一种棉花抗病相关蛋白GaGSTF2及其编码基因与应用
阅读：267发布：2023-02-28
专利汇可以提供一种棉花抗病相关蛋白GaGSTF2及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抗病相关蛋白GaGSTF2及其编码基因与应用。本发明提供的 蛋白质 是如下a)或b)或c)的蛋白质：a) 氨 基酸序列是序列3所示的蛋白质；b)在序列3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。本发明的抗病相关蛋白及其编码基因为人为控制 植物 中抗病相关基因的表达提供了 基础 ，将在培育抗病植物中发挥重要的作用。，下面是一种棉花抗病相关蛋白GaGSTF2及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.如下A）- I）任一所述在如下（1）或（2）中的应用：
A) 蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列3所示；
B）编码A）所述的蛋白质的核酸分子；
C）含有B）所述核酸分子的表达盒；
D）含有B）所述核酸分子的重组载体；
E）含有C）所述表达盒的重组载体；
F）含有B）所述核酸分子的重组微生物；
G）含有C）所述表达盒的重组微生物；
H）含有D）所述重组载体的重组微生物；
I）含有E）所述重组载体的重组微生物；
（1）调控植物对棉花黄萎病的抗性；
（2）培育棉花黄萎病抗性提高的转基因植物；所述棉花黄萎病是由黄萎病菌Vd07038引起的；所述植物为棉花。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B）所述核酸分子的编码序列是序列表中序列2所示的cDNA分子或序列1所示的基因组DNA分子。
3.一种培育棉花黄萎病抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中权利要求1中所述的蛋白质表达，得到转基因植物；所述转基因植物对棉花黄萎病的抗性低于受体植物；所述棉花黄萎病是由黄萎病菌Vd07038引起的；所述植物为棉花。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述转基因植物对棉花黄萎病的抗性低于受体植物体现在如下a1）或a2）：
a1）转基因植物的发病率高于受体植物；
a2）转基因植物的发病时间早于受体植物。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述抑制受体植物中权利要求1中所述的蛋白质表达的方法为向所述受体植物中导入抑制权利要求1中所述的蛋白质表达的物质，
所述抑制权利要求1中所述的蛋白质表达的物质为如下A）或B）：
A）序列表中序列12所示的DNA分子；
B）含有所述A）的表达载体；具体为将所示A）插入表达载体得到的重组载体，所述重组载体为TRV156-GSTF2载体，所述TRV156-GSTF2载体为将序列12所示的DNA片段替换TRV156载体的Xba I 和Sac I酶切位点间的片段，且保持TRV156载体的其他序列不变得到的载体。
6.一种具有如下b1）或b2）中至少一种功能的产品，其活性成分为权利要求5中所述的抑制权利要求1中所述的蛋白质表达的物质；
b1）降低植物对棉花黄萎病的抗性；
b2）培育棉花黄萎病抗性降低的转基因植物；所述棉花黄萎病是由黄萎病菌Vd07038引起的；所述植物为棉花。
一种棉花抗病相关蛋白GaGSTF2及其编码基因与应用
技术领域
背景技术
[0003] 棉花枯萎病和黄萎病是棉花生产上主要的两种病害，堪称棉花的“癌症”，目前尚无有效的措施进行防治。棉花的黄萎病和枯萎病已经成为导致棉花产量损失的主要生物胁迫因素。对棉花的生产的持续稳定发展构成严重威胁，世界上的主要产棉国家都受到它们的侵害，每年都有不同程度的损失。同样的，我国作为棉花生产大国，病害(黄萎病、枯萎病)给我国的棉花产业带来了严重的挑战。棉花的枯萎病菌和黄萎病菌主要通过土壤传播，并且可以在种子、病残体及土壤中越冬。枯萎病菌或者黄萎病菌存活时间长，处理困难，能从棉株根部伤口或直接从根的表皮或根毛侵入，在棉株内扩展，进而危害棉花的维管束等部位，导致叶片枯死或脱落。转基因技术能够将快速、高效地将外源基因整合进入棉花的基因组，产生具有目标性状的转基因棉花。因此，挖掘抗病相关基因成为转基因抗病育种的关键。
[0004] GWAS(Genome wide analysis study)作为一种联系表型与基因型之间的分析方法，已在控制作物(水稻、玉米、谷子、番茄、黄瓜、大豆中)的主要农艺性状的关键基因的定位中发挥着重要作用。中国亚洲棉作为亚洲棉六大地里种系之一，在长期的种植过程中经人工选择和分化形成了众多地方品种，具有一定的多样性，可以作为GWAS分析的群体。而中国亚洲棉在地理选择过程中关键基因受到选择，从而提高了植株抗病性，因此GWAS可以作为鉴定棉花抗病相关基因的强有力手段。
[0005] 谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferanse，GST)是一个同工酶家族，在原核生物和真核生物钟广泛存在。植物中的GST分为 (Phi)、ζ(Zeta)、τ(Tau)、θ(Theta)、λ(Lambda)和脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductases，DHARs)六类。其中(Phi)和τ(Tau)是植物特异性的(Moons A.et al，2003)。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何调控植物对棉花枯萎病和/或黄萎病的抗性。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物对棉花枯萎病和/或黄萎病的抗性相关蛋白。
[0008] 本发明所提供的与植物对棉花枯萎病和/或黄萎病的抗性相关蛋白的名称为GaGSTF2蛋白质，所述GaGSTF2蛋白质为如下a)或b)或c)的蛋白质：
[0009] a)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
[0010] b)在序列3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0011] c)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0012] 其中，序列3由215个氨基酸残基组成。
[0014] 表1、标签的序列
[0015]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0016] 上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0017] 上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0018] 上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0019] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GaGSTF2蛋白质相关的生物材料。
[0020] 本发明提供的与GaGSTF2蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
[0021] A1)编码GaGSTF2蛋白质的核酸分子；
[0022] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0023] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
[0024] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0025] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0026] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0027] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0028] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0029] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0030] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0031] A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0032] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0033] 上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0034] 1)其编码序列是序列2所示的cDNA分子或序列1所示的基因组DNA分子；
[0035] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GaGSTF2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0036] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GaGSTF2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0037] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0038] 其中，序列1由1353个核苷酸组成，序列2由653个核苷酸组成，均编码序列3所示的氨基酸序列。
[0039] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GaGSTF2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与编码GaGSTF2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GaGSTF2蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0040] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0041] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0042] 上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0043] 上述生物材料中，A2)所述的含有编码GaGSTF2蛋白质的核酸分子的表达盒(GaGSTF2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GaGSTF2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GaGSTF2转录的启动子，还可包括终止GaGSTF2转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；
Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,
91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,
91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
[0044] 可用现有的表达载体构建含有所述GaGSTF2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0045] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0047] 上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
[0048] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
[0049] 本发明提供了上述GaGSTF2蛋白质或上述相关生物材料在如下(1)-(5)中至少一种中的应用：
[0050] (1)调控植物对棉花枯萎病的抗性；
[0051] (2)调控植物对棉花黄萎病的抗性；
[0052] (3)调控植物的谷胱甘肽活性；
[0053] (4)培育棉花枯萎病抗性提高的转基因植物；
[0054] (5)培育棉花黄萎病抗性提高的转基因植物。
[0055] 上述应用中，所述调控为提高。
[0056] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育棉花枯萎病抗性降低的转基因植物的方法。
[0057] 本发明提供的培育棉花枯萎病抗性降低的转基因植物的方法包括如下步骤：抑制受体植物中GaGSTF2蛋白质表达，得到转基因植物；所述转基因植物对棉花枯萎病的抗性低于受体植物。
[0058] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育棉花黄萎病抗性降低的转基因植物的方法。
[0059] 本发明提供的培育棉花黄萎病抗性降低的转基因植物的方法包括如下步骤：抑制受体植物中GaGSTF2蛋白质表达，得到转基因植物；所述转基因植物对棉花黄萎病的抗性低于受体植物。
[0060] 上述方法中，所述转基因植物对棉花黄萎病的抗性和/或对棉花枯萎病的抗性低于受体植物体现在如下a1)-a3)中至少一种：
[0061] a1)转基因植物的发病率高于受体植物；
[0062] a2)转基因植物的发病时间早于受体植物；
[0063] a3)转基因植物的谷胱甘肽活性低于受体植物。
[0064] 上述方法中，所述抑制受体植物中GaGSTF2蛋白质表达的方法为向所述受体植物中导入抑制GaGSTF2蛋白质表达的物质。
[0065] 上述方法中，所述抑制GaGSTF2蛋白质表达的物质为如下A)或B)或C)：
[0066] A)序列表中序列12所示的DNA分子；
[0067] B)含有所述A)的表达载体；
[0068] C)B)所述载体和TRV192载体；
[0069] 所述B)具体为将所示A)插入表达载体得到的重组载体。所述重组载体为TRV156-GSTF2载体，所述TRV156-GSTF2载体为将序列12所示的DNA片段替换TRV156载体的Xba I和Sac I酶切位点间的片段，且保持TRV156载体的其他序列不变得到的载体。
[0070] 为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种具有如下b1)-b5)中至少一种功能的产品：
[0071] b1)降低植物对棉花枯萎病的抗性；
[0072] b2)降低植物对棉花黄萎病的抗性；
[0073] b3)降低植物的谷胱甘肽活性；
[0074] b4)培育棉花枯萎病抗性降低的转基因植物；
[0075] b5)培育棉花黄萎病抗性降低的转基因植物。
[0076] 上述产品的活性成分为上述抑制GaGSTF2蛋白质表达的物质。
[0077] 上述方法或产品中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为棉花。
[0078] 本发明方法利用反转录PCR技术从棉花中克隆到了一个含C端和N端分别包含GST结构域蛋白的基因GaGSTF2。通过实验证明：利用VIGS技术获得的GaGSTF2表达水平降低的转基因棉花对致病菌(棉花枯萎病菌(Ag49)、黄萎病菌(Vd-07038))的抵抗能力下降，而GaGSTF2过表达转基因拟南芥则表现出明显抗性。说明GaGSFT2参与了棉花对病原菌及真菌的防御反应，是一种重要的参与棉花天然免疫反应的基因。
附图说明
[0080] 图1是棉花抗病性GWAS分析结果示意图。
[0081] 图2是GaGSTF2基因受棉花枯萎病诱导上调表达示意图。
[0082] 图3是注射VIGS后定量PCR检测基因沉默效率示意图(枯萎病)。其中，TRV156-GaGSTF2-1、TRV156-GaGSTF2-2和TRV156-GaGSTF2-3均为GaGSTF2沉默棉花。
[0083] 图4是注射VIGS后原本抗枯萎病的棉花品系的染病率示意图。
[0084] 图5是注射VIGS后原本抗枯萎病的棉花品系的发病情况示意图。
[0085] 图6是注射VIGS后定量PCR检测基因沉默效率示意图(黄萎病)。其中，TRV156-GaGSTF2-1、TRV156-GaGSTF2-2和TRV156-GaGSTF2-3均为GaGSTF2沉默棉花。
[0086] 图7是注射VIGS后原本抗黄萎病的棉花品系的染病率示意图。
[0087] 图8是注射VIGS后原本抗黄萎病的棉花品系的发病情况示意图。
[0088] 图9是注射VIGS后，谷胱甘肽转移酶(GST)酶活结果示意图。
具体实施方式
[0089] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0090] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0091] 下述实施例中的TRV156和TRV192载体均在文献“Liu Y，Schiff M，Marathe R et al(2002)，Tobacco Rar1，EDS1and NPR1/NIM1like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus.The Plant journal:for cell and molecular biology 30:415-429”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
[0092] 下述实施例中的TRV156-PDS载体在文献“Pang,J.,et al.,Development of Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing and performance evaluation of four marker genes in Gossypium barbadense.PLoS One,2013.8(9):
p.e73211”中公开过，公众可以从中国农业科学院棉花所获得。
p.e73211”中公开过，公众可以从中国农业科学院棉花所获得。
[0093] 下述实施例中的棉花枯萎病菌7号生理小种在文献“李志芳，冯自力，赵丽红，师勇强，朱荷琴.一种棉花枯萎病抗性鉴定的新方法[J]中国棉花，2013，10:15-18.”中公开报道过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
[0094] 下述实施例中的棉花黄萎病菌Vd07038在文献“Chu,J.,et al.,Comparative analyses of secreted proteins from the phytopathogenic fungus Verticillium dahliae in response to nitrogen starvation.Biochim Biophys Acta,2015.1854(5):p.437-48.”中公开报道过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
[0095] 下述实施例中的pCambia3300载体是NTCC典型培养物保藏中心下属的BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的产品，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
[0096] 下述实施例中的农杆菌GV3103在文献“F.van Vliet，B.Silva，M.van Montagu，J.Schell，Transfer of RP4::Mu plasmids to Agrobacterium tumefaciens Plasmid，1(4)：446-455”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
[0097] 实施例1、棉花GaGSTF2基因的克隆及表达模式分析
[0098] 一、GaGSTF2基因的定位
[0099] 1、黄萎病和枯萎病研究群体的选择
[0100] 采用SSR标记引物对中国种系的500余份亚洲棉的多态性进行分析，根据分子标记结果选择215份能够代表中国亚洲棉群体的核心种质材料。
[0101] 2、亚洲棉群体基因型的获得
[0102] 采用QIAGEN(德国)公司的DNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取亚洲棉群体中各个个体的基因组DNA，建库，并进行5倍深度的重测序，采用GATAK软件进行群体SNP分析。
[0103] 3、群体病情指数调查
[0104] (1)枯萎病情指数调查
[0105] 参考文献“李志芳，冯自力，赵丽红，师勇强，朱荷琴.一种棉花枯萎病抗性鉴定的新方法[J]中国棉花，2013，10:15-18.”中的方法，对215份亚洲棉的枯萎病抗病性进行鉴定，统计病情指数。
[0106] (2)黄萎病情指数调查
[0107] 25℃，150rpm的条件下将黄萎病菌Vd07038接种于察氏培养基(NaNO3，2.0g；K2PO4，1.0g；KCl，0.5g；MgSO4·7H2O，0.5g；FeSO4，0.01g；蔗糖30.0g；用水定容至1L)中，培养1周，
7
稀释至10conidia每毫升，备用。采用蘸根法，将种于蛭石和沙土中的2周大的棉花幼苗接种黄萎病菌，发病期统计棉花的发病情况和病情指数。
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稀释至10conidia每毫升，备用。采用蘸根法，将种于蛭石和沙土中的2周大的棉花幼苗接种黄萎病菌，发病期统计棉花的发病情况和病情指数。
[0108] 4、棉花抗病性GWAS分析
[0109] 采用TASSEL软件的GLM(General linear model)模型，进行GWAS分析，其结果见附图1。从结果中可以看出在Cotton_A_12321的启动子上游具有很强的信号。从本地的亚洲棉基因组中提取Cotton_A_12321的蛋白序列，并采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)分析发现该蛋白在C端和N端分别具有一个GST结构域。
[0110] 二、GaGSTF2基因全长的获得
[0111] 1、引物设计
[0112] GaGSTF2-F：TCTAGAATGGTGGTGAAGGTGTATGG(序列4)；
[0113] GaGSTF2-R：GGCGCGCCGAAAGGAGGAGCATAGAGCTG(序列5)。
[0114] 2、以抗病材料浙江定海中棉(由国家棉花种质资源中期库提供)的基因组DNA为模板，采用步骤1设计的引物进行PCR扩增，得到PCR产物。
[0115] PCR扩增反应的反应体系(50μL)如下：5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，GaGSTF2-F(10μM)1μL，GaGSTF2-R(10μM)1μL，Genomic DNA 1μL，PrimeSTAR HS Taq 1μL，超纯水32μL。
[0116] PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃70s，68℃45s，32个循环；68℃5min。
[0117] 3、将步骤2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pMD-19T-Simple(货号：D104A)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入T克隆载体中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，把阳性克隆进行单克隆测序。
[0118] 测序结果表明：PCR扩增得到大小为1353bp的条带，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为GaGSTF2基因。采用DNAMAN软件对获得的序列进行预测分析，发现该基因具有3个外显子，位置分别为1-201bp，331-429bp和1057-1351bp。
[0119] 三、GaGSTF2的cDNA中完整编码区(CDS)的获得
[0120] 1、引物设计
[0121] GaGSTF2-F：TCTAGAATGGTGGTGAAGGTGTATGG(序列4)；
[0122] GaGSTF2-R：GGCGCGCCGAAAGGAGGAGCATAGAGCTG(序列5)。
[0123] 2、以抗病材料浙江定海中棉的总RNA所合成的互补DNA(cDNA)为模板(cDNA获得方法具体参见大连宝生物公司的PrimeScriptTM II 1st Strand cDNASynthesis Kit(货号6210A)中的方法)，采用步骤1所设计的引物进行PCR扩增，得到PCR产物。
[0124] PCR扩增反应的反应体系(50μL)如下：5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，GaGSTF2-F(10μM)1μL，GaGSTF2-R(10μM)1μL，cDNA 1μL，PrimeSTAR HS Taq 1μL，超纯水32μL。
[0125] PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃40s，68℃45s，32个循环；68℃5min。
[0126] 3、将步骤2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pMD-19T-Simple(货号：D104A)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入T克隆载体中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，把阳性克隆进行单克隆测序。
[0127] 测序结果表明：PCR扩增得到大小为645bp的条带，其核苷酸序列如序列2所示，即为GaGSTF2基因cDNA的CDS全长，终止密码子为TAA。采用在线网站GSDS 2.0Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对基因组结构进行了进一步分析，与DNAMAN预测结果一致。采用DNAMAN软件对获得的CDS序列进行蛋白序列预测，结果表明：GaGSTF2基因编码的氨基酸序列如序列3所示，将其命名为GaGSTF2蛋白。
[0128] 四、病菌侵染下GaGSTF2的表达模式分析
[0129] 1、材料选择
[0130] 根据枯萎病和黄萎病病情指数的不同选取表1中的材料进行表达模式分析。其中，平展寨中棉、福建深山乡紫花中棉和商丘小白花均为枯萎病感病材料(susceptible lines)，浙江定海中棉、法库白籽和云南富宁中棉为枯萎病抗病材料(tolerance lines)。湖南常德铁子棉为黄萎病抗病材料(tolerance lines)，纳上区小花为黄萎病感病材料(susceptible lines)。
[0131] 表1、枯萎病和黄萎病的分析材料选择表
[0132]DNA编号 品种名称 中期库编号 生态型 病情指数 基因型
GA0035 平展寨中棉 M310081 S 49.5 G
GA0198 福建深山乡紫花中棉 M310231 S 60.2 G
GA0026 商丘小白花 M310064 YR 56.3 G
GA0078 浙江定海中棉 M310172 CJ 0.3 A
GA0165 法库白籽 M310274 YR 1.2 A
GA0190 云南富宁中棉 M310230 S 2.0 A
GA0099 湖南常德铁子棉 M310220 CJ 3 A
GA0176 纳上区小花 M310313 S 45 G
GA0035 平展寨中棉 M310081 S 49.5 G
GA0198 福建深山乡紫花中棉 M310231 S 60.2 G
GA0026 商丘小白花 M310064 YR 56.3 G
GA0078 浙江定海中棉 M310172 CJ 0.3 A
GA0165 法库白籽 M310274 YR 1.2 A
GA0190 云南富宁中棉 M310230 S 2.0 A
GA0099 湖南常德铁子棉 M310220 CJ 3 A
GA0176 纳上区小花 M310313 S 45 G
[0133] 2、引物设计
[0134] 定量PCR引物如下：
[0135] QGaGSTF2-F：GGGAAAGACAGTAGAGGAAAGGGG(序列6)；
[0136] QGaGSTF2-R：GATCAAATTTTCATCAGGAGGGAACC(序列7)；
[0137] GAhiston3-F：TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA(序列8)；
[0138] GAhiston3-R：GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC(序列9)。
[0139] 3、材料种子及接菌
[0140] 将表1中所示材料的饱满种子种于营养钵中(蛭石：沙子体积比为3:2)，1周大定苗，每个营养钵中留5株，幼苗期(3片真叶)接种枯萎病菌(棉花枯萎病菌7号生理小种)1×106个分生孢子的培养基中，分别于接种后0h、6h、12h、24h、48h和72h取根部，速冻于液氮中，-80℃冰箱保藏备用。
[0141] 4、RNA提取及cDNA的合成
[0142] 采用液氮冷冻研磨样品，并采用植物多糖多酚总RNA(TIANGEN，北京，货号DP441)中的方法提取根部总RNA，随后采用大连宝生物公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(货号RR047A)试剂盒合成cDNA，-20℃保藏备用。
[0143] 5、以步骤4中合成的cDNA为模板，采用步骤2中的引物，使用ABI7900定量PCR仪，进行定量PCR扩增，每个样品3个技术重复，以GAhistone为内参基因，所有数据已0h为对照，采用2-△△CT法进行计算。
[0144] PCR扩增体系如下：SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL；Q12321-F 0.5μL；Q12321-R 0.5μL；ROX Reference Dye II(50×)0.4μL；cDNA模板2μL；ddH2O 6.8μL；
SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL；Ghhistone3-F(内参):0.5μL；
Ghhistone3-R(内参):0.5μL；ROX Reference Dye II(50×)0.4μL；cDNA模板2μL；ddH2O
6.8μL；
SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL；Ghhistone3-F(内参):0.5μL；
Ghhistone3-R(内参):0.5μL；ROX Reference Dye II(50×)0.4μL；cDNA模板2μL；ddH2O
6.8μL；
[0145] PCR条件如下：95℃30s，1个循环；95℃5s；60℃30s，40个循环。95℃15s；60℃30s；95℃15s；
[0146] 采用RQ manager 2.1对获得的数据进行分析，结果如图2所示。从图2中可以看出：GaGSTF2基因在抗病材料(tolerance lines)中受到枯萎病菌的诱导而上调表达，感病材料(susceptible lines)不受枯萎病菌的诱导。该结果进一步验证GWAS定位的结果，说明GaGSTF2与抗枯萎病相关。
[0147] 实施例2、GaGSTF2基因在棉花中的功能验证
[0148] 一、重组载体及重组菌的构建
[0149] 1、TRV156-GSTF2载体的构建
[0150] (1)引物设计：
[0151] VGaGSTF2-F：TCTAGAATGGTGGTGAAGGTGTATGG(序列10)；
[0152] VGaGSTF2-R：GAGCTCTTGATCAAAT TTTCATCAGG(序列11)。
[0153] (2)以抗病材料浙江定海中棉的cDNA为模板，以步骤(1)中设计引物来扩增获得目的片段，连接pMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆，并将其菌液测序。选择正确的克隆，提取质粒(pMD-19T-GaGSTF2-V)。
[0154] (3)采用XbaI和Sac I分别双酶切pMD-19T-GaGSTF2-V和TRV156载体，分别回收小片段和大片段，并采用T4连接酶过夜连接，得到TRV156-GSTF2载体。将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在卡那霉素培养基上筛选阳性克隆，采用菌落PCR验证并对其进行测序。
[0155] 结果表明：TRV156-GSTF2载体为将序列12所示的DNA片段替换TRV156载体的Xba I和Sac I酶切位点间的片段，且保持TRV156载体的其他序列不变得到的载体。
[0156] 2、侵染菌液的制备
[0157] (1)重组菌的获得
[0158] 将步骤1获得的TRV156-GSTF2载体转化农杆菌GV3103，得到重组菌TRV156-GSTF2/GV3103。
[0159] 将TRV156载体转化农杆菌GV3103，得到重组菌TRV156/GV3103。
[0160] 将TRV156-PDS载体转化农杆菌GV3103，得到重组菌TRV156-PDS/GV3103。
[0161] 将TRV192载体转化农杆菌GV3103，得到重组菌TRV192/GV3103。
[0162] 上述TRV156-GaGSTF2/GV3103为实验组；TRV156/GV3103为空载体对照；TRV156-PDS/GV3103为阳性对照，其中，PDS基因为干涉棉花的八氢番茄红素脱氢酶基因，影响叶绿素的合成，导致棉花叶片出现白化现象。
[0163] (2)重组菌的培养
[0164] 分别将重组菌TRV156/GV3103，TRV156-GaGSTF2/GV3103，TRV156-PDS/GV3103和TRV192/GV3103接种于添加25μg/ml利福平，25μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，28℃，180rpm培养至OD值为1.5-2.0；离心(5000rpm)收集上述菌体，并采用MMA溶液(10mM MES、10mM MgCl2、200μM乙酰丁香酮)重悬浮至OD600等于1.5，室温静置5h，分别得到培养后的重组菌。
[0165] (3)侵染菌液的制备
[0166] 将培养后的重组菌TRV156/GV3103与TRV192/GV3103按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液1；
[0167] 将培养后的重组菌TRV156-GaGSTF2/GV3103与TRV192/GV3103按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液2；
[0168] 将培养后的重组菌TRV156-PDS/GV3103与TRV192/GV3103按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液3。
[0169] 二、GaGSTF2沉默棉花的获得及其抗病分析
[0170] (一)GaGSTF2基因在棉花抗枯萎病中的作用
[0171] 1、待侵染棉花幼苗的制备
[0172] (1)棉花生长介质的制备
[0173] 用察氏培养基在35℃的恒温培养箱中培养枯萎病菌(棉花枯萎病菌7号生理小种)6～8天，等孢子数到5×106时，转移到克氏瓶中用玉米糁和沙子的混合物(粗细玉米糁质量比1:1混匀后再和沙子1:1质量比混匀)进行培养，枯萎病生长6～8天后掏出阴干4～6天，然后碾碎备用。将灭菌后的沙子、砂土和营养土按照2：2：1的质量比均匀混合，得到沙土混合物，将培养在玉米糁和沙子的混合物中的枯萎病菌以总质量0.8％的量加入沙土混合物中，混匀，作为棉花生长介质。
[0174] (2)待侵染棉花幼苗的制备
[0175] 挑选饱满的抗枯萎病品种GA0078(浙江定海中棉)和感枯萎病品种GA0198(福建深山乡紫花中棉)(抗枯萎病品种GA0078和感枯萎病品种GA0198的种子均来自中国棉花种质资源库，其编号如表1所示)的种子，分别种植于步骤(1)制备的棉花生长介质中，播种7天后定苗，每个营养钵留5株，25℃，16h光照/8h暗培养进行培养，作为待侵染棉花。其中，感病品种作为发病条件的对照植株。
[0176] 2、GaGSTF2沉默棉花的获得及其在抗枯萎病中的作用
[0177] 分别将混合菌液1、混合菌液2和混合菌液3注射子叶刚平展期的待侵染棉花子叶的下表皮，暗培养24h后在25℃，16h光照/8h暗培养进行培养，分别得到转空载体棉花(TRV156)、GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)和PDS沉默棉花(阳性对照植株)。待阳性对照植株出现白化现象后，随机取转空载体棉花、GaGSTF2沉默棉花和野生型抗枯萎病品种GA0078棉花的叶片，提取总RNA，并进行定量PCR检测基因沉默效率(GaGSTF2沉默棉花中的GaGSTF2基因相对表达量与转空载体棉花中的GaGSTF2基因相对表达量的比值)。检测方法同实施例1步骤四。并于注射混合菌液后的不同的时间观察其表型变化，统计发病率(发病植株占总植株数的比例)。
[0178] 定量PCR检测基因沉默效率见图3，由图3可以看出：和转空载体棉花相比，GaGSTF2沉默棉花中的GaGSTF2基因表达量明显下降，说明GaGSTF2基因被沉默，沉默效率在50％左右。
[0179] 发病率统计结果见图4，发病症状见图5。通过观察发现：和转空载体棉花相比，GaGSTF2沉默棉花发病较早，发病时间提前一天以上而且发病明显增快、病情加重，最终的发病率也比转空载体棉花高很多。说明GaGSTF2沉默棉花的枯萎病抵抗能力明显减弱，进而说明GaGSTF2基因参与棉花抗枯萎病调控，与棉花的抗枯萎病密切相关，可作为育种的候选基因。
[0180] 野生型抗枯萎病品种GA0078棉花和转空载体棉花的PCR检测和表型检测结果均无显著差异。
[0181] (二)GaGSTF2基因在棉花抗黄萎病中的作用
[0182] 1、待侵染棉花幼苗的制备
[0183] 将饱满的抗黄萎病品种GA0099(湖南常德铁子棉)和感黄萎病品种GA0176(纳上区小花)(抗黄萎病品种GA0099和感黄萎病品种GA0176的种子均来自中国棉花种质资源库，其编号如表1所示)的种子播种于营养钵(蛭石与沙子的体积比为3:2)中，播种7天后定苗，每个营养钵留5株，23℃，16h光照/8h暗培养进行培养，作为待侵染棉花。其中，感病品种作为发病条件的对照植株。
[0184] 2、GaGSTF2沉默棉花的获得及基因沉默效率检测
[0185] 分别将混合菌液1、混合菌液2和混合菌液3注射子叶刚平展期的待侵染棉花子叶的下表皮，暗培养24h后在25℃，16h光照/8h暗培养进行培养，分别得到转空载体棉花(TRV156)、GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)和PDS沉默棉花(阳性对照植株)。待阳性对照植株出现白化现象后，随机取转空载体棉花、GaGSTF2沉默棉花和野生型抗黄萎病品种GA0099棉花的叶片，提取总RNA，并进行定量PCR检测基因沉默效率(GaGSTF2沉默棉花中的GaGSTF2基因相对表达量与转空载体棉花中的GaGSTF2基因相对表达量的比值)。检测方法同实施例1步骤四。
[0186] 定量PCR检测基因沉默效率的结果如图6所示。从图6中可以看出：和转空载体棉花相比，GaGSTF2沉默棉花中的GaGSTF2基因表达量明显下降，说明GaGSTF2基因被沉默，沉默效率在50％左右。
[0187] 3、黄萎病菌孢子液的制备
[0188] 用察氏培养基在35℃的恒温培养箱中培养黄萎病菌Vd07038 6～8天，等孢子数到7
1×10时停止培养，用四层纱布滤去菌丝，得到黄萎病菌孢子液。
1×10时停止培养，用四层纱布滤去菌丝，得到黄萎病菌孢子液。
[0189] 4、GaGSTF2沉默棉花的获得及其在抗黄萎病中的作用
[0190] 取黄萎病菌孢子液接种于生长至18天的转空载体棉花(TRV156)、GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)、野生型抗黄萎病品种GA0099棉花和阳性对照植株幼苗的根部(10ml/钵)。之后于不同的时间观察其表型变化，统计发病率。
[0191] 发病率统计结果见图7，发病症状图见图8。从图中可以看出，和转空载体棉花相比，GaGSTF2沉默棉花在接病后，发病率急速上升，即GaGSTF2基因的沉默能显著降低棉花对黄萎病菌的抵抗能力，说明基因GaGSTF2也与棉花抗黄萎病密切相关。
[0192] 野生型抗黄萎病品种GA0099棉花和转空载体棉花的检测结果无显著差异。
[0193] (三)GaGSTF2沉默棉花谷胱甘肽转移酶(GST)酶活测定
[0194] 1、待侵染棉花幼苗的制备
[0195] 分别将饱满的过夜浸泡后的抗枯萎病品种GA0078种子和感枯萎病品种GA0198种子种于营养钵(沙子：蛭石的体积比为2:3)中，覆膜后，放置28℃温室中培养。待子叶破土时揭膜，定苗，每个纸钵中留苗五棵，作为待侵染棉花。
[0196] 2、孢子液的制备
[0197] 用察氏培养基在35℃的恒温培养箱中培养枯萎病菌(棉花枯萎病菌7号生理小种)6～8天，等孢子数到5×106时停止培养，用四层纱布滤去菌丝，枯萎病菌孢子液。
[0198] 3、待侵染棉花出苗后7d左右，分别将混合菌液1、混合菌液2和混合菌液3注射子叶刚平展期的待侵染棉花子叶的下表皮，注射后的棉花在25℃，16h光照/8h暗培养进行培养，分别得到转空载体棉花(TRV156)、GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)和PDS沉默棉花(阳性对照植株)。
[0199] 4、待阳性对照植株出现白化现象后，分别提取转空载体棉花(TRV156)、GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)和抗病枯萎病品种GA0078的总RNA，并进行定量PCR检测，检测方法同实施例1步骤四。
[0200] 定量PCR检测结果表明：和转空载体棉花与抗病材料GA0078相比，GaGSTF2沉默棉花中的GaGSTF2基因表达量明显下降。
[0201] 5、播种后第25天，分别将转空载体棉花(TRV156)、GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)、抗病枯萎病品种GA0078棉花和感枯萎病品种GA0198棉花接入步骤2制备的枯萎病菌孢子液，每纸钵接10ml，孢子浓度为5×106。并于接种后0h、6h、12h、24h、48h、72h对根进行取样，每次取样为3个生物学重复。使用还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(分光光度法)(南京建成生物科技有限公司，货号A006-1)测定枯萎病侵染的转空载体棉花(TRV156)、GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)、抗病枯萎病品种GA0078棉花和感枯萎病品种GA0198棉花的根部中的谷胱甘肽(GSH)活性。
[0202] 谷胱甘肽(GSH)活性检测结果见图9所示，由图9可以看出，GaGSTF2沉默棉花(TRV156-GaGSTF2)和感枯萎病品种GA0198棉花的GST酶活变化趋势一致，说明随着目的基因表达量的变化，GST也呈现出相同的变化趋势，这也进一步说明GAGSTF2与棉花的枯萎病抗性相关。
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