alr缺陷植物乳杆菌NC8
阅读：559发布：2020-05-29
专利汇可以提供alr缺陷植物乳杆菌NC8专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种alr 缺陷 植物 乳杆菌NC8及alr标记表达载体pCJ2，alr缺陷植物乳杆菌NC8是将alr缺失自杀性质粒pNZ5319?Δalr 转染 植物乳杆菌NC8后，获得了缺失alr基因的植物乳杆菌NC8，同时构建了alr标记表达载体pCJ2，是食品级乳酸菌表达系统，安全可靠。，下面是alr缺陷植物乳杆菌NC8专利的具体信息内容。
1.一种融合基因片段Δalr，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种融合基因片段Δalr，其特征在于：所述的基因为人工合成。
3.一种融合基因片段Δalr的制备方法，它包括：
1）提取植物乳杆菌NC8株基因组；
2）以其为模板，用引物：
Alr基因5’同源重组手臂引物
Alr-5F: ataCTCGAGagtggcaccgaacttagcacaatc
Alr-5R: ataAAGCTTcccaattacaaccatcacaaattgcctc
Alr基因3’同源重组手臂引物
Alr-3F: ataAAGCTTgtttatatagattaagttttatcagacgatag
Alr-3R: ataGGATCCacaataatgttagctcatcactaaatg
扩增Alr基因5’ 和Alr基因3’；
3）Alr基因5’ 与Alr基因3’连接。
4.alr缺失自杀性质粒pNZ5319-Δalr，它是在pNZ5319上插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。
5.alr缺陷植物乳杆菌NC8，它转染了权利要求1所述的alr缺失自杀性质粒pNZ5319-Δalr后，缺失了alr基因的植物乳杆菌NC8。
6.alr标记表达载体pCJ2，它是用BamHⅠ和 ClaⅠ分别双酶切基因片段EmS-alr-EmX和pCJ1载体，连接；所述的基因片段EmS-alr-EmX其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
alr缺陷植物乳杆菌NC8
技术领域
背景技术
[0002] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种常见的乳酸菌并在工业乳酸发酵以及医疗保健等领域有着较为广泛的应用。研究表明，植物乳杆菌通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用（de Vries,et al,2006），利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白表达系统，以其作为口服药用蛋白载体很大程度上解决了蛋白易在消化道中发生水解的问题，从而使多种口服药用蛋白都能有效地发挥防治疾病的作用。
[0003] pCJ1可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达, 但该质粒载体使用了红霉素抗性基因(erm)作为筛选标记，一旦抗性基因转移到宿主染色体内，很可能产生严重的生物安全隐患，因此该系统潜在的应用价值受到了限制。另外，Nguyen(Nguyen, et al, 2011)等认为红霉素在酸性条件下会发生降解，这对外源基因的诱导表达造成了不利的影响。红霉素也会使菌体产生“生理应激”，从而影响目的基因表达。因此将红霉素抗性基因替换为其他标记型基因，如营养缺陷型突变菌，突变株在基本培养基上不能生长，只有补充相应的外源营养物质或转入含有特定筛选标记基因的质粒，菌株才能生存。一般情况下，基本培养基即可满足互补型菌株表达系统的培养要求，因此该类型表达系统为工业化生产具有食品应用潜力的重组蛋白创造了条件。
[0004] 丙氨酸消旋酶（Alanine Racemase）基因广泛存在于原核生物基因组中，该基因可将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，D-丙氨酸是细胞壁中重要的交联成分，是菌株生长的必需物质，因此该酶对原核细胞的生长至关重要(Hols, et al, 1997)。
发明内容
[0006] 本发明的目的是为了保证外源蛋白表达系统的生物安全性，而提供一种alr缺陷植物乳杆菌NC8及 alr标记表达载体pCJ2。
[0007]一种融合基因片段Δalr，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
所述的基因为人工合成；
一种融合基因片段Δalr的制备方法，它包括：
1）提取植物乳杆菌NC8株基因组；
2）以其为模板，用引物：
Alr基因5’同源重组手臂引物
Alr-5F: ataCTCGAGagtggcaccgaacttagcacaatc
Alr-5R: ataAAGCTTcccaattacaaccatcacaaattgcctc
Alr基因3’同源重组手臂引物
Alr-3F: ataAAGCTTgtttatatagattaagttttatcagacgatag
Alr-3R: ataGGATCCacaataatgttagctcatcactaaatg
扩增Alr基因5’ 和Alr基因3’；
3）Alr基因5’ 与Alr基因3’连接。
所述的基因为人工合成；
一种融合基因片段Δalr的制备方法，它包括：
1）提取植物乳杆菌NC8株基因组；
2）以其为模板，用引物：
Alr基因5’同源重组手臂引物
Alr-5F: ataCTCGAGagtggcaccgaacttagcacaatc
Alr-5R: ataAAGCTTcccaattacaaccatcacaaattgcctc
Alr基因3’同源重组手臂引物
Alr-3F: ataAAGCTTgtttatatagattaagttttatcagacgatag
Alr-3R: ataGGATCCacaataatgttagctcatcactaaatg
扩增Alr基因5’ 和Alr基因3’；
3）Alr基因5’ 与Alr基因3’连接。
[0008] alr缺失自杀性质粒pNZ5319-Δalr，它是在pNZ5319上插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。
[0009] alr缺陷植物乳杆菌NC8，它转染了alr缺失自杀性质粒pNZ5319-Δalr后，缺失了alr基因的植物乳杆菌NC8。
[0010] alr标记表达载体pCJ2，用BamHⅠ和 ClaⅠ分别双酶切基因片段EmS-alr-EmX和pCJ1载体，连接；所述的基因片段EmS-alr-EmX其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0011] 本发明提供了一种alr缺陷植物乳杆菌NC8及 alr标记表达载体pCJ2，alr缺陷植物乳杆菌NC8是将alr缺失自杀性质粒pNZ5319-Δalr转染植物乳杆菌NC8后，获得了缺失alr基因的植物乳杆菌NC8，同时构建了alr标记表达载体pCJ2，是食品级乳酸菌表达系统，安全可靠。附图说明
[0012] 图1 Alr基因5’同源重组手臂PCR结果电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：5’同源重组臂，长度1088bp）；图2 Alr基因3’同源重组手臂PCR结果电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：3’同源重组臂，长度973bp）；
图3 pET41a/Alr53 PCR结果电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：
5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pET41a/Alr53的扩增结果）；
图4 pNZ5319质粒和pET41a/Alr53质粒电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pET41a/Alr53；2：pNZ5319）；
图5 pNZ5319/XhoI/BglII和pET41a/Alr53/XhoI/BamHI酶切电泳结果图（M: DNA分子
量标准。从上到下分子量依次为： 5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中
750bp加亮；1：pET41a/Alr53/XhoI/BamHI；2：pNZ5319/XhoI/BglII）；
图6 pNZ5319-ΔAlr电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、
3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pNZ5319-ΔAlr）；
图7 pNZ5319-ΔAlr扩增电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：
5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：2μl pNZ5319-Alr的电泳结果）；
图8 NC8/Δalr基因组DNA的alr基因外侧引物扩增电泳图（Marker从上到下为：10000、
8000、6000、5000、4000、3000（加亮）、2500、2000、1500、1000（加亮）、750 bp、500（加亮）、250 bp；1：NC8基因组DNA的alr基因外侧引物扩增条带；2：NC8/Δalr基因组DNA的alr基因外侧引物扩增条带）；
图9 alr和pCJ1上游臂端的PCR扩增电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次
为：2000、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1-3：Alr基因PCR产物回收；4：pCJ1载体红霉素基因上游PCR产物回收）；
图10 pCJ1下游臂端的PCR扩增电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：
2000、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pCJ1载体红霉素基因下游PCR产物回收）；
图11 EmS-alr-EmX电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320
bp、9416 bp、6557 bp、4361 bp、2322 bp、2027 bp、564bp、125bp；1-3 :SOE-PCR回收纯化）；
图12 pCJ2电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 bp、9416 bp、6557 bp、4361 bp、2322 bp、2027 bp、564bp、125bp。M1：2000、1000、750、500、250、
100bp，其中750bp加亮。1-3 ：质粒 pCJ2用BamHⅠ和 ClaⅠ双酶切鉴定）；
图13 pCJ2 PCR和酶切电泳图（M: λ- Hind Ⅲ digest DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 bp、9416 bp、6557 bp、4361 bp、2322 bp、2027 bp、564bp、125bp；M1：
DL2000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250、100bp，其中
750bp加亮；1：质粒pCJ2 PCR鉴定；-：PCR阴性对照；2： pCJ2用BamHⅠ和 ClaⅠ双酶切鉴定）。
图3 pET41a/Alr53 PCR结果电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：
5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pET41a/Alr53的扩增结果）；
图4 pNZ5319质粒和pET41a/Alr53质粒电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pET41a/Alr53；2：pNZ5319）；
图5 pNZ5319/XhoI/BglII和pET41a/Alr53/XhoI/BamHI酶切电泳结果图（M: DNA分子
量标准。从上到下分子量依次为： 5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中
750bp加亮；1：pET41a/Alr53/XhoI/BamHI；2：pNZ5319/XhoI/BglII）；
图6 pNZ5319-ΔAlr电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、
3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pNZ5319-ΔAlr）；
图7 pNZ5319-ΔAlr扩增电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：
5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：2μl pNZ5319-Alr的电泳结果）；
图8 NC8/Δalr基因组DNA的alr基因外侧引物扩增电泳图（Marker从上到下为：10000、
8000、6000、5000、4000、3000（加亮）、2500、2000、1500、1000（加亮）、750 bp、500（加亮）、250 bp；1：NC8基因组DNA的alr基因外侧引物扩增条带；2：NC8/Δalr基因组DNA的alr基因外侧引物扩增条带）；
图9 alr和pCJ1上游臂端的PCR扩增电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次
为：2000、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1-3：Alr基因PCR产物回收；4：pCJ1载体红霉素基因上游PCR产物回收）；
图10 pCJ1下游臂端的PCR扩增电泳图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：
2000、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮；1：pCJ1载体红霉素基因下游PCR产物回收）；
图11 EmS-alr-EmX电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320
bp、9416 bp、6557 bp、4361 bp、2322 bp、2027 bp、564bp、125bp；1-3 :SOE-PCR回收纯化）；
图12 pCJ2电泳结果图（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 bp、9416 bp、6557 bp、4361 bp、2322 bp、2027 bp、564bp、125bp。M1：2000、1000、750、500、250、
100bp，其中750bp加亮。1-3 ：质粒 pCJ2用BamHⅠ和 ClaⅠ双酶切鉴定）；
图13 pCJ2 PCR和酶切电泳图（M: λ- Hind Ⅲ digest DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 bp、9416 bp、6557 bp、4361 bp、2322 bp、2027 bp、564bp、125bp；M1：
DL2000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250、100bp，其中
750bp加亮；1：质粒pCJ2 PCR鉴定；-：PCR阴性对照；2： pCJ2用BamHⅠ和 ClaⅠ双酶切鉴定）。
具体实施方式
[0013] 实施例1 丙氨酸消旋酶基因alr缺失自杀性质粒pNZ5319-Δalr的构建1．主要实验材料及分子生物学试剂
（1）菌株及质粒载体
植物乳杆菌NC8株由印度卡马拉杰大学Anbazhagan.K高级研究员惠赠；大肠杆菌JM109
由本实验室保存；质粒pNZ5319、pNZ5348由荷兰乳品研究所（NIZO food research ）Ingrid van Alen博士惠赠；pET41a载体由Novagen公司提供；pCJ1（pSIP409）,由本实验室保存。
（1）菌株及质粒载体
植物乳杆菌NC8株由印度卡马拉杰大学Anbazhagan.K高级研究员惠赠；大肠杆菌JM109
由本实验室保存；质粒pNZ5319、pNZ5348由荷兰乳品研究所（NIZO food research ）Ingrid van Alen博士惠赠；pET41a载体由Novagen公司提供；pCJ1（pSIP409）,由本实验室保存。
[0014] （2）主要材料及试剂革兰氏阳性细菌基因组提取试剂盒，质粒小提试剂盒，胶回收试剂盒， PCR产物回收试剂盒由北京天根生物科技公司提供；高保真PCR聚合酶，限制性内切酶，T4DNA连接酶由宝生物（Takara）公司提供；电转杯由Bio-Rad公司提供；红霉素，氯霉素由Sigma提供；其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。
[0015] （3）培养基乳酸菌专用MRS培养基，大肠杆菌用LB培养基。
[0016] 2．植物乳杆菌NC8基因组DNA提取采用革兰氏阳性细菌基因组提取试剂盒参照说明说方法提取。
[0017] 3．Alr基因两侧同源臂的PCR扩增及自杀性质粒pNZ5319-Δalr的构建（1）引物设计与合成
参考NCBI Lactobacillus plantarum WCFS1序列(GenBank: AL935263.2)，分别设计
alr基因两侧（5’端和3’端）同源臂，
Alr基因5’同源重组手臂引物：
Alr-5F: ataCTCGAGagtggcaccgaacttagcacaatc
Alr-5R: ataAAGCTTcccaattacaaccatcacaaattgcctc
Alr基因3’同源重组手臂引物：
Alr-3F: ataAAGCTTgtttatatagattaagttttatcagacgatag
Alr-3R: ataGGATCCacaataatgttagctcatcactaaatg
（2）Alr基因5’同源重组手臂的扩增、克隆和测序
a. PCR反应体系如下：
b. PCR反应条件如下：
c. PCR结果电泳图如图1。
参考NCBI Lactobacillus plantarum WCFS1序列(GenBank: AL935263.2)，分别设计
alr基因两侧（5’端和3’端）同源臂，
Alr基因5’同源重组手臂引物：
Alr-5F: ataCTCGAGagtggcaccgaacttagcacaatc
Alr-5R: ataAAGCTTcccaattacaaccatcacaaattgcctc
Alr基因3’同源重组手臂引物：
Alr-3F: ataAAGCTTgtttatatagattaagttttatcagacgatag
Alr-3R: ataGGATCCacaataatgttagctcatcactaaatg
（2）Alr基因5’同源重组手臂的扩增、克隆和测序
a. PCR反应体系如下：
b. PCR反应条件如下：
c. PCR结果电泳图如图1。
[0018] （3）Alr-3’同源重组手臂的扩增a. PCR反应体系如下：
b. PCR反应条件如下：
c. PCR结果电泳图见图2。
b. PCR反应条件如下：
c. PCR结果电泳图见图2。
[0019] （4）5’及3’PCR产物与pET41a连接5’PCR产物经柱离心纯化后洗脱于去离子水，用HindIII和XhoI双酶切；3’PCR产物经柱离心纯化后洗脱于去离子水，用HindIII和BamHI双酶切；pET41a质粒用XhoI和BamHI双酶切；双酶切产物经0.8%凝胶电泳分离，紫外灯下割取DNA片段，柱分离纯化，用去离子水洗脱。取50ng pET41a/BamHI/XhoI, 50ng Alr5/ XhoI /HindIII ,50ng Alr3/BamHI/
HindIII片段用T4 DNA连接酶连接过夜（16℃）。次日转化E.coli TOP10化学感受态细胞，铺LB/Kan(50μg/ml)平板，30℃培养至单克隆形成。PCR鉴定阳性克隆pET41a/Alr53。
HindIII片段用T4 DNA连接酶连接过夜（16℃）。次日转化E.coli TOP10化学感受态细胞，铺LB/Kan(50μg/ml)平板，30℃培养至单克隆形成。PCR鉴定阳性克隆pET41a/Alr53。
[0020] a.PCR反应体系如下：(pET-F2: CCGGATATAGTTCCTCCTTTCA；pET-R2: CCGCGAAATTAATACGACTCAC)
b.PCR反应条件如下：
c.电泳图见图3。
b.PCR反应条件如下：
c.电泳图见图3。
[0021] （5）Alr基因5’和3’重组手臂亚克隆入pNZ5319载体1）柱离心方法制备pNZ5319质粒和pET41a/Alr53质粒，质粒洗脱于无菌去离子水，电泳结果见图4。
[0022] 2）亚克隆：酶切、连接和转化。
[0023] a.酶切反应如下：b.电泳结果见图5。
[0024] 在紫外灯下，分别割取pNZ5319/XhoI/BglII泳道中的载体片段和pET41a/Alr53/XhoI/BamHI泳道中的插入片段，DNA经柱分离试剂盒纯化。
[0025] a.连接反应如下：连接产物直接转化E.coli TOP10化学感受态细胞，全部转化液铺LB平板（含红霉素250μg/ml），37℃培养至单克隆形成。用Alr外侧引物做PCR鉴定阳性克隆pNZ5319-ΔAlr。
[0026] b.PCR反应体系如下：c.PCR反应条件如下：
d.电泳结果见图6。
d.电泳结果见图6。
[0027] 4．使用自杀性质粒pNZ5319-Δala敲除ala基因（1）打靶质粒制备
打靶质粒pNZ5319-ΔAlr菌液（10μl）接种100ml LB（含红霉素250μg/ml）经扩增后提取质粒DNA，于37℃,220rpm培养过夜，次日用柱离心法提取质粒，质粒洗脱于500μl无菌去离子水，估计浓度约200ng/μl，电泳图如图7，可直接用于电转化。
打靶质粒pNZ5319-ΔAlr菌液（10μl）接种100ml LB（含红霉素250μg/ml）经扩增后提取质粒DNA，于37℃,220rpm培养过夜，次日用柱离心法提取质粒，质粒洗脱于500μl无菌去离子水，估计浓度约200ng/μl，电泳图如图7，可直接用于电转化。
[0028] （2）打靶质粒的电转化a. 植物乳酸菌电转化感受态细胞的制备：
从MRS平板上挑单克隆接种50ml MRS培养基，密封，置30℃培养过夜。次日，于4℃、
3000rpm离心10分钟沉淀细胞；用等体积冰冷的0.5M sucrose（含10%甘油）轻柔悬浮细胞，相同条件沉淀细胞，轻轻倒去液体，相同条件重复洗涤一次。两次洗涤后的细胞用100μl0.5M sucrose（含10%甘油）轻柔悬浮，按40μl体积分装两管。
从MRS平板上挑单克隆接种50ml MRS培养基，密封，置30℃培养过夜。次日，于4℃、
3000rpm离心10分钟沉淀细胞；用等体积冰冷的0.5M sucrose（含10%甘油）轻柔悬浮细胞，相同条件沉淀细胞，轻轻倒去液体，相同条件重复洗涤一次。两次洗涤后的细胞用100μl0.5M sucrose（含10%甘油）轻柔悬浮，按40μl体积分装两管。
[0029] b. 植物乳酸菌的电转化：取其中一管感受态细胞立刻进行电转化：在细菌中加入5μl 打靶质粒pNZ5319-Δalr，冰上静置5min，迅速转移入2mm电转杯（Eppendorf），于1800V电压下电击（Eppendorf 2510电转仪）。电击结束后，立即用1ml MRS培养基（含D-Alanine 0.2mg/ml）悬浮细菌，转入2ml eppendorf管，置30℃培养3小时后铺MRS平板（含0.2mg/ml D-Alanine，5mg/ml红霉素），密封后置30℃培养2天。单克隆经MRS液体培养基（含D-丙氨酸0.2 mg/mL，10 μg/mL氯霉素）培养后提取基因组DNA，用Alr外侧引物进行alr基因的鉴定，见图8，命名为NC8/Δalr。
[0030] 实施例2 丙氨酸消旋酶基因alr标记质粒表达载体pCJ2的构建为实现无突变替换pCJ1载体上的红霉素标记基因，先分别PCR扩增出pCJ1载体上红霉
素基因上游臂端（含酶切位点BamHI）343bp、alr基因1128bp、pCJ1载体红霉素基因下游臂端（含酶切位点ClaI）567bp 片段，PCR产物回收纯化后加入EmS F和EmX R引物采用SOE-PCR单管反应将三片段连接，获得碱基序列为2038bp的 EmS-alr-EmX片段。链接片段亚克隆后用BamHⅠ和ClaⅠ双酶切，酶切产物回收纯化定量，与用相同酶双酶切的pCJ1片段进行链接，转化至丙氨酸缺陷型受体菌植物乳杆菌NC8/Δalr，获得无抗生素标记的食品级质粒表达载体pCJ2。
素基因上游臂端（含酶切位点BamHI）343bp、alr基因1128bp、pCJ1载体红霉素基因下游臂端（含酶切位点ClaI）567bp 片段，PCR产物回收纯化后加入EmS F和EmX R引物采用SOE-PCR单管反应将三片段连接，获得碱基序列为2038bp的 EmS-alr-EmX片段。链接片段亚克隆后用BamHⅠ和ClaⅠ双酶切，酶切产物回收纯化定量，与用相同酶双酶切的pCJ1片段进行链接，转化至丙氨酸缺陷型受体菌植物乳杆菌NC8/Δalr，获得无抗生素标记的食品级质粒表达载体pCJ2。
[0031] 1．菌种及试剂（1）菌株及质粒载体
植物乳杆菌NC8株由印度卡马拉杰大学Anbazhagan.K高级研究员惠赠；E. coli Top10
感受态细胞由本实验室保存；双基因敲除的E.coli TOP10/ΔdadX/ΔAlr感受态细胞由吉林农业大学动物微生态实验室构建保存；质粒pCJ1由吉林农业大学动物微生态实验室保存；pJET1.2blunt载体由Thermo scientific -fermentas公司提供。
植物乳杆菌NC8株由印度卡马拉杰大学Anbazhagan.K高级研究员惠赠；E. coli Top10
感受态细胞由本实验室保存；双基因敲除的E.coli TOP10/ΔdadX/ΔAlr感受态细胞由吉林农业大学动物微生态实验室构建保存；质粒pCJ1由吉林农业大学动物微生态实验室保存；pJET1.2blunt载体由Thermo scientific -fermentas公司提供。
[0032] （2）主要材料及试剂革兰氏阳性细菌基因组提取试剂盒，质粒小提试剂盒，胶回收试剂盒， PCR产物回收试剂盒由OMEGA公司提供；高保真PCR聚合酶，限制性内切酶，T4DNA连接酶Promega公司提供；
电转杯由Bio-Rad公司提供；D-丙氨酸，红霉素，氯霉素由Sigma提供；其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。
电转杯由Bio-Rad公司提供；D-丙氨酸，红霉素，氯霉素由Sigma提供；其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。
[0033] 2．PCR扩增 pCJ1载体上红霉素基因上游臂端、alr基因、pCJ1载体红霉素基因下游臂端（1）丙氨酸消旋酶基因alr的PCR扩增
采用OMEGA公司革兰氏阳性菌基因组提取试剂盒，提取植物乳杆菌NC8（Lb.plantarum NC8）基因组，参照NCBI Lactobacillus plantarum WCFS1 (GenBank: AL935263.2)alr基因序列，设计引物，通过PCR扩增alr基因的CDS序列（1128 bp）。PCR反应产物回收纯化，引物序列、反应体系及反应条件如下，电泳结果见图9，结果显示扩增出1128bp的alr基因。
采用OMEGA公司革兰氏阳性菌基因组提取试剂盒，提取植物乳杆菌NC8（Lb.plantarum NC8）基因组，参照NCBI Lactobacillus plantarum WCFS1 (GenBank: AL935263.2)alr基因序列，设计引物，通过PCR扩增alr基因的CDS序列（1128 bp）。PCR反应产物回收纯化，引物序列、反应体系及反应条件如下，电泳结果见图9，结果显示扩增出1128bp的alr基因。
[0034] a.引物序列：AlrF 5' ATGGTTGTAATTGGGGAGCAC 3'AlrR 5' TTAATCTATATAAACTCTCGGCACT 3'
b.反应体系：
c.反应条件 ：
（2）pCJ1载体红霉素基因上、下游臂端的PCR扩增
分别以载体pCJ1红霉素基因上、下游为模板设计四对引物，PCR扩增红霉素基因上、下游臂端，扩增产物用试剂盒回收纯化。
b.反应体系：
c.反应条件 ：
（2）pCJ1载体红霉素基因上、下游臂端的PCR扩增
分别以载体pCJ1红霉素基因上、下游为模板设计四对引物，PCR扩增红霉素基因上、下游臂端，扩增产物用试剂盒回收纯化。
[0035] 1） pCJ1载体红霉素基因上游臂端的PCR扩增a.引物序列：EmS F：5’ TATGCGTGCGGGATCCC(BamHI)3 ’
EmS R ：5’ GCGGTGCTCCCCAATTACAACCATGTAATCTCTCCTGAAGTTAAACGATT3 ’
b.反应体系：
c.反应条件：
PCR产物回收纯化电泳结果见图9，结果显示扩增出343bp的上游臂端。
EmS R ：5’ GCGGTGCTCCCCAATTACAACCATGTAATCTCTCCTGAAGTTAAACGATT3 ’
b.反应体系：
c.反应条件：
PCR产物回收纯化电泳结果见图9，结果显示扩增出343bp的上游臂端。
[0036] 2）pCJ1载体红霉素基因下游臂端的PCR扩增以pCJ1载体为模板，电泳结果见图10，结果显示扩增出567bp的下游臂端。
[0037] a.引物序列：EmX F ：5’GAGTGCCGAGAGTTTATATAGATTAATTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATT3’
EmX R ：5’ CACTTTTGATAATCGATATGGTAAACT(ClaI)3’
b.反应体系：
c.反应条件 ：
（3）SOE-PCR连接pCJ1载体红霉素基因上游臂端、alr基因、pCJ1 载体红霉素基因下游臂端
将回收纯化的pCJ1载体红霉素基因上游臂端、alr基因、pCJ1 载体红霉素基因下游臂
端进行单管反应重叠延伸PCR，产物回收纯化，产物命名为EmS-alr-EmX，片段长2038bp，反应体系、反应条件及电泳结果见图11。
EmX R ：5’ CACTTTTGATAATCGATATGGTAAACT(ClaI)3’
b.反应体系：
c.反应条件 ：
（3）SOE-PCR连接pCJ1载体红霉素基因上游臂端、alr基因、pCJ1 载体红霉素基因下游臂端
将回收纯化的pCJ1载体红霉素基因上游臂端、alr基因、pCJ1 载体红霉素基因下游臂
端进行单管反应重叠延伸PCR，产物回收纯化，产物命名为EmS-alr-EmX，片段长2038bp，反应体系、反应条件及电泳结果见图11。
[0038] a.反应体系：b.反应条件：
c.电泳结果见图11。
c.电泳结果见图11。
[0039] 3．表达载体pCJ1红霉素标记基因用Alr基因的替换用BamHⅠ和 ClaⅠ分别双酶切EmS-alr-EmX和pCJ1载体,获得2038bp的EmS-alr-EmX组件和5097bp的pCJ1/Δem片段，凝胶回收后进行连接，连接反应体系如下：
连接产物直接转化至丙氨酸消旋酶dadX和Alr双基因敲除的E.coli TOP10/ΔdadX/Δ
Alr感受态细胞(双基因敲除菌株TOP10/ΔdadX/ΔAlr因缺失D-丙氨酸合成必要的酶，在普通培养基不生长，只有在添加有D-丙氨酸的培养基中或是转化入能表达D-丙氨酸的质粒表达载体才能生长)，全部转化液涂M9平板，37℃培养，利用营养互补型载体/受体系统筛选标记进行筛选。长出的单克隆随机挑入M9培养液，过夜培养后质粒小量制备，PCR鉴定，鉴定的阳性载体命名为pCJ2。电泳结果见图12，BamHⅠ和 ClaⅠ双酶切得到2038bp的EmS-alr-EmX组件和5097bp载体片段，表明构建出能在E.coli TOP10/ΔdadX/ΔAlr中表达的食品级表达载体pCJ2，载体载体大小7135bp。
连接产物直接转化至丙氨酸消旋酶dadX和Alr双基因敲除的E.coli TOP10/ΔdadX/Δ
Alr感受态细胞(双基因敲除菌株TOP10/ΔdadX/ΔAlr因缺失D-丙氨酸合成必要的酶，在普通培养基不生长，只有在添加有D-丙氨酸的培养基中或是转化入能表达D-丙氨酸的质粒表达载体才能生长)，全部转化液涂M9平板，37℃培养，利用营养互补型载体/受体系统筛选标记进行筛选。长出的单克隆随机挑入M9培养液，过夜培养后质粒小量制备，PCR鉴定，鉴定的阳性载体命名为pCJ2。电泳结果见图12，BamHⅠ和 ClaⅠ双酶切得到2038bp的EmS-alr-EmX组件和5097bp载体片段，表明构建出能在E.coli TOP10/ΔdadX/ΔAlr中表达的食品级表达载体pCJ2，载体载体大小7135bp。
[0040] 4．用pCJ2验证alr基因缺陷植物乳杆菌NC8株实验组将pCJ2质粒电击转化alr基因缺失植物乳杆菌NC8，同时设对照组。对照组1，转化pCJ1至alr缺失植物乳杆菌NC8，铺MRS平板（不加D-丙氨酸）；对照组2，即空白对照组，质粒以TE缓冲溶液替代，转化入alr基因缺失植物乳杆菌NC8，铺MRS平板（加D-丙氨酸），37℃培养至长出单克隆。结果显示在实验组单个菌落长出，对照组1无菌落，对照组2，多菌落长出，表明质粒与受体菌具有营养互补作用，可以作为筛选标记。随机选择单克隆经MRS液体培养基（不加D-丙氨酸）培养后提取质粒，进行质粒的PCR和酶切鉴定，结果见图13，将鉴定阳性的重组菌命名L. plantarum NC8pAlr。重组L. plantarum NC8pAlr连续培养15代后，分离培养，小提质粒电泳检测表明pCJ2在重组菌中能稳定存在。
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