脱羧酶、和使用了该脱羧酶的不饱和烃化合物的制造方法
阅读：572发布：2020-06-12
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1.下述式(2)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的制造方法，其包含下述工序：在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶的存在下，使下述式(1)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧的工序，在式(1)和式(2)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基；A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
2.下述式(5)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的制造方法，其包含下述工序：在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶的存在下，使下述式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧的工序，在式(3)～式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基；A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
3.一种不饱和烃化合物的制造方法，其包含下述工序：对导入了编码下述阿魏酸脱羧酶的DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞和/或其培养物中生成的下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的工序，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，
在式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基；A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的不饱和烃化合物的制造方法，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺，并且序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸的阿魏酸脱羧酶。
5.一种阿魏酸脱羧酶，其序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸被改变成谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，并且具有生成下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性，
在式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基；A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
6.根据权利要求5所述的阿魏酸脱羧酶，其序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸被改变为谷氨酰胺，并且，序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸被改变为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸。
7.一种DNA，其编码权利要求5或6所述的阿魏酸脱羧酶。
8.一种载体，其包含权利要求7所述的DNA。
9.一种宿主细胞，其导入了权利要求7所述的DNA或权利要求8所述的载体。
10.一种阿魏酸脱羧酶变体的制造方法，其包含下述工序：对权利要求9所述的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
11.一种制造方法，是生成下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性提高了的阿魏酸脱羧酶的制造方法，其包含下述工序：在阿魏酸脱羧酶中，使序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸改变成谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的工序，
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在式(2)和式(5)中，R、R 、R和R 各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基；A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
12.根据权利要求11所述的制造方法，在所述阿魏酸脱羧酶中，使序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸改变成谷氨酰胺，并且，使序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸改变成组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸。
13.一种制剂，是用于使下述式(1)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧、促进下述式(2)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，其包含下述阿魏酸脱羧酶、编码该阿魏酸脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：
2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，在式(1)和式(2)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基；A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
14.一种制剂，是用于使下述式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧、促进下述式(5)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，其包含下述阿魏酸脱羧酶、编码该阿魏酸脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：
2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，
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在式(3)～式(5)中，R、R 、R和R 各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基；A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
15.根据权利要求13或14所述的制剂，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺，并且序列号：2所记载的氨基酸序列的
394位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸的阿魏酸脱羧酶。
脱羧酶、和使用了该脱羧酶的不饱和烃化合物的制造方法
技术领域
[0001] 本发明涉及使用了阿魏酸脱羧酶中395位等为谷氨酰胺等的脱羧酶的、不饱和烃化合物的制造方法。此外，本发明涉及使用了导入了编码该脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体的宿主细胞的、不饱和烃化合物的制造方法。进而，本发明也涉及包含上述脱羧酶、上述DNA或上述载体的、用于促进不饱和烃化合物的生成的制剂。
[0002] 此外，本发明涉及395位等被改变成谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶变体、及其制造方法，进一步涉及编码该阿魏酸脱羧酶变体的DNA、插入有该DNA的载体、导入了该DNA或该载体的宿主细胞。
背景技术
[0003] 由于丁二烯(1,3-丁二烯)作为各种合成橡胶(丁二烯橡胶、丁苯橡胶、丁腈橡胶等)、聚合物树脂(ABS树脂、尼龙66等)这样的各种高分子化合物的原料使用，因此在化学产业中可以说是极其重要的有机化合物。此外，这些以丁二烯作为原料的高分子化合物不仅广泛利用于汽车用轮胎等工业用品，而且也广泛利用于服装类等生活用品。因此，丁二烯的需求逐年增加，其年间需求为1300万吨，此外市场规模也达到150亿美元。
[0004] 一直以来，丁二烯主要通过将在从石油制造乙烯和丙烯时副生的C4馏分进行精制来制造。然而，因为石油等化石燃料的枯竭、温室效应气体排出引起的地球变暖等环境问题，为了应对上述不断增加的丁二烯需求，实现可持续的丁二烯制造的必要性提高。进而，作为其对策，从作为可再生资源的来源于生物质资源的物质，利用酶制造丁二烯的方法的开发盛行。
[0005] 例如，在专利文献1中，公开了以木糖作为原料，使用具有能够将其转变为巴豆醇等的酶活性的微生物，来制造丁二烯的方法。此外，在专利文献2中，公开了以木糖作为原料，使用具有能够将其转变为2,3-丁二醇的酶活性的微生物，来制造丁二烯的方法。这样，虽然尝试了多种利用了酶的丁二烯等不饱和烃化合物的制造，但是从生产性等观点考虑仍然不充分。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1：日本特开2014-30376号公报
[0009] 专利文献2：日本特开2015-228804号公报
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献1：Karl A.P.Payne等，Nature，2015年6月25日发行，522卷，7557号，497～501页
发明内容
[0012] 发明所要解决的课题
[0013] 本发明是鉴于上述现有技术所具有的课题而提出的，其目的是提供能够以高生产性制造丁二烯等不饱和烃化合物的酶。
[0014] 用于解决课题的方法
[0015] 本发明人等为了达到上述目的而反复进行了深入研究，结果想到，将通过阿魏酸脱羧酶参与的、阿魏酸的脱羧反应而生成4-乙烯基愈创木酚(4VG)的方法(参照非专利文献1和下述式)应用于丁二烯等不饱和烃化合物的制造。
[0016]
[0017] 即想到，向阿魏酸脱羧酶的氨基酸导入变异，将该酶的底物特异性从原来的针对阿魏酸变更为针对粘康酸等，从而经过下述式所示那样的脱羧反应来制造丁二烯等。
[0018]
[0019] 因此，本发明人等向来源于曲霉属的阿魏酸脱羧酶(包含序列号：2所记载的氨基酸序列的脱羧酶)的10个部位各自导入伴随氨基酸置换的变异，调制出121个阿魏酸脱羧酶的变体。进而，关于这些变体，对与以粘康酸作为底物的丁二烯的生成有关的催化活性进行了评价。
[0020] 其结果明确了，在导入了变异的10个部位，在395位中，将该部位的苏氨酸置换成其它氨基酸(谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、丝氨酸或精氨酸)，从而大体上与丁二烯的生成有关的催化活性提高(与变异导入前的野生型的阿魏酸脱羧酶相比，催化活性提高至少约3倍)。令人惊讶的是，发现在将395位置换成天冬酰胺的情况下，与野生型的阿魏酸脱羧酶相比，与丁二烯的生成有关的催化活性提高近50倍；在置换成组氨酸的情况下，与野生型的阿魏酸脱羧酶相比，与丁二烯的生成有关的催化活性提高近70倍；在置换成谷氨酰胺的情况下，与野生型的阿魏酸脱羧酶相比，与丁二烯的生成有关的催化活性提高100倍以上。
[0021] 进一步，也制作出在这些将395位置换成其它氨基酸的阿魏酸脱羧酶中，将其它部位的氨基酸进一步置换了的变体，关于它们，也评价了上述催化活性。
[0022] 其结果明确了，通过除了上述395位的氨基酸置换以外，将394位置换成其它氨基酸，从而与1,3-丁二烯的生成有关的催化活性能够进一步提高。特别令人惊讶的是，发现在将395位置换成组氨酸的变体中，在将394位置换成丝氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的情况下，与野生型的FDC相比，与1,3-丁二烯的生成有关的催化活性提高500倍以上；此外，在将该部位置换成组氨酸的情况下，与野生型的FDC相比，与1,3-丁二烯的生成有关的催化活性提高1000倍以上。
[0023] 此外也发现，在除了上述395位的氨基酸置换以外，仅将394位的酪氨酸置换成其它氨基酸(苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苏氨酸、精氨酸或天冬酰胺)的情况下、以及将437位的苯丙氨酸置换成酪氨酸的情况下，阿魏酸脱羧酶的与1,3-丁二烯的生成有关的催化活性与野生型相比提高，从而完成了本发明。
[0024] 即，本发明涉及使用了阿魏酸脱羧酶中395位等为谷氨酰胺等的脱羧酶的、不饱和烃化合物的制造方法。此外，本发明涉及使用了导入了编码该脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体的宿主细胞的、不饱和烃化合物的制造方法。进而，本发明也涉及包含上述脱羧酶、上述DNA或上述载体的、用于促进不饱和烃化合物的生成的制剂。
[0025] 此外，本发明涉及395位等被改变成谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶变体、及其制造方法，进一步涉及编码该阿魏酸脱羧酶变体的DNA、插入有该DNA的载体、导入了该DNA或该载体的宿主细胞。
[0026] 更具体而言，本发明提供以下方案。
[0027] ＜1＞下述式(2)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的制造方法，其包含下述工序：在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶的存在下，使下述式(1)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧的工序，
[0028]
[0029] [在式(1)和式(2)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键]。
[0030] ＜2＞下述式(5)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的制造方法，其包含下述工序：在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶的存在下，使下述式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧的工序，
[0031]
[0032] [在式(3)～式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键]。
[0033] ＜3＞一种不饱和烃化合物的制造方法，其包含下述工序：对导入了编码下述阿魏酸脱羧酶的DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞和/或其培养物中生成的下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的工序，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，
[0034]
[0035] [在式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键]。
[0036] ＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的不饱和烃化合物的制造方法，上述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺，并且序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸的阿魏酸脱羧酶。
[0037] ＜5＞一种阿魏酸脱羧酶，其序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸被改变成谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，并且具有生成下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性，
[0038]
[0039] [在式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键]。
[0040] ＜6＞根据＜5＞所述的阿魏酸脱羧酶，其序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸被改变为谷氨酰胺，进一步，序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸被改变为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸。
[0041] ＜7＞一种DNA，其编码＜5＞或＜6＞所述的阿魏酸脱羧酶。
[0042] ＜8＞一种载体，其包含＜7＞所述的DNA。
[0043] ＜9＞一种宿主细胞，其导入了＜7＞所述的DNA或＜8＞所述的载体。
[0044] ＜10＞一种阿魏酸脱羧酶变体的制造方法，其包含下述工序：对＜9＞所述的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
[0045] ＜11＞一种制造方法，是生成下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性提高了的阿魏酸脱羧酶的制造方法，其包含下述工序：在阿魏酸脱羧酶中，将序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸改变成谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的工序。
[0046]
[0047] [在式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键]。
[0048] ＜12＞根据＜11＞所述的制造方法，在上述阿魏酸脱羧酶中，使序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸改变成谷氨酰胺，进而使序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸改变成组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸。
[0049] ＜13＞一种制剂，是用于使下述式(1)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧、促进下述式(2)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，其包含下述阿魏酸脱羧酶、编码该阿魏酸脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，
[0050]
[0051] [在式(1)和式(2)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键]。
[0052] ＜14＞一种制剂，是用于使下述式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧、促进下述式(5)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，其包含下述阿魏酸脱羧酶、编码该阿魏酸脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体，所述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，
[0053]
[0054] [在式(3)～式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键]。
[0055] ＜15＞根据＜13＞或＜14＞所述的制剂，上述阿魏酸脱羧酶是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺，并且序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸的阿魏酸脱羧酶。
[0056] ＜16＞上述式(2)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的制造方法，其包含下述工序：在阿魏酸脱羧酶的存在下，使上述式(1)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧的工序，并且
[0057] 上述阿魏酸脱羧酶为选自下述(a)～(c)中的至少1种阿魏酸脱羧酶，
[0058] (a)序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，
[0059] (b)序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸为苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苏氨酸、精氨酸或天冬酰胺的阿魏酸脱羧酶，以及
[0060] (c)序列号：2所记载的氨基酸序列的437位或与该部位对应的氨基酸为酪氨酸的阿魏酸脱羧酶
[0061] 另外，在上述式(1)和式(2)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
[0062] ＜17＞上述式(5)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的制造方法，其包含下述工序：在阿魏酸脱羧酶的存在下，使上述式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧的工序，并且
[0063] 上述阿魏酸脱羧酶为选自＜16＞所记载的(a)～(c)中的至少1种阿魏酸脱羧酶，[0064] 另外，在上述式(3)～式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
[0065] ＜18＞一种不饱和烃化合物的制造方法，其包含下述工序：对导入了编码阿魏酸脱羧酶的DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞和/或其培养物中生成的上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的工序，并且[0066] 上述阿魏酸脱羧酶为选自＜16＞所记载的(a)～(c)中的至少1种阿魏酸脱羧酶，[0067] 另外，在上述式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
[0068] ＜19＞一种阿魏酸脱羧酶，其导入有选自下述(d)～(f)中的至少1种改变，并且具有生成上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性，[0069] (d)将序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸改变为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，
[0070] (e)将序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸改变为苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苏氨酸、精氨酸或天冬酰胺，和[0071] (f)改变为序列号：2所记载的氨基酸序列的437位或与该部位对应的氨基酸为酪氨酸的阿魏酸脱羧酶
[0072] 另外，在上述式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
[0073] ＜20＞一种DNA，其编码＜19＞所述的阿魏酸脱羧酶。
[0074] ＜21＞一种载体，其包含＜20＞所述的DNA。
[0075] ＜22＞一种宿主细胞，其导入了＜20＞所述的DNA或＜21＞所述的载体。
[0076] ＜23＞一种阿魏酸脱羧酶变体的制造方法，其包含下述工序：对＜22＞所述的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
[0077] ＜24＞一种制造方法，是生成上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性提高了的阿魏酸脱羧酶的制造方法，其包含下述工序：在阿魏酸脱羧酶中，导入选自＜19＞所记载的(d)～(f)中的至少1种改变的工序。
[0078] 另外，在上述式(2)和式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
[0079] ＜25＞一种制剂，是用于使上述式(1)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧、促进上述式(2)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，其包含阿魏酸脱羧酶、编码该阿魏酸脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体，并且
[0080] 上述阿魏酸脱羧酶为选自＜16＞所记载的(a)～(c)中的至少1种阿魏酸脱羧酶，[0081] 另外，在上述式(1)和式(2)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
[0082] ＜26＞一种制剂，是用于使上述式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧、促进上述式(5)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，其包含阿魏酸脱羧酶、编码该阿魏酸脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体，并且
[0083] 上述阿魏酸脱羧酶为选自＜16＞所记载的(a)～(c)中的至少1种阿魏酸脱羧酶，[0084] 另外，在上述式(3)～式(5)中，R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基，在碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成双键。
[0085] 发明的效果
[0087] 图1为表示在阿魏酸脱羧酶中，使将10个部位的氨基酸(185位的亮氨酸、187位的异亮氨酸、283位的蛋氨酸、323位的苏氨酸、327位的异亮氨酸、331位的丙氨酸、394位的酪氨酸、395位的苏氨酸、437位的苯丙氨酸和439位的亮氨酸)各自置换成其它氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)的变体在大肠杆菌中表达，对与以顺,顺-粘康酸作为底物的1,3-丁二烯的生成有关的催化活性进行了解析的结果的图。另外，在该图中，仅对与野生型的阿魏酸脱羧酶相比上述催化活性提高了3倍以上的变体显示结果。图中，纵轴表示将通过各阿魏酸脱羧酶变体生成的1,3-丁二烯量以野生型的阿魏酸脱羧酶(WT)的该1,3-丁二烯量作为基准(1)而算出的相对值。此外，图中“A331I”等表示阿魏酸脱羧酶的各变体，数字表示在该酶中导入了伴随氨基酸置换的变异的部位(331位等)，数字的左侧的字母表示被置换前的氨基酸(A/丙氨酸等)，数字的右侧的字母表示被置换后的氨基酸(I/异亮氨酸等)。关于与氨基酸变体有关的表述，只要没有特别指明，在图2和表8～12中也同样。
[0088] 图2为表示对与阿魏酸脱羧酶变体(T395N、T395H或T395Q)、或使各变体和野生型的阿魏酸脱羧酶表达了的大肠杆菌有关，并与以顺,顺-粘康酸作为底物的1,3-丁二烯的生成有关的催化活性进行了解析的结果的图。图中，纵轴表示将通过各阿魏酸脱羧酶变体生成的1,3-丁二烯量、或通过各变体和野生型的阿魏酸脱羧酶生成的1,3-丁二烯量以野生型的阿魏酸脱羧酶(WT)的该1,3-丁二烯量作为基准(1)而算出的相对值。
具体实施方式
[0089] ＜不饱和烃化合物的制造方法1＞
[0090] 如在后述的实施例中所示那样，发现395位的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶的促进生成下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的下述反应的催化活性(也称为“生成不饱和烃化合物的催化活性”)高。
[0091]
[0092] 因此，本发明提供下述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的制造方法，其包含下述工序：在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶(以下，也称为“本发明涉及的脱羧酶”。关于该脱羧酶，参照后述)的存在下，使下述式(1)或式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物、或它们的几何异构体脱羧的工序。
[0093] 在本发明中，通过上述反应生成的“不饱和烃化合物或其几何异构体”是指如上述式(2)和式(5)所示那样，具有至少1个碳间双键的烃化合物，可以为导入了碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基的化合物。作为这样的化合物，可举出例如，丁二烯(1,3-丁二烯)，2,4-戊二烯酸、异巴豆酸、3-甲基异巴豆酸、3-戊烯酸、10-十一碳烯酸。
[0094] 在本发明中，成为不饱和烃化合物生成的原料的“不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体”是指如上述式(1)和(3)所示那样，具有至少1个碳间双键，并且具有至少2个羧基的烃化合物，可以为导入了碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基的化合物。作为这样的化合物，可举出例如，顺,顺-粘康酸、顺,反-粘康酸、反,反-粘康酸、戊烯二酸、2-甲基戊烯二酸、3-甲基戊烯二酸、愈伤酸。
[0095] 这样的上述式(1)和式(3)所示的化合物、以及它们的几何异构体如后述实施例中所示那样，可以作为市售的制品而购入。此外，如果是本领域技术人员，也可以适当参考公知的合成方法(例如，Kiyoshi Kudo等，石油学会志，1994年07月13日发行，38卷，1号，48～51页所记载的方法)来合成。
[0096] 上述式(1)和式(2)所示的化合物、以及它们的几何异构体中的R1和R2、或上述式(3)～式(5)所示的化合物、以及它们的几何异构体中的R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢原子、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基或羟基。
[0097] 作为“碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基”，可举出例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基。
[0098] 作为“碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基”，可举出例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正戊氧基、1,2-二甲基-丙氧基。
[0099] 此外，上述式(1)～(5)所示的化合物、以及它们的几何异构体中的A表示可以被取代的碳原子数0～5的直链状烃基。另外，所谓“可以被取代的碳原子数0的直链状烃基”，是指在上述式(1)～式(5)所示的化合物、以及它们的几何异构体中经由A而结合的碳原子彼此不经由A而直接结合。进一步，在可以被取代的直链状烃基的碳原子数为2～5的情况下，可以在相邻的碳原子间形成至少1个双键。此外，在A中所谓烃基可以具有的取代基，可举出例如，碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基、碳原子数1～5的直链状或支链状的烷氧基、羟基、卤原子(例如，氟、氯、溴、碘)、硝基、氰基、氨基、羧基、甲酰基。
[0100] 关于在本发明涉及的脱羧酶的存在下，使不饱和烃二羧酸化合物脱羧的条件，只要是促进该脱羧，生成不饱和烃化合物的条件即可，如果是本领域技术人员，则可以适当调整反应液的组成、反应液的pH、反应温度、反应时间等来设定。
[0101] 例如，作为添加了本发明涉及的脱羧酶、和作为其底物的不饱和烃二羧酸化合物的反应液，只要不妨碍上述反应，就没有特别限制，优选可举出pH6～8的缓冲液，更优选可举出pH6～7的包含氯化钾和磷酸钠的缓冲液。进一步，从更易于促进上述反应这样的观点考虑，优选包含被异戊二烯化(Prenylation)了的黄素单核苷酸(prFMN)或其异构体(关于prFMNketimine，prFMNiminiu、这些prFMN及其异构体，参照非专利文献1)。
[0102] 此外，作为在这样的反应中使用的本发明涉及的脱羧酶，可以仅使用1种序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶，但也可以并用2种以上本发明涉及的脱羧酶。进一步，如后述实施例所示那样，从更易于促进不饱和烃羧酸化合物的脱羧这样的观点考虑，优选并用序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为苏氨酸的阿魏酸脱羧酶(关于“序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为苏氨酸的阿魏酸脱羧酶”，参照后述表1～3)。
[0103] 此外，作为反应温度，只要不妨碍上述反应，也就没有特别限制，通常为20～40℃，优选为25～37℃。进一步，作为反应时间，只要是能够生成上述不饱和烃化合物的时间即可，没有特别限制，但通常为30分钟～7天，优选为12小时～2天。
[0104] 此外，在这样的条件下生成的上述不饱和烃化合物由于大体上来说易于气化，因此可以通过挥发性气体的公知的回收、精制方法而收集。作为这样的收集方法，可举出气提、分馏、吸附、脱附、渗透蒸发、吸附于固相的异戊二烯的利用热或真空进行的从固相的脱附、通过溶剂进行的提取、或色谱(例如，气相色谱)等。此外，即使在生成的烯烃化合物为液体的情况下，也可以适当利用并收集公知的回收、精制方法(蒸馏、色谱等)。进一步，这些方法可以单独进行，此外能够适当组合而多阶段地实施。
[0105] ＜不饱和烃化合物的制造方法2＞
[0106] 此外，如在后述的实施例中所示那样，通过对以表达阿魏酸脱羧酶的395位为谷氨酰胺等的脱羧酶的方式进行了转化的宿主细胞进行培养，可以生产性高地制造不饱和烃化合物。
[0107] 因此，在本发明中，也提供不饱和烃化合物的制造方法，其包含下述工序：对导入了编码本发明涉及的脱羧酶的DNA或载体的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞和/或其培养物中生成的上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的工序。
[0108] 关于“导入了编码本发明涉及的脱羧酶的DNA或载体的宿主细胞”，如后述那样，但作为在这样的宿主细胞中表达的本发明涉及的脱羧酶，可以仅为1种序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶，也可以为2种以上本发明涉及的脱羧酶。进一步，如后述的实施例所示那样，从更易于促进不饱和烃羧酸化合物的脱羧这样的观点考虑，优选在上述宿主细胞中，也表达序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为苏氨酸的阿魏酸脱羧酶。
[0109] 此外，关于上述细胞的培养条件，如后述那样，但优选在培养基中添加作为本发明涉及的脱羧酶的底物的由上述式(1)或式(3)表示的不饱和烃二羧酸化合物、或它们的几何异构体。培养温度能够根据所使用的宿主细胞的种类而适当设计变更，但通常为20～40℃，优选为25～37℃。
[0110] 此外，在本发明中，所谓“培养物”，是含有通过将宿主细胞用培养基进行培养而获得的、增殖了的宿主细胞、该宿主细胞的分泌产物和该宿主细胞的代谢产物等的培养基，包含它们的稀释物、浓缩物。
[0111] 关于从这样的宿主细胞和/或培养物收集不饱和烃化合物，也没有特别限制，可以使用上述公知的回收、精制方法进行。此外，作为收集的时期，根据所使用的宿主细胞的种类而适当调整，只要是不饱和烃化合物能够生成的时间即可，但通常为30分钟～7天，优选为12小时～2天。
[0112] ＜本发明涉及的脱羧酶＞
[0113] 接下来，对在上述本发明的不饱和烃化合物的制造方法等中使用的脱羧酶进行说明。
[0114] 通常，所谓“阿魏酸脱羧酶”，是作为EC号：4.1.1.102登记的酶，是指催化将阿魏酸脱羧而生成4-乙烯基愈创木酚(4VG)的下述反应的酶。
[0115]
[0116] 如上述那样，本发明人等发现：395位的氨基酸为谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶具有高的生成不饱和烃化合物的催化活性。
[0117] 因此，本发明涉及的脱羧酶只要是序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，并具有生成不饱和烃化合物的催化活性的脱羧酶即可，如在后述的实施例中所示那样，不仅包含上述部位的氨基酸被人工改变成谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶(以下，也称为“阿魏酸脱羧酶变体”)，也包含上述部位的氨基酸为谷氨酰胺等的、天然存在的阿魏酸脱羧酶(以下，也称为“阿魏酸脱羧酶同源物(homologue)”或“阿魏酸脱羧酶天然变异体”)。
[0118] 在本发明的“阿魏酸脱羧酶变体”中，作为被实施氨基酸改变的阿魏酸脱羧酶，没有特别限制，可以使用各种生物来源的阿魏酸脱羧酶。例如，除了来源于曲霉属黑曲霉(Aspergillus niger)(CBS513.88株)的阿魏酸脱羧酶(UNIPROT ID：A2QHE5，包含序列号：2所记载的氨基酸序列的阿魏酸脱羧酶)以外，可举出在UNIPROT上相当于“Ferulic acid decarboxylase”(阿魏酸脱羧酶)的蛋白质，更具体而言，可举出下述表1～6所记载的阿魏酸脱羧酶。
[0119] 【表1】
[0120]
[0121] 【表2】
[0122]
[0123] 【表3】
[0124]
[0125] 【表4】
[0126]
[0127] 【表5】
[0128]
[0129] 【表6】
[0130]
[0131] 另外，表1～3表示序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为苏氨酸的阿魏酸脱羧酶，表4表示序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺的阿魏酸脱羧酶，表5表示序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸的阿魏酸脱羧酶，表6表示序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为天冬酰胺的阿魏酸脱羧酶。此外，应该理解在自然界中通过核苷酸序列变异，蛋白质的氨基酸序列的变化能够发生。
[0132] 在表1～6所记载的阿魏酸脱羧酶中，作为被实施氨基酸改变的阿魏酸脱羧酶，优选为来源于曲霉属黑曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸脱羧酶，更优选为包含序列号：2所记载的氨基酸序列的蛋白质。
[0133] 此外，作为本发明涉及的“阿魏酸脱羧酶同源物”和“阿魏酸脱羧酶天然变异体”，可举出例如，表4～6所记载的、上述部位为谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸的阿魏酸脱羧酶。
[0134] 在“本发明涉及的脱羧酶”中，作为序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸，只要是谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸即可，但从生成不饱和烃化合物的催化活性更高这样的观点考虑，优选为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸或赖氨酸，更优选为谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺，进一步优选为谷氨酰胺或组氨酸，特别优选为谷氨酰胺。
[0135] 进一步，如在后述的实施例中所示那样，在“本发明涉及的脱羧酶”中，从具有生成不饱和烃化合物的催化活性易于进一步变高的倾向考虑，优选除了上述的395位以外，进一步序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、色氨酸或谷氨酰胺。更具体而言，在“本发明涉及的脱羧酶”中，在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸更优选为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸或天冬酰胺，进一步优选为组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或亮氨酸，特别优选为组氨酸。在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸更优选为色氨酸、苯丙氨酸或组氨酸。此外，在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为天冬酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸更优选为苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸或色氨酸。
[0136] 此外，与上述同样地在“本发明涉及的脱羧酶”中，优选除了上述的395位以外，进一步序列号：2所记载的氨基酸序列的187位或与该部位对应的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、亮氨酸、蛋氨酸或色氨酸。更具体而言，在“本发明涉及的脱羧酶”中，在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的187位或与该部位对应的氨基酸更优选为组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或精氨酸，进一步优选为组氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的187位或与该部位对应的氨基酸更优选为丝氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或亮氨酸，进一步优选为丝氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或谷氨酰胺。在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为天冬酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的187位或与该部位对应的氨基酸更优选为组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬酰胺。
[0137] 此外，在“本发明涉及的脱羧酶”中，优选除了上述的395位以外，进一步序列号：2所记载的氨基酸序列的327位或与该部位对应的氨基酸为亮氨酸。
[0138] 此外，在“本发明涉及的脱羧酶”中，优选除了上述的395位以外，进一步序列号：2所记载的氨基酸序列的331位或与该部位对应的氨基酸为苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或天冬酰胺。更具体而言，在“本发明涉及的脱羧酶”中，在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的331位或与该部位对应的氨基酸更优选为蛋氨酸、亮氨酸或苏氨酸，进一步优选为蛋氨酸或亮氨酸。在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的331位或与该部位对应的氨基酸更优选为天冬酰胺。
[0139] 此外，在“本发明涉及的脱羧酶”中，优选除了上述的395位以外，进一步序列号：2所记载的氨基酸序列的437位或与该部位对应的氨基酸为苏氨酸、天冬酰胺或酪氨酸。更具体而言，在“本发明涉及的脱羧酶”中，在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的437位或与该部位对应的氨基酸更优选为酪氨酸。在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的437位或与该部位对应的氨基酸更优选为酪氨酸。
[0140] 此外，在“本发明涉及的脱羧酶”中，优选除了上述的395位以外，进一步序列号：2所记载的氨基酸序列的439位或与该部位对应的氨基酸为异亮氨酸或蛋氨酸。更具体而言，在“本发明涉及的脱羧酶”中，在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为组氨酸的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的439位或与该部位对应的氨基酸更优选为异亮氨酸。在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为天冬酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的439位或与该部位对应的氨基酸更优选为蛋氨酸。
[0141] 此外，在“本发明涉及的脱羧酶”中，在序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺的情况下，序列号：2所记载的氨基酸序列的185位或与该部位对应的氨基酸优选为酪氨酸，或序列号：2所记载的氨基酸序列的283位或与该部位对应的氨基酸优选为亮氨酸。
[0142] 另外，在本发明中，所谓“对应的部位”，是在利用核苷酸和氨基酸序列解析软件(GENETYX-MAC，Sequencher等)、BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)排列序列号：2所记载的氨基酸序列、与来源于其它品种的阿魏酸脱羧酶等的氨基酸序列时，与序列号：2所记载的氨基酸序列中的395位的苏氨酸、394位的酪氨酸等成为同列的部位。
[0143] “本发明涉及的脱羧酶”可以为除了序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸以外，还人工地导入了变异的脱羧酶。即，在本发明涉及的脱羧酶中也包含：包含除了阿魏酸脱羧酶的氨基酸序列(序列号：2所记载的氨基酸序列等)的395位以外、还置换、缺失、附加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质”。这里所谓“多个”，没有特别限制，通常为2～100个，优选为2～50个，更优选为2～40个，进一步优选为2～30个，更优选为2～20个，进一步优选为2～10个(例如，2～8个、2～4个、2个)。
[0144] 此外，本发明涉及的脱羧酶与序列号：2所记载的氨基酸序列的同一性优选为15％以上(例如，16％以上、17％以上、18％以上、19％以上)，更优选为20％以上(例如，30％以上、40％以上)，进一步优选为50％以上(例如，60％以上、70％以上)，更优选为80％以上(例如，85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上)，更优选为90％以上(例如，91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)。另外，在本发明中所谓“同一性”，是指本发明涉及的脱羧酶与序列号：2所记载的氨基酸序列一致的氨基酸数相对于本发明涉及的脱羧酶的氨基酸总数的比例(％)。
[0145] 此外，脱羧酶是否具有生成不饱和烃化合物的催化活性，例如，如后述的实施例所示那样，可以通过利用气相色谱质谱分析(GC-MS)，对不饱和烃化合物的量进行直接测定来判定。进一步，通过与包含序列号：2所记载的氨基酸序列的阿魏酸脱羧酶或野生型的阿魏酸脱羧酶中的量进行比较，也可以判定与该阿魏酸脱羧酶相比生成不饱和烃化合物的催化活性是否高。
[0146] 对于生成不饱和烃化合物的催化活性，本发明涉及的脱羧酶相对于包含序列号：2所记载的氨基酸序列的阿魏酸脱羧酶，优选为2倍以上(例如，3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上)，更优选为10倍以上(例如，20倍以上、30倍以上、40倍以上)，进一步优选为50倍以上(例如，60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上)，更优选为100倍以上(例如，200倍以上、300倍以上、400倍以上)，更优选为500倍以上(例如，600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上)，特别优选为1000倍以上。
[0147] 此外，作为本发明涉及的脱羧酶，也可以仅使用1种序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶，但也可以并用2种以上本发明涉及的脱羧酶。进一步，如后述的实施例所示那样，从更易于促进不饱和烃羧酸化合物的脱羧这样的观点考虑，可以与序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为苏氨酸的阿魏酸脱羧酶并用。
[0148] 本发明的“阿魏酸脱羧酶变体”，在生成不饱和烃化合物的催化活性中，相对于野生型的阿魏酸脱羧酶，优选为2倍以上(例如，3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上)，更优选为10倍以上(例如，20倍以上、30倍以上、40倍以上)，进一步优选为50倍以上(例如，60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上)，更优选为100倍以上(例如，200倍以上、300倍以上、400倍以上)，更优选为500倍以上(例如，600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上)，特别优选为1000倍以上。
[0149] 另外，“野生型的阿魏酸脱羧酶”为导入序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸的改变、以及上述其它部位的变异前的阿魏酸脱羧酶，可举出例如，表1～6所记载的阿魏酸脱羧酶及其天然的变异体。
[0150] 本发明涉及的脱羧酶可以直接或间接地加成其它化合物。作为这样的加成，没有特别限制，可以为基因水平的加成，也可以为化学加成。此外关于加成的部位，也没有特别限制，可以为本发明涉及的脱羧酶的氨基末端(以下也称为“N末端”)和羧基末端(以下也称为“C末端”)的任一者，也可以为这两者。基因水平的加成通过使用对编码本发明涉及的脱羧酶的DNA、在阅读框合并加成编码其它蛋白质的DNA而成的物质来实现。作为这样操作而加成的“其它蛋白质”，没有特别限制，在出于使本发明涉及的脱羧酶的精制容易的目的的情况下，适合使用聚组氨酸(His-)标签(tag)蛋白质、FLAG-标签蛋白质(注册商标，Sigma-Aldrich社)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等精制用标签蛋白质，此外在出于使本发明涉及的脱羧酶的检测容易的目的的情况下，适合使用GFP等荧光蛋白质、荧光素酶等化学发光蛋白质等检测用标签蛋白质。化学加成可以为共价键，也可以为非共价键。作为“共价键”，没有特别限制，可举出例如，氨基与羧基的酰胺键、氨基与卤代烷基的烷基胺键、硫醇彼此间的二硫键、硫醇基与马来酰亚胺基或卤代烷基的硫醚键。作为“非共价键”，可举出例如，生物素-抗生物素蛋白间键。此外，作为这样操作而化学加成的“其它化合物”，在出于使本发明涉及的脱羧酶的检测容易的目的的情况下，适合使用例如，Cy3、若丹明等荧光色素。
[0152] ＜编码本发明涉及的脱羧酶的DNA、和具有该DNA的载体＞
[0153] 接下来，对编码本发明涉及的脱羧酶的DNA等进行说明。通过导入这样的DNA，能够转化宿主细胞，在该细胞中制造本发明涉及的脱羧酶，进而制造不饱和烃化合物。
[0154] 本发明涉及的DNA只要编码上述本发明涉及的脱羧酶，就可以为天然的DNA，也可以为向天然的DNA人为导入了变异的DNA，也可以为包含人工设计的核苷酸序列的DNA。进一步，对其形态没有特别限制，除了cDNA以外，还包含基因组DNA、和化学合成DNA。这些DNA的调制对于本领域技术人员而言能够利用常规手段进行。基因组DNA例如能够通过从曲霉属等中提取基因组DNA，制作基因组文库(作为载体，可以利用质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用以阿魏酸脱羧酶基因的核苷酸序列(例如，序列号：1所记载的核苷酸序列)为基础调制的探针进行菌落杂交或噬菌斑杂交来调制。此外，也能够通过制作对阿魏酸脱羧酶基因特异性的引物，进行利用了该引物的PCR来调制。此外，cDNA例如能够通过以从曲霉属等中提取的mRNA为基础合成cDNA，将其插入到λZAP等载体而制作cDNA文库，将其展开，与上述同样地进行菌落杂交或噬菌斑杂交，此外，通过进行PCR而调制。
[0155] 进而，关于向这样调制的DNA根据需要导入将序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸置换成谷氨酰胺等的变异，如果是本领域技术人员，则可以通过利用公知的位点定向诱变法来进行。作为位点定向诱变法，可举出例如，Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc Natl Acad Sci USA，1985年，82卷，2号，488～492页)、SOE(splicing-by-overlap-extention，重叠延伸剪接)-PCR法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.，and Pease，L.R.，Gene，1989年，77卷，51～59页)。
[0156] 此外，如果是本领域技术人员，则也可以人工设计编码将阿魏酸脱羧酶的395位或与该部位对应的氨基酸置换成谷氨酰胺等的蛋白质的核苷酸序列，基于该序列信息，使用自动核酸合成机，化学合成本发明涉及的DNA。
[0157] 进一步，从使其编码的本发明涉及的脱羧酶的表达效率在宿主细胞中更加提高这样的观点考虑，本发明涉及的DNA也能够根据该宿主细胞的种类，而采用将密码子进行了最佳化的编码本发明涉及的脱羧酶的DNA的方案。
[0158] 此外，在本发明中，为了能够在宿主细胞内复制上述DNA，也可以采用插入有该DNA的载体的方案。
[0159] 在本发明中，“载体”作为自主复制载体，即，染色体外的独立体而存在，其复制不依赖于染色体的复制，例如，可以以质粒为基本而构建。此外，载体可以为在导入到宿主细胞时，并入到该宿主细胞的基因组中，与并入了其的染色体一起被复制的载体。
[0160] 作为这样的载体，可举出例如，质粒、噬菌体DNA。此外，作为质粒，可举出来源于大肠杆菌的质粒(pET22、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、来源于酵母的质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)、来源于枯草菌的质粒(pUB110、pTP5等)。作为噬菌体DNA，可举出λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。进一步，如果宿主细胞来源于昆虫，则也可以使用杆状病毒等昆虫病毒载体作为本发明涉及的载体，如果来源于植物则也可以使用T-DNA等作为本发明涉及的载体，如果来源于动物则也可以使用反转录病毒、腺病毒载体等动物病毒载体作为本发明涉及的载体。此外，本发明涉及的载体构建的步骤和方法可以使用在基因工程的领域中惯用的步骤和方法。例如，在将本发明涉及的DNA插入到载体时，采用首先将被精制了的DNA用适当的限制性酶切断，插入到适当的载体的限制性酶部位或多克隆化位点而与载体连接的方法等。
[0161] 此外，本发明涉及的载体可以为能够使上述DNA编码的本发明涉及的脱羧酶以在宿主细胞内表达的状态包含而成的表达载体的形态。本发明涉及的“表达载体”，为了将其导入到宿主细胞而使本发明涉及的脱羧酶表达，期望除了上述DNA以外，还包含控制其表达的DNA序列、用于选择进行了转化的宿主细胞的基因标志物等。作为控制表达的DNA序列，启动子、增强子、剪接信号、poly-A加成信号、核糖体结合序列(SD序列)和终止子等包含于其中。启动子只要在宿主细胞中显示转录活性，就没有特别限定，可以作为控制编码与宿主细胞同种或不同种的任一蛋白质的基因表达的DNA序列而获得。此外，除了上述控制表达的DNA序列以外，还可以包含诱导表达的DNA序列。作为这样的诱导表达的DNA序列，在宿主细胞为细菌的情况下，可举出可以通过异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃苷(IPTG)的添加来诱导配置在下游的基因的表达的乳糖操纵子。本发明中的基因标志物可以根据进行了转化的宿主细胞的选择方法而适当选择，例如可以利用编码药剂抗性的基因、互补营养缺陷性的基因。
[0162] 此外，本发明涉及的DNA或载体可以与其它成分混合使用。作为其它成分，没有特别限制，可举出例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、助溶剂、缓冲剂、DNase(脱氧核糖核酸酶)抑制剂、保存剂。
[0163] ＜用于促进不饱和烃化合物的生成的制剂＞
[0164] 如上述那样，通过使用本发明涉及的脱羧酶、编码该脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体，能够使上述式(1)或式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物、或它们的几何异构体脱羧，促进上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的生成。
[0165] 因此，本发明提供用于使上述式(1)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧，促进上述式(2)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，或者用于使上述式(3)所示的不饱和烃二羧酸化合物或其几何异构体脱羧，促进上述式(5)所示的不饱和烃化合物或其几何异构体的生成的制剂，其包含：序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶、编码该阿魏酸脱羧酶的DNA或插入有该DNA的载体。
[0166] 作为这样的制剂，只要包含本发明涉及的脱羧酶即可，但也可以与其它成分混合使用。作为这样的其它成分，没有特别限制，可举出例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、助溶剂、缓冲剂、蛋白酶抑制剂、DNase抑制剂、保存剂。
[0167] 此外，本发明也可以提供包含这样的制剂的试剂盒。在本发明的试剂盒中，上述剂可以以导入本发明涉及的DNA等并进行了转化的后述宿主细胞的形式被包含。进一步，除了这样的制剂以外，上述式(1)或式(3)所示的化合物、或它们的几何异构体、用于导入本发明涉及的DNA等的宿主细胞、用于对该宿主细胞进行培养的培养基、和它们的使用说明书等也包含于本发明的试剂盒中。此外，这样的使用说明书为用于将本发明的制剂等利用于上述不饱和烃化合物的制造方法的说明书。说明书可以包含例如，本发明的制造方法的实验方法、实验条件、和与本发明的制剂等有关的信息(例如，显示载体的核苷酸序列等的载体图谱等信息、本发明涉及的脱羧酶的序列信息、宿主细胞的来源、性质、该宿主细胞的培养条件等信息)。
[0168] ＜导入了编码本发明涉及的脱羧酶的DNA等的宿主细胞＞
[0169] 接下来，对导入了本发明涉及的DNA或载体的宿主细胞进行说明。如果使用通过上述DNA或载体的导入而进行了转化的宿主细胞，则能够制造本发明涉及的脱羧酶，进而也能够制造上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体。
[0170] 导入本发明涉及的DNA或载体的宿主细胞没有特别限定，可举出例如，微生物(大肠杆菌、芽殖酵母、裂殖酵母、枯草菌、放线菌、丝状菌等)、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞，从在比较便宜的培养基中，在短时间显示高增殖性，进而能够有助于生产性高的、上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的制造这样的观点考虑，优选利用微生物作为宿主细胞，更优选利用大肠杆菌。
[0171] 此外，从诱导黄素单核苷酸(FMN)的异戊二烯化(Prenylation)，产生有助于上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的生产性提高的prFMN或其异构体这样的观点考虑，导入本发明涉及的DNA或载体的宿主细胞优选为保持黄素异戊烯基转移酶的细胞。
[0172] 此外，从在丁二烯的制造中，易于以葡萄糖作为原料而生成成为本发明涉及的脱羧酶的底物的粘康酸这样的观点考虑，导入本发明涉及的DNA或载体的宿主细胞优选为从葡萄糖经由3-脱氢莽草酸和儿茶酚而生物合成粘康酸的途径被活化的细胞。作为这样的细胞，可举出例如，磷酸转移酶系酶和丙酮酸激酶的活性被抑制，并且具有能够由分支酸或异分支酸合成芳香族化合物的酶的细胞(例如，国际公开2017/033965所记载的微生物)、Kruyer NS等，Curr Opin Biotechnol.2017年，Jun；45：136～143页所记载的大肠杆菌、恶臭假单胞菌或芽殖酵母。
[0173] 本发明涉及的DNA或载体的导入也可以按照该领域中惯用的方法实施。例如，作为对大肠杆菌等微生物导入的方法，可举出热休克法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法，作为向植物细胞导入的方法，可举出使用土壤杆菌的方法、粒子枪法，作为向昆虫细胞导入的方法，可举出使用杆状病毒的方法、电穿孔法，作为向动物细胞导入的方法，可举出磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法。
[0174] 这样操作而导入到宿主细胞内的DNA等可以通过在宿主细胞内，随机插入到其基因组DNA来保持，也可以通过同源重组来保持，此外如果为载体，则可以作为其基因组DNA外的独立体被复制而保持。
[0175] 此外，导入了本发明涉及的DNA或载体的宿主细胞，利用在后述的实施例中所示的方法测定的生成1,3-丁二烯的催化活性优选为5μM以上(例如，10μM以上、20μM以上、30μM倍以上、40μM以上)，更优选为50μM以上(例如，60μM以上、70μM以上、80μM、90μM)，更优选为100μM以上(例如，150μM以上、200μM以上、300μM以上、400μM以上)，更优选为500μM以上(例如，600μM以上、700μM以上、800μM以上、900μM以上)，特别优选为1mM以上。
[0176] ＜本发明的阿魏酸脱羧酶变体的制造方法＞
[0177] 如后述的实施例所示那样，通过对导入了编码本发明的阿魏酸脱羧酶变体的DNA等的宿主细胞进行培养，可以在该宿主细胞内制造阿魏酸脱羧酶变体。
[0178] 因此，本发明也可以提供阿魏酸脱羧酶变体的制造方法，其包含下述工序：对导入了编码本发明的阿魏酸脱羧酶变体的DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，收集在该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
[0179] 在本发明中，“对宿主细胞进行培养”的条件只要是上述宿主细胞可以制造本发明的阿魏酸脱羧酶变体的条件即可，如果是本领域技术人员，则可以根据宿主细胞的种类、所使用的培养基等，来适当调整温度、空气的添加的有无、氧的浓度、二氧化碳的浓度、培养基的pH、培养温度、培养时间、湿度等进行设定。
[0180] 作为这样的培养基，只要含有宿主细胞能够同化的物质即可，可举出碳源、氮源、硫源、无机盐类、金属、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、酪蛋白水解物、血清等作为含有物。此外，也可以在这样的培养基中添加例如，用于诱导编码本发明的阿魏酸脱羧酶变体的DNA的表达的IPTG、与本发明涉及的载体能够编码的耐药剂性基因对应的抗生素(例如，氨苄西林)、与本发明涉及的载体能够编码的互补营养缺陷性的基因对应的营养物(例如，精氨酸、组氨酸)。
[0181] 进而，作为从这样操作而培养的宿主细胞“收集在该细胞中表达的蛋白质”的方法，可举出例如，将宿主细胞通过过滤、离心分离等从培养基回收，将回收的宿主细胞通过细胞溶解、磨碎处理或加压破碎等进行处理，进一步通过超滤处理、盐析、硫酸铵沉淀等溶剂沉淀、色谱(例如，凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱)等，将在宿主细胞中表达的蛋白质进行精制、浓缩的方法。此外，在对本发明的阿魏酸脱羧酶变体加成上述精制标签蛋白质的情况下，也可以使用该标签蛋白质吸附的底物进行精制并收集。进一步，这些精制、浓缩方法也可以单独进行，此外能够适当组合而多阶段实施。
[0182] 此外，本发明的阿魏酸脱羧酶变体不限定于上述生物学合成，也可以使用本发明的DNA等和无细胞蛋白质合成系统而制造。作为这样的无细胞蛋白质合成系统，没有特别限制，可举出例如，来源于小麦胚芽、来源于大肠杆菌、来源于兔网织红细胞、来源于昆虫细胞的合成系统。进一步，如果是本领域技术人员，则也可以使用市售的肽合成机等，化学合成本发明的阿魏酸脱羧酶变体。
[0183] 此外，本发明也可以提供一种制造方法，是生成上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性提高了的阿魏酸脱羧酶的制造方法，其包含下述工序：在阿魏酸脱羧酶中，使序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸改变成谷氨酰胺等，优选进一步改变其它部位的氨基酸(例如，上述的序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸等)的工序。
[0184] 所谓“生成上述式(2)或式(5)所示的不饱和烃化合物、或它们的几何异构体的催化活性提高了的阿魏酸脱羧酶”，是指通过向序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸导入变异，优选通过向上述其它部位的氨基酸进一步导入变异，从而与上述导入前相比，生成不饱和烃化合物的催化活性高的阿魏酸脱羧酶，其比较对象通常为来源于上述曲霉属等各种生物的阿魏酸脱羧酶及其天然的变异体。
[0185] 另外，作为向序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸、或其它部位的氨基酸(序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸等)导入的变异、即向谷氨酰胺等或组氨酸等置换的适合方案，参照上述＜本发明涉及的脱羧酶＞的记载。
[0186] 阿魏酸脱羧酶中的“向谷氨酰胺等或组氨酸等的改变”可以通过编码的DNA的改变来进行。关于“DNA的改变”，这样的DNA的改变如上述那样，能够使用本领域技术人员公知的方法，例如，位点定向诱变法、基于被改变了的序列信息的DNA的化学合成法适当实施。此外，“向谷氨酰胺等或组氨酸等的改变”如上述那样，也可以使用肽的化学合成法进行。
[0187] 此外，是否通过这样的变异导入而提高了生成烯烃化合物的催化活性如上述那样，可以通过GC-MS分析等进行评价。
[0188] 以上，对本发明的适合的实施方式进行了说明，但本发明涉及的阿魏酸脱羧酶中的氨基酸不限定于上述序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸。
[0189] 如在下述实施例中所示那样，在序列号：2所记载的氨基酸序列的394位为苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等的情况下，生成不饱和烃化合物的催化活性与野生型相比变高。此外同样地，在序列号：2所记载的氨基酸序列的437位为酪氨酸的情况下，上述催化活性变高。
[0190] 因此，本发明代替上述序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺等的阿魏酸脱羧酶，也能够提供选自下述(a)～(c)中的至少1种阿魏酸脱羧酶、和使用该阿魏酸脱羧酶的方案，
[0191] (a)序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的阿魏酸脱羧酶，
[0192] (b)序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸为苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苏氨酸、精氨酸、或天冬酰胺的阿魏酸脱羧酶，和[0193] (c)序列号：2所记载的氨基酸序列的437位或与该部位对应的氨基酸为酪氨酸的阿魏酸脱羧酶。
[0194] 此外同样地，本发明代替与上述序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸向谷氨酰胺等的改变有关的方案，也能够提供与选自下述(d)～(f)中的至少1种改变有关的方案。
[0195] (d)使序列号：2所记载的氨基酸序列的395位或与该部位对应的氨基酸改变为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，[0196] (e)使序列号：2所记载的氨基酸序列的394位或与该部位对应的氨基酸改变为苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苏氨酸、精氨酸或天冬酰胺，和[0197] (f)改变为使序列号：2所记载的氨基酸序列的437位或与该部位对应的氨基酸改变为酪氨酸的阿魏酸脱羧酶。
[0198] 实施例
[0199] 以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限定于以下实施例。
[0200] (实施例1)
[0201] ＜阿魏酸脱羧酶变体的制作和评价＞
[0202] 本发明人等为了能够以高生产性制造丁二烯(1,3-丁二烯)，想到向催化下述4-乙烯基愈创木酚(4VG)的生成反应的阿魏酸脱羧酶(以下也称为“FDC”)的氨基酸导入变异，将该酶(阿魏酸脱羧酶变体)的底物特异性从原来针对阿魏酸变更为针对顺,顺-粘康酸，从而制造1,3-丁二烯。
[0203]
[0204] 即，想到通过向阿魏酸脱羧酶的氨基酸导入变异，将该酶的底物特异性从原来针对阿魏酸变更为针对粘康酸等，从而经过如下述式所示那样的脱羧反应，制造丁二烯等不饱和烃化合物。
[0205]
[0206] 因此，本发明人等利用以下所示的方法等，向阿魏酸脱羧酶的各种部位导入伴随氨基酸置换的变异，调制多个阿魏酸脱羧酶的变体。进而，关于这些变体，评价了与以顺,顺-粘康酸作为底物的1,3-丁二烯的生成有关的催化活性。
[0207] ＜质粒载体的调制＞
[0208] 首先，为了使来源于曲霉属的FDC在大肠杆菌中高效地表达，利用使聚组氨酸标签融合于编码其的野生型核苷酸序列的C末端的形态，考虑大肠杆菌中的密码子的使用频率而改变。接着，按照常规方法化学合成包含这样的改变核苷酸序列的DNA。进而，将这样操作而调制的DNA与pET22b(+)载体(Novagen社制)通过Gibson Assembly法(使用New England Biolabs社的试剂盒NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(注册商标))而连接，从而调制出能够在大肠杆菌中表达该野生型的FDC的质粒载体(FDC载体)。同样地操作，将从大肠杆菌(K-12)株将编码黄素异戊烯基转移酶(以下也称为“UbiX”)的基因通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)法扩增而得的DNA与pColADuet载体(Novagen社制)通过Gibson Assembly法而连接，从而调制出在大肠杆菌中能够表达该野生型的UbiX的质粒载体(UbiX载体)。
[0209] 接下来，如下述表7所示那样，在阿魏酸脱羧酶的10个各自部位中，为了将伴随氨基酸置换的变异导入到FDC，设计并合成了编码导入了各变异的氨基酸序列的引物。
[0210] 【表7】
[0211]氨基酸部位 置换前的氨基酸 置换后的氨基酸
185 L R，K，H，T，Q，N，I，M，F，Y，W
187 I R，K，H，T，Q，N，L，M，F，Y，W
283 M R，K，H，T，Q，N，I，L，F，Y，W
323 T R，K，H，Q，N，I，L，M，F，Y，W
327 I R，K，H，T，Q，N，L，M，F，Y，W
331 A R，K，H，T，Q，N，I，L，M，F，Y，W
394 Y R，K，H，T，Q，N，I，L，M，F，W
395 T R，K，H，Q，N，I，L，M，F，Y，W
437 F R，K，H，T，Q，N，I，L，M，Y，W
439 L R，K，H，T，Q，N，I，M，F，Y，W
185 L R，K，H，T，Q，N，I，M，F，Y，W
187 I R，K，H，T，Q，N，L，M，F，Y，W
283 M R，K，H，T，Q，N，I，L，F，Y，W
323 T R，K，H，Q，N，I，L，M，F，Y，W
327 I R，K，H，T，Q，N，L，M，F，Y，W
331 A R，K，H，T，Q，N，I，L，M，F，Y，W
394 Y R，K，H，T，Q，N，I，L，M，F，W
395 T R，K，H，Q，N，I，L，M，F，Y，W
437 F R，K，H，T，Q，N，I，L，M，Y，W
439 L R，K，H，T，Q，N，I，M，F，Y，W
[0212] 进而，以上述FDC载体作为模板，使用上述引物，按照Gibson Assembly法的实验方法，对于导入了各变异的FDC，利用使聚组氨酸标签融合于其C末端的形态，调制出在大肠杆菌中能够表达的质粒载体(FDC变体载体)。
[0213] 此外，以FDC变体载体作为模板，将编码FDC变异体的基因通过PCR扩增。接着，将所得的扩增产物与FDC载体通过Gibson Assembly法连接，从而也调制出在大肠杆菌中可以共表达野生型FDC和变异型FDC的质粒载体(FDCDuet载体)。
[0214] <酶反应溶液的调制和酶活性的测定>
[0215] 将如上述那样调制的载体(5μg的FDC载体或FDC变体载体、与5μg的UbiX载体)通过热休克法导入到大肠杆菌C41(DE3)株(Lucigen Corporation社制，100μL)，调制出共表达野生型的FDC或各FDC变体与UbiX的转化体。此外与上述同样地，通过将FDCDuet载体和UbiX载体(各5μg)导入到100μL的大肠杆菌C41(DE3)株，从而也调制出共表达野生型的FDC、各FDC变体和UbiX的转化体。
[0216] 进而，将这些转化体分别在添加了氨苄西林和卡那霉素的LB培养基中培养6小时。另外，通过这样的6小时的培养(前培养)，这些转化体的增殖达到极限。因此，后述的酶反应开始时刻的菌体量在这些转化体间变得均匀。
[0217] 此外，在12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母提取物、10g/L甘油、9.4g/L磷酸氢二钾、2.2g/L磷酸二氢钾、20g/L乳糖、100mg/L氨苄西林和50mg/L卡那霉素中，以终浓度为0.5mM的方式添加作为底物的顺,顺-粘康酸(シグマアルドリッチ社制)，调制出酶反应用培养基。
[0218] 进而，在顶空型气相色谱质谱分析计(HS/GSMS)用的10mL瓶中，添加上述培养了6小时的大肠杆菌培养液100μL和上述酶反应用培养基2.5mL，在刚添加后立即关闭瓶的盖，在37℃、振荡速度180rpm下进一步培养。通过GC-MS(制品名：GCMS-QP Ultra，岛津制作所社制)测定了表示在开始该培养后18小时后在瓶的顶部空间(headspace)中生成的1,3-丁二烯量的峰面积。
[0219] 将基于所得的峰面积算出的、各FDC变体相对于野生型的FDC的1,3-丁二烯生成量的相对值示于表8、以及图1和2中。此外，关于1,3-丁二烯生成量(酶反应用培养基中的1,3-丁二烯的浓度)，将添加了1,3-丁二烯(东京化成工业株式会社制)的酶反应用培养基2.5mL添加到HS/GSMS用的10mL瓶中，在刚添加后立即关闭瓶的盖而获得标准品，从基于所得的标准品获得的峰面积算出。将所得的结果示于表9中。
[0220] [表8]
[0221]
[0222] [表9]
[0223]
[0224] 如表8和图1所示那样，明确了：通过在导入了变异的10个部位，在395位，将该部位的苏氨酸置换成其它氨基酸(谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸)，从而大体上与1，3-丁二烯的生成有关的催化活性提高(与野生型的FDC相比，催化活性提高至少约3倍)。令人惊讶的是，在将395位置换成天冬酰胺的情况下，与野生型的FDC相比，与1，3-丁二烯的生成有关的催化活性提高了近50倍；在置换成组氨酸的情况下，与野生型的FDC相比，与1，3-丁二烯的生成有关的催化活性提高了近70倍；特别令人惊讶的是，在置换成谷氨酰胺的情况下，与野生型的FDC相比，与1，3-丁二烯的生成有关的催化活性提高了100倍以上。
[0225] 此外，如表9和图2所示那样，明确了：通过与野生型的FDC并用，从而如上述那样提高了的与1，3-丁二烯的生成有关的催化活性进一步提高。
[0226] 此外，如表8和图1所示那样，也明确了：除了上述395位的氨基酸置换以外，在仅将394位的酪氨酸置换成其它氨基酸(苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苏氨酸、精氨酸或天冬酰胺)的情况下，和仅将437位的苯丙氨酸置换成酪氨酸的情况下，阿魏酸脱羧酶的与1，3-丁二烯的生成有关的催化活性与野生型相比都提高。
[0227] (实施例2)
[0228] <阿魏酸脱羧酶双重氨基酸变体的制作和评价>
[0229] 与实施例1所记载的方法同样地操作，将阿魏酸脱羧酶的395位置换成谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺的变体(分别也称为“T395Q”、“T395H”、“T395N”)中，进一步向其它部位导入伴随氨基酸置换的变异，调制出阿魏酸脱羧酶双重氨基酸变体。进而，关于这些变体，评价了与以顺，顺-粘康酸作为底物的1，3-丁二烯的生成有关的催化活性。关于“T395Q”、“T395H”和“T395N”的进一步氨基酸变体，将所得的结果分别示于表10～12中。
[0230] 【表10】
[0231]
[0232] 【表11】
[0233]
[0234] 【表12】
[0235]
[0236] 如表10～12所示那样，明确了：在“T395Q”、“T395H”和“T395N”的任一者中，通过将394位置换成其它氨基酸，从而与1,3-丁二烯的生成有关的催化活性都有进一步提高的倾向。特别令人惊讶的是，在“T395H”中，在将394位置换成丝氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的情况下，与野生型的FDC相比，与1,3-丁二烯的生成有关的催化活性提高了500倍以上，此外在将该部位置换成组氨酸的情况下，与野生型的FDC相比，与1,3-丁二烯的生成有关的催化活性提高了1000倍以上。
[0237] 产业可利用性
[0238] 如以上说明地那样，根据本发明，能够提供能够以高生产性制造1,3-丁二烯等不饱和烃化合物的酶、以及使用了该酶的不饱和烃化合物的制造方法。此外，根据本发明，不依靠化学合成，通过生物合成可以制造不饱和烃化合物，因此对环境的负荷少。因此，本发明在丁二烯这样的合成橡胶等各种合成聚合物的原料的制造中是极其有用的。
[0240] 序列号：1
[0241] ＜223＞阿魏酸脱羧酶
[0242] 序列号：3
[0243] ＜223＞用于在大肠杆菌中的表达的密码子被最佳化了的序列
[0244] ＜223＞阿魏酸脱羧酶
[0245] 序列号：4
[0246] ＜223＞阿魏酸脱羧酶
[0247] 序列号：5
[0248] ＜223＞黄素异戊烯基转移酶。
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