视黄酯的生产
阅读：147发布：2020-06-12
专利汇可以提供视黄酯的生产专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种经由视黄醇的转换来生产视黄酯，诸如特别是视黄基长链酯的新颖酶促方法，所述方法包括使用具有酰基转移酶活性的酶。所述方法可用于维生素A的 生物 技术生产。，下面是视黄酯的生产专利的具体信息内容。
1.一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞包含具有视黄醇酰化活性，优选酰基转移酶[EC 2.3.1]活性，更优选酰基转移酶[EC 2.3.1.20]活性的酶，基于由所述宿主细胞产生的类视黄醇的总量，所述宿主细胞产生百分比为至少约20％的长链视黄酯。
2.根据权利要求1所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞包含异源酰基转移酶。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属(Paracoccus)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)、布拉霉属(Blakeslea)和耶氏酵母属(Yarrowia)，更优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述酰基转移酶选自植物、包括人在内的动物、藻类、包括酵母在内的真菌、或细菌，优选地选自果蝇属(Drosophila)、镰刀菌属(Fusarium)、毛霉属、人、大鼠和耶氏酵母属。
5.根据权利要求4所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述酰基转移酶是选自耶氏酵母属或果蝇属，优选地选自解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)或黑腹果蝇(D.melanogaster)的酰基转移酶。
6.根据权利要求5所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述酰基转移酶选自与根据序列XM_502557或序列NM_135969的酰基转移酶具有至少约60％同一性的多肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述长链视黄酯被进一步转换为维生素A。
8.一种经由酰基转移酶[EC 2.3.1]的酶促活性生产包括长链视黄酯的类视黄醇的方法，所述方法包括使视黄醇与所述酰基转移酶接触，其中所述长链视黄酯混合物中反式同种型与顺式同种型的比值为至少约4。
9.根据权利要求8所述的方法，所述方法使用根据权利要求1至7中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞。
10.一种产生维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将编码酰基转移酶[EC 2.3.1]的核酸分子引入合适的产生胡萝卜素的宿主细胞中，
(b)将视黄醇酶促转换为包含比值为至少约4的反式视黄酯和顺式视黄酯的长链视黄酯混合物，
(c)在合适的培养条件下将长链视黄酯转换为维生素A。
11.酰基转移酶[EC 2.3.1]用于产生包含比值为至少约4的反式视黄酯和顺式视黄酯的长链视黄酯混合物的用途，其中所述酰基转移酶在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞中异源表达。
视黄酯的生产
[0001] 本发明涉及一种经由视黄醇的转换来生产视黄酯(retinyl esters)，诸如特别是视黄基长链酯(retinyl long chain esters)的新颖酶促方法，所述方法包括使用具有酰基转移酶活性的酶。所述方法可用于维生素A的生物技术生产。
[0002] 视黄酯，包括例如长链视黄酯，是类视黄醇生产，特别是诸如维生素A生产过程中的重要中间体/前体。类视黄醇，包括维生素A，是必须经由营养品供应给人类的非常重要且不可缺少的营养因子之一。类视黄醇促进人类的健康，尤其是在视觉、免疫系统和生长方面。
[0003] 目前用于类视黄醇(包括维生素A及其前体)的化学生产方法具有一些不期望的特性，诸如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了其他制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的方法，包括微生物转换步骤，这将更加经济和环保。
[0004] 通常，产生类视黄醇的生物系统在工业上难以处理，且/或以低水平产生化合物，使得商业规模的分离是不可行的。造成这种情况的原因有一些，包括类视黄醇在此类生物系统中的不稳定性或副产物的相对高产量。
[0005] 因此，改善β-胡萝卜素酶促转换为维生素A的产物特异性和/或生产率是一项持续存在的任务。特别地，期望优化参与视黄醇朝向视黄酯(诸如长链视黄酯)的转换的酶的生产率。
[0006] 令人惊讶地，我们现在发现，视黄酯(特别是长链视黄酯)的产生是通过使用能够将视黄醇转换为长链视黄酯的具有酰基转移酶活性的特异性酶而触发的。
[0007] 特别地，本发明涉及一种宿主细胞，特别是产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含酰基转移酶活性，所述宿主细胞能够产生，即能够将视黄醇酶促转换为视黄基长链酯。
[0008] 术语“酰基转移酶”、“视黄醇酰化酶”、“具有视黄醇酰化活性的酶”在本文中可互换使用，并且是指能够催化视黄醇转换为长链视黄酯的酶。
[0009] 如本文所述的酶在这样的方法中可为特别有用的，所述方法包括使用产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞能够产生高百分比的反式同种型，诸如产生这样的类视黄醇，其中至少约65％的百分比为反式类视黄醇，包含反式视黄醇或顺式视黄醇，诸如约至少65％至90％的类视黄醇为反式同种型，这可能是由于在相应宿主细胞中表达的反式特异性β-胡萝卜素氧化酶(BCO)的作用。然而，如本文所限定的酰基转移酶能够以相同的活性催化反式视黄醇或顺式视黄醇。
[0010] 如本文所用，术语“真菌宿主细胞”尤其包括酵母作为宿主细胞，例如耶氏酵母属(Yarrowia)或酵母属(Saccharomyces)。
[0011] 与视黄醇的酶促催化有关的术语“转换”或“酰化”在本文中可互换使用，并且是指酰基转移酶的作用，所述酰基转移酶包括但不限于如本文所限定的DGAT、DGA、YAL。
[0012] 优选将如本文所限定的酰基转移酶引入合适的宿主细胞，诸如产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，即表达为异源酶，或可表达为内源酶，所述酰基转移酶导致产生基于视黄酯，特别是长链视黄酯的总量，至少约20％的长链视黄酯。优选地，如本文所述的酶被(过)表达为异源酶。
[0013] 根据本发明的合适的酰基转移酶可获自不同来源，诸如植物、动物(包括人)、藻类、真菌(包括酵母)或细菌。所述酰基转移酶包括酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶家族[EC 2.3.1]的成员，包括但不限于DGAT[EC 2.3.1.20]，诸如DGAT1或DGAT2、ARAT、mdy，特别是从耶氏酵母属(Yarrowia)，优选解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)分离的酰基转移酶，诸如根据SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7的酶或由来自数据库的序列(例如，编码解脂耶氏酵母DGA2的XM_504700；编码解脂耶氏酵母ARE2的XM_505086)编码的酶；从毛霉属(Mucor)，优选卷枝毛霉(Mucor circinelloides)分离的酰基转移酶，诸如由从数据库已知的序列(例如，EPB93051.1)编码的酶；从镰刀菌属(Fusarium)，优选藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)分离的酰基转移酶，诸如由从数据库已知的序列(例如CCT66282.1)编码的酶；从哺乳动物，诸如人或大鼠，优选智人(Homo sapiens)或褐家鼠(Rattus norvegicus)分离的酰基转移酶，诸如由从数据库已知的序列(例如NM_053437或NM_012079)编码的酶；从果蝇属(Drosophila)，优选黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)分离的酰基转移酶，诸如从数据库已知的酶(NM_135969，例如UniProtKB序列Q960U8)。
[0014] 在一个实施方式中，具有如本文所限定的酰基转移酶活性，即增强的经由视黄醇的酰化而朝向形成长链视黄酯的活性的多肽，能够获自果蝇属，诸如黑腹果蝇，特别地选自与SEQ ID NO:3具有至少约60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，SEQ ID NO:3例如由根据SEQ ID NO:4的多核苷酸序列编码，所述序列在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，并且在如本文所述的合适条件下表达。可以对序列进行密码子优化以在相应宿主细胞中表达。
[0015] 在一个实施方式中，具有如本文所限定的酰基转移酶活性，即增强的经由视黄醇的酰化而朝向形成长链视黄酯的活性的多肽，能够获自镰刀菌属，诸如藤仓镰刀菌，特别地选自与FfDgat1(序列CCT66282.1)具有至少约60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，所述序列在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，并且在如本文所述的合适条件下表达。可以对序列进行密码子优化以在相应宿主细胞中表达。
[0016] 在一个实施方式中，具有如本文所限定的酰基转移酶活性，即增强的经由视黄醇的酰化而朝向形成长链视黄酯的活性的多肽，能够获自耶氏酵母属，诸如解脂耶氏酵母，特别地选自与YlDGA2(序列XM_504700)、YlARE2(序列XM_505086)、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有至少约60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，所述序列在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，并且在如本文所述的合适条件下表达。可以对序列进行密码子优化以在相应宿主细胞中表达。
[0017] 优选地，如本文所述的具有酰基转移酶活性的多核苷酸在合适的(表达)载体上表达，所述载体能够在例如转化到合适的宿主细胞(诸如产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞)中后增强克隆到其中的所述多核苷酸的表达。克隆的多核苷酸通常可操作地连接至某些控制序列，诸如启动子序列。技术人员知道哪些(表达)载体和/或启动子适合在如本文所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞中表达。
[0018] 用于使如本文所限定的宿主细胞产生更多蛋白质和/或基因拷贝的修饰可以包括：使用强启动子、合适的转录和/或翻译增强子，或将一个或多个基因拷贝引入产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，导致在给定时间内相应酶的积累增加。技术人员知道根据宿主细胞使用哪些技术。基因表达的增加或减少可以通过各种方法来测量，诸如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。
[0020] 因此，本发明涉及如本文所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含编码如本文所述的酰基转移酶的表达载体或已整合到其染色体DNA中的编码如本文所述的酰基转移酶的多核苷酸。此类产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞被称为重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含在表达载体上或整合到染色体DNA中的编码如本文所述的酰基转移酶的异源多核苷酸。产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，可包含编码如本文所限定的酰基转移酶的基因的一个或多个拷贝，诸如编码与根据SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或由数据库序列(例如XM_504700、EPB93051.1、XM_505086、CCT66282.1、NM_012079或NM_053437)编码的已知序列具有至少约60％同一性的多肽的多核苷酸，从而导致编码如本文所限定的酰基转移酶的此类基因过表达。基因表达的增加可以通过各种方法来测量，诸如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。
[0021] 基于如本文所公开的序列并且基于将视黄醇酰化成长链视黄酯，其中转换率为至少约20％是长链视黄酯的形式的偏好，能够容易地推断出编码如本文所限定的具有视黄醇酰化活性的多肽的其他合适的基因，所述多肽能够用于将视黄醇转换为长链视黄酯。因此，本发明涉及一种鉴定新颖视黄醇酰化酶的方法，其中将与序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或由数据库序列(例如XM_504700、EPB93051.1、XM_505086、CCT66282.1、NM_012079，或NM_053437)编码的序列具有至少约60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽用作新颖酰基转移酶筛选方法中的探针，所述新颖酰基转移酶具有产生反式同种型或顺式同种型长链视黄酯的偏好。本文公开的任何具有酰基转移酶活性的多肽都可以用于如本文所述由视黄醇生产长链视黄酯，只要酰化作用导致基于产生的类视黄醇的总量，至少约20％的长链视黄酯即可。
[0022] 本发明特别地涉及此类新颖酰基转移酶在生产长链视黄酯的方法中的用途，其中基于类视黄醇的总量，顺式同种型的产量可被减少到约20％或更少。该方法可以用表达所述酰基转移酶的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞执行，优选地其中编码所述酶的基因是异源表达的，即被引入到所述宿主细胞中，此外还表达反式特异性酶，诸如反式特异性BCO，从而催化β-胡萝卜素转换为优选视黄醛的反式同种型。视黄酯，特别是长链视黄酯，能够通过(已知的)合适机制的作用而被进一步转换为维生素A。
[0023] 如本文所用，关于长链视黄酯的生产，术语“至少约20％”是指类视黄醇中的至少约20％，诸如30％、40％、50％、60％、70％、80％、87％、90％、92％、95％、97％、99％或至多100％是长链视黄酯。关于长链视黄酯的顺式同种型的生产，术语“约20％或更少”是指产生的长链视黄酯中的约20％或更少，诸如18％、16％、14％、12％、10％、8％、7％、5％、2％或直至0％是顺式同种型形式。所有这些数字均基于如本文所限定的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中存在的类视黄醇的总量。
[0024] 术语“序列同一性”、“％同一性”或“序列同源性”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此限定，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,Longden和Bleasby,Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
[0025] 如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。如果所比较的两个氨基酸序列在他们的任何氨基酸上都没有差异，则它们是相同的或具有100％的同一性。关于本文所限定的源自植物的酶，技术人员知道植物来源的酶可包含叶绿体靶向信号，所述叶绿体靶向信号将经由特定的酶(例如叶绿体加工酶(chloroplast processing enzyme,CPE))被切割。
[0026] 取决于宿主细胞，如本文所限定的用于视黄醇的酰化的多核苷酸可经优化以在相应宿主细胞中表达。技术人员知道如何生成此类经修饰的多核苷酸。应当理解的是，如本文所限定的多核苷酸还包括此类经宿主优化的核酸分子，只要它们仍表达具有如本文所限定的相应活性的多肽即可。
[0027] 如本文所限定的酰基转移酶还包括带有不改变酶活性的一种或多种氨基酸取代的酶，即所述酶相对于野生型酶显示出相同的性质并且催化视黄醇转换为如本文所限定的长链视黄酯。此类突变也称为“沉默突变”，其不改变如本文所述的酶的(酶促)活性。
[0028] 根据本发明的核酸分子可仅包含由本发明提供的核酸序列(诸如本文所公开的序列，诸如根据序列XM_504700、XM_504038、EPB93051.1、XM_505086、CCT66282.1、XM_502557、NM_135969、NM_012079、NM_053437或根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列中所示的)的部分或片段，例如可用作探针或引物的片段或编码如本文所限定的酰基转移酶的部分的片段。由酰基转移酶的克隆确定的核苷酸序列允许生成被设计用于鉴定和/或克隆来自其他物种的其他同源物的探针和引物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸，所述基本上纯化的寡核苷酸通常包含优选在高度严格条件下与如本文所公开的核苷酸序列(诸如根据序列XM_504700、XM_504038、EPB93051.1、XM_505086、CCT66282.1、XM_502557、NM_135969、NM_012079、NM_053437或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10的核苷酸序列)的至少约12个或15个，优选约18个或20个，更优选约22个或25个，甚至更优选约30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或75个或更多个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域，或其片段或衍生物。
[0029] 此类杂交条件的优选的非限制性示例是在约45℃下于6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下，优选在55℃下，更优选在60℃下，甚至更优选在65℃下在1x SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。
[0030] 高度严格条件包括例如在42℃下使用洋地黄毒苷(DIG)标记的DNA探针(通过使用DIG标记系统；Roche Diagnostics GmbH,68298Mannheim,德国制备)在含有或不含有100μg/ml鲑鱼精DNA的溶液(诸如DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH))，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基硫酸钠、0.1％的N-月桂酰肌氨酸和2％的封闭剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中孵育2h至4天，然后在室温下在2x SSC和0.1％SDS中将滤器(filters)洗涤两次(持续5至15分钟)，以及然后在65-68℃下在0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗涤两次(持续15-30分钟)。
[0031] 编码如本文所限定的特异性酰基转移酶中的一种的多核苷酸/酶的表达可以在任何宿主系统中实现，所述宿主系统包括适于类胡萝卜素/类视黄醇产生并且允许表达编码如本文所公开的酶(包括如本文所述的功能等同物或衍生物)中的一种的核酸的任何(微)生物。合适的产生类胡萝卜素/类视黄醇的宿主(微)生物的示例是细菌、藻类、真菌(包括酵母)、植物或动物细胞。优选的细菌是以下属的细菌：埃希氏菌属(Escherichia)，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)；链霉菌属(Streptomyces)；泛菌属(Pantoea)(欧文氏菌属(Erwinia))；芽孢杆菌属(Bacillus)；黄杆菌属(Flavobacterium)；聚球藻属(Synechococcus)；乳杆菌属(Lactobacillus)；棒状杆菌属(Corynebacterium)；微球菌属(Micrococcus)；Mixococcus；短杆菌属(Brevibacterium)；慢生根瘤菌属
(Bradyrhizobium)；戈登氏菌属(Gordonia)；迪茨氏菌属(Dietzia)；鼠尾菌属(Muricauda)；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)；集胞藻属(Synochocystis)；副球菌属(Paracoccus)，诸如产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)。优选的真核微生物，特别是真菌(包括酵母)，选自酵母属(Saccharomyces)，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；曲霉属(Aspergillus)，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；毕赤酵母属(Pichia)，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；汉逊酵母属(Hansenula)，诸如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；须霉属(Phycomyces)，诸如布氏须霉(Phycomyces blakesleanus)；毛霉属(Mucor)；红酵母属(Rhodotorula)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)；
法夫酵母属(Xanthophyllomyces)；发夫酵母属(Phaffia)；布拉霉属(Blakeslea)，诸如三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)；或耶氏酵母属(Yarrowia)，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。特别地，优选的是在真菌宿主细胞，诸如耶氏酵母属或酵母属中表达，或在埃希氏菌属中表达，更优选地在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。
(Bradyrhizobium)；戈登氏菌属(Gordonia)；迪茨氏菌属(Dietzia)；鼠尾菌属(Muricauda)；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)；集胞藻属(Synochocystis)；副球菌属(Paracoccus)，诸如产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)。优选的真核微生物，特别是真菌(包括酵母)，选自酵母属(Saccharomyces)，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；曲霉属(Aspergillus)，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；毕赤酵母属(Pichia)，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；汉逊酵母属(Hansenula)，诸如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；须霉属(Phycomyces)，诸如布氏须霉(Phycomyces blakesleanus)；毛霉属(Mucor)；红酵母属(Rhodotorula)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)；
法夫酵母属(Xanthophyllomyces)；发夫酵母属(Phaffia)；布拉霉属(Blakeslea)，诸如三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)；或耶氏酵母属(Yarrowia)，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。特别地，优选的是在真菌宿主细胞，诸如耶氏酵母属或酵母属中表达，或在埃希氏菌属中表达，更优选地在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。
[0032] 关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(International Code of Nomenclature)(Melbourne法)所限定的。
[0033] 如本文所用，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致产生类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素。用于生成产生类胡萝卜素的宿主细胞的基因和方法是本领域已知的，参见例如
WO2006102342。取决于要产生的类胡萝卜素，可以涉及不同的基因。
WO2006102342。取决于要产生的类胡萝卜素，可以涉及不同的基因。
[0034] 如本文所用，产生类视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致经由β-胡萝卜素的酶促转换经由视黄醛、视黄醇和视黄酯产生类视黄醇，例如维生素A及其前体。这些多肽包括如本文所限定的酰基转移酶。维生素A途径的基因和生成产生类视黄醇的宿主细胞的方法是本领域已知的。
[0035] 如本文所用，视黄酯混合物是包含长链视黄酯的视黄酯混合物。它还可包括其他酯形式，诸如视黄醇乙酸酯。优选地，此类混合物中反式同种型含量高，诸如包含至少约20％的视黄酯，特别是长链反式视黄酯，为反式同种型。术语“长链视黄酯”限定了由至少约
8个，诸如9个、10个、12个、13个、15个或20个碳原子且至多约26个，诸如25个、22个、21个或更少的碳原子，以及优选至多约6个不饱和键，诸如0个、1个、2个、4个、5个、6个不饱和键组成的烃酯。长链视黄酯包括但不限于亚油酸、油酸或棕榈酸。
8个，诸如9个、10个、12个、13个、15个或20个碳原子且至多约26个，诸如25个、22个、21个或更少的碳原子，以及优选至多约6个不饱和键，诸如0个、1个、2个、4个、5个、6个不饱和键组成的烃酯。长链视黄酯包括但不限于亚油酸、油酸或棕榈酸。
[0036] 本发明涉及一种通过如本文所述的酰基转移酶的作用经由视黄醇的酰化来产生长链视黄酯，即至少20％的百分比为呈反式同种型或顺式同种型，优选呈反式同种型的长链视黄酯的类视黄醇的方法，其中所述酰化酶优选在如本文所述的合适条件下在合适的宿主细胞中异源表达。可以从培养基和/或宿主细胞中分离产生的长链视黄酯，并任选地进一步纯化。在另一个实施方式中，长链视黄酯可以在产生维生素A的多步方法中用作前体。如本领域中已知的，可以从培养基和/或宿主细胞中分离维生素A，并任选地进一步纯化。
[0037] 宿主细胞，即微生物、藻类、真菌、动物或植物细胞，能够表达产生β-胡萝卜素的基因、如本文所限定的酰基转移酶、任选地编码β-胡萝卜素氧化酶的基因、任选地编码视黄醛还原酶的基因和/或任选地生物合成维生素A所需的其他基因，所述宿主细胞可以如技术人员关于不同宿主细胞所已知的那样在需氧或厌氧条件下在补充有适当营养物的水性培养基中培养。任选地，如本文所限定，所述培养是在参与电子转移的蛋白质和/或辅因子存在下进行的。宿主细胞的培养/生长可以以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。如本领域技术人员所已知的，取决于宿主细胞，优选地类视黄醇(诸如维生素A)和前体(诸如视黄醛、视黄醇、视黄酯)的产生可变化。选自耶氏酵母属的产生β-胡萝卜素和类视黄醇的宿主细胞的培养和分离描述于例如WO2008042338中。关于在选自大肠杆菌的宿主细胞中的类视黄醇产生，方法描述于例如Jang等人，Microbial Cell Factories,10:95(2011)中。在例如WO2014096992中公开了在酵母宿主细胞(诸如酿酒酵母)中生产β-胡萝卜素和类视黄醇的具体方法。
[0038] 如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”是指其催化活性，即其催化从给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内和在限定温度下每限定量的蛋白质消耗的底物和/或产生的产物的量。通常，比活性表示为每mg蛋白质每分钟消耗的底物或形成的产物的μmol数。通常，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，在本文件全文中可互换地使用μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性单位定义。如果酶在体内，即在如本文所限定的宿主细胞内，或在合适的底物存在下的系统内，执行其催化活性，则所述酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性，特别是如本文所限定的酰基转移酶的活性。评估如本文所限定的合适酰基转移酶用于由视黄醇转换进行视黄酯生产，特别是长链视黄酯生产的能力的分析方法是本领域已知的，诸如在WO2014096992的实施例4中所述。简而言之，产物(诸如视黄酯，特别是长链视黄酯；视黄醇；反式视黄醛；顺式视黄醛；β-胡萝卜素等)的滴度可通过HPLC测量。
[0039] 如本文所用的类视黄醇包括β-胡萝卜素切割产物，也称为脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、视黄酸甲醇盐(retinoic methoxide)、视黄醇乙酸酯(retinyl acetate)、视黄酯(retinyl ester)、4-酮-类视黄醇、3羟基-类视黄醇，或它们的组合。包含视黄醛、视黄醇和视黄酯的混合物在本文中被称为“类视黄醇混合物”。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008042338中。
[0040] 如本文所用的视黄醛是以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯醛已知的。视黄醛在本文中可互换地称为维生素A醛，并且包括顺式同种型和反式同种型两者，诸如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。
[0041] 如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域公知的。它包括通过两个具有20个碳的香叶基香叶基焦磷酸酯分子的连接而自然形成的长的40个碳缀合的类异戊二烯多烯。这些类胡萝卜素包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，诸如β-胡萝卜素，所述类胡萝卜素可以在4-酮位置或3-羟基位置上被氧化以产生角黄素、玉米黄质或虾青素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006102342中。
[0042] 如本文所用的维生素A可以是水溶液中存在的维生素A的任何化学形式，诸如未解离的，其游离酸形式，或解离为阴离子。如本文所用的该术语包括生物技术维生素A途径中的所有前体或中间体。它还包含维生素A乙酸酯。
[0043] 特别地，本发明的特征在于以下实施方式：
[0044] -一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含具有视黄醇酰化活性，优选酰基转移酶[EC 2.3.1]活性，更优选酰基转移酶[EC 2.3.1.20]活性的酶，所述宿主细胞产生基于由所述宿主细胞产生的类视黄醇的总量，百分比为至少约20％的长链视黄酯。
[0045] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含具有视黄醇酰化活性，优选酰基转移酶[EC2.3.1]活性，更优选酰基转移酶[EC 2.3.1.20]活性的酶，所述宿主细胞产生包含长链视黄酯的视黄酯混合物，其中所述混合物包含至少约20％，诸如30％、40％、50％、60％、70％、80％、87％、90％、92％、95％、97％、99％或至多100％的反式同种型长链视黄酯。
[0046] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述视黄酯选自长链视黄酯。
[0047] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含异源酰基转移酶。
[0048] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属(Paracoccus)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)、布拉霉属(Blakeslea)和耶氏酵母属(Yarrowia)，更优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0049] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述酰基转移酶选自植物、包括人在内的动物、藻类、包括酵母在内的真菌、或细菌，优选地选自果蝇属(Drosophila)、镰刀菌属(Fusarium)、毛霉属、人、大鼠和耶氏酵母属。
[0050] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述酰基转移酶是选自耶氏酵母属或果蝇属，优选地选自解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)或黑腹果蝇(D.melanogaster)的酰基转移酶。
[0051] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述酰基转移酶选自与根据序列XM_502557、序列NM_135969的酰基转移酶或由根据SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的多核苷酸编码的酰基转移酶具有至少约60％同一性的多肽。
[0052] -如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中将包括长链视黄酯的视黄酯进一步转换为维生素A。
[0053] -一种经由酰基转移酶[EC 2.3.1]的酶促活性生产包括长链视黄酯的视黄酯混合物的方法，所述方法包括使视黄醇与所述酰基转移酶接触，其中所述混合物中反式同种型与顺式同种型的比值为至少约4。
[0054] -一种减少由酰基转移酶的酶促作用产生的类视黄醇混合物中顺式同种型的量的方法，所述方法包括使视黄醇与酰基转移酶接触，其中由所述酶促作用导致的所述类视黄醇混合物中的顺式视黄酯的量，与在与所述酶接触之前所述类视黄醇混合物中的量相比，减少了至少20％。
[0055] -一种增加由酰基转移酶的酶促作用产生的类视黄醇混合物中反式同种型的量的方法，所述方法包括使视黄醇与酰基转移酶接触，其中由所述酶促作用导致的所述类视黄醇混合物中的反式视黄酯的量，与在与所述酶接触之前所述类视黄醇混合物中的量相比，增加了至少约20％。
[0056] -如上文和本文所限定的方法，所述方法使用所述产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含具有视黄醇酰化活性，优选酰基转移酶[EC 2.3.1]活性，更优选酰基转移酶[EC 2.3.1.20]活性的酶，所述宿主细胞产生包含长链视黄酯的视黄酯混合物，其中所述混合物包含至少约20％，诸如30％、40％、50％、60％、70％、80％、87％、90％、92％、95％、97％、99％或至多100％的反式同种型视黄酯。
[0057] -一种产生维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：
[0058] (a)将编码如本文所限定的酰基转移酶[EC 2.3.1]的核酸分子引入合适的产生胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中；
[0059] (b)将视黄醇酶促转换为包含比值为至少约4的反式视黄酯和顺式视黄酯的长链视黄酯混合物，
[0060] (c)在合适的培养条件下将视黄酯转换为维生素A。
[0061] -如所限定的酰基转移酶[EC 2.3.1]用于产生包含比值为至少约4的反式视黄酯和顺式视黄酯的长链视黄酯混合物的用途，其中所述酰基转移酶在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中异源表达。
[0062] 以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文，特别是WO2006102342、WO2008042338或WO2014096992。实施例
[0063] 实施例1：通用方法、菌株和质粒
[0064] 本文所述的所有基本分子生物学和DNA操纵程序通常是根据Sambrook等人(编著)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press:New York(1989)或Ausubel等人(编著)Current Protocols in Molecular Biology.Wiley:New York(1998)执行的。
[0065] 摇板试验。通常，向800μl的0.075％酵母提取物、0.25％的蛋白胨(0.25X YP)接种10μl新近生长的耶氏酵母属，并覆盖200μl的Drakeol5矿物油碳源，5％的矿物油中的玉米油和/或5％的水相中的葡萄糖。使转化体在24孔板(Multitron，30℃，800RPM)中在含有
20％十二烷的YPD培养基中生长4天。将矿物油级分从摇板孔中移出，并使用光电二极管阵列检测器在正相柱上通过HPLC进行分析。
20％十二烷的YPD培养基中生长4天。将矿物油级分从摇板孔中移出，并使用光电二极管阵列检测器在正相柱上通过HPLC进行分析。
[0066] DNA转化。通过在YPD板培养基上过夜生长来转化菌株，从板上刮下50μl细胞，然后通过在含有1μg转化DNA(通常是用于整合转化的线性DNA)、40％PEG 3550MW、100mM乙酸锂、50mM二硫苏糖醇、5mM Tris-Cl pH 8.0、0.5mM EDTA的500μl中在40℃下孵育60分钟来转化，随后直接铺板到选择性培养基上，或者在显性抗生素标记物选择的情况下，使细胞在30℃下在YPD液体培养基上生长4小时，然后再铺板到选择性培养基上。
[0067] DNA分子生物学。在pUC57载体中以NheI和MluI末端合成基因。通常，将基因亚克隆到MB5082‘URA3’、MB6157 HygR和MB8327 NatR载体中，以用于解脂耶氏酵母转化中的标记物选择，如在WO2016172282中所述。为了通过基因和标记物HindIII/XbaI(MB5082)或PvuII(MB6157和MB8327)的随机非同源末端连接来进行干净的基因插入，分别通过凝胶电泳和Qiagen凝胶纯化柱进行纯化。
[0068] 质粒列表。表1、表2和序列表中列出了要使用的质粒、菌株和密码子优化的序列。除了经密码子优化以在耶氏酵母属中表达的编号序列ID NO:1、ID NO:2外，所有序列均与数据库中作为核苷酸(nt)的登录序列相同。
[0069] 表1：用于构建携带解脂耶氏酵母的异源酰基转移酶基因(YlDGA1)序列XM_502557和黑腹果蝇的异源酰基转移酶基因(Dm Dgat1)序列NM_135969的菌株的质粒列表。有关更多详细信息，请参见文本。
[0070]
[0071] 表2：携带异源酰基转移酶基因的用于产生类视黄醇的耶氏酵母属菌株的列表。有关更多详细信息，请参见文本。
[0072]
[0073] 正相视黄醇方法。使用附接到Waters 717自动进样器的Waters 1525二元泵来注入样品。使用配有安全硅胶保护柱套件的150×4.6mm的Phenomenex Luna 3μ Silica(2)来解析(resolve)类视黄醇。对于虾青素相关化合物，流动相由1000mL己烷、30mL异丙醇和0.1mL乙酸组成；或者对于玉米黄质相关化合物，流动相由1000mL己烷、60mL异丙醇和0.1mL乙酸组成。所述流动相的流速各自为每分钟0.6mL。柱温是环境温度。注入体积是20μL。检测器是从210nm至600nm进行收集的光电二极管阵列检测器。根据表3检测分析物。
[0074] 表3：使用正相视黄醇方法的分析物列表。有关更多详细信息，请参见文本。
[0075]
[0076] 样品制备。根据条件，通过各种方法制备样品。对于全培养液或经洗涤的培养液样品，将培养液置于经称重的 管中，并加入流动相，根据制造商的用法说明书在匀浆器(Bertin Corp,Rockville,MD,USA)中在最高设置3X下处理样品。在经洗涤的培养液中，将样品在微量离心机中的1.7ml管中以10000rpm旋转1分钟，将培养液倾析出，加入1ml水，混合，沉淀，然后倾析出，并定容至初始体积，将混合物再次沉淀，并用适量的流动相定容，并通过 珠磨进行处理。为了分析矿物油级分，将样品以
4000RPM旋转10分钟，并通过正排量移液器(Eppendorf,Hauppauge,NY,USA)将油从顶部移出，在流动相中稀释，通过涡旋混合，并通过HPLC分析测量类视黄醇浓度。
4000RPM旋转10分钟，并通过正排量移液器(Eppendorf,Hauppauge,NY,USA)将油从顶部移出，在流动相中稀释，通过涡旋混合，并通过HPLC分析测量类视黄醇浓度。
[0077] 发酵条件。发酵与前述条件相同，使用矿物油覆盖和搅拌罐，将玉米油加入总体积为0.5L至5L的台式反应器中(见WO2016172282)。通常，在补料分批搅拌罐反应器中观察到了相同的结果，具有提高的生产率，证明了该系统用于生产类视黄醇的效用。
[0078] 实施例2：在解脂耶氏酵母中产生类视黄醇
[0079] 将产生视黄醇的菌株ML17767用纯化的HinDIII/XbaI基因片段转化，并在不含尿嘧啶的基本培养基上进行选择，所述基因片段含有经密码子优化的酰基转移酶基因，所述经密码子优化的酰基转移酶基因与URA3营养标记物连接。在摇板试验中针对增加的视黄醇酰化和减少的残留视黄醇筛选多个分离株。将成功的分离株在补料分批搅拌罐反应器中运行，显示了该方法用于增加视黄醇酯(retinol esters)产量的效用。实验结果如下所示，表明我们分离出了在真菌生产系统中具有增强的视黄醇酰化活性的基因。
[0080] 表4：异源酰基转移酶的作用增强的耶氏酵母属中类视黄醇的产生。“％酯”是指类视黄醇混合物中长链视黄酯的百分比。有关更多详细信息，请参见文本。
[0081]
[0082] 实施例3：在酿酒酵母中产生类视黄醇
[0083] 通常，根据本领域已知的标准方法(诸如，如在US20160130628或WO2009126890中所述)，用编码酶(诸如香叶基香叶基合酶、八氢番茄红素合酶、番茄红素合酶、番茄红素环化酶)的异源基因转化β-胡萝卜素菌株，所述β-胡萝卜素菌株被构建用于产生β-胡萝卜素。通过引入和/或过表达如本文所限定的酰基转移酶，获得了关于长链视黄酯产生的类似结果。此外，当用β-胡萝卜素氧化酶基因转化时，能够产生视黄醛。此外，当用视黄醇脱氢酶转化时，则能够产生视黄醇。用这种方法，获得了关于朝向长链视黄酯的生产率的相似结果。
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