采用土著PHA合成菌回注法提高剩余活性污泥合成PHA产率
专利汇可以提供采用土著PHA合成菌回注法提高剩余活性污泥合成PHA产率专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 采用回注少量土著PHA高产合成菌，“规制”驯化初期活性 污泥 的驯化方向，促使 活性污泥 中PHA合成菌成为优势菌群，提高活性污泥合成PHA产率。本发明的目的是建立一种简单、经济、快速提高活性污泥合成PHA产率的方法——土著PHA高产合成菌回注法；提供一种结构简单、自动化程度较高、造价低廉、易操作的活性污泥驯化装置。其操作步骤如下：采用Nile-Red 荧光 染色 法从试验所用活性污泥中分离得到PHA合成菌，筛选PHA高产菌作为回注用菌；将0.1-0.25g的回注菌(单株)或回注菌群(数株)接种于活性污泥驯化初期的反应桶中，完成驯化周期；排净驯化液，加入 发酵 培养基和微量元素液进行PHA发酵，发酵结束收集污泥沉淀，干燥，使用氯仿抽提PHA；抽提液经浓缩于冷甲醇中沉淀析出PHA。该方法能够有效地提高活性污泥合成PHA的产率三成至五成。 摘要 附图 是本发明的活性污泥驯化装置。，下面是采用土著PHA合成菌回注法提高剩余活性污泥合成PHA产率专利的具体信息内容。
1.回注土著PHA合成菌提高活性污泥合成PHA生产率的方法，包括以下步骤：
a)采用Nile-Red荧光染色法从实验所用活性污泥中分离得到一株或三株PHA合成 菌，选择其中一株或三株土著高产PHA合成菌作为回注菌株；
b)采用由空气泵(1)、补充驯化液恒流泵(2)、驯化反应桶(3)、排出上清液恒流泵(4)、 微电脑时控开关(5)、温度计(6)和恒温水浴搅拌装置(7)、进液孔(8)、出液孔(9)、 排气孔(10)、进液桶(11)、排液桶(12)和排气指示杯(13)组成的活性污泥驯化装置， 进行活性污泥驯化，具体过程是：土著高产PHA合成菌经扩大培养和离心收集菌体后， 将0.10-0.25g湿菌体加入至含有活性污泥和驯化液的3L驯化反应桶中，进行驯化，整个驯 化周期为10天，温度25℃，每个循环包括：2小时厌氧，4小时好氧，1.5小时沉淀， 0.5小时排出1升上清液和加入1升新鲜驯化液，驯化液为C6H12O6 0.150～0.300g/L， MgSO4 0.050～0.100g/L，(NH4)2SO4 0.010～0.100g/L，CaCl2 0.010～0.020g/L，KCl 0.050～ 0.100g/L，K2HPO4 0.050～0.100g/L，蛋白胨0.100～0.200g/L，酵母0.010～0.100g/L，pH 7.0；
c)驯化后污泥合成PHA：驯化结束后，排净驯化液，加入出C6H12O6 5.0～10.0g/L，MgSO4 0.100～0.500g/L，CaCl2 0.010～0.050g/L和微量元素1mL/L组成的发酵液，pH7.0，进行PHA 发酵，好氧发酵48小时，温度30℃；组成该发酵液的微量元素的成分为：H3BO3 0.3g/l， CoCl2·6H2O 0.2g/l，ZnSO4·7 H2O 0.1g/l，MnCl2·4 H2O 30mg/l，NaMoO4·2 H2O 30mg/l， NiCl2·6 H2O 20mg/l和CuSO4·5 H2O 10mg/l；
d)PHA提取：发酵结束，离心收集污泥沉淀，干燥至恒重，氯仿抽提，抽提液经旋转蒸 发仪浓缩至5-10mL，40-80倍冷甲醇中沉淀析出PHA。
2.根据权利要求1所述的回注土著PHA合成菌提高活性污泥合成PHA生产率的方法， 其特征在于：采用Nile-Red荧光染色法从实验所用活性污泥中分离得到一株或三株PHA 合成菌，选择其中一株或三株土著高产PHA合成菌作为回注菌株的步骤是将污泥按比例稀 释为10-1～10-7，10-3～10-7每个稀释度取0.1mL涂布PHA合成菌平板，培养4-5天后在 312nm紫外灯下观察，发桔黄色荧光的菌落即为PHA合成菌，保存PHA合成菌，并进行发 酵合成PHA实验，筛选到高产PHA菌株，用于活性污泥回注法。
3.根据权利要求1所述的回注土著PHA合成菌提高活性污泥合成PHA生产率的方法， 其特征在于：活性污泥驯化装置中的微电脑时控开关(5)控制恒温水浴搅拌装置(7)、 补充驯化液恒流泵(2)、排出上清液的恒流泵(4)和空气泵(1)定时开关，按照规定要 求，自动完成厌氧、好氧和沉淀驯化过程，补充驯化液的恒流泵(2)和排出上清液的恒流 泵(4)控制驯化反应桶(3)中液体量恒定。
4.根据权利要求1所述的回注土著PHA合成菌提高活性污泥合成PHA生产率的方法， 其特征在于：活性污泥驯化装置中的驯化反应桶(3)由4mm厚的有机玻璃制成，Φ＝150 mm，h＝400mm，内置磁性转子，驯化反应桶(3)外加恒温水浴搅拌装置(7)，顶部有进 液孔(8)、出液孔(9)和排气孔(10)。
技术领域
背景技术
1974年Wallen从活性污泥中分离得到PHA，为以后利用活性污泥合成PHA 的研究奠定了基础。在污水生物处理尤其是厌氧-好氧活性污泥法中PHA是一种 重要的中间产物，扮演着能量转化器的角色。在有氧阶段聚磷菌吸收废水中的磷， 形成胞内多聚磷酸盐，同时有糖原形成，当环境中无氧时，聚磷菌以体内的多聚磷 酸盐和糖原为能量，吸收环境中的有机物，并在胞内转化为PHA。在污水处理过程 中，产生大量的剩余活性污泥，需要进行适当处理，否则会造成二次污染。利用剩 余活性污泥经驯化，发酵制备生物降解材料PHA，既能解决剩余活性污泥资源化的 问题，又能降低PHA合成成本。堪称一箭双雕。然而，利用剩余活性污泥合成PHA 的产率不高，制约了该方法的推广应用。
发明内容
本发明的目的2是提供一种结构简单、自动化程度较高、造价低廉、易操作的 活性污泥驯化装置。
本发明提出一种回注土著PHA合成菌提高活性污泥生产率的方法，包括以下步 骤：a)采用Nile-Red荧光染色法从实验所用活性污泥中分离得到一株或数株PHA 合成菌，选择其中一株或几株高产PHA菌作为回注菌株；b)采用自行设计的活性污 泥驯化装置，进行活性污泥驯化；c)土著高产PHA合成菌经扩大培养和离心收集 菌体后，将一定量加入至含有活性污泥和驯化液的驯化反应桶中，进行驯化；d)整 个驯化周期为10天，温度25℃，每个循环包括：2小时厌氧，4小时好氧，1.5小 时沉淀，0.5小时排出1升上清液和加入1升新鲜驯化液；e)驯化结束后，排净驯化 液加入发酵培养基进行PHA发酵，温度30℃；f)发酵结束，收集污泥沉淀，干燥， 采用氯仿抽提PHA，计算产率。
所述的活性污泥驯化装置，由空气泵(1)、补充驯化液恒流泵(2)、驯化反应 桶(3)、排出上清液恒流泵(4)、微电脑时控开关(5)、温度计(6)、恒温水浴搅 拌装置(7)、进液孔(8)、出液孔(9)、排气孔(10)、进液桶(11)、排液桶(12) 和排气指示杯(13)等部分组成。
所述的活性污泥驯化装置的特征在于：微电脑时控开关(5)能控制恒温水浴搅 拌装置(7)、补充驯化液恒流泵(2)、排出上清液的恒流泵(4)和空气泵(1)定 时开关，使整个驯化装置成为一个整体，按照规定要求，自动完成厌氧、好氧和沉 淀驯化过程。补充驯化液的恒流泵(2)和排出上清液的恒流泵(4)能控制驯化反 应桶(3)中液体量恒定。驯化反应桶(3)由4mm厚的有机玻璃制成(Φ＝150mm， h＝400mm)。内置磁性转子。驯化反应桶(3)外加恒温水浴搅拌装置(7)，顶部有 进液孔(8)、出液孔(9)和排气孔(10)。
回注菌是分离自实验所用活性污泥中的高产土著PHA合成菌。
本发明的主要优点是：第一，在驯化初期回注少量高产土著PHA合成菌或菌群， 能够“规制”驯化方向，促使污泥中PHA合成菌成为优势菌，大量繁殖，从而抑制 非PHA合成菌生长，有效提高活性污泥合成PHA产率，降低PHA生产成本。第二， 该装置能自动、准确的完成活性污泥好氧-厌氧-沉淀-排上清液和补新鲜培养基 的各个步骤。具有结构简单、自动化程度较高、造价低廉、易操作等特点。
附图说明
下面结合附图和实例对本发明进一步说明。
图1.本专利申请的活性污泥驯化装置示意图
1.空气泵、2.补充驯化液恒流泵、3.驯化反应桶、4.排出上清液恒流泵、5.微 电脑时控开关、6.温度计、7.恒温水浴搅拌装置、8.进液孔、9.出液孔、10.排 气孔、11.进液桶、12.排液桶和13.排气指示杯。
图2.单株高产土著PHA合成菌回注法与非回注法驯化过程中PHA合成菌数和 总菌数的变化(回注菌分离自生活及少量工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)
图3.单株高产土著PHA合成菌回注法与非回注法驯化过程中葡萄糖利用率的 变化(回注菌分离自生活及少量工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)
图4.混合高产土著PHA合成菌群回注法与非回注法驯化过程中PHA合成菌数 和总菌数的变化(三株回注菌分离自生活及工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)
图5.混合高产土著PHA合成菌群回注法与非回注法驯化过程中葡萄糖利用率 的变化(三株回注菌分离自生活及工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)
具体实施方式
采用回注单株高产土著PHA合成菌提高污泥(生活及少量工业废水污水处理 厂好氧池活性污泥)合成PHA产率。
1.试验仪器
1.1生物反应桶
本试验使用一个3升的自制反应桶作为生物反应桶，反应桶顶部有进液孔、出 液孔、排气孔和温度计孔，内置磁力转子，生物反应桶置于具有磁力搅拌功能的恒 温水浴装置内，以确保反应过程中温度恒定。
1.2供气系统
本试验所使用的空气泵能准确地控制通入反应桶中的量为1.2L/min。
1.3排液和补液恒流泵
恒流泵能匀速吸取液体，排液恒流泵在15分钟内将1L上清液排出，补液恒流 泵在后15分钟内加入1L新鲜驯化液，保证反应器中活性污泥驯化需要的各种营 养物质。
1.4微电脑时控开关
通过定时开启和关闭控制供气系统、排液和补液恒流泵，使活性污泥驯化过程 中厌氧、好氧和沉淀各个过程按要求进行，在整个驯化周期中自动完成各个驯化循 环。
1.5旋转蒸发仪浓缩PHA抽提液.(氯仿)至5-10mL。
1.6酸度计测定驯化液和每个循环流出液pH值。
2.程序
2.1驯化液的配制
C6H12O6 0.150～0.300g/L，MgSO4 0.050～0.100g/L，(NH4)2SO40.010～0.100g/L， CaCl2 0.010～0.020g/，KCl 0.050～0.100g/L，K2HPO4 0.050～0.100g/L，蛋白胨 0.100～0.200g/L，酵母0.010～0.100g/L，pH7.0
2.2发酵液配制：C6H12O6 5～10g/L，MgSO4 0.100～0.500g/L，CaCl2 0.010～ 0.050g/L微量元素1mL/L(成分见表1)，pH7.0
表1微量元素成分表
成分 含量 H3BO3 0.3g/l CoCl2·6H2O 0.2g/l ZnSO4·7H2O 0.1g/l MnCl2·4H2O 30mg/l NaMoO4·2H2O 30mg/l NiCl2·6H2O 20mg/l CuSO4·5H2O 10mg/l
2.3PHA合成菌分离和计数培养基的配制：牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L， NaCl 3～7g/L，葡萄糖15～25g/L，琼脂粉1.5～2.5g/100mL，尼尔红(Nile red) 0.1～0.3mL/100mL，pH7.0
2.4总菌数计数培养基的配制：牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，NaCl 3～ 7g/L，琼脂粉1.5～2.5g/100mL，pH7.0
2.5采用Nile-Red法分离高产土著PHA合成菌
将污泥按比例稀释为10-1～10-7，10-3～10-7每个稀释度取0.1mL涂布PHA合 成菌平板，培养4-5天后在312nm紫外灯下观察，发桔黄色荧光的菌落即为PHA 合成菌，保存PHA合成菌，并进行发酵合成PHA实验，筛选到高产PHA菌株，用于 活性污泥回注法。
2.6高产土著PHA合成菌的鉴定：筛选所得的一株PHA高产菌株经 BIOLOG-System系统鉴定为：Pseudomonas bathycetes。
2.7接种
a.对照组：活性污泥经9000rpm离心15min，收集沉淀部分，取湿重75.00g加 入3L反应器中。
b.试验组：活性污泥经9000rpm离心15min，收集沉淀部分，取湿重75.00g加 入3L反应器中。高产土著PHA合成菌培养液经9000rpm离心，取0.1g～0.25g湿 菌体加入至3L反应器中。
2.8活性污泥驯化
对照组和试验组驯化方式相同：2小时厌氧，4小时好氧，1.5小时沉淀，0.5 小时排出1升上清液和加入1升新鲜驯化培养基，每个驯化循环8小时，每天实 施3个循环，整个驯化周期为10天。
2.9驯化过程中的参数分析
a.驯化液中总菌数计数方法
每间隔48小时取驯化液1mL(好氧期末)，第一次取样在驯化46小时实施。 采用倾注平皿法计数总菌数：取10支无菌试管，每管加入9mL无菌生理盐水，吸 取1mL驯化液加入到试管1中，混匀，样品稀释倍数即为101，从试管1中取1mL 加入至试管2中，样品稀释倍数即为102，以此类推，稀释至108。取103到108各 稀释度0.5mL，加至无菌平板中。同时，倒入熔化的计数琼脂培养基(45～50℃)， 混匀，30℃培养，24～48小时后计数菌落数，计算总菌数。
b.驯化液中PHA合成菌数计数方法
取样方法同上述a。采用Nile-Red荧光染色法计数PHA合成菌数。取10支无 菌试管，每管加入9mL无菌生理盐水，吸取1mL驯化液加入到试管1中，混匀， 样品稀释倍数即为101，从试管1中取1mL加入到试管2中，样品稀释倍数即为102， 以此类推，稀释至108。取103到108各个稀释度0.5mL，加至无菌平板中，同时， 倒入熔化的PHA合成菌计数培养基(45～50℃)，混匀，30℃培养，4-5天后，在 312nm下计数发桔黄色荧光的菌落数目，计算PHA合成菌数。
c.葡萄糖利用率
每间隔48小时取排出驯化液1mL，第一次取样在47.5小时左右实施。采用葡 萄糖试剂盒[国食药监械(准)字，2004第3400196号]进行测定。配制一定体积 的工作液[R1(葡萄糖氧化酶加过氧化氢酶)与R2(磷酸缓冲液)以9比1的比例 混合]。分别给空白对照管，标准样品管和样品测定管中加入3mL工作液。再依次 加入20μL蒸馏水，20μL葡萄糖标准品(浓度为5.55×10-3moL/L)和20μL待测样 品。于37℃放置15分钟，505nm比色，得到A标准和A样品。
样品中葡萄糖量＝(A样品/A标准)×标准浓度×体积×葡萄糖分子量
葡萄糖利用率＝[(初始葡萄糖量-样品中葡萄糖量)/初始葡萄糖量]×100％
2.10驯化后污泥合成PHA
排净驯化液，加入发酵培养基，好氧发酵48小时。
2.11 PHA提取
发酵结束，离心收集污泥沉淀，干燥至恒重。氯仿抽提，抽提液经旋转蒸发仪 浓缩至5-10mL，40-80倍冷甲醇中沉淀析出PHA。
2.12对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，PHA合成菌数与总菌数的变 化情况见图2。对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，葡萄糖利用率 变化情况见图3所示。
3.实施例1结果
通过计算PHA产率[产率＝(PHA干重/污泥干重)×100％]，回注法比非回 注法合成PHA产率提高了51.91％。结果说明，回注单株高产土著PHA合成菌的方法 能够有效提高活性污泥合成PHA的产率。
实施例2
采用回注混合高产土著PHA合成菌群提高污泥(生活及工业废水污水处理厂 好氧池活性污泥)合成PHA产率。
1.试验仪器
同实施例1
2.程序
2.1驯化液的配制同实施例1
2.2发酵液配制同实施例1
2.3PHA合成菌分离和计数培养基配制同实施例1
2.4总菌数计数培养基配制同实施例1
2.5采用Nile-Red法分离得到三株高产土著PHA合成菌方法同实施例1
2.6高产土著PHA合成菌的鉴定：分离所得的三株高产土著PHA合成菌未进行分 类鉴定；
2.7接种
a.对照组：同实施例1
b.回注组：活性污泥的收集，加入量与实施例1同。三株高产土著PHA合成菌 分别经9000rpm离心，各取0.033g～0.083g湿菌体加入至3L反应器中。
2.8活性污泥驯化同实施例1
2.9驯化过程中的参数分析方法同实施例1
2.10驯化后污泥合成PHA同实施例1
2.11 PHA提取同实施例1
2.12对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，PHA合成菌数与总菌数的 变化情况见图4。对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，葡萄糖利用率 变化情况见图5所示。
3.实施例2结果
通过计算PHA产率[产率＝(PHA重量/污泥干重)×100％]，回注法比非回 注法合成PHA产率提高了39.45％。结果说明，回注混合高产土著PHA合成菌的方法 能有效提高活性污泥合成PHA的产率。
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