已知mRNA翻译引发机制是帽依赖性的，或是非帽依赖性的。原核mRNA 的5′末端结构是pppN，真核mRNA 5′端的帽结构则是(7-MeG)-5′-ppp-5′-(G/A)- 3′-p-)(G或A，具有可能甲基化的核糖)。该帽结构在mRNA从细胞核向细胞质的 转移中起着重要作用，它保护mRNA不被RNA酶消化。在真核细胞的细胞质中， 帽结合蛋白复合物(又称真核启动因子4F(elF-4F))与帽结构的结合促进40S的核 糖体亚基进入mRNA的5′端，mRNA5′端内的核糖体然后沿着mRNA向3′端移动， 扫过约100个碱基的5′非翻译区，然后，在大多数情况下，以核糖体遇到的第一 个AUG序列作为起始密码子开始肽的合成。
然而，现已发现真核mRNA使用一种不同于上述帽依赖性翻译机制的机制。 虽然真核mRNA被认为在5′端具有帽结构，但据报道，脊髓灰质炎病毒mRNA 的5′端没有加帽；相反，其结构只是pU(Nomoto，A.等.，美国科学院院报，74，5345， 1977)。一张详细的基因图谱已经阐明了脊髓灰质炎病毒RNA完整的一级结构 (Kitamura，N.等.，自然，291，547，1981)。所以，起始密码子AUG位于mRNA的 第743碱基处，前面还有一些AUG三联子。已发现，这样的mRNA结构普遍存 在于与脊髓灰质炎同一家族(小RNA病毒家族)的其他成员中。而且，用脊髓灰质 炎病毒RNA(Pelletier，J.等，自然334，320，1988)和脑心肌炎病毒 (EMCV)RNA(Jang.S.K.等，病毒学杂志62，2636，1988)进行的试验证实小RNA 病毒具有非帽依赖性翻译启动机制(内部启动模式)，表明核糖体识别mRNA 5′非 翻译区(5′-UTR)碱基序列并从5′非翻译区内的位点进入。核糖体进入所需的区域 称为内部核糖体进入位点(IRES)。
小RNA病毒具有一段长约600-1200碱基的5′非翻译区，其中一段约450碱 基的区域具有IRES活性。小RNA病毒IRES具有共同结构，即一段富嘧啶区 ((C/U)X)后跟一段含AUG的7碱基短序列。多嘧啶段和短序列之间有一段长10-20 碱基的随机碱基序列(Ny)(Jang，S.K.等，高等真核生物基因的翻译调节，Thack， R.E.编辑，292-309，Karger，1990)。多嘧啶段即含有至少4-5或更多个连续嘧啶 碱基的区域。(C/U)x-Ny-AUG单元可能是IRES的必须结构之一，事实上，缺失 含AUG的碱基序列将降低IRES活性，进一步缺失整个(C/U)x区确实则会使该活 性完全丧失(Kuge，S.等，病毒学杂志，61，1478，1987；Iizuka，N.等，病毒学杂志， 65，4867，1991)。通常，将(C/U)x序列区称为“BoxA”，长约7碱基的含AUG 区称为“BoxB”。因为这些盒与18S核糖体RNA(rRNA)3′端的一段序列互补，IRES 被认为具有类似于原核mRNA的SD序列的功能(Pilipenko，E.V.等.，细胞，68，119， 1992)。
小RNA病毒IRES分为两类：I类IRES存在于肠道病毒和鼻病毒中，II类 IRES存在于心脏病毒和口蹄疫病毒(aphthovirus)中。肝病毒IRES被认为是II类 IRES的类似物。
就I类IRES而言，核糖体扫描(C/U)x-Ny-AUG单元的下游区，在第一个作 为启动密码子的AUG处启动肽的合成。实际上，在AUG启动密码子上游某位置 插入一段AUG序列实际上会抑制病毒的复制(Kuge，S.等，病毒学志，63，1069， 1989；Kuge，S.等，分子生物学杂志，207，175，1989)。另一方面，就II类IRES而 言，(C/U)x-Ny-AUG单元内部的AUG被用作起始密码子。
1989年，丙肝病毒(后文称HCV病毒)被认为是引起非甲、非乙病毒性输血 后肝炎的又一种致病性单链病毒(Choo，Q.等，科学244，359，1989)。该病毒的慢 性感染会造成肝硬化和肝癌的高发，这在临床上十分麻烦(Saito，I.等，美国科学院 院报，87，6547，1990)。目前已鉴定了至少40种HCV基因组亚类的完整碱基序列。 长约9600碱基的基因组RNA含有一段长约341碱基的5′非翻译区，编码一段 3008-3037氨基酸残基多肽的编码区，和长约200-300碱基的3′非翻译区，其中3′ 非翻译区以聚U/C段后的一段长98碱基称为3′X的结构为结束。该病毒的多肽 与黄热病病毒和鼠疫病毒的相似(Kato，N.等，美国科学院院报，87，9524，1990； Takamizawa，A.等，病毒学杂志，65，1105，1991)，从N末端起带有以下顺序的病 毒蛋白：C/核心，E1，E2，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B和NS5A。E2区对应 于黄热病病毒的非结构蛋白NS1和鼠疫病毒的包膜蛋白E2。曾认为HCV是 E2/NS1，但最近认为是E2，因为发现它具有与鼠疫病毒类似的特性，因而估计 是包膜蛋白。据报道，根据序列特征，该病毒有6-11种基因型。
根据病毒分类，HCV和以后鉴定的GB病毒/丙肝病毒同属于黄热病病毒家 族。已发现，HCV碱基序列的5′非翻译区内有一个内部核糖体进入位点(IRES)， 该位点存在于例如小RNA病毒中，与真核mRNA通常的帽依赖性蛋白质翻译不 同(Tsukiyama-Kohara，K.等.，病毒学杂志，66，1476，1992)。该IRES表现出活性的 碱基序列短于小RNA病毒，因此，估计HCVIRES具有与小RNA病毒完全不同 的二级结构(Tsukiyama-Kohara，K.等，病毒学杂志，66，1476，1992；Brown，E.A. 等，核酸研究，20，5041，1992)。另一方面，观察到HCV IRES区内有对应于BoxA 和BoxB，与18S rRNA的3′末端互补的碱基序列(Nomoto，A.等.，病毒性肝炎和肝 病，Nishioka，K.，Suzuki，H.，Mishiri，S.，Oda，T.编辑，118，Springer-Verlag，1994)。 参见显示HCV IRES推定结构的图1。图中，粗线表示对应于BoxA的多嘧啶段 和对应于BOXB的含有AUG的7碱基序列，双线表示位于BoxA上游的多嘧啶 段，此外还圈出了反式因子(见后文)结合位点。
最近经鉴定具有IRES活性的鼠疫病毒(Fraviviridae家族)IRES没有对应于 BoxA和BoxB的碱基序列，但它们的二级结构与HCV IRES的相似(Brown，E.A. 等.，核酸研究，20，5041，1992)。近年来不断发现的植物病毒IRES表现出活性的 碱基序列更短，且没有对应于BoxA与BoxB的保守部分。以上结果说明这两个 盒并非IRES活性所必需。因此，一种简单的标准化机制，例如帽依赖性翻译启 动，尚不足以解释IRES功能的多种表现模式。
HCV内翻译的启动依赖于5′位点内的IRES，这与大多数真核mRNA的帽依 赖性蛋白质合成不同。IRES依赖性地合成一段单一长肽，经宿主的信号肽酶和 两种病毒蛋白酶加工成为蛋白质。这些蛋白质进一步分别被信号肽酶加工，被一 种病毒蛋白质糖基化和磷酸化，从而获得病毒复制和成功感染所必需的各种特 性。
长约341碱基的长HCV 5′-UTR与鼠疫病毒或小RNA病毒类似，与黄热病 病毒的不同，因为它含有多个(2-5个)AUG序列，它们不是起始密码子而且可能 形成一种复杂的二级结构(Han，J.H.等，美国科学院院报，88，1711，1991；Brown， E.A.等，核酸研究，20，5041，1992)。
曾有许多有关HCV IRES的报道，但各不相同。这样的不一致可能是因为各 实验所用的RNA结构和翻译系统不同。采用体外转染兔网织红细胞裂解液，或 以共表达T7RNA聚合酶的牛痘病毒感染培养细胞进行的DNA转染，可认为从 5′-UTR的约40个碱基至编码区的约30个碱基的一段序列是对应于IRES的区域 (Reynolds，J.E.等，欧洲生物学杂志，14，6010，1995)。此外，RNA转染培养细胞 证明，HCV IRES的5′边界位于第28和第45位碱基之间(Kamoshita，N.等，病毒 学，233，10，1997)。而且，对无细胞系统的分析得到这样的结果：该区的3′边界位 于第370至516位碱基之间，而不是在编码区的数十碱基内。这一结果与以下报 道一致，即核心蛋白(由紧接在5′非翻译区下游的编码区内序列编码的蛋白质)N′ 末端一侧的2/3部分促进IRES活性(Lu，H.-H.等，美国科学院院报，93，1412， 1996)，但不能完全否定该区域对于RNA的结构十分重要的可能性。
许多分子参与帽依赖性翻译启动机制而表现出IRES功能，除此之外，可能 还需要来自宿主细胞的其他分子(反式因子)(Scheper，G.C.等，生物化学杂志， 267，7269，1992)。因为IRES功能的表现是物种、组织和细胞特异性的，所以不 难作出这样的推断。
根据用加帽mRNA的无细胞蛋白质合成系统麦芽裂解物、兔网织红细胞裂 解物(RRL)和HeLa细胞裂解物进行的病毒IRES活性比较实验报道，小RNA病 毒的IRES在麦芽裂解物中没有活性。另一方面，据报道，在RRL中，EMCV IRES 表现出高活性，脊髓灰质炎病毒IRES表现出弱活性，脊髓灰质炎病毒IRES在 RRL内的活性可因添加HeLa细胞裂解物而恢复(Brown，B.A.等，病毒学，97，396， 1979；Dorner，A.J.等，病毒学杂志，50，507，1984)。而且，已提出，这些病毒IRES 在HeLa细胞裂解物中都表现出高活性，只有甲肝病毒的IRES即使在HeLa细胞 裂解物中活性也很低(Glass，M.J.等，病毒学，193，1047，1993)。以上结果清楚地表 明，加帽mRNA所用的起始因子之外，IRES功能还需要许多来自宿主细胞的分 子。此外，同样清楚的是，功能表现所需分子的质量和数量取决于IRES的类型。
此外，UV交联法分析(用UV光使得核酸与与之结合的蛋白质交联，以便测 定结合蛋白)显示，许多宿主细胞的分子能与任何一种IRES结合。而且，已知， 除RNA的构相之外，IRES特异性的反式因子可能在翻译的启动中起着重要作用。 更具体地说，已知两类IRES结合蛋白是促进小RNA病毒IRES活性的宿主分子： La(52kDa)和PTB(多嘧啶段结合蛋白，57kDa)(Meerovitch，K.等，病毒学杂志，67， 3798，1993；Hellen，C.V.T.等，美国科学院院报，90，7642，1993；Borman，A.等，遗 传与病毒学杂志74，1775，1993)。已知La是一种自身免疫疾病中的抗原性蛋白 质，而且是RNA聚合酶III的转录终止因子。此外，PTB是一种RNA剪接辅因 子。这些蛋白质位于细胞核内，实际上参与核内反应。然而，已有报道称，脊髓 灰质炎病毒感染引起La从细胞核内转运到细胞质内(Meerovitch，K.等，病毒学杂 志，67，3798，1993)，据报道，这一转运与作为细胞质反应的翻译启动有关。
对与各种IRES对PTB和La的需要进行了研究，目前已提出，小RNA病毒 IRES对PTB的需要程度很高，而HCV IRES的需要则显著较低(Kaminski，A.等， RNA，1，924，1995)，而且，HCV需要的La也比脊髓灰质炎病毒少。相反，另一 研究提出，PTB在3个位点与HCR IRES结合，而且，这样的结合是IRES功能 所必需的(Ali，N.et al.，J.Viol.，69，6367，1995)，and that the La recognizes the RNA structure containing the initiation AUG，thus activation is resulted(Ali.N.等，美国科 学院院报，94，2249，1997)。这类实验用尽可能去除了PTB的无细胞蛋白质合成系 统进行，其中用特异性抗体或PTB结合性RNA片段来去除PTB。所以，如果PTB 与其他分子形成复合物((Toyoda，H.等，病毒学文献，138，1，1994)，则整个复合物 被完全去除。此外，也可以考虑去除核糖体，因为已知许多PTB与之结合。因此， 进一步的研究应该是关于IRES对反式因子的需要，但是，估计IRES对反式因子 的需要可能因各种IRES而不同，引起功能表现的机制因此可能因IRES不同而不 同。HCV中可能存在新的IRES结合因子，事实上，已在HeLa细胞内发现了一 种蛋白质p25，它识别5′非翻译区的二级结构，其结合亲和力与翻译效率有关 (Fukushi，S.等，病毒学杂志，71，1662，1997)。
已用基因工程生产了多种蛋白质和肽。例如，已在包括大肠杆菌在内的微生 物细胞和例如CHO细胞的动物细胞内生产得到了胰岛素、干扰素、红细胞生成 素、甘露聚糖结合蛋白、凝集素、神经蛋白(neurosin)等。
在对有用的动物基因产物进行基因工程操作时，使用大肠杆菌、枯草杆菌或 酿酒酵母等微生物宿主细胞时，常会因基因产物不恰当的三级结构或不正确的翻 译后修饰导致基因表达失败或丧失活性等问题。为此，常用动物细胞来解决这些 问题。虽然动物细胞具有上述相比微生物细胞的优点，但动物细胞的培养步骤复 杂得多，并可能会降低基因的表达量。
在许多分子生物学研究中，构建用于在此类细胞内表达基因的载体是一项重 要的基础工作。根据不同目的，要求这样的载体允许有效的大量表达和诱导型瞬 时表达。用于以上表达系统且符合上述要求的表达载体的常规构建思路是以启动 子和/或增强子的固有功能为基础。即，为了提高靶基因产物的生成效率，广泛采 用的是这样的过程：从天然基因中选择强启动子或增强子，将它们与编码靶蛋白 质或靶肽的DNA序列连接，从而提高mRNA转录的效率。用于有效大量表达的 已知强启动子包括SV40(猿病毒40)、SE-α、巨细胞病毒启动子、肌动蛋白启动 子、病毒LTR(长末端重复序列，包括HTLV-1LTR、HIV-LTR和Rous肉瘤病毒 LTR)和单纯性疱疹病毒酪氨酸激酶启动子。含有这些启动子的表达载体主要用于 哺乳动物细胞。或者，可在载体内加入增强子序列以提高基因的转录效率，继而 提高靶基因产物的生产效率。
就瞬时基因表达而言，可使用能诱导表达的物质。例如，当需要在使用小鼠 哺乳动物肿瘤病毒(MMTV)启动子的表达系统内进行表达时，加入能诱导表达的 地塞米松。
有关编码两种不同蛋白质的cDNA(第一和第二顺反子)的表达，曾报道称， 在第一和第二顺反子之间插入一段相当于内部翻译起始信号的碱基序列，就可以 用一个启动子表达这两种不同蛋白质，这已经付诸实施。然而，用此类常规技术 获得的表达载体尚不足以获得令人满意的生产效率。
而且，近年来迅猛发展的基因疗法使得治愈常规技术难以治愈的疾病成为可 能，因而可预计更为广泛的用途。然而，要构建在生物体特定部位高效表达靶基 因的载体仍有问题需要解决。具体地说，即使某启动子是器官或组织特异性的， 它也可能因活性低而导致基因的低效表达，所以，用含有此类启动子的载体进行 基因转导并不总能获得令人满意的治疗效果。
由此可见，本技术领域需要一种具有更高表达效率的表达载体。所以，本发 明目的之一是提供一种不拘泥于任何具体的载体构建理论的新表达载体，为的是 提高靶基因产物的生产效率。
发明概述
为了达到上述目的，本发明发明人经大量研究发现，在基因表达载体内加入 一段病毒基因5′非翻译区内的核酸序列或其片段或变体可增强有用靶基因的表 达，因此得到本发明。
本发明中，“用于增强有用基因表达的序列”指所含核酸序列为任意病毒基 于的5′非翻译区或5′非翻译区和毗邻5′非翻译区的部分编码序列的序列，或其片 段或变体。
此外，“增强有用基因表达”在此用于描述有用基因表达被增强的结果，不 论增强表达的活性试剂、翻译过程、表达环境和表达方法等条件。
此外，可以包含在本发明用于增强有用基因表达的核酸序列中的“毗邻5′ 非翻译区的部分编码区”指比5′非翻译区小5倍的碱基片段，较好的是碱基数与 5′非翻译区相同或比5′非翻译区少或多100个碱基的片段。
较好的是，用于增强有用基因表达的核酸序列内的5′非翻译区含有至少一段 多嘧啶段，更好的是，还含有选自BoxA、BoxB、反式因子结合位点及它们组合 的一段序列，或一段AUG或ATG序列。较好的是，包含在用于增强有用基因表 达的核酸序列内的这些区域和片段完整或没有突变。这样的AUG或ATG序列以 及包含在BoxB内的AUG或ATG序列可以作为起始密码子加在用于增强有用基 因表达的核酸序列的最下游或编码区的最上游。
而且，用于增强基因表达的核酸序列内的5′非翻译区最好含完整的病毒 mRNA IRES或其一部分。IRES区可以具有或没有IRES活性，但该IRES原所在 区域最好具有IRES活性。
当用于增强基因表达的核酸序列内的5′非翻译区含有对应于多嘧啶段、 BoxA、BoxB和/或反式因子结合位点的序列时，在野生型病毒序列或其近似序列 (非高度保守序列)内的至少一个位置具有一个或多个核苷酸取代、缺失、插入和/ 或增加突变的序列也是较好的本发明用于增强基因表达的核酸序列。当用于增强 基因表达的核酸序列含有对应于5′非翻译区可变区的序列时，该对应序列宜含有 一段突变序列，即，野生型病毒的序列具有一个或多个核苷酸的取代、缺失、插 入和/或增加。较好的是，所述突变能直接或间接增强IRES活性。
较好的是，含有上述5′非翻译区的用于增强有用基因表达的核酸序列或其片 段或变体是通过对病毒5′非翻译区内的非高度保守区进行取代、缺失、插入和/ 或增加等突变而得到的。具体地说，当用于增强基因表达的核酸序列含有IRES 时，适宜使用多嘧啶段，特别是保留了BoxA和/或BoxB的变异体。在序列内引 入突变可以采用(例如)用PCR进行的诱变技术。
对用于增强基因表达的核酸序列加入基因表达载体的位置应能通过将该序 列加入所构建的表达有用基因的表达载体内而直接或间接增强有用基因的表达， 但较好的是，该位置在表达调控启动子序列的下游和有用基因的上游。此外，用 于增强基因表达的核酸序列插入表达载体的位置应使得转录和翻译能够按正常 方向(即从5′向3′)进行。
加入表达载体内的用于增强基因表达的核酸序列以cDNA序列为宜。而且， 基因表达载体以在真核细胞内表达的载体为宜。
以上所述的病毒以RNA病毒为宜，例如小RNA病毒或HCV病毒。
如果是HCV mRNA的5′非翻译区，BoxA被发现位于SEQ ID NO：1的191-199 位，BoxA上游的多嘧啶段是SEQ ID NO：1的40-46位和120-130位，BoxB位 于SEQ ID NO：1的213-219位(见附图1，加圈的是反式因子结合位点)，可变区 则是SEQ ID NO：1的1-36位和175-270位，高度保守区是SEQ ID NO：1的121-174 和271-339位。
包含在用于增强基因表达的核酸序列内结合入基因表达载体的HCV的5′非 翻译区或5′端侧区(即5′非翻译区和与5′非翻译区相邻编码区的一部分)片段经证 明优选包含SEQ ID NO：1内1-180、181-314、1-341、181-713或1-713的核酸 序列。已发现，在这些片段中，增强有用基因表达活性最强的是包含SEQ ID NO： 1内181-341位的核酸序列(见实施例5和6)。
此外，已发现，特别适宜的是，加入基因表达载体的增强有用基因表达的核 酸序列还有包括SEQ ID NO：7中1-342位核苷酸的核酸序列，或第119位被腺 嘌呤取代的该序列。
当所用病毒是HCV时，包含在用于增强基因表达的核酸序列内的HCV 5′非 翻译区或5′端侧区内核酸序列的变异体可以是含有完整SEQ ID NO：1序列或其 一部分的核酸序列和第207位或附近插入一个或多个核苷酸的序列，更好的是， 在上述位置插入了一个胸腺嘧啶的核酸序列，还包括含有上述优选突变的其他核 酸序列。
在使用来自HCV的核酸序列时，与5′非翻译区相邻的编码区是核心蛋白， 而且，用于增强基因表达的核酸序列内可以包含核心蛋白编码区5′侧的约300个 碱基。所以，另外还含HCV核心蛋白编码区一部分的用于增强有用基因表达的 核酸序列也适用于本发明。此外，核酸序列的变异体最好是通过可变区(非高度保 守区)内的取代、插入和/或缺失突变而得到的。
本发明还涉及由核苷酸序列SEQ ID NO：7构成的分离的聚核苷酸，以及 IRES活性与该核酸序列相似并由该序列的片段或其变异体构成的聚核苷酸(即， 在第206和207位之间插入至少一个碱基的来自HCV的核酸序列SEQ ID NO：1 第1-341位，其变异体或其片段)。这些聚核苷酸的IRES活性显著高于已知来自 HCV的IRES序列。所以，可以用这样的聚核苷酸通过常规的宿主细胞表达来生 产多肽，以及将这样的聚核苷酸加入用于基因疗法的载体，从而更有效地启动翻 译。因为这些聚核苷酸本身的IRES活性高于已知序列，它们可用于体内治疗(例 如)IRES活性位点突变引起IRES活性降低所致疾病。
后文中，以“5′-UTR314”表示的序列指包含SEQ ID NO：1或其片段的序 列，以“5′-UTR342”表示的序列指根据本发明由HCV变异体获得的序列(SEQ ID NO：7)。
此外，较好的是，用于增强基因表达的核酸序列是通过其自身翻译促进活性 来增强有用基因表达的序列(例如5′-UTR314)，和通过增强IRES活性来增强有用 基因表达的序列(例如5′-UTR342)。
本发明还涉及含有上述用于增强有用基因表达的核酸序列的基因表达载体， 用该载体转化或转染的宿主细胞，用该载体表达和生产有用基因产物的方法，以 及用该载体增强有用基因表达的方法。
本发明还提供一种筛选能与IRES相互作用的物质的探针，它含有核苷酸序 列SEQ ID NO：7构成的聚核苷酸，或由该序列的片段或其变异体构成的IRES 活性与其相似的聚核苷酸(即，HCV 5′-UTR341核苷酸序列(SEQ ID NO：1的第 1-341位核苷酸)第206和207位之间插入了至少一个碱基的序列)。该探针最好被 标记，以利用其与IRES的相互作用来鉴定靶物质。“与IRES相互作用的物质” 在此指那些能够直接或间接改变IRES活性(例如与其他因子形成复合物)的物质 和与IRES结合的物质。这些物质的例子包括IRES结合蛋白，嘧啶区结合蛋白， 反式因子和翻译起始因子。因此，相互作用性物质可望成为抑制或增强IRES活 性的调节剂。所述探针可以固定在固相支持物上或用在液相中。
本发明还提供用于筛选IRES依赖性翻译起始因子的探针，它含有核苷酸序 列SEQ ID NO：7构成的分离的聚核苷酸或由该序列的片段或其变异体构成的 IRES活性与其相似的聚核苷酸(即，HCV 5′-UTR341核苷酸序列(SEQ ID NO：1 的第1-341位核苷酸)第206和207位之间插入了至少一个碱基的序列)。该探针 也最好被标记，从而可以通过与IRES依赖性翻译起始因子的结合和对翻译引发 的作用来鉴定靶物质。
至今已发现，在真核细胞内，采用的是通过c-myc(Nanbru C.等，生物化学杂 志272(51)，32061-32066，1988；Stoneley，M.等，致癌基因16(3)，423-428，1998)， Bip(免疫球蛋白重链结合蛋白)(Le S.Y.等，核酸研究25(2)，362-369，1997；Yang Q.等，核酸研究25(14)，2800-2807，1997)，FGF-2(Le S.Y.等，核酸研究25(2)， 362-369，1997)，PDGF2(Bernstein J.等，生物化学杂志271(14)，9356-9362，1997)， eIF-4G(Gan W.等，生物化学杂志273(9)，5006-5012，1998)和钾通道的一种IRES 依赖性mRNA翻译引发机制。
从以下实施例可以看出，新的5′-UTR342序列分离自病毒大量复制的丙肝患 者血清，可以通过鉴别该序列内与5′-UTR341的区别来确定丙型肝炎的严重程度。 具体地说，本发明涉及一种确定丙型肝炎严重程度的方法，该方法包括：用核苷 酸序列SEQ ID NO：7构成的分离的聚核苷酸或由该序列的片段或其变异体构成 的IRES活性与其相似的聚核苷酸(即，HCV 5′-UTR341核苷酸序列(SEQ ID NO： 1的第1-341位核苷酸)第206和207位之间插入了至少一个碱基的序列)作为靶， 检查被测者生物样品内有否该聚核苷酸序列，根据该序列的存在情况确定丙型肝 炎的严重程度。
最后，本发明提供了一种治疗生物体内帽依赖性mRNA翻译降低所致疾病 或IRES活性降低所致疾病的治疗组合物，其中含有用于增强有用基因表达的核 酸序列，从而可以通过将该核酸序列引入生物体来促进mRNA的翻译。通过引入 这些序列来弥补mRNA翻译机制低下可以治疗或预防这些疾病。
更具体地说，本发明发现，当用于增强有用基因表达的核酸序列插在载体内 启动子序列和编码荧光素酶的cDNA序列之间时，荧光素酶表现出的酶活性比用 没有所述核酸序列的常规载体所表达的高。活性的增强可能是因为酶蛋白量的增 加，所以，这证明，加入的序列获得了增强有用基因表达的效果。
此外，用其他启动子和来自其他不同来源的荧光素酶也可以观察到相同的结 果，所以，这一现象可能是相对普遍的，而不限于特定的启动子序列、用于增强 有用基因表达的核酸序列和特定有用基因序列的特定组合。而且，在用不同长度 的各种用于增强有用基因表达的核酸序列鉴定具有上述效果的区域后发现，HCV 基因5′侧第181-341位核苷酸的片段表现出最强的作用。此外还发现，由临床分 离株即变异株HCV1b获得的序列SEQ ID NO：7，或第119位被腺苷取代的该序 列特别适用于增强基因的表达。具体地说，当本发明用于增强有用基因表达的核 酸序列被用于IRES活性依赖性翻译时，以采用5′-UTR342为宜，另一方面，当 本发明用于增强有用基因表达的核酸序列被用于非IRES活性依赖性翻译(如帽依 赖性分离等)时，以采用5′-UTR341或5′-UTR342为宜。上述作用可用于在体外单 细胞培养系统中增强蛋白质或肽(例如细胞因子等)的生产，而且，结合对体内器 官或肿瘤具有特异性但因为活性低而难以实际应用的启动子，可用于体外基因疗 法。
本发明有用基因的例子包括可在宿主内表达的编码肽的核酸，编码诱捕者 (decoy)的核酸(该核酸含有编码细胞转录调节因子结合蛋白的基因或转录调节因 子结合位点序列或类似序列)和自杀基因。所述基因以基因组DNA，cDNA或部 分或全合成DNA为佳，cDNA更好。
所述肽可以包括寡肽，多肽和蛋白质，但本发明的肽包括在基因转录和翻译 后被糖、脂、磷酸或金属修饰的肽。这些肽的例子包括但不限于有用的肽，例如 胰岛素、多种干扰素、促红细胞生成素、甘露聚糖结合蛋白、共凝集素、neurosin 等。
上述编码诱捕者的核酸代表了编码细胞转录调节因子结合蛋白的核酸或含 有细胞转录调节因子结合位点序列的核酸，或它们的类似序列。将这些核酸作为 诱捕者引入细胞，可能会抑制转录调节因子与结合位点的结合，从而抑制转录调 节因子的作用，最终抑制基因簇的活化。
自杀基因包括(例如)细胞衰亡诱导基因(程序性细胞死亡诱导基因)和坏死诱 导基因，此类基因的表达将导致细胞死亡。
此外，有用基因可以表达为融合蛋白的形式。融合蛋白可以是由有用基因表达 的的蛋白质，其N末端肽链来自另一蛋白质，或在C末端连接了一段合适的肽链。
用于获得本发明增强有用基因表达的核酸序列的核酸可以来自其基因5′段具 有非翻译区的任何来源(以mRNA为佳)。特别好的是在其mRNA的5′非翻译区内 有完整或部分IRES区的核酸来源。
以下详细说明的是含有可用作本发明增强有用基因表达的核酸序列的病毒。
在病毒颗粒内含有RNA或DNA遗传物质的病毒一般可分为DNA病毒和 RNA病毒。
DNA病毒一般分为：
(1)在细胞核内繁殖的双链DNA病毒，例如乳多空病毒科、腺病毒科和疱疹病 毒科；
(2)在细胞质内繁殖的双链DNA病毒，例如痘病毒科；
(3)在细胞核内繁殖的单链DNA病毒，例如小DNA病毒科；
(4)虹彩病毒属，例如虹彩病毒科；
(5)肝DNA病毒属，例如肝DNA病毒科；
另一方面，RNA病毒一般分为：
(1)正单链RNA病毒，例如小RNA病毒、披膜病毒科、黄病毒科、杯状病 毒科和冠状病毒科；
(2)非节段负单链RNA病毒，例如副粘病毒科、弹状病毒科和线状病毒科；
(3)分节段负单链RNA病毒，例如正粘病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒科；
(4)双链RNA病毒，例如呼肠弧病毒科；
(5)双义RNA病毒，例如沙粒病毒科和布尼亚病毒科；
(6)逆转录病毒，例如逆转录病毒科。
以下是基因中具有5′非翻译区的代表性DNA和RNA病毒的科名、属名和种 名，本发明用于增强有用基因表达的核酸序列可选自由这些病毒衍生的序列，或 可选自病毒变异体或病毒新种衍生的序列，还可选自以上所述以外其他DNA或 RNA病毒衍生的序列。
乳多空病毒科的典型属包括乳头瘤病毒属和多瘤病毒属等，其中典型的种包括 肖普氏乳头瘤病毒，多瘤病毒空泡形成病毒等。
腺病毒科的典型属包括乳腺病毒属和禽腺病毒属等，其中典型的种包括人腺病 毒，CELO病毒等。
疱疹病毒科的典型属包括α-、β-和γ-疱疹病毒属等，其中典型的种包括I型单 纯性疱疹病毒，II型单纯性疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，B病毒，巨细胞病毒， EB病毒，HHV-6，HHV-7等。
痘病毒的典型属包括正痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、野兔痘病毒属、 副痘病毒属、猪痘病毒属、昆虫痘病毒属、Yata痘病毒属和软体动物痘病毒属等， 其中典型的种包括牛痘病毒、禽痘病毒、绵羊痘病毒、粘液瘤病毒、羊病毒、猪痘 病毒、昆虫痘病毒、Yata病毒、人传染性软疣痘病毒等。
小DNA病毒科的典型属包括小DNA病毒属、依赖病毒属和浓核病毒属，其中 典型的种包括小DNA病毒B19、腺病毒伴随的卫星病毒和致密核增生病毒等。
虹彩病毒科的典型属包括虹彩病毒属等，其中典型的种包括iridescent病毒等。
肝DNA病毒科的典型属包括肝DNA病毒属等，其中典型的种包括乙肝病毒等。
小RNA病毒科的典型属包括肠病毒属、肝RNA病毒属和鼻病毒属等，其中典 型的种包括I型脊髓灰质炎病毒、III型脊髓灰质炎病毒(I型多瘤病毒)、A型和B型 柯萨奇病毒(1-5血清型除外)，甲肝病毒、牛肠道细胞病变孤儿病毒、1A型人鼻病 毒等。
披膜病毒科的典型属包括α-病毒属、风疹病毒属、昆虫病毒属等，其中典型的 种包括辛德华斯病毒、风疹病毒、东部马脑脊髓炎病毒、牛粘膜病病毒等。
黄病毒科的典型属包括黄病毒属、Hepacavirus等，其中典型的种包括日本乙型 脑炎病毒、黄热病病毒、丙肝病毒等。
杯状病毒科的典型属包括杯状病毒属、hepevirus等，其中典型的种包括Norwalk 病毒、戊肝病毒等。
冠状病毒科的典型属包括冠状病毒属等，其中典型的种包括人冠状病毒、禽传 染性支气管炎病毒、小鼠肝炎病毒等。
副粘病毒科的典型属包括肺病毒属、副粘病毒属、麻疹病毒属等，其中典型的 种包括呼吸道合胞病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒等。
弹状病毒科的典型属包括水疱性病毒属、狂犬病病毒属等，其中典型的种包括 水疱性口炎病毒、狂犬病病毒等。
线状病毒科的典型属包括线状病毒属等，其中典型的种包括马尔堡病毒、埃博 拉病毒等。
正粘病毒科的典型属包括流感病毒属等，其中典型的种包括A、B、C型流感 病毒，猪流感病毒等。
布尼亚病毒科的典型属包括布尼亚病毒属等，其中典型的种包括布尼亚病毒、 汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒等。
沙粒病毒科的典型属包括沙粒病毒属等，其中典型的种包括淋巴细胞性脉络膜 脑膜炎病毒、拉沙病毒等。
呼肠弧病毒科的典型属包括环状病毒属、呼肠弧病毒属、轮状病毒属等，其中 典型的种包括蓝舌病毒、人呼肠弧病毒、轮状病毒等。
逆转录病毒科的典型亚科包括肿瘤病毒亚科、炮沫病毒亚科、慢病毒亚科等， 其中典型的种包括人T细胞白血病病毒、人免疫缺陷病毒等。
可用于本发明的增强有用基因表达的核酸序列可以是以上DNA和RNA病毒 核酸序列内的5′非翻译区，或是含有从非翻译区延伸至相邻编码区的序列段，或 是以上序列的片段或变异体。5′非翻译区指位于5′末端而且不翻译成氨基酸序列 的区域，而且，作为增强有用基因表达的核酸序列，该区可以具有或没有IRES 活性，虽以具有这一活性为佳。5′非翻译区包括5′-UTR(5′非翻译区)，5′-NCR(5′ 非编码区)和5′-NTR(5′不翻译区)等。
以下是从上述病毒中获得用于增强有用基因表达的核酸序列的方法。在细胞 核内繁殖的双链DNA病毒含有双链DNA(dsDNA)基因组，因此，可用II型DNA 依赖性RNA聚合酶由dsDNA合成mRNA，从而制得含有该核酸序列5′非翻译区 序列或含有从非翻译区延伸至相邻编码区的序列，或含有所述序列片段的序列。 此外，在细胞核内繁殖的双链DNA病毒含有双链DNA(dsDNA)基因组，因此， 可用病毒本身的DNA依赖性RNA聚合酶合成mRNA，以便利用含有该核酸序列 5′非翻译区序列或含有从非翻译区延伸至相邻编码区的序列，或含有所述序列片 段的序列。在细胞核内繁殖的单链DNA病毒含有单链DNA(ssDNA)基因组，因 此，可先用DNA聚合酶合成dsDNA，然后用II型DNA依赖性RNA聚合酶合成 mRNA，以便利用含有核酸序列5′非翻译区序列或含有从非翻译区延伸至相邻编 码区的序列，或含有所述序列片段的序列。肝DNA病毒含有部分双链环状DNA 基因组，因此，先修补缺口，接着使DNA超螺旋，然后用II型DNA依赖性RNA 聚合酶由超螺旋DNA合成mRNA。这样，就可利用含有所得核酸序列5′非翻译 区序列或含有从非翻译区延伸至相邻编码区的序列，或含有所述序列片段的序 列。
以下是从RNA病毒获得用于增强有用基因表达的核酸序列的方法。正链 RNA病毒含mRNA作为基因组，因此可使用该含有核酸序列5′非翻译区或从非 翻译区延伸至相邻编码区的核酸序列或含所述序列片段的序列。对非节段和节段 性负链RNA病毒来说，可用ssRNA依赖性RNA聚合酶(复制酶)将其转化为互补 正链RNA，以便利用含有该核酸序列5′非翻译区或从非翻译区延伸至相邻编码区 的核酸序列或含所述序列片段的序列。双链RNA病毒含分节段dsRNA作为基因 组，所以可用dsRNA依赖性RNA聚合酶合成mRNA，以便利用含有核酸序列5′ 非翻译区或从非翻译区延伸至相邻编码区的核酸序列或含所述序列片段的序列。 双义RNA病毒含正链和负链作为基因组，所以可用ssRNA依赖性RNA聚合酶 合成mRNA，以便利用含有核酸序列5′非翻译区或从非翻译区延伸至相邻编码区 的核酸序列或含所述序列片段的序列。对逆转录病毒来说，可用tRNA引物和RNA 依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)形成DNA-RNA杂合体，然后可利用逆转录酶的核 糖核酸酶H(RnaseH)活性分离与DNA杂交的RNA，然后合成线性dsDNA。在对 线性dsDNA充分处理后，用II型DNA依赖性RNA聚合酶合成mRNA，以便利 用含有核酸序列5′非翻译区或从非翻译区延伸至相邻编码区的核酸序列或喊所述 序列片段的序列。
在用cDNA作为本发明用于增强有用基因表达的核酸序列时，所述cDNA最 好是用逆转录酶按上述方法从mRNA制得的。此外，其他合适的DNA包括通过 PCR等方法从病毒基因组制得的基因组DNA序列，根据核苷酸测序信息用DNA 合成仪等方法部分或完全化学合成的DNA。
可将本发明的表达载体构建成可在体外和体内表达有用基因，而且，对此没 有特殊限制，可以是任何如下载体：在其中，本发明用于增强有用基因表达的核 酸序列连接在启动子的下游，有用基因的上游。用于构建表达载体的载体可以是 购买的。这样的载体包括，例如，pUC19和pTV118N(Takara Shuzo Co.Ltd.)， pUEX2(Amersham)，pGEX-4T和pKK233-2(Pharmacia)，pMAM-neo(Clontech)， pGL2(Promega)，pDNA3.1+(Invitrogen)等。可用各种标准方法构建本发明的表达 载体，例如使用限制性酶和连接酶的那些方法。
“表达载体”在此不限于实施例中所用的载体，相反，所述载体可以是质粒、 λ噬菌体或粘粒之类复制子，其中含有能增强有用基因表达的核酸序列，因此可 进行有用基因的复制和表达。例如，可比粘粒克隆更长DNA片段的表达载体例 子包括P1噬菌体、F因子、酵母人造染色体(YAC)等。λ噬菌体包括取代载体和 插入载体，可根据有用基因的长度选用。
可在动物细胞内表达的已知载体例包括SV40载体，牛乳头瘤病毒载体、疱 疹病毒载体，腺病毒载体，痘病毒载体，逆转录病毒载体等。
在用细菌尤其是大肠杆菌作为表达载体转化或转染的宿主细胞时，表达载体 通常至少含有启动子区(包括启动子、操纵基因和SD序列)，起始密码子，有用 基因序列，终止密码子和终止区。当宿主是酵母或动物细胞时，表达载体最好至 少含启动子，起始密码子，信号肽序列，有用基因序列和终止密码子。此外，可 在表达载体内插入增强子序列，有用基因的5′和3′非翻译区，剪接接头，聚腺苷 酸化位点和可选标记。
本发明基因表达载体内的启动子可以是本领域熟知的强或弱启动子，包括 SV40(猿病毒40)，SR-α，巨细胞病毒(CMV)启动子，肌动蛋白启动子，病毒LTR(长 末端重复序列，包括HTLV-1LTR和HIV-LTR，Rous肉瘤病毒LTR)，单纯性疱 疹病毒酪氨酸激酶启动子，等。
希望在成纤维细胞、神经细胞、血细胞和软组织细胞以及癌细胞等各种真核 细胞中进行表达时，典型的启动子是巨细胞病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子、β 肌动蛋白启动子，SV40早期基因启动子等。常将增强子与启动子序列组合使用。
总之，凡能在衍生自哺乳动物的细胞内高效表达有用基因，且与宿主相容的 启动子都可选为本发明的启动子。此外，如果要在特定细胞和组织内引入并表达 基因，可选用对该细胞特异性的启动子。此外，可以将同源或异源启动子组合， 由此可获得更高的表达，并使蛋白质表达稳定化。
同时，用于原核细胞的启动子例子包括PBAD、PL、trc、T7、SP6、T3、lac 等。
总之，凡能在衍生自原核细胞的细胞内高效表达有用基因，且与宿主相容的 启动子都可选为本发明的启动子。此外，如果要在特定细胞和组织内引入并表达 基因，可选用对该细胞特异性的启动子。此外，可以将同源或异源启动子组合， 由此可获得更高的表达，并使蛋白质表达稳定化。
用于酵母的启动子的例子包括GAL1、AOX1、CUP1、PGK等。
加入基因表达载体用于选择表达靶载体的细胞的选择标记可以是二氢叶酸 还原酶(DHFR)基因(甲氨碟呤抗性基因)，neo基因(G418抗性基因)等。例如，在 用DHFR作为无DHFR基因CHO细胞的选择标记时，可用无胸腺嘧啶培养基进 行选择。或者，可通过递升浓度甲氨碟呤培养选择抗性细胞，引起有用基因的胞 内表达，从而获得更高表达的细胞系。
图2-4，7，8，11和12(参见实施例2-6和8-12)以图形方式显示了构建的表 达载体例子。
本发明还包括用上述方法所构建的基因表达载体转化或转染的宿主细胞，例 如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞和微生物细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌、酿酒 酵母等)，它们能够表达结合于表达载体内的有用基因。选择合适的宿主细胞可以 获得插入在启动子序列和有用基因之间用于增强有用基因表达的核酸序列的最 大活性。
本发明用作宿主细胞的动物细胞包括由人细胞衍生的细胞，但对此没有特殊 的限定，只要该动物细胞使得本发明具有增强有用基因表达活性的核酸序列能够 增强基因在其中的表达。这些细胞的例子包括CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、 Vero细胞、骨髓瘤细胞、HEK293细胞，HeLa细胞、Jurkat细胞，小鼠L细胞， 小时C127细胞，小鼠FM3A细胞，小鼠成纤维细胞，成骨细胞，软骨细胞等。 此外，微生物细胞包括大肠杆菌和枯草杆菌，以及酿酒酵母和Saccharomyces uvarum等酵母。而且，植物细胞包括来自棉花和拟南芥菜属的细胞。
如前所述，用于增强有用基因表达的核酸序列最好具有IRES活性，然而， 病毒IRES可能具有多种结构，并根据宿主细胞有关表达功能的要求而不同。此 外，有些IRES相关分子簇可能在病毒感染后转移，所以，在本发明使用含IRES 的核酸序列时，最好根据核酸序列选择最合适的宿主细胞。
此外，在无法获得能增强表达的宿主细胞时，可通过例如转化对宿主细胞进 行修饰。作为修饰宿主细胞的方法，可将反式因子(例如La，p25，PTB等)引入 宿主细胞，或转化细胞以在宿主细胞内表达。为了表现IRES功能需动用参与帽 依赖性翻译启动的许多分子，以及其他反式因子。“反式因子”在此指来自宿主 细胞的一簇分子，它们直接或间接赋予或促进本发明的增强有用基因表达活性。 如前所述，RNA以及作用于IRES的反式因子的构相在翻译的启动中具有重要作 用，然而，各IRES所需的反式因子可能不相同，而且，获得功能性表达的机制 可能也取决于相应的IRES。
将表达载体引入宿主细胞的方法包括，例如，通过脂多胺介导法、DEAE-葡 聚糖法、Hanahan法、脂质转染法、磷酸钾介导法以及显微注射、电穿孔等方法 进行的转染。
通过特定处理，与真核细胞所用原核RNA聚合酶具有亲和力的启动子和 IRES依赖性翻译机制都可用来实施本发明。例如，如本发明实施例所述，事先 在宿主细胞内引入与启动子相容的聚合酶基因，则可用这样的宿主细胞在真核细 胞细胞质内表达有用基因。引入的方法包括常规方法，例如使用病毒外膜的脂质 体制剂法，电穿孔法，磷酸钾介导法和使用病毒载体的方法。具体地说，临床应 用适合采用脂质体制剂，例如HVJ脂质体、VSV脂质体、阳离子脂质体等，或 病毒载体，例如腺病毒载体，逆转录病毒载体等。脂质体制剂或病毒载体可器官 或部位特异性地引入真核细胞以表达原核RNA聚合酶，然后，就可用其中启动 子与所用原核RNA聚合酶具有亲和性的该表达载体表达有用基因，从而获得有 用基因的器官或部位特异性表达。该方法的优点在于，例如，即使脂质体制剂或 病毒载体被引入不期望的部位，仍可降低可能的副作用和提高器官特异性，因为， 有用基因无法在没有启动子特异性聚合酶表达的细胞内表达。如实施例9-12所证 明的(见后文)，在这类情况中，突变HCV的5′-UTR342序列提供的有用基因表达 效率高于野生型HCV的5′-UTR341序列。
如前所述，本发明用于增强有用基因表达的核酸序列可以增强有用基因的表 达，不论具体启动子、宿主、作用原因、翻译过程差异、表达环境和表达方法如 何。
此外，本说明书揭示了这样的生物(例如动物、植物和昆虫)，它们具有用含 有增强基因表达的核酸序列的载体所转化或转染从而可有效表达有用基因产物 的宿主细胞。
此外，本发明还包括生产有用基因产物的方法：在培养基中培养宿主细胞， 然后分离有用基因产物；或在含有所述宿主细胞的生物体内生产靶基因产物。还 包括表达有用基因的方法，以及用表达载体增强基因表达的方法。
对本发明实施方式的修改之一可以是检索并发现含有新5′非翻译区和/或 IRES的核酸序列，于是，可将该方法获得的该序列、其片段，或由5′非翻译区延 伸至编码区的序列或其片段，或它们的变异体用作增强有用基因表达的核酸序 列。
以下是检索并发现含有新5′非翻译区和/或IRES的核酸序列举例。已知，在 脊髓灰质炎病毒感染的细胞内，eIF-4F(eIF-4E，eIF-4A和eIF-4γ的复合物)的亚基 eIF-4γ(p220)会被切掉。于是，感染细胞内的eIF-4F水平降低。可以用热休克法 来产生这样的情况。帽结合蛋白eIF-4E脱磷酸，伴随以与帽结构亲和力降低 (Lamphear，B.J.等，生物化学杂志，266，2789，1991)。在这种状态下，对eIF-4F 需求高的mRNA翻译被抑制，因而只有需要低的mRNA或含有IRES的mRNA 能翻译。根据以上发现，能够用热休克等方法发现具有IRES(类似物)活性的核酸 序列。实际上，检索了即使在脊髓灰质炎病毒感染细胞内仍然有效的mRNA，而 且已鉴定了它们序列中含有的IRES(Macejak，D.G.等，自然，353，90，1991)。作 为另一实验，可检索基因的序列库是否含有内含多个AUG密码子的长5′非翻译 区的核酸序列。实际上，已发现：与果蝇发育和分化有关的许多mRNA都含有这 样的序列，同时，在由antennapedia基因(Antp)转录得到的两种mRNA中鉴定到 了IRES(Oh，S.K.等，基因发展，6，1643，1992)。曾有人推断：在发育和分化阶段 的动物细胞内，象经历热休克的细胞一样，eIF-4E的磷酸化不足，帽依赖性翻译 机制因而无法生效(Bonneau，A.M.等，生物化学杂志，262，11134，1987)。
而且，如前所述，曾报道：真核mRNA的5′非翻译区内具有IRES活性区域， 例如c-myc、免疫球蛋白重链结合蛋白质(BiP)、FGF-2、PDGF2、eIF-4G、钾通 道等，而且，真核细胞内的翻译其实是由帽依赖性机制启动的。
此外，可用含两个顺反子的mRNA鉴定IRES元件。该方法的基础是：即使 在第一个顺反子的翻译被抑制的情况下，含有IRES的第二个顺反子的翻译仍能 进行。近年来已发现，即使在翻译后的延长反应被稀疏霉素抑制的条件下，含有 脑心肌炎病毒(EMCV)IRES的环状RNA仍能与核糖体结合(Chen，C.等，科学，268， 415，1995)。
附图简述
图1显示HCV基因5′非翻译区的二级结构；
图2显示含有本发明用于增强有用基因表达的核酸序列之一的表达载体；
图3显示含有本发明另一用于增强有用基因表达的核酸序列的表达载体；
图4显示含有本发明又一用于增强有用基因表达的核酸序列的表达载体；
图5显示两种不同HCV的5′非翻译区核酸序列比较(HCV1-341：5′UTR341和 HCV-342：5′UTR342)；
图6显示一种HCV突变核酸序列5′非翻译区二级结构上的突变位置；
图7显示含有本发明又一用于增强有用基因表达的核酸序列的表达载体；
图8显示含有图7用于增强有用基因表达的核酸序列的表达载体；
图9显示图7和图8载体在体外系统中增强表达的效果；
图10显示图7和图8载体转染的Hep细胞中增强表达的效果；
图11显示含有本发明另一用于增强有用基因表达的核酸序列的双顺反子表 达载体；
图12显示含有图11用于增强有用基因表达的核酸序列的双顺反子表达载 体；
图13显示图11和图12载体转染的COS细胞中增强表达的效果。
本发明的最佳实施方式
虽然以下通过具体实施例对本发明进行进一步描述，但不应以这些说明性实 施例限定本发明的范围，本领域技术人员可以看出对这些实施方式的许多改进和 修改，因此，这些都包括在本发明范围内。
以下实施例中，首先简要描述将含有本发明用于增强有用基因表达的核酸序 列的表达载体转染进入宿主细胞，以及鉴定转染子(萤光素酶活性试验)的方法。
[转染]
后文实施例2-6中用Profection哺乳动物转染系统试剂盒(Promega)，用磷酸 钙沉淀法将表达载体转染到宿主细胞内。这些实施例采用不同的细胞系，但不论 如何，在转染前1天将细胞接种到6孔板的各孔内(直径35mm)，使得在第二天 使用时孔内细胞浓度达到50％。更具体地说，将5×105个细胞接种在3ml培养基 中，37℃，5％CO2培养过夜。转染当天，吸去培养细胞的营养培养基上清液， 加入新鲜的培养基，然后加入磷酸钙沉淀和表达载体DNA。所有实验通用的培养 基是含10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(GIBCO)。
如下产生磷酸钙沉淀和表达载体DNA。提供两支聚苯乙烯试管(A和B)，在 A管内混合试剂盒内的液体、CaCl2和表达载体DNA，将等体积的试剂盒内的 2×HEPES(50mM HEPES，(pH 7.1)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4)和A管中的 混合物加入B管。通过缓慢滴加，将管A中的溶液全部加入B管，同时进行搅 拌，混合物在室温下放置30分钟，得到略显浑浊的溶液。然后，用涡流搅拌器 充分混合所得液体，然后将管内混合物全部滴加到一个孔内，从而在孔内加入了 5μg的DNA。然后，37℃培养6小时后，吸去营养培养基，细胞表面用PBS(-)(磷 酸盐缓冲液(pH7.4)：137mM NaCl，8.10mM Na2HPO4(非水合)，2.68mM KCl， 1.47mM KH2PO4)洗涤2次。然后加入新鲜培养基，再37℃培养18小时。
[萤光素酶活性试验法]
在采用pGL2载体的实施例2，3，4，10和12中，用萤光素酶试验系统(Promega) 分析萤光素酶活性，在采用其他载体的实施例5，6，9，10和12中则使用双重 萤光素酶试验系统(商标，Promega)。如上转染后48小时，在各孔中加入500μl/ 孔的试剂盒内的裂解缓冲液，按照制造商的说明提取细胞内的萤光素酶，从而得 到各孔细胞的萤光素酶溶液。
测定以上所得酶溶液的萤光素酶活性。具体地说，用萤光素酶试验系统 (Promega)(实施例2，3，4，10和12)或双重萤光素酶试验系统(Promega)(实施例5， 6，9，10和12)，加入20μl酶溶液，100μl萤光素酶试验试剂，然后按照制造商 的说明，用发光读数仪BRL-301(Aloka)在室温下对各样品进行1分钟读数。
用考马斯加蛋白质试验试剂(PIERCE)和附带的牛血清白蛋白标准溶液测定 萤光素酶活性测定后留下的酶溶液中的蛋白质含量，从而得出酶溶液中单位重量 萤光素酶活性数据。
实施例2-6中，从转染实验开始，相应实验重复2次或3次。具体地说，将 同一种DNA转染到2孔或3孔宿主细胞内，并测定各孔酶溶液的萤光素酶活性。 必须指出的是：表1-5中的数据并非对同一转化子的酶溶液进行2-3次活性测定 所得的结果。
实施例1：HCV核酸序列片段的制备
制备含有HCV 5′非翻译区的IRES区的cDNA序列作为用于增强有用基因表 达的核酸序列。按照标准方法从HCV患者血清中提取mRNA，通过逆转录酶 (GIBCO BRL)反应合成cDNA。以该cDNA为模板，用以下序列的引物(在5′末端 加有一个HindIII识别位点；SEQ ID NO：2-6)进行PCR，扩增特定的IRES活性 片段，其中包括HCV 5′非翻译区(SEQ ID NO：1；第1-341位核苷酸)和部分核心 蛋白编码区(SEQ ID NO：1；第342-713位核苷酸)：
5′HindHCV001：5′-ccc aag ctt gcc agc ccc ctg atg ggg gcg a-3′(SEQ ID NO：2)
5′HindHCV180：5′-ccc aag ctt ctg gca att ccg gtg tac tca c-3′(SEQ ID NO：3)
5′HindHCV181：5′-ccc aag ctt gac gac cgg gtc ctt tct tg-3′(SEQ ID NO：4)
3′HindHCV341：5′-ccc aag ctt ggt gca cgg tct acg aga cct-3′(SEQ ID NO：5)
3′HindHCV713：5′-ccc aag ctt atc gat gac ctt acc ca-3′(SEQ ID NO：6)
进行20轮PCR：94℃30秒；55℃30秒和72℃30秒。这样，得到包括HCV 5′非翻译区的片段，即具有SEQ ID NO：1以下位置核苷酸序列的DNA片段：SEQ ID NO：1的第1-180，181-341，1-341，181-713和1-713位。后文将这些片段称 为HCV1-180，HCV 181-341，HCV 1-341，HCV 181-713和HCV 1-713。
实施例2：瞬时转染
分别获得两种载体，即pGL2B载体(即，含SV40聚A信号和编码萤火虫萤 光素酶的cDNA序列，没有启动子、增强子和用于增强表达的核酸序列的pGL2 基础质粒(Promega))和pGL2C载体(即，含萤火虫萤光素酶、SV40聚A信号和SV40 早期启动子/增强子，但没有用于增强表达的核酸序列pGL2对照质粒(Promega) 参见图2(a))，并如下制备pGL2B UTR5′-3′(将实施例1所得的HCV 1-341按5′-3′ 方向插入pGL2B的HindIII位点，参见图2(b))。
在以上PCR所得，带有HindIII识别位点的HCV cDNA片段中，挑选 HCV1-341用HindIII，37℃消化过夜，pGL2B载体也用HindIII消化，然后用碱 性磷酸酯酶(Boehringer Mannheim)在37℃处理30分钟，以避免分子内自身连接。 按照制造商的说明，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)将cDNA片段与 HindIII消化的载体连接。
将所得载体-DNA导入感受态细胞内，得到转化细胞，然后，在菌落中选出 含HCV片段的重组细胞，按照标准方法纯化质粒DNA。
为了进行转染，以上三种载体-DNA各取5μg，与18.5μl转染试剂盒中的CaCl2 溶液一起加入试管，加水，使最后体积达到150μl，这样制得前述A管，同时在 B管内加入150μl 2×HEPES。用COSI细胞作为宿主细胞，按上述过程进行转染， 然后测定萤光素酶活性。
因为pGL2B载体没有萤光素酶活性，用由该载体转染细胞所得酶溶液作为 空白。萤光素酶活性表示为每毫克蛋白质的相对光单位(U/mg)。
结果见表1。
表1
  载体   No.1(U/mg)   No.2(U/mg)   pGL2C   pGL2B UTR5′-3′   1623   60   1616   52
以上结果表明，载体pGL2B UTR5′-3′转染的宿主细胞内，萤光素酶活性很低， 该载体是将HCV1-341插入没有启动子的pGL2B得到的。由此证明，HCV基因 的5′非翻译区(SEQ ID NO：1；第1-341位核苷酸)本身没有或只有极小的启动子 活性。换言之，不可能根据表现错误地认为HCV 5′非翻译区具有促进基因表达的 作用是因为其作为启动子的活性高于本发明实施例所用的载体内启动子。HCV是 一种RNA病毒，在其复制循环中不转化为DNA，因此，其基因的5′非翻译区没 有启动子活性是十分合理的。
实施例3：瞬时转染
为了构建本发明的有用基因表达载体，用类似制备pGL2B UTR5′-3′的方法， 用HindIII制备pGL2C UTR5′-3′，即在HindIII位点按5′-3′方向插入了HCV1-341 的pGL2C(见图2C)。
按实施例2的方法，用5μg载体DNA即pGL2C或pGL2C UTR5′-3′转染COS1 细胞，然后测定萤光素酶活性。
结果见表2。
表2
  载体   No.1(U/mg)   No.2(U/mg)   pGL2C   pGL2C UTR5′-3′   1123   4758   1360   4637
以上数据清楚地表明，在表达载体内，在萤光素酶基因和启动子序列之间按 5′-3′方向插入HCV1-341时，萤光素酶活性升高。这说明，HCV基因的5′非翻译 区具有增强基因表达的作用。
实施例4：瞬时转染
进行类似实施例3的实验，但用pGL2C UTR3′-5′，即在HindIII位点按与实 施例3相反的3′-5′方向插入了HCV1-341的pGL2C(见图2d)，代替实施例3的 pGL2C UTR5′-3′。结果见表3。
表3
  载体   No.1(U/mg)   No.2(U/mg)   pGL2C   pGL2C UTR3′-5′   117   156   197   96
以上结果表明，与实施例3的结果相比，按3′-5′方向插入HCV1-341时，没 有观察到增强活性的效果，活性反而降低。将该结果与实施例3的结果综合考虑， 证明HCV 5′非翻译区增强有用基因表达的作用具有碱基序列特异性，而且依赖于 5′-3′的方向。此外，还可以看出，这一序列在本质上不同于任何常规增强子序列。
该实施例中，与实施例2和3的水平相比，含pGL2C细胞内的活性水平低 至十分之一或更低，这被认为是该实施例中的转染效率比实施例2和3低10倍 的缘故。所以，因为检测到了pGL2C和pGL2C UTR3′-5′之间的差异，这一较低 的活性水平应该忽略。
实施例5：瞬时转染
为了确定本发明增强有用基因表达的作用是否具有对启动子、有用基因、宿 主细胞或其组合的特异性，本实施例采用了启动子和萤光素酶来源不同于实施例 2-4的启动子和pRLTK载体((Promega)，它含HSV TK启动子、SV40聚A信号 和Renilla萤光素酶)，并用人肝癌Hep G2细胞作为宿主细胞。
将实施例1制备的含HCV 5′非翻译区的cDNA片段，即HCV1-180、 HCV1-341、HCV181-341和HCV181-713，按实施例2所述插入pRLTK的HindIII 位点，分别得到pRLTK1-180(图3(b))，pRLTK1-341(图3(d))，pRLTK181-341(图 3(c))和pRLTK181-713(图3(e))。pRLTK1-341中插入了一段与实施例3的pGL2C UTR5′-3′中相同的增强表达的核酸序列，pRLTK1-180中的插入片段对应于 pRLTK1-341的前半段，pRLTK181-341中的则对应于后半段。pRLTK181-713所 含的序列比pRLTK1-341长192个碱基对，这192个碱基对对应于核心蛋白的编 码区。
为了转染到宿主细胞内，与实施例2、3、4相同，每孔加5μg DNA，其他条 件也相同。
但是，因为用Renilla萤光素酶代替了以上实施例中的萤火虫萤光素酶，所 以试验试剂盒使用前述双重萤光素酶试验系统。
载体转染宿主细胞内的活性结果见表4。
表4
  载体   No.1(U/mg)   No.2(U/mg)   No.3(U/mg)   pRLTK   pRLTK 1-341   pRLTK 1-180   PRLTK 181-341   PRLTK 181-713   21   314   227   1,035   482   65   125   175   1,036   381   42   291   164   1,111   491
结果显示，序列HCV1-180，HCV1-341，HCV181-341和HCV181-713都表现 出显著的促进活性的作用，由此证明，实施例2、3和4中观察到的促活性作用 并非特定于SV40启动子与萤火虫萤光素酶联用并转染COS1细胞这一情况。而 且，PRLTK 181-341的作用最强，说明核酸序列HCV1-341的作用可能来自该序 列的第181-341位。
所以，本实施例表明，5′非翻译区(SEQ ID NO：1的第1-341位核苷酸序列) 仍具有增强基因表达的作用，这与启动子，有用基因的种类和来源或宿主细胞的 差异无关，而且，在这些序列中，起到本发明作用的序列可能位于第181-341位 核苷酸，因为第181-341位核苷酸可产生最强的作用。此外，本实施例还发现， 在5′非翻译区以外加上部分核心蛋白编码区可获得相似的增强表达的作用。
实施例6：稳定细胞系
与实施例2-5测定宿主细胞内瞬时转染的效果不同，本实施例测定本发明用 于增强有用基因表达的核酸序列在稳定细胞系中的作用，即使得载体在转染后稳 定存在于细胞中从而保持表达水平稳定。可以如下产生稳定细胞系：用含neo基 因的表达载体转染宿主细胞，该基因赋予对抗生素G418(新霉素)的抗性，然后收 获能在含G418培养基中繁殖的细胞。
首先，获取pcDNA3.1+(Invitrogen)载体，去除其中的T7启动子序列，在该 HindIII/XbaI位点插入实施例5的Renilla荧光素酶，由此获得质粒pcDNARL(图 4(a))。该表达载体内的启动子和增强子序列来自CMV，而聚A信号则来自牛生 长激素。
将cDNA片段HCV1-180，HCV1-341，HCV181-341，HCV181-713或HCV1- 713插入pcDNARL载体，制得质粒：pcDNARL 1-180，pcDNARL 1-341，pcDNARL 181-341，pcDNARL 181-713或pcDNARL 1-713。
按实施例2方法将这些质粒转染到宿主细胞内。本实施例中，A管内的溶液最 终体积为300μl，含10μg载体DNA和试济盒内的CaCl237μl和水，B管内的则 是300μl 2×HEPES。此外，在表面事先涂以胶原的T75瓶(组织培养瓶，细胞粘附 面积为75cm2)内，将作为宿主细胞的HepG2细胞培养至约50％细胞密度(5×106 个细胞/20ml培养基)。
实施例2-5在转染细胞培养48小时后即测定荧光素酶活性，与之相反，本 实施例在转染后约48小时加入800μg/ml G418以获取稳定的细胞系。37℃培养1 周后，细胞几乎全部死亡，但含有上述质粒DNA(含抗性基因neo)的细胞存活并 形成菌落。待菌落长至足够大，将其转移到一新瓶内，37℃，5％CO2培养繁殖， 同时取部分细胞保存于液氮中。
显然，收获的菌落是所有含存活细胞菌落的混合物，而不是在繁殖前分离菌 落，所以可以推定，在相同条件下获得了来自不同cDNA片段的稳定细胞系。
如前所述，从相当于一块6孔培养板(真经35mm)的区域内所含稳定细胞系的 细胞中提取酶溶液，然后测定荧光素酶活性。pcDNARL，pcDNARL1-341(见图 4(c))和pcDNARL181-341(见图4(b))的结果见表5。
表5
 载体   No.1(U/mg)   No.2(U/mg)  PcDNARL  pcDNARL 1-341  pcDNARL 181-341   69,593   89,987   198,413   66,062   86,442   201,365
结果显示，与实施例5一样，在稳定细胞系中，仍是cDNA序列HCV181-341 促进活性的程度最大。此外，虽然本实施例所用的启动子不同于实施例2-5，但 仍有增强基因表达的作用，所以，这明确表明，本发明的作用不依赖于特定的启 动子。
所以，在永久表达细胞中可以观察到在瞬时系统中的增强基因表达的作用， 由此消除了这样的疑惑：即，表达活性差异是否是因为各比较组内表达荧光素酶 的细胞数量不同。
实施例7：HCV1b突变株核酸序列的制备与测序
制备另一种cDNA，其中含HCV1b 5′非翻译区的IRES。由与实施例1不同的 HCV1b阳性患者的血清，用实施例1的方法合成cDNA。本实施例的患者患有高 病毒血症(109病毒拷贝/ml血浆)，有显著的病毒大量复制，所以，HCV可能在该 患者内高效翻译。以该cDNA为模板，用以下序列的引物(5′末端具有HindIII位 点(下划线)的有义引物(SEQ IN NO：8)和反义引物(SEQ ID NO：9))进行PCR，扩增 含有该HCV突变株5′非翻译区的片段。
cccaagcttgccagccccctgatgggggc    (SEQ ID NO：8)
ggtgcacggtctacgagacc    (SEQ ID NO：9)
PCR的反应条件与实施例1的相同。用Hind III和ApaL I消化所得的PCR 产物，通过琼脂糖凝胶电泳纯化。
用标准方法测定所得片段的序列，得到342个核苷酸的序列SEQ ID NO：7。 在将所得序列与前述本领域熟知的HCV1b(GenBank登录号：D00832)5′非翻译区 的片段HCV1-341(SEQ ID NO：1中第1-341位核苷酸)比较时，即图5所示的 5′-UTR342与5′-UTR341比较，在突变株的5′非翻译区中：(1)第119位的腺嘌呤被 胞嘧啶取代；(2)第207位插入了胸腺嘧啶。来自同一样品的其他cDNA中也存 在这些突变。如图6所示，鉴定为IRES内的这些突变不在高度保守区内，而在 多嘧啶段内或附近，反式因子结合位点附近，或BoxA和BoxB附近。
实施例8：含来自HCV1b的增强表达序列的载体的构建
为了测定实施例7所得片段对增强表达的作用，以及该片段内突变对表达增 强作用的影响，由pGEMEX-1载体(Promega)构建载体，其中含T7启动子，一段 增强表达的序列(来自HCV 5′非翻译区的片段)，Renilla荧光素酶(Rluc)基因和T7 终止子。
如下获得Rluc：用以下序列的引物(5′端具有Apa LI限制性位点(下划线)的 有义引物(SEQ ID NO：10)和5′端具有AscI限制性位点的反义引物(SEQ ID NO：11)) 扩增pRL-TK(Promega)。然后，用Apa LI和AscI消化所得PCR产物，然后通过 琼脂糖凝胶电泳纯化。
accgtgcaccatgacttcgaaagtttatga    (SEQ ID NO：10)
ttggcgcgccttattgttcatttttgagaa    (SEQ ID NO：11)
含HCV1-341的载体pT7-RL-UTR341的结构如图7和8(b)所示，含HCV1-342 的载体pT7-RL-UTR342的结构如图8(c)所示。
以实施例2方法制备各载体：先去除pGEMEX-1载体中的T7基因10个序 列，在T7启动子和T7终止子之间插入Hind III/Asc I限制性位点，用HCV-342 或HCV-341(增强表达的序列)和Rluc连接。在没有表达增强序列的对照质粒 pT7-RL中，Rluc报道基因直接连在T7启动子下游T7终止子上游，如图7和8(a) 所示。
此外，为了测定HCV-342中第119位的腺嘌呤被胞嘧啶取代的影响，制备 质粒pT7-RL-UTR341C(图8(d))：具有HCV-341的序列但第119位发生以上突变； 同时，为了测定在第207位插入胸腺嘧啶的影响，制备质粒pT7-RL-UTR342A(图 8(e))：具有HCV-342的序列但第119位的胞嘧啶被腺嘌呤取代。按照前述方法， 由PCR诱变产物制备分别具有以上突变的载体。
在使用前对导入载体的PCR产物进行测序，以证实含有所需序列。
实施例9：失控RNA合成和体外翻译
如下所述，用实施例8所得的质粒载体进行失控RNA合成和体外翻译以表 达荧光素酶，从而鉴定表达增强序列的效果。
通过Asc I消化将环状的各质粒载体线性化，以各DNA为模板，用T7RNA 聚合酶(Boehringer Mannheim)进行失控RNA合成。转录反应的条件按照制造商的 说明。转录反应完成后，在反应混合物中加入10U RQ DNase I(Promega)，消化 模板DNA，然后用苯酚/氯仿混合物提取RNA，用乙醇和7.5M乙酸钠沉淀。用 分光光度计测定合成RNA的浓度。
然后，在核酸酶处理过的兔网织红细胞裂解液(RRL；Promega)中体外翻译以 上每一种RNA。翻译反应在120mM氯化钾存在下，30℃进行90分钟，所用反 应混合物含1μgRNA，17.5μl上述裂解液，10U Rnase抑制剂(RNasin；Promega) 和20μM氨基酸混合物(Promega)，总体积25μl。通过添加用以保持生理性盐浓度 的氯化钾，HCV RNA可以很好地以IRES依赖性方式得以翻译。然后，加入RNase A终止反应，取2.5μl反应混合物测定荧光素酶活性。
所得结果见图9。该图中，纵轴代表载体相对于pT7-RL-UTR341(b)的算得活 性百分比。结果表示的是一式三份实验重复2次的平均值和标准差。星号(*)表示 与pT7-RL-UTR341(b)的结果有显著差异(p＜0.01)。
从图9可以看出，引入HCV-342作为增强表达序列的载体pT7-RL-UTR342(c) 的活性比引入HCV-341的载体pT7-RL-UTR341(b)高近4倍。此外，因为pT7- RL-UTR341C(d)的活性几乎与pT7-RL-UTR341的相同，所以HCV-342第119位的 突变可能对表达的增强没有作用。另一方面，pT7-RL-UTR342A(e)的强活性近似 pT7-RL-UTR342，所以可能是HCV来源序列SEQ ID NO：1第207位的胸腺嘧啶插 入造成了HCV-342的IRES依赖性强表达增强能力。
实施例10：瞬时转染
在用实施例8载体转染的细胞中测定了增强表达的效果，结果与实施例9体 外系统中的类似。
从美国典型培养物保藏中心获得Hep G2细胞(ATCC登录号：HB-8065)， 5％CO2的潮湿条件下，将其培养在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。用 pAM8-1(Osaka大学的Nakanishi博士提供)转染Hep G2细胞，建立稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系Hep T。
转染前24小时，将Hep T细胞接种到直径35mm的组织培养皿中，在与培 养Hep G2细胞相同的条件下培养。用Profection哺乳动物转染系统试济盒 (Promega)，通过磷酸钙沉淀法，用7μg各种质粒DNA进行转染。为了将转染效 率标准化，将表达萤火虫荧光素酶的pGL3-对照载体(Promega)以10∶1的摩尔比 与上述各载体共转染。各质粒的共转染各自进行3个孔。这样的一式三份实验重 复2次。
培养转染细胞48小时后，用双重荧光素酶试验系统测定细胞裂解液中的荧 光素酶活性。此外，为了测定转染效率，用荧光素酶试验系统测定共转染的萤火 虫荧光素酶活性，用它来校正上一值。结果见图10。该图中，与图9一样，纵轴 代表载体相对于pT7-RL-UTR341(b)的算得活性百分比。结果表示的是一式三份实 验重复2次的平均值和标准差。星号(*)表示与pT7-RL-UTR341(b)的结果有显著差 异(p＜0.01)。
图10显示出与图9相似的效果。即，引入HCV-342作为增强表达的序列的 载体pT7-RL-UTR342(c)的活性比引入HCV-431的载体pT7-RL-UTR341(b)高近6- 7倍。此外，pT7-RL-UTR342A(e)的活性与pT7-RL-UTR342相似。
用载体pT7-RL转染的Rluc活性显著较低，这可能是因为未能成功启动帽依 赖性翻译。所以，以上证明：HCV-342以及第119位发生取代的HCV-342序列 在体外翻译系统或在转化子内都能增强表达。
实施例11：构建含有来自HCV1b变异体的表达增强序列的双顺反子载体
为了进一步验证以上单顺反子系统中所得的效果，制备了一种含有两个顺反 子的载体，其中含有与实施例8载体类似的表达增强序列。由含有Fluc基因的 pGL3对照载体(Promega)构建含有SV40启动子，萤火虫荧光素酶(Fluc)基因，表 达增强序列，Renilla荧光素酶(Rluc)基因和SV40聚A信号的载体(见图11和12)。
如实施例8所述，通过PCR扩增各种表达增强序列(对照pGL3中没有；参 见图11和12(a))，并将Rluc引入pGL3对照载体的Xba I位点。然后，测序验证 各序列已以正确的方向插入。
实施例12：瞬时转染
如实施例2所述，用实施例11所得双顺反子载体转染COS1细胞(得自 ATCC，编号：CRL-1650)。
如下测定转化子表达出的荧光素酶活性：先用双重荧光素酶试验系统测定， 然后用荧光素酶试验系统测定上游顺反子所表达的萤火虫荧光素酶活性以测定 转染效率，用该值校正上一值。结果见图13。该图中，与图9相似，
纵轴代表载体相对于pGL3R-UTR341(b)的算得活性百分比。结果表示的是一 式三份实验重复2次的平均值和标准差。星号(*)表示与pGL3R-UTR341(b)的结果 有显著差异(p＜0.01)。
图13显示，对照pGL3R(a)的下游第二顺反子(Rluc)几乎不表达，该活性只 有在引入表达增强序列后才表达。而且，引入HCV-342作为表达增强序列的载 体pGL3R-UTR342(c)产生的活性比引入HCV-341的pGL3R-UTR341(b)高近2倍。 此外，pGL3R-UTR342A(e)产生近似pGL3R-UTR342的强活性，所以，这再次证明， 207位的胸腺嘧啶插入可能促进增强表达的能力，而第119位的突变对表达增强 的效果则较小。
以上结果表明，来自HCV突变株的序列(5′-UTR342)提供了特别好的基于 IRES活性的增强表达作用，而这种作用不是细胞特异性的，因为，在非肝细胞 中也可获得这样的作用，虽然程度略有差异。此外，已证明，在野生型HCV 5′ 非翻译区的第207位插入胸腺嘧啶可提高增强表达的效果，这也是非细胞特异性 的。
以上实施例说明，在增强表达的HCV来源序列中引入一个突变能够显著提 高增强表达的效果。引起这一效果的突变位点，即HCV基因5′非翻译区的第207 位，包含在据估计是嘧啶段结合蛋白结合位点的区域内(Ali，N.，和Siddiqul，A； 病毒学杂志，69，6367-6375，1995)。因为嘧啶段结合蛋白被认为是一种翻译因子 (Hellen，C.U.等，美国科学院院报，90，7642-7646，1993；Witherell，G.W.等，生物 化学，32，8268-8275，1993；Hellen，C.U.等，病毒学杂志，68，941-950，1994；以及 Witherell，G.W.，和Wimmer，E.病毒学杂志，68，3183-3192，1994)，所以认为，在 这一区域插入一个核苷酸会促进启动翻译所需细胞因子与IRES之间的相互作 用。酶足迹分析证明：多肽链起始因子eIF-3保护野生型HCV IRES区III内的第 204，214，215，216和212位，提示可将HCV IRES上的eIF-3结合位点掺入结 构域III的末端(Sizova，D.V.等，病毒学杂志，72，4775-4782，1998)。因为第207 位位于推定eIF-3结合位点的中央，所以推测在该位置插入胸腺嘧啶会改变其与 eIF-3的亲和力，从而提高了增强表达的效果，然而，对于这一机制的细节尚不 清楚。与已知的5′-UTR341相比，新的5′-UTR342具有更强的增强IRES活性的 能力，这可能是因为：(1)多嘧啶段附近的一处突变；(2)反式因子结合位点附近的 突变；或BoxA和BoxB附近的突变，于是，核糖体更牢固的结合产生了上述的 增强作用。
此外，因为从高毒血症患者血清中分离到了5′非翻译区内有突变(SEQ ID NO：7)的新HCV临床分离株，所以估计5′-UTR342的病毒复制是广泛的。因此， 可以通过检测在第207位有胸腺嘧啶插入的5′-UTR342来鉴定HCV感染的特征。
从以上实施例2-6可以看出，在使用对真核RNA聚合酶具有亲和力的 SV40、HSV TK和CMV启动子之一在COS1或Hep G2真核细胞内增强荧光素酶 表达的实验中，即使在不同表达条件下应用不同表达方法，本发明用于增强有用 基因表达的核酸序列仍能够增强荧光素酶的表达。已知，真核细胞内的翻译是帽 依赖性和非IRES依赖性的。所以，可以将实施例2-6所述的实验系统理解成以 非IRES活性依赖性翻译过程为基础的系统。所以，可以认为，本发明用于增强 有用基因表达的核酸序列的作用原因是其作为非IRES活性依赖性翻译增强因子 发挥功能。在这方面，本发明首次证明：HCV 5′-UTR341能在基于非IRES活性 依赖性翻译过程的实验系统中增强有用基因的表达。
另一方面，实施例9表明，在用兔网织红细胞裂解液进行的体外翻译中，这 是一种以IRES活性依赖性翻译过程为基础的实验系统，与5′-UTR341相比，5′- UTR342能够通过大幅提高IRES活性来增强有用基因的表达。此外，实施例10 -12表明，在采用原核RNA聚合酶亲和性的T7启动子增强荧光素酶表达时， 即使在将T7RNA聚合酶引入Hep G2细胞而转化得到的Hep T细胞细胞质中， 荧光素酶的表达仍被成功增强。此外，用双顺反子系统内的SV40启动子在表达 T抗原的COS细胞内进行增强荧光素酶表达的实验时，荧光素酶的表达也增强。 实施例9-12所示IRES活性依赖性实验系统中荧光素酶表达的增强可能是因为： 5′-UTR342增强了5′-UTR341的IRES的活性，或提高了mRNA的稳定性。本发 明还通过引物延伸试验(病毒学杂志，72，8789-8796，1998)证明HCV 5′-UTR342与 mRNA稳定性提高无关。不论如何，与5′-UTR341引起的情况相比，用HCV 5′- UTR342可在基于IRES活性依赖性翻译过程的实验系统中增强有用基因的表达。 目前，已知HCV 5′非翻译区内的5′-UTR341在IRES活性依赖性翻译实验系统中 具有IRES活性(病毒学，226，47-56，1996；病毒学杂志72，8789-8796，1998)。然 而，本发明首次证明，与已知5′-UTR341的IRES活性相比，本发明新的来自HCV 的5′-UTR342序列能更大程度地提高IRES活性，由此增强有用基因的表达。
曾报道，可以象实施例9-12那样，在单顺反子或双顺反子系统内将HCV 5′ 非翻译区接在T7启动子下游，再将有用基因连入下游从而表达该有用基因(病毒 学，226，47-56，1996；病毒学杂志，72，8789-8796，1998)。然而，这些实验都是用 预先以HCV 5′-UTR341转化的哺乳动物细胞进行的，这样，T7RNA聚合酶都如 实施例10-12所示在基于IRES依赖性翻译的实验系统中表达。换言之，虽然 HCV 5′-UTR341已被证实具有IRES活性，但尚未表现出翻译增强因子的作用， 而这需要用基于非IRES依赖性翻译的实验系统来证明。所以，本发明实施例2 -6首次证明了这种翻译增强因子功能。此外，本发明还首次证明：HCV的5′- UTR342能够在基于IRES依赖性翻译的实验系统中提高IRES活性，从而与已知 5′-UTR341相比，增强有用基因的表达。
工业实用性
本发明增强基于在体内和体外的表达，从而提高有用基因产物的产量，而不 论表达载体的种类，表达载体内启动子、信号和增强子等序列，有用基因或宿主 细胞的种类和来源。
可对引入序列进行某种突变从而进一步提供其增强基因表达的能力。
这样的作用可用于在细胞培养物系统中提高肽的产量，或在载体内与特定启 动子组合用于有效的基因治疗，所述的启动子对某内部器官或肿瘤具有特异性但 曾因活性低而无法实际应用。
此外，可以用含有IRES活性高于遍在IRES的序列的探针筛选能与IRES相 互作用的物质(调节物等)，或筛选IRES依赖性翻译的起始因子。
此外，可以通过在生物体内引入用于增强有用基因表达的核酸序列而促进 mRNA的翻译，从而治疗因生物体内帽依赖性mRNA翻译减弱所致的疾病。
此外，为了治疗因生物体内IRES活性降低所致的疾病，可将用于增强有用 基因表达的核酸序列引入生物体从而促进mRNA的翻译。
此外，通过检测被测者的生物样品内是否含有来自HCV的特定聚核苷酸序 列，可以确定丙肝的严重程度。
序列表
<110>扶桑药品工业株式会社
<120>增强基因表达的核酸序列和增强基因表达的方法
<130>99P137WO
<160>11
<210>1
<211>713
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(HCV)
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(341)
<220>
<221>CDS
<222>(342)..(713)
<400>1
gccagccccc tgatgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg   60
tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac  120
cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag  180
gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc  240
gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg  300
gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac c atg agc aca aat cct  356
                                              Met Ser Thr Asn Pro
                                                1               5
aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac cgc cgc cca cag gac    404
Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp
                 10                  15                  20
gtc aag ttc ccg ggc ggt ggt cag atc gtt ggt gga gtt tac ctg ttg    452
Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu
             25                  30                  35
ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc gcg act agg aag act tcc    500
Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser
         40                  45                  50
gag cgg tcg caa cct cgt gga agg cga caa cct atc ccc aag gct cgc    548
Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg
     55                  60                  65
cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct cag ccc ggg tat cct tgg ccc ctc    596
Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu
 70                  75                  80                  85
tat ggc aac gag ggc atg ggg tgg gca gga tgg ctc ctg tcg ccc cgc    644
Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg
                 90                  95                 100
ggc tcc cgg cct agt tgg ggc cct tcg gac ccc cgg cgt agg tcg cgt    692
Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Ser Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg
            105                 110                 115
aat ttg ggt aag gtc atc gat                                        713
Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp
        120
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(HCV)
<220>
<223>用于扩增HCV cDNA片段的PCR引物的序列
<400>2
cccaagcttg ccagccccct gatgggggcg a                                  31
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(HCV)
<220>
<223>用于扩增HCV cDNA片段的PCR引物的序列
<400>3
cccaagcttc tggcaattcc ggtgtactca c    31
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(HCV)
<220>
<223>用于扩增HCV cDNA片段的PCR引物的序列
<400>4
cccaagcttg acgaccgggt cctttcttg       29
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(HCV)
<220>
<223>用于扩增HCV cDNA片段的PCR引物的序列
<400>5
cccaagcttg gtgcacggtc tacgagacct      30
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒(HCV)
<220>
<223>用于扩增HCV cDNA片段的PCR引物的序列
<400>6
cccaagctta tcgatgacct taccca          26
<210>7
<211>342
<212>DNA
<213>突变C1b肝炎病毒(HCV)
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(342)
<400>7
gccagccccc tgatgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg     60
tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggcc    120
cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag    180
gacgaccggg tcctttcttg gatcaatccc gctcaatgcc tggagatttg ggcgtgcccc    240
cgcgagactg ctagccgagt agtgttgggt cgcgaaaggc cttgtggtac tgcctgatag    300
ggtgcttgcg agtgccccgg gaggtctcgt agaccgtgca cc                       342
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>C1b肝炎病毒(HCV)
<220>
<223>扩增突变HCV1b cDNA片段的PCR有义引物的核苷酸序列
<400>8
cccaagcttg ccagccccct gatgggggc                                       29
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>C1b肝炎病毒(HCV)
<220>
<223>扩增突变HCV1b cDNA片段的PCR反义引物的核苷酸序列
<400>9
ggtgcacggt ctacgagacc                                                 20
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>Renilla荧光素酶
<220>
<223>扩增Renilla荧光素酶基因的PCR有义引物的核苷酸序列
<400>10
accgtgcacc atgacttcga aagtttatga    30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>Renilla荧光素酶
<220>
<223>扩增Renilla荧光素酶基因的PCR反义引物的核苷酸序列
<400>11
ttggcgcgcc ttattgttca tttttgagaa    30