -H460、NCI-H661和黑色素瘤细胞系Hs294T，来自美国典型培养 物保藏中心。细胞按常规在培养箱中传代培养，培养箱保持一定湿度， 温度为37℃，气体为大气压下5％CO2/95％空气。在含10％胎牛血清90％ RPMI-1640的培养液中，两种细胞系均为贴壁生长。将细胞铺于96孔 培养板中，每孔2000个细胞，然后加入各种浓度(0.1，0.25，0.5， 1.0μM)的反义和有义寡核苷酸，下文中将对这些寡核苷酸作更详细描 述。培养72小时后，所有细胞均按1μCi/ml加入[3H]胸腺嘧啶，继续培 养2个小时，自动的96型收集仪(Tomtec)收集细胞，β-计数仪测定[3H] 胸腺嘧啶的掺入量。为确保结果的准确性，所有实验均设三个复孔，至 少重复三次。

在进行DNA抑制实验以前，用肺癌细胞进行了预筛选。每一种寡核 苷酸以0.5μM的浓度与肺癌细胞NCI-H460和NCI-H661共同孵育 72小时。图1为筛选的结果，其中的每一条垂直线(1-22)均表示一种 特异的寡核苷酸对细胞生长的抑制效应。反义寡核苷酸中有六种：第一 道-ICN-240(SEQ ID NO：1)、第三道-ICN-248(SEQ ID NO：2)、 第六道-ICN-237(SEQ ID NO：3)、第11道-ICN-308(SEQ ID NO：4)、第13道-ICN-310(SEQ ID NO：5)和第17道-ICN-314(SEQ ID NO：6)几乎完全抑制了肺癌细胞的生长，而其它被测的寡核苷酸对细 胞生长影响甚微。

图2是用中性红吞噬法(Clonetics，San Diego)检测六种寡核苷酸(选 自图1)对两种肺癌细胞系的细胞毒性作用的结果。每一种寡核苷酸与未 处理细胞结果相当，表明它们处理时没有细胞毒作用。

图3A和3B是检测三种反义寡核苷酸ICN-240(SEQ ID NO：1)、 ICN-237(SEQ ID NO：3)、ICN-308(SEQ ID NO：4)和一种有义寡核苷 酸ICN-236(SEQ ID NO：7)的剂量效应结果。实验时，两种肺癌细胞以 不同浓度(0.1，0.25，0.5，1.0μM)的寡核苷酸处理72小时。随着浓度 的升高，三种反义寡核苷酸对细胞生长的抑制程度均有所增加，浓度在 0.25～0.5μM的时候对细胞生长抑制程度从55％增至95％。有义寡核苷 酸ICN-236(SEQ ID NO：7)浓度的升高并不影响细胞生长。

图4A和4B是反义寡核苷酸ICN-237(SEQ ID NO：3)、ICN-240 (SEQ ID NO：1)和ICN-308(SEQ ID NO：4)对两种肺癌细胞系作用六天 后的实验结果。显而易见，所选的三种反义寡核苷酸对细胞生长有最高 抑制(20～45％)作用的时间均在24-48小时，72-120小时抑制作用 基本消失。

为了确定序列作用特异性，我们用RT-PCR的方法核定了寡核苷 酸ICN-88(SEQ ID NO：8)、ICN-236(SEQ ID NO：7)、ICN-237 (SEQ ID NO：3)、ICN-240(SEQ ID NO：1)、ICN-248(SEQ ID NO：2) 和ICN-308(SEQ ID NO：4)。实验中，对肺癌细胞和黑色素瘤细胞均用 异硫氰酸胍法(Glass MAX RNA Microisolation Spin Cartridge System- Gibco BRL)提取细胞总RNA，然后根据厂商(Perkin Elmer Cetus)说明， 用0.5μg总RNA、oligo(dT)引物和M-MLV反转录酶合成cDNA的第 一条链。接着，我们选择能特异地与CD44基因的某些部分发生退火的 引物扩增编码特异性CD44蛋白的基因部分。所用的针对人CD44 cDNA 的引物和DNA探针其序列在Stamenkovic等人发表的序列(1989)中已列 出，具体如下：(26) 引物        序列5′-3′                   位置(bp)    SEQ ID NO P-1  GACACATATT  GCTTCAATGC  TTCAGC       520         SEQ ID NO：9 P-2  GATGCCAAGA  TGATCAGCCA  TTCTGGAAT    920         SEQ ID NO：10 P-3  AGCAGAGTAA  TTCTCAGAG                947         SEQ ID NO：11 P-4  CTGATAAGGA  ACGATTGACA               1,221       SEQ ID NO：12 P-5  GAGACCAAGA  CACATTCCAC CCCAG         1,241       SEQ ID NO：13 P-6  ACTCCTTGTT  CACCAAATGCA              1,561       SEQ ID NO：14 P-7  ACACCTTGTT  CACCAAATGCA              182         SEQ ID NO：15 PCR引物P-1(SEQ ID NO：9)和P-2(SEQ ID NO：10)与Matsamura和Tarcin 所用引物一致(27)，被设计成能与CD44的标准型部分退火。在表达标准 型CD44的样品中，这些引物的PCR产物是一个480bp的片段；在表达 CD44上皮型的样品中，这些引物的PCR产物是一个878bp的片段；而 在发生可变剪接转录的样品中，会产生位于不同带的片段。接下来用这 些cDNA产物(每一例总量的10％)作模板进行PCR，其反应混合物包括 1×Taq缓冲液、MgCl2(15mM)，dNTP(500μM)、适宜的5′和3′引物和 Taql聚合酶(50单位/ml)。所有样品的循环参数为55℃8分钟，94℃1 分钟，55℃1分钟和72℃2分钟；(三十五个循环)之后是72℃8分钟。

为证实质量和数量，cDNA也用核糖体基因(pHE7)(29)有义引物 5′CTT CGAAAGG CAAGGAGGAA(SEQ ID NO：16)和反义引物5′ TGGCTCTACA ATCCTCAGCA(SEQ ID NO：17)以及β-肌动蛋白有义 引物5′CAGCCATGTA CGTTGCTATC CAG(SEQ ID NO：18)和反义 引物5′GTTTCGTGGA TGCCACAGGA C(SEQ ID NO：19)进行PCR扩增 作为内对照。结果是产生了针对核糖体基因的300bp的片段或针对β- 肌动蛋白的450bp的片段。取每种PCR产物10μl，用15％琼脂糖凝胶 进行电泳，然后转到带正电的尼龙膜上(Boehringer Mannheim)，与CD44 寡核苷酸探针5′CCTGAAGAAG ATTGTACATC AGTCACAGAC(SEQ ID NO：20)进行杂交。探针的5′端用T4多核苷酸激酶标记上放射性 g-32P-ATP。预杂交和杂交在快速杂交缓冲液(Arnersham)中进行，温度42 ℃，时间90分钟。然后在42℃依次以5×SSC、含0.1％SDS的1×SSC 洗膜2次，每次15分钟，再用分子成像仪(GS-250，Bio-Rad)进行分 析。

为确定有CD44分子的表达，我们使用为扩增CD44基因的不同编 码区域而设计的不同引物的组合，首先检测了未经处理的肺癌细胞NCI -H460(26)。实验时，从约5×105细胞中提取RNA，以上述相同的条 件用RT-PCR进行分析。正如预期的那样，使用引物P-1(SEQ ID NO： 9)和P-2(SEQ ID NO：10)进行PCR扩增产生的是针对标准型CD44同种型 RNA的480bp片段(图5，第1道)。相形之下，由其它引物的不同组合 扩增的是针对分子大小迥然不同的CD44的其它片段(图5，第2道-P3 (SEQ ID NO：11)+P4(SEQ ID NO：12)，第3道-P5(SEQ ID NO：13)+P6 (SEQ ID NO：14)和第4道-P6(SEQ ID NO：14)+P7(SEQ ID NO：15)。

为了说明一个所选的反义寡核苷酸怎样抑制CD44 mRNA的表达， 我们接下来用RT-PCR和Southern印迹杂交相结合的方法检测CD44 的表达。用作RT-PCR引物的P-1(SEQ ID NO：9)和P-2(SEQ ID NO：10)来源于编码标准型同种型序列的外显子(1-5和16-20)，这些 序列靠近变异插入序列。同样，正如从已发表的数据(30)和在图5中总结 的我们以前的结果所显示的那样，引物P-1(SEQ ID NO：9)和P-2(SEQ ID NO：10)的扩增只产生CD44标准型同种型。接着从两种肺癌细胞系中 提取RNA标本，这些细胞中有一些未用反义寡核苷酸处理，一些用了反 义寡核苷酸处理(0.5/μM2小时)。我们检测了我们所选的六种反义寡核苷 酸，并用一种有义和一种随机寡核苷酸作内对照(图6)。在RT-PCR和 Southern印迹之后我们发现其中三种反义寡核苷酸一致表现出对NCI H460细胞系CD44 mRNA表达的强烈抑制作用(见图6，第一道-ICN -237(SEQ ID NO：3)，第三道-ICN-240(SEQ ID NO：1)和第五道- ICN-308(SEQ ID NO：4)。同样的对mDNA的抑制也可在NCI-H661 上找到(图8，第2道-ICN-237(SEQ ID NO：3)，第3道-ICN-240 (SEQ ID NO：1)和第5道-ICN-308(SEQ ID NO：4)。与之相反，CD44 的表达在未处理细胞上是阳性(图8，第1道)，在经有义或随机寡核苷酸 处理的细胞上也是阳性(见图8，第4道-ICN-236(SEQ ID NO：7)， 第6道-ICN-88(SEQ ID NO：8)。

应用“热”PCR可以定量测定在应用反义寡核苷酸处理肺癌细胞后 CD44 mRNA表达的下降量(图7)。此项实验基本应用上述同样的方法， 只是混和物中的一种脱氧核苷酸在PCR扩增时进行了放射性标记，PCR 的终产物也被标记。通过光密度测定所得的结果是0.5μM的反义寡核苷 酸处理2h后，CD44mRNA的表达下降79-94％(图7，第1道-ICN -308(SEQ ID NO：4)和第4道-ICN-240(SEQ ID NO：1)。无论是有义 寡核苷酸还是随机寡核苷酸(图7，第3道-ICN-236(SEQ ID NO：7) 和第6道-ICN-88(SEQ ID NO：8))，或其余两种反义寡核苷酸(图7， 第2道-ICN-248(SEQ ID NO：2)和第5道-ICN-310(SEQ ID NO：5)) 均未观察到同样的效应。并且没有任何一种被测的寡核苷酸影响了核糖 体RNA的水平(pHE7)，这样就证明了对靶CD44 mRNA有选择性，

图9是与图6相似的Southern印迹分析的结果。但此处黑色素瘤细 胞(Hs294T)的样品是与四种反义寡核苷酸ICN-237(SEQ ID NO：3)、 ICN-240(SEQ ID NO：1)、ICN-310(SEQ ID NO：5)和ICN-248(SEQ ID NO：2)，一种有义寡核苷酸(SEQ ID NO：7)和一种随机寡核苷酸ICN -88(SEQ ID NO：8)共同孵育。在进行了RT-PCR和Southern印迹分 析之后我们发现有两种反义寡核苷酸抑制CD44 mRNA表达的效率很 高：第3道-ICN-240(SEQ ID NO：1)达91％，第5道-ICN-248(SEQ ID NO：6)达84％；剩下的反义寡核苷酸，第5道-ICN-308(SEQ ID NO：4) 抑制效率为约54％。第4道-ICN-236(SEQ ID NO：4)，随机寡核苷酸， 第7道-ICN-88(SEQ ID NO：8)以及第1道未经处理的细胞均未表现 出任何效应。β-肌动蛋白用作内对照。

图10是一条形图，表示裸鼠应用ICN-240(SEQ ID NO：1)后对体 内人白血病(NB4)的抑制，这幅图显示在一段长达两周的时间里，体内的 生长抑制约为80％；而且图中还显示在第5到第15天，白血病细胞几乎 一点生长都没有。

图11A和11B是条形图，表示在应用ICN-240(SEQ ID NO：1)和 其糖基化修饰形式ICN-967(SEQ ID NO：1)处理后，对NB4和Daudi 人白血病细胞分别所起的抑制作用。这些图显示G1期的白血病细胞的百 分比明显升高。

此处所描述的寡核苷酸的给药方法，在许多动物身上，包括哺乳动 物，尤其是人，在本领域中是众所周知的。例如，CRC出版社出版的 (Saghir Akhtar编辑，1995)《(反义寡核苷酸治疗剂的给药策略))详述了 许多这样的给药途径和策略，在此将此书全文引入作为参考，以下仅以 第五章为例进行说明，但并不限制整本书的应用。第五章，描述了以传 统的静脉内、腹膜内和皮下途径给药；此外，还描述了一些“非损伤性” 给药途径，如鼻内给药、眼部给药、经皮给药和离子渗透给药等途径(同 上71-83)。所有这些途径均可用于本项发明。同一本书中的第6章提 及为使寡核苷酸治疗剂有核酸酶抗性而进行的修饰，此处所用术语核苷 酸、寡核苷酸和核酸碱基具体包括这些化合物的修饰形式和所有其它的 对天然形式进行微小修饰的变体(同上85-104)。要求专利保护的寡核 苷酸也可与一种脂或其它能主动跨越细胞膜的化合物相连，连接可使用 连接物也可不用连接物；并且，可以象美国专利5,411,947所公开的那样 口服给药，美国专利5,411,947也在此引入以作参考。此外，本发明中的 寡核苷酸的给药方式还有“裸露”形式，用胶囊包裹，与囊泡、脂质体、 珠子、微球相连、作为偶合体以及使用象ICN Biomedicals号码为SPAG.2 的产品作气雾剂直接入肺。因此，本发明中的寡核苷酸基本可以以已知 的所有寡核苷酸的给药途径给药，进行各种已接受的修饰以制备核苷酸 类似物和药物前体，使用所有的适宜的粘合剂和赋形剂，采用所有适当 的药物剂量和治疗方案。

目前，本发明的寡核苷酸的最优选给药包括按病人每kg体重0.1～ 10mg寡核苷酸的量给药，每天1-2次，持续约40天。这个方案基于 曾经观察到的相似寡核苷酸在体内半衰期达数小时，而且对蛋白合成的 影响可持续48或72小时。针对任何某人的特殊治疗方案都将取决于临 床医生的经验，包括估计疾病的严重程度、病人的健康情况和反应性、 副作用以及他们所熟知的许多其它因素。比如，剂量的高低，治疗方案 持续时间的长短都将取决于主治医生的判断，治疗时可能还会有间歇 期，这时用寡核苷酸的治疗将暂时停止。如果合适，还可以结合其它抗 癌治疗和姑息治疗。疾病是好转还是恶化可通过肿瘤大小、转移程度以 及由放射学分析和本领域已知的其它方法所得的参数进行判断；副作用 的有无和广泛程度可通过测肝脏和/或肾脏的功能进行判断，还可以通过 使用象EKG这样的方法测血循环情况进行判断，这种方法在本领域中也 是众所周知的。

这样，反义寡核苷酸控制过度表达CD44的肺癌细胞，尤其是非小 细胞肺癌和黑色素瘤细胞表达CD44的效应已被公开。在临床实践中应 用这些寡核苷酸的方法也已被公开。虽然已经例举和描述了具体的实施 方案和应用，但对本领域的技术人员来说，可以进行不脱离本发明精神 的其它改动。因此，本发明仅由所附权利要求的精神进行限定。

参考文献：

1. Haynes F.B.Telen，J，M.，Hale，P.L.Denning M.S.CD44-参与淋巴细 胞粘附和T细胞活化的分子。今日免疫学，1989，10：423-4282，

2. Penno MB.Auguet JT，Baylin SB.Mabry M，Linnoila RI.Lee VS.Croteau D，Yang XL and Rosada C.人肺部肿瘤CD44的表达。肿瘤研 究，1994，54，1381-1387。

3. Lesley J，Hyman R and Kincade PW.CD44和它与胞外基质的相互 作用。高级免疫学，1994，54：271-335。

4. Sherman L.，Sleeman J.，Herrlich P.，Ponta H.，透明质酸盐受体：生 长、分化、迁移和肿瘤进展的关键分子，细胞生物学当今论点，1994， 6：726-733。

5. Gunthert U.，CD44：功能各异的多种同种型，微生物学和免疫学当 今话题，1993，184：47-55。

6. Herrlich p，Zoller M.，Pals T.，Ponta H.CD44剪接变异体：转移瘤 和淋巴细胞达到的共识。今日免疫学，1993，14：395-399，

7. Salles G，Zain M，Wei-meng J，Boussiotis VA and Shipp A，在扩散 型大细胞性淋巴瘤中的可变剪接的CD44转录物：其特点及与正常活化B 细胞和上皮性恶性肿瘤的比较。血液，1993，82：3539-3547。

8. Koopman G，Heider KH，Horst E，Adolf GR，van der Berg F，Ponta H， Herrlich P and Pals ST，活化人淋巴细胞和浸润性非何杰金氏淋巴瘤表达 一种大鼠转移瘤相关性CD44变异体的同源物。实验医学杂志，1993， 177：897-904。

9. Bartolazzi A，Peach R，Aruffo A，Stamenkovic I，CD44与透明质酸 盐之间的相互作用直接参与对肿瘤形成的调节。实验医学杂志，1994， 180：53-66。

10. Goodfellow PN，Banting G，Wiles MV，Tunnacliffe A，Parkar M， Sdornan E，Dalchau R，Fabre JW，控制单克隆抗体F10.44.2鉴定的抗原表 达的基因MIC4位于人第11号染色体，欧洲免疫学杂志，1982，12： 659-663。

11. Screaton GR，Bell MV，Jackson DG，Cornelis FB，Gerth U and Bell LI，编码淋巴细胞归巢受体CD44的DNA基因组结构显示至少有12个可 变剪接的外显子。美国国家科学院院刊，1992，89：12160-12164。

12. Aruffo A，Stamenkovic I，Melnick M，Underhill CB and Seed B， CD44是透明质酸盐的主要细胞表面受体。细胞，1990，61：1303 1313。

13. Seiter S，Arch R，Reber S，Komitowski D，Hofmann M，Ponta H， Herrlich P，Matzku S and Zoller M，通过抗变异型CD44阻止肿瘤转移灶 形成。实验医学杂志，1993，177：443-455。

14. LiH，Hamous MF，Tribolet N，Jaufeerally R，Hofmann M，Diserens AC and Meir EG，变异型CD44粘附分子在人脑转移瘤而不是成胶质细胞 瘤中表达。肿瘤研究，1993，53：5345-5349。

15. Merzak A，Koocheckpour S and Pilkington GJ，CD44介导人神经胶 质细胞在体外的转移和浸润，肿瘤研究，1994，54：3988-3992。

16. Dall P，Heider KH，Hekele A，von Minckwitz G，Kaufmann M， Ponta H and Herrlich P，宫颈上皮CD44的表面蛋白表达和信使RNA剪接 分析。肿瘤研究，1994，54：3337-3341。

17. Wielenga VJM，Heider KH，Offerhaus JA，Gunther RA，van der Berg Fm，Ponta H，Herrlich P and Pals ST，CD44变异型蛋白在人结肠直肠 癌的表达与肿瘤进展相关。肿瘤研究，1993，53：4754-4756。

18. Finn L，Dougherty G，Finley G，Meisler A，Becich M and Cooper DL， 人结肠直肠肿瘤CD44前mRNA的可变剪接。生物化学和生物物理研究 交流1994，200：1015-1022。

19. Heider KH，Dammrich J，Skroch-Angel P，Muller-Hermelink HK， Vollmers HP，Herrlich P and Ponta H，CD44剪接变异体在人肠型胃癌，扩 散型胃癌和正常胃粘膜的不同表达。肿瘤研究，1993，53：4197 4203。

20. Joensuu H，Klemi PJ，Toikkanen S and Jalkanen S，乳腺癌中糖蛋白 CD44的表达以及它与患者生存的相关性。美国病理学杂志，1993， 143：867-874。

21. Kaufrnann M，Heider KH，Sinn Hp，von Minckwitz G，Ponta H， Herrlich P，CD44变异型外显子在原位乳腺癌的表达与存活时间长短的关 系。柳叶刀，1995，345：615-619。

22. Guo Y，Ma J，Wang J，Che X，Narula J，Bigby M，Wu M and Sy M， 体内应用抗CD44的单克隆抗体对人黑色素瘤生长和转移的抑制。肿瘤 研究，1994，54：1561-1565。

23. Aaronson SA，生长因子与癌症。科学，254：1146-1153， 1991。

24. Rodech U，人黑色素瘤进展过程中对生长因子的不依赖性及生 长因子调节途径。癌症与转移综述，12：219-226，1993。

25. Birch M，Mitchell S and Hart IR，表达高水平CD44和低水平CD44 的不同人黑色素瘤细胞的分离和鉴定肿瘤研究，1991，51，6660- 6667。

26. Stamenkovic I，Aruffo A，Amiot M，Seed B，CD44的造血型和上 皮型是不同的多肽，对有透明质酸盐的细胞有不同的粘附能力。EMBO 杂志，1991，10：343-348。

27. Matsumura Y，Tarin，CD44基因产物对癌症诊断和疾病评估的意 义。柳叶刀，1992，340：1053-1058。

28. Kao HT and Nevins JR.＿＿＿＿细胞和分子生物学， 1983，2058-206。

29. Iuima SN，Hamada H，Reddy P and Kakunaga T，人细胞质β-肌 动蛋白基因分子结构：内含子序列的种间同源性。美国国家科学院院刊 1985，82：6133-6137。