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多胺作为分离剂在带标记聚糖的使用凝胶的毛细管电泳中的用途

阅读：524发布：2020-06-12

专利汇可以提供多胺作为分离剂在带标记聚糖的使用凝胶的毛细管电泳中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了在使用凝胶作为筛分基质的毛细管电泳技术中改善对带标记聚糖的分离度的方法，其手段是通过在凝胶中掺入多胺。，下面是多胺作为分离剂在带标记聚糖的使用凝胶的毛细管电泳中的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种改善通过毛细管电泳分析来分离样品中带标记聚糖的分离度的方法，其中所述分离在凝胶中发生，其中所述凝胶包含具有任一以下结构的多胺
结构1
其中R1、R2和R3独立地选自H和CH3，
结构2
其中各R1和各R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自可独立地是H或CH3，
结构6，
其中R1-R6各自可独立地是H或CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多胺具有结构4，且为1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)-1,2-乙二胺或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多胺是N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多胺具有结构2，且为N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚糖已经通过与8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(“APTS”)、InstantQTM或8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐(“ANTS”)反应而被标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚糖已经用APTS标记，且为MAN-5聚糖和A1F。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚糖进一步包括G0。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚糖已经用InstantQTM标记，且为MAN-5聚糖和A1F。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚糖进一步包括G0F-N。
11.一种用于毛细管电泳分离带标记聚糖的组合物，所述组合物包含适用于带标记聚糖的毛细管凝胶电泳的凝胶，该凝胶包含任一以下结构的至少一种多胺：
结构1
其中R1–R3各自独立地选自H和CH3，
结构2
其中R1和R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自独立地选自H和CH3，
结构6，
其中R1-R6各自独立地选自H和CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述多胺具有结构4，且为1,4,7-三甲基-1,4,
7-三氮杂环壬烷。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)-1,
2-乙二胺或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述多胺为N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述多胺具有结构2，且为N,N,N′,N′-四甲基-
1,3-丙二胺。
16.根据权利要求11所述的组合物，其中所述适用于带标记聚糖的毛细管凝胶电泳的凝胶包含聚氧乙烯。
17.一种柱筒或毛细管，其装载有用于毛细管电泳分离带标记聚糖的凝胶，该凝胶包含任何以下结构的至少一种多胺：
结构1
其中R1–R3各自独立地选自H和CH3，
结构2
其中R1和R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自独立地选自H和CH3，或
结构6，
其中R1-R6各自独立地选自H和CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3。
18.根据权利要求17所述的柱筒或毛细管，其中所述多胺具有结构4，且为1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷。
19.根据权利要求17所述的柱筒或毛细管，其中所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)-1,2-乙二胺或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。
20.根据权利要求17所述的柱筒或毛细管，其中所述多胺是N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺。
21.根据权利要求17所述的柱筒或毛细管，其中所述多胺具有结构2，且为N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺。
22.根据权利要求17所述的柱筒或毛细管，其中所述凝胶进一步包含聚氧乙烯。
23.根据权利要求17所述的柱筒或毛细管，其中所述柱筒或毛细管是柱筒。
24.根据权利要求17所述的柱筒或毛细管，其中所述柱筒或毛细管是毛细管。
25.一种试剂盒，其用于毛细管电泳分离带标记聚糖，所述试剂盒包含(a)柱筒、毛细管或二者，其装载有适用于带标记聚糖的毛细管凝胶电泳的凝胶，该凝胶进一步包含有效量的任何以下结构的至少一种多胺：
结构1
其中R1–R3各自独立地选自H和CH3，
结构2
其中R1和R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自独立地选自H和CH3，
结构6，
其中R1-R6各自独立地选自H和CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3，和
(b)标记物，其用于标记待通过毛细管电泳分离的聚糖。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述多胺具有结构4，为1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷。
27.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)-1,
2-乙二胺或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。
28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述多胺为N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺。
29.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述多胺具有结构2，且为N,N,N′,N′-四甲基-
1,3-丙二胺。
30.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述凝胶进一步包含有效量的聚氧乙烯。
TM
31.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述标记物是APTS或InstantQ 。
32.根据权利要求25所述的试剂盒，其进一步包含聚糖标准物或带标记聚糖标准物。
33.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述柱筒、毛细管或二者是柱筒。
34.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述柱筒、毛细管或二者是毛细管。

说明书全文

多胺作为分离剂在带标记聚糖的使用凝胶的毛细管电泳中的

用途

相关申请的交叉引用

[0001] 本申请要求2017年9月22日提交的美国临时专利申请号62/562,189的权益，其内容出于所有目的并入本文。联邦资助声明

[0002] 不适用。发明背景

[0003] 本发明涉及聚糖分析领域。

[0004] 由真核细胞产生的许多蛋白质在翻译后通过添加共价连接的、直链或支链的糖类而被修饰。这些蛋白质-糖类缀合物被称为糖蛋白；糖类的附着点被称为糖基化位点。附着的多糖或寡糖被称为聚糖。在特定糖蛋白的不同糖基化位点上发现了多种多样的聚糖。特定糖蛋白上聚糖的特定模式是由产生蛋白质的具体细胞系以及细胞生长的条件确定的。

[0005] 由于与蛋白质缀合的聚糖可影响对其功能至关重要的特性(包括药代动力学、稳定性、生物活性或免疫原性)，因此在许多用途中确定存在哪些聚糖很重要。例如，美国食品药品监督管理局要求对生物制剂(如治疗性糖蛋白和疫苗)附着的糖类进行表征，以显示物质的组成和制造的一致性，从而需要对产品进行详细的表征。对释放的糖谱进行分析对于重组蛋白生产中的质量控制也是很重要的，其中糖谱的变化可指示系统中的压力，提示可能需要将一个工业级发酵罐的昂贵蛋白质丢弃的条件。

[0006] 从糖缀合物释放的聚糖通常被处理，用荧光染料或其他可检测部分标记其游离的还原末端，然后通过诸如高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)或糖类凝胶电泳的方法分析带标记聚糖。

[0007] 困扰通过CE鉴定带标记聚糖的一个问题是区分彼此共迁移的聚糖。阻遏带标记聚糖的共迁移可改善被分析的样品中存在的聚糖的分离度。不幸的是，迄今为止，尚未报道过用于减少带标记聚糖的共迁移从而改善分离度的组合物和方法。

[0008] 美国专利号9,222,913教导了在血红蛋白分子(糖化的蛋白质链，其中，糖非酶促地附着至N端或者附着至赖氨酸残基(程度低于前者))的分离中使用某些多胺来减少电渗通量。

[0009] 仍然需要可改善在CE期间一起共迁移的带标记聚糖的分离度的组合物和方法。令人惊讶地，本发明满足了这些需求和其他需求。发明概述

[0010] 本发明提供了用于改善通过毛细管电泳分析样品中带标记聚糖的分离的方法、组合物和试剂盒，其中所述分离在凝胶中进行，其中所述凝胶包含具有任一以下结构的多胺结构1其中R1、R2和R3独立地选自H和CH3，
结构2
其中各R1和各R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自可独立地是H或CH3，
结构6
其中R1-R6各自可独立地是H或CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3。在一些实施方案中，所述多胺具有结构4，且为1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷。在一些实施方案中，所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)-1,2-乙二胺或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。在一些实施方案中，所述多胺是N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。在一些实施方案中，所述多胺具有结构2，且是N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺。在一些实施方案中，所述TM
聚糖已经通过与8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(“APTS”)、InstantQ 或8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐(“ANTS”)反应而被标记。在一些实施方案中，所述聚糖已经用APTS标记，且为MAN-5聚糖和A1F。在一些实施方案中，所述聚糖进一步包括G0。在一些实施方案中，所述聚糖已经用InstantQTM标记，且为MAN-5聚糖和A1F。在一些实施方案中，所述聚糖进一步包括G0F-N。

[0011] 在另一组实施方案中，本发明提供了用于毛细管电泳分离带标记聚糖的组合物，所述组合物包含适用于带标记聚糖的毛细管凝胶电泳的凝胶，该凝胶包含任何以下结构的至少一种多胺：结构1
其中R1–R3各自独立地选自H和CH3，
结构2
其中R1和R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自独立地选自H和CH3，
结构6
其中R1-R6各自独立地选自H和CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3。

[0012] 在一些实施方案中，所述多胺具有结构4，且为1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷。在一些实施方案中，所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)-1,2-乙二胺、或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。在一些实施方案中，所述多胺是N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺。在一些实施方案中，所述多胺具有结构2，且是N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺。在一些实施方案中，所述适用于带标记聚糖的毛细管凝胶电泳的凝胶包含聚氧乙烯。

[0013] 在另一组实施方案中，本发明提供了柱筒或毛细管，其装载有用于毛细管电泳分离带标记聚糖的凝胶，该凝胶包含任一以下结构的至少一种多胺：结构1
其中R1–R3各自独立地选自H和CH3，
结构2
其中R1和R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自独立地选自H和CH3，或
结构6
其中R1-R6各自独立地选自H和CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3。在一些实施方案中，所述多胺具有结构4，且为1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷。在一些实施方案中，所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)1,2-乙二胺或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。在一些实施方案中，所述多胺是N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺。在一些实施方案中，所述多胺具有结构2，且是N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺。在一些实施方案中，所述凝胶进一步包含聚氧乙烯。在一些实施方案中，所述柱筒或毛细管是柱筒。在一些实施方案中，所述柱筒或毛细管是毛细管。

[0014] 在又一组实施方案中，本发明提供了用于毛细管电泳分离带标记聚糖的试剂盒，其包含柱筒、毛细管或柱筒和毛细管二者，其装载有适用于带标记聚糖的毛细管凝胶电泳的凝胶，该凝胶进一步包含有效量的任何以下结构的至少一种多胺：结构1
其中R1–R3各自独立地选自H和CH3，
结构2
其中R1和R2独立地选自H和CH3，
结构3
其中R1和R2各自独立地选自H和CH3，
结构4
其中R1-R3各自独立地选自H和CH3，
结构5
其中R1-R4各自独立地选自H和CH3，
结构6，
其中R1-R6各自独立地选自H和CH3，
结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3，或
结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3，和
(b)标记物，其用于标记待通过毛细管电泳分离的聚糖。在一些实施方案中，所述多胺具有结构4，且为1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷。在一些实施方案中，所述多胺具有结构1，且为N1-(2-氨乙基)-1,2-乙二胺或N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺。在一些实施方案中，所述多胺是N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺。在一些实施方案中，所述多胺具有结构2，且为N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺。在一些实施方案中，所述凝胶进一步包含有效量的聚氧乙烯。在一些实施方案中，所述标记物是APTS或
InstantQTM。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含聚糖标准物或带标记的聚糖标准物。在一些实施方案中，所述柱筒、毛细管或柱筒和毛细管二者是柱筒。在一些实施方案中，所述柱筒、毛细管或柱筒和毛细管二者是毛细管。
附图简述

[0015] 图1.图1呈现了毛细管凝胶电泳分离用标记物InstantQTM(ProZyme公司，Hayward，CA)标记的G0F-N和Man5聚糖的电泳图。下方的虚线显示带标记的聚糖标准物G0F-N[3]和Man5的混合物在掺入了1.0μl/ml凝胶的N,N,N′,N′--四甲基乙二胺(CAS号110-18-9)的凝胶上分析的电泳图。如电泳图上所示的，此多胺未能帮助分离G0F-N[3]和Man5，二者发生了共迁移。在另一个实验准备中，以每ml凝胶0.50μl的浓度向凝胶中掺入N,N,N′,N′-四甲基-1，3-丙二胺(CAS号110-95-2)。上方的实线显示了使用此凝胶分离的电泳图。此多胺的存在使Man5偏离G0F-N[3]，且显著地改善了Man5与G0F-N[3]的分离度。“RFU”：“相对荧光单位”。
“RMT”：“相对迁移时间”。

[0016] 图2.图2呈现了显示毛细管凝胶电泳分离从依那西普释放的聚糖的电泳图，依那西普是一种TNF受体与IgG1抗体恒定端融合的融合蛋白。通过用PNGase F酶促消化释放聚糖，并用标记物InstantQTM标记。然后将它们在含有(a)示例性多胺(实线，上方)或(b)不含有多胺(虚线，下方)的凝胶中进行CGE。“RFU”：“相对荧光单位”。“RMT”：“相对迁移时间”。星号表示Man5聚糖的峰，其也由一个指向上方线中Man5的峰的箭头指示。发明详述

[0017] 如发明背景中所述，确定哪些糖类或聚糖附着至糖缀合物(诸如糖蛋白)，对于理解糖蛋白的药代动力学、免疫原性和潜在的治疗效果是重要的。因此，确定哪些聚糖附着至给定的糖蛋白已经成为糖蛋白(诸如抗体和其他旨在用于治疗性用途的生物制剂)的一个重要的监管上的问题。

[0018] 一组用于分析多种类型化合物的技术是毛细管电泳或“CE”。CE有很多种，包括：毛细管凝胶电泳，又称“CGE”，其可基于分子大小分离分子；以及毛细管区带电泳。又称“CZE”，其可根据电荷:质量比分离分子。一般而言，CE，特别是CGE，在本领域是众所周知的，并且在许多参考文献中有教导，包括Beckman Coulter的小册子“Introduction to Capillary Electrophoresis”(未标明日期，但不迟于1991-2),Whatley,H.,Basic Principles and Modes of Capillary Electrophoresis，收录于Petersen和Mohammad编辑的Clinical and Forensic Applications of Capillary Electrophoresis,Humana Press Inc.,Totowa,NJ(2001),以及Lauer和Rozing编辑,High Performance Capillary Electrophoresis,第2版,Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA(2014)。CGE用于分离蛋白质和核酸已达数十年。参见，例如，Zhu等，Anal Chim Acta.2012Jan 4；709:21–31。然而，聚糖，特别是N-聚糖的高度结构多样性已经使聚糖的分离和表征比蛋白质和核酸的分离和检测更具挑战性。Schwarzer，等，“N-glycan analysis by CGE-LIF:Profiling influenza A virus hemagglutinin N-glycosylation during vaccine production,”Electrophoresis 2008,29,4203–4214,4204页。通常，要通过CGE分析的聚糖分别用带电荷的荧光团或UV可见染料标记，以允许电迁移并相应通过激光诱导的荧光(“LIF”)或通过UV光来检测。参见，例如，Schwarzer，同上，Reusch，等，High-throughput glycosylation analysis of therapeutic immunoglobulin G by capillary gel electrophoresis using a DNA analyzer,”2014,doi:10.4161/mabs.26712。

[0019] 尽管标准CE技术已经很好地分离了许多聚糖，但是一些聚糖彼此共迁移阻碍了某些带标记聚糖的分析。减少带标记聚糖的共迁移可改善针对正在分析的样品中存在的聚糖的分离度。不幸的是，迄今为止，还尚未报道过用于减少带标记聚糖的共迁移从而改善分离度的组合物和方法。

[0020] 例如，哺乳动物抗体和融合蛋白是一类重要且非常昂贵的治疗剂，并且通常在工业级发酵系统中生产。在抗体或融合蛋白的生产过程中，监测MAN-5聚糖(甘露戊糖-二-(N-乙酰基-D-葡萄糖胺)，又名“寡甘露糖-5聚糖”，CAS号66091-47-2，有时也称为“Man5”)的水平可作为发酵系统正在承压并允许干预的标志，有望能及时节省生产批量。MAN-5聚糖的以下结构是从Sigma-Aldrich网站获取的(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)：

[0021] 令人惊讶地，如今我们已发现，在带标记聚糖的CGE分析期间，凝胶基质中选定的多胺的存在可改善重要的带标记聚糖(诸如MAN-5聚糖)和能够与感兴趣的带标记聚糖共迁移的其他聚糖的分离度。在作为本公开基础的研究中，MAN-5聚糖用CGE中常用的标记物8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(“APTS”)，CAS号196504-57-1或用InstantQTM(ProZyme公司，TMHayward，CA)标记，InstantQ 是一种可商购的标记物，其不需要使用还原胺化，固相萃取净化后不需要干燥步骤，并且可减少使用有毒试剂的需要。可以使用带有内涂层和含有示例性多胺的凝胶基质的毛细管对用任一标记物标记的聚糖进行CGE。

[0022] 测试了下列结构1的两种多胺。令人惊讶地，每种多胺产生的电泳图(由毛细管凝胶电泳产生的分离结果的作图)都能够改善将带标记的MAN-5聚糖与样品中存在的其它带标记聚糖分离的能力。重要的是，带标记的MAN-5聚糖的分离度的提高并不是以降低观察到样品中其他带标记的聚糖的分离的能力为代价的。这一点本身出人预料，因为在最初的研究中使用了大的多胺，结果发现其没有改善标记的MAN-5聚糖的分离度，而是改变了样品中其它聚糖的电泳图的某些部分，以至于干扰了对这些其它聚糖的解读。特别地，唾液酸化聚糖的峰发生了塌陷，导致接近染料峰的较早的相对迁移时间(通常，技术人员希望代表的峰与系统中剩余的任何未结合的染料或水解的染料的峰相距一定距离，这些未结合的染料或水解的染料不代表与感兴趣的聚糖缀合的染料)，并且较大的中性聚糖的峰变宽。以下所示结构的较大的多胺令人惊讶地不仅提供了MAN-5聚糖的出色分离，而且还提供了样品中其它标记的聚糖的令人满意的电泳图。在作为本公开基础的研究中，多胺存在于凝胶中，而不存在于缓冲液中。如本领域技术人员将理解的，CGE是使用填充有优选的凝胶的毛细管进行的。不同于CZE，电泳期间凝胶不会被缓冲液充满。因此，在优选的实施方案中，多胺用于凝胶中，而不用于电泳分离过程中可使用的任何缓冲液中。

[0023] 鉴于改善CGE对MAN-5聚糖的分离度的结果，我们期望使用以下所述结构的其它多胺可获得相似的改善其它感兴趣的标记聚糖的分离度的结果。如技术人员将理解的，在CGE分离中，与特定的感兴趣的带标记聚糖共迁移的其它带标记聚糖部分地取决于所使用的特定标记物，因为本领域中使用的不同标记物通常在尺寸和电荷上不同。具有下文教导的结构的任何特定的多胺的存在，或者这些多胺中的某一种在CGE凝胶中的特定浓度，是否可以改善任何感兴趣的特定带标记聚糖的分离度，是容易确定的。例如，可以使用含有期望浓度的选定多胺的凝胶，对含有用已知量的选定标记物标记的MAN-5聚糖的样品进行CGE。然后使用相同的凝胶组合物、相同的多胺和相同浓度的该多胺对一种或多种其它已知量的怀疑在CGE处理时能够与MAN-5聚糖共迁移的带标记聚糖进行CGE。然后将相同量的MAN-5聚糖(以相同方法标记)和相同量的其它聚糖(以相同方法标记)合并，并使用与前述分析中相同的凝胶组合物和相同浓度的相同多胺一起运行CGE分析。如果合并后仍能从由带标记聚糖的CGE产生的电泳图中确定在第一个CGE中检测到的带标记MAN-5聚糖的量，则该特定的多胺可成功地防止可能对样品中带标记MAN-5聚糖的分离造成干扰的带标记聚糖共迁移。技术人员也可容易地使用相同的测定法来测试所选的毛细管涂层或者用作筛分基质的凝胶。

[0024] 考虑到使用CGE的结果，可以预期，使用其它形式的CE(这些CE使用用于尺寸分离分析物的凝胶，包括混合技术)将获得类似的结果。在优选的实施方案中，CE技术是CGE。

[0025] 多胺方便地以溶液形式引入到凝胶组合物中，但是可以以粉末形式混合到用于形成凝胶基质的缓冲液中，或者通过本领域已知的其他方便方式引入。在作为本公开基础的研究中，多胺在5％水溶液(v/v)中添加。为了滴定有用的多胺的量，将5μl至100μl范围(取决于所测试的多胺)的量的多胺添加到5ml至7ml(我们最初的测试中凝胶的量为5ml，随后的测试中增加至7ml)的凝胶配方成分中，使得多胺均匀地分布在凝胶中。较大的多胺或者具有更多多胺的多胺与较小的多胺或具有较少胺基基团的多胺相比，可以在更低的浓度下观察到测试聚糖(在这些研究中为MAN-5聚糖)的分离度改善(例如，具有三个胺基的多胺需要比具有四个胺基基团的多胺更高的浓度方能显示出带标记聚糖的分离度提高)。在一定多胺的浓度以上——对于某些测试的多胺为每7ml约90μl——电流超过了设备推荐的量，因此超过了能够用于CGE分离的量。在作为本公开基础的研究中，发现70μl的测试多胺(N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺(“PDA”)，CAS号110-95-2)的5％溶液在7ml的凝胶中有效。

[0026] 含有3个胺基基团的典型多胺通常以5％溶液添加到凝胶配方中。通常将此类溶液以约0.5μl至20μl的量添加到凝胶配方中，“约”意指±0.1μl。通含有4个胺基基团的典型多胺通常以1％溶液添加到凝胶配方中，添加的量与上文相同。我们预期含有5个胺基基团的多胺将以更稀的溶液中添加，添加的体积与上文相同。对于任何特定量的任何特定多胺，可以容易地通过对标记的聚糖进行CGE，察看凝胶是否成功地将不同的感兴趣的带标记聚糖彼此分离，来测试该多胺改善感兴趣的带标记聚糖(诸如Man5、A1F和G0)的分离度的作用。任何特定的多胺均可以通过执行一系列此类滴度测定来测试，以确定良好分离感兴趣的带标记聚糖的量。用APTS或InstantQTM以外的标记物标记的聚糖同样可用于确定特定量的特定多胺是否成功地将不同的聚糖彼此分离。最后，可以使用一种以上的多胺来改善带标记聚糖的分离度。通过以不同的量简单地将多胺混合到凝胶配方中，察看哪种组合或组合范围成功地将不同的感兴趣的带标记聚糖彼此分离，可容易地确定相应的多胺的使用量。

[0027] 如技术人员所知，CE有几种类型。尽管所有类型共有某些基本特征(使用毛细管和电泳分离)，但它们也具有显著差异，因此不能被视为彼此的简单替代。CGE(也称为“毛细管筛分电泳”)使用筛分基质以按尺寸分离分析物，因此不同于CE技术(诸如毛细管区带电泳，或“CZE”)，后者使用背景电解质溶液并按电荷:质量比分离分析物。还存在“混合”CE技术，其也使用筛分基质。由于使用筛分基质的CE与不使用筛分基质的CE技术之间存在多种差异，因此无法预测，将在不采用筛分基质的技术(诸如CZE)中可改善分离度的试剂用于使用筛分基质的CE技术(诸如CGE)时(或反之)，会取得相同甚至相似的效果。

[0028] 作为本公开基础的研究表明，不仅在CGE程序中多胺在筛分基质或凝胶中的存在改善了样品中带标记聚糖的分离度，而且某些多胺的存在令人惊讶地好于其它多胺。如上所述，CGE凝胶中氮原子之间存在较大间隔的四元多胺的存在，导致带标记MAN-5聚糖的分离度有所改善，但不理想地导致唾液酸化的聚糖的峰谱图塌陷以及较大中性聚糖的峰谱图变宽。然而，当测试三元多胺时，令人惊讶的是，不但更好地改善了带标记MAN-5聚糖的分离度，样品中存在的其它带标记聚糖的电泳图也没有变差。

[0029] 乙二胺(1,2-乙二胺)这种多胺不应用作多胺，因为我们发现电导率太高，不能用于CGE系统。

[0030] 鉴于在作为本公开基础的研究中获得的结果，我们预期本文所述类型的多胺可改善带标记的N-聚糖、带标记的O-聚糖、带标记的唾液酸、乳寡糖和带标记的单糖的分离度。

[0031] 在一些实施方案中，多胺是结构1的化合物：结构1
其中R1–R3各自独立地是H或CH3。在特别优选的实施方案中，结构1的化合物是N1-(2-氨乙基)1,2-乙二胺，CAS号111-40-0。在另一特别优选的实施方案中，结构1的化合物是N1-[2-(二甲氨基)乙基]-N1,N2,N2-三甲基-1,2-乙二胺，CAS号3030-47-5。在另一特别优选的实施方案中，结构1的化合物是2,6,10-三甲基-2,6,10-三氮杂十一烷，CAS号3855-32-1。此化合物效力很强，因而可以以更低浓度使用。

[0032] 在一些实施方案中，多胺是结构2的化合物：结构2
其中R1和R2独立地选自H和CH3。在特别优选的实施方案中，结构2的化合物是N,N,N′,N′-四甲基-1,3-丙二胺(“PDA”)，CAS号110-95-2。PDA当与染料APTS一起使用时似乎提供特别好的结果。结构2的化合物不可为乙二胺(1，2-乙二胺)或尸胺(1，5-二氨基戊烷)，但可以使用甲基化的尸胺。
在一些优选的实施方案中，多胺是结构3的化合物：
结构3
其中R1和R2独立地选自H和CH3。

[0034] 在一些优选的实施方案中，多胺是结构4的化合物：结构4
其中R1-R3各自独立地为H或CH3。这些结构的化合物可被称为“tacns”。在一些实施方案中，结构4的多胺是1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(CAS号96556-05-7)。

[0035] 在一些优选的实施方案中，多胺是结构5的化合物：结构5
其中R1-R4各自独立地为H或CH3。

[0036] 在一些实施方案中，多胺是结构6的四氮金刚烷化合物：结构6：
其中R1-R6各自独立地为H或CH3。在优选的实施方案中，结构6的化合物是六亚甲基四胺，CAS号100-97-0。

[0037] 在一些实施方案中，多胺是结构7的线性四胺化合物：结构7
其中R1-R6各自独立地为H或CH3。

[0038] 在一些实施方案中，多胺是结构8的线性戊胺：结构8
其中R1-R7各自独立地为H或CH3。预期结构7和8特别有用于唾液酸化聚糖的分离。

[0039] 在本项研究的过程中，注意到有几种CE程序在CZE缓冲液中使用多胺来分离蛋白质。例如，美国专利号9,222,913教导在血红蛋白分子(具有一种或多种附着的糖的蛋白质链)的分离中使用某些多胺，特别是小多胺，来减少电渗通量。如本领域技术人员将理解的，带标记聚糖，作为本发明方法中通过CGE程序分离的分子，属于糖类，与‘913专利中研究的糖基化蛋白质相比，具有非常不同的结构、功能和物理性质。进一步地，虽然‘913专利和本公开均涉及电泳技术的使用，但‘913专利中使用的技术和本公开中使用的技术是使用不同系统的不同技术，各系统针对通过系统分离并分析的分子的不同物理性质。类似地，Lucy等，“Non-covalent capillary coatings for protein separations in capillary electrophoresis,”Journal of Chromatography A,1184(2008)81–105，教导了胺可减少蛋白质对熔融石英毛细管壁的吸附。该教导与聚糖分离的相关性不大，因为预期聚糖不会与毛细管壁结合。定义

[0040] 如本文所用的，短语“凝胶”、“凝胶基质”和“筛分基质”是同义词。

[0041] 在使用凝胶执行CGE或混合CE程序的语境中，术语“分离度”是指区分如下所述的两种分析物的能力：这些分析物在用于分离它们的分析系统中原本会一起迁移。为了便于引述，除非上下文另有要求，否则本文所用的术语“CGE”包括使用凝胶的混合CE程序。

[0042] 对于标记聚糖而言，术语“标记”意指将荧光部分或UV可见染料化学附着至聚糖。

[0043] 短语“聚糖已经通过与指定化合物反应而被标记”，意味着附着于带标记聚糖的标记物是使聚糖与指定化合物在允许该化合物以荧光部分或UV可见染料标记该聚糖的条件下接触之后剩下的标记物。CE和CGE

[0044] 毛细管电泳和CGE已经用于分离各种分析物超过二十年了。因此，预期技术人员熟悉在使用凝胶进行CGE和混合CE方法中使用的各种方案和试剂。在以下文章中一般性地讨论了CE，并具体讨论了CGE：诸如“Capillary Electrophoresis Methods for Pharmaceutical Analysis,”第9卷,Ahuja和Jimidar,编辑,Elsevier,London(2008),“Capillary Electrophoresis Guidebook:Principles,Operation,and Applications,”(Methods in Molecular Biology),Altria,编辑,Humana Press,Totowa,NJ(2010),和“Capillary Electrophoresis:Methods and Potentials,”Engelhardt等编辑,Friedr,Vieweg&Sohn,Braunschweig/Wiesbaden(1996)。许多文章中还特别教导了糖类的CE，包括“Capillary Electrophoresis of Carbohydrates”(Methods in Molecular Biology,Vol.213),Thibault和Honda,eds.,Humana Press Inc.,Totowa,NJ(2003),“Capillary Electrophoresis of Carbohydrates:From Monosaccharides to Complex Polysaccharides,”Volpi,编辑,Humana Press Inc.,Totowa,NJ(2011)以及
“Carbohydrate Analysis:High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis,”El Rassi,编辑,Elsevier Science B.V.,Amsterdam,the Netherland(1995)。上述最后一篇参考文献的第8章讨论了使用多种CE技术(包括CZE和CGE二者)来分析糖类和糖缀合物。
柱筒、凝胶和染料

[0045] 用于聚糖的CGE的凝胶在本领域中是已知的。通常，用于分离聚糖的凝胶不同于用于分离蛋白质的凝胶。例如，用于分离蛋白质的凝胶通常包含十二烷基硫酸钠以及比用于分离聚糖的凝胶更高水平的去污剂，以保持蛋白质完全变性。制备用于蛋白质分离的凝胶的方法也不同于制备用于聚糖分离的凝胶的方法，因为用于蛋白质分离的凝胶通常会经历再生程序。

[0046] 在优选的实施方案中，本发明的CGE方法和组合物中使用的凝胶可以如美国专利号8,163,152(“’152专利”)中第12栏第15-23行所教导的。在一些优选的实施方案中，凝胶是根据‘152专利中第12栏第25-35行中所述的配方制备的，并进行了以下修改：(1)配方中所述的7000000mwt g/mol的聚氧化乙烯(“PEO”)被替换为8000000mwt g/mol的PEO，因为7000000分子量的PEO目前不可商购，且(2)省略了EtBr(此改良的配方有时在本文中称为“改良PEO凝胶”)。在一些实施方案中，配方中列出的较大和较小的PEO的mwt g/mol可以独立为所述mwt g/mol值的±20％。并且，无论所用PEO的大小如何，优选从凝胶中省略EtBr。
尽管已将‘152专利整体通过提述并入，但是特别将上面引用的部分通过提述并入。如技术人员所知，“PEO”和“聚乙二醇”或“PEG”在化学上是同义词，但“PEG”通常用于指低于20,
000g/mol的聚合物，而“PEO”通常用于指高于该点的聚合物。作为本发明基础的研究是使用上述改良PEO凝胶配方进行的。

[0047] 在一些实施方案中，凝胶可以由用于聚糖的毛细管凝胶电泳的PEO以外的化合物组成，例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)。尽管PEO是特别优选的凝胶，但是可使用其它中性亲水性聚合物，诸如烷基纤维素、聚乙烯醇、葡聚糖或聚丙烯酰胺。

[0048] 用于聚糖的CGE分析的凝胶可以通过本领域已知的任何方式生成。方便地，将凝胶提供在柱筒中。柱筒通常用于配置为接受它们的分析仪器中，诸如供GL1000聚糖分析仪(BiOptic有限公司,新北市,中国台湾)中使用配制的凝胶柱筒，且允许快速更换凝胶，从而可加快一系列分析。在形成凝胶之前，可以将多胺方便地添加到试剂中，以使多胺均匀地分布在凝胶中。通常，凝胶是大批制备且分装到柱筒中的，再由期望使用柱筒的技术人员购买已经填充有所选凝胶的柱筒，以在配置为接收该柱筒的仪器中进行CGE分离。柱筒充当储池，在仪器中的各次电泳分离运行之间，一个或多个毛细管中的凝胶可从储池中得到补充。

[0049] 实施例讨论了聚糖标记物APTS和InstantQTM(ProZyme公司,Hayward,CA)的使用。也可以使用ANTS(通常以8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐，水合钠盐，CAS号5398-34-5的形式购买)以及用于聚糖的其它聚磺酸盐标记物。
毛细管和涂层

[0050] 用于CGE的毛细管通常由熔融石英制成，内径为200微米或更小。为了减少变量，作为本发明基础的研究全部使用内径为75微米的毛细管。

[0051] 作为本公开基础的研究表明，未涂覆的熔融石英毛细管不适用于使用PEO凝胶分离聚糖。因此，优选涂覆的毛细管。适用于分离聚糖的涂层是本领域已知的，例如T.Kubo,等,“Tunable separations based on a molecular size effect for biomolecules by poly(ethyleneglycol)gel-based capillary electrophoresis,”J.Chromatogr.A(2017),http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2017.06.043。从其它聚糖分离MAN-5聚糖

[0052] 如前述部分所述的，发酵罐中MAN-5聚糖水平的变化可以提示发酵反应中的压力，这样的压力可能会导致一整个生产运行中有价值的治疗剂(诸如一种由FDA批准的抗癌治疗剂)的损失。因此，确定系统中存在的MAN-5聚糖的量是重要的。不幸的是，通过CGE监测MAN-5聚糖的量是困难的，因为使用常规CGE凝胶可能会存在与MAN-5聚糖共迁移的其他聚糖。当用APTS标记聚糖时，与MAN-5聚糖共迁移的特定聚糖是G0和AlF。当用InstantQTM标记聚糖时，与MAN-5聚糖共迁移的聚糖是G0F-N和A1F。如图2中所示的(在下文实施例2中讨论)，与使用相同聚糖和相同凝胶但凝胶中无多胺的CGE相比，示例性CGE凝胶中示例性多胺的存在显著改善了MAN-5聚糖与A1F的分离度。实施例
实施例1

[0053] 在两种不同的多胺的存在下，使用用市售标记物InstantQTM(ProZyme公司,Hayward,CA)标记的G0F-N和Man5聚糖进行毛细管凝胶电泳分离。使用InstantQTM的CGE比APTS有更好的聚糖分离，所以G0F-N被根据GlcNAc所附着的臂(即二元的[3]或[6]臂)分离成两个同种型。在用于此研究的系统中，APTS并未分离这些同种型结构。

[0054] 结果显示在图1中。图1中下方的虚线显示在掺入了1.0μl/ml凝胶的EDA(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺，CAS号110-18-9)的凝胶上分析的带标记聚糖标准物G0F-N和Man5的混合物的电泳图。如电泳图下方虚线所示，EDA的存在并未帮助分离共迁移的G0F-N[3]和Man5。

[0055] 在另一实验准备中，在凝胶中以每ml凝胶0.50μl的浓度掺入了PDA(N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺，CAS号110-95-2)。使用此凝胶分离的电泳图如图1的上方实线所示。如图1的上方实线所示，PDA多胺的存在使Man5偏离G0F-N[3]，并显著改善了将Man5与样品中存在的G0F-N[3]区分的能力。
实施例2

[0056] 将依那西普，一种TNF受体与IgG1抗体恒定端融合而成的融合蛋白，PNGase F酶促去糖基化。将从该蛋白质释放的聚糖用InstantQTM(ProZyme,Inc.,Hayward,CA)标记，并使用两种凝胶(其中一种具有示例多胺，另二种凝胶遵循相同配方制成，但无多胺)通过CGE分析。具有多胺的凝胶以每ml凝胶0.86μl的浓度加入示例多胺1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,产品311294，Pubchem物质ID 24858510)。

[0057] 结果显示在图2中。参见图2，MAN-5聚糖的峰用星号标示，对于上方的线，还用箭头标示。MAN-5聚糖峰左边紧邻的峰是聚糖A1F的峰。图2中上方的实线表示使用含有多胺的凝胶的聚糖分离的电泳图，下方的虚线显示了遵循相同配方制备但无多胺的凝胶的结果。该线显示，与不存在多胺的凝胶相比，Man5远离峰肩。进一步地，上方的线(来自含有多胺的凝胶)中Man5的峰返回基线，有助于确定Man5的存在量。因此，与不存在多胺的相同测定相比，测定中多胺的存在显著改善了MAN-5聚糖的分离度。应当理解，本申请所述的实施例和实施方案仅出于说明性目的，其各种修改或改变是本领域技术人员能够想到的，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。本申请引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过提述整体并入本申请。

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