本发明涉及一种由产生碱性氨基酸的微生物菌株的发酵肉汤制备碱性 氨基酸的方法。

碱性氨基酸如L-赖氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸和L-鸟氨酸主要通过微 生物的发酵方法制备(如参见Axel Kleemann等人，“Amino acids”， “Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry”，CD-ROM第5版，1997 年，Wiley-VCH及其中引入的文献；Th.Hermann，J.Biotechnol.104 (2003)，155-172及其中引入的文献；Pfefferle等人，Adv.Biochem. Eng./Biotechnology，卷79(2003)，59-112及其中引入的文献，以及Atkinson 等人，Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook(生化工程和 生物技术手册)，第二版，Stockton Press，1991年，第20章及其中引入的 文献)。

在所述发酵方法的情形下，主要获得除了从所用的微生物中产生的所 需碱性氨基酸和生物质以外还包含多种副产物和杂质如其它氨基酸、基质 (substrate)残渣、盐类、溶胞作用产物和其它副产物的含水发酵肉汤。

由发酵肉汤制备碱性氨基酸，及它的纯化经常使用强酸性阳离子交换 剂进行(例如参见Th.Hermann，见上；Atkinson等人，见上)。为此目的， 在除去微生物和其它不溶性组分(生物质)之前或之后，将含水发酵肉汤用 强酸例如硫酸酸化至pH低于2，以使得碱性氨基酸以二价阳离子存在。然 后将酸化的含水肉汤通过酸基团呈盐形式，如钠盐或氨盐形式的强酸性阳 离子交换剂，结果是碱性氨基酸二价阳离子被吸附到离子交换树脂上。之 后，加载有碱性氨基酸的阳离子交换剂通常用水洗涤以除去杂质。然后碱 性氨基酸用稀碱性水溶液例如氢氧化钠溶液、氨水或含水铵缓冲液处理洗 脱，同时再生阳离子交换剂的盐形式。由如此制得的洗出液，如果合适的 话，在酸化该洗出液后，将碱性氨基酸以传统的方式如结晶进行分离。

当然，当阳离子交换剂加载碱性氨基酸的二价阳离子时，流出的液体 (流出液)具有高的盐浓度，因此可称作高密度废水(HDWW)。而且如果合 适的话，随后的洗涤步骤产生了大量的具有盐加载的水(低密度废水 (LDWW))。为了降低盐加载，这些废水必须进行复杂的废水处理。可选择 地，可将盐废水脱水且可将所得的浓缩液处理掉或用于其它用途。然而， 考虑到装置和高的能量消耗，两种措施都伴随着额外的费用，因此相当大 的程度归因于有发酵能力的氨基酸的制备成本。因此已经不乏有尝试以降 低通过在包含碱性氨基酸的发酵肉汤的阳离子交换剂的后处理中产生的盐 加载和废水量。

为了降低废水量，Hsiao等人，Biotechnology and Bioengineering，卷 49(1996)，341-347提出向发酵培养基中再循环在阳离子交换剂上产生的含 盐流出液。结果是除了在发酵培养基中积聚通常在微生物代谢中作为副产 物形成的发酵抑制剂的风险以外，已经发现在此情形下，阳离子交换剂的 结合能力降低，使得由降低废水量实现的节省费用被更大的阳离子交换设 备的成本所消耗。

为了降低在含赖氨酸的发酵肉汤的后处理中的盐加载，I.Lee等人， Enzyme and Microbiol.Technol.30(2002)，798-803提出使用离子排斥色 谱法代替常用的阳离子交换剂。为此，首先通过微量过滤法除去发酵肉汤 的固含量。将所得的含赖氨酸的含水肉汤调节到等电点(pH 9.74)，然后使 其通过阳离子交换剂。由于肉汤的离子组分没有被吸收，因此这些组分在 流出液中被回收。然后将氨基酸用水洗脱。然而已经发现大于90％的L- 赖氨酸的高回收率只有在含赖氨酸的进料速和通流速率都低时才能实现。 因此尽管是更低的盐加载，但该实施方案是不经济的。

另一方面，US 4,714,767描述了一种通过多个串接的阳离子交换柱的 设备由含水肉汤分离出碱性氨基酸的多级方法，其中将在加载第一个柱子 时产生的流出液的最后部分再循环至随后分离的加载操作。还提出将第一 个柱子的洗出液的最后部分再循环至随后分离的洗脱过程。以此方式，水 量减少，但盐加载没有减少。

EP 1,106,602 A1描述了在强酸性阳离子交换剂上通过模拟移动床色 谱法由含杂质的氨基酸水溶液中分离氨基酸。根据优选实施方案，为此使 用包括一个或多个具有强酸性阳离子交换剂的串接色谱柱且在接连的设备 中包括第一解吸口、取料口、进料口、萃余液口和第二解吸口的装置。为 了分离出氨基酸，同时地，(i)经由进料口将含氨基酸的进料溶液和(ii)经由 第一解吸口将碱性洗脱剂与阳离子交换材料接触，如果合适的话，(iii)经 由第二解吸口取出水溶液，以及(iv)经由取料口，取出包含氨基酸的溶液， 与进料溶液相比，该溶液具有更少的杂质。有关盐加载和废水量降低的优 点不清楚。

因此本发明的目的是提供一种由产生碱性氨基酸的微生物菌株的发酵 肉汤制备碱性氨基酸的方法，该方法克服了现有技术所述的缺点。

令人吃惊地发现该目的通过如下一种方法实现，其中首先从发酵肉汤 中分离出大多数的微生物(步骤a)，和然后从所得含水肉汤中通过用该肉汤 连续加载呈盐形式的强酸性阳离子交换剂的单级或多级的通常串联的设备 并洗脱碱性氨基酸而分离出碱性氨基酸(步骤b)，其中在加载前，碱性肉 汤的pH为4.0～7.5、尤其是4.5～7.2和尤其是4.6～7，以及阳离子交换设备 的至少第一级用酸水溶液预处理，以使得在该预处理结束时经预处理的阳 离子交换剂的流出液的pH为4.5～7.0。

因此，本发明涉及在此处和权利要求书中给出的由产生碱性氨基酸的 微生物菌株的发酵肉汤制备碱性氨基酸的方法。

本发明方法具有许多优点：首先，在本发明方法中产生的盐量和因而 废水的盐加载低于其中将阳离子交换剂用于由发酵肉汤分离出和制备碱性 氨基酸的现有技术的方法。另外，甚至在阳离子交换剂的高加载和高通流 速率时也能获得通常大于95％的碱性氨基酸的高产率。考虑到所选择的肉 汤的pH，不会发生明显的可堵塞阳离子交换剂并因而增加洗涤水需求的杂 质的沉淀。

根据本发明，在第一步中，将大多数存在于发酵肉汤中的微生物和如 果合适的话，存在的其它固体从发酵肉汤中分离出。原则上完全分离这些 组分不是必须的。然而通常将至少70％、尤其是至少80％的存在于发酵肉 汤中的固体(包括微生物)在步骤a)中分离出。优选所得的含水肉汤包含小 于1％体积、尤其是不超过0.6％体积的细胞物质。

微生物和其它固体组分的分离可通过包括饼式过滤和深度过滤、交叉流 过滤在内的过滤，通过如超滤和微量过滤法的膜分离方法，通过离心和滗析， 通过使用旋液分离器的通常方式，这些方法的组合或以其它方式进行。

在分离之前，已经证实使发酵肉汤中的微生物失活(杀菌发酵肉汤)是 有用的，例如通过通常的巴氏杀菌方法如通过引入热量和/或热蒸汽。为此， 可使用传统的热交换器，例如壳管式热交换器或板式热交换器。

在分离出大多数微生物和如果合适的话，其它固体后获得的肉汤通常 具有的碱性氨基酸的含量为4～30％重量，经常是8～20％重量，尤其是 10～15％重量。其pH经常为5～7.5，尤其是6～7。因此，可省略调整含水 肉汤的pH，如现有技术中的酸化。然而，原则上，可以在上述具体范围内 设置pH，例如通过添加少量的酸，优选pKa＜4.5的酸，如甲酸、乙酸或 硫酸。因此在该实施方案中，肉汤优选pH为4.0～6，尤其是4.5～5.5。

然后在步骤b)中，由所得的含水肉汤，使用阳离子交换设备将碱性氨 基酸分离出。根据本发明，步骤b)中的分离包括至少一个预处理步骤，随 后的其中碱性氨基酸被吸附到强酸性离子交换剂上的加载步骤，和至少一 个碱性氨基酸由离子交换剂上解吸的洗脱步骤。这些步骤可以述及的顺序 重复几次，且在这些步骤之间，可进行用水的洗涤步骤。

本发明方法使用的阳离子交换设备包括一个或优选多个，如2、3或4 个、至多50个串接(依次连接)的级，后者通常呈包含一种或多种强酸性阳 离子交换剂作为固定相的离子交换柱的形式。

作为强酸性阳离子交换剂，原则上可考虑具有强酸性基团，通常是磺 酸基团(Sulfonatgruppen)的所有离子交换材料，例如有机离子交换树脂或 无机离子交换剂。常常这些交换剂是经常基于聚苯乙烯的粒状的、中度或 重度交联的有机聚合物，在该聚合物颗粒的表面上具有多个强酸性基团。 酸基团的平均数通常是1～4meq/ml的离子交换树脂。离子交换颗粒的平均 颗粒尺寸通常是0.1～1mm，取决于离子交换设备的尺寸设计，更大和更小 的颗粒尺寸也能够是合适的。聚合物颗粒可以是例如凝胶状或具有大孔的 结构体。

所述的离子交换剂是已知的且一些可商购用于纯化氨基酸，例如购自 Bayer Aktiengesellschaft的商品名为LewatitK或LewatitS的产品， 如LewatitK 2629、LewatitS110、LewatitS110H、LewatitS1467、 LewatitS1468、LewatitS2568，LewatitS2568H；购自Rohm&Haas 的Amberjet、Amberlyst或Amberlite，如Amberjet1200、Amberjet 1500、Amberlite200、Amberlite250、AmberliteIRV120、Amberlite IR 120、AmberliteIR 200C、AmberliteCG 6000、Amberlyst119 Wet；购自Dow Chemicals的Dowex，如Dowex50X1-100、Dowex 50X2-100、Dowex50X2-200、Dowex50X2-400、Dowex50X4-100、 Dowex50X4-200、Dowex50X4-400、Dowex50X8-100、Dowex 50X8-200、Dowex50X8-400、Dowex40X1-100、Dowex40X1-100、 Dowex40X1-100、DowexHCR-S、DowexHCR-W2、DowexMSC-1、 Dowex650C、DowexG26、Dowex88、DowexMonosphere 88、 DowexMonosphere 99K/320、DowexMonosphere 99K/350、Dowex Monosphere 99Ca/320、DowexMarathon C、Dowex  032、Dowex 406、Dowex437、DowexC500ES、DowexXUS 43518、DowexXUS 40406.00；购自Mitsubishi Corp.的Diaion，如DiaionSK1B、Diaion SK1BS、DiaionSK104、DiaionSK112、DiaionSK116、Diaion 1-3561、Diaion1-3565、Diaion1-3570、Diaion1-3573、Diaion1-3577、 Diaion1-3581、DuoliteD 5427、DuoliteD 5552(有机基阳离子交换剂)， 以及另外还有AdsorbosphereSCX、BakerbondSCX、PartisilSCX、 SpherisorbSCX、SupelcosilLC3-SCX、UltralsilSCX和Zorbax300 SCX(二氧化硅基阳离子交换剂)。

阳离子交换设备可分批操作，于是具有一个或多个如2、3或4个串接 (依次连接)的固定的离子交换固定床。它也可连续操作，于是通常具有 5～50、尤其是15～40个离子交换床，其可以是例如“真实移动床”设备(参 见K.Tekeuchi J.Chem.Eng.Japan 11(1978，216-220)、“连续循环环”设 备(参见J.P.Martin，Discuss.Farraday Soc.1949，7)或者描述在例如US 2,985,589、WO 01/72689和G.J.Rossiter等人Proceedings of AIChE Conference，Los Angeles，CA，1991年11月，或者H.J.Van Walsem等人J. Biochtechnol.59(1997)，127-123中的“模拟移动床”设备中的组件。

在本发明的用酸水溶液预处理阳离子交换剂之前，阳离子交换剂呈其 盐形式，即阳离子交换剂的强酸性基团呈脱质子化形式并与相应数量的阳 离子配合给出电荷中性。通常阳离子是碱金属阳离子，尤其是钠离子，或 者特别优选铵离子(NH4+)。

作为本发明的用弱酸水溶液预处理的结果，一部分这些阳离子被洗脱 且等量的酸性基团被重新质子化，使得在阳离子交换剂上，不仅存在酸性 基团，而且存在碱性基团。假设为：结果是阳离子交换剂对碱性氨基酸的 结合能力增加，并因此离子交换设备的能力增加。洗脱/重新质子化过程可 经由在预处理过程中从阳离子交换剂中流出的含水液体的pH监控。根据 本发明，当流出液体的pH(在25℃下测定)为4.5～7、尤其是5～6.6时，所 需程度的预处理得以实现。

对于预处理，原则上可使用所有已知的酸的稀水溶液。当然，优选这 些酸的选择应使得它们不干涉由洗出液制备碱性氨基酸。如果所述酸是除 了待分离的碱性氨基酸以外的酸，优选那些不会被阳离子交换剂吸附或者 仅仅被非常轻微程度吸附的酸。合适的那些酸是无机酸，如硫酸、盐酸、 硝酸和磷酸，优选具有1-4个碳原子的有机羧酸，如甲酸、乙酸、丙酸， 通常具有2-4个羧基和如果合适的话羟基的多元羧酸，如马来酸、富马酸、 琥珀酸、己二酸、柠檬酸等，羟基羧酸，如乳酸及乙醇酸，和磺酸，以及 还有呈质子形式的待分离氨基酸，如上述碱性氨基酸的单和二价阳离子。 优选的酸首先是pKa＜4的酸，尤其是甲酸和硫酸，其次是呈单价阳离子形 式的待分离碱性氨基酸。

酸在水溶液中的浓度通常为1～85g/L，尤其为2～40g/L。当该酸不同 于碱性氨基酸时，实现所需效果所需的酸量通常为0.01～0.2mol/L的阳离 子交换剂，尤其是0.02～0.1mol/L的阳离子交换剂。如果用于预处理的酸 是碱性氨基酸，如待分离的碱性氨基酸，酸的用量优选为0.3～1.2mol/L， 尤其是0.5～0.8mol/L的阳离子交换剂。酸水溶液的用量通常为阳离子交换 设备的总床体积的0.7～10倍。

比流速SV，即酸溶液通过阳离子交换设备的平均流速V(体积速度)与 在阳离子交换设备中的阳离子交换剂的总体积(床体积BV)的比例是次要 的且通常是0.1～5h-1。进行处理的温度通常为10～80℃，优选为20～70℃， 特别为30～60℃。该处理不仅可以上升的方式进行，即酸水溶液由阳离子 交换设备的柱子的底部通过顶部，而且可以下降的方式进行，即酸水溶液 由阳离子交换设备的柱子的顶部通过底部。

然后，如此预处理的阳离子交换剂通过将除去了生物质的含水肉汤通 过阳离子交换设备而加载碱性氨基酸。该加载不仅可以下降的方式而且可 以上升的方式进行，优选前者。该加载优选以0.1h-1～2h-1的比流速进行。 该加载优选以20～70℃、尤其是30～60℃的温度进行。通常选择含水肉汤 的用量以使得存在于含水肉汤中的碱性氨基酸至少60％、尤其至少65％被 吸附。含水肉汤的量通常是床体积量的0.5～2倍。取决于吸附程度，在阳 离子交换设备的出口产生的流出液可仍然包含碱性氨基酸，以使得如果合 适的话，在调整pH后，流出液可根据实施方案A或B用于预处理。然而， pH的调整通常不是必须的。

加载过程后可为洗涤步骤。为此，将水例如生产用水通过阳离子交换 设备。在该级，洗涤水量通常是床体积的0.05～0.3倍。所得的洗涤水通常 包含杂质，因而将其丢弃。它们还可能包含少量的碱性氨基酸且然后可与 加载产生的流出液混合。

在加载步骤或者如果合适的话进行的洗涤步骤后为碱性氨基酸的洗 脱。为此将碱水溶液(洗脱剂)通过阳离子交换设备。结果碱性氨基酸被解 吸和洗脱，阳离子交换剂再生，即阳离子交换剂的酸性基团被转化回盐形 式。洗脱剂中的碱浓度通常是1～10％重量，尤其是2～8％重量。合适的碱 是例如氨、碱金属氢氧化物和碱金属碳酸盐，优选氢氧化钠溶液，尤其优 选氨。碱水溶液的量通常是床体积量的0.5～5倍。关于温度和流速，适用 对加载所述。洗脱不仅可以上升方式进行，而且可以下降方式进行。洗脱 可以与加载同样的方向进行或者以与之相反的方向进行。

如果合适的话，洗脱后可进行其它的洗涤步骤以除去存在的杂质。为 此，将水通过阳离子交换设备。该级的洗涤水量通常是床体积的0.2～1.3 倍。洗涤步骤中产生的流出液作为低盐加载的废水进料给通常的废水处理 或者其它的后处理。

洗脱产生的洗出液以通常方式后处理以制备氨基酸。为此，通常将洗 出液如以传统的蒸发器设备除去水而浓缩。

以上述方式，获得浓缩的碱性氨基酸水溶液，由该溶液，将碱性氨基 酸以盐酸盐形式通过沉淀或结晶分离，例如在加入盐酸后通过沉淀或结晶 分离。实现此目的的方法对于本领域技术人员而言是已知的，且大量地描 述在文献中(如Hermann，T.氨基酸由棒杆菌的工业生产，J.of Biotechnology，104(2003)，155-172)。

浓缩中产生的含水浓缩液可丢弃或者再循环到该方法中。例如，可将 浓缩液再循环至在随后的氨基酸分离中的碱性氨基酸的洗脱步骤中。为此 优选的是，用碱水溶液洗脱后，将浓缩液通过阳离子交换设备。所得的流 出液经常仍然包含少量的碱性氨基酸并通常再循环至随后的氨基酸分离的 洗脱中。

本发明将参照下面两个优选的实施方案进行更详细的描述。

在本发明的第一个优选实施方案(实施方案A)中，对于阳离子交换剂 的预处理，使用pH为4.5～7.5的待分离碱性氨基酸的水溶液。优选的是， 该水溶液具有的碱性氨基酸的浓度为1～85g/L，特别是2～40g/L。实现所 需效果需要的碱性氨基酸量通常是0.3～1.2mol/L、尤其是0.5～0.8mol/L的 阳离子交换剂。酸水溶液的量优选为阳离子交换设备的总床体积的0.7～10 倍。

有利的是，作为碱性氨基酸的水溶液，使用来自在前的氨基酸分离的 阳离子交换设备的加载料的流出液的至少一部分，该流出液包含未吸收的 碱性氨基酸。在多级阳离子交换设备的情形下，所述溶液优选包含至少一 部分如至少50％或全部量的第一级的流出液。

当然，当根据实施方案A的方法第一次进行时，所述的流出液尚不存 在。因此，阳离子交换设备必须提前启动。为此，将分离出生物质后获得 的含水肉汤通过阳离子交换剂加载了碱性氨基酸的阳离子交换设备。所得 的流出液通常仍不包含吸附的碱性氨基酸，并且具有在上述限定范围内的 pH。所得的流出液然后可用于预处理阳离子交换设备。

图1a和1b显示启动方法的优选实施方案的各流出液。首先，将分离 出生物质后获得的肉汤FB通过阳离子交换设备(示意显示)。流出液的第 一部分称为LDWW(低密度废水)，并对应于离子交换剂的“自由体积”；将 流出液的第二部分作为流出液1(1)收集。然后，将阳离子交换设备再次加 载流出液1(1)。将该流出液的第一部分作为LDWW取出，第二部分作为 流出液1(2)取出。  随后，用肉汤FB加载，将其流出液作为流出液2(2)取 出。在下一步中，将阳离子交换设备按流出液1(2)、流出液2(2)、肉汤FB 加载。在用流出液1(2)加载时，在出口处除了LDWW外，也产生HDWW。 之后，用氨水(如6％NH3)洗脱。将所得的包含碱性氨基酸的洗出液1在 蒸发器设备(未示出)中分离成冷凝液和氨基酸浓缩液。再次用氨水(如 6％NH3)加载(再次在出口处产生洗出液1(2))，然后用蒸发步骤的冷凝液加 载。所得的流出液称作洗出液2(2)，并用于制备氨水，该氨水在下一步中 通入离子交换剂。将所得的洗出液1(2)再次在蒸发器设备中分离成冷凝液 和氨基酸浓缩液，并将所得的冷凝液再次通入离子交换剂(流出液：洗出液 2(3))。然后，为了纯化阳离子交换设备，将它用水洗涤，并将流出液作为 LDWW处理掉或供入后处理。

图2显示实施方案A的优选设计的各流出液。首先，将启动方法的流 出液1(或实施方案A的在前工序的流出液1(n-1))通过阳离子交换设备，所 得的流出液作为LDWW和然后HDWW处理掉或供入后处理。然后，将 启动方法的流出液2(或实施方案A的在前工序的流出液2(n-1))通过阳离子 交换设备。收集流出液作为流出液1(n)，并在下一级中对应于流出液1(n+1) 的氨基酸分离点供入。之后，将由发酵肉汤分离出生物质后获得的含水肉 汤FB通过阳离子交换设备。收集流出液作为流出液2(n)，并在下一级中 对应于流出液2(n+1)的氨基酸分离点供入。之后，使用来自启动方法或者 来自在前级产生的洗出液2(n-1)进行洗脱，该洗出液已经补充了6％氨水。 由此产生洗出液1(n)，将该洗出液1(n)在蒸发器设备(未示出)中分离成冷 凝液和氨基酸浓缩液。将该冷凝液进料给下一级。作为另一个洗脱步骤， 将启动方法或前一级的洗出液1(n-1)的冷凝液施加于离子交换剂，并收集 流出液作为洗出液2(n)，并补充6％强度的氨水用于下一级。然后，为了 纯化阳离子交换设备，用水洗涤，并将流出液作为LDWW处理掉或供入 后处理。

在本发明另一个优选实施方案B中，为了预处理阳离子交换剂，使用 pKa不超过4的酸的稀水溶液。优选的酸示甲酸、磷酸、盐酸，尤其是硫 酸，还有这些酸的混合物。

优选的是，稀酸水溶液的酸浓度为1～20g/L。实现所需效果需要的酸 量通常为每升阳离子交换剂0.01～0.1mol。酸水溶液的量优选为阳离子交 换设备的总床体积的0.7～2倍。

在实施方案B的优选设计中，在用稀酸水溶液处理后，用碱性氨基酸 的稀水溶液进行处理，在该溶液中至少90％的碱性氨基酸以单质子化形式 存在。该溶液通常pH为4.5～7。优选的是，水溶液的碱性氨基酸浓度为 8～70g/L，尤其是8～50g/L。碱性氨基酸水溶液的量优选为阳离子交换设 备的总床体积的0.1～1倍。

在实施方案B的进一步优选设计中，首先仅用一部分具有的pKa≤4 的酸的稀水溶液进行处理，然后使用其中至少90％的碱性氨基酸以单质子 化形式存在的碱性氨基酸的稀水溶液进行处理。关于浓度和pH，适用上文 所述。碱性氨基酸的水溶液的量优选为阳离子交换设备的总床体积的0.1～1 倍。这里同样有利的是，使用来自在前的氨基酸分离的阳离子交换设备的 加载料的流出液的至少一部分，该流出液包含未吸收的碱性氨基酸。在用 碱性氨基酸的水溶液处理之后，然后通常用剩余量的pKa≤4的酸的稀水溶 液处理。

在实施方案B的阳离子交换设备的处理中产生的流出液通常供入废水 处理。关于废水以及洗出液和冷凝液的回收，同样适用上面对于实施方案 A所述。

本发明方法原则上可用于所有碱性氨基酸的分离，尤其是天然氨基酸 如赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸或精氨酸，尤其用于分离发酵产生的L-赖氨酸。

发酵方法的类型还有用于产生氨基酸的微生物菌株的类型对本发明方 法不重要，因而本发明方法适于由任何所需发酵肉汤中分离碱性氨基酸。

通常而言，它是这样一种方法，其中将产生所需碱性氨基酸的微生物 菌株在发酵培养基中进行培养，所述发酵培养基包含作为基质(substrate) 的至少一种碳源如糖蜜和/或原糖，和氮源如氨或氨盐如硫酸铵，还有如果 合适的话矿物和微量元素。这些基质组分可以本身使用或以复合混合物形 式如玉米浆使用。

微生物菌株的类型显然取决于待制备的氨基酸类型。通常这些是超量 产生所需碱性氨基酸的菌株。在L-赖氨酸和组氨酸的情形下，这些微生物 菌株通常是棒杆菌(Corynebacterium)或短杆菌(Brevibacterium)属的菌株， 如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或Brevibacterium lactofermentum，在精氨酸的情形下，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或 Brevibacteriumflavum的菌株，然而最近可使用其它种的菌株。

通常而言，发酵进行至碱性氨基酸在发酵肉汤中的含量为50～200g/L， 尤其是80～150g/L。生物质，即微生物(作为生物干物质(Biotrockenmasse)) 和生物来源的其它不溶组分(如葡萄糖源的纤维素纤维)的含量通常是 3～7％重量。此外，发酵肉汤通常进一步包含剩余量的基质，如未消耗的糖， 还有发酵的副产物，如酸性或中性氨基酸，或其它碱性氨基酸、肽等。

发酵方法可连续进行，或者作为分批或者进料分批(Fed-Batch)方法而 分批进行。通常该方法涉及由进料-分批方法制备的发酵肉汤，所述方法即 为，大多数基质在发酵过程中供入到含微生物的肉汤中。

所述方法和合适的微生物菌株是本领域技术人员已知的，如由本文开 头所引用的现有技术(尤其参见Pfefferle等人和Th.Herrmann，见上)，还 有WO 95/16042、WO 96/06180、WO 96/16042、WO 96/41042、WO 01/09306、EP-A 175309、EP-A 327945、EP-A 551614、EP-A 837134、US 4346170、US 5305576、US 6025165、US 6653454、DE 253199、GB 851396、 GB 849370和GB 1118719(L-赖氨酸的制备)、EP-A 393708、GB 1098348、 US 3668072、US 3574061、US 3532600、US 2988489、JP 2283290、JP 57016696(L-鸟氨酸)、US 3902967、US 4086137、GB 2084566(精氨酸)、 US 3875001和US 3902966(组氨酸)获知。

进行和控制所述发酵的措施技术上对本领域技术人员是熟悉的并可在 相关文献中找到，例如Storhas(参见如上)和J.E.Bailey等人，Biochemical Engineering Fundamentals，第2版，MacGraw-Hill 1986，笫9章。

本发明将通过下述表明本发明方法的优选实施方案且不应理解为限制 的下述附图、实施例和比较例进行描述。

图1a和1b：示出了实施方案A(图1a：加载；图1b：吸附)的启动方 法中的各方法步骤。

图2：示例性示出实施方案A的各方法步骤。

所用缩写：

FB：发酵肉汤

HDWW：高密度废水

LDWW：低密度废水

ID：内径

H：高度

Lys-HCl：L-赖氨酸单盐酸盐

BV：床体积(设备中阳离子交换剂的体积)

SV：比流速(以1[m3进料/(m3树脂h)]表示的流动速率，下文中其单位缩 写为[h-1])

所用材料：

所有试验使用以本身已知的方式通过谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)发 酵制备的含L-赖氨酸的发酵肉汤进行。发酵肉汤中Lys-HCl的含量为 110～130g/L和生物质的含量(以生物干物质计算)为2.5～3.5％重量。盐含 量为3～5％重量。

阳离子交换设备

在比较例1和实施例1、2和6中，阳离子交换设备使用加载有400mL 的强酸性阳离子交换树脂的尺寸为25mm(ID)×1200mm(H)的圆柱。作为 阳离子交换剂，使用平均颗粒尺寸为约0.6mm的且总容量＞2meq/mL的 凝胶型磺化交联聚苯乙烯(购自Bayer Aktiengesellschaft的LewatitS 1468)。阳离子交换设备在使用前用6重量％强度的氨水平衡。

在实施例3和4中，阳离子交换设备使用具有30个尺寸为33mm(ID) ×1000mm(H)的圆柱的“模拟移动床”型(“L 100 C”型，购自AST，USA)， 在该情形下，腔室装填有总计18 L的强酸性阳离子交换剂(购自Bayer Aktiengesellschafi的LewatitS1468)。

在实施例5中，作为阳离子交换设备，使用已经加载有600mL的强酸 性阳离子交换树脂(LewatitS 1468)的尺寸为35mm(ID)×900mm(H)的圆 柱。

实施例7中使用的阳离子交换设备包括9个串接的尺寸为 35mm(ID)×900mm(H)的串接圆柱，其中每一个柱子都装填有845mL的 强酸性阳离子交换树脂(“Diaion SK1B”，购自Mitsubishi，日本)。

所有的阳离子交换设备在使用前都用6重量％强度的氨水进行平衡。

比较例1

将赖氨酸含量为12.5％重量和生物质含量为3％重量(作为生物干物质) 的发酵肉汤每g Lys-HCl使用0.7g的浓硫酸酸化至pH为1.5。然后将经 酸化的发酵肉汤于45℃温度下通过阳离子交换设备。收集所得的流出液 并作为HDWW处理掉。然后将阳离子交换设备用水洗涤。将所得的流出 液LDWW处理掉。随后，用6重量％强度的氨水以0.305g氨/g的Lys-HCl 的量洗脱L-赖氨酸。

实施例1

将发酵肉汤在45～70℃的温度下加热并蒸汽杀菌。然后通过离心和滗 析的组合除去细胞物质。含水残余物的赖氨酸浓度为12.5％重量。上层清 液的pH为6.5。

然后，将总计2040mL的由5种不同的来自在前赖氨酸分离的预备级 的流出液组成的赖氨酸水溶液在50℃的温度下向上通过阳离子交换设备， 所述赖氨酸水溶液的赖氨酸含量为0.36～8.45％w/v且pH为4.5～7.5。在 预处理结束时流出液的pH为5.8。然后，将416mL的离心上层清液在55℃ 的温度下向上通过经如此预处理的阳离子交换设备。将所得的流出液在下 述实施例之一中用于预处理。随后，用600mL的6重量％强度的氨水溶 液向下洗脱赖氨酸。所得的赖氨酸水溶液可以常规的方式结晶。

实施例2

以与实施例1相似的方式进行实施例2的工序，但与实施例1相比， 对于预处理，将1248mL的由3种不同的来自在前赖氨酸分离的预备级的 流出液组成的赖氨酸水溶液由阳离子交换设备的顶部通过底部，所述赖氨 酸水溶液的赖氨酸浓度为0.28-3.3％w/v且pH为6.3～6.7，并且随后用离 心分离的上层清液同样以下降方式进行加载。在预处理结束时流出液的pH 为6.5。

实施例3

将发酵肉汤在45～70℃的温度下加热并杀菌。然后通过离心分离出细 胞物质。所得上层清液的赖氨酸浓度为12.5％重量且pH为6.5。

对于预处理，将5.5L赖氨酸浓度为0.36～8.45％w/v重量且pH为 4.5～7.5的赖氨酸水溶液在55℃的温度下以5.5L/h的流速向上通过阳离子 交换设备。在预处理结束时流出液的pH为5.8。随后，将9L在离心中获 得的上层清液在55℃的温度下以5.5L/h的流速向上通过阳离子交换设 备。随后，在55℃的温度下以5.5L/h的流速用总计10.8L的6重量％强 度的氨水溶液向下进行洗脱。

实施例4

以与实施例3相似的方式进行实施例4，但对于预处理，将仅仅33.7L 的由3种不同的来自在前赖氨酸分离的预备级的流出液组成的赖氨酸水溶 液向下通过阳离子交换设备，所述赖氨酸水溶液的赖氨酸浓度为0.28-3.3％ w/v且pH为6.3～6.7。在预处理结束时流出液的pH为6.5。使用总计10.8 L的离心上层清液向下进行加载。

实施例5

将发酵肉汤在45～70℃下通过加热和引入蒸汽杀菌，然后将其转移到 离心分离器中。以此方式，获得赖氨酸含量为118.3g/L、pH为6.7的含赖 氨酸的含水上层清液，该上层清液仍然包含0.5体积％的细胞物质。

在40～50℃的温度下以比流速SV＝1h-1，将下列物质接连地通过阳离 子交换设备：240mL的0.44重量％强度的硫酸溶液、500mL的2.344重 量％强度的pH为5的赖氨酸水溶液，和然后180mL的0.44重量％强度 的硫酸溶液。流出液的pH为5.2。之后，以SV＝1h-1的流速并同时保持 温度，将480mL的含赖氨酸的含水上层清液和然后120mL的水通过离子 交换剂。分离出流出液并准备用于下一步的预处理。然后，以SV＝1h-1于 55℃下，将650mL的4重量％强度的氨水溶液和然后720mL的水通过 阳离子交换设备。

实施例6

将发酵肉汤在45～70℃下通过加热和引入蒸汽杀菌，然后将其转移到 离心分离器中。以此方式，获得赖氨酸含量为121g/L、pH为6.7的含赖 氨酸的含水上层清液，该上层清液仍然包含0.5体积％的细胞物质。

在40～50℃的温度下以比流速SV＝1h-1，将下列物质接连地通过阳离 子交换设备：240mL的0.44重量％强度的硫酸溶液、500mL的2.344重 量％强度的pH为5的赖氨酸水溶液，和然后180mL的0.44重量％强度 的硫酸溶液。流出液的pH为5.2。之后，以SV＝1h-1的流速并同时保持 温度，将480mL的含赖氨酸的含水上层清液和然后120mL的水通过离子 交换剂。分离出流出液并准备用于下一步的预处理。然后，以SV＝1h-1于 55℃下，将650mL的4重量％强度的氨水溶液和然后720mL的水通过 阳离子交换设备。

实施例7

将发酵肉汤在45～70℃下通过加热和引入蒸汽杀菌，然后将其转移到 离心分离器中。以此方式，获得赖氨酸含量为129.1g/L、pH为6.7的含赖 氨酸的含水上层清液，该上层清液仍然包含0.5体积％的细胞物质。

在40～50℃的温度下以比流速SV＝1h-1，将下列物质接连地通过阳离 子交换设备：2300mL的0.66重量％强度的硫酸溶液、4800mL的0.882％ 重量％强度的pH为5的赖氨酸水溶液，和然后1200mL的0.66重量％强 度的硫酸溶液。流出液的pH为5.2。之后，以SV＝1h-1的流速并同时保 持温度，将6200mL的含赖氨酸的含水上层清液和然后1100mL的水通过。 分离出流出液并准备用于下一步的预处理。然后，以SV＝1h-1于55℃下， 将6000mL的4重量％强度的氨水溶液和然后9100mL的水通过阳离子 交换设备。

结果汇总在表1a和1b中，本文中赖氨酸产率(％)计算如下：

其中mLys-HCl(洗出液)：洗出液中Lys-HCl量[g]

mLys-HCl(吸附)：吸附到离子交换剂上的Lys-HCl量[g]

表1a：

  实施   例   用于预处理   的流出液   [L/每升   树脂]   赖氨酸   进料1)   [g Lys-HCl/   每升树脂]     硫酸2)     [g/g     Lys-HCl]     氨     [g/g     Lys-HCl]     HDWW     [g/g Lys-     HCl洗出液]   赖氨酸   产率   [％]   C1   --   210     0.7     0.305     20.5   97.5   1   5   270     -     0.33     11.8   97.5   2   3   150     -     0.6     12.7   97.8   3   3.1   270     -     0.13     11.8   97.5   4   1.9   150     -     0.24     12.7   97.8

1)每升阳离子交换树脂的Lys-HCl的重量份

2)用于酸化发酵肉汤的硫酸

表1b：

  实施   例   用于预处理   的流出液   [L/每升树   脂]   赖氨酸   进料   [g Lys-HCl/   每升树脂]   硫酸   [g/g   Lys-HCl]   氨   [g/g   Lys-HCl]     HDWW     [ml/(g-Lys-H     Cl洗出液)]   赖氨酸   产率   [％]   5   0.83   105.8   0.029   0.4     13.2   96.8   6   0.88   107.6   0.029   0.39     12.2   97.3   7   0.63   110.9   0.027   0.28     10.8   97.5