本申请是申请日为2001年5月14日、发明名称为“人体内生长 激素变异的检测方法、该变异及其应用”的中国发明专利申请 No.01809392.2的分案申请。

本发明涉及一种检测自然发生的生长激素突变的方法；还涉及由 此检测到的突变，及其在筛选生长激素紊乱患者方面或在制造适于治 疗此类紊乱的变体蛋白质方面的应用。

一个多世纪以前人们已经知道，人类的身材受遗传因素的影响。 虽然早在1912年，家族性矮小身材及其通常以隐性方式遗传的特点就 为人所知，但在科学文献中正确地记载这些家族则是20多年后的事。 而直到1966年人们才认识到隐性遗传的矮小身材通常与单一性生长 激素(GH)缺乏症相关。

与生长激素缺陷相关的矮小身材，在出生人口中的发生几率估计 在1/4000到1/10000之间。其中大多数情况为偶尔发生的和自发性的， 但5％到30％的病例有与遗传病因相一致的轻度发病相关性。对生长激 素缺陷的遗传病因的证实，来自对家族性矮小身材的分子遗传学分析， 以及早期对发病个体中垂体表达的生长激素基因(GH1)突变损伤的阐 述。家族性矮小身材也有可能是许多其它基因(如POU1F1，PROP1和 GHRHR)突变所致，将不同的类型区分开来是重要的。

生长激素(GH)是一种多功能的激素，通过各种效应促进出生后 骨骼和软组织生长。对GH直接和间接作用的相对作用仍有争议。一方 面，GH在各种组织和器官中的直接效应现已得到阐明，并证明在多种 细胞类型中存在生长激素受体。另一方面，有充分的数据表明大多数 GH的效应是通过生长激素依赖的胰岛素样生长因子I(IGF-1)所介导 的。IGF-I是由多种组织，主要是肝脏所产生的，并通过其受体促进 包括骨、软骨、骨骼肌在内的多种组织的发育和成熟。除了促进组织 生长，GH还可发挥许多其它生物作用，包括生乳的、致糖尿病的、脂 肪分解和蛋白质合成代谢的作用以及钠和水的潴留作用。

在整个儿童期需要足量的GH来维持正常生长。GH缺陷的新生儿 通常身高和体重正常。有些可能有阴茎过小或空腹性低血糖，伴随低 线性的出生后的生长，其随着年龄的增长转变为进行性生长迟缓。在 单一性生长激素缺乏症(IGHD)的个体中，骨骼成熟延迟，并通常伴 随着身高的发育延迟。经常会出现躯体肥胖、面貌年轻于实足年龄、 恒牙出牙延迟的现象。在发病的成人中，可见与早老性人相似的皮肤 变化。

家族性IGHD包含几种不同的具有典型的遗传方式的疾病。已知与 GH1基因座位缺损相关的IGHD形式，连同目前检测到的不同类型的基 本损伤，列于表1中。

表1：与GH1基因有关的遗传性疾病的分类  疾病   遗传方式   效应基因损伤   的类型   GH蛋   白质   缺陷状态  IGHD IA   常染色体   隐性   大的缺失   少量缺失   无意突变   无   严重矮小身材.用GH治疗   时经常产生抗-GH的抗体，   因此反应较弱.  IGHD IB   常染色体   隐性   剪接位点突变   缺陷   矮小身材.患者通常对外源   性GH反应较好.  IGHD II   常染色体   显性   剪接位点和内   含子突变，错   意突变   缺陷   矮小身材.患者通常对外源   性GH反应较好.

这些损伤特性有助于解释这些类型的IGHD的临床严重程度、遗传 方式及针对外源性GH给药时产生抗体的倾向性方面的差异。大部分病 例是偶尔发生的，并被认为是由脑损伤或缺陷，包括脑水肿、染色体 异常、组织细胞增多病、感染、辐射、眼中隔发育不良、外伤、或肿 瘤侵袭下丘脑或垂体所造成的。磁共振成像检查可从12％的IGHD患 者中检测出下丘脑或垂体异常。

尽管矮小身材、“高度速度”迟缓或生长速度迟缓及骨骼成熟延 迟均可见于GH缺陷，但它们并非这一疾病的独有特征，其它系统性疾 病也可能导致这些症状。在本说明书中，“高度速度”或生长速度均 指受试者或患者身高变化的速率，如以每年多少厘米来度量。

证明GH缺陷的刺激试验采用L-多巴(L-Dopa)、胰岛素诱导的 低血糖症、精氨酸、胰岛素-精氨酸、氯压定(clonidine)、胰高血 糖素或心得安(propranolol)。不同试验中不足GH峰效应(通常 ＜7-10ng/mL)不同。应进行LH、FSH、TSH和ACTH的相关缺乏症的测 定，以判断垂体功能障碍的程度并制定最佳治疗方案。

重组产生的GH在全世界都可买到，经皮下注射给药。为获得最佳 结果，患有IGHD的儿童通常一经确诊就开始进行替代治疗。重组GH 的初始剂量依体重或体表面积而定，但不同方案所用的确切数量及给 药频率可能有所不同。在青春期，剂量随着体重的增加而增加直至最 大值。其后，GH治疗应暂时停止，同时对个体的GH的分泌能力重新 评价。确认为GH缺陷的，在成年期可接受低剂量的外源性GH。

使用GH进行治疗的情况包括：(i)已证明GH对其有效的和(ii) 有使用报导，但不被认为是标准惯例的各种其它情况。已证明GH对其 有效的疾病包括单一性GH缺乏症、伴有并发性垂体激素缺乏症(CPHD) 的GH缺乏症，以及特纳综合症。前两种疾病的个体对GH替代治疗的 临床效应取决于：(i)GH缺陷的严重程度和它对生长的不利影响， 开始治疗的年龄，出生时体重，当前体重和GH剂量；(ii)对相关的 缺陷如甲状腺激素缺陷的治疗的识别与效应；(iii)是否因抗GH抗 体的生成而使治疗变得复杂。对患有特纳综合症个体的治疗效果，因 其矮小身材的严重程度，染色体互补及开始治疗的年龄而不同。

已报导的应用GH治疗的其它疾病，包括治疗某些骨骼发育不良如 软骨发育不全，Prader-Willi综合症，外源类固醇继发性，或与长期 感染性疾病，如类风湿性关节炎相关的生长抑制、慢性肾衰竭、极度 先天性矮小、Russell-Silver综合症和子宫内的生长迟缓等。

有多种理由表明对家族性IGHD在分子遗传学水平上的性质鉴定 很重要。对相关位点的阐释不仅可表明生长迟缓可能的严重程度，更 重要的是，可表明当前各种治疗方案是否恰当。同时，对潜在的基因 损伤的检测可确定该病的遗传病因。它可能在预见(i)生长延迟的严 重程度和(ii)随GH治疗产生抗GH抗体的可能性中还具有预后价值。 在某些情况下，对病理损伤的了解还有助于解释这种疾病的异常的遗 传方式，并由此对发病家族的咨询而言十分重要。最后，对引起带有 功能障碍(与无功能相对)性GH分子的突变损伤的性质鉴定，可以对 GH结构与功能产生新的认识。

在细胞水平上，一个GH分子结合两个GH受体分子(GHR)，导致 它们二聚化。据信GH结合的两个GHR分子的二聚化，对于酪氨酸激酶 JAK-2相关的信号转导是必需的。研究表明，GH的各种作用可能是由 单一类型的GHR分子所介导的，这些分子在不同组织中具有不同的胞 质结构域或磷酸化位点。被JAK-2激活后，那些不同的胞质结构域可 引起不同的磷酸化途径，其一是生长效应，另外则是各种代谢效应。

GH是由垂体前叶的促生长细胞所分泌的22KDa的蛋白质。X-射线 晶体学研究表明，GH包含以上-上-下-下的方式排列的两对平行α-螺 旋所形成的核心。这一结构借助分子间二硫键(Cys53-Cys165和 Cys182-Cys189)得以稳定。两个生长激素受体(GHR)分子与GH分子 上的两个结构不同的位点结合，依次与位点1和位点2相结合。GHR 与GH的结合增强了GHR分子的二聚化。

对GH分子的扫描突变生成研究提供了GH与其受体间的结合相互 作用的图谱，而定点突变已用来探查特定残基的功能。因此，用Arg 替换Gly120(位于人GH第3个α-螺旋上)导致GHR不能与位点2结 合从而阻断了GHR的二聚化。与此相似，人GH蛋白质中的Phe44残基 对结合催乳激素受体非常重要。最后，已证实Asp115、Gly119、Ala122 和Leu123对鼠GH分子的生长促进潜力至关重要。

二聚化GHR与胞内酪氨酸蛋白激酶JAK2的相互作用导致下游信号 转导分子中酪氨酸磷酸化、有丝分裂原-活化蛋白(MAP)激酶的刺激 和信号转导子及转录激活子(STAT蛋白)的诱导。这样，GH可通过多 条不同的信号途径影响多个基因的表达。

通过表达GH1基因产生了几种不同的GH同种型(GH1参考序列如 图5所示)。在9％的GH1转录产物中，外显子2与外显子3内45bp 处的可变剪接受体拼接，从而缺失了32-46位的氨基酸残基，形成 20KDa的同种型，而不是正常的22KDa蛋白质。该20KDa的同种型显 示能够促进生长和分化。决定可变剪接受体选择的相关因素尚未性质 鉴定，但其无疑具有复合体性质。在垂体肿瘤中可检测到痕量的 17.5KDa的同种型，它是由外显子3编码的32-71位密码子的缺失所 致。已报导在垂体中有缺少外显子3和4或者缺少外显子2、3和4的 拼接产物，但它们编码没有活性的蛋白质。还有关于24KDa的糖基化 的GH变体的描述。主要的22KDa同种型的氨基酸序列如图6所示，其 显示了GH1基因编码区核苷酸序列及包括26个氨基酸前导肽在内的蛋 白质氨基酸序列。侧面的数字表示氨基酸残基序号。垂直箭头侧面的 粗体数字指定出外显子边界。终止密码子以星号标出。

编码垂体生长激素(GH1)的基因位于染色体17q23上的5个相关 基因簇内(图1)。现已测定了该66.5Kb基因簇的全部序列(Chen 等人，基因组(Genomics)4：479-497，1989，见图5)。生长激素 基因簇中的其它基因座为两个绒毛膜生长催乳激素基因(CSH1和 CSH2)，一个绒毛膜生长催乳激素假基因(CSHP1)和一个生长激素基 因(GH2)。这些基因被长度为6-13bp的基因间区隔开，位于相同的 转录方向上，在胎盘表达且受下游组织特异性增强子的控制。GH2基 因位点编码与GH1来源生长激素有13个氨基酸残基差异的蛋白质。全 部5个基因有十分相似的结构，即5个外显子在相同位置上为短内含 子所隔断，这些内含子在GH1中的长度分别为260bp、209bp、92bp 和253bp(图2)。

GH1基因的外显子1包含60bp的5’非翻译序列(尽管在-54位有 另一个转录起始位点)、-26～-24位密码子和对应于26个氨基酸的前 导序列的起始位点的-23位密码子的第一个核苷酸。外显子2编码前 导肽的其余序列及成熟GH的前31个氨基酸。外显子3～5分别编码第 32-71、72-126和127-191位氨基酸。外显子5还编码结束于多聚腺 苷酸化位点的112bp的3’非翻译序列。在多聚腺苷酸位点3’100bp 处有Alu重复序列元件。尽管这5个相关基因在整个5’旁侧区和编码 区高度同源，但它们在3’旁侧区存在差异。

GH1和GH2基因的mRNA拼接方式不同。如上所述，在9％的GH1 转录产物中，外显子2与外显子3内45bp处的可变剪接受体拼接，形 成20KDa的同种型，而不是正常的22KDa蛋白质。GH2基因不以这种 方式可变剪接。缺少GH1的外显子3所编码的40个氨基酸的第3种 17.5KDa的变体也已被报导。

CSH1和CSH2基因座编码序列相同的蛋白质，它们在DNA水平上 与GH1序列有93％的同源性。与CSH基因序列比较，CSHP1假基因在其 “外显子”中含有25个核苷酸的替换，及内含子2的供体剪接位点的 专性+1位置处的一个G→A转换，这使其表达部分失活。

据报导，在GH基因区域内存在大量的双等位基因限制性片段长度 多态性(RELPs)。其中5个(2个BglII，2个MspI，1个HincI)出 现在高加索人和黑人当中，另外一个BamHI多态性主要出现在黑人当 中。在这些多态性中观察到高度的连锁不平衡，与基因簇的较近的进 化起源关系是一致的。HincII和BamHI多态性出现在紧靠GH1基因5′ 端。-75位核苷酸处A/G二态性所致的RsaI多态性出现在GH1启动子 区域，而相对常见的SphI多态性，还需进行充分地性质鉴定。在距 GH1基因3’端大约19kb处，存在不同数量有高度提示性的(83％杂合 性)重复的多态性；采用PCR方法，该多态性中的18种不同等位基因 可通过片段大小加以区分(201bp-253bp)。

最后，GH1基因的启动子/5’非翻译区域570bp片段内含有17个 不同的核苷酸，呈现出相当高水平的序列多态性(表2A)。

表2A：已知的人GH1基因启动子/5’非翻译区域多态性[Giordano 等人，人类遗传学(Human Genetics)100：249-255，1997和Wagner 等人，欧洲内分泌杂志(Eur.J.Endocrinol.)137：474-481](图 3)

表2A：在人GH1基因启动子/5’非翻译区已知的多态性[根据 Giordano等，Human Genetics 100：249-255(1997)和Wagner等 Eur.J.Endocrinol.137：474-481].(图3)   核苷酸位置   多态性(可变核苷酸)   -476   G/A   -364   G/T   -339   ΔG   -308   T/G   -301   T/G   -278   T/G   -272至-276   CCAGA/SMRRR   -168   T/C   -75   A/G   -57   G/T   -31   ΔG   -6   G/A   -1   T/A/C   +3   G/C   +16   A/G   +26   A/C   +59   T/G

预测由-1、+3和+59处的多态性将引起GHDTA蛋白质中氨基酸替 换，该蛋白质推定是由GH1基因启动子上相应区域所编码的(见下文)。 一些序列变体出现的位置，正是GH1基因与其它胎盘表达的基因所不 同的地方，这暗示其机制可能是基因转换，而胎盘基因做为转换序列 的供体。

在对具有GH不足的青春期前矮小儿童的研究中，Hasegawa等人 [J.Clin.Endocrinol Metab 85：1290-1295，2000]报导了GH1基 因中3种多态性[IVS4 C→T 1101(在下文表7A和7B中也有报导)， T/G-278和T/G-57]和GH分泌及身高之间的关联。

从第一个GH1基因缺失被报导以来，已经描述了许多更为微细的 损伤。在某些病例中，这些损伤与罕见类型的GH缺陷相关，并对作为 获取对GH结构与功能的新认识的手段是非常重要的。

编码生长激素(GH1)的基因是最早克隆的人类基因之一，很快， 最早的导致遗传性生长激素缺陷的大的缺失(6.7Kb型)就通过 Southern印迹检测出来。涉及GH基因的所有大的缺失均导致严重缺 陷(IA型)，其特征是GH的完全缺失。大约70％的鉴定的GH1基因的缺 失长度为6.7kb，而其它大部分的长度为7.6kb或7.0kb(表2B-涉及 GH1基因或GH1基因邻近部位的大的缺失，其导致GH缺陷和矮小身材)

表2B：GH1基因或其邻近区域的大的缺失   缺失大   小   涉及的基因座   位   注释   治疗后是否产   生抗体？   6.7   GH1   瑞士人家系   是   6.7   GH1   日本人家系   是   6.7   GH1   西班牙裔阿根廷人家系.纯合的.   是   6.7   GH1   澳大利亚人家系   是   6.7   GH1   巴西人家系   是   6.7   GH1   矮小身材和囊性纤维化的患者   是   6.7   GH1   各种   否   7.6   GH1   伊拉克、也门和伊朗人家系   否   7.6   GH1   意大利人家系.纯合的.近亲结婚.   是   7.6   GH1   意大利和土耳其人家系   是   7.6   GH1   西班牙人家系   否   7.6   GH1   各种   是   7.0   GH1   加拿大人家系   是   7.0   GH1   墨西哥人家系   是   7.0   GH1   中国人家系.纯合的   否-未用GH治   疗   45   GH1，CSHP1，   CSH1，GH2   土耳其人家系.纯合的.近亲结婚.   是   45   GH1，CSHP1，   CSH1，GH2   意大利人家系.纯合的.   是   45   GH1，CSHP1，   CSH1，GH2   意大利人家系.纯合的.近亲结婚   是   45   GH1，CSHP1，   CSH1，GH2   亚洲人家系   否   ？   CSH1，GH2，   CSH2   意大利人家系.杂合的   否   ？   CSH1，GH2，   CSH2   丹麦人家系.复合杂合的非相同性   缺失   否   双重   (i)GH1(6.7kb)   (ii)CSH1，   GH2，   CSH2(～32kb)   法裔(罗马).纯合的.近亲结婚.   是

此外，一些很不常见的缺失实例亦见报导。近年来，人们进行了 许多尝试，由Southern印迹转向以PCR为基础的方法作为突变筛选 的工具。利用PCR扩增GH1基因和旁侧区，然后对PCR产物进行限制 性酶切消化，可以相当简便地检测出纯合的GH1基因缺失。尽管这一 方法成功地应用于排除危险妊娠中的GH1基因缺失纯合性，它却不能 区分野生型的纯合性基因与基因缺失的杂合性基因。除较短的6.7kb、 7.0kb和7.6kb的缺失(只去除GH1基因)以外，该方法检测不到其 它缺失。

设计紧靠GH1基因两侧的PCR引物，从对照DNA样本中产生790bp 的片段。缺少这一片段被认为是GH1基因缺失，但是，用“非特异性 PCR片段”作为PCR扩增的内对照必然使这一方法的可靠性受到某种 程度的质疑。

象大的缺失一样，三种GH1基因微小缺失也有报导；其中两名患 者也是6.7kb GH1基因缺失的杂合体(表3)。

表3：导致GH缺陷和矮小身材的GH1基因中的少量缺失   缺失类   型   缺失(小写字母表示缺失的碱基.^在紧   接的下游指定了的被编号的密码子的   位置)  密码子(相对于  -26位的翻译  起始密码子编  号) 治疗后 是否出 现抗体？   IA   GCCTG^CTCTGcCTGCCCTGGC  -11 是   II   CCCCAGGCGGggatgggggagacctgtaG   TCAGAGCCC  内含子3(缺失  +28至+45) 否   IA   TCTGT^TTCTCagAGTCTATTCC  54 否

在GH1基因编码区内，只有7个不同的单碱基对替换见诸报导(表 4)。

表4：导致GH缺陷和矮小身材的GH1编码区内的单碱基对替换   缺陷类型   核苷酸替换   氨基酸替换   密码子(相对   于-26位的翻   译起始密码子   编号)   治疗后是否出   现抗体？   IA   ACA→GCA   Thr→Ala   -24   否   IA   TGG→TAG   Trp→Term   -7   否   IA   GAG→TAG   Glu→Term   -4   是   II   CGC→TGC   Arg→Cys   77   否   ？   CCC→CTC   Pro→Leu   89   否   ？   GAC→GGC   Asp→Gly   112   否   ？   CGC→CAC   Arg→His   183   否

这些单碱基替换中有两个是无义突变，将信号肽中的氨基酸残基 Trp-7和Glu-4变成终止密码子。这些突变是唯一已知的导致IA型缺 陷(非基因缺失)的基因损伤。这些损伤预示翻译在信号肽内终止， 因此不能产生有功能的GH分子。另外5个单碱基对替换(包括密码 子77处的R→C，公开于EPA790350中有关巨人症的治疗)是错义突 变，其导致产生功能异常的生长激素分子。这种自然发生的突变远比 人工诱导的突变更具提示性意义，因为前者原则上与临床表型即该患 者的身高直接相关。

通过对3个IGHD IA型的中国患者和2个对照者的GH1基因启动 子区域(在相对于转录起始位点的-60和+70间)的序列测定，首次 找出了启动子区域可能具病理意义的单碱基对替换。指出了几处差 异，但其可能是多态性，没有进一步的性质鉴定。如上文所述，后来 表明GH1基因启动子区域显示出非常高的序列多态性(在570bp片段 中有17个变异核苷酸)(图3)。可是与对照者相比，没有发现这些 序列变体在患者中存在的概率增加。

对GH1启动子变异分别进行了调查研究，共检测出22个变异多 态性位点，大多数为单碱基对替换：其中17个出现在ATG起始密码5’ 端的550bp区域，3个出现在ATG 5’端-1075左右，2个分别出现在 内含子1中的76和219位置处[Wagner等人，Eur J Endocrinol 137： 474-81，1997]。除了4种变体，所有其他变体也出现在对照者中， 但并不认为是这4种变体导致了生长激素缺陷。只有一个变体位点出 现在与转录结合位点同源的一段序列内：在潜在的(但未确证的)NF-1 结合位点内-333位，或者为CCAGA，或者为GAGAG序列。

因此，至今尚无在GH1基因启动子内的具病理意义的突变的报导。

GH1基因内单碱基对替换对mRNA的拼接的影响已有描述。其中大 部分与相对罕见的显性形式的GH缺陷有关(表5)。

表5：影响mRNA剪接和导致GH缺陷和矮小身材的单碱基对替换   缺陷类型   核苷酸替换/位置   剪接位点   人种-地理起源/接合性   II   G→A，+1   IVS3供体   瑞典，北美，北欧，南非，智   利/杂和的   II   G→C，+1   IVS3供体   土耳其/杂和的   II   T→C，+2   IVS3供体   ？   II   G→A，+5   IVS3供体   智利/杂和的   II   G→C，+5   IVS3供体   ？   II   T→C，+6   IVS3供体   土耳其/杂和的   亚洲人/杂和的   II   G→A，+28   IVS3供体   ？/杂和的   IB   G→C，+1   IVS4供体   沙特阿拉伯/纯和的   IB   G→T，+1   IVS4供体   沙特阿拉伯/纯和的   IB   G→C，+5   IVS4供体   ？

转染细胞mRNA体外表达分析表明，第4内含子供体剪接位点处 的碱基颠换，可激活外显子4供体剪接位点5’端73bp处的隐蔽剪接 位点。这预示可产生异常的拼接产物，其缺少外显子4所编码的 103-126氨基酸以及由于阅读框架移动而掺入94个新氨基酸(其中包 括29个由于GH1基因中正常3’非翻译区的通读而产生的氨基酸)。

由于外显子4和5编码的GH蛋白质区域被认为对蛋白质正确靶 向到分泌小体至关重要，所以预测这种异常蛋白质不能正常分泌。然 而，在IB型GH缺陷患者体内没有发现针对外源性GH的抗体。免疫 不耐受的屏蔽可能表明，至少某些异常蛋白质产物可以分泌，且其在 循环中部分地稳定。7种已知的IVS3(表5)内的剪接突变与表现为 发病家族常染色体显性遗传的II型缺陷有关。

具有截短的GH1突变或纯合的基因缺失的GH缺陷患者，GH治疗 时有产生抗GH抗体的危险。相反，我们未见到任何描述伴随错义突 变或剪接位点单碱基对替换患者体内产生同种抗体的报道。

迄今，没有其它的突变基因型与临床表型间相互关系的报导。在 公开发表的文献中，必要的数据极少且质量相差很大，但我们尝试以 粗略的中间分析法为手段，来衡量是否具大的基因缺失的患者与具剪 接位点突变的患者在临床和表型后遗症上不同。发现GH1缺失患者的 身高比标准年龄组均值(n＝29)平均低7.3SD，而GH1剪接突变患者 的身高则平均低于均值(n＝17)5.4SD。尽管缺失患者的骨龄延迟更大， 生长速度更低，但这些发现由于可能受到谱系偏性的影响，因而很难 解释。

因为大多数目前为止所描述的家族性GH缺失病例为常染色体隐 性性状遗传，所以很可能某些遗传缺陷状态因家系小而未为人知。类 似地，由新的GH1基因突变所致的GH缺陷病例可能被归类为偶尔发 生的，人们既不会采纳也不会寻求对疾病的遗传学解释。最后，依照 定义缺陷状态所采用的标准，GH缺陷的表型和基因型谱全貌可能永远 不会引起临床关注。由于这些原因，当前对GH缺陷存在范围的估计 可能是不准确的，也许因此严重低估了人群中的真实存在范围。

被大多数认可的IGHD的定义结合了(a)严重的生长迟缓，通常 -如上文所述-限定为身高＜-4.5SD；(b)降低的对刺激/激发作用的 GH反应(即血清GH水平＜40ng/ml)；及(c)没有其它导致生长迟缓 的因素。在选择患者进行研究时，严格遵守组成GH缺陷正式的定义， 以及对各标准尤其是准则(b)相当统一的认同[Shalet SM 等，Endocrine Rev19，203-223(1998)]，说明GH1突变谱不仅不 全面，且不能代表较宽突变谱。因此，导致SD值不是非常低或GH水 平降低不多的GH缺陷的突变(如基因编码区的错义突变或启动子突 变)极少会引起临床重视。事实上，这可在某种程度上解释为什么至 今只有5种不同GH1基因的错义突变的报导，这一结果对于一种在分 子水平上研究了近20年、非常普遍的疾病而言，实在是史无前例的 (人类基因突变数据库(The Human Gene Mutation Database)； Krawczak等人，Hum Mutation 15：45-51，2000)。

GH完全缺失引起易识别的严重临床表型，其已得到广泛研究。在 那些患者表型不太严重，以及患者选择标准经过实际确认的报导的研 究中，患者确定方案通常用个体身高与对于其年龄的平均身高的偏差 作为生长衰退的诊断指标。

用标准(a)和(b)选择患者，如上所述，可用于判定程度严重的 IGHD相关的生长衰退患者。我们曾提出，调整研究中的选择患者所用 的标准，可能将其生长衰退为GH缺陷谱不同部分的体现的患者包括 进来，并可由此产生一套新的潜在突变损伤。某些该新损伤能产生稳 定的但无功能的GH分子，其具有正常的免疫反应性，而几乎没有或 没有生物活性。根据放射性免疫测定试验的结果，功能障碍的GH分 子可能被错误地认为是正常的。如果这种功能障碍的变体是普遍的， 那么当前依赖基于放射性免疫测定的GH“功能试验”将导致GH缺陷 的诊断不完全。进而也表明急需开发真正的功能性诊断分析方法。

我们认为身高增长速度是比绝对身高更为灵敏的生长障碍指标。 联合采用增高速度和骨龄延迟(也是由GH缺陷引起的骨成熟迟缓) 的估算及其它一些正常变量，我们可以确定统一的患者群，其具有比 典型的无GH的IGHD患者轻的表型，但这类患者与只基于身高选择的 患者相比，更可能具有GH1基因的损伤。另一个重要的指标是生长衰 退，其可能伴随或不伴随矮小身材和/或增高速度迟缓和/或骨龄延 迟。

为此，本发明提供了一种检测GH1变异的方法，可有效作为个体 GH功能障碍指标，该检测方法包含以下步骤：

(a)从个体中获得含有人GH1基因核苷酸序列的试验样本；及

(b)将从试验样本中获得的序列与已知的人GH1基因标准序列进 行比较，其中试验样本序列与标准序列的差异指示存在可有效作为GH 功能障碍指示物的变异(下文称“GH1变体”)，其特征在于，试验 采样个体符合以下标准：

(i)生长衰退，定义为一种生长模式[通过一系列身高测量绘制 的，Brook CDG(Ed)临床儿科内分泌学(Clinical Paediatric Endocrinology)第三版，第9章，p141(1995，Blackwell Science)]， 即在标准身高记录纸上进行绘图时[Tanner等人，Arch Dis Child 45： 755-762，1970]，预报该个体的成年身高，处于根据该个体的父母身 高所估计的个体目标成年身高的范围之外。

本发明还提供了GH1变体，该变体是用本发明上文所述方法检出 的或能检测到的。

本发明还提供了GH1变体的转录产物，如含有由GH1变体所编码 的氨基酸序列的蛋白质(下文的“GH变体”)，其中该GH1变体是 用本发明上文所述方法检出的或能检测到的。

(本发明中，术语“患者”和“个体”在本发明的上下文中交替 使用)。

标准(i)的有益参考文献为Tanner和Whitehouse.Arch Dis Child 52：170-179，1976]。患者目标成年身高范围通过父母平均身 高(mid-parental height，MPH)来计算，范围在平均身高的10-90％ 间，依性别而定：

MPH(男性)＝[父亲身高+(母亲身高+13)]/2±6～8cm，通常是 7.5cm，而

MPH(女性)＝[(父亲身高-13)+母亲身高]/2±6～8cm，通常是 6cm。

这些是用于人生长范畴的标准试验和方法，尽管上述基于 Brook(同前，1996)关于用来预测目标身高范围界限的公式的描述及 Tanner(目前，1970)关于标准身高图的描述的方法为本发明的优选方 法，但其它任何可接受的计算方法，都可用来判定生长衰退。

因而这种标准根本不同于那些迄今在鉴定GH功能障碍患者时所 用的标准，且涉及到根据父母身高预测患者的(未来)成年身高。

优选地，本发明的检测方法中，除上述标准(i)外，试验样品采 样个体还符合如下一个或多个标准，即：

(ii)身高增长速度相对于年龄来说低25％；和/或

(iii)根据Tanner-Whitehouse度量法，与实龄比较骨龄延迟至 少为两年；和/或

(iv)没有其它已知疾病可能产生上述标准(i)～(iii)包含 的症状。

优选地，标准(ii)～(iv)可累加应用，因此对于特定个体/ 患者，需同时满足标准(ii)、(iii)和(iv)。

对于标准(ii)～(iv)，各标准可根据本领域中易于获得的和 描述的已知方法和参数进行评价，如下文所详细阐述：

(ii)以Tanner JM，Whitehouse RH.Atlas of Children’s Growth，1982年，伦敦：学院出版社(Academic press)；及Butler 等人，Ann Hum Biol，17：177-198，1990为原始资料，统计出第一 个判定标准，即患者身高增长速度对于其年龄来说低25％。

(iii)Tanner JM，Whitehouse RH，Cameron N等人在骨骼成熟 和成年身高预测(Assessment of Skeletal Maturity and Prediction of Adult Height)(1983，伦敦，学院出版社)中描述了 Tanner-Whitehouse度量法估算骨龄延迟。本发明方法中，个体优选 地表现出骨龄延迟3.5～4年(与实龄相比较时)。对个体的骨龄延迟 进行一次以上的估算时，个体年龄越小，估算值发生的变化越大，例 如，对一个2岁儿童进行多次估算可能得到的骨龄延迟结果在+/-6个 月间变化，而3岁儿童可能在+/-4个月间变化。

(iv)因为矮小身材也可能由GH功能障碍以外的其它状况继发产 生的，因此感染此类疾病患者的试验样本不在本发明方法之列。通过 基线调查来判定未感染可引发与GH功能障碍相似症状的其它疾病的 患者。因此“基线调查”(“Baseline investigutions”)包括排除， 特别是排除甲状腺机能衰退、甲状旁腺功能衰退、营养吸收不良综合 症如乳糜泄、肾脏与肝脏疾病、血液学疾病如贫血症的方法，以及核 对染色体异常如Tanner综合症不是导致生长功能障碍的原因的染色 体核型。还应对患者实行全面的临床检查，以排除引起生长功能障碍 的其它因素，如包括先天性心脏病的心脏疾病；慢性自身免疫疾病如 类风温性关节炎和肠炎；慢性呼吸疾病如严重哮喘或囊肿性纤维化； 和骨骼问题如软骨发育不全。完整的治疗史也应作为医学检查的补充， 不仅有助于排除上述已鉴别的物理性疾病，还可排除另外一种众所周 知的导致儿童生长缺陷的自闭症。

任选地，(V)，还可对患者施行一项或多项生长激素功能试验。 术语“生长激素功能试验”指生长激素分泌试验，如上文中提到的刺 激试验，特别是胰岛素诱导的低血糖症试验(IST)。

通常施行GH功能试验的患者为：矮小的；经临床评定的，就诊于 内分泌门诊一次以上进行身高监控的；没有其它能检测到的可致生长 衰退疾病的；因此有理由接受对其经适当刺激后(如经胰岛素静脉给 药所引起的血糖急剧下降)，垂体产生生长激素分泌的能力的评估的。 优选地，在本发明的方法中，个体生长激素功能试验的结果是正常的。

因此，在根据本发明的检测方法中，尽管可测定当前身高以应用 于上述标准，但身高本身不用作该方法中选择患者的标准。如上文所 述，现有技术方法以偏离“正常”身高水平(即绝对生长)为标准来 选择患者。本发明不需要包括这样的标准，因此本发明提供了排除或 可以排除绝对身高作为选择标准的诊断方法。

GH1突变谱的拓宽必然引致用分子遗传学方式对遗传性GH缺陷的 重新定义。此外，对新型矮小身材的认识必然需要对GH缺陷作为一种 疾病病种重新分类。这对筛选和确认那些用生长激素治疗可能有益的 短小身材的个体来说，显然具有重要含意。

在本发明检测方法中，采自患者的试验样本最好含有以标准方法 从患者淋巴细胞提取的基因组DNA，例如口腔涂片、血液样本或毛发 中的淋巴细胞。通过任一适当方法对GH1基因进行基因测序和多态性 分析，包括但不限于凝胶或毛细管电泳质谱分析和高温测序 (pyrosequencing)。优选地按如下步骤进行：

1(a).扩增，优选PCR扩增含有完整GH1基因(启动子，编码 区的5个外显子，内含子和非翻译区)的3.2kb片段，然后用设计好 的引物对更小的、重叠组成片段进行巢式PCR，以确保GH1基因特异 性。在使用已知6个引物的同时，发现有必要设计新的GH1特异性引 物，以避免无意中PCR扩增出共生的、紧密连锁的高度同源GH2、CSH1 和CSH2基因及CSHP1假基因，造成交叉污染。因此，本发明方法可能 包括，采用GH1基因特异性片段(即GH1基因特有的，在GH基因簇内 4个其它共生基因(非GH1基因)中没有发现此序列的片段)，和一 种或多种GH1基因特异性引物(该引物不会与GH基因簇内4个其它共 生基因(非GH1基因)中同源的旁侧区相结合)，对个体或是任何疑 为GH功能障碍个体的GH1基因进行PCR扩增。优选地，扩增完整GH1 基因，和/或

1(b)扩增，优选PCR扩增患者GH1基因上游约15kb处、跨越基 因座控制区(超敏位点I和II)的全部基因组DNA或其片段[Jones 等，Mol Cell Biol，15，7010-21(1995)]。基因座控制区(LCR)是影 响GH1转录水平和时间的增强子区。LCR位于距GH1基因5′端14kb处， 负责GH基因簇内基因的协同表达。采用新型寡核苷酸引物，对某些患 者的2个重叠片段(254bp和258bp)进行PCR扩增(实施例5)；所有 患者都可扩增出1.9kb的LCR片段(实施例5A)；及

2.任选地，但优选地，采用Transgenomic WAVETM System [O’Donovan等人，Genomics 52：44-49，1998]，通过变性高效液相 色谱(DHPLC)对整个GH1基因或其片段进行突变筛选。之所以选用这 种筛选方法是因为它快速，便宜，灵敏，可重复，而且，具有(至少 在我们手中)＞95％的检测效率。通过DHPLC检测到的“带迁移” (Bandshifts)可表示潜在DNA序列变异；(另外，也可采用无DHPLC 步骤的对含有3.2kb GH1基因的PCR片段直接进行DNA测序的方法)； 及

3.通过DNA测序(自动或人工方法)对任意此类DNA变体进行性 质鉴定；以及，任选地，但也是优选地，

4.使用适于损伤定位和功能缺陷机制推断的方法学，对GH1基因 损伤进行功能性质鉴定。

因此，本发明还提供了新型GH1基因特异性引物，用于上文所述 GH1基因分析及各实施例中，该引物包括：

适用于DHPLC步骤的新型引物(详见实施例3，表6)。

CTC CGC GTT CAG GTT GGC(GHD1F)；

AGG TGA GCT GTC CAC AGG(GHD1R)；

CIT CCA GGG ACC AGG AGC(GHD2R)；

CAT GTA AGC CAA GTA TTT GGC C(GHD3F)；

GGA GAA GGC ATC CAC TCA CGG(GHD4R)；

TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC(GHD5F)；

CGT AGT TCT TGA GTA GTG CGT CAT CG(GHD6R)；和

TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC G(GHD7F)；

及适用于LCR步骤的引物(全部5′→3′)，亦详见实施例5和5A。

GTGCCCCAAGCCTTTCCC(LCR15：1159-1177)；

TGTCAGATGTTCAGTTCATGG(LCR13：1391-1412)；

CCTCAAGCTGACCTCAGG(LCR25：1346-1363)；和

GATCTTGGCCTAGGCCTCG(LCR23：1584-1602)；和

LCR 5A(5’CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3’)；和

LCR 3.0(5’CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3’)；和

LCR 5.0(5’CCTGTCACCTGAGGATGGG 3’)；

LCR 3.1(5’TGTGTTGCCTGGACCCTG 3’)；

LCR 3.2(5’CAGGAGGCCTCACAAGCC 3’)；和

LCR 3.3(5’ATGCATCAGGGCAATCGC 3’)

(适用于1.9kb片段的测序)。

其它新型引物，用于整个GH1基因的PCT扩增(见实施例5D)， 包括：

GH1G5(5′GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3′)；

GH1G3(5′CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′)；

BGH3(5′TAGAAGGCACAGTCGAGG 3′)；

GH1R5(5′ATGGCTACAGGCTCCCGG 3′)；和

GH1R3(5′CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′).

本发明中的检测方法及用此方法可鉴定的或检出的GH1变体还具 有如下优点：

1.通过对新型损伤的确定和性质鉴定，扩充了已知的GH1基因 的突变谱。

2.评价了GH1基因突变在矮小身材的病理学中的作用。

3.确定了新型GH1基因损伤的遗传方式。

4.阐明了突变基因型和临床表型间的关系。这被认为对GH缺陷 的早期诊断和恰当的临床处理是非常必要的。

5.评价了GH1基因突变对GH分子结构和功能的影响。这对评估 那些具有相对轻微的矮小身材临床表型的儿童来说，尤为重要。在这 群患者中，可能产生具有免疫活性的、并因而在GH功能试验中落到正 常范围内的功能障碍的GH。

6.开发了用于遗传性GH缺陷的快速DNA检测试验。

7.评价了我们关于人群中GH缺陷未能全面检出和低估的假定。

因此，对自然发生的GH1基因损伤的进一步性质鉴定，对于研究 GH的结构、功能和表达具有相当的重要性。新型编码序列变体的研究 不但增进了我们对GH功能的了解，也增进了我们对GH和它的受体 (GHR)间相互作用，以及GHR介导的信号转导过程的了解。获得的认 识与新一代治疗试剂的理性设计是正相关的。同样，对启动子区自然 发生的GH1基因损伤的研究，将提供对GH1基因表达控制的新的认识。 由此可以看出，宽的突变损伤谱，必将提高我们对突变基因型和遗传 方式的GH缺陷临床表型间关系的了解。这些研究对于家族性GH缺陷 的早期诊断和恰当的临床处理无疑是很有必要的。

本发明因此还提供了GH1变体，其与GH1不同，并根据本发明方 法可检出，而用现有技术方法(例如依靠主要基于身高或其它标准或 这些标准的联合的患者选择标准的方法)无法检出。本发明中的这些 GH1变体包括在下文实施例6及特别是表7B中性质鉴定的那些变体。

如上所述，目前评估GH分泌的试验很多且各种各样，没有一种现 有的试验是理想的。因为人GH的分泌是脉动的，且GH脉动的振幅和 频率变化极大(受多种内因和外因的影响，包括睡眠、体育锻炼、压 力及有关个体的青春期等)，因此要得到最佳的信息，试验需要对患 者在专用试验室内的密切监察。因此这种试验不仅耗时、昂贵，而且 会给患者及其家属带来相当大的压力。特别要提及的是胰岛素诱导的 低血糖症试验(IST)，如上文所述，很多医生用它来评估GH分泌， 但由于为成功实施必须诱导患者产生低血糖症时，曾导致死亡现象发 生。因此，决定进行某项试验，例如IST，对矮小儿童评估前，谨慎 的考虑是极为重要的。因而，用于筛选矮小患者的DNA试验的建立， 具有许多优于其它现有方法的优点。

为此，本发明提供了筛选疑为具有功能障碍的GH的患者的方法， 该筛选方法包括如下步骤：

(a)从患者身上获得含有人GH1基因核苷酸序列的试验样本；和

(b)将从试验样本中获得的序列的区域与预定的序列相应区域进 行比较，特征在于该预定序列是选自根据本发明上述方法能检测到的 GH1变体。

更具体而言，本发明的筛选方法的特征在于，预定的序列是具有 与GH1基因变体的某一区域相应的核酸序列的寡核苷酸，与野生型序 列中相应区域相比，这一区域至少包括一种变异。

尤为优选的，该变异为本发明检测方法可检测到的，如下文实例 6和表7中所确定的任一种。

优选的，试验样本中包含可使用常规方法提取的基因组DNA。

为此，本发明还提供了确定GH功能障碍的筛选方法，包括：

(a)从疑为GH功能障碍患者身上获得第一份试验样本；及

(b)将第一份试验样本中的GH1基因或GH1转录产物，或其片 段(如cDNA)，与可从第二份试验样本中获得的GH1变体的相应基因、 转录产物或片段进行比较，该第二份试验样本取自符合如下标准的个 体：

(i)生长衰退，其定义为一种生长模式[通过一系列身高测量来 绘制的，Brook CDG(Ed)临床儿科内分泌学(Clinical Paediatric Endocrinology)第三版，第9章，p141(1995，Blackwell Science)]， 即在标准身高记录纸上进行绘图时[Tanner等人，Arch Dis Child 45： 755-762，1970]，预报患者的成年身高处于根据患者父母身高所估计 的患者目标成年身高的范围之外；和/或

(ii)身高增长速度低于年龄的25％；和/或

(iii)根据Tanner-Whitehouse度量法，与实龄比较骨龄延迟至 少为两年；和/或

(iv)没有其它已知疾病可能产生上述标准(i)～(iii)包含 的症状。

方便地，本发明提供了筛选疑为GH功能障碍的个体的方法，筛选 方法包括以下步骤：

(a)从个体身上获得含有人GH1基因核苷酸序列的试验样本；和

(b)将从试验样本中获得的序列区域与预定的序列相应的区域进 行比较，其中预定的序列选自本发明检测方法鉴定的或是可鉴定的GH1 变体。

预定序列优选地是具有与GH1基因变体的某一区域相应的核酸序 列的寡核苷酸，与野生型序列中相应区域相比，这一区域至少包括一 种变异。

本发明筛选方法中的第一份试验样本或试验样本优选地包含基因 组DNA。

本发明筛选方法中，比较步骤可以常规方式进行，例如通过对GH1 基因适当区域的测序，特别是在要检测/比较的变体很少的情况下。当 涉及相当大量的变体时，可使用DNA芯片技术，如其中该芯片是一种 微型平行分析设备，其通过使标记的样本DNA(来自患者的cDNA或基 因组DNA)与固定于固相支持物上的突变特异性寡核苷酸探针微阵列杂 交，来同时筛选多种已知或所有可能的突变[Southern，Trends Genet 12：110-115，1996]。

依照本发明的DNA筛选方法与现有试验方法相比，优点包括：

1.对于患者，其仅涉及可在门诊完成的单一血液试验。大多数现 有试验中所需的住院、长期的医疗监控和重复的血液样本采集，将不 再需要。从而减少了所需费用、专科医师花费的时间和每位受试患者 的痛苦。

2.患者GH功能缺陷的早期诊断将成为可能。与其它方法相比， DNA筛选试验的简易性，使临床医生在处理患者时，可以更早地考虑 进行试验。目前，由于GH分泌试验中存在的问题，医生在将一个儿童 诊断为IST前，会对门诊儿童进行长时间的，甚至好几年的评估。对 GH缺陷遗传病因学的早期诊断，能尽早采用GH治疗，对表型不严重 的个体而言，患者接受恰当治疗的时机可能因此而提前数月甚至数年。

3.有更多的患者可进行GH功能障碍试验。DNA试验的简易性使 医生可在患者首次就诊于内分泌门诊时，就将本试验作为对所有矮小 患者初始评估的一部分来施行。这很可能找出有可致严重生长问题的 GH1基因损伤的患者，以及那些轻度损伤患者(例如编码区错义突变)。 这些患者以前不可能引起临床关注，因为他们的临床/表型问题还未严 重到被批准施行IST的程度，然而他们仍可能会得益于GH治疗。

4.对于那些需要终生进行GH治疗的患者的早期鉴定将是可能 的。这些患者可能被鉴别出来并进行恰当的治疗，不需借助于GH分泌 的初始试验或重复试验，也不需阶段性停用GH以评估治疗进程(一种 “无治疗试验”)。

5.对GH功能障碍家族成员的简易的早期鉴定将是可行的。一旦 引致生长问题的遗传损伤从一个个体中被鉴定出来，就可相对容易地 对其它家族成员进行同样遗传损伤的评估，并确定他们是否会得益于 GH治疗。

6.将提高诊断的精确性。同一实验室内和不同实验室间，GH分泌 缺陷试验分析结果重复性的变化是众所周知的。DNA筛选将使这一问 题成为过去。另外，GH分泌试验结果在某些情况下可能非常难以解释， 例如，在患者同时患有甲状腺功能衰退，或是青春期延迟的情况下。 DNA筛选会排除这些疑点，并防止耽搁可能得益于治疗的患者开始治 疗。

因此，本发明还提供了适于进行本发明筛选方法的试剂盒，其包 括：

(a)具有与GH1基因变体的区域相应的核酸序列的寡核苷酸，与 相应的野生型序列序列相比，这一区域至少包括一种变异；和

(b)具有相应于(a)中所限定区域内的野生型序列的核酸序列的 寡核苷酸；和任选地，

(c)一种或多种适于进行PCR，从患者DNA中扩增目的片段的试 剂。

这些试剂可能包括，例如，对应于GH1基因外显子的PCR引物， 和/或这里提到的引物，特别是在上文中提到的新型引物；和/或PCR 所用其它试剂，如Taq DNA聚合酶。

优选的，试剂盒中的寡核苷酸包含20～25个碱基对，如对变体序 列而言为20个碱基对，当变体为单碱基替换时相对野生型序列为20 个碱基对，或者变体为5个碱基对缺失时相对野生型序列而言为25个 碱基对。无论哪种情况下，必须选择所选区域独有的、在基因组其它 任何位置都没有重复的寡核苷酸片段。

显然，在想要筛选多点变异，如15～20个或更多的情形下，试剂 盒中应包含多达40种核苷酸或者更多。因此在另一筛选方法中，采用 了DNA芯片技术，本发明为此提供了许多固定于支持物上的称为试剂 盒组分(a)的寡核苷酸。

也可使用其它的核苷酸检测方法，如纳米技术首创的信号扩增方 法(如Q-打点)。也可使用单分子检测方法(如STM)。在这些情况 下，依照本发明的试剂盒可包含一种或多种使用这些方法时所用的试 剂。

可选的，依照本发明的筛选方法和相应的试剂盒，可以以一种或 多种所谓“代理标志物”为基础，代理标志物指示GH1或GH变体的存 在，或与其存在相关，如蛋白质/氨基酸序列，例如GH变体或GH1变 体的特异性抗体。这种“代理标志物”可能包含：

(a)任何生物分子(包括但不仅限于，核苷酸，蛋白质，糖和脂 类)；

(b)化学化合物(包括但不仅限于，药物，其代谢物及其它化学 化合物)；和/或

(c)物理特征，

它的存在与否，或其在个体中的含量是可以测定的，且与GH变体 或GH1变体的存在相关。

另外，依照本发明的适当的、其它的筛选方法，可能还包括获得 含有GH变体(即含有hGH变异的蛋白质/氨基酸序列，如用本发明方 法检测出的一种GH1变体编码的蛋白质/氨基酸序列)的试验样本，其 是利用常规蛋白质测序方法(包括质谱，微阵列分析，高温测序，等 等)，和/或基于抗体的检测方法(如ELISA)可鉴定的，也包括进行 一次或多次这种(些)蛋白质测序方法。

在另外的情况下，依照本发明的试剂盒可能包含一种或多种用于 这些其它方法的试剂。

用本发明检测方法可检测到的GH1变体除作为GH功能障碍的筛选 试验标准外，可能还有另外的用途。例如，变异不在GH1基因启动子 区域的变体，可用来治疗GH产量刺激过度的患者，如垂体分泌过多性 巨人症或肢端肥大症患者。

本发明还提供了：

(a)一种或多种包含2个终止突变的GH或GH1变体在鉴定根本不 产生任何生长激素的个体和依照常规诊断技术将被划分为典型GHD的 个体中的应用；

(b)一种或多种GH或GH1变体，该变体使GH与生长激素受体或 其结合蛋白(即体内的GH载体)的结合发生改变，由于通过结合其结 合蛋白而使变体GH从垂体中的转运受到削弱或抑制，导致未结合蛋白 在去往组织受体的途中被破坏；

(c)能破坏垂体中GH的锌指贮存方式形成的GH或GH1变体；

(d)GH变体或是GH1变体表达的蛋白质，其是具有GH受体拮抗 性质的蛋白质，其受体结合常数决定了治疗患者(为克服变异蛋白质 的力量和抑制作用)所需外源性GH的量(剂量)；即变异蛋白质与野 生型GH竞争结合受体；

(e)依照本发明的GH变体或GH1变体在治疗、诊断和检测方法中 的应用；

(f)依照本发明的GH变体或GH1变体在确定个体对某种疾病的易 感性中的应用；

(g)依照本发明的GH变体或GH1变体在确定糖尿病、肥胖或感染 易感性中的应用；

(h)依照本发明的GH变体或GH1变体在确定结合缺陷和/或垂体 贮积缺陷中的应用；

(i)依照本发明的GH变体或GH1变体在确定肢端肥大症拮抗剂治 疗的诊断剂量中的应用；

(j)依照本发明的GH变体或GH1变体在医学治疗中的应用；

(k)依照本发明的GH1变体在基因治疗中的应用；

(l)依照本发明的GH变体或GH1变体在确定一种或多种与疾病状 态相关的多态性中的应用；及

(m)依照本发明的GH变体或GH1变体在制备治疗组合物、诊断组 合物或试剂盒，或检测试剂盒中的应用。

因此，本发明还提供了组合物，其包含GH变体，特别是依照本发 明检测方法能检测到的、且在此确定的GH变体，及其药物可接受的载 体。

此外，本发明还提供：

(a)编码GH变体的核酸序列；

(b)与序列(a)基本同源或在严谨条件下可与(a)杂交的序列；或

(c)除遗传密码简并性外，与(a)或(b)基本同源或在严谨条件下 可与(a)或(b)杂交的序列；或

(d)(a)或(b)或(c)中任一种的特异性寡核苷酸。

还提供了：

(a)包含上述核酸序列的载体；

(b)包含载体(a)的宿主细胞，如细菌宿主细胞；及

(c)制备GH1变体的方法，其包括：

i)培养宿主细胞(b)；及

ii)从培养基中收获所产生的GH1变体。

(d)培养基中的上文所描述的序列、载体或细胞所编码或表达的 蛋白质或氨基酸序列。

将通过以下实施例对本发明作详细阐述。

实施例1——患者选择

患者来源

通常咨询加的夫(Cardiff)的威尔士大学医学院(University of Wales College of Medicune)Regional Paediatric Growth， Endocrine and Diabetes Service，并通过与其它类似的英国中心(即 Newport、Birmingham、Bristol、Wrexham、Livepool、Stoke-on-Trent、 Portsmouth和Southampton)的合作，对矮小身材儿童进行了鉴定。 收集了完整的临床病史，包括家族病史、家谱、生长参数记录和早先 施行的内分泌试验。如果可能，记录索引病例、其父母及同胞的准确 发育学。用于分子遗传学分析的血液样本采自索引病例及适当的近亲 属。另外的家系由John A.Phillips III教授(Nashville，TN，USA)， Mohamad Maghnie博士(Pavia，Italy)和Tamas Niederland博士(Gyor， Hungary)提供。迄今，已采集了692个GH功能障碍家系的样本。

所用标准

用于所有患者选择的标准为：

(i)生长低于预定身高范围的百分数的下限，依照本发明上文所 描述的标准(i)确定；

(ii)身高增长低于25％；

(iii)骨龄延迟至少2年，如在患者病例1中，与实龄相比，骨 龄延迟了3.5～4年；

(iv)所有其它试验均正常；且

(v)生长激素分泌试验正常。

表5B中，*GH FT：峰：表示一种或多种标准生长激素功能试验中 的活性单位(IU/L)。“随机”表示随机采取的GH测量。ND表示“试验未 做”。包含身高百分数在内，和下文表7B提供的数据一起，用来阐明 具有基本在该百分数以下的身高并不是选择患者的必须标准；我们甚 至在根本没有身高减少的患者中发现了GH/GH1变异。

表5B：研究的患者和所用标准的结果   患者编号   高度百分数   生长速度   百分数(ii)   骨龄延迟(年)   (iii)   GH FT：峰   (v)   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33a   33b   34   35   36   ＜0.4   ＜0.4   ＞50th   ＜0.4     ＜0.4   ＜&平行于3rd       3rd百分数     0.4     10-25   ＜＜3     ＜3   ＜3     ＜10             0.4     ＜0.4           ＜3   ＜3     ＜25   25       25   25       ＜25     ＜25     25         25                 25     25           25   25   ＜0.4   3.5   2   1.9     3+   2.8   3       2         4     2     3.15     2             3     2           2.6   1.4   48.6   20.2 at 60   3.7 at 60   26.7     28.4 at 30   111.3 at 90       38.7     未做     13.2 at 60   2.6随机   4.6；正常         4.1             38.6     2.2               10随机   37   38   39   40   41a   41b   42   43   44   45   46   47   48   49   50a   51   52   53   54   55   56a   56b   57   58   59   60   61a   61b   62   63   64   65a   65b     66   67   68   69   70   71   72a   72b         3-10   ＜4   ＜4                                   0.4               10           ＜0.4         ＜1       ＜0.4         11   ＜3                                                   ＜25           ＜25         25         2.6                               3.25                           2     2   2                           1.4                                   27.3               1.3     1     3   18.8 at 90              

实施例2——聚合酶链反应(PCR)扩增GH1特异性片段。

对65名不相关的患者进行了GH1特有3.2kb片段的PCR扩增。采 用标准方法提取患者淋巴细胞的基因组DNA。

设计针对于GH1特有序列的寡核苷酸引物GH1F(5′ GGGAGCCCCAGCAATGC 3′；-615至-599)和GH1R(5′ TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3′；+2598至+2616)，采用ExpandTM高保真系 统(Roche)进行PCR扩增含有人GH1基因的3.2kb单个基因组DNA 片段。

每一反应使用两个单独的0.65ml的薄壁PCR管。第一管内含有各 引物(GH1F和GH1R)500纳克(ng)，200μM的dATP，dTTP，dCTP 和dGTP和200ng的患者基因组DNA，补无菌水使其终体积为25μl。 第二管含有5μl的10×反应缓冲液，补无菌水使其终体积为24.25μl。 两管都在冰上放置5分钟。然后向第二管中加入0.75μl的ExpandTM 聚合酶混合物，混匀后转移入第一管。离心30秒，用30μl轻质矿物 油(Sigma)覆盖反应混合物。然后将反应混合物置于480或9700PCR 可编程热循环仪，温度设置为95℃。

然后反应混合物在下述条件下扩增：95℃，2分钟，然后进行30 个循环反应：95℃30秒，58℃30秒，68℃2分钟。在后20个循环 中，每进行一个循环68℃的延伸步骤增加5秒。最后，于68℃再温育 7分钟，然后冷却至4℃以进行下一步分析。每批反应还设立一组空白 (阴性对照)。空白反应管含有除基因组DNA外的所有试剂，以确保 没有试剂受到污染。

在进行巢式PCR前，取1/10体积(5μl)反应物在1.5％的琼脂糖 凝胶上进行分析，以评估PCR扩增是否成功。将PCR扩增成功的样本 稀释100倍，用于进行巢式PCR。

实施例3——巢式PCR

对实施例2中产生的片段进行巢式PCR，每例中产生7个重叠的 亚片段，其合成一起跨越整个GH1基因。此外还对除3名患者外所有 患者的基因座控制区城进行了PCR扩增(见实施例5)。

使用Taq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer)，PCR-扩增初始的 3.2kb PCR产物的7个重叠亚片段。用于这些反应的寡核苷酸，以及 它们如在GH1基因参考序列中确定的序列位置，列于表6中。

1μl稀释的长PCR产物(3.2kb)加入0.2ml的薄壁PCR管或96孔 微量滴定板的孔内。加入5μl10×反应缓冲液，500ng适当的引物对 (如GH1DF和GH1DR)，终浓度为200μM的dATP，dTTP，dCTP和dGTP， 加无菌水至终体积为49.8μl，然后加入0.2μl的Taq Gold DNA聚合 酶。

然后将PCR管或微量滴定板置于Primus 96热循环仪上进行以下 循环：95℃，12分钟，然后进行32个循环反应：95℃30秒，58℃30 秒，72℃2分钟。然后于72℃再温育10分钟，冷却至4℃以进行下 一步分析。

在用WAVETMDNA片段分析系统(Transgenomic Inc.Crewe， Cheshire，UK)进行变性高效液相色谱分析前，取1/10体积(5μl) 反应混合物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分析以确定反应是否发生。为 促进异源双链的形成，PCR产物先在95℃变性5分钟，然后经45分钟 逐渐再退火至50℃。产物上DNAsep柱(Transgenomic Inc)，并用 0.1M含乙腈(BDH，Merck)的乙酸三乙胺缓冲液(TEAA pH7.0)，以 2％/分钟，0.9ml/分钟的恒定流速进行线性梯度洗脱。根据PCR产物的 大小调整梯度的起点和终点。每个扩增的样本分析约需6.5～8.5分 钟，其中包括柱再生和平衡的时间。在用DHPLCMelt软件 ( http://insertion.stanford.edu/melt.html)确定的熔解温度 (TM)下分析样本，列于表6。洗脱的DNA片段用UV-C测定仪检测 (Transgenomic Inc.)。

表6：用于DHPLC分析和DNA测序的寡核苷酸引物   片段   引物   序列(5’至3’)   位置   DHPLC   溶解   温度   1   GH1DF   CTCCGCGTTCAGGTTGGC   -309至-292   60℃   GH1DR   CTTGGGATCCTTGAGCTGG   -8至+11   2   GH2DF   GGGCAACAGTGGGAGAGAAG   -59至-40   63℃   GH2DR   CCTCCAGGGACCAGGAGC   +222至+239   3   GH3DF   CATGTAAGCCCAGTATTTGGCC   +189至+210   62℃   GH3DR   CTGAGCTCCTTAGTCTCCTCCTCT   +563至+586   4   GH4DF   GACTTTCCCCCGCTGGGAAA   +541至+560   62℃   GH4DR   GGAGAAGGCATCCACTCACGG   +821至+841   5   GH5DF   TCAGAGTCTATTCCGACACCC   +772至+792   62℃   GH5DR   GTGTTTCTCTAACACAGCTCTC   +1127至   +1148   6   GH6DF   TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA   +1099至   +1122   62℃   GH6DR   CGTAGTTCTTGAGTAGTGCGTCATCG   +1410至   +1435   7   GH7DF   TTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCG   +1369至   +1393   57℃   和   62℃   GH7DR   CTTGGTTCCCGAATAGACCCCG   +1731至   +1752

实施例4——GH1特异性长PCR片段的克隆和DNA序列测定

克隆

DHPLC分析可以鉴定含推定DNA序列变化的DNA片段。为确定哪一等 位基因含有推定的序列变化，将GH1特异性长(3.2kb)PCR片段克隆入 PCR克隆质粒载体pGEM-T(Promega)。获得克隆的方法是，在1×反应缓 冲液和1μl T4DNA连接酶(3单位)体系内，加入50ng的GH1特异性长 PCR片段和10ng的pGEM-T，终体积为10μl。反应物于10℃温育16小时。 将全部反应物放入1.5ml管中并在冰上冷却。加入50μl的DH5α感受态细 胞(Life Technologies)，在冰上放置30分钟。然后将混合物在37℃热 休克20秒，重新在冰上放置2分钟。然后加入0.95ml的YT×2培养基(每 升含16g蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl)，将混合物于37℃摇动温 育1小时。将混合物涂布到预先温育的、含有50μg/ml氨苄青霉素、IPTG 和X-gal的平板上，于37℃温育16小时，使长出单个的克隆。

每板挑取8个白色克隆，转到另一块划有方格的板上。取少量的 每个细菌克隆，使用GH1DF和GH1RF引物(见实例3，表6)和前面所 述条件进行PCR扩增以确定GH1特异性长PCR片段的成功克隆。

含有GH1特异性长PCR片段的克隆在2ml YT×2培养基中培养；使 用Qiagen spin miniprep试剂盒，按照操作指南从细菌中提取质粒 DNA。用这种方法提取的质粒DNA，通过测定其在260nm的光密度进行 定量，在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳以确证克隆大小是正确的。然后 对其中4个克隆进行了序列测定。

DNA序列自动测定

使用BigDye测序试剂盒(Perkin Elmer)，对含有GH1特异性长 PCR片段的克隆进行序列测定，在0.2ml管或96孔微量滴定板内，在 Primus 96(MGW)或9700(Perkin Elmer)PCR热循环仪上进行。用于 序列测定的寡核苷酸引物有：

GH1S1(5’GTGGTCAGTGTTGGAACTGC 3：-556至-537)；

GH3DF(5’CATGTAAGCCAAGTATTTGGCC 3’：+189至+210)；

GH4DF(5’GACTTTCCCCCGCTGTAAATAAG 3’：+541至+560)：和

GH6DF(5’TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA 3’：+1099至+1122).

在20μl终体积内，用3.2pmol适当的引物及4μl BigDye测序混 合物对1μg克隆DNA进行序列测定。然后将管或微量滴定板放到热循 环仪上进行如下循环：96℃，2分钟，然后进行30个循环：96℃30 秒，50℃15秒，60℃4分钟。纯化前将反应物冷却至4℃。

向完成的测序反应物中加入80μl75％的异丙醇进行纯化。混匀后 在室温放置30分钟。反应物于室温，14000rpm离心20分钟。去掉上 清，向沉淀中加入250μl75％的异丙醇。混匀样品并于室温，14000rpm 离心5分钟。去掉上清，沉淀在75℃干燥2分钟。

样品随后在ABI Prism 377或3100 DNA测序仪上进行分析。

实施例5——生长激素基因座控制区分析

已知人GH1基因上游约14.5kb处的DNA区域，与GH1基因转录的 组织特异性和发育控制相关[Jin等人，Mol Endocrinol 13： 1249-1266，1999]。它被称为基因座控制区(LCR)，从GenBank中可 得到其DNA序列(登录号：AF010280)。核苷酸编号是基于GH LCR 参考序列(图4)。

1192位置处的多态性位点以粗体和下划线标出。对其中部分区域 进行了PCR和DHPLC分析。

使用参考现有DNA序列所设计的新型寡聚核苷酸引物，产生了2 个覆盖约400bp的重叠PCR片段：

片段1引物为LCR15(5’GTGCCCCAAGCCTTTCCC3’：1159-1177)和 LCR13(5’TGTCAGATGTTCAGTTCATGG3’：1391-1412)；而片段2引物为 LCR25(5’CCTCAAGCTGACCTCAGG3’：1346-1363)和LCR23 (5’GATCTTGGCCTAGGCCTCG3’：1584-1602)。

使用Taq Gold聚合酶进行PCR：取1μl患者基因组DNA，放入 0.2ml的薄壁PCR管或96孔微量滴定板的一个孔中。然后加入5μl 10× 反应缓冲液，500ng适当引物对(如GH1DF和GH1DR)，终浓度200μM 的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，加无菌水至体积为49.8μl，再加入0.2μl 的Taq Gold聚合酶。然后将PCR管或微量滴定板放到Primus 96热循 环仪(MWG Biotech)上进行如下循环：95℃12分钟，然后进行32 个循环：95℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟。然后再于72℃温育 10分钟，使反应物冷却至4℃以进行进一步分析。

在进行变性高效液相色谱分析(DHPLC)前，取1/10体积(5μl) 的反应物在1.5％的琼脂糖凝胶上分析以确定反应是否完成。按实施例 3所描述的方法，在61℃的熔解温度下进行DHPLC分析。

实施例5A——生长激素基因座控制区的进一步分析

从40名对照个体和40名具有遗传的GH缺乏症患者中采集600ng DNA，使用如下新型引物进行1.9kb LCR片段的PCR扩增：

LCR 5A(5’CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3’)；和

LCR 3.0(5’CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3’；见图4)，

5mM dNTP和Roche High Fidelity DNA聚合酶。反应条件为98 ℃×2分钟，94℃×15秒，58℃×30秒，72℃×1分钟循环10次，58℃ ×30秒，72℃×1分钟+每循环一次增加5秒，循环20次。PCR反应产 物在2％琼脂糖凝胶上分离，用手术刀切下对应于LCR片段的条带。通 过凝胶过滤去除琼脂糖，洗脱DNA用于测序。用如下新型引物，在ABI 3100自动测序仪上对1.9kb的LCR片段进行序列测定。

LCR 5.0(5’CCTGTCACCTGAGGATGGG 3’)；

LCR 3.1(5’TGTGTTGCCTGGACCCTG 3’)；

LCR 3.2(5’CAGGAGGCCTCACAAGCC 3’)：和

LCR 3.3(5’ATGCATCAGGGCAATCGC 3’)

用于覆盖该区域。

实施例5B——利用萤光素酶报告子基因分析对GH1启动子单倍型 和推定的启动子突变的性质鉴定。

用QuickChangeTM定点突变试剂盒，在pGL3-GH1构建体中引入特 定的序列变体。这一方法涉及将2条互补寡核苷酸引物(每条引物都 含有目的突变)与野生型构建体对应链的退火。然后使用高保真的Pfu DNA聚合酶进行引物延伸，从而产生高度特异性突变效率，随机突变 水平较低。最终，dam甲基化的亲代DNA，经甲基化或半甲基化的特异 性内切酶DpnI进行消化，进而选出含有突变的质粒。

选择简便、高效的脂质体介导转染法，将DNA导入大鼠GH3和人 HeLa细胞。GH3细胞瞬时转染所用试剂为TfxTM-50。它含有由合成阳离 子脂分子(N，N，N，N-四甲基-N，N’-双(2-羟乙基)-2，3-二(油酰氧 基)-1，4-丁烷二铵碘化物)和L-二油酸磷脂酰乙醇胺(DOPE)。水 化后，这些脂类可形成多层小囊，其与核酸结合并促进它们向细胞内 的转移。细胞用96孔板培养。从培养瓶中取出铺满的细胞，用新鲜培 养基稀释，计算每板孔至160％的铺满度的细胞密度。200μl稀释细胞 等分到每个板孔中，平板在含有湿纸的湿盒内37℃温育过夜。这可使 细胞在第二天被转染时达到约80％的铺满度。

转染混合物包含无血清培养基，DNA(pGL3-GH1和pRL-CMV)及 TfxTM50试剂。每个孔含0.25μg pGL3构建体，2ng pRL-CMV和0.5μl 的TfxTM-50试剂(这提供了TfxTM-50试剂与DNA间最佳的3∶1比例)， 总体积为90μl。先混合培养基和DNA，然后加入TfxTM-50试剂。溶液 立刻震荡混匀，于室温温育20分钟。在第15分钟时，从培养箱中取 出培养板，移去培养基，短暂震荡混匀TfxTM-50试剂/DNA混合物，然 后将90μl加入每个板孔中。将培养板放回培养箱温育1小时后，然后 向每板孔中加入200μl预热(37℃)的完全培养基。再将细胞放回培 养箱中，再培养24小时，然后裂解，进行报告子试验。HeLa细胞的 转染与GH3细胞转染基本相同。差别在于：用TfxTM-20替代TfxTM-50， 共转染pRL-CMV量为1ng，计算每板孔为60％铺满度的细胞密度。

从37℃培养箱内取出培养的转染细胞，移去培养基，加入50μl 磷酸缓冲盐溶液(PBS)。轻摇培养板，然后移出漂洗液。向每培养孔 内加入20μl被动裂解缓冲液，确保细胞单层被完全覆盖。将培养板放 到旋转台上，室温放置30分钟，然后-70℃冻存。溶化培养板，并离 心，6000rpm，20秒。对每次报告子试验，将微板发光计设置成进行2 秒钟测量前延迟，再进行10秒钟的测量阶段。50μl体积的萤光素酶 测定试剂II(来自Dual Luciferase reporter Assay System(Promega， UK))直接加到第一孔中，测量并记录萤火虫萤光素酶活性。然后直 接加入50μl的Stop&GloTM试剂，记录Renilla萤光素酶活性。对每组 细胞裂解物重复这一步骤。

实施例5C——GH变体信号转导活性分析

在我们的生物测定试验中，选择HK293细胞作为研究GH变体的靶 细胞，因为这些细胞表现出GH受体表达的升高。在测定前，细胞置于 24孔板中(每孔100,000个细胞)24小时，然后与STAT 5-效应的 萤光素酶报告子基因构建体以及组成性表达的β-Gal质粒(CMV启动 子)共转染，以修正转染效率。经过夜转染后，洗涤细胞并分别将其 与稀释到已知标准浓度范围的变体GH及野生型GH一起温育6小时。 在此期间，GH受体的活化将导致STAT 5的活化和萤光素酶的表达。 这样，试验中萤光素酶的表达就提供了GH受体的活化程度，即作用于 细胞的GH的生物学活性的测定。经过6小时的温育阶段后，裂解细胞 并用标准方法在平板光读计上测定萤光素酶活性(依照Ross RJM等人 发表在Molec Endocrin 11：265-73，1997上的方法进行测定；试剂 盒由Promega UK Ltd提供)。

实施例5D——体外剪接试验

使用新型寡聚核苷酸引物进行全部人GH1基因的PCR扩增：

GH1G5(5′ GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3′)；和

GH1G3(5′ CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′)

将KpnI(GH1G5)或XhoI(GH1G3)加在适当引物的5′端，以扩增长 1467bp的含有限制性酶切位点的片段。这些位点以下划线标出。PCR 扩增条件如下：95℃45秒，58℃45秒，68℃2分钟循环10次，然 后95℃45秒，68℃2分钟(每循环一次加5秒)，循环20次。

然后扩增的片段用限制性酶Kpn I和XhoI消化，并克隆入经同样 限制性酶消化的质粒载体pCDNA3.1(Invitrogen)中。克隆后，对片 段进行序列测定以检查错误。然后用重组质粒转染大鼠垂体前叶GH3 细胞。转染后，细胞放置24小时。用RNAzol B(Biogenesis)提取RNA。

然后使用新型引物(BGH3(5’TAGAAGGCACAGTCGAGG3’))和 Superscript II(Life Technologies)，用提取的RNA进行反转录。 将5μg总RNA加入到500ng的BGH3中，终体积为12μl，70℃加热15 分钟。样品放在冰上冷却，然后加入4μl 5×缓冲液，2μl 0.1M的DTT 和1μl 10mM的dNTP’s。样品加热到42℃，加入200U(1μl)Superscript II，于该温度下放置50分钟。然后加热至70℃加热15分钟以灭活 Superscript II。

然后用反转录的RNA进行PCR。使用新型寡聚核苷酸引物，4μl 反转录混合物进行PCR反应：

GH1R5(5′ATGGCTACAGGCTCCCGG 3′)；和

GH1R3(5′CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′)

经以下PCR循环，扩增长度为654bp的片段：95℃45秒，58℃45 秒，68℃2分钟循环10次，然后95℃45秒，58℃45秒，68℃2 分钟(每循环一次加5秒)，循环20次。然后PCR产物在1.5％琼脂 糖凝胶上进行电泳、纯化、测序。

实施例6——GH1基因突变和多态性

依照本发明的选择特征，迄今已对54种不同的新型GH1基因变体 (“突变”，表7)进行了性质鉴定，基于下面所示的不同类型的证 据，这些变异可能与矮小身材病因学相关。这些新型损伤包括31种不 同的错义突变，21种不同的启动子/5′非翻译区突变和2种剪接位点突 变。此外，我们还检测到71种GH1基因区域内的多态性(表7A)。

表7A：在患者的人GH1基因(内含子，编码序列和3′非翻译区) 中发现的多态性。给出了共生同源的GH2、CSH1、CSH2基因和CSHP 假基因相似位置处的核苷酸以便比较。   核苷酸   改变   GH1   GH2   CSH1   CSH2   CSHP   IVS1   124   A→G   A   G   A   A   G   IVS1   128   A→T   A   T   C   C   C   IVS1   134   A→G   A   A   A   A   A   IVS1   135   G→T   G   G   G   G   G   IVS1   135   G→C   G   G   G   G   G   IVS1   136   A→G   A   A   A   A   A   IVS1   141   A→G   A   A   A   A   A   IVS1   179   T→C   T   T   T   T   T   IVS1   188   C→T   C   C   C   C   C   IVS1   218   G→A   G   G   G   G   G   IVS1   226   C→G   C   C   C   C   C   IVS1   230   T→C   T   T   T   T   T   IVS1   234   T→C   T   T   T   T   T   IVS1   236   G→C   G   G   G   G   G   IVS1   249   A→G   A   A   A   A   A   IVS1   281   T→C   T   C   C   C   T   IVS1   284   T→A   T   T   T   T   T   IVS1   284   T→C   T   T   T   T   T   IVS1   286   G→C   G   G   G   G   G   IVS1   303   T→C   T   T   T   T   T   IVS1   313   G→A   G   G   G   G   G   IVS2   508   delA   A   A   A   A   A   IVS2   519   A→T   A   T   G   G   G   IVS2   524   G→A   G   A   G   G   G   IVS2   558   A→G   A   A   A   A   A   IVS2   565   A→G   A   G   G   G   G   IVS2   573   A→G   A   A   A   A   A   IVS2   580   A→G   A   A   A   A   A   IVS2   585   A→G   A   A   A   A   A   IVS2   620   G→A   G   G   G   G   G   IVS2   622   A→G   A   A   A   A   A   IVS2   649   T→C   T   T   C   C   T   IVS2   665   T→C   T   T   T   T   T   IVS2   670   A→G   A   A   A   A   A   IVS2   676   G→A   G   G   G   G   G   IVS2   685   G→A   G   G   G   G   G   IVS3   836   T→C   T   T   G   G   G   IVS3   839   T→C   T   T   T   T   T   IVS3   879   C→G   C   C   C   C   C   IVS3   883   C→A   C   C   C   C   C   IVS3   901   T→C   T   T   T   T   T   exon 4   1010   C→T   C   T   T   T   T   IVS4   1097   G→A   G   G   G   G   G  *IVS4   1101   C→T   C   C   A   G   C   IVS4   1114   C→T   C   C   C   C   C   IVS4   1169   T→A   T   T   T   T   T   IVS4   1182   C→T   C   C   C   C   C   IVS4   1189   A→G   A   A   A   A   A   IVS4   1193   A→G   A   A   A   A   A   IVS4   1196   T→G   T   G   T   T   A   IVS4   1196   T→C   T   G   T   T   A   IVS4   1208   T→C   T   T   T   T   T   IVS4   1212   C→T   C   C   C   C   C   T   IVS4   1216   T→G   T   T   T   T   T   IVS4   1219   A→G   A   A   A   A   A   IVS4   1232   T→C   T   T   T   T   T   IVS4   1240   A→G   A   A   A   A   A   IVS4   1243   C→T   C   C   C   C   C   IVS4   1261   A→G   A   A   A   A   A   IVS4   1274   G→T   G   G   G   G   G   IVS4   1302   T→G   T   T   T   T   T   exon5   1341   A→G   A   A   A   A   A   exon5   1347   C→T   C   C   C   C   C   exon5   1410   C→T   C   C   C   C   C   3’UTR   1536   C→T   C   C   C   C   C   3’UTR   1558   T→C   T   T   T   T   T   3’UTR   1607   G→A   G   G   G   G   G   3’UTR   1630   T→C   T   T   T   T   T   3’UTR   1648   T→C   T   T   T   T   T   3’UTR   1654   T→C   T   T   T   T   T   3’UTR   1659   C→T   C   C   C   C   C

*IVS4从Hasegawa(如前)处得知

表7B中，核酸编号建立在图5所示的GH1参考序列的基础上，其 中人GH1基因编码序列的5个外显子在上部显示；翻译起始点(ATG) 和终止密码子(TAG)以下划线标出；多聚腺苷酸信号以粗体显示并有 下划线；3′非翻译区边界在+1642处；+1为转录起始位点。文中提到 的所有编号的突变损伤、多态性和寡核苷酸引物(基因座控制区域除 外；见图4)都可能与GH1基因参考序列有关。

表7B：生长激素缺陷：GH1基因突变和多态性   启动子单倍型b   突变b，c，d   参考文献   多态性b，c，d   患者a   -168   (T/C)   -75   (A/G)   -57   (G/T)   -31   (ΔG)   -6   (G/A)   -1   (T/A/C)   +3   (G/C)   +16   (A/G)   +26   (A/C)   +59   (T/G)   1(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   1(6)   T   A   G   G   G   T   G   A   A   T   Arg64Gly(AGG→GGG：799)   未发表   IVS4 T→A 1169   2(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 C→T 1114   2(11)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   IVS4 G→T 1274   3(5)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   3(6)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   Leu163Pro(CTC→CCC：1442)   未发表   IVS1 A→G 141   4(1)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS2 A→G 622   IVS4 T→C 1196   5(2)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS2 A→G 565   5(4)   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   ND   IVS1 A→G 134   IVS1 T→C 179   6(1)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→Aat-1(702)   未发表   IVS4 T→A 1169   6(3d)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   A→G-9   IVS4 T→A 1169   6(8d)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   7(9)   T   A   G   G   G   T   G   A   A   T   Leu-12Pro(CTG→CCG：366)   Lys168Arg(AAG→AGG：1457)   ND   7(10)   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 C→T 1243   3’UTR G→A 1607   8(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   8(4)   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   ND   Asn152(AAC→AAT：   1410)   9(1)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   IVS4 A→G 1219   9(3)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS2 A→G 670   IVS4 T→A 1169   IVS4 T→G 1216   3’UTR T→C 1630   10(1)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   Lys41Arg(AAG→AGG：731)   未发表   IVS4 T→A 1169   10(6)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   11(3)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS2 A→G 580   IVS4 C→T 1101   IVS4 T→A 1169   11(5)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   12(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS1 T→C 230   IVS2 DelA 508   IVS3 T→C 836   IVS4 C→T 1101   IVS4 T→A 1169   12(4)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   G→A-48   未发表   IVS4 C→T 1101   IVS4 T→A 1169   13(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   Glu129(GAA→GAG：   1341)   13(2)   T   A   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   14(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 C→T 1101   IVS4 T→A 1169   14(7)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   15(1)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   15(3)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   16(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   16(7)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   Lys41Arg(AAG→AGG：731)   未发表   ND   17   18(1)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   G   C→T-108   IVS1 C→T 188   18(2)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS1 A→G 124   IVS1 A→T 128   19(2)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   G→A-156   未发表   IVS4 T→A 1169   19(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   20(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   IVS4 T→C 1208   IVS4 T→G 1302   20(3)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   Asp11Asn(GAC→AAC：431)   未发表   IVS4 T→A 1169   21   22(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   22(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 C→T 1101   IVS4 T→A 1169   23(2)   T   A   G   G   A   G   A   T   T→C-237   Phe1Leu(TTC→CTC：401)   IVS2 A→G 558   IVS4 T→A 1169   23(8)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS2 G→A 620   IVS4 T→A 1169   24(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS1 G→A 313   IVS4 T→C 1232   24(4)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   Thr-20Ala(ACG→GCG：341)   IVS4 T→A 1169   25(1)   T   G   G   G   G   A   G   G   C   T   ND   IVS3 C→G 879   IVS4 T→A 1169   25(4)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS2 G→A 685   26(1)   C   A   G   G   G   T   G   A   A   T   ND   Gly131(GGC→GGT：   1347)   26(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS1 T→C 281   27(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   Ser43Leu(TCA→TTA：737)   未发表   ND   27(4)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A1169   3’UTR C→T1659   28(4)   T   A   T   G   G   A   G   A   A   T   ND   ND   28(5)   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   ND   ND   29(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   29(3A)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   IVS4 A→G 1189   30(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   -177A→G   Ser108Cys(AGC→TGC：1023)   Phe176Ser(TTC→TCC：1481)   IVS3 T→C 901   IVS4 A→G 1261   30(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   -177A→G   Ser108Arg(AGC→CGC：1023)   Leu163Pro(CT℃→CCC：1442)   IVS1 T→C 234   IVS3 T→C 901   31(3)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   Lys41Arg(AAG→AGG：731)   未发表   ND   31(11)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   Ser108Arg(AGC→CGC：1023)   Phe176Ser(TTC→TCC：1481)   IVS3 T→C 901   IVS4 G→A 1097   IVS4 A→G 1193   32-2(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   IVS4 A→G 1240   32-2(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   -177A→G   Ser108Arg(AGC→CGC：1023)   Phe176Ser(TTC→TCC：1481)   未发表   未发表   未发表   IVS3 T→C 901   32-3(3)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   Ins GAAA 251   IVS4 T→A 1169   33(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   33(4)   T   ？   ？   -   G   A   G   A   A   T   基因转换(至GH2)，   最大-161至+69   最小-86至-46   未发表   ND   34(3)   C   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   34(4)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   35(6)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   35(8)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   36(3)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS1 T→C 281   IVS1 T→C 303   36(5)   T   A   ？   G   A   A   G   A   A   T   Del5G-57至-61   Asp26Val(GAC→GTC：477)   未发表   未发表   ND   37(1)   T   G   G   G   G   A   G   G   C   T   受体剪接位点IVS2   G→Aat-1(702)   未发表   IVS4 T→A 1169   37(4)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→Aat-1(702)   未发表   IVS4 C→T 1212   IVS4 T→A 1169   38(2)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→Aat-1(702)   未发表   IVS4 T→A 1169   39(1a)   T   G   G   G   G   T   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   39(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   Thr175Ala(ACA→GCA：1477)*   未发表*   ND   40(1)   T   A   T   G   G   A   G   A   A   T   ND   ND   40(5)   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   ND   ND   41(1)   T   G   G   G   G   A   G   G   C   T   ND   IVS4 T→A 1169   41(4)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   41(6)   T   A   ？   G   G   A   G   A   A   T   DelG-57 to-61   未发表   42(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   42(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   43(4)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   43(6)   C   A   G   G   G   T   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   44(1)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   C→T-18   未发表   IVS4 T→A 1169   3’UTR C→T 1536   44(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   Ser85Pro(TCG→CCG：954)   未发表   IVS4 T→A 1169   45(4)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS1 T→C 281   IVS4 T→A 1169   46(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   IVS4 T→G 1216   46(7)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS1 T→C 281   IVS4 T→A 1169   47(4)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS4 C→T 1101   IVS4 T→A 1169   3’UTR T→C 1648   47(7)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   C→T-347   A→G-44   IVS2 A→G 585   IVS4 T→A 1169   48(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   48(5)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   G   Thr-24Ala(ACA→GCA：69)   Ala155Val(GCA→GTA：1418)   Miyata et al   (1997)c   未发表   IVS4 T→A 1169   49(3)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS2 T→C 665   50(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Leu-11Pro(CTC→CCC：369)   IVS4 T→A 1169   50(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   T→C+31   Leu-11Pro(CTC→CCC：369)   Ile4Val(ATT→GTT：410)   IVS1 A→G 249   IVS4 T→A 1169   50(3)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Met-26Val(ATG→GTG：63)   Leu-11Pro(CTC→CCC：369)   IVS4 T→A 1169   51(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Leu-11Pro(CTC→CCC：369)   IVS1 C→G 226   IVS4 T→A 1169   51(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   52(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Lys168Glu(AAG→GAG：1456)   IVS4 T→A 1169   3’UTR T→C 1558   52(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   C→T-56   供体剪接位点IVS23   T→C at+2(824)   Lys168Glu(AAG→GAG：1456)   IVS4 T→A 1169   3’UTR T→C 1558   53(1)   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   Ser71Phe(TCC→TTC：821)   未发表   ND   53(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS2 G→A 676   IVS4 C→T 1182   54(1b)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS1 T→C 284   IVS2 A→G 573   IVS4 T→A 1169   54(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS1 A→G 134   55(2)   T   ？   ？   -   G   A   G   A   A   T   最大-161至+692)，   最小-86至-46   未发表   ND   55(3)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→A at-1(702)   未发表   IVS4 T→A 1169   56(1)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→A at-1(702)   未发表   IVS4 T→A 1169   56(1A)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   A→G-24   ND   57(1)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→A at-1(702)   未发表   IVS4 T→A 1169   57(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Asp107Gly(GAC→GGC：1021)   未发表   IVS4 T→A 1169   58(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   58(4)   T   ？   ？   -   G   A   G   A   A   T   基因转换(至GH2)，   最大-161至+69   最小-86至-46   未发表   ND   59(1)   T   A   G   G   G   A   G   G   A   T   ND   IVS4 C→T 1101   IVS4 T→A 1169   59(5)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   60(2)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→A at-1(702)   未发表   IVS4 T→A 1169   60(4)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   G→A-280   IVS1 T→C 281   IVS4 T→A 1169   61(1)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   61(4)   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   受体剪接位点IVS2   G→A at-1(702)   ND   62(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS4 T→A 1169   62(2)   C   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Gln91Leu(CAG→CTG：973)   IVS4 T→A 1169   63(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Glu74Lys(GAG→AAG：921)   IVS4 T→A 1169   63(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   ND   64(7)   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   Glu56Gly(GAG→GGG：776)   IVS4 T→A 1169   64(8)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS3 C→A 883   65(1)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   A→G-248   未发表   IVS4 T→A 1169   65(2)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS2 G→T 586   IVS3 T→C 836   IVS4 T→A 1169   66(1)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Leu-11Pro(CTC→CCC：369)   IVS1 T→A 284   IVS4 T→A 1169   66(2)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   Val110Ile(GTC→ATC：1029)   IVS4 T→A 1169   67(2b)   T   G   G   G   G   A   G   G   C   T   G→A-364   IVS1 T→C 303   IVS4 T→A 1169   67(13)   T   A   G   G   G   A   G   A   C   T   T→C-413   IVS1 G→T 135   IVS1 G→C 236   IVS4 T→A 1169   67(15)   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   ND   IVS2 T→C 649   68(2b)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   Tyr143His(TAC→CAC：1381)   ND   68(7)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   ND   IVS2 A→T 519   IVS2 G→A 524   3’UTR T→C 1654   69(3)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   T→C-495   IVS1 A→G 136   IVS3 T→C 839   69(11)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   Glu30Gly(GAG→GGG：489)   Tyr103(TAC→TAT：   1010)   1VS4 T→G 1196   70(5)   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   T→C-30   ND   70(10)   T   G   G   G   G   A   G   G   C   T   A→G-267   A→G-248   Gln22Arg(CAG→CGG：465)   Lys41Arg(AAG→AGG：731)   Trp86Arg(TGG→CGG：957)   IVS4 T→A 1169   3’UTR T→C 1654

关键词：

IVS：间插序列(内含子)

ND：未检测到突变或多态性

UTR：非翻译区

a患者(克隆数)

b基于GH1参考序列的核苷酸编号。At-31，有G或无G的可变等位基因。

c氨基酸残基数和替换，(基于GH1参考序列的核苷酸替换和数目)。

d IVS数，核苷酸变化，碱基数

e Miyata I，Cogan J，Prince MA，Kamijo T，Ogawa M，Phillips JA，Detection of growth hormone defects by dideoxy fingerprinting(ddF)Endocrinol J. 44：149-154(1997)

*首次在体内鉴定这种突变；以前因丙氨酸扫描突变而在体外鉴定到 (Cunningham等.USP5849535(1998)).

GH1参考序列是由Chen等人(1989)登录到GenBank中的(登录 号：J03071)。迄今为止所分析的68位患者中，在47人中发现有突 变。除30，37，50和52号患者(纯合的)，30，31，44，50，52， 55，56，57，60，66，67号患者(混合型杂合的，反式非相同性损伤) (即在不同等位基因上)及7，23，30，31，32，36，47，48，50， 52和70号患者具有2个或多个顺式突变(即在同一等位基因上)以 外，所有检测到的突变均以杂合状态存在。

(d)错义突变：

在GH1基因编码区内，共发现31种新型的碱基对替换，其改变了 所编码的氨基酸。这些错义突变的致病性证据有四个来源：(i)对照 人群的研究，(ii)氨基酸替换的性质及所研究的残基在进化上的保 守程度，(iii)分子模建和(iv)它们的信号转导活性的体外分析。

(i)对照中GH1编码序列变异的研究

对总共80名健康的高加索裔英国对照者的GH1编码区的变异进行 了筛选。在单一个体中发现有5例沉默替换[Asp26的GAC→GAT，Ser85 的TCG→TCC，Ser85的TCG→TCA，Thr123的ACG→ACA和Asn109的 AAC→AAT]。此外还有2例错义突变[AAC→ACA，Asn47→Asp；GTC→ATC， Val110→Ile，等位基因4/160]；在我们的病人研究中(患者66)只 发现Val110→Ile替换。分子模建表明这一替换对GH的结构具有有害 的作用；Val110形成第3螺旋N-末端疏水核心的一部分，而替换成侧 链较长的Ile可能导致空间位阻。因此，即便Val110→Ile替换在对 照组和患者组中出现的频率都较高，它仍有可能会影响构象。尽管如 此，在对照组中相对低的错义突变有力地支持了患者组中发现的损伤 的可靠性。

(ii)氨基酸替换的性质及相关残基在进化上的保守程度

一种错义突变能否引起临床关注，取决于许多影响因素，包括所 研究的基因的序列结构，氨基酸替换的数量，被替换残基在蛋白分子 内的确切位置和直接环境，及其对蛋白质结构和功能产生的影响 (Wacey等人，Hum Genet 94：594-608，1994)。为评估检出的错义 突变是否可能具有病理学意义，分别测定了变异的生物物理性质(表 7C)。大多数情况下，变异是非保守性的，替换氨基酸明显地不同于 被替换氨基酸，从而支持了它们具有病理学意义的论点。

有关病理学中的错义突变的证据来自进化保守数据，因为那些进 化上保守的氨基酸残基可能具有生物学功能。相反，进化上不保守的 氨基酸残基不太可能具有功能意义。因此病理学损伤倾向于发生在进 化上保守的残基上，而中性的多态性或罕见变异却不这样(Wacey等 人，ibid)。因此，通过与19种其它脊椎动物直向同源的GH蛋白序 列进行比较，根据其进化保守性检测了发现与错义突变有关的每种人 GH残基(表7C)。发现大部分受错义突变影响的残基高度保守，有时 严格保守，再一次支持了这些损伤具有病理意义的观点。

表7C：相关残基的错义突变、生物物理性质和进化保守性   氨基酸替换   变异的生物物理性质   (保守性的/非保守性的)   脊椎动物GH蛋白质的氨基酸残基的进   化保守性   Met→Val-26   起始子甲硫氨酸   Thr→Ala-24   NC：极性的→疏水的   小鼠中保守的，大多数哺乳动物中为疏水   的Ala   Thr→Ala-20   NC：极性的→疏水的   在arterodactyls、家兔、啮齿类动物中保   守的.在狗(Asn)和鸟类(Ser)中极性的.   青蛙中为Gly.   Leu→Pro-12   C：疏水的   除鸟类(极性的Thr)和青蛙(Val)外，在所   有哺乳动物和大多数鱼中保守.   Leu→Pro-11   C：疏水的   在所有哺乳动物、鸟类和rock cod中保守.   在其他鱼中为疏水的残基.   Phe→Leu1   C：疏水的   除鱼(极性的Tyr、Gln和Gly)外，在哺乳   动物、鸟类和青蛙中保守.   Ile→Val 4   C：疏水的   除在鲑鱼中都不保守.在其他哺乳动物、鸟   类和青蛙中为Met   Asp→Asn 11   NC：带电荷的→极性的   非保守的.在大多数其他哺乳动物和鸟类   中为疏水的Ala.   Glu→Arg 22   NC：极性的→带电荷的   在大多数其他哺乳动物中(鲸鱼中Glu)、   青蛙和一些鱼类保守.在鸟类、乌龟和一   些鱼类中为疏水的Leu.   Asp→Val 26   NC：带电荷的→疏水的   在哺乳动物、乌龟和青蛙中保守.在鸟类   (Glu)和鱼类(Gly/Lys)中为带电荷的.   Glu→Gly 30   (见图7)   NC：带电荷的→小的、不   带电荷的   在哺乳动物、鸟类、乌龟和rock cod中保   守.在青蛙和大多数鱼类中为带电荷的   Asp.   Lys→Arg 41   C：带电荷的   在所有其他脊椎动物中为Arg！   Ser→Leu 43   NC：极性的→疏水的   侧链增加   除了鲸鱼(Phe)、乌龟、青蛙和鲨鱼外，在   所有哺乳动物中保守.鸟类(Thr)，海鲢   (Leu)   Glu→Gly 56   NC：带电荷的→小的、不   带电荷的   在哺乳动物、鸟类、乌龟、青蛙、鲨鱼中   保守.海鲢中为带电荷的Asp   Arg→Gly 64   NC：带电荷的→小的、不   带电荷的   在所有其他脊椎动物中严格保守(带电荷   的的Lys)   Ser→Phe 71   NC：极性的→疏水的   侧链增加   在除了啮齿类动物(极性的Thr)外的所有   脊椎动物中保守   Glu→Lys 74   C：带电荷的   在哺乳动物、鸟类、乌龟、青蛙、鲨鱼中   保守.鱼类中为带电荷的Lys.   Ser→Pro 85   NC：极性的→疏水的   在所有其他脊椎动物中严格保守   Trp→Arg 86   NC：极性的→带电荷的   在所有其他脊椎动物中严格保守   Glu→Leu 91   NC：极性的→疏水的   在除了sea bream和rock cod(极性的   Arg)外的所有脊椎动物中保守   Asp→Gly 107   NC：带电荷的→小的、不   带电荷的   在除了海鲢(Arg/Ala/Pro)外的所有脊椎   动物中保守   Ser→Cys 108   C：极性的   在除了鱼类(极性的Asn)外的大多数其他   脊椎动物中为Arg(带电荷的)   Ser→Arg 108   NC：极性的→带电荷的   侧链增加   在除了鱼类(极性的Asn)外的大多数其他   脊椎动物中为Arg(带电荷的)   Val→Ile 110   C：疏水的   在除了海鲢(疏水的Ile)外的大多数其他   脊椎动物中保守   Tyr→His 143   C：极性的   在除了鲤鱼和金鱼(疏水的Phe)外的脊椎   动物中保守   Ala→Val 155   C：疏水的   在所有哺乳动物、鸟类、乌龟、鲨鱼中保   守.青蛙中为Gly、海鲢中为Ala/极性的   Ser   Leu→Pro 163   C：疏水的   在所有脊椎动物中严格保守   Lys→Arg 168   C：带电荷的   在所有脊椎动物中严格保守   Lys→Glu 168   C：带电荷的   在所有脊椎动物中严格保守   Thr→Ala 175   NC：极性的→疏水的   在所有脊椎动物中严格保守   Phe→Ser 176   NC：疏水的→极性的   在所有其他脊椎动物中为极性的Tyr

同源共生的GH蛋白质的比较

(括号中为相对于人的同一性％、变异的保守性％)

小鼠(66，77)，大鼠(64，75)，家兔(66，77)，鲸鱼、狗(67，78)，猪(67，78)，绵羊(66，76)， 母牛(66，76)，火鸡(55，74)，小鸡(56，73)，鸭(55，72)，乌龟、青蛙(45，68)，鲨鱼、 sea bream、rock cod、鲑鱼、鲤鱼(38，57)，金鱼(37，57).

(iii)用分子模建来证明具有推定的功能效果的错义突变

分子模建研究表明错义突变经常位于GH分子上与GH受体相互作 用或可能影响GH-GH受体相互作用的区域。通过对人生长激素的X-射 线晶体学结构中适当氨基酸的简单置换，对错义突变进行分子模建。 然后从静电相互作用、氢键、疏水性相互作用和表面暴露几个方面比 较了野生型和突变体“结构”。大部分错义突变看来由GH分子结构变 形引起，而不是功能紊乱引起。这种氨基酸替换可能导致分子的错误 折叠或不稳定性。但下面的8种错义突变看起来是产生功能性效果而 不是单纯的结构效果的氨基酸替换：

Ile4Val：N-端，位点2内。丙氨酸扫描诱变(ASM)早就证明了 Ile4替换影响GHR二聚化。

Gln22Arg：螺旋1。Arg的引入导致同Asp26间的氢键消失。还导 致在螺旋同侧引入两个正电荷。可能使螺旋构象变得不稳定或是与GHR 上的Arg217发生不利的相互作用。

Lys41Arg：环1。Lys41溶剂易接近的。直向同源基因中经常在 相似位置上含有Arg。Lys41Nζ与GH残基Tyr28和Glu32形成氢键， 并与GHR上的Glu1270ε2有离子间相互作用。ASM显示Lys41参与GHR 结合。Arg的引入可能不增加GH对GHR的亲合性。细微的变化不具必 然的致病性。患者GH水平正常。

Glu56Gly：Glu56处于螺旋1和2间的环区，含有部分结合位点1。 Glu56与GHR上的Arg71相互作用。Glu56还与Lys168内部相互作用， Lys168构成GH-GHR复合物结合能量热点的部分。

Arg64Gly：环2。Arg64溶剂易接近的。Arg或Lys在这一位置处 保守。ASM显示Arg64参与GHR结合。碱性的Arg侧链与GHR上的Asp164 形成盐桥和氢键。Arg64还与GHR的Trp169有疏水性相互作用。被Gly 替换将削弱GHR的结合并可能使螺旋变得不稳定。患者GH水平正常。

Lys168Arg：螺旋4。Lys168与GHR的Trp104间疏水性相互作 用。预计没有不利的相互作用。患者GH水平高于正常。

Lys168Glu：Lys168与GHR的Trp104间有广泛的疏水相互作用。 通过形成有利的分子内静电作用，其电荷可能稳定GH的活性构象。Glu 替换可能不会产生对活性的严重影响。

Thr175Ala：螺旋4。ASM显示Thr175参与GHR结合；Thr175与 GH分子中的Asp171，GHR上的Trp169、Arg43形成氢键。Ala的引入 可能使螺旋变得不稳定从而降低受体结合活性。

以上提到的错义突变可能提供这样一种暗示，即存在自然产生的 生长激素抑制物，其-除了依照本发明应用的选择标准-可能还从未 发现过。

(iv)GH变体的信号转导活性分析

使用萤光素酶报告子基因分析系统(依照Ross RJM等人在Molec Endocrin 11：265-73，1997中报导的方法)来分析GH变体的信号转 导活性(生物活性)。为了使生长激素具有生物活性，它必须能与两 个GH受体结合并使受体二聚化。这将导致胞内称为JAK2的酪氨酸激 酶的活化。继而，JAK2使转录因子STAT 5磷酸化并激活。磷酸化的 STAT5二聚化，转移到核中与STAT 5效应启动子结合，从而开启GH 效应基因的表达。我们采用的GH生物活性分析要求这一途径中的所有 阶段都是有功能的。从表7D中可以看到一些变体，如Q22R，K41R， W86R和S108R，与激活JAK/STAT信号转导途径能力的显著降低有关。 69号患者中的变异体E30G，显著增强了激活JAK/STAT信号转导途径 能力，因而可作为一种超激动剂(数据如图8所示，其中RLU表示相 对光单位)。

表7D：GH变体的信号转导活性的分析   患者编号   突变   ％WT   SEM   p对WT   野生型   -   100   3   48   T-24A   92   5   NS   23   FlL   121   4   NS   70   Q22R   49   2   0.001   36   D26V   85   5   NS   69   E30G   137   6   0.001   10.16，31，70   K41R   67   5   0.001   27   S43L   93   6   NS   53   S71F   77   9   0.05   44   S85P   78   7   0.05   70   W86R   75   3   0.001   57   D107G   100   3   NS   30，31，32   S108R   46   5   0.001   48   A155V   85   9   NS   3   L163P   92   6   NS   7   K168R   100   8   NS   39   T175A   67   6   0.01   30，31，32   S108R+F176S   34   2   0.001   70   Q22R+K41R+   W86R   53   2   0.001

萤光素酶报告子基因分析试验结果用1nM剂量时(1nM约＝实验中 野生型GH的ED50)相对于野生型的活性百分数表示。P表示观察值与 野生型真实值之间差异的显著性。NS表示“不显著”

在4名无亲缘关系的患者中发现了一种错义突变(Lys41Arg)， 其中3人具有不同的单倍型背景。这与该位点处的频发突变(即独立 突变事件)是一致的。IVS2中-1位处的G→A转换突变在共8名明显 无亲缘关系患者的8个等位基因上被发现；因为两种不同的单倍型非 常明显，至少两例这种损伤可能是频发的，而其余可能是与家族一致 的(identical-by-descent)。这些患者样本中还有3个启动子基因 转换事件。还发现了多例其它各种损伤[A→G-177(3)，A→G-248(2)， Leu-11Pro(4)，Ser108Arg(2)，Lys168Glu(2)，Phe176Ser(2) 和Leu163Pro(2)]。总而言之，患者样本中发现32/75(43％)等位 基因的10个频发突变。这对快速检测GH1基因频发性病理损伤的前景 来说是令人鼓舞的。

(e)启动子单倍型

在我们在研究中，发现已知的GH1基因多态性核苷酸中15/17是 变化的。将研究中患者组和对照组(157名高加索裔英国军队新兵) 中的15处变化，归纳为共40种不同的单倍型。这些单倍型的频率(表 7F)在0.339(单倍型1)到0.0033(单倍型25-36)，到0(单倍型 37-40，患者特有的，只在患者中发现，对照人群中没有发现)间变化。

我们发现，这些启动子单倍型在报告基因分析试验中，驱动萤光 素酶报告基因表达的能力不同。40个单倍型中的27个已经在大鼠垂 体GH3细胞中进行了研究。对每种单倍型，进行3种不同实验的6次 重复(即共18次重复)。那些与萤光素酶报告子基因表达水平显著降 低[＜大多数普通单倍型的62％(no.1)]相关[并因而可能与体内GH1 基因表达水平降低相关]的单倍型列于表7E，一起列出的还有它们在 患者组与对照组中各自的频率。

这些发现表明，正常人群中15％的个体可能是杂合的GH、其(至 少体外如此)GH合成水平比拥有最普遍单倍型的那些个体低40％以上 的启动子单倍型。而且，可能正常人群中约有2％具有2种这样的低表 达单倍型(或相同的或不同的)，直接导致其GH水平显著低于平均值。 如果体内研究支持这一论点，那么诊断筛选方案中还应包括启动子单 倍型的确定及突变检测。

表7E：启动子单倍型；利用萤光素酶报告子基因分析测定的其 频率和相对强度   单倍型  萤光素酶活性±sem   单倍型的频率(％)   对照组   患者组   1   3   5   10   23   26   29   100±18   59±15   57±13   61±18   28±15   55±26   62±15   33.9   9.2   4.3   2.0   1.0   0.3   0.3   26.4   8.5   5.4   0.0   0.8   0.8   0.0

表7F；研究过程中在对照组GH1基因中发现的不同启动子单倍 型的总结   单倍型   -476   (G/A)   -339   (ΔG)   -308   (T/G)   -301   (T/G)   -278   (G/T)   -168   (T/C)   -75(A/G)   -57   (G/T)   -31   (ΔG)   -6(G/A)   -1   (T/A/C)   +3   (G/C)   +16(A/G)   +26   (A/C)   +59   (T/G)   频率   (％)   1   G   G   G   G   G   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   33.9   2   G   G   G   G   T   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   16.5   3   G   G   T   T   G   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   9.2   4   G   G   T   T   G   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   5.3   5   G   G   G   G   T   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   4.3   6   G   G   T   T   G   T   A   G   -   A   A   G   A   A   G   3.0   7   G   G   G   G   T   T   A   G   G   G   T   G   A   A   T   2.6   8   G   G   T   T   G   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   2.0   9   G   G   G   G   T   T   A   T   G   G   A   G   A   A   T   2.0   10   G   G   T   T   G   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   2.0   11   G   G   G   G   T   T   G   G   G   G   A   G   G   C   T   1.6   12   G   G   G   G   T   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   1.6   13   G   -   G   G   T   T   G   G   G   G   A   G   A   A   T   1.6   14   G   G   G   G   T   C   A   G   G   G   T   G   A   A   T   1.6   15   G   G   T   T   G   T   A   G   G   G   T   G   A   A   T   1.3   16   G   G   G   G   T   T   G   G   G   A   A   G   A   A   T   1.3   17   G   -   G   G   T   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   1.3   18   G   G   G   G   T   T   A   G   -   G   A   G   A   A   T   0.99   19   A   G   G   G   T   T   A   G   G   G   A   G   A   A   T   0.99   20   G   G   G   G   G   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   0.99   21   G   G   G   G   T   T   G   G   G   G   A   G   A   A   G   0.99   22   G   G   T   T   G   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   0.99   23   G   G   G   G   G   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   0.99   24   G   G   T   T   G   T   G   G   -   A   A   G   A   A   T   0.66   25   G   G   T   T   G   T   A   G   G   A   A   G   A   A   G   0.33   26   G   G   G   G   T   T   G   G   G   G   T   G   A   A   T   0.33   27   G   G   G   G   T   T   A   T   G   A   A   G   A   A   T   0.33   28   G   G   G   G   T   T   A   G   -   A   A   G   A   A   T   0.33   29   A   G   G   G   T   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   0.33   30   G   -   G   G   T   T   A   G   G   A   A   G   A   A   T   0.33   31   G   G   G   G   T   T   G   G   -   G   A   G   A   A   T   0.33   32   G   G   T   T   G   T   G   G   G   G   A   G   A   A   G   0.33   33   G   G   G   G   T   T   A   G   G   G   A   G   G   C   T   0.33   34   G   G   G   T   C   A   G   G   G   T   G   A   A   T   0.33   35   G   G   G   G   G   T   A   G   G   A   C   C   A   A   T   0.33   36   G   G   G   G   T   T   A   G   G   G   T   G   A   A   G   0.33   37   A   G   G   G   T   T   A   G   G   G   A   G   G   A   T   0   38   G   G   G   G   T   C   A   G   G   A   A   G   A   A   T   0   39   G   G   T   T   G   T   A   G   G   G   A   G   A   C   T   0   40   G   G   G   G   T   C   A   G   G   G   A   G   A   A   T   0

给出的频率来自对照组(157名高加索裔英国军队新兵)

(c)启动子突变

从我们的患者群中检测到各种新型的启动子变体(18种单碱基对 替换，2种少量缺失，1种重大基因转换)。这些损伤的可靠性的证据 来自(i)对健康对照的GH1启动子区域的研究，(ii)对不同哺乳动 物物种受影响的核苷酸进化上保守程度的研究及(iii)体外借助萤光 素酶报告子基因分析，确定它们对GH1启动子的功能影响。

(i)对照组中的GH1启动子变体

对157名高加索裔英国人对照组的GH1启动子区域进行了突变筛 选。在2例个体中检测到唯一一种相应于患者样品中发现的突变的序 列改变，即-48位的G→A转换。另外3种对照组特有的替换出现在单 一个体中(+62A→G，-123T→C，-373G→A)。最后，在一个个体内发 现了基因转换(最小-57～-31，最大-168～-6)，其也是对照组特有 的。因此，从对照组检出的变化远少于患者组，这一发现与患者突变 具有病理意义是一致的。

(ii)进化上的保守

采用10种哺乳动物中的对应于GH1基因转录起始点上游130bp 处的DNA序列。当进行归类时，发现7/10病例中，患者体内突变的核 苷酸是进化上保守的(+31T→C，-18C→T，-24A→G，-30T→C， Δ5G-57～-61，ΔG-57～-61及-108C→T)。这一发现与患者组内发现 为突变的核苷酸的功能重要性是一致的。

(iii)对GH1启动子突变的萤光素酶报告子基因分析

在报告子基因分析试验中，比较了各种推定的启动子突变对萤光 素酶基因表达的驱动能力(表7G)。在大鼠垂体GH3细胞和人HeLa 细胞中，对每种单倍型在3种不同的实验条件下进行6次重复(即共 重复18次)。在HeLa细胞中，发现因-30T→C的转换和Δ5G-57至-61 的缺失，其水平显著低于正常表达水平(GH3细胞中也有此倾向)。 因而，报告子基因分析试验支持了这两种损伤的病理相关性。

表7G：推定的启动子突变及报告子基因的表达   启动子突变   相关的单倍型   归一化的萤光素   酶活性   归一化的单倍型   ±sem   GH3   HeLa   A→G-248   1   115±16   105±18   T→C-495   1   127±11   106±15   A→G-177   1   98±13   166±10   T→C-30(TATA)   1   86±16   57±19   A→G-24   1   117±19   113±13   C→T-347，A→G-44   1   166±20   144±12   A→G+62   1   130±10   112±15   G→A-48，A→G-498   2   90±16   107±18   T→C-508   2   117+17   99±11   ΔGGGGG-57 to-61   2   91±16   48±14   ΔG-57   2   106±19   96±16

(d)影响mRNA剪接的突变

剪接位点处发现有两种新型的变异体，一种是外显子3中供体剪 接位点处T→C的转换，另一种是外显子2受体剪接位点的专性AG二 核苷酸的普通单碱基替换。通过体外剪接分析对后一突变进行了进一 步的性质鉴定。它的致病性证据来自分析条件下，观察到的它导致GH1 mRNA转录物上外显子3的“跳读”(排除)的现象。

(e)人GH1基因多态性

我们研究过程中，从GH1基因的外显子，内含子或3′非翻译区 (3′UTR)中鉴别出71种不同的推定的多态性(表7A)。大多数多态 性只出现一次，且可能属罕见变异。除IVS4 T→A 1169多态性由 Hasegawa等人(ibid)报导过外，所有多态性都是新发现的。IVS1-4 表示内含子位置：

(f)基因座控制区多态性

在基因座控制区共发现11种推定的多态性。它们是154G→A， 154G→C，457G→A，505G→T，507T→G，661C→T，1055C→T，1429 C→G，1568T→G，1615-1620ΔGGTGGT和1934T→C。残基编号同图4 中的参考序列。总体上，患者组与对照组在等位基因频率上没有明显 差异。但是，505G→T，1055C→T和1934T→C替换是患者组特有 的，因而可能会影响这些个体中GH1基因的表达。