肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用
阅读：833发布：2023-03-12
专利汇可以提供肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于免疫 生物 学领域，涉及一种肠道病毒71型VP1 抗原 的免疫原性多肽及其制备方法与应用。具体的，涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，其具有如 序列表 中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5任一序列所示的 氨 基酸序列，或上述序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还涉及所述免疫原性多肽的制备方法和在制备EV71病毒的诊断 试剂 中的用途。本发明的免疫原性多肽具有良好的抗原性和免疫原性，为EV71的早期诊断试剂开发和 疫苗 研发提供了研究 基础 。，下面是肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.编码权利要求1所述免疫原性多肽的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.10所示。
3.一种重组载体，其含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的重组载体，特征在于，其出发载体为pET-49b(+)。
5.一种重组表达菌，其含有权利要求4所述的重组载体。
6.如权利要求所述的重组表达菌，特征在于，其出发菌株为大肠杆菌DE3。
7.一种制备权利要求1所述的免疫原性多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO.10所示的基因片段和载体pET-49b(+)，经SpeI及HandⅢ双酶切后，连接构建得到表达载体pET-49b(+)-VP1565-864；
565-864
(2)将步骤(1)的表达载体pET-49b(+)-VP1 转化至大肠杆菌DE3，筛选阳性克隆，诱导表达重组蛋白；
(3)将步骤(2)的重组蛋白采用谷胱甘肽巯基转移酶琼脂糖凝胶纯化，即得。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，SEQ ID NO.10所示的基因片段的构建方法为：以SDLY107全长cDNA为PCR模板，以SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示的引物序列为扩增引物，经PCR扩增得到。
9.权利要求1所述的免疫原性多肽在制备EV71病毒的诊断试剂中的应用。
肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] EV71是单股正链RNA病毒，从属于小RNA病毒科肠道病毒A属，其感染可引起婴幼儿手足口病，发病时主要表现为发热、腹泻及疱疹性咽峡炎。与典型手足口病不同的是，某些EV71毒株感染可引起重症手足口病，并发症包括无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经源性肺水肿甚至死亡。EV71感染发病广泛，其流行范围波及亚洲、欧洲、北美洲、澳洲等，死亡率高，是目前颇受重视的公共卫生问题。
[0003] 多年来，各国学者一直致力于EV71疫苗的研发，随着分子生物学及免疫学等多学科的交叉发展，EV71的重组亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗相继问世。其中EV71传统全灭活疫苗发展最为迅速，目前中国有三家机构已完成EV71全灭活疫苗的Ⅲ期临床试验。但全灭活疫苗存在诸多问题，例如免疫效果一般较低，无法诱导细胞毒T淋巴细胞反应，诱导产生的免疫反应持续时间较短，灭活剂对病毒抗原存在影响等；所以亟需研发新型疫苗，在保留完整免疫原性的同时有效刺激免疫应答，同时避免感染。
[0004] 关于EV71的感染诊断，传统方法包括中和实验法及病毒分离法，以上方法费时费力，实验要求较高，不适于临床应用。近年来，分子生物学检测技术(如逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR))用于诊断EV71感染的应用越来越多，但是此类方法存在假阳性及假阴性，对实验技术要求较高，不易在基层医院开展。而酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫层析法(ICA)利用抗原抗体结合的原理进行 EV71的检测，操作简单快速，目前有不少相关研究，但尚未在临床上推广。
[0005] EV71可分为A、B、C三个亚型，其中B及C亚型又可分别分为B1-B5及C1-C5型。 EV71仅含一个开放阅读框(open reading frame，ORF)，ORF的上下游分别为5’UTR和3’UTR。基因组RNA全长约含7500个核苷酸，编码具有2193个氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白可以水解为P1、P2、P3三个前体蛋白，最终水解为4个结构蛋白(VP1-VP4)和7个非结构蛋白(2A-2C、 3A-3D)。4个结构蛋白中，VP4包埋于病毒外壳的内侧，其余三个均暴露于病毒颗粒表面，直接接触宿主免疫系统；其中VP1蛋白具有与血清型相对应的遗传多样性，包含EV71主要的抗原决定簇，因此VP1是目前研究的热点之一，已被广泛应用于手足口病的病原检测及疫苗研究。
[0006] VP1蛋白的BC loop区(91-106氨基酸位点)是目前公认的中和抗原决定簇位点，但是否还存在其他重要的抗原决定簇尚需进一步的研究论证。
发明内容
[0007] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用。将VP1蛋白进行分割，研究各肽段的抗原性及免疫原性，为EV71的早期诊断试剂和疫苗研发提供基础研究。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 本发明的一个方面涉及一种肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽，其具有如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5任一序列所示的氨基酸序列，或上述序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010] 本发明的再一个方面涉及编码上述免疫原性多肽的多核苷酸；具体的，所述多核苷酸的序列分别如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示。
[0011] 本发明还提供含有上述多核苷酸序列的重组载体。
[0012] 前述的重组载体，其出发载体为pET-49b(+)。
[0013] 本发明还提供含有上述重组载体的重组表达菌。
[0014] 前述的重组表达菌，其出发菌株为大肠杆菌DE3。
[0015] 本发明还提供肠道病毒71型VP1抗原的免疫原性多肽的表达和纯化方法，其包括如下步骤：
[0016] (1)将SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示的基因片段和载体pET-49b(+)，经SpeI及 HandⅢ双酶切后，连接构建得到表达载体pET-49b(+)-VP1、pET-49b(+)-VP179-432、 pET-49b(+)-VP1436-864、pET-49b(+)-VP1436-735和pET-49b(+)-VP1565-864；
[0017] (2)将步骤(1)的表达载体pET-49b(+)-VP1、pET-49b(+)-VP179-432、pET-49b(+)-VP1436-864、 pET-49b(+)-VP1436-735和pET-49b(+)-VP1565-864转化至大肠杆菌DE3，筛选阳性克隆，诱导表达重组蛋白；
[0018] (3)将步骤(2)的重组蛋白采用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)琼脂糖凝胶纯化，即得。
[0019] 步骤(1)中，SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示的基因片段的构建方法为：以SDLY107 (GenBank:JX244186.1)全长cDNA为PCR模板，以SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.20所示的引物序列为扩增引物，经PCR扩增得到VP1基因全长片段及4段VP1基因片段，分别为VP1、 VP179-432、VP1436-864、VP1436-735和VP1565-864。
[0020] 扩增的引物序列具体如下：
[0021] SpeI VP1 Primer F：5’-CGGACTAGTGGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTG-3’；(SEQ ID NO.11)；
[0022] HindIII VP1 Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAAAGAGTGGTGATCGCTGTGCG-3’；(SEQ ID NO.12)；
[0023] 1 VP1 SpeI Primer F:5'-CGGACTAGTATGCCCACAGGCCAGAACACACAGGTGA-3’； (SEQ ID NO.13)；
[0024] 1 VP1 HindIII Primer R:5'-CCCAAGCTTCTACCCGGTGGGTGTGCACGCAACAAAA-3’；(SEQ ID NO.14)；
[0025] 2 VP1 SpeI Primer F:5’-CGGACTAGTATGGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATA-3’； (SEQ ID NO.15)；
[0026] 2 VP1 HindIII Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTTG-3’； (SEQ ID NO.16)；
[0027] 3 VP1 SpeI Primer F:5'-CGGACTAGTGTTGTCCCACAATTGCTCCAATA-3’；(SEQ ID NO.17)；
[0028] 3 VP1 HandIII Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAGTACTTGGACTTGGAGGTCC-3’；(SEQ ID NO.18)；
[0029] 4 VP1 SpeI Primer F:5’-CGGACTAGTCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTC-3’；(SEQ ID NO.19)；
[0030] 4 VP1 HandIII Primer R:5’-CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTT-3’；(SEQ ID NO.20)。
[0031] 本发明还提供上述肠道病毒71型的VP1抗原的免疫原性多肽在制备EV71病毒的诊断试剂中的应用。
[0032] 本发明的有益效果：
[0033] (1)本发明在EV71结构蛋白VP1上BC loop区(91-106氨基酸位点)之外发现了新的免疫原性多肽，该多肽具有良好的抗原性和免疫原性，为EV71的早期诊断试剂开发和疫苗研发提供了研究基础。
[0035] 图1：VP1蛋白的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：未转化过质粒的DE3菌体；3：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达3h；5：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；7：
以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；8：以浓度为0.67mmol/L的IPTG 诱导表达5h。VP1-GST融合蛋白分子量为59kd。
以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；8：以浓度为0.67mmol/L的IPTG 诱导表达5h。VP1-GST融合蛋白分子量为59kd。
[0036] 图2：免疫原性多肽VP179-432的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：以浓度为 0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；3：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为
0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；5：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为
0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；7：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达5h。 VP179-432-GST融合蛋白分子量约为39kd；8：未转化过质粒的DE3菌体。
0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；5：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为
0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；7：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达5h。 VP179-432-GST融合蛋白分子量约为39kd；8：未转化过质粒的DE3菌体。
[0037] 图3：免疫原性多肽VP1436-864的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：以浓度为 0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；3：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为
0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；5：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为
0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；7：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达5h。 VP1436-864GST融合蛋白分子量约为40kd；8：未转化过质粒的DE3菌体。
0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；5：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为
0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；7：以浓度为0.67mmol/L的IPTG诱导表达5h。 VP1436-864GST融合蛋白分子量约为40kd；8：未转化过质粒的DE3菌体。
[0038] 图4：免疫原性多肽VP1436-735的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：未转化过质粒的DE3菌体；3：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达3h；5：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达4h；7：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；8：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达5h。VP1436-735-GST融合蛋白分子量为40kd。
[0039] 图5：免疫原性多肽VP1565-864的表达及鉴定结果；图中，1：蛋白marker；2：未转化过质粒的DE3菌体；3：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达3h；4：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达3h；5：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达4h；6：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达4h；7：以浓度为0.33mmol/L的IPTG诱导表达5h；8：以浓度为0.67mmol/L 的IPTG诱导表达5h。VP1565-864-GST融合蛋白分子量为37kd。
[0040] 图6：纯化的VP1蛋白抗原性检测结果；图中，1：阴性对照；2：纯化后的VP1-GST融合蛋白，VP1-GST融合蛋白分子量为59kd；3：未纯化的VP1-GST融合蛋白；一抗为鼠源抗 EV71血清。
[0041] 图7：纯化的VP179-432蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP179-432-GST融合蛋白，VP179-432-GST融合蛋白的分子量约为39kd；2-3：纯化的VP179-432-GST融合蛋白；4：阴性对照；一抗为鼠源抗EV71血清。
[0042] 图8：纯化的VP1436-864蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP1436-864-GST融合蛋白，VP1436-864-GST融合蛋白的分子量约为40kd；2：纯化的VP1436-864-GST融合蛋白；3：阴性对照；一抗为鼠源的抗EV71血清。
[0043] 图9：纯化的VP1436-735蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP1436-735-GST融合蛋436-735 436-735
白，VP1 -GST融合蛋白的分子量约为40kd；2：纯化的VP1 -GST蛋白；3：阴性对照；一抗为鼠源的抗EV71血清。
白，VP1 -GST融合蛋白的分子量约为40kd；2：纯化的VP1 -GST蛋白；3：阴性对照；一抗为鼠源的抗EV71血清。
[0044] 图10：纯化的VP1565-864蛋白抗原性检测结果；图中，1：未纯化的VP1565-864-GST融合蛋白，VP1565-864-GST融合蛋白的分子量约为37kd；2：纯化的VP1565-864-GST蛋白；3：阴性对照；一抗为鼠源的抗EV71血清。
[0045] 图11：VP1蛋白及免疫原性多肽的免疫原性的鉴定结果；图中，1、2、3分别为EV71 病毒，阴性对照及蛋白marker。阴性对照为RD细胞离心后上清。
具体实施方式
[0046] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0047] 下述实施例中所用到的实验材料和试剂如下：
[0048] 1.实验材料：
[0049] 1.1细胞、病毒及实验动物
[0050] 所用细胞为人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cells，RD)。RD细胞生长至对数生长期时接种EV71 SDLY107病毒，待细胞病变至80％左右时，-40℃和室温之间反复冻融三次后 4℃10,000r/min离心10分钟取上清，收获病毒并储存于-80℃冰箱中。Balb/c小鼠共25只，昆明鼠5只，购自山东大学实验动物中心。
[0051] 1.2实验试剂
[0052] 所用主要试剂为病毒RNA提取试剂盒(OMEGA，中国)、逆转录试剂盒(TOYOBO，日本)、DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(OMEGA，中国)；细胞培养基、血清(HyClone，美国)；LA Taq酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker(Takara，中国)；限制性内切酶、蛋白 Marker(Thermo，美国)；PVDF膜(Millipore,美国)；5×蛋白上样缓冲液(碧云天，中国)； BCA蛋白定量试剂盒(艾德莱，中国)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG、浓缩型DAB试剂盒(中杉金桥，中国)；GST单克隆抗体(Proteintech，美国)；TMB单组份显色液(索莱宝，中国)； GST琼脂糖凝胶(康为世纪，中国)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；测序由上海博尚生物技术公司完成。
[0053] 实施例1：肠道病毒71型的VP1抗原的免疫原性多肽的表达和纯化
[0054] 1.扩增EV71 SDLY107株病毒的cDNA
[0055] 使用OMEGA公司的Viral RNA kit试剂盒提取SDLY107株病毒的RNA，病毒株 SDLY107分离自山东省临沂市人民医院死亡的手足口病患儿，经鉴定为强毒株(毒株感染细胞后，细胞病变快而强，动物病理特征明显)，毒株已经进行全序列分析(GenBank: JX244186.1)，使用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR Kit逆转录生成cDNA。
[0056] 2.引物设计与PCR扩增
[0057] 以SDLY107全长cDNA为PCR模板，设计PCR扩增的引物，引物序列如表1所示：
[0058] 表1引物序列
[0059]
[0060] 以SDLY107全长cDNA为PCR模板，SpeI VP1 Primer F为上游引物，HindIII VP1 Primer R为下游引物扩增SDLY107毒株的VP1全长基因(如SEQ ID NO.6所示)；以1 VP1 SpeI Primer F/1 VP1 HindIII Primer R、2 VP1 SpeI Primer F/2 VP1 HindIII Primer R、3 VP1 SpeI Primer F/3 VP1 HindIII Primer R及4VP1 SpeI Primer F/4VP1 HindIII Primer R为引物扩增4段 VP1基因片段，即：VP179-432(如SEQ ID NO.7所示)、VP1436-864(如436-735 565-864
SEQ ID NO.8所示)、 VP1 (如SEQ ID NO.9所示)、VP1 (如SEQ ID NO.10所示)。
SEQ ID NO.8所示)、 VP1 (如SEQ ID NO.9所示)、VP1 (如SEQ ID NO.10所示)。
[0061] PCR条件：94℃预变性10min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；72℃终末延伸10min共30个循环。
[0062] 3.表达载体的构建
[0063] SpeI和HindIII双酶切pET-49b(+)载体及“2.引物设计与PCR扩增”中所得DNA片段：SpeI 与HindIII FastDigest enzyme各2μL，DNA片段10μg，10×FastDigest Green Buffer 5μl，水补齐至50μl，37℃酶切4h。胶回收酶切片段，T4连接酶连接过夜获得重组质粒pET-49b(+)-VP1、 pET-49b(+)-VP179-432、pET-49b(+)-VP1436-864、pET-49b(+)-VP1436-735、pET-49b(+)-VP1565-864。
[0064] 4.VP1蛋白及免疫原性多肽的表达及鉴定
[0065] 将上述所构建的重组质粒10μL转化至100μL大肠杆菌DE3中，加入LB液体培养基 890μL，37℃160rpm 1h后，取100μL菌液均匀涂布于固体琼脂培养基，37℃过夜。次日挑取经卡那霉素(30μg/ml)筛选阳性菌落，接种于5mL LB(含卡那霉素)液体培养基中，37℃
160rpm震荡培养过夜；次日按比例1:100接种于新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD 值达到0.8-1.0时，加入异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)0.33mmol/L,继续培养4-5h，取1mL菌液，4℃10000r/min离心2min收集菌体，加入80μL磷酸盐缓冲液(PBS)将菌体重悬，上述样品按1：4加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后沸水浴7min，4℃10000r/min 离心
2min，取上清进行电泳后，将菌液蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉封闭40min；一抗用兔源的抗GST抗体(1:5000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1:5000)，室温孵育30min,TBST洗膜3次后加DAB显色观察结果。结果分别如图1-图5所示。如图所示，以IPTG浓度为0.33mmol/L，诱导表达4-5h 后，蛋白表达量较高。
160rpm震荡培养过夜；次日按比例1:100接种于新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD 值达到0.8-1.0时，加入异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)0.33mmol/L,继续培养4-5h，取1mL菌液，4℃10000r/min离心2min收集菌体，加入80μL磷酸盐缓冲液(PBS)将菌体重悬，上述样品按1：4加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后沸水浴7min，4℃10000r/min 离心
2min，取上清进行电泳后，将菌液蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉封闭40min；一抗用兔源的抗GST抗体(1:5000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1:5000)，室温孵育30min,TBST洗膜3次后加DAB显色观察结果。结果分别如图1-图5所示。如图所示，以IPTG浓度为0.33mmol/L，诱导表达4-5h 后，蛋白表达量较高。
[0066] 5.VP1蛋白及免疫原性多肽的纯化
[0067] 离心收集IPTG诱导的表达菌体，PBS重悬菌体(每50mL菌体加3mLPBS)，按照1:100 比例加入100mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)冰浴中超声破碎，10000r/min离心，弃上清，将沉淀重悬于19.7mL Buffer A(Tris-base：50mM、EDTA：0.5mM、NaCl：50mM、甘油： 5％、DTT 5mM)及0.3mL 20％的十二烷基肌氨酸钠(SKL)贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置至包涵体溶解；4℃10000r/min离心10分钟，取上清；加20％聚乙二醇(PEG4000) 210ul及
50mM的氧化型谷胱甘肽420ul，加100mM的还原型谷胱甘肽420ul，静置30min至2h，以PBS(pH8.0)透析，然后用抗GST亲和层析柱纯化，操作过程严格遵守说明书。蛋白浓度测定使用BCA蛋白定量试剂盒。
50mM的氧化型谷胱甘肽420ul，加100mM的还原型谷胱甘肽420ul，静置30min至2h，以PBS(pH8.0)透析，然后用抗GST亲和层析柱纯化，操作过程严格遵守说明书。蛋白浓度测定使用BCA蛋白定量试剂盒。
[0068] 实施例2：VP1蛋白及免疫原性多肽的抗原性鉴定
[0069] 1.Western Blot法鉴定抗原性：
[0070] 将实施例1制备的蛋白样品按1:4加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后沸水浴7min， 4℃10000r/min离心2min，取上清进行电泳后，将菌液蛋白转移至硝酸纤维素膜上，
5％脱脂奶粉封闭40min；一抗用鼠源的抗EV71多抗(1:5000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:5000)，室温孵育30min，TBST洗膜3 次后加DAB显色观察结果。同时将pET-49b(+)空载体转化至DE3大肠杆菌诱导表达产物作为阴性对照。结果分别如图6-图10所示。如图所示，蛋白纯化效果较好，经鉴定，纯化的蛋白均具有抗原性。
5％脱脂奶粉封闭40min；一抗用鼠源的抗EV71多抗(1:5000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:5000)，室温孵育30min，TBST洗膜3 次后加DAB显色观察结果。同时将pET-49b(+)空载体转化至DE3大肠杆菌诱导表达产物作为阴性对照。结果分别如图6-图10所示。如图所示，蛋白纯化效果较好，经鉴定，纯化的蛋白均具有抗原性。
[0071] 2.ELISA法鉴定抗原性：
[0072] 将实施例1制备的蛋白样品包被于ELISA包被板上，每种蛋白设立两个稀释度，使用包被缓冲液进行稀释(包被缓冲液：每1L蒸馏水中含Na2CO3:1.59g,NaHCO3:2.93g)，第一个稀释度蛋白浓度为：2.08×10-2mg/mL，第二个稀释度蛋白浓度为：1.04×10-2mg/mL；蛋白包被后 4℃过夜；次日PBST洗板3次，每次3min；5％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭1h；PBST 洗板3次，每次3min；一抗用鼠源的抗EV71多抗(1：5000)37℃孵育2h；PBST洗板6次，每次3min；二抗加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(1：5000)，37℃孵育1h； PBST洗板
6次，每次3min；TMB单组份显色液显色。同时将pET-49b(+)空载体转化至DE3 大肠杆菌诱导表达产物作为阴性对照。检测结果如表2所示。
6次，每次3min；TMB单组份显色液显色。同时将pET-49b(+)空载体转化至DE3 大肠杆菌诱导表达产物作为阴性对照。检测结果如表2所示。
[0073] 表2 ELISA法鉴定抗原性检测结果
[0074]
[0075]
[0076] 如表2所示，以GST蛋白为阴性对照，无论稀释度1或稀释度2，VP1抗原及其免疫原性多肽的A值较GST蛋白的A值有2倍以上增长，鉴定为阳性结果，即所纯化的蛋白具有抗原性。
[0077] 实施例3：VP1蛋白及免疫原性多肽的免疫原性的鉴定
[0078] 将实施例1纯化后的VP1蛋白及免疫原性多肽与弗氏佐剂按照体积比1:1比例混匀后免疫Balb/c小鼠，每种蛋白免疫5只小鼠，共免疫4次。初次免疫1.0mg蛋白加弗式完全佐剂， 2周后免疫0.5mg蛋白加弗氏不完全佐剂，之后间隔1周连续免疫0.5mg蛋白加弗氏不完全佐剂两次，于末次免疫一周后摘眼球取血；同时使用pET-49b(+)空载体表达蛋白免疫小鼠取血作为阴性对照。Western Blot检测血清与EV71病毒是否能够发生特异性反应，以检测蛋白免疫原性。结果如图11所示。
[0079] 如图所示，将RD细胞培养的EV71病毒加入聚丙烯酰胺凝胶的上样孔内，将RD细胞离心所得上清加入上样孔内作阴性对照，以纯化的VP1蛋白及其多肽免疫BALB/c小鼠后所得血清为一抗，EV71病毒、VP1-GST融合蛋白、VP179-432-GST融合蛋白、VP1436-864GST融合蛋白、VP1436-735-GST融合蛋白及VP1565-864-GST融合蛋白免疫小鼠后所得血清能与EV71病毒发生特异性结合，图中所示条带分子量约为35KD(EV71结构蛋白VP1)；GST蛋白免疫小鼠所得血清也能与EV71病毒发生特异性结合，但是图中所示条带分子量大小非EV71结构蛋白VP1；PBS免疫小鼠所得血清与EV71病毒无特异性结合(阴性对照)。
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