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一种用于向细胞传递外源分子的辅助平台及其制备方法和应用

阅读：92发布：2020-10-03

专利汇可以提供一种用于向细胞传递外源分子的辅助平台及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种细胞内外源大分子传递平台，其包括硅纳米线阵列、形成在所述的硅纳米线阵列表面的聚合物刷，所述的聚合物刷带有苯硼酸基团。本专利在表面修饰了识别性分子用于捕获悬浮细胞，然后采用表面辅助光热穿孔的技术提高对细胞的传递效率，从而解决了目前大多数表面辅助传递技术只适用于贴壁细胞的问题，实现了对悬浮细胞的高效率大分子传递。，下面是一种用于向细胞传递外源分子的辅助平台及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种辅助平台，其特征在于：其包括硅纳米线阵列、形成在所述的硅纳米线阵列表面的聚合物刷，所述的聚合物刷带有苯硼酸基团。
2.根据权利要求1所述的辅助平台，其特征在于：所述的聚合物刷的厚度为10～30nm。
3.根据权利要求1所述的辅助平台，其特征在于：所述的硅纳米线阵列的硅纳米线的长度为5～35μm。
4.根据权利要求1所述的辅助平台，其特征在于：所述的辅助平台通过引发剂对所述的硅纳米线阵列进行修饰，然后接枝共聚物，最后修饰含有苯硼酸基团的修饰物制得。
5.根据权利要求4所述的辅助平台，其特征在于：所述的引发剂为2-溴-2-甲基丙酸(3-三甲氧基硅基)丙酯，或者所述的引发剂通过先在所述的硅纳米线阵列上修饰硅烷偶联剂
3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3-氨基丙基三甲氧基硅烷，然后再修饰2-溴异丁酰溴或2-氯代异丁酰氯形成；形成所述的共聚物的单体为甲基丙烯酸羟乙酯和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯；所述的修饰物为4-羧基-3氟苯硼酸、4-羧基苯硼酸、3-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的辅助平台，其特征在于：所述的辅助平台还包括负载于所述的硅纳米线阵列和/或所述的聚合物刷上的外源分子。
7.一种如权利要求1至6中任一项所述的辅助平台的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将所述的硅纳米线阵列与引发剂溶液反应得到修饰了引发剂的硅纳米线阵列；
(2)在引发体系的存在下，将所述的修饰了引发剂的硅纳米线阵列与单体反应得到表面接枝有共聚物的基材；
(3)在缩合试剂的存在下，将所述的基材与修饰物溶液反应制得所述的辅助平台；
(4)选择性地将外源分子负载于所述的辅助平台上。
8.一种如权利要求1至6中任一项所述的辅助平台的体外细胞传递方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)将细胞种植到所述的辅助平台上；
(2)加入无血清培养基进行细胞培养，当采用的辅助平台上负载有外源分子时，所述的无血清培养基中添加有或者不含有外源分子；当采用的辅助平台上没有负载外源分子时，所述的无血清培养基中添加有外源分子；
(3)采用近红外光以1～10W/cm2的光照强度照射10～50s得到含有所述的外源分子的细胞。
9.一种如权利要求8所述的传递方法得到细胞的释放方法，其特征在于：在照射完毕后
1～10h，将所述的无血清细胞培养基更换成果糖溶液，收集细胞。
10.一种如权利要求1至6中任一项所述的辅助平台辅助制得的细胞、或者如权利要求8所述的传递方法制得的细胞、或者如权利要求9所述的释放方法收集得到的细胞。

说明书全文

一种用于向细胞传递外源分子的辅助平台及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明具体涉及一种用于向细胞传递外源分子的辅助平台及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 悬浮细胞广泛分布于整个细胞系中，例如造血细胞、循环血液细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞等。向悬浮细胞内传递外源大分子(例如：蛋白质、核酸等) 是了解开发各种疾病治疗方案的关键，并且在细胞治疗、再生药物、疾病诊断以及药物筛选等领域有着十分重要的作用。相对于贴壁细胞，悬浮细胞更加难转染。目前向悬浮细胞内传递外源大分子的方法主要有生物化学方法以及物理方法。

[0003] 生物化学方法是采用一些载体等辅助外源大分子进入细胞，主要可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。目前，病毒载体以其高效性、特异性的特征成为临床上应用最先进的核酸载体。但是，病毒载体也存在一些严重性的挑战，例如：免疫原性、安全性以及制备复杂性，这也是病毒载体一直难以获得FDA 批准的原因。由于病毒性载体的局限性，研究者们开发了多种非病毒载体，例如阳离子聚合物、脂质体、无机纳米粒子以及细胞穿膜肽等。但是这些载体的转染效率相对较低。另外，大部分的非病毒载体都是用于核酸转染，而用于蛋白质、糖类传递的载体还比较少。并且一种载体可能只适用于某种带有特异性标记的物质传递，而对其它没有这种标记的物质不起作用，因此，此类载体对于传递的大分子的通用性较差。同时，对于难转染的悬浮细胞而言，由于其自我保护机制更强，致其传递效率微乎其微。

[0004] 物理方法是一种基于细胞膜破损从而促进外源性大分子进入细胞的方法。其中最典型的且目前应用于悬浮细胞传递比较多的是电穿孔方法。电穿孔是通过高强度的电场作用来瞬时增加细胞膜的通透性，促使周围介质中的外源大分子进入到细胞内部，但是其高的脉冲强度会造成悬浮细胞的大量死亡。

[0005] 1、采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞。公开号：CN105420278A。

[0006] 此发明是将金纳米粒子沉积到金片表面，利用其光热效应实现了对多种贴壁细胞的大分子传输，但是其对悬浮细胞的外源大分子传输没有作用。

[0007] 2、一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法。公开号：CN103981218A。

[0008] 此发明属于哺乳动物细胞基因工程领域，具体是一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法。但其转染效率仍有待提高，且存在电穿孔技术对细胞活性伤害较大的问题。

[0009] 3、悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法。公开号：CN102719480A。

[0010] 此发明公开一种悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法，此发明是采用表面辅助的脂质体转染方法，依旧是属于载体法的范畴。特别地，对于悬浮的淋巴细胞而言，其细胞膜表面正电荷含量显著增加，从而增加了采用阳离子脂质体等载体向淋巴细胞中转染核酸的困难。

[0011] 因此，发展一种通用简单的、高效的、不仅能够向贴壁细胞传递大分子，还能无损地向悬浮细胞传递外源分子的表面辅助传递体系还有待研究。

发明内容

[0012] 本发明所要解决的技术问题是提供一种辅助平台及其制备方法和应用，该辅助平台为苯硼酸基团修饰的硅纳米线阵列基材，该基材能够捕获多种悬浮细胞，从而使得该辅助平台不仅适用于贴壁细胞，也能够适用于悬浮细胞。并且利用光热效应向细胞中高效传递多种外源性分子，从而实现了对贴壁细胞和悬浮细胞的高效传递。进一步地，利用糖响应可以实现对改性后细胞的收获，且对细胞损伤小。

[0013] 为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0014] 本发明一方面提供了一种辅助平台，其包括硅纳米线阵列、形成在所述的硅纳米线阵列表面的聚合物刷，所述的聚合物刷带有苯硼酸基团。

[0015] 由于唾液酸存在于大部分细胞膜表面并且在大多数癌细胞、T细胞、B细胞以及自然杀伤细胞细胞膜表面上过表达，而苯硼酸可以和唾液酸相结合，并且此苯硼酸酯键可以在果糖分子的作用下发生解离，并且相对于温度响应性，糖响应对细胞更加的友好。因此，本发明通过在光热效应基材硅纳米线阵列上修饰了可以捕获悬浮细胞的带有苯硼酸基团的聚合物刷，实现了向多种悬浮细胞进行外源大分子传递，并且通过加入果糖分子，可以将辅助平台表面的细胞无损地收获下来，用于后续研究和应用。

[0016] 本发明的表面的辅助使得DNA等大分子与悬浮细胞之间的接触更加的紧密，有助于提高传递效率，并且此表面辅助的硅纳米线阵列具有光热效应，利用光热穿孔，促使细胞膜变得更加通透，有助于外源性大分子通过细胞膜进入到细胞内部，且能够较好地保持细胞的活性。

[0017] 优选地，所述的聚合物刷的厚度为10～30nm。在聚合物刷的厚度小于20nm 时，表面捕获的细胞数目随着聚合物刷的厚度增加而增加，当厚度达到20nm 时，表面捕获的细胞数目基本保持不变，因此，出于成本和性能的综合考虑，所述的聚合物刷的最优厚度为20nm左右。

[0018] 优选地，所述的硅纳米线阵列的硅纳米线的长度为5～35μm。实验发现，随着硅纳米线的长度越长，其光热效应有所增加，但是与细胞的相容性变差，其原因是长的硅纳米线不适合细胞的生长。进一步优选硅纳米线的长度为10～28 μm，更优选为10～18μm。

[0019] 根据一种实施方式，所述的辅助平台通过引发剂对所述的硅纳米线阵列进行修饰，然后接枝共聚物，最后修饰含有苯硼酸基团的修饰物制得。

[0020] 优先地，所述的引发剂为2-溴-2-甲基丙酸(3-三甲氧基硅基)丙酯，或者所述的引发剂通过先在所述的硅纳米线阵列上修饰硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3-氨基丙基三甲氧基硅烷，然后再修饰2-溴异丁酰溴或2-氯代异丁酰氯形成。

[0021] 优先地，形成所述的共聚物的单体为甲基丙烯酸羟乙酯和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯。

[0022] 优先地，所述的修饰物为4-羧基-3氟苯硼酸、4-羧基苯硼酸、3-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸中的一种或多种。

[0023] 根据一种实施方式，所述的辅助平台还包括负载于所述的硅纳米线阵列和/ 或所述的聚合物刷上的外源分子，可以提高外源分子的浓度，从而提高传递的效率。此辅助平台可以直接用作体外转染细胞的优异平台，进一步用于疾病的细胞治疗。

[0024] 本发明中，外源分子可以是所需的物质，例如DNA、RNA、多肽、蛋白质、糖类、药物等。

[0025] 本发明的所述的辅助平台在近红外光以1～10W/cm2的光照强度照射10～50 s时，辅助平台的温度能够升高，从而可以使得细胞的细胞膜通透性增加，便于外源分子进入细胞，提高传递效率。

[0026] 本发明的辅助平台，不仅适用于贴壁细胞，也适用于悬浮细胞。

[0027] 本发明的第二方面是提供一种所述的辅助平台的制备方法，包括如下步骤：

[0028] (1)将所述的硅纳米线阵列与引发剂溶液反应得到修饰了引发剂的硅纳米线阵列；

[0029] (2)在引发体系的存在下，将所述的修饰了引发剂的硅纳米线阵列与单体反应得到表面接枝有共聚物的基材；

[0030] (3)在缩合试剂的存在下，将所述的基材与修饰物溶液反应制得所述的辅助平台；

[0031] (4)选择性地将外源分子负载于所述的辅助平台上。

[0032] 根据一种具体实施方式，所述的制备方法的步骤如下：

[0033] (1)用体积比为2～3：1的硫酸和过氧化氢混合溶液清洗硅片，氮气吹干；配置含有氢氟酸和硝酸银的混合水溶液，其中，水与氢氟酸的投料体积比为 2～4:1，所述的硝酸银的浓度为8～9g/L；将所述的混合水溶液加入到清洗好的硅片中，45～55℃反应5～30min，而后经清洗、干燥得硅纳米线阵列；

[0034] (2)用体积比为2～3：1的硫酸和过氧化氢混合溶液清洗硅纳米线阵列，然后将清洗过的硅纳米线阵列放入到1～3wt％的2-溴-2-甲基丙酸(3-三甲氧基硅基)丙酯的无水甲苯溶液中，室温静置20～30h，然后清洗得到修饰了引发剂的硅纳米线阵列；

[0035] (3)将2-氨基乙基甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸羟乙酯加入无水甲醇和去离子水中配制得到混合溶液，其中，所述的2-氨基乙基甲基丙烯酸酯的浓度为 0.1～0.2mol/L，所述的甲基丙烯酸羟乙酯的浓度为0.6～0.7mol/L，然后按照顺序加入CuBr2、联吡啶、抗坏血酸，混合均匀后加入到修饰了引发剂的硅纳米线阵列中，室温反应10～60min，经清洗去除残余的单体和物理吸附的聚合物，得到表面接枝有共聚合物刷的基材；

[0036] (4)配置浓度为4～6mg/mL的4-羧基-3氟苯硼酸的无水N,N-二甲基甲酰胺的溶液，而后加入O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N- 二异丙基乙胺，控制其终浓度分别为3～4mg/mL以及2～3μL/mL，而后鼓氮气 20～40min后移入到手套箱中，然后将混合液体加入到基材中，室温反应10～15h 后得到所述的辅助平台。

[0037] 进一步地，将所述的辅助平台放入含有外源分子的溶液中，静置得到负载有外源分子的辅助平台。

[0038] 本发明的第三个方面是提供一种所述的辅助平台的体外细胞传递方法，包括如下步骤：

[0039] (1)将细胞种植到所述的辅助平台上；

[0040] (2)加入无血清培养基进行细胞培养，当采用的辅助平台上负载有外源分子时，所述的无血清培养基中添加有或者不含有外源分子；当采用的辅助平台上没有负载外源分子时，所述的无血清培养基中添加有外源分子；

[0041] (3)采用近红外光以1～10W/cm2的光照强度照射10～50s得到含有所述的外源分子的细胞。

[0042] 本发明的第四个方面是提供一种经所述的传递方法得到的细胞的释放方法，在照射完毕后1～10h，将所述的无血清细胞培养基更换成果糖溶液，收集细胞。

[0043] 本发明的第五个方面是提供一种所述的辅助平台制得的细胞、或者所述的传递方法制得的细胞、或者所述的释放方法收集得到的细胞。

[0044] 由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

[0045] 本专利在表面修饰了可以捕获悬浮细胞的识别性分子，提高了对悬浮细胞的捕获率，并且采用表面辅助光热穿孔的技术能够提高对细胞的传递效率，从而解决了目前大多数表面辅助传递技术只适用于贴壁细胞的问题，实现了对悬浮细胞的高效率大分子传递。附图说明

[0046] 图1为实施例1的表征图，其中图1(a)为实施例1制得的SN-PHB的俯视SEM表征图，图1(b)为实施例1制得的SN-PHB的横截面SEM表征图，图1(c)为实施例1制得的SN-PHB的单根TEM表征图；

[0047] 图2为实施例1中制备的SiNWAs、SN-Br、SN-PHA以及SN-PHB的水接触角数据图；

[0048] 图3为实施例1的实验结果，其中图3(a)为实施例1中样品流式数据表征绿色荧光蛋白编码的质粒DNA(pGFP)向Ramos细胞中的转染效率图，图3 (b)为实施例1中样品流式数据表征pGFP向Ramos细胞中转染后的平均荧光强度结果图；

[0049] 图4为实施例1中样品捕获以及果糖作用下释放Ramos细胞的密度统计；

[0050] 图5为实施例1中样品采用CCK-8测试的增殖能力结果图；

[0051] 图6为实施例2的实验结果，其中图6(a)为实施例2中样品流式数据表征pGFP向T细胞中的转染效率，图6(b)为实施例2中样品流式数据表征pGFP 向T细胞中转染后的平均荧光强度结果图；

[0052] 图7为实施例2中样品采用CCK-8测试的增殖能力结果图。

具体实施方式

[0053] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

[0054] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可从商业途径获得。

[0055] 实施例1：

[0056] (1)SiNWAs的制备：用硫酸/过氧化氢混合溶液(7:3体积比)清洗硅片，氮气吹干。配置含有氢氟酸和硝酸银的混合水溶液(其中去离子水90mL，氢氟酸30mL，硝酸银1.02g)，将此混合水溶液加入到清洗好的硅片中，50℃反应10min，而后用25％的稀硝酸溶液和去离子水清洗，真空干燥箱烘干，即得 SiNWAs。

[0057] (2)SiNWAs上修饰引发剂：将用硫酸：过氧化氢混合溶液(7:3体积比) 清洗过的SiNWAs放入到2％的2-溴-2-甲基丙酸(3-三甲氧基硅基)丙酯的无水甲苯溶液中，室温静置24h，然后用无水甲苯清洗，即得修饰了引发剂的SiNWAs，记为SN-Br。

[0058] (3)利用电子转移活化再生原子转移自由基聚合(ARGET-ATRP)方法表面接枝聚(甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)-共聚-2-氨基乙基甲基丙烯酸酯(AMA))：配置聚合反应液：AMA和HEMA的摩尔比为20:80，将2.2mmolAMA和8.8 mmolHEMA溶解到7mL无水甲醇和7mL去离子水的混合溶液中，然后按照顺序加入7μmol的CuBr2、44μmol的联吡啶(bpy)以及98μmol的抗坏血酸(Vc)，混合均匀后加入到SN-Br中，室温反应30min，用无水甲醇和去离子水交替清洗表面残余的单体和物理黏附的聚合物，得到表面接枝有AMA和HEMA共聚合物刷的基材，记为SN-PHA。

[0059] (4)表面后修饰4-羧基-3氟苯硼酸：配置浓度为5mg/mL的4-羧基-3氟苯硼酸(CFPBA)的无水N,N-二甲基甲酰胺的溶液，而后加入O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，控制其终浓度分别为为3.8mg/mL以及2.58μL/mL。而后鼓氮气30min后移入到手套箱中，然后将混合液体加入到SN-PHA中，室温反应12h后即得SN-PHB；该SN-PHB的SEM图和单根SN-PHB的TEM图见图1。

[0060] SiNWAs、SN-Br、SN-PHA以及SN-PHB的水接触角数据见图2。

[0061] 表1为样品制备过程中的XPS表征。

[0062] 表1

[0063]

[0064] (5)用75％的乙醇对SN-PHB基材进行消毒，然后用无菌PBS进行润洗，然后将基材放入含有1.5μg pGFP的PBS溶液中静置4h，使基材预先负载pGFP。

[0065] (6)然后将人B淋巴细胞瘤细胞Ramos以10万/孔的密度种植于基材表面，培养4h使细胞在基材表面充分黏附。

[0066] (7)用无菌PBS清洗未黏附的细胞以及一些蛋白质、盐类等，然后加入含有pGFP的无血清培养基，每孔中pGFP的质量为1.5μg。

[0067] (8)用波长为808nm的激光光源在2.3W/cm2的功率下照射30s，然后将培养板放回到细胞培养箱中放置4h，接下来的样品分为两部分处理：分别为 (9-1)中流式细胞计数表征pGFP转染情况和(9-2)中释放的Ramos细胞的增殖能力表征和荧光显微镜表征细胞释放情况：

[0068] (9-1)将培养液更换成无菌的60mM的果糖溶液，120rpm下摇晃20min，然后用枪头轻轻吹打收集释放的细胞，然后离心重悬到新的培养基中，放置于新的培养孔中继续培养48h，48h后收集上述Ramos细胞于无菌PBS中，并将未经过任何处理的Ramos细胞作为对照组进行流式细胞仪测试，表征其转染效率；测试结果见图3，图3(a)为样品流式数据表征pGFP向Ramos细胞中的转染效率图，(b)为样品流式数据表征pGFP向Ramos细胞中转染后的平均荧光强度结果图。从流式数据图中可以看出，利用本发明中的材料SN-PHB经过近红外光照射后，其转染效率达到85％左右，证明本发明可以高效率的对悬浮细胞进行转染外源性大分子pGFP。

[0069] (9-2)将培养液更换成无菌的60mM的果糖溶液，120rpm下摇晃20min，然后用枪头轻轻吹打收集释放的细胞然后离心重悬到新的培养基中，放到新的培养孔中继续培养，并对继续培养的细胞采用CCK-8测试其增殖能力。细胞释放实验前后，用细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对样品上的细胞进行染色，观察脱附前后细胞数量。测试结果见图4和图5。图4为样品捕获以及果糖作用下释放 Ramos细胞的密度统计。Si-PHB为之前所述的在硅片基材上修饰的PHB聚合物刷，SiNWAs为前面所述的将硅片制成硅纳米线阵列，SN-PHB为前面所述的在 SiNWAs上修饰的PHB聚合物刷。从数据图可以看出，在平面硅片和修饰有PHB 的Si-PHB基材上，其捕获的Ramos细胞非常少，而SiNWs和SN-PHB基材能够增强对Ramos的捕获，这是由于SiNWAs的拓扑结构和PHB中苯硼酸基团对 Ramos细胞的亲和性。并且在加入果糖溶液后，SN-PHB表面捕获的Ramos细胞基本全部被释放掉。证明利用本发明中所制备的材料，可以捕获悬浮的Ramos 细胞，并且能将捕获的细胞通过糖响应性从基材上收获下来，并用于后续的表征研究以及应用之中。图5为采用CCK-8测试的Ramos细胞增殖能力结果，从图中可见，利用本发明中的材料，经过激光照射传递的Ramos细胞能够保持良好的细胞增殖活性。

[0070] 实施例2：

[0071] (1)SiNWAs的制备：用硫酸/过氧化氢混合溶液(7:3体积比)清洗硅片，氮气吹干。配置含有氢氟酸和硝酸银的混合水溶液(其中去离子水90mL，氢氟酸30mL，硝酸银1.02g)，将此混合水溶液加入到清洗好的硅片中，50摄氏度反应10min，而后用25％的稀硝酸溶液和去离子水清洗，真空干燥箱烘干，即得SiNWAs。

[0072] (2)SiNWAs上修饰引发剂：将用硫酸：过氧化氢混合溶液(7:3体积比) 清洗过的SiNWAs放入到2％的2-溴-2-甲基丙酸(3-三甲氧基硅基)丙酯的无水甲苯溶液中，室温静置24h，然后用无水甲苯清洗，即得修饰了引发剂的SiNWAs，记为SN-Br。

[0073] (3)利用ARGET-ATRP表面接枝聚(甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)-共聚-2- 氨基乙基甲基丙烯酸酯(AMA))：配置聚合反应液：AMA和HEMA的摩尔比为20:80，将2.2mmolAMA和8.8mmolHEMA溶解到7mL无水甲醇和7mL去离子水的混合溶液中，然后按照顺序加入7μmol的CuBr2、44μmol的联吡啶(bpy)以及98μmol的抗坏血酸(Vc)，混合均匀后加入到SN-Br中，室温反应30min，用无水甲醇和去离子水交替清洗表面残余的单体和物理黏附的聚合物，得到表面接枝有AMA和HEMA共聚合物刷的基材，记为SN-PHA。

[0074] (4)表面后修饰4-羧基-3氟苯硼酸：配置浓度为5mg/mL的4-羧基-3氟苯硼酸(CFPBA)的无水N,N-二甲基甲酰胺的溶液，而后加入O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，控制其终浓度分别为为3.8mg/mL以及2.58μL/mL。而后鼓氮气30min后移入到手套箱中，然后将混合液体加入到SN-PHA中，室温反应12h后即得SN-PHB。

[0075] (5)用75％的乙醇对SN-PHB基材进行消毒，然后用无菌PBS进行润洗，然后将基材放入含有1.5μgpGFP的PBS溶液中静置4h，使基材预先负载pGFP。

[0076] (6)将T细胞以10万/孔的密度种植于基材表面，培养4h使细胞在基材表面充分黏附。

[0077] (7)用无菌PBS清洗未黏附的T细胞以及一些蛋白质、盐类等，然后加入含有pGFP的无血清培养基，每孔中pGFP的质量为1.5μg。

[0078] (8)用波长为808nm的激光光源在2.3W/cm2的功率下照射30s，然后将培养板放回到细胞培养箱中放置4h，接下来的样品分为两部分处理：分别为 (9-1)中流式细胞计数表征pGFP转染情况和(9-2)中释放的T细胞的增殖能力表征。

[0079] (9-1)将培养液更换成无菌的60mM的果糖溶液，120rpm下摇晃20min，然后用枪头轻轻吹打收集释放的细胞然后离心重悬到新的培养基中，放置于新的培养孔中继续培养48h，48h后收集上述T细胞于无菌PBS中，并将未经过任何处理的T细胞作为阴性对照组，采用商品化Lipo2000转染试剂向T细胞中转染pGFP作为阳性对照(Lipo2000向T细胞中转染pGFP：在48孔板中以10 万/每孔的密度种植T细胞，4h后，将Lipo2000和pGFP复合10min后加入到上述种植的T细胞中，转染6h后，将含有Lipo2000和pGFP复合物的培养基更换成含有血清的新鲜培养基继续培养48h)，对三种样品进行流式细胞仪测试，表征其转染效率；结果见图6，图6(a)为样品流式数据表征pGFP向T细胞中的转染效率，(b)为样品流式数据表征pGFP向T细胞中转染后的平均荧光强度结果图。从流式数据图中可以看出，商品化的转染试剂Lipo2000对T细胞转染 pGFP的效率几乎没有，而利用本发明中的材料SN-PHB经过近红外光照射后，其转染效率达到80％以上，证明本发明可以高效率的对难转染的悬浮T细胞进行转染外源性大分子pGFP。

[0080] (9-2)将培养液更换成无菌的60mM的果糖溶液，120rpm下摇晃20min，然后用枪头轻轻吹打收集释放的细胞然后离心重悬到新的培养基中，放到新的培养孔中继续培养，并对继续培养的细胞采用CCK-8测试其增殖能力。测试结果见图7，从图7可见，利用本发明中的材料，经过激光照射传递的T细胞能够保持良好的细胞增殖活性。

[0081] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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