一种溴代过氧化物酶及其编码基因
阅读：180发布：2023-03-11
专利汇可以提供一种溴代过氧化物酶及其编码基因专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程技术领域，具体是一种溴代过 氧 化物酶及其编码基因。所述基因来源于海带(Sacchrina japonica)，命名为SjavHPO1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列，其编码 蛋白质 的 氨 基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列，该蛋白质为溴代过氧化物酶。本发明通过基因克隆技术克隆出该基因序列，构建原核表达载体，通过对重组蛋白进行酶活性检测，证实了其具有催化溴离子和碘离子卤化的功能，且酶活 力 显著高于目前所公开的其他溴代过氧化物酶。，下面是一种溴代过氧化物酶及其编码基因专利的具体信息内容。
1.一种编码溴代过氧化物酶的基因，其特征在于：所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种由权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质为溴代过氧化物酶。
4.含有权利要求1所述的基因的载体。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于：所述的载体为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。
6.如权利要求4所述的载体，其特征在于：所述的载体为pGEX表达载体或pET表达载体。
7.如权利要求4所述的载体，其特征在于：所述的载体为酵母表达载体、昆虫细胞表达载体或哺乳动物细胞表达载体。
8.含有权利要求1所述基因的基因工程细胞。
9.如权利要求8所述的基因工程细胞，其特征在于：所述的基因工程细胞为大肠杆菌细胞。
10.如权利要求8所述的基因工程细胞，其特征在于：所述的基因工程细胞为枯草芽孢杆菌细胞、乳酸菌细胞或毕赤酵母细胞。
一种溴代过氧化物酶及其编码基因
技术领域
背景技术
[0002] 大多数生物都具有产生卤化有机物的能力，已知的含卤化合物达3800种。卤代有机物主要来源于海洋藻类的生物合成过程，生物的卤化过程主要依赖于卤代酶的作用，卤代酶主要包括卤代过氧化物酶和黄素依赖型卤代酶，其中研究最多的是卤代过氧化物酶，根据其氧化卤素离子能力的不同，可将其分为氯代过氧化物酶(chloroperoxidase)、溴代过氧化物酶(bromoperoxidase)和碘代过氧化物酶(iodoperoxidase)。氯代过氧化物酶可以催化碘、溴和氯元素的卤化；溴代过氧化物酶可以催化碘、溴元素的卤化；而碘代过氧化物酶只能催化碘元素的卤化反应。
[0003] 卤代过氧化物酶根据其催化辅助亚基的不同也可以分成三类，即钒离子依赖型过氧化物酶，亚铁血红素依赖型以及无辅助因子依赖型。其中以钒离子依赖型过氧化物酶研究最为广泛深入，钒依赖型碘过氧化物酶(vanadium-dependent iodoperoxidase)具有最强的催化活性。
[0004] 海洋中发现了大量具有生物活性的含卤有机物，包括卤代烃类、卤代酚类、卤代酪氨酸、卤代脂肪酸和卤代萜类，这些有机物中大部分都具有较高的药用及应用价值，用生物合成方法合成卤化物具有一定的可行性和经济价值。在海洋中，能产生卤代烃的生产者范围极其广泛，种类繁多，形式多样，例如多种固着藻类和部分活动能力较弱的无脊椎动物会产生大量含有卤素的扩散性分子或具有粘性的附着分子，用来促进个体之间的信息交流。
[0005] 海洋藻类具有较强的吸收卤素的能力，其体内的卤化物更加丰富。钒依赖型卤素氧化酶在红藻、绿藻和褐藻中都被发现，但钒依赖型碘过氧化物酶仅在褐藻中被发现，特别是一些较高等的类群，例如海带目。海带是我国常见的大型经济褐藻，其碘元素含量较高，其碘含量极高，1g干重的海带中能能够分离得到10mg的碘，占到自身干重的1％，这可能与其藻体中含有的特殊的卤素氧化酶有关。
[0006] 本发明完成对海带(Sacchrina japonica)中的SjavHPO1基因进行了克隆、表达和功能鉴定，构建了SjavHPO1的表达载体，并对SjavHPO1进行了诱导表达和纯化，纯化后的目的蛋白具有溴代过氧化物酶的活性，可催化溴离子和碘离子发生卤化反应，且该酶的比活力远高于现有技术。因此本发明的SjavHPO1为合成卤代有机物的反应提供了优异的基因资源和酶资源。
发明内容
[0007] 本发明提供了一种溴代过氧化物酶的SjavHPO1基因，该基因来自于海带(Sacchrina japonica)，所述的SjavHPO1基因的编码产物为溴代过氧化物酶，该酶具有催化溴离子和碘离子发生卤化反应的活性。
[0008] 一方面，本发明提供了一种溴代过氧化物酶的编码基因，所述的溴代过氧化物酶的编码基因的编码产物为溴代过氧化物酶，所述的溴代过氧化物酶的编码基因为SjavHPO1基因；所述的SjavHPO1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
[0009] 另一个方面，本发明提供了一种溴代过氧化物酶，所述的溴代过氧化物酶由所述SjavHPO1基因所编码；所述的溴代过氧化物酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
[0010] 再一个方面，本发明还提供了含有所述SjavHPO1基因的载体或基因工程细胞。
[0011] 所述的载体可以为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。
[0013] 所述的原核细胞表达载体可以为pGEX表达载体或pET表达载体。
[0014] 所述的pGEX表达载体包括但不限于：pGEX-2T载体、pGEX-2TK载体、pGEX-4T载体、pGEX-3X载体、pGEX-5X载体、pGEX-6P载体、pGEX-KG载体等。
[0015] 所述的pET表达载体包括但不限于：pET-22载体、pET-28载体、pET-30载体、pET-32载体、pET-34载体、pET-40载体或pET-42载体等。
[0016] 所述的基因工程细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸菌细胞或毕赤酵母细胞等。
[0017] 本发明的有益效果为：本发明提供的基因及其编码的蛋白质具有溴代过氧化物酶的功能，可催化溴离子和碘离子发生卤化反应，且酶活力显著高于目前所公开的其他溴代过氧化物酶。本发明提供的溴代过氧化物酶的基因及其编码的蛋白质为溴代过氧化物酶的研究和含卤化合物的制备提供了优异的基因资源和酶资源。附图说明
[0018] 图1为实施例4中的SjavHPO1基因转化大肠杆菌BL21表达产物纯化后的Western-Blot检测结果。
[0019] 图2为实施例5中的MCD浓度与紫外吸收峰面积标准曲线。
具体实施方式
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0021] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0023] 实施例1海带中SjavHPO1基因的获取
[0024] 根据海带(Sacchrina japonica)全基因组序列信息，得到1个溴代过氧化物酶基因，命名为SjavHPO1基因，其中所述的SjavHPO1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。对SjavHPO1基因进行全序列合成(委托上海旭冠生物科技发展有限公司进行合成)，同时在两端引入EcoRI和NotI酶切位点及相应保护碱基，得到SjavHPO1基因。SjavHPO1的CDS序列全长为2037bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码678个氨基酸，以ATG为起始密码子，TAG为终止密码子。
[0025] 实施例2SjavHPO1基因的克隆表达
[0026] 将实施例1得到的SjavHPO1基因片段连接至pET32a质粒载体(宝生物工程有限公司)的EcoRI和NotI位点之间，获得pET32a-SjavHPO1重组载体；将获得的pET32a-SjavHPO1重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养平板上，37℃培养过夜；将阳性克隆接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.6-0.7时，加入终浓度为0.1mM IPTG，在25℃、160rpm的诱导条件下，经6-8h诱导目的蛋白的表达。
[0027] 实施例3SjavHPO1蛋白的分离纯化
[0028] 收集实施例2诱导表达得到的菌体，收集500ml菌液离心后弃去上清，将沉淀完全溶于加入了200μL PMSF的20ml破菌缓冲液中；在冰上对菌体进行超声破碎，12000rpm，5min离心取上清；以下步骤均在4℃环境中操作：第一次洗柱使用10倍柱体积(约10ml)破菌缓冲液平衡His-tag柱，将过滤后液体加入His-tag柱，自然流速流下，过柱2-3次，将约20ml的配置好的1mM咪唑的破菌缓冲液加入柱中，自然流速流下洗去杂蛋白，将约20ml的配置好的20mM咪唑的破菌缓冲液加入柱中，自然流速流下洗去杂蛋白；将约40ml的配置好的200mM咪唑的破菌缓冲液加入柱中，洗脱目的蛋白，用离心管收集洗脱下来的目的蛋白即得到纯化后的蛋白，该重组蛋白为SjavHPO1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，命名为SjavHPO1蛋白，该蛋白质为溴代过氧化物酶。
[0029] 实施例4重组蛋白的鉴定
[0030] 对实施例3获得的SjavHPO1蛋白进行Western-Blot杂交，用以验证所得条带是否为目的条带。Western-Blot检测结果如图2所示，条带清晰，SjavHPO1蛋白的分子量大小符合预期值90kDa。
[0031] 实施例5Sja vHPO1蛋白的酶活测定
[0032] SjavHPO1蛋白活性的检测采用单氯双甲酮(MCD)标准方法。单氯双甲酮(MCD)其全称为2-氯-5,5-二甲基-1，3环己二酮。MCD在278nm处有紫外吸收，它能够与vHPO蛋白反应，使卤素取代掉第二位碳原子上的另一个H，形成另外一种化合物，以卤素氯为例，可以形成双氯双甲酮(DCD)。产物DCD在278nm处，没有紫外吸收峰，因此可以通过分光光度计测量底物MCD紫外吸收的减少量而确定反应消耗量，从而测量酶的活力。这一方法可以不必确定底物而对酶活性进行研究，大大提高了卤素过氧化物酶活力的检测的便利性，被称为检测卤代反应的标准方法。
[0033] 试验方法：
[0034] (一)MCD浓度与紫外吸收峰面积标准曲线的建立
[0035] (1)称取一定量的MCD标准品，用50％的甲醇作为溶剂，配置成0.15mM、0.1mM、0.05mM、0.025mM不用浓度的标准溶液。
[0036] (2)用液相色谱仪进样针吸取10μL标准溶液，推注到液相色谱中，在278nm处测量其紫外吸光度值。液相色谱移动相成分为A相：甲醇；B相：10％甲醇溶液[0037] (3)液相色谱洗脱程序如下表所示
[0038]
[0039] (二)蛋白酶活力的测算
[0040] (1)在等体积Buffer中加入不同量的实施例3制备得到的SjavHPO1蛋白溶液(钒离子预处理)，反应1min后，吸取10μL反应液加入到液相色谱仪中，经检测得到MCD浓度，找到最合适测算的每次反应的酶的用量。
[0041] (2)在1.5ml离心管中加入148μL反应Buffer和0.25μL SjavHPO1蛋白，放置在金属浴中25℃温浴2min，加入2μL 30％的H2O2溶液，快速混匀，开始反应。
[0042] (3)反应1min后，将离心管迅速取出，放入液氮中冷冻，停止反应。
[0043] (4)使用冻干机将反应液冻干，用等体积的50％甲醇溶解，离心混匀，吸取10μL反应液加入到液相色谱仪中，在278nm处测量MCD的紫外吸光度值，经检测得到MCD的消耗量，计算酶的活力，针对于不同离子的反应，做3组对照试验以减小误差。
[0044] 测定结果：
[0045] MCD浓度与紫外吸收峰面积标准曲线如图2所示，对酶的活性进行测定，SjavHPO1蛋白对于I-的酶活为40.8U/mg,对于Br-的酶活为5861.1U/mg。
[0046] 与从其他文献所获得的vHPO蛋白的酶活性相比，本发明所获得的SjavHPO1蛋白对Br离子的酶活力高达5861.1U/mg，是目前已知的活性最高的vHPO蛋白。本发明所获得的SjavHPO1蛋白与从其他文献所获得的vHPO蛋白的酶活性对比如下：
[0047]
[0048]
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