降低前ADAM10分泌酶和/或β分泌酶水平的方法
阅读：488发布：2020-12-19
专利汇可以提供降低前ADAM10分泌酶和/或β分泌酶水平的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了降低个体中前ADAM 10和/或BACE蛋白的 水 平的方法，该方法包括向有需要的个体给予杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药。，下面是降低前ADAM10分泌酶和/或β分泌酶水平的方法专利的具体信息内容。
1.具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在降低有需要的个体中的前ADAM10和/或BACE蛋白水平中的用途：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基；和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述杂环化合物为螺(咪唑并(1，2-a)吡
啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述个体患有阿尔茨海默病。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述个体被诊断为阿尔茨海默病。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述个体患有包涵体肌炎。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述个体患有阿尔茨海默病相关的病理学介导的唐氏综合征性认知功能减退。
7.化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在降低有需要的个体中的前ADAM10和/或BACE蛋白水平中的用途，所述化合物不是具有通式(I)的化合物：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基；和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述个体患有阿尔茨海默病。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述个体被诊断为阿尔茨海默病。
10.如权利要求7所述的用途，其中所述个体患有炎性疾病。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述个体被诊断为炎性疾病。
12.如权利要求7所述的用途，其中所述个体患有癌症。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述个体被诊断为癌症。
14.如权利要求7所述的用途，其中所述个体患有囊性纤维化。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述个体被诊断为囊性纤维化。
16.如权利要求1所述的用途，其中所述个体患有过敏性疾病。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述个体被诊断为过敏性疾病。
18.具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在降低有需要的个体中的tau蛋白积累中的用途：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基；和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述杂环化合物为螺(咪唑并(1，2-a)吡
啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
20.如权利要求18所述的用途，其中所述个体患有阿尔茨海默病。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述个体被诊断为阿尔茨海默病。
22.具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在治疗或预防有需要的个体中的炎症中的用途：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基；和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述杂环化合物为螺(咪唑并(1，2-a)吡
啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
24.如权利要求22所述的用途，其中所述个体患有炎性疾病。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述个体被诊断为炎性疾病。
26.具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在治疗有需要的个体中的过度增生性疾病中的用途：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中在用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基；和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述杂环化合物为螺(咪唑并(1，2-a)吡
啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
28.如权利要求26所述的用途，其中所述过度增生性疾病为癌症。
29.如权利要求26所述的用途，其中所述癌症被治疗。
30.如权利要求26所述的用途，其中所述个体被诊断为癌症。
31.具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在治疗或预防有需要的个体中的囊性纤维化中的用途：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
(IV)
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基；和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9是选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述杂环化合物为螺(咪唑并(1，2-a)吡
啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
33.如权利要求31所述的用途，其中所述个体患有囊性纤维化。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述个体被诊断为囊性纤维化。
35.具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在治疗或预防有需要的个体中的过敏症中的用途：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
(IV)
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
36.如权利要求35所述的用途，其中所述杂环化合物为螺(咪唑并(1，2-a)吡
啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
37.如权利要求35所述的用途，其中所述个体患有一种或多种过敏症。
38.如权利要求35所述的用途，其中所述个体被诊断为一种或多种过敏症。
39.化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药在降低有需要的个体中的tau蛋白积累中的用途，所述化合物不是具有通式(I)的化合物：
其中
Rx为甲基或无；
R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5和-O-(CH2)n-R6；
R3和R4为
(i)独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5和-CH(R8)-R7；或
(ii)R3和R4一起形成通式(IV)的螺环：
其中B可以为选自具有式(V)的多种结构单元中的一种或多种结构单元，
所述结构单元B在所述式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环；并且
R5为萘基、噻吩基或苯基，其可以被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代；
R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1；
R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，其任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基和呋喃基；
R8为氢原子或C1-C6烷基；并且
R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基，并且
其中所述化合物不是第PCT/US2006/026331号国际申请所公开的化合物。
40.如权利要求39所述的用途，其中所述个体患有阿尔茨海默病。
41.如权利要求30所述的用途，其中所述个体被诊断为阿尔茨海默病。
42.分离的约32kDa的磷酸化的tau蛋白片段。
43.筛选降低前ADAM10和/或BACE水平的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将表达前ADAM10和/或BACE的细胞或组织暴露于测试化合物，并且
(b)检测所述细胞或组织中前ADAM10和/或BACE的量，
其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中前ADAM10和/或BACE蛋白的量，暴露于所述化合物的细胞或组织中前ADAM10和/或BACE蛋白的量的降低，表明所述化合物降低前ADAM10和/或BACE蛋白的量。
44.筛选降低tau蛋白积累的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将积累tau蛋白的细胞或组织暴露于测试化合物，并且
(b)检测所述细胞或组织中积累的tau蛋白的量，
其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中tau蛋白积累的量，暴露于所述化合物的细胞或组织中tau蛋白积累的量的降低，表明所述化合物降低tau蛋白积累的量。
45.筛选降低tau蛋白积累的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将积累tau蛋白的细胞或组织暴露于测试化合物，并且
(b)检测所述细胞或组织中积累的tau蛋白的量，
其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中的tau蛋白积累，暴露于所述化合物的细胞或组织中tau蛋白积累的量的缺乏，表明所述化合物降低tau蛋白积累的量。
降低前ADAM10分泌酶和/或β分泌酶水平的方法
发明领域
[0001] 本发明涉及淀粉样前体蛋白(APP)加工的调节。
[0002] 发明背景
[0003] 阿尔茨海默病(AD)是神经退行性疾病，对其仅具有有限功效的对症治疗。APP的某些淀粉样β(Aβ)片段，尤其是Aβ1-40和Aβ1-42与AD的病理学有牵连。Aβ的减少已被用作缓解AD进程的方法(Barten，D.and C.Albright，MoL Neurobiol.37：171-186(1998))。然而，迄今为止，这种方法没有产生被认可的疗法。
[0004] 已经尝试通过针对Aβ的主动和被动免疫来治疗AD。一种这类免疫方法已经在人体测试中失败(Holmes，C.et al.，Lancet 372：216-23(2008))。Aβ免疫疗法的限制可能是其仅针对已经形成的Aβ。该疗法不能减缓或停止新的Aβ的产生，并且，事实上可能甚至激发新的Aβ的产生增加。
[0005] 治疗AD的其他尝试涉及在有害Aβ片段产生之前阻断APP加工中的已知酶。这些酶的靶标是γ分泌酶和β分泌酶。γ分泌酶抑制剂未被证实有用，因为许多这类抑制剂影响其他γ分泌酶底物的切割并因此是有毒的(Czirr，E.and S.Weggen，Neurodegenerative Dis.3：298-302(2006)；Tomita，T.，Nauyn-Schmiedegerg ′ s Arch.Pharmacol.377：295-300(2008))；Milano，J.et al.，Toxicological Sciences 82：341-358(2004))。
[0006] γ分泌酶调节剂也未被证实有用。γ分泌酶调节剂的实例包括非甾体类抗炎药(NSAID)，其是γ分泌酶的别构调节剂。这类化合物无毒，但是已经进入临床测试的化合物在体外效力中仅有高的微摩尔量，因此他们太弱而不能具有足够的临床效应。原型γ分泌酶调节剂——Flurizan最近在三期临床试验中失败。
[0007] 此外，用β分泌酶抑制剂治疗AD的现有尝试未被证实有用，因为β分泌酶的大的结合袋以及其膜定位对设计以足够有用的量跨越血脑屏障的抑制剂制造难题。
[0008] 因此，领域内仍然需要AD的有效治疗。
[0009] 推定的α分泌酶ADAM10是在多种生理过程中起重要作用的表面表达的金属蛋白酶。已知其在邻近细胞膜的细胞外位点切割底物，导致该底物的可溶性胞外域的释放。具有靶向破坏的adam10基因的小鼠已经表明，该蛋白酶对于发育是关键的，而近期的体外研究表明ADAM10参与多种疾病和修复功能。参见Pruessmeyer，J.and Ludwig，A.，Semin.Cell & Dev.Biol.1-11(2008)。
[0010] 急性和慢性炎症反应是由细胞因子驱动，细胞因子转而驱动促炎性分子的基因表达，所述促炎性分子例如参与白细胞募集的趋化因子和粘附分子。已经发现一种主要的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)是ADAM10的底物。ADAM10的其他促炎性底物包括Notch、IL-6受体、CX3CL1、CXCL16、JAM-A、VE钙粘附蛋白和Fas配体。参见Pruessmeyer，J.and Ludwig，A.，Semin.Cell & Dev.Biol.1-11(2008)。因此，ADAM10活性的下调可以导致对炎症反应的控制。
[0011] ADAM10的超表达与癌症相关，例如前列腺癌、结肠癌和鳞状细胞癌。此前，金属蛋白酶由于促进肿瘤细胞接近血管和淋巴系统而已经与肿瘤侵袭相关。最近，已经证实ADAM10参与早期肿瘤发生事件，例如通过释放的生长因子或从免疫监视逃逸而刺激增殖。已知参与肿瘤发生的ADAM10底物包括EGF、乙胞素、ErbB2/HER2、CD44、Des 2、MICA和CD30。
参见Pruessmeyer，J.and Ludwig，A.，Semin.Cell & Dev.Biol.1-11(2008)。因此，ADAM10的下调可以通过减少生长因子、粘附分子和帮助癌症逃避免疫监控的分子的流出而导致对早期肿瘤发生的控制。
参见Pruessmeyer，J.and Ludwig，A.，Semin.Cell & Dev.Biol.1-11(2008)。因此，ADAM10的下调可以通过减少生长因子、粘附分子和帮助癌症逃避免疫监控的分子的流出而导致对早期肿瘤发生的控制。
[0012] 而且，已经表明ADAM切割低亲和性IgE(CD23)受体。参见Lemieux，G.A.et al.，J.Biol.Chem.282：14，836-44(2007) 和 Weskamp et al.，Nature Immunol.7：1293-98(2006)。因此，ADAM10的下调可以导致对过敏性反应的控制。
[0013] 而且，已经表明ADAM10参与介导囊性纤维化患者中粘蛋白基因表达的革兰氏阳性菌活化，导致粘液的过度产生，而粘液通过阻塞气流和保护细菌免受抗生素而使发病率和死亡率增加。参见Lemjabber，H.and C.Basbaum，Nature Medicine 8：41-46(2002)。因此，ADAM的下调可以导致对囊性纤维化患者中的粘液过度产生的控制。
[0014] 发明简述
[0015] 本发明提供了诱导个体中淀粉样前体蛋白的切割，以产生约17千道尔顿(kDa)的淀粉样前体蛋白的羧基末端片段的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0016]
[0017] 其中，所述约17kDA的片段包含淀粉样前体蛋白的羧基末端氨基酸序列和淀粉样β氨基酸序列，其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文所定义。
[0018] 本发明还提供了约17kDa的淀粉样前体蛋白片段，其包含淀粉样前体蛋白的羧基末端氨基酸序列和淀粉样β氨基酸序列。
[0019] 本发明还提供了筛选化合物的方法，所述化合物切割淀粉样前体蛋白以产生淀粉样前体蛋白的约17kDa的片段，所述方法包括：(a)将产生淀粉样前体蛋白或其片段的细胞暴露于测试化合物，和(b)检测所述约17kDa的片段的量，其中所述约17kDa的片段包含淀粉样前体蛋白的羧基末端氨基酸序列和淀粉样β氨基酸序列，并且其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞中的约17kDa的片段的量，暴露于所述化合物的细胞中的约17kDa的片段的量的增加，表明所述化合物切割淀粉样前体蛋白以产生所述约17kDa的片段。
[0020] 本发明提供了诱导个体中淀粉样前体蛋白的切割，以产生约17kDa的淀粉样前体蛋白的羧基末端片段的方法，所述方法包括给予化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药，所述化合物不是具有通式(I)的化合物：
[0021]
[0022] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0023] 本发明还提供了降低个体中前ADAM10和/或BACE蛋白的水平的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0024]
[0025] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0026] 本发明还提供了筛选降低前ADAM10和/或BACE水平的化合物的方法，所述方法包括：(a)将表达前ADAM10和/或BACE的细胞或组织暴露于测试化合物，和(b)检测所述细胞或组织中前ADAM10和/或BACE的量，其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中的前ADAM10和/或BACE蛋白的量，暴露于所述化合物的细胞或组织中的前ADAM10/和或BACE蛋白的量的降低，表明所述化合物降低前ADAM10和/或BACE蛋白的量。
[0027] 本发明还提供了降低个体中前ADAM10和/或BACE蛋白的水平的方法，所述方法包括向有需要的个体给予杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药，所述杂环化合物不是具有通式(I)的化合物：
[0028]
[0029] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0031] 本发明还提供了降低个体中tau蛋白积累的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0032]
[0033] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0034] 本发明还提供了筛选降低tau蛋白积累的化合物的方法，所述方法包括：(a)将积累tau蛋白的细胞或组织暴露于测试化合物，和(b)检测所述细胞或组织中积累的tau蛋白的量，其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中tau蛋白积累的量，暴露于所述化合物的细胞中tau蛋白积累的量的降低，表明所述化合物降低tau蛋白积累的量。
[0035] 本发明还提供了降低个体中tau蛋白积累的方法，所述方法包括向有需要的个体给予杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药，所述杂环化合物不是具有通式(I)的化合物：
[0036]
[0038] 本发明还提供了治疗或预防个体中炎症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0039]
[0040] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0041] 本发明还提供了治疗或预防个体中囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0042]
[0043] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0044] 本发明还提供了治疗或预防个体中过敏症的方法，所述方法包括在向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0045]
[0046] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0047] 本发明还提供了治疗个体中过度增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0048]
[0049] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0051] 图1A和1B是显示化合物ST101对Neuro2a(N2a)细胞的Aβ产生的影响的柱状图。图1A是显示在处理后24小时，相对于对照，细胞培养基中的Aβ浓度与ST101浓度的函数的柱状图。图1B是显示相对于对照，Aβ1-42与Aβ1-40的比与ST101浓度的函数的柱状图。
[0052] 图2A、2B和2C是显示ST101对Morris水迷宫中3xTg-AD小鼠的影响的图表。图2A是显示相对于对照小鼠，在七天的训练期间执行时间(以秒为单位)的图。图2B和2C是显示训练后24小时和72小时，ST101处理的动物和对照小鼠的执行时间(以秒为单位)和穿过平台位置的次数。
[0053] 图3A和3B是显示ST101对来自3xTg-AD小鼠的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图3A显示了相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠的脑组织中可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的量。图3B是显示相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠中不溶性Aβ1-40和Aβ1-42(甲酸提取)的量的柱状图。
[0054] 图4是显示相对于未处理的(C)3xTg-AD小鼠，用ST101处理的(S)3xTg-AD小鼠的脑中通过抗体CT20检测APP羧基末端片段的免疫印迹。
[0055] 图5是显示相对于未处理的(C)3xTg-AD小鼠，用ST101处理的(S)3xTg-AD小鼠的脑中通过抗体CT20检测到的APP和降解片段的免疫印迹。*指示全长APP种类，**指示主要的降解产物，并且“肌动蛋白”代表抗β肌动蛋白抗体，作为蛋白内参对照。
[0056] 图6是显示导致新的淀粉样前体蛋白羧基末端片段的推定的淀粉样蛋白加工途径的图。
[0057] 图7A和7B是显示ST101对来自3xTg-AD小鼠的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图7A显示了相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠的脑组织中可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的量。图7B是显示相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠中不溶性Aβ1-40和Aβ1-42(甲酸提取)的量的柱状图。*表示与对照动物在统计学上差异显著。
[0058] 图8A和8B是显示ST101对来自3xTg-AD小鼠的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图8A显示了相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠的脑组织中可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的量。图8B是显示相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠中不溶性Aβ1-40和Aβ1-42(甲酸提取)的量的柱状图。
[0059] 图9是显示ST101对来自食蟹猴的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图9显示了相对于对照猴，用ST101处理的猴中Aβ1-40的水平。
[0060] 图10A-10D是显示相对于未处理的(C)3xTg-AD小鼠，ST101处理的(图10A中的T，图10B-10C中的S)3xTg-AD小鼠的脑中检测APP羧基末端片段的免疫印迹。在图10A和10B中，使用CT20抗体。图10B是来自与图10A的实验使用相同的脑提取物的分离试验。
在图10C和10D中，使用APPC末端抗体(Eptitomics#：1565-1)。图10D是图10C中免疫印迹的更亮的曝光。
在图10C和10D中，使用APPC末端抗体(Eptitomics#：1565-1)。图10D是图10C中免疫印迹的更亮的曝光。
[0061] 图11A是显示与对照小鼠(C)相比，来自ST101处理的3xTG-AD小鼠(S)的脑提取物中前ADAM10、ADAM10、前BACE、BACE、早衰蛋白1和APP-CFT的水平的一系列免疫印迹。图11B显示通过光密度测定法对来自图11A的免疫印迹条带进行定量。
[0062] 图12是显示与对照小鼠(C)相比，来自ST101处理的3xTG-AD小鼠(S)的脑提取物中全长tau水平、tau降解产物和磷酸化的tau水平的一系列免疫印迹。β肌动蛋白水平(Ac)被用作内参对照。
[0063] 图13是显示ST101对来自3xTgAD小鼠的脑组织中sAPP-β的影响的免疫印迹。
[0064] 图14是显示ST101对来自3xTgAD小鼠的脑组织中TACE的影响的免疫印迹。
[0065] 发明详述
[0066] 除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的具有相同的含义。
[0067] 本发明提供了诱导个体中APP的切割，以产生APP的约17kDa的羧基末端片段的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0068]
[0069] 其中所述约17kDa的片段包含APP的羧基末端氨基酸序列和淀粉样β氨基酸序列。
[0070] 在另一实施方案中，给予具有通式(I)的杂环化合物导致以下一种或多种的产生降低：Aβ1-42、Aβ1-40、APP的C99片段和/或APP的C83片段。
[0071] 在另一实施方案中，给予具有通式(I)的杂环化合物导致Aβ的降低。
[0072] 在另一实施方案中，所述个体患有阿尔茨海默病相关的病理学介导的唐氏综合征性认知功能减退。在另一实施方案中，所述阿尔茨海默病相关的病理学介导的唐氏综合征性认知功能减退被治疗。在另一实施方案中，所述阿尔茨海默病相关的病理学介导的唐氏综合征性认知功能减退被预防。
[0073] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有AD。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。在另一实施方案中，所述个体患有轻度认知功能损伤。在另一实施方案中，所述个体被诊断为轻度认知功能损伤。
[0074] 在另一实施方案中，所述AD被治疗。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被治疗。如本文所用的，“治疗”是指其中疾病状态、病症或疾病的症状被改善或者以其它方式被有益地改变的任何方式。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。
[0075] 在一实施方案中，所述AD被预防。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被预防。如本文所用的，“预防”AD或认知功能损伤是指预防个体中AD的一种或多种症状的发生。
[0076] 如本文所用的，通过给予特定药物组合物来改善特定病症的症状是指归功于所述化合物的给药或与之有联系的任何减轻，不管是永久的还是临时的、持续的还是短暂的。
[0077] 在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否患有AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0078] 在另一实施方案中，所述个体被诊断为易患AD。在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否倾向于发展成AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD素因的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0079] 本发明还提供了分离的约17kDa的APP片段，其包含APP的羧基末端氨基酸序列和淀粉样β氨基酸序列。
[0080] 本发明还提供了包含本发明的约17kDA的片段的组合物。在另一实施方案中，所述组合物还包含细胞培养物裂解物和/或培养基。
[0081] 本发明还提供了包含本发明的约17kDA的片段的容器。在另一实施方案中，所述容器是微型管。在另一实施方案中，所述容器是试管。在另一实施方案中，所述容器是移液管或微量移液管。在另一实施方案中，所述容器是微阵列装置。在另一实施方案中，所述容器是微量滴定板。在另一实施方案，所述容器是筛选测定仪器的组件。
[0082] 本发明还提供了筛选切割APP以产生APP的约17kDa的片段的化合物的方法，所述方法包括：(a)将产生APP或其片段的细胞暴露于测试化合物，和(b)检测所述约17kDa的片段的量，其中所述约17kDa的片段包含APP的羧基末端氨基酸序列和淀粉样β氨基酸序列，其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞中的约17kDa的片段的量，暴露于所述化合物的细胞中的约17kDa片段的量的增加，表明所述化合物诱导APP的切割以产生所述约17kDa的片段。
[0083] 可选地，可以检测约17kDa的片段的自由氨基末端的存在，或可以检测通过产生17kDa的片段的切割所产生的APP的自由羧基末端。
[0084] 本发明还提供了筛选切割APP以产生APP的约17kDa的片段的化合物的方法，所述方法包括：(a)将产生APP或其片段的细胞暴露于测试化合物，和(b)检测所述约17kDa的片段，其中所述约17kDa的片段包含APP的羧基末端氨基酸序列和淀粉样β氨基酸序列，其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞中不存在约17kDa的片段，暴露于所述化合物的细胞中的约17kDa片段的存在，表明所述化合物诱导APP的切割以产生所述约17kDa的片段。
[0085] 在一个实施方案中，所述方法还包括(c)测定暴露于所述化合物的细胞中Aβ1-42、Aβ1-40、APP的C99片段或APP的C83片段中的一种或多种的量相对于未暴露于所述化合物的细胞中Aβ1-42、Aβ1-40、APP的C99片段或APP的C83片段的量是否降低。
[0086] 在另一实施方案中，本发明的筛选方法在体外进行。在该实施方案中，检测暴露于所述化合物的细胞的细胞培养物和未暴露于所述化合物的细胞的细胞培养物中约17kDa的片段的量。相对于未暴露于所述化合物的细胞的细胞培养物中约17kDa的片段的量，暴露于所述化合物的细胞的细胞培养物中约17kDa的片段的量的增加，表明所述化合物切割APP以产生所述约17kDa的片段。
[0087] 例如，可以使用凝胶电泳检测所述所述约17kDa的APP片段、Aβ1-42、Aβ1-40、APP的C99片段或APP的C83片段。还可以使用夹心ELISA测定检测所述约17kDa的APP片段、Aβ1-42、Aβ1-40、APP的C99片段或APP的C83片段，所述夹心ELISA测定利用针对所述
17kDa的片段的N末端的第一单克隆抗体和针对所述约17kDa的片段的另一区域(例如，所述17kDa的片段的羧基末端)的第二单克隆抗体。
17kDa的片段的N末端的第一单克隆抗体和针对所述约17kDa的片段的另一区域(例如，所述17kDa的片段的羧基末端)的第二单克隆抗体。
[0088] 例如，还可以使用伴有或不伴有抗体的前免疫沉淀的质谱法检测所述约17kDa的APP片段、Aβ1-42、Aβ1-40、APP的C99片段或APP的C83片段。
[0089] 在另一实施方案中，分离所述约17kDa的片段。本文所用的术语“分离”是指从个体的脑中分离。在另一实施方案中，所述约17kDa的片段存在于电泳凝胶中。在另一实施方案中，所述约17kDa的片段存在于细胞培养物裂解物或培养基中。
[0090] APP的“约17kDa的片段”是包含APP的C末端序列和APP的淀粉样β序列的APP片段。所述约17kDa的片段不是APP的C99片段或APP的C83片段。
[0091] 本发明还提供了诱导个体中APP的切割，以产生APP的约17kDa的羧基末端片段的方法，所述方法包括给予化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药，所述化合物不是具有通式(I)的化合物：
[0092]
[0093] 在一个实施方案中，所述化合物不是美国申请第11/872,408号(公开为US2008/0103157 A1)、美国专利申请第11/872,418号(公开为US 2008/0103158 A1)、美国专利第6,635,652号、美国专利第7,141,579号和第PCT/JP2007/070962号国际申请(公开为WO 2008/047951)中的任何一个所公开的化合物，通过引用将每个文件以其整体并入本文。
在另一实施方案中，所述化合物不是螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
在另一实施方案中，所述化合物不是螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2’-茚满)。
[0094] 在另一实施方案中，给予化合物导致以下一种或多种的产生降低，所述化合物不是具有通式(I)的化合物：Aβ1-42、Aβ1-40、APP的C99片段和/或APP的C83片段。
[0095] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有AD。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。在另一实施方案中，所述个体患有轻度认知功能损伤。在另一实施方案中，所述个体被诊断为轻度认知功能损伤。
[0096] 在另一实施方案中，所述AD被治疗。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被治疗。如本文所用的，“治疗”是指其中疾病状态、病症或疾病的症状被改善或者以其它方式被有益地改变的任何方式。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。
[0097] 在一个实施方案中，所述AD被预防。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被预防。如本文所用的，“预防”AD或认知功能损伤是指预防个体中AD的一种或多种症状的发生。
[0098] 如本文所用的，通过给予特定药物组合物来改善特定病症的症状是指归功于所述化合物的给药或与之有联系的任何减轻，不管是永久的还是临时的、持续的还是短暂的。
[0099] 在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否患有AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0100] 在另一实施方案中，所述个体被诊断为易患AD。在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否倾向于发展成AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD素因的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0101] 本发明还提供降低个体中前ADAM10和/或BACE蛋白水平的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0102]
[0103] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0104] 在一个实施方案中，前ADAM10的水平被降低。在一个实施方案中，BACE的水平被降低。在另一实施方案中，前ADAM10的水平和BACE的水平均被降低。
[0105] 例如，可以分别使用对前ADAM10和BACE特异的抗体在免疫印迹中测定前ADAM10和BACE的水平。
[0106] 在一个实施方案，个体脑中的前ADAM10和/或BACE蛋白的水平被降低。
[0107] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有AD。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。在另一实施方案中，所述个体患有轻度认知功能损伤。在另一实施方案中，所述个体被诊断为轻度认知功能损伤。
[0108] 在另一实施方案中，所述AD被治疗。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被治疗。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。
[0109] 在一个实施方案中，所述AD被预防。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被预防。
[0110] 在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否患有AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0111] 在另一实施方案中，所述个体被诊断为易患AD。在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否倾向于发展成AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD素因的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0112] 在另一实施方案中，所述个体患有包涵体肌炎。在另一实施方案中，所述包涵体肌炎被治疗。在另一实施方案中，所述包涵体肌炎被预防。
[0113] 在另一实施方案中，所述个体患有阿尔茨海默病相关的病理学介导的唐氏综合征性认知功能减退。在另一实施方案中，所述阿尔茨海默病相关的病理学介导的唐氏综合征性认知功能减退被治疗。在另一实施方案中，所述阿尔茨海默病相关的病理学介导的唐氏综合征性认知功能减退被预防。
[0114] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的mRNA转录的降低。
[0115] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的蛋白翻译或前ADAM10和/或BACE的蛋白翻译速率的降低。
[0116] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的翻译后修饰。
[0117] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的降解增加。
[0118] 本发明还提供了筛选降低前ADAM10和/或BACE水平的化合物的方法，所述方法包括：(a)将表达前ADAM10和/或BACE的细胞或组织暴露于测试化合物，和(b)检测所述细胞或组织中前ADAM10和/或BACE的量，其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中的前ADAM10和/或BACE蛋白的量，暴露于所述化合物的细胞或组织中的前ADAM10/和或BACE蛋白的量的降低，表明所述化合物降低前ADAM10和/或BACE蛋白的量。
[0119] 在一个实施方案中，所述筛选方法在体内进行。在另一实施方案中，所述细胞位于动物的脑中。在另一实施方案中，所述筛选方法在体外进行。在另一实施方案中，所述筛选方法在细胞或组织培养物的细胞中进行。在另一实施方案中，所述筛选方法以高通量方式进行。在另一实施方案中，所述筛选方法是计算机控制的。在另一实施方案，所述细胞选自SHSY5Y、HEK、PC12、CHO、成纤维细胞、3T3、IMR-32、BV-2、T98G、NT2N和Neuro2A细胞。在另一实施方案中，所述细胞是Neuro2A细胞。
[0120] 本发明还提供了降低个体中前ADAM10和/或BACE蛋白的水平的方法，所述方法包括向有需要的个体给予杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药，所述杂环化合物不是具有通式(I)的化合物：
[0121]
[0122] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0123] 在一个实施方案中，前ADAM10的水平被降低。在一个实施方案中，BACE的水平被降低。在另一实施方案中，前ADAM10的水平和BACE的水平均被降低。
[0124] 在一个实施方案，个体脑中的前ADAM10和/或BACE蛋白的水平被降低。
[0125] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有AD。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。在另一实施方案中，所述个体患有轻度认知功能损伤。在另一实施方案中，所述个体被诊断为轻度认知功能损伤。
[0126] 在另一实施方案中，所述AD被治疗。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被治疗。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。
[0127] 在一个实施方案中，所述AD被预防。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被预防。
[0128] 在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否患有AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0129] 在另一实施方案中，所述个体被诊断为易患AD。在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否倾向于发展成AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD素因的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0130] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的mRNA转录的降低。
[0131] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的蛋白翻译或前ADAM10和/或BACE的蛋白翻译速率的降低。
[0132] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的翻译后修饰。
[0133] 在另一实施方案中，给予所述杂环化合物导致前ADAM10和/或BACE的降解增加。
[0134] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有炎性疾病。在另一实施方案中，所述个体被诊断为炎性疾病。在另一实施方案中，所述炎性疾病被治疗。在另一实施方案中，所述炎性疾病被预防。
[0135] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有癌症。在另一实施方案中，所述个体被诊断为癌症。在另一实施方案中，所述癌症被治疗。在另一实施方案中，所述癌症被预防。
[0136] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有囊性纤维化。在另一实施方案中，所述个体被诊断为囊性纤维化。在另一实施方案中，所述囊性纤维化被治疗。在另一实施方案中，所述囊性纤维化被预防。
[0137] 在另一实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有过敏性疾病。在另一实施方案中，所述个体被诊断为过敏性疾病。在另一实施方案中，所述过敏性疾病被治疗。在另一实施方案中，所述过敏性疾病被预防。
[0138] 本发明还提供了分离的约32kDa的磷酸化的tau蛋白片段。
[0139] 本发明还提供了包含分离的约32kDa的磷酸化的tau蛋白片段的组合物。在另一实施方案中，所述组合物还包含细胞培养物裂解物和/或细胞培养基。
[0140] 本发明还提供了包含分离的磷酸化的tau蛋白片段的容器。在另一实施方案中，所述容器是微型管。在另一实施方案中，所述容器是试管。在另一实施方案中，所述容器是移液管或微量移液管。在另一实施方案中，所述容器是微阵列装置。在另一实施方案中，所述容器是微量滴定板。在另一实施方案，所述容器是筛选测定仪器的组件。
[0141] 本发明还提供了降低个体中tau蛋白积累的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0142]
[0143] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0144] 例如，可以使用免疫印迹或特异性ELISA测定Tau水平，所述免疫印迹利用对tau特异的抗体。
[0145] 在一个实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有AD。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。在另一实施方案中，所述个体患有轻度认知功能损伤。在另一实施方案中，所述个体被诊断为轻度认知功能损伤。
[0146] 在另一实施方案中，所述AD被治疗。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被治疗。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。
[0147] 在一个实施方案中，所述AD被预防。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被预防。
[0148] 在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否患有AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0149] 在另一实施方案中，所述个体被诊断为易患AD。在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否倾向于发展成AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD素因的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0150] 在另一实施方案中，额颞痴呆被治疗。在另一实施方案中，额颞痴呆被预防。
[0151] 本发明还提供了筛选降低tau蛋白积累的化合物的方法，所述方法包括：(a)将积累tau蛋白的细胞或组织暴露于测试化合物，和(b)检测所述细胞或组织中积累的tau蛋白的量，其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中tau蛋白积累的量，暴露于所述化合物的细胞或组织中tau蛋白积累的量的降低，表明所述化合物降低tau蛋白积累的量。
[0152] 本发明还提供了筛选降低tau蛋白积累的化合物的方法，所述方法包括：(a)将积累tau蛋白的细胞或组织暴露于测试化合物，和(b)检测所述细胞或组织中积累的tau蛋白的量，其中，相对于未暴露于所述化合物的细胞或组织中的tau蛋白积累，暴露于所述化合物的细胞或组织中tau蛋白积累的量的缺乏，表明所述化合物降低tau蛋白积累的量。
[0153] 在一个实施方案中，所述筛选方法在体内进行。在另一实施方案中，所述细胞位于动物的脑中。在另一实施方案中，所述筛选方法在体外进行。在另一实施方案中，所述筛选方法在细胞或组织培养物的细胞中进行。在另一实施方案中，所述筛选方法以高通量方式进行。在另一实施方案中，所述筛选方法是计算机控制的。在另一实施方案，所述细胞选自SHSY5Y、HEK、PC12、CHO、成纤维细胞、3T3、IMR-32、BV-2、T98G、NT2N和Neuro2A细胞、原代神经细胞、原代小胶质细胞和来自野生型或转基因小鼠的器官型片(organotypic slice)培养物。在另一实施方案中，所述细胞是Neuro2A细胞。
[0154] 本发明还提供了降低个体中tau蛋白积累的方法，所述方法包括向有需要的个体给予杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药，所述杂环化合物不是具有通式(I)的化合物：
[0155]
[0156] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义，并且其中所述化合物不是公开为WO2007/008586的第PCT/US2006/026331号国际申请所公开的化合物。
[0157] 在一个实施方案中，被给予具有通式(I)的杂环化合物的个体患有AD。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。在另一实施方案中，所述个体患有轻度认知功能损伤。在另一实施方案中，所述个体被诊断为轻度认知功能损伤。
[0158] 在另一实施方案中，所述AD被治疗。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被治疗。在另一实施方案中，所述个体被诊断为AD。
[0159] 在一个实施方案中，所述AD被预防。在另一实施方案中，所述轻度认知功能损伤被预防。
[0160] 在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否患有AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0161] 在另一实施方案中，所述个体被诊断为易患AD。在另一实施方案中，筛选个体以确定所述个体是否倾向于发展成AD。通过检查个体进行筛选。可选地，通过测定AD素因的一种或多种生物标志物进行筛选。
[0162] 本发明还提供了治疗或预防个体中炎症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0163]
[0164] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0165] 在一个实施方案中，所述个体患有炎性疾病。在另一实施方案中，所述个体被诊断为炎性疾病。在另一实施方案中，所述炎性疾病被治疗。在另一实施方案中，所述炎性疾病被预防。
[0166] 在另一实施方案中，所述炎性疾病选自：银屑病，克罗恩病，类风湿性关节炎，哮喘，自身免疫性疾病，慢性炎症，慢性前列腺炎，肾小球肾炎，过敏症，炎性肠病，盆腔炎，再灌注损伤，类风湿性关节炎，移植排斥反应，包涵体肌炎和血管炎。本发明的方法可以治疗或预防本文未列出的其他炎性疾病。
[0167] 本发明还提供了治疗或预防个体中囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0168]
[0169] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0170] 在一个实施方案中，所述个体患有囊性纤维化。在另一实施方案中，所述个体被诊断为囊性纤维化。在另一实施方案中，所述囊性纤维化被治疗。在另一实施方案中，所述囊性纤维化被预防。
[0171] 在另一实施方案中，所述杂环化合物通过吸入被给药。
[0172] 本发明还提供治疗或预防个体中过度增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0173]
[0174] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0175] 在一个实施方案中，所述过度增生性疾病是癌症。在另一实施方案中，所述癌症被治疗。
[0176] 在另一实施方案中，所述个体被诊断为癌症。在另一实施方案中，所述个体被诊断为易患癌症。在另一实施方案中，已经筛查个体以确定所述个体是否易患癌症。
[0177] 在另一实施方案中，所述癌症选自乳腺癌(breast cancer)、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌(colon cancer)、直肠癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌(thyroid cancer)、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑肿瘤、原发性脑癌、头颈癌(head-neck cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌(head or neck carcinoma)、乳腺癌(breast carcinoma)、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌(pancreatic carcinoma)、胃癌、结肠癌(colon carcinoma)、前列腺癌、泌尿生殖系统癌、甲状腺癌(thyroid carcinoma)、食管癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌癌、绒毛膜癌、蕈样肉芽肿、恶性高钙血症、颈椎增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、多毛细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波西氏肉瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤。本发明的方法可以治疗或预防本文未列出的其他癌症。
[0178] 本发明还提供了治疗或预防个体中过敏症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予具有通式(I)的杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药：
[0179]
[0180] 其中R1、R2、R3、R3和Rx如下文定义。
[0181] 在一个实施方案中，所述个体患有一种或多种过敏症。在另一实施方案中，所述个体被诊断为一种或多种过敏症。
[0182] 在另一实施方案中，所述一种或多种过敏症被治疗。在另一实施方案中，所述一种或多种过敏症被预防。
[0183] 在另一实施方案中，所述杂环化合物通过吸入被给药。
[0184] 在另一实施方案中，所述个体是人个体。
[0185] 在另一实施方案中，所述过敏性疾病选自：过敏性哮喘，常年性过敏性鼻炎，季节性过敏性鼻炎，过敏性皮炎，接触性过敏症、接触性皮炎，结膜炎，过敏性结膜炎，嗜酸粒细胞性支气管炎，食物过敏，嗜酸细胞性胃肠炎，炎性肠病，溃疡性结肠炎，克罗恩病，肥大细胞增多症，高IgE综合征，系统性红斑狼疮，牛皮癣，痤疮，多发性硬化症，同种异体移植排斥，再灌注损伤，慢性阻塞性肺病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎和骨关节炎、动物过敏，毒液过敏，植物过敏、过敏反应和超敏反应。在一个实施方案中，所述过敏性疾病是局部过敏性疾病。在一个实施方案中，所述过敏性疾病是系统性过敏性疾病。本发明的方法可以治疗或预防本文未列出的其他过敏性疾病。
[0186] 在本文的任何筛选方法的一个实施方案中，所述筛选方法在体内进行。在另一实施方案中，所述筛选方法在体外进行。
[0187] 在本文的任何筛选方法的另一实施方案中，所述筛选方法以高通量方式进行。在另一实施方案中，所述筛选方法是自动化的。在另一实施方案中，所述筛选方法发明是计算机控制的。
[0188] 在本文的任何筛选方法的另一实施方案中，所述筛选方法在动物的脑中进行。
[0189] 在本文的任何筛选方法的另一实施方案中，所述筛选方法在细胞培养物的细胞中进行。在另一实施方案中，所述细胞选自SHSY5Y、HEK、PC12、CHO、成纤维细胞、3T3、IMR32、BV-2、T98G、NT2N、Neuro2A细胞、原代神经细胞、原代小胶质细胞和来自野生型或转基因小鼠的器官型片培养物。在另一实施方案中，所述细胞是Neuro2A细胞。
[0190] 在本文的任何筛选方法的另一实施方案中，所述筛选方法以高通量方式进行。在另一实施方案中，所述筛选方法是计算机控制的。
[0191] 在本文的任何筛选方法的另一实施方案中，筛选的化合物是小分子。在另一实施方案中，筛选的化合物是核酸。在另一实施方案中，筛选的化合物是反义RNA分子、RNAi分子、干扰RNA分子、小干扰RNA分子或siRNA分子。在另一实施方案中，筛选的化合物不是反义RNA分子、RNAi分子、干扰RNA分子、小干扰RNA分子或siRNA分子中的一种或多种。
[0192] 在本文的任何筛选方法的另一实施方案中，多种培养的细胞分别暴露于多种测试化合物，例如在微量滴定板的单独的孔中。在本实施方案，可以同时筛选大量测试化合物。
[0193] 测试化合物可以呈递到溶解于溶剂中的细胞或细胞系。溶剂的实例包括DMSO、水和/或缓冲液。可以以低于约1％的量使用DMSO。可选地，可以以约0.1％或更低的量使用DMSO。在该浓度，DMSO对于测试化合物起增溶剂的作用而不是起破膜剂的作用。最初，必须用单独的不同的溶剂量检测细胞活力来检查细胞耐受的溶剂量，从而确保溶剂量对待检测的细胞性质没有影响。
[0194] 合适的缓冲液包括细胞生长培养基，例如添加或不添加10％胎牛血清的Iscove培养基(Invitrogen Corporation)。其他已知细胞孵育缓冲液包括磷酸盐、PIPES或HEPES缓冲液。本领域技术人员仅通过常规实验就可以鉴定其他合适的缓冲液。
[0195] 产生APP或其片段的细胞包括但不限于SHSY5Y、HEK、PC12、CHO、成纤维细胞、3T3、IMR-32、BV-2、T98G、NT2N、Neuro2A细胞、原代神经细胞和原代小胶质细胞。在另一实施方案中，所述细胞是Neuro2A细胞
[0196] 在另一实施方案中，产生APP及其片段的细胞包括已经被引入编码APP或突变的APP的核酸的细胞，例如通过转染。
[0197] 可以将本发明的杂环化合物以0.0005mg每千克体重或更高的有效口服剂量给药。在一个实施方案中，将该化合物作为包含5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120或180mg的单位剂型的一部分进行给药。
[0198] 用于本发明的组合物包括以有效实现活性组分的预期目的的量包含所述活性组分的所有组合物。当个体需求变化时，确定每种组分的有效量的最佳范围属于本领域的技术。通常，可以将活性组分以每天0.001-3mg/kg待治疗AD的哺乳动物的体重的剂量或其等量的药物可接受的盐口服给予诸如人的哺乳动物。可以将活性组分以每天0.001-3mg/kg待治疗AD的哺乳动物的体重的剂量或其等量的药物可接受的盐静脉注射或肌内注射给予诸如人的哺乳动物。约0.001-约3mg/kg可以被口服给予以治疗或预防这类病症。如果还给予另一种药剂，可以将该药剂以有效实现其预期目的的量给予。
[0199] 单位口服剂量可以包含约0.001-约200mg、或约0.5-约180mg的本发明的组合物。可以将单一剂量作为一片或多片片剂，每天给予一次或多次，每片包含约0.1-约90mg，方便地约10-180mg组合物或其溶剂合物。在一个实施方案中，单位口服剂量可以为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180mg。
[0200] 在局部制剂中，活性组分可以以约0.01-100mg每克载体的浓度存在。
[0201] 除了将活性组分作为原化学品给药外，还可以将活性组分作为药物制剂的一部分给药，所述药物制剂包含合适的药物可接受的载体(包括赋形剂和辅助剂)，所述药物可接受的载体有助于将活性组分加工成药学上使用的制剂。该制剂，尤其是那些可以口服给药的制剂(例如片剂、糖衣丸和胶囊)和可以直肠给药的制剂(例如栓剂)以及通过注射或口服给药的合适溶液可以包含与赋形剂一起的约0.01-99％、或约0.28-75％的活性组分。
[0202] 通式(I)的杂环化合物可以是水合物或作为药物可接受盐的酸加成盐的形式。可能的酸加成盐包括诸如盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐和磷酸盐的无机酸盐和有机酸盐，所述有机酸盐诸如乙酸盐、草酸盐、丙酸盐、羟乙酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和水杨酸盐。
[0203] 酸加成盐是通过将本发明的特定化合物的溶液和药物可接受的非毒性酸的溶液混合形成，所述药物可接受的非毒性酸例如盐酸、氢溴酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、碳酸、磷酸、硫酸、草酸等。碱性盐是通过将本发明的特定化合物的溶液与药物可接受的非毒性碱的溶液混合形成，所述药物可接受的非毒性碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胆碱、碳酸钠、Tris、N-甲基-葡糖胺等。
[0204] 本发明的药物组合物可以给予可能感受活性组分的有益效果的任何动物。这类动物中最重要的是哺乳动物，例如人和兽医诊疗的动物，尽管本发明不意图如此限制。
[0205] 本发明的药物组合物可以通过任何方法给药以实现它们的预期目的。例如，可以通过肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、口腔含化(buccal)、鞘内、颅内、鼻内、吸入或局部途径给药。可选地或同时地，可以通过口服途径给药。给药的剂量会取决于接收者的年龄、健康状况和体重，同时治疗的种类(如果有)、治疗的频率和期望效果的性质。
[0206] 本发明的药物制剂是用自身已知的方式来制备，例如通过常规的混合、造粒、糖衣丸制备(dragee-making)、溶解或冷冻干燥过程。因此，口服用药物制剂可以通过下述方法获得：将活性组分与固体赋形剂组合，任选地将所得的混合物研磨，并在添加合适的辅助剂(如果需要或必须)后将混合物加工成颗粒，以获得片剂或糖衣丸核心。
[0207] 合适的赋形剂是，具体地：填充剂，例如糖类，例如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制剂和/或磷酸钙，例如，磷酸三钙或磷酸氢钙；以及粘合剂，例如淀粉糊，使用例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可以添加崩解剂，例如上述的淀粉以及羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者藻酸或其盐，如藻酸钠。辅助剂首先是流量调节剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，例如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇。如果需要，向糖衣丸核心提供抵抗胃液的合适的包衣。为了这个目的，可以使用浓的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生抵抗胃液的包衣，可以使用合适的纤维素制剂的溶液，所述纤维素制剂例如乙酰纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。可以向片剂或糖衣丸包衣添加染料或颜料，例如为了鉴定或表征活性组分剂量的组合。
[0208] 可以口服使用的其他药物制剂包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和诸如甘油或山梨醇的增塑剂制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以含有与诸如乳糖的填充剂，诸如淀粉的粘合剂和/或诸如滑石或硬脂酸镁的润滑剂，以及任选的稳定剂混合的颗粒形式的活性组分。在软胶囊中，可以将活性组分溶解或悬浮在合适的液体中，例如，脂肪油或液态石蜡。另外，可以添加稳定剂。
[0209] 可以直肠给药使用的可能的药物制剂包括，例如栓剂，其由一种或多种活性组分与栓剂基质组合组成。合适的栓剂基质是，例如天然的或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，还可能使用由活性组分与基质组合组成的明胶直肠胶囊。可能的基质材料包括，例如液态甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。
[0210] 肠道外给药的合适的剂型包括水溶性形式的活性组分(例如水溶性盐和碱性溶液)的含水溶液。另外，可以将活性组分的悬浮液作为合适的油性注射悬浮液给药。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油；或合成的脂肪酸酯，例如油脂乙酸或甘油三酯或聚乙二醇-400。含水注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质，包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含稳定剂。
[0211] 如本文所用的，前药是这样的化合物，一旦体内给药后就新陈代谢为或以其它方式转变为该化合物的生物活性形式、药物活性形式或治疗活性形式。为产生前药，修饰药物活性化合物，使得该活性化合物会通过新陈代谢途径再生。可以设计前药以改变药物的新陈代谢稳定性或运输特征，掩饰副作用或毒性，改善药物的味道或改变药物的其他特征或性质。一旦药物活性化合物是已知的，本领域技术人员借助于药效学过程和药物体内新陈代谢的知识可以设计该化合物的前药(参见，例如Nogrady，Medicinal Chemistry：A Biochemical Approach(药物化学：生物化学方法)，Oxford University Press，New York，pages 388 392(1985))。
[0212] 本发明的范围还包括活性组分的剂型，其中口服药物制剂包含肠溶包衣。本文所用的术语“肠溶包衣”是指覆盖在口服药物剂型上抑制活性组分在酸性介质中溶解，但在中性至碱性介质中快速溶解并具有长期储存的良好稳定性的任何包衣。可选地，具有肠溶包衣的剂型还可以在肠溶包衣与核心之间包含水溶性分离层。
[0213] 肠溶包衣剂型的核心包含活性组分。任选地，该核心还包含药物添加剂和/或赋形剂。分离层可以是用于薄膜包衣应用的水溶性惰性活性组分或聚合物。通过本领域技术人员已知的任何常规包衣技术将分离层应用在核心上。分离层的实例包括但不限于糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、和羟丙基甲基纤维素。通过任何常规包衣技术将肠溶包衣应用在分离层上。肠溶包衣的实例包括但不限于邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，例如EudragitL 12,5或Eudragit L 100(Rohm Pharma)、基于水的分散剂，例如Aquateric (FMC Corporation)，Eudragit L 100-55(Rohm Pharma)和Coating CE 5142(BASF)、以及包含诸如Citroflex (Pfizer)的水溶性增塑剂的那些。最终剂型是肠溶包衣的片剂、胶囊或微丸剂。
[0214] 本发明化合物的前药的实例包括包含羧酸单酯的化合物(例如，根据本领域已知的方法通过与C1-4醇缩合获得的那些化合物)；包含羟基酯的化合物(例如，通过与C1-4羧酸、C3-6二酸或其酸酐(例如根据本领域已知的方法获得的琥珀酸酸酐和富马酸酸酐)缩合获得的那些化合物)；包含氨基亚胺的化合物(例如根据本领域已知的方法通过与C1-4醛或酮缩合获得的那些化合物)；以及含有醇的缩醛和缩酮的化合物(例如根据本领域已知的方法通过与氯甲基甲醚或氯甲基乙醚缩合获得的那些化合物)。
[0215] AD的症状包括精神错乱、短时记忆障碍、注意力问题、空间定位问题、性格改变、语言困难和情绪波动。应当理解，随着未来医学持续发展，AD症状的列表可以扩展。因此，术语“AD的症状”并不限于本文提供的症状列表。
[0216] 如本文所用的，用于治疗特定疾病的化合物的有效量是足以改善或以某些方式减少与该疾病相关的症状的量。可以以单剂量给予这样的量或可以根据起作用的疗程给予这样的量。所述量可能治愈该疾病，但是通常被给予的量是为了改善该疾病。通常，需要重复给药以实现期望的症状改善。
[0217] 在通式(I)中，具有通式(II)的结构单元可以是选自具有通式(III)的多种结构单元类型中的一种或多种结构单元。
[0218]
[0219]
[0220] 在通式(I)中，Rx为甲基或无。在通式(I)和通式(II)中，R1和R2均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、氨基、乙酰氨基、苄氨基、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、苄氧基、CH2-R5(其中R5为苯基(其被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代)或噻吩基)和-O-(CH2)n-R6，其中R6为乙烯基、C3-C8环烷基或苯基，且n为0或1。
[0221] 在通式(I)和通式(II)中，R3和R4均为独立地选自以下的一种或多种官能团：氢原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C8环烷基、CH2-R5(其中R5为苯基(其被C1-C6烷基、卤原子或氰基取代)；萘基或噻吩基)和-CH(R8)-R7。可选地，R3和R4一起形成具有通式(IV)的螺环：
[0222]
[0223] R7为选自以下的一种或多种官能团：乙烯基；乙炔基；苯基，任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、1或2个卤原子、二C1-C6烷基氨基、氰基、硝基、羧基或苯基取代；苯乙基；吡啶基；噻吩基；和呋喃基。上述R8是氢原子或C1-C6烷基。
[0224] 此外，在通式(IV)中，结构单元B可以是选自具有通式(V)的多种结构单元类型中的一种或多种结构单元。结构单元B在通式(V)中用*标记的位置处结合形成螺环。
[0225]
[0226] R9为选自以下的一种或多种官能团：氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、氰基和三氟甲基。
[0227] 当具有通式(I)的杂环化合物在结构中具有不对称碳原子时，存在其来自不对称碳原子的异构体和它们的混合物(外消旋体)。在这样的情况下，它们均被包括在下文描述的实施方案所用的杂环化合物中。
[0228] 除非另外定义，术语“C1-C6”是指1至6个碳原子。除非另外定义，术语“C3-C8”是指3至8个碳原子。术语“C1-C6烷基”包括直链或支链烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基和正己基。术语“C1-C6烷氧基”包括直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基和正己氧基。术语“C3-C8环烷基”包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。术语“卤原子”包括氟、氯、溴和碘。
[0229] 在另一实施方案中，在本发明的实践中有用的杂环化合物选自：
[0230] 3，3-二甲基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0231] 3，3-二丙基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0232] 3，3-二丁基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0233] 3，3-二烯丙基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0234] 3，3-二烯丙基-8-苄氧基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0235] 3，3-二(2-丙炔基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0236] 3，3-二苄基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0237] 3，3-二苄基-8-甲基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0238] 3，3-二苄基-5，7-二甲基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0239] 3，3-二苄基-8-羟基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0240] 3，3-二苄基-8-甲氧基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0241] 3，3-二苄基-8-乙氧基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0242] 8-烯丙氧基-3，3-二苄基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0243] 3，3-二苄基-8-异丙氧基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0244] 3，3-二苄基-8-环丙基甲基氧咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0245] 3，3-二苄基-8-环庚基氧咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0246] 3，3-二苄基-6-氯咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0247] 3，3-二苄基-6，8-二氯咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0248] 3，3-二苄基-8-氯-6-三氟甲基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0249] 3，3-二苄基-8-苄氧基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0250] 8-氨基-3，3-二苄基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0251] 8-乙酰氨基-3，3-二苄基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0252] 3，3-二苄基-8-苄基氨基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0253] 3，3-双(3-氯苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0254] 3，3-双(3-氟苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0255] 3，3-双(4-氟苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0256] 3，3-双(2，4-二氯苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0257] 3，3-双(4-二甲基氨基苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0258] 3，3-双(4-甲氧基苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0259] 3，3-双(4-二苯基甲基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0260] 3，3-双(4-氰基苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0261] 3，3-双(4-羟基-苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0262] 3，3-双(3-苯基-1-丙基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0263] 3，3-双(2，4-二氟苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0264] 3，3-双(4-硝基苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0265] 3，3-双(4-羧基苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0266] 8-苄氧基-3，3-双(1-苯乙基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0267] 8-苄氧基-3，3-双(3-甲基苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0268] 8-苄氧基-3，3-双(4-甲基苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0269] 3-苄基-3-(4-氟苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0270] 3-乙基-3(4-氟苄基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0271] 8-甲基-3，3-双(3-吡啶基甲基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0272] 8-甲基-3，3-双(4-吡啶基甲基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0273] 3，3-双(2-噻吩基甲基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0274] 3，3-双(2-呋喃基甲基)咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0275] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-茚满)，
[0276] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-(2，3)二氢非那烯)，
[0277] 螺(咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮-5，2′-苯并(f)茚满)，
[0278] 螺(咪唑并(1，2-b)噻唑-6(5H)-酮-5，2′-茚满)，
[0279] 螺(2-甲基咪唑并(1，2-b)噻唑-6(5H)-酮-5，2′-苯并(f)茚满)，
[0280] 5，5-双(4-氟苄基)咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0281] 5，5-二苄基咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0282] 5，5-双(4-甲基苄基)咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0283] 5，5-双(4-氰基苄基)咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0284] 5，5-二苄基-2-甲基咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0285] 5，5-双(4-氟苄基)-2-甲基咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0286] 5，5-二环己基-2-甲基咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0287] 5，5-双(4-氰基苄基)-2-甲基咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0288] 5，5-二(2-丁烯基)咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0289] 5，5-二丁基咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0290] 5，5-二环己基咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0291] 5，5-双(2-噻吩基甲基)咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0292] 螺(2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮-5，2′-苯并(f)茚满)，
[0293] 5，5-二丁基-2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0294] 5，5-二(2-丁烯基)-2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0295] 5，5-双(4-甲基苄基)-2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0296] 5，5-双(2-噻吩基甲基)-2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0297] 5，5-双(4-氟苄基)-2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0298] 5，5-二苄基-2，3-二氢咪唑并(2，1-b)噻唑-6(5H)-酮，
[0299] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-苯并(f)茚满)，
[0300] 2-羟基-3-(2-萘基甲基)-咪唑并(1，2-a)吡啶，
[0301] 3-苄基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0302] 螺(5，6，7，8-四氢咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-苯并(f)茚满)，[0303] 3，3-二环己基-5，6，7，8-四氢咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0304] 3，3-双(2-噻吩基甲基)-5，6，7，8-四氢咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，[0305] 3，3-二丁基-5，6，7，8-四氢咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0306] 3，3-二丙基-5，6，7，8-四氢咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮，
[0307] 螺(咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮-3，2′-苯并(f)茚满)，
[0308] 3，3-二(2-丁烯基)咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮，
[0309] 3，3-双(2-噻吩基甲基)咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮，
[0310] 3，3-双(4-氟苄基)咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮，
[0311] 3，3-二环己基咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮，
[0312] 3，3-双(4-氰基苄基)咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮，
[0313] 3，3-双(4-甲基苄基)咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮，
[0314] 4，4--二苄基-1-甲基-5-氧代-4，5-二氢咪唑，
[0315] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-(4′-氟代茚满))，
[0316] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-(5′-甲氧基茚满))，
[0317] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-(5′-碘代茚满))，
[0318] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-(4′-氰基茚满))，
[0319] 螺(咪唑并(2，1-a)异喹啉-2(3H)-酮-3，2′-茚满)，
[0320] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-((1，2，5-噻二唑)(4，5-c)茚满))，[0321] 螺(咪唑并(2，1-a)异喹啉-2(3H)-酮-3，2′-((1，2，5-噻二唑)(4，5-c)茚满))，
[0322] 螺(咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮-3，4′-(1-环戊烯))，
[0323] 螺(咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮-3，2′-茚满)，
[0324] 螺(咪唑并(1，2-a)嘧啶-2(3H)-酮-3，2′-((1，2，5-噻二唑)(4，5-c)茚满))，[0325] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-(5t-三氟甲基茚满))，
[0326] 螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-苯并(e)茚满)，
[0327] 螺(咪唑并(2，1-a)异喹啉-2(3H)-酮-3，1’-(3′-环戊烯))，
[0328] 螺(8-苄氧基咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，1′-(3′-环戊烯))，
[0329] 螺(7，8，9，10-四氢咪唑并(2，1-a)异喹啉-2(3H)-酮-3，1′-环戊烷)，[0330] 螺(咪唑并(2，1-a)异喹啉-2(3H)-酮-3，1′-环戊烷)，和
[0331] 螺(5，6，7，8-四氢咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-茚满).
[0332] 在另一实施方案中，所述化合物是螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-茚满)。
[0333] 在另一实施方案中，本发明的方法可以使用美国申请第11/872,408号(公开为US2008/0103157 A1)；美国申请第11/872,418号(公开为US 2008/0103158 A1)；美国专利第6,635,652号；美国专利第7,141,579号和第PCT/JP2007/070962号国际申请(公开为WO 2008/047951)中所公开的任何化合物实施，通过引用将每个文件以其整体并入本文。
[0334] 化合物ST101，也被称作ZSET1446，在急性(单剂量)给药和慢性给药后的啮齿动物模型中显示出对AD相关的学习和记忆的药理活性。ST101的化学名是螺(咪唑并(1，2-a)吡啶-2(3H)-酮-3，2′-茚满)。
[0335] 例如，ST101显著改善老年性记忆受损和由化学致遗忘剂诱导的轻度记忆缺陷，所述致遗忘剂例如甲基苯丙胺、谷氨酸盐受体拮抗剂、MK-801和毒蕈碱拮抗剂——莨菪胺(Yamaguchi Y.，et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.377：1079-87(2006)；Ito Y.，et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.320：819-27(2007))。
[0336] 实验已经表明，ST101增强尼古丁刺激的乙酰胆碱(Ach)释放，增加脑皮层中胞外Ach的浓度并增加海马中ACh和多巴胺两者的胞外浓度。ST101表现其效果所横跨的模型范围表明在其涉及与这些过程相关的信号途径中上游靶位的可能性。
[0337] 在加速衰老的小鼠8(SAMP8)中已经证实ST101的效果，加速衰老的小鼠8是伴随脑组织中Aβ样沉积物积累而患有老年性学习和记忆缺陷的小鼠品系。SAMP8小鼠在Morley，J.E.，Biogerontology 3：57-60(2002)中详述。ST101降低Aβ样沉积物的积累并且还导致学习和记忆功能的改善，表明ST101的行为影响可能与Aβ产生和/或积累的减少有关。参见US 2008/103158 A1。
[0338] 通过引用将本文所述的所有专利、专利申请和出版物以其整体并入本文。
[0339] 实施例1
[0340] ST101对体外Neuro2a培养细胞中β淀粉样蛋白的影响
[0341] Neuro2a是小鼠成神经细胞瘤细胞系，已知其产生的淀粉样肽Aβ1-40和Aβ1-42的量可用ELISA测定检测到。Aβ的这些形式与AD脑中病理学相关，特别是Aβ1-42被视为具有封闭α7烟碱受体和产生直接神经中毒效应的能力。用添加到组织培养基的ST101处理Neuro2a细胞24小时。收集组织培养基并用ELISA分析Aβ的存在。
[0342] 图1A和1B是显示化合物ST101对Neuro2a细胞的Aβ产生的影响的柱状图。图1A是显示相对于对照，细胞培养基中的Aβ浓度作为ST101浓度的函数的柱状图。图1B是显示相对于对照，Aβ1-42与Aβ1-40的比值作为ST101浓度的函数的柱状图。如图1A和1B所示，ST101显著降低Aβ1-42而对Aβ1-40没有显著的影响(图1)。
[0343] 实施例2
[0344] ST101对Morrris水迷宫中3xTg-AD小鼠的影响
[0345] 位于加利福尼亚大学欧文分校的Frank Laferla博士的实验室已经开发出包含3个与阿尔茨海默病理学相关的突变(βAPPSwe、PS1M146V和tauP301L)的转基因小鼠(Oddo et al，″Triple-transgenic model of AD with plaques and tangles：intracellular Aβ and synaptic dysfunction(具有斑块和缠结的AD三倍体转基因模型：细胞内Aβ和突触机能障碍)，Neuron 39(3)：409-21(2003))。这些突变将APP切割从α分泌酶转换到β分泌酶，增加Aβ1-42的产生，和驱动tau向配对的螺旋纤维中的积累。3xTg-AD动物以年龄依赖的方式发展出AD的基本特征，具有记忆相关的行为功能缺陷，斑块和缠结病变以及突触机能障碍，包括被认为对记忆十分关键的活性——长时程增强缺陷(Oddo et al.，2003)。此外，斑块形成先于缠结形成并因此模拟人体中AD的发展。3xTg-AD小鼠代表迄今为止开发出的最接近AD的动物模型中的一种。
[0346] ST101给药和测试方法
[0347] 用ST101处理约1岁龄的3xTg-AD小鼠2个月。在饮用水中以5mg/kg/天的平均剂量给予(根据平均水消耗量计算出的剂量)。通过评价在Morris水迷宫的表现测试行为影响。通过ELISA和免疫印迹检测Aβ和APP的脑含量来检查生化影响。
[0348] 行为影响：3xTg-AD小鼠在Morris水迷宫(MWM)中的表现，来自Roozendaal et al.，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.100：1328-1333(2003)。
[0349] MWM同时测试啮齿动物的空间记忆(即海马体依赖的)和信号学习(cuedlearning)(非海马体的)。该迷宫是充满不透明水的圆形槽。小鼠被置于水中并必须游泳以寻找并逃离至在水平面下1.5cm淹没的平台。记录下寻找平台所需的时间(以秒为单位)。动物依赖包含该槽的房间中的视觉信号从而在连续挑战中发现平台。连续七天每天进行训练。
[0350] 在最后的训练试验后24小时和72小时，两次评估对训练的记忆力。移除平台，使动物在槽中自由游泳60秒。测量的参数包括(1)执行时间：到达以前平台位置所需时间和(2)穿过次数：动物游泳穿过以前平台位置的次数。执行时间的降低和穿过次数的增加表明空间记忆和信号学习得以改善。
[0351] 图2A、2B和2C是显示ST101对MWM中3xTg-AD小鼠的影响的图表。图2A是显示相对于对照小鼠，训练期间执行时间(以秒为单位)的图。图2B和2C是显示训练后24小时和72小时，ST101处理的动物和对照小鼠的执行时间(以秒为单位)的柱状图。
[0352] 如图2A所示，在训练的第一天，ST101和对照动物具有类似的执行时间。然而，在连续训练几天之后，相对于对照，ST101处理的小鼠显示出显著的降低。图2B和2C也表明在24小时和72小时，记忆力测试期间的执行时间降低和穿过次数增加。这些数据证实ST101改善3xTg-AD小鼠品系的学习和记忆能力，这与人类AD非常相似。
[0353] 实施例3
[0354] ST101对3xTg小鼠AD的脑组织中Aβ的影响
[0355] 生化影响：ST101和淀粉样蛋白加工途径
[0356] 在2个月的处理期结束时，处死3xTg小鼠并处理脑组织。在分析的第一环节，通过ELISA对可溶性Aβ1-40和Aβ1-42以及不溶性Aβ(用甲酸提取后)进行定量。可溶性Aβ代表已经从全长APP加工并释放的蛋白。不溶性Aβ代表最终沉积于淀粉样蛋白斑块中的纤维积累。
[0357] 图3A和3B是显示ST101对来自3xTg-AD小鼠的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图3A显示了相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠的脑组织中可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的量。图3B是显示相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠中不溶性Aβ1-40和Aβ1-42(甲酸提取)的量的柱状图。图A中ST101处理组中的一只动物由于分析上的人工假象而排除。
[0358] 如图3A和3B所示，ST101处理的小鼠具有显著降低的可溶性Aβ1-42水平和中度降低的可溶性Aβ1-40。不溶性Aβ未受影响。这些结果表明ST101可能影响Aβ的产生或释放。
[0359] 实施例4
[0360] 通过抗体CT20检测APP C末端片段
[0361] 为了试图确定ST101在Aβ加工/释放途径中哪部分起作用，对同一小鼠的脑提取物进行一系列的免疫印迹分析。这些免疫印迹检查完整的APP及其翻译后加工产物和随后的降解产物。
[0362] 图4是显示相对于未处理的(C)3xTg小鼠AD，用ST101处理的(S)3xTg-AD小鼠的脑中通过抗体CT20检测APP的C末端片段的免疫印迹。
[0363] 如图4所示，抗体CT20(抗APP的C末端)显示出C99和C83的APPC末端片段的显著减少。这些片段分别是β分泌酶和α分泌酶切割的副产物。还显示了新的更长的约17kDa分子量的C末端片段的出现(用*指示)。
[0364] 实施例5
[0365] 通过抗体CT20检测APP和降解片段
[0366] 图5是显示相对于未处理的(C)3xTg-AD小鼠，用ST101处理的(S)3xTg-AD小鼠的脑中通过抗体CT20检测APP和降解片段的免疫印记。“CT20”代表全长APP种类，并且“肌动蛋白”代表抗β肌动蛋白抗体，作为蛋白内参对照。
[0367] 免疫印迹分析检测到了所有提取物中全长未加工的APP(图5，*)。细微的条带迁移表明额外的ST101引起的APP修饰，例如某些全长种类的分子量略微降低(糖基化、磷酸化或其他翻译后修饰的可能的改变)和主要APP降解中间体(约50kDa)的消失或显著减少(图5，**)。
[0368] 实施例6
[0369] 可选的淀粉样蛋白加工途径
[0370] 图6是显示导致新的APP的C末端片段的推定的淀粉样蛋白加工途径的图。推定的途径解释了图4的免疫印迹中显示的新的约17kD片段的出现。该片段是通过在距离β分泌酶切割位点N末端约60个氨基酸的未表征位点处切割而产生的。
[0371] 新的途径似乎先于α和β分泌酶切割，因为这些切割事件的通常产物显著减少(C83和C99分别对应α和β分泌酶)，并且因此作为这些酶的靶标的切割位点保持完整。
[0372] ST101诱导的APP代谢作用的这种改变伴有动物模型中学习和记忆任务的显著改善，所述动物模型可论证地被认为是临床AD的相近代表。当与早期非临床数据结合观察时，似乎ST101可以在位于这两种销售的试剂和目前根据对已知作用机理研究的试剂上游的生理过程操作，并且因此代表AD治疗的新途径。
[0373] 实施例7
[0374] ST101对体内(3xTg-AD小鼠)Aβ产生的影响
[0375] 之前描述的ST101在3xTg-AD小鼠脑中的Aβ降低效应的结果是从用饮用水中以5/mg/kg/天的ST101处理2个月的约12月龄的小鼠获得的。进行两次实验以确认这些发现。一次实验评价ST101对于以相同的剂量水平处理2.5个月的约14.5月龄的3xTG-AD小鼠的影响。图7A和7B是显示ST101对来自3xTg-AD小鼠的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图7A显示了相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠的脑组织中可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的量。图7B是显示相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠的脑组织中不溶性Aβ1-40和Aβ1-42(甲酸提取)的量的柱状图。N＝6只/组。*表示与对照动物在统计学上差异显著(p＜0.05，学生t检验)。组大小：对照n＝6只，ST101 n＝6只。动物在用ST101以5/mg/kg/天处理2.5个月后在约14.5月龄时被处死。
[0376] 另一实验评价ST101对于约18月龄动物在处理2个月后的影响(图8)。图8A和8B是显示ST101对来自3xTg-AD小鼠的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图8A显示了相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠的脑组织中可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的量。图8B是显示相对于对照小鼠，用ST101处理的小鼠中不溶性Aβ1-40和Aβ1-42(甲酸提取)的量的柱状图。
*表示与对照动物在统计学上差异显著(p＜0.05，学生t检验)。组大小：对照n＝6只，ST101 n＝6只。动物在用ST101以5mg/kg/天处理2个月后在约20月龄时处死。
*表示与对照动物在统计学上差异显著(p＜0.05，学生t检验)。组大小：对照n＝6只，ST101 n＝6只。动物在用ST101以5mg/kg/天处理2个月后在约20月龄时处死。
[0377] 两个实验都表现出在之前实验所见到的“可溶性”脑提取物中Aβ1-40和Aβ1-42的减少。“不溶性”部分(通过甲酸提取获得)中Aβ的减少是更多变的。之前的来自12月龄小鼠的数据表明不溶性Aβ没有减少，而图7展示了经历2.5个月处理而不是2个月处理的14.5月龄小鼠中不溶性Aβ显著减少。由于对照组(n＝4只)中的动物数量少，20月龄小鼠展示了未达到统计学差异的Aβ减少。
[0378] 综上，这些结果证实了ST101对可溶性Aβ水平的强烈影响。在老年动物中效果是最不明显的，因为在治疗开始前这些动物已经有大的淀粉样蛋白斑块负载。对不溶性部分中Aβ的影响的较大可变性需要进一步的追踪。由于动物年龄和治疗时长以及甲酸提取效率的技术问题(从最老的小鼠脑中提取到较少的Aβ1-42)而产生的影响是可能的。
[0379] 实施例8
[0380] ST101对体内(食蟹猴)Aβ产生的影响
[0381] 在六个月的慢性毒性研究结束时从食蟹猴获得脑样品。本研究所用的食蟹猴是小于4岁龄的幼体。通过鼻胃管以10mg/kg/天的量持续6个月每天给予ST101(n＝8只每组)。从8只处理的动物和8只对照动物产生数据。Aβ1-40的水平在图9中示出，其是显示ST101对来自食蟹猴的脑组织中Aβ的影响的柱状图。图9显示了相对于对照猴，用ST101处理的猴中Aβ1-40水平的量。
[0382] 这些幼体动物中Aβ水平十分低。用ST101处理的动物中Aβ1-40的减少未达到统计学差异。然而，可见的平均Aβ1-40水平处于该测定的灵敏度的下限，因此Aβ1-42水平检测不到。
[0383] 数据表明食蟹猴脑中Aβ1-40的下降，并支持从3xTG-AD小鼠模型中产生的数据。需要使用免疫印迹利用猴脑提取物的更多实验来确定对APP加工的影响。
[0384] 实施例9
[0385] ST101对3xTg-AD小鼠的脑组织中APP CTF的影响
[0386] 12月龄3xTg-AD小鼠中的前述实验显示C末端APP片段的明显减少。使用来自处理了2.5个月的14.5月龄3xTg-AD小鼠的脑提取物确认了该影响(图10A-10B)。
[0387] 图10A-10B是显示相对于未处理的(C)3xTg-AD小鼠，通过抗体CT20在ST101处理的(图10A中的T，图10B中的S)3xTg-AD小鼠的脑中检测APP羧基末端片段的免疫印迹。图10B来自单独的实验，但是其使用的脑提取物与图10A的实验使用的脑提取物相同。动物用饮用水中5mg/kg/天的ST101处理2.5个月后在约14.5月龄时被处死。*表示具有低水平CTF的对照动物。
[0388] 图10C和10D是显示相对于未处理的(C)3xTg小鼠AD，通过APP C末端抗体(Eptitomics #：15654-1)在ST101处理的(S)3xTg-AD小鼠的脑中检测APP C末端片段的免疫印迹。图10D是图10C中免疫印迹的更亮的曝光。动物用饮用水中5mg/kg/天的ST101处理2.5个月后在约14.5月龄时被处死。
[0389] 图10A中结果确认了之前实验(图4)所见的APP CTF减少的显著效果。然而，图10A中描述的免疫印迹没有清晰地解析C99和C83片段。同一脑提取物的重复免疫印迹在图10B中示出。该免疫印迹得到C99和C83片段的清晰的分辨率。尽管该特定免疫印迹显示出一些非特异性的背景，但是其显示了C99片段的减少比C83片段的减少更加明显。
[0390] 在利用抗APP的C末端片段的不同C末端抗体的重复免疫印迹中进一步确认了图10A和B的结果。该重复免疫印迹的结果显示为图10C和10D中同一免疫印迹的两次不同曝光。该免疫印迹确认了通过ST101处理的C99片段的减少。其还确认了C83片段没有减少到与之前的12月龄小鼠的实验中相同的程度。C99的减少可以通过之前实验(图11)所见的BACE的减少来解释。图10A-D所示重复实验的BACE的等效数据仍不可获得。之前实验已经显示前ADAM-10的减少，这解释了C83片段的减少(图11)。在本处所述的实验中，C83没有减少到相同的程度。这预示了在本实验中ST101对ADAM-10的影响较小。从本实验无法获得对ADAM-10的数据。相对于前ADAM10，ST101对于BACE的更有选择性的影响还与Aβ的更明显的减少(图7B)和sAPP-β的减少(图13)相符。C83片段减少较少还与实验中没有检测到17kDa相符。由于本实验中α分泌酶(ADAM-10)切割似乎在很大程度上是完整的，因此APP不需要被强迫进入产生17kDa片段的备选途径。此时，不清楚是什么决定了在12月龄(图4)对14.5月龄小鼠的两个实验(图10A-10D)之间ST101对C83片
段的影响的差异。然而，动物年龄不同并且处理持续时间不同。
段的影响的差异。然而，动物年龄不同并且处理持续时间不同。
[0391] 实施例10
[0392] 通过用ST101处理(3xTG-AD小鼠)导致β分泌酶(BACE)和ADAM10的减少
[0393] β分泌酶和α分泌酶切割分别产生APP C末端片段C99和C83。因此，由ST101诱导的C99和C83的减少是由于分泌酶的减少或抑制。对来自3xTg-AD小鼠的脑提取物进行免疫印迹来检验该假说，所述小鼠来自对用ST101处理2个月的12月龄动物的最初实验。仅有的β分泌酶是BACE1，而组成型α分泌酶是ADAM10。
[0394] 使用抗BACE1和ADAM10的抗体探测免疫印迹。结果在图11中示出。图11A是显示与对照小鼠(C)相比，来自ST101处理的3xTG-AD小鼠(S)的脑提取物中前ADAM10、ADAM10、前BACE、BACE、早衰蛋白1和APP-CFT的水平的一系列免疫印迹。C：对照脑提取物。S：ST101处理的脑提取物。动物在用ST101以5mg/kg/天处理2个月后在约12月龄时被处死。
[0395] 图11B显示通过光密度测定法对来自图11A的免疫印记条带进行定量。
[0396] 免疫印迹显示出BACE和前ADAM10的明显减少。前BACE和ADAM-10蛋白水平没有受到显著影响。这些结果与导致APP-CTF C99和C83减少的α和β分泌酶的活性降低相符。γ分泌酶复合体的组分——早衰蛋白1没有显示出显著改变。
[0397] 进一步的实验会包括直接测量ADAM10和BACE的酶活性。这些实验还会解决ST101对前酶与活性酶水平的不同影响(ST101减少BACE而不减少前BACE，但是减少前ADAM10而不减少ADAM10)而引起的问题。
[0398] 实施例11
[0399] 体内(3xTG-AD小鼠)病理学tau积累的减少
[0400] 3xTg-AD小鼠模型包含阿尔茨海默病的两个病理标志：Aβ淀粉样蛋白斑块和神经元纤维缠结。神经元纤维缠结由异常磷酸化的tau蛋白的积累组成。在3xTg-AD小鼠中，tau的病理学体-树突积累在免疫组织化学中可见，作为疾病模型表型的一部分。
[0401] ST101对tau分布和积累的影响在免疫组织化学中使用H7抗tau抗体探察。在海马中观察到病理学体-树突tau染色的明显减少。苏木精/曙红染色的对照切片显示没有神经元损失。
[0402] 实施例12
[0403] 体内(3xTg-AD小鼠)tau种类的分子量转变
[0404] Tau磷酸化、积累和降解的状态可以在免疫印迹中评价。针对未磷酸化的tau和磷酸化的tau的两种抗tau抗体用于探测来自最初实验的脑提取物。免疫印迹在图12中示出。图12是显示与对照小鼠(C)相比，来自ST101处理的3xTG-AD小鼠(S)的脑提取物中全长tau水平、tau积累、tau降解产物和磷酸化的tau水平的一系列免疫印记。β肌动蛋白水平(Ac)被用作内参对照。P-tau，每个抗体两板：顶部-正常曝光；底部-过曝以使小蛋白条带可见。Ac：β肌动蛋白抗体作为蛋白内参对照。动物在用ST101以5mg/kg/天处理2个月后在约12月龄时被处死。
[0405] 使用两种抗体的过曝光的免疫印迹揭示由ST101处理诱导的细微变化。H7抗体示出积累的tau和降解产物的消失。R-p-tau抗体示出新的磷酸化的tau降解产物的出现。
[0406] BACE和前ADAM10的减少的发现对ST101作用机理提供了较大的新认识，并且为筛选测定评价新的APPM(淀粉样蛋白加工途径调节剂)提供了新机会。
[0407] 负责BACE和前ADAM10的减少的分子机理此时尚不清晰。通常，蛋白水平的降低是由于转录降低、翻译降低或降解增加。多种研究将被启动以区别这些可能性。这些实验最初会包括评定mRNA水平的实验、评定参与细胞内运输的蛋白水平的免疫印迹、泛素-蛋白酶体系统和自我吞噬以及检测ST101对包括去乙酰化酶sirtuin家族在内的HDAC的影响。同样，需要综合研究成果以鉴定ST101的分子靶标。
[0408] 数据表明ST101的潜在的缓解疾病的效应是通过BACE蛋白水平的降低介导的。ST101诱导的改变代表BACE抑制/减少的新机理，似乎其不与任何已知BACE抑制剂或BACE调节剂分享。BACE活性的降低仍然是阿尔茨海默病中主要的治疗目标。
[0409] ST101还诱导前ADAM10的减少和反应为C83降低的α分泌酶切割的减少。表面上看，α分泌酶切割的减少可能被视为非期望效果，因为α分泌酶还切割多种其他底物。因此，人们可以假定α分泌酶的减少可能引起毒性。然而，已经在高达6个月的使用高达
3xTg-AD小鼠中所用剂量的约100倍的剂量的啮齿动物和猴毒性研究中证实ST101是安全的。这表明ST101引起的α分泌酶减少的水平不足以诱导毒性。这可能是因为ST101对α分泌酶的不完全效应或是因为补偿ST101对ADAM10的主要影响的其他α分泌酶的活性。
3xTg-AD小鼠中所用剂量的约100倍的剂量的啮齿动物和猴毒性研究中证实ST101是安全的。这表明ST101引起的α分泌酶减少的水平不足以诱导毒性。这可能是因为ST101对α分泌酶的不完全效应或是因为补偿ST101对ADAM10的主要影响的其他α分泌酶的活性。
[0410] 进一步的工作将必须针对ST101对BACE和ADAM10影响的特异性。似乎ST101还会影响其他蛋白。在本语境中，确定ST101是否影响还被称为TACE(肿瘤坏死因子转化酶)的另一α分泌酶ADAD17是有趣的。如果ST101降低TACE的水平，这会开启ST101作为TNF拮抗剂的用途的新机会。
[0411] 本实验确认ST101对APP加工和Aβ产生的明显影响。BACE和ADAM10的下调的证明对ST101对Aβ产生的效应提供了貌似可信的解释。
[0412] 实施例13
[0413] ST101对来自3xTgAD小鼠的脑组织中sAPP-β的影响
[0414] 图10B描述了片段C99的减少。C99是由BACE切割产生的，这导致可溶性APP、特别是sAPP-β的释放。因此，C99的减少预示着sAPP-β的同时减少。这通过图13所示的免疫印迹检验。在来自ST101处理的3xTG-AD小鼠(S)与对照小鼠(C)的脑提取物中使用sAPP-β特异性抗体获得免疫印迹。动物用饮用水中5mg/kg/天的ST101处理2个月后在约14.5月龄时被处死。
[0415] 图13证实了图10B中C99的减少伴有sAPP-β的同时减少。在之前的同样示出了C99的显著减少的实验中，sAPP-β可能由于技术困难而无法被检测。
[0416] 实施例14
[0417] ST101对来自3xTgAD小鼠的脑组织中TACE的影响
[0418] 除了ADAM10，已知ADAM17(TACE，肿瘤坏死因子转化酶)起APP的α分泌酶的作用。因此，在免疫印迹中检测ST101是否降低ADAM17(TACE)的水平。
[0419] 图14是显示ST101对来自3xTgAD小鼠的脑组织中TACE的影响的免疫印记。在来自ST101处理的3xTG-AD小鼠(S)与对照小鼠(C)的脑提取物中使用TACE特异性抗体获得免疫印迹。动物用饮用水中5mg/kg/天的ST101处理2个月后在约14.5月龄时被处死。
[0420] 图14示出相对于对照动物，在大多数ST101处理的动物中TACE水平的降低。这表明ST101可以降低TACE水平。
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