2.技术领域

本发明涉及用于控制脂肪积聚和防治体重增加的组合物和方法。例如，本发明涉及采用 包含一种多甲氧基化黄酮的组合物，以控制脂肪细胞内脂肪的积聚和阻止脂肪形成的方法。 在一些实施方式里，提供了防止已经历减肥的个体的体重反弹的方法。

3.背景技术

肥胖症是一种重要的难以满足的医疗需求，正蔓延性增长。三分之一多的美国人属于临 床上的超重，体重控制的年均花费超过了300亿美元。

在人体，肥胖症的特征在于储存脂肪的脂肪细胞数量(超常增生)以及大小(肥大)的 增加。通过脂肪形成产生新的脂肪细胞，这是一个过程，通过该过程位于脂肪组织(前体脂 肪细胞)的特异性成纤维细胞被触发进行脂肪细胞分化。在哺乳动物整个生命期里，新生的 脂肪细胞分化可由补充成纤维细胞前体开始启动。

抗肥胖症药物是许多医药公司的主要目标，目前市场上尚无有效的药物。急需预防、治 疗肥胖症的有效的食品添加剂或安全有效的药物。

4.发明概要

一方面，本发明提供控制脂肪积聚的方法。在一些实施方式里，本发明提供控制脂肪在 脂肪细胞中积聚的方法。在一些实施方式里，脂肪细胞是在个体，优选为哺乳动物，最优选 为人中。特别是，所提供的方法包含给予个体有效量的包含一如下所述的多甲氧基化黄酮 (PMF)组分的组合物，依此控制个体内脂肪细胞里的脂肪积聚。

在某些实施方式里，提供了方法，以控制超重的或肥胖的个体内脂肪积聚。在一些实施 方式里，人具有不希望的体重增加史，在没有用上述描述的控制脂肪积聚方法治疗时容易变 成超重或者肥胖。

在某些实施方式里，本发明所提供的方法在有需要的人里预防脂肪的形成。

在某些实施方式里，本发明所提供的方法在有需要的人里预防在成熟脂肪细胞内的脂肪 积聚。

在某些实施方式里，本发明所提供的方法用来预防脂肪细胞中的脂肪积聚，包含使脂肪 细胞与包含多甲氧基化黄酮(PMF)组分和非PMF组分的组合物接触。

在一些实施方式里，脂肪细胞与组合物体外接触。

在一些实施方式里，脂肪细胞在个体内与组合物接触。

在另一方面，本发明提供预防有需要的人的反弹性体重增加的方法，该方法包含给予个 体有效量的包含如下所述的PMF组分的组合物，依此阻止反弹性体重增加。

本方面所述的组合物包含一种或多种PMF。在某些实施方式里，本组合物包含一PMF组 分和一非PMF组分，其中PMF组分包含一种或多种PMF。

在某些实施方式里，本发明的组合物包含一种橙皮提取物。在一些实施方式里，本发明 的组合物基本上由橙皮提取物组成。一般而言，本组合物不是一种自然原料，例如橙皮。

在某些实施方式里，本发明的组合物包含30％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重)的PMF 组分。在某些实施方式里，本发明的组合物包含40％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重)的 PMF组分。在一些实施方式里，PMF组分的含量范围为0.5％(w/w)-5％(w/w)，1％(w/w)- 10％(w/w)，10％(w/w)-20％(w/w)，20％(w/w)-30％(w/w)，30％(w/w)-40％(w/w)，40 ％(w/w)-50％(w/w)，50％(w/w)-60％(w/w)，60％(w/w)-70％(w/w)，70％(w/w)-80％ (w/w)，80％(w/w)-98％(w/w)。

在一些实施方式里，本发明所述组合物的PMF组分包含PMF中的至少1种，至少2种， 至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种， 至少11种，至少12种，至少13种，或至少14种，选自以下的PMF：

5，6，7，3’，4’-五甲氧基黄酮(甜橙黄酮)；

5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮(川陈皮素)；

5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮(桔皮素)；

5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮(酸橙素)；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

3，5，6，7，8，3’，4’-七甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮。

在一些实施方式里，本发明所述组合物的PMF组分由PMF中的至少1种，至少2种，至 少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种，至 少11种，至少12种，至少13种，或至少14种选自以下的PMF组成：

5，6，7，3’，4’-五甲氧基黄酮(甜橙黄酮)；

5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮(川陈皮素)；

5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮(桔皮素)；

5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮(酸橙素)；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

3，5，6，7，8，3’，4’-七甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮.

在一些实施方式里，本发明所述组合物包含PMF混合物，其中组合物中PMF的浓度不同 于在该PMF天然原料中的浓度，或组合物中一种PMF与另一PMF的比例不同于各PMF在天然 原料里的比例。这种组合物可通过以下方法制备：例如，加工PMF的天然原料，例如橙皮， 以致于至少一种特殊的PMF被选择性地除掉、保留或富聚。可选择地，一种或多种分离的或 合成的PMF可用于制备上述组合物或能加入到PMF天然原料的加工物里。

在一些实施方式里，本发明所述组合物包含一种橙皮提取物。

在一些实施方式里，本发明所述组合物是一种营养品组合物，包含一种或多种PMF和食 品、食品添加剂、膳食补充剂或药膳食品。

典型地，在本发明所述的方法里，个体所给予的组合物的量每天可为约0.05mg，约0.1 mg，约0.5mg，约1.0mg，约5mg，约10mg，约15mg，约20mg，约25mg，约30mg，约 35mg，约40mg，or约50mg，to约75ing，约100mg，约200mg，约250mg，约300 mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约750mg，约800mg，约900mg，约 1g，约2g，约3g，或约5g。

在某些实施方式里，按本发明所述的方法，给予个体的组合物里PMF组分的量的变化范 围每天可为约0.05mg，约0.1mg，约0.5mg，约1.0mg，约5mg，约10mg，约15mg， 约20mg，约25mg，约30mg，约35mg，约40mg，or约50mg，to约75mg，约100 mg，约200mg，约250mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约 750mg，约800mg，约900mg，约1g，约2g，约3g，或约5g。

在一些实施方式中，本组合物每天可以被给予1次、2次或多次。在一些实施方式中， 本组合物可连续数日给予，如2天、3天或更多天，直到约7天、约2周、约3周、约4周、 约30天、约5周、或约6周。

在一些实施方式中，本组合物可偶尔被给予，例如，当个体已摄取或打算摄取高碳水化 合物或高脂肪含量的食物时给予。

在一些实施方式中，按本发明所述方法，给予的组合物可采取口腔黏膜、鼻腔、口服、 非肠胃道、直肠、舌下、局部给药或透皮途径给予

在一些实施方式中，本发明所述方法里给予的组合物可采用下列剂型被给予：气雾剂、咀 嚼棒，散状或蓬松干粉，胶囊，乳膏，饮料，酏剂，乳剂，液剂，胶体，颗粒剂，咀嚼胶， 洗剂，锭剂，软膏剂，糊剂，贴剂，丸剂，粉剂，溶液剂，喷剂，栓剂，混悬剂，糖浆剂， 片剂，茶剂，酊剂，吸入剂或薄片。

5.附图说明

图1提供在采用关于用DMSO处理的细胞组(对照)或不同浓度上述试验组合物处理的 细胞组的基于色度法的3T3-L1细胞增殖/细胞毒性分析所得的平均吸光率(光密度单位)。这 些结果表明在试验组合物约20微克/mL或更高浓度下细胞增殖被抑制。

图2提供了在第0(“生长”)、2、4、10天时，在没有试验组合物的条件下用分化因子 处理的前体脂肪细胞标志基因的被观察到RNA表达水平。

图3提供了在第4、10天时，相对对照细胞水平(见图2)，用试验组合物处理的细胞 标志基因的RNA表达水平的百分比变化。

图4提供了用试验组合物处理的细胞内HMGA2的表达水平。

图5提供了喂养标准饮食、标准饮食加包含PMF的组合物、高脂肪饮食或高脂肪饮食加 包含PMF的组合物的小鼠食物消耗每周均值(单位：大卡)。

图6提供了喂养标准饮食(SD)、标准饮食加包含PMF的组合物(SD70％OPE)、高脂肪饮食 (HFD)或高脂肪饮食加包含PMF的组合物(HFD70％OPE)的小鼠体重增加百分比。

图7提供了喂养标准饮食(SD)、标准饮食加包含PMF组合物(SD70％OPE)、高脂肪饮食(HFD) 或高脂肪饮食加包含PMF的组合物(HFD70％OPE)的小鼠体脂肪百分比。

图8提供了喂养16周的标准饮食(SD)、标准饮食加包含PMF的组合物(SD70％OPE)、高 脂肪饮食(HFD)或高脂肪饮食加包含PMF的组合物(HFD70％OPE)的小鼠个体脂肪垫重量。

图9提供了采用不同饮食的小鼠的血糖控制。4个小时禁食后检测小鼠禁食血糖水平(A) 和糖基化血红蛋白(HbAlc)(B)。

图10提供了高脂肪饮食转换成高脂肪饮食加包含70％OPE喂养小鼠的体重增长百分比以 及高脂肪饮食加包含70％OPE转换成高脂肪饮食喂养小鼠的体重增长百分比。

图11提供了采取指定的食谱包括转换食谱喂养的小鼠脂肪量百分比。

图12提供了采取指定的食谱包括转换食谱喂养的小鼠个体脂肪垫重量。

6.术语

在本文，“约”是指不高于或低于被该词修饰的数值的10％的数值。例如，“约5分钟” 意味为4.5-5.5分钟的范围。

在本文，“组合物”为包含药学组分、生理可接受的组分和营养制品组分。应该理解的是， 在一个“组合物”中，一个组分，例如，一种PMF，也存在于天然原料(如橙皮)中时，术 语“组合物”不由该组分的天然原料(例如，橙皮)构成，但在一些实施例里可包含该天然 原料的物理或化学改性的或加工的形式，例如这种天然原料的提取物。

在本文，“有效量”是指当被给予个体时，化合物或组合物的量足够产生希望的或有益的 效果。在某些实施例中，与未同该化合物或组合物接触的前体脂肪细胞或未被给予该化合物 或组合物的个体的脂肪细胞比较，化合物或组合物的“有效量”能预防、迟滞、减缓或减少 与该化合物或组合物接触的脂肪细胞内或被给予该化合物或组合物的个体的脂肪细胞内脂 肪，如三酰基甘油的积聚。在一些实施例中，与未被给予该化合物或组合物的个体比较，该 化合物或组合物的“有效量”能预防、迟滞、减缓或减少被给予该化合物或组合物的个体的 反弹性体重增加。

当用在从天然原料获得的化合物组合物的场合时，“分离的”是指从来源于天然原料的一 种或多种组分中分离出的化合物或组合物。天然原料可为真菌类、植物或动物或由真菌类、 植物或动物产生的天然或非天然的产物，包括血液、胞质、树叶、乳汁、黏液、果皮、血浆、 树脂、壳、树液、唾液、茎、汗液、尿液等。因此，一种“分离的”化合物或组合物是处在 一种形式，以致于它的浓度或纯度高于它在天然原料中的浓度或纯度。。例如，在某些实施例 中，一种“分离的”化合物或组合物能通过从天然原料纯化或部分纯化该化合物或组合物而 获得。在一些实施例中，一种“分离的”化合物或组合物能通过合成、生物合成或半合成的 有机化学反应混合物而体外获得。

在本文，“控制”、“控制中”和“控制”是指当本发明所述方法被应用到个体时，该个体 所获得的有益效果。在某些实施例中，与未被给予组合物的个体比较，个体被给予本发明所 述“控制”脂肪积聚的组合物，以便预防、迟滞、减缓或减少该个体的脂肪细胞中脂肪的积 聚。在一些实施例中，与未被给予组合物的个体比较，体被给予本发明所述“控制”脂肪积 聚的组合物，以便预防、迟滞、减缓或减少个体的脂肪形成。

除非另有所指，“多甲氧基化黄酮”或“PMF”是指具有下列结构的化合物

其中，在化学价许可下，上述结构式上至少1个碳原子，优选2个或多个碳原子与-OCH3 基团连接(取代一个或多个H，未在结构式标出)。任意地，取代基，例如羟基、卤素、单糖 或其它基团，可取代到1个或多个未被甲氧基取代的碳原子上。例如，一种“羟基化PMF” 是1个或多个羟基连接到未被甲氧基取代的碳原子上的PMF.

“反弹性体重增加”是指伴随个体停止或减少锻炼疗法、限制热量饮食或服药(包括烟 草)时，个体内身体脂肪的增加发生，超过了个体减肥或保持他或她体重的时期。典型地， “反弹性体重增加”是出现在个体停止或减少锻炼疗法、限制热量饮食或服药(包括烟草) 后数天、数周、更普遍地为数月直到一年的时期。

“溶剂化物”是指一种化合物，例如，一PMF，还包括化学计量或非化学计量量的通过 非共价的分子间力而结合的溶剂。当溶剂是水时，溶剂化物为水合物。

在本文，“个体”是指一哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、猪、马、驴、 山羊、绵羊、骆驼、猫、狗)，更优选为灵长类(例如猴子、猿、大猩猩、黑猩猩)，和最优 选为人类。

7.发明详述

脂肪细胞的主要功能是在过量的能量可用时储备三酰基甘油或脂肪。正如下面实施例的 结果所支持的，一种包含如多甲氧基化黄酮(PMF)组分的组合物能有效的控制个体内脂肪积 聚。尤其，不必然局限任何特别的理论或机理，实施例中的结果表明包含PMF的组合物能迟 滞或阻止脂肪形成，也减少或阻止了脂肪积聚进入脂肪细胞。采用包含PMF组分的组合物的 方法在7.1节描述。包含PMF的组合物和它们的制备方法在7.2节描述。

7.1使用包含PMF组分的组合物的方法

一方面，本发明提供控制脂肪积聚的方法。在某些实施方式里，本发明提供控制脂肪细 胞里脂肪积聚的方法。在一些实施方式里，脂肪细胞在个体里，优选为哺乳动物，最优选为 人。在一些实施方式里，本方法提供包含给予个体有效量的含多甲氧基化黄酮(PMF)组分的 组合物，依此控制个体内脂肪细胞里脂肪积聚。

在某些实施方式里，提供了方法，以控制超重的或肥胖的个体内的脂肪积聚。在一些实 施方式里，有意外体重增加历史的人群，在没有上述描述的控制脂肪积聚方法的情况下，是 易于变得体重超重或肥胖。

在某些实施方式里，本发明为有需要的人提供控制脂肪积聚的方法，其特征在于脂肪形 成被控制、被阻止、被迟滞、被减缓或被减少。

在一些实施方式中，本发明为有需要的人提供控制脂肪积聚的方法，其特征在于成熟脂 肪细胞内脂肪积聚被控制、被阻止、被迟滞、被减缓或被减少。

在某些实施方式里，本发明控制脂肪积聚的方法是满足具有减肥需求的人或保持体重需 求的人。具有减肥需求的人体普遍具有的体质指数(BMI)超过正常值(如25)。在一些实施例 里，人体具有体质指数(BMI)≥30，即肥胖个体。

一方面，本发明为有需要的人的提供控制反弹性体重增加的方法，该方法包含给予该个 体有效量的包含PMF组分的组合物，依此控制反弹性体重增加。

在某些实施例里，本发明提供控制伴随个体停止或减少锻炼疗法、限制热量饮食或服药 (包括烟草)的个体的反弹性体重增加的方法。

在一方面，本发明为个体提供减肥、控制体重、阻止反弹性体重增加的方法，该方法包 含给予该个体有效量的组合物，该组合物包含一至少40％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重) 的多甲氧基化黄酮(PMF)组分。在某些实施例里，该组合物包含一至少30％(w/w)(干重) -75％(w/w)(干重)的PMF组分。

一方面，为了增加个体瘦体重或肌肉体重，本发明所提供的方法包含给予个体有效量的 组合物以有效减少个体内脂肪积聚，其中该组合物包含一至少40％(w/w)(干重)-75％(w/w) (干重)的多甲氧基化黄酮(PMF)组分，从而增加个体瘦体重或肌肉体重。在某些实施例里， 该组合物包含一至少30％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重)的PMF组分。

在另一方面，为了减少个体腰围，本发明所提供的方法包含给予个体有效量的组合物， 该组合物包含一至少40％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重)的多甲氧基化黄酮(PMF)组 分。在某些实施例里，该组合物包含一至少30％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重)的PMF 组分。

一方面，为了增加个体代谢率，本发明所提供的方法包含给予个体有效剂量一组合物， 该组合物包含一至少40％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重)的多甲氧基化黄酮(PMF)组 分。在某些实施例里，该组合物包含一至少30％(w/w)(干重)-75％(w/w)(干重)的PMF 组分。

另一方面，为了阻止脂肪细胞内的脂肪积聚，本发明所提供的方法包含使脂肪细胞与包 含PMF组分的组合物接触。

7.2包含PMF的组合物和它们的制备方法

本发明所提供的组合物通常包含PMF组分和非PMF组分。在某些实施例里，PMF组分包 含一种或多种PMF。

在某些实施例里，PMF能从天然原料中分离，如提取，以作为本发明所述方法中所使用 的组合物的内含物。在一些实施例中，组合物是一种包含PMF组分的天然原料的提取物。在 一些实施例里，本发明所述方法中所使用的组合物包含来源于冷压处理的橙皮油固体的提取 物。优选的，本发明所述方法中所使用的组合物包含来源于夏橙和哈姆林橙的提取物。

在一些实施例里，本发明所述方法中所使用的组合物包含PMF的混合物，其中组合物中 PMF的浓度不同于天然原料中该PMF的浓度。

在一些实施例里，本发明所述方法中所使用的组合物包含一PMF组分，其中组分中的一 种PMF与另一种PMF的比例不同于在PMF在天然原料里的比例。

在某些实施例里，PMF能合成获得，以作为本发明所述方法中所使用的组合物的内含物。 PMF能无限定地使用任何合成或半合成技术合成获得。常见的黄酮合成路线可在，例如， Cushman and Nagarathnarn(1990)Tetrahedron Letters31：6497-6500中找到。

通常，高效液相色谱(HPLC)可被用作一种纯化或部分纯化PMF的制备技术，也可作为分 析技术鉴别来源于天然原料的混合物或合成反应混合物中PMF。例如，为了分离橙皮提取物 中的PMF，采用尺寸为4.6mm i.d.，x 25cm长的硅胶HPLC柱(MacMod Analytical Co.，Chadds Ford，PA)，采用10％-90％氯仿(溶于己烷)梯度洗脱(20分钟)，加上20分钟90％氯仿 洗脱。PMF的分子量鉴别采用大气压化学电离质谱。

在某些实施例里，本发明所述方法中所使用的组合物包含30％(w/w)(干重)-75％(w/w) (干重)的一PMF组分。在某些实施方式里，本发明的组合物包含40％(w/w)(干重)-75 ％(w/w)(干重)的一PMF组分。在一些实施方式里，PMF组分的含量范围为0.5％(w/w)-5 ％(w/w)，1％(w/w)-10％(w/w)，10％(w/w)-20％(w/w)，20％(w/w)-30％(w/w)，30％(w/w) -40％(w/w)，40％(w/w)-50％(w/w)，50％(w/w)-60％(w/w)，60％(w/w)-70％(w/w)，70 ％(w/w)-80％(w/w)，80％(w/w)-98％(w/w)。

应该理解的是，PMF组分可包含一种PMF或包含多种PMF。

在某些实施例里，本发明所述方法中所使用的组合物的PMF组分至少包含 5，6，7，3’，4’-五甲氧基黄酮(甜橙黄酮)；

5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮(川陈皮素)；

5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮(桔皮素)；

5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮(酸橙素)；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

3，5，6，7，8，3’，4’-七甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮中之一。

在一些实施方式里，本发明所述方法中使用的组合物的PMF组分包含PMF中的至少1种， 至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种， 至少10种，至少11种，至少12种，至少13种，或全部PMF，该PMF选自：

5，6，7，3’，4’-五甲氧基黄酮(甜橙黄酮)；

5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮(川陈皮素)；

5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮(桔皮素)；

5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮(酸橙素)；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

3，5，6，7，8，3’，4’-七甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮。

在一些实施方式里，本发明所述方法中所使用的组合物由一种或多种PMF组成。

在一些实施方式里，本发明所述方法中所使用的组合物基本上由一种或多种PMF组成。

在一些实施方式里，本发明所述方法中使用的组合物的PMF组分包含一种或多种PMF， 该PMF选自：

5，6，7，3’，4’-五甲氧基黄酮(甜橙黄酮)；

5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮(川陈皮素)；

5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮(桔皮素)；

5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮(酸橙素)；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

3，5，6，7，8，3’，4’-七甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮。

在一些实施方式里，本发明所述方法中所使用的组合物包含羟基化的多甲氧基黄酮。在 一些实施例中，该组合物至少包含5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮(酸橙素)；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮中之一。

在一些实施方式里，本发明所述方法中所使用的组合物包含五甲氧基黄酮、六甲氧基黄 酮、七甲氧基黄酮或八甲氧基黄酮。在一些实施例中，该组合物至少包含5，6，7，8，3’，4’- 六甲氧基黄酮(川陈皮素)；3，5，6，7，8，3’，4’-七甲氧基黄酮；5-羟基-3，6，7，8，3’，4’- 六甲氧基黄酮；7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮中之一。

在一些实施方式里，本发明所述方法中所使用的组合物包含一种或多种羟基化的PMF。 在某些实施方式里，本组合物包含PMF组分和一种或多种非PMF组分，其中PMF组分包含一 种或多种羟基化的PMF。

在一些实施方式里，本发明所述方法中使用的组合物或组合物中的PMF组分基本上由一 种羟基化的PMF，或至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，或更多种羟基 化的PMF组成，该羟基化的PMF选自：

3-羟基-5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

3-羟基-5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮；

3-羟基-5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-3，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5-羟基-3，7，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5-羟基6，7，8，3’，4’，5’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，4’-三甲氧基黄酮；

5，3’-双羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮；

3’-羟基-5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

3’-羟基-5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮；

3’，4’-双羟基-5，6，7，8-四甲氧基黄酮；和

4’-羟基-5，6，7，8，3’-五甲氧基黄酮。

在一些实施方式里，本发明所述方法中使用的组合物不含有可检测数量的柠檬苦素类化 合物。在一些实施方式里，本组合物不含有可检测浓度的柠檬苦素或nomalin。

7.2.1营养制品

在一些实施方式里，本发明所述方法中使用的组合物可为营养组合物。在本文，术语“营 养组合物”是指包含食品、食品添加剂、营养添加剂、药膳或特殊营养用途食物和PMF组分 的组合物。

在一些实施方式里，本发明所述营养组合物常包含一种或多种可消费的媒介物、载体、 辅料或填充剂。术语“可消费的”是指通常适合被动物或更具体被人消费的或被联邦或州政 府监督部门认可的。

在本文，“食品”是指预期能被动物包括人所消费的任何物质，无论是加工的、半加工的 或生的，但不包括化妆品、烟草制品或仅作为药物的物质。

在本文，术语“营养添加剂”是指补充日常膳食的物质(不包括烟草)。通常，营养添加 剂是指被标识为营养补充品的物质，不被描述以常规食物或作为膳食或日常饮食的一项而使 用。通常，营养添加剂包括一种或多种下列营养成分：维生素、矿物质、草本或其它植物、 氨基酸、通过增加整个营养摄取补充营养而为人所用的营养品、或任何组分的浓缩物、代谢 物、组成物、提取物或这些成分的组合。。营养添加剂能不依赖于任何食物地被人消费，不像 在食物加工、制造、准备或运输过程中或刚在它消费前掺合到食品中的食品添加剂。

在本文，术语“药膳”是指以在医生监督下被消费化或肠内给药而按配方制造的、为针 对疾病的特定膳食管理的，基于已公知的科学原理被医学评价所确认的特殊营养要求的食物。 药膳例子包括但不限于单来源营养产品(sole source nutrition products)，它为完全的营 养产品，可用于替代所有其它食物摄取；口服再水合溶液，用于替代腹泻或呕吐后损失的体 液和电解质；含有特别选择的成分的模块营养产品(modular nutrient products)，它无意 成为全面的营养来源但是设计为针对特定的疾病的管理，它还连带地主张具有直接或暗示的 功效；以及打算用于先天性代谢障碍的膳食管理的产品。

在本文，“特殊营养用途的食物”指的是一种食物，它意图用于或被描述用于至少下列情 况之一：供应特殊的饮食需求，因身体、生理、病理或其它情况的原因，包括但不限于疾病、 康复、怀孕、哺乳、婴幼儿期、食物过敏性超敏反应、体重过轻、超重或控制钠摄取需求的 情况；补充维生素、矿物质或通过增加总的膳食摄取来补充膳食的其它成分；以及作为膳食 的单项而使用的食物的原因而提供的特殊膳食需求。

本发明所述方法所用的营养制品也包括1种或多种能带来额外健康的或医学的益处的其 它成分。

在一些实施例中，本发明所述方法所用的营养制品包括PMF组分和1种或多种“公认安 全的”【“Generally Regarded As Safe”(“GRAS”)】物质。许多GRAS物质是公知的，已 被列在多份美国公共健康部门的规章中，21 CFR 73，74，75，172，173，182，184 and 186。 这里这些规章作为整体引入本文。

在某些实施例里，术语“药膳”或“特殊营养用途食物”、“营养添加剂”或“食品添加 剂”的词义如美国州政府或联邦政府的监督部门，包括美国食品药品管理局，所定义的词义。

在一些实施例中，本发明所述方法所用的营养制品包含约0.001％-90％重量比的PMF组 分。该组合的其它量可以是约0.0075％-约75％，约0.005％-约50％，约0.01％-约35％， 0.1％-约20％，0.1％-约15％，1％-约10％，和2％-7％重量比的PMF组分。

7.2.2药物配方

在一些实施例中，本发明所述方法所用的包含1种或多种PMF和1种或多种生理上可接 受的载体或辅料的药物组合物可采用常规方法制剂。1种或多种生理上可接受的载体或辅料 和1种或多种PMF及其生理上可接受的盐和溶剂化物的组合可按吸入或喷射入(通过口或鼻 腔)口服、黏膜、非肠胃道、直肠或透皮途径服用方法而制剂。

为了口服给药，药物组合物可采用例如药片或胶囊的形式，这些可以与药学上可接受的 赋形剂，如黏合剂(例如预先明胶化的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)， 填料(如乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)，润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或硅胶)，崩解剂 (如马铃薯淀粉和羟基乙酸淀粉钠)，或润湿剂(如月桂基硫酸钠)一起用常规的方法制备。 药片可用本领域公知的方法包衣。口服用的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式， 或者可才用干粉的形式，在使用前用水或其他合适的载体重建。这样的液体制剂可与药学上 可接受的添加剂(如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的使用脂肪)，乳化剂(如卵磷脂或 阿拉伯树胶)，非水性介质(如杏仁油、油脂、乙醇或分级的植物油)，和防腐剂(如对羟基苯 甲酸架酯或丙酯或抗坏血酸)用常规方法制造。制剂也可含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜 味剂。

口服制剂还可合适地配制为一种或多种PMF的控制释剂。

为了含服给药，组合物可用常规方法配制成药片或锭剂。

为了吸入给药，本发明组合物可方便地用加压包或喷雾器一气溶胶喷雾剂的形式用合适 的推进剂输送，如二氟二氯甲烷、三氟氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。 在加压的气溶胶的情况下，剂量单位可通过阀门输送计量的量来控制。用于吸入器的明胶胶 囊或药包可配制成含一种或多种PMF和合适的粉基如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本发明组合物可配制成通过注射用于胃肠外给药，如药团注射或连续输液。注射用制剂 可以是在安瓿中或在多剂容器中的单位剂量形式，带有防腐剂。组合物可采取以下形式：在 油或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，可含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者， 活性成分可以是粉末形式，用来与合适的载体如灭菌无热源水在使用前重建。

药物组合物还可配制为直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，如含有常规栓剂基料(如可可 酯或其他甘油酯)。

用于本发明方法的组合物可配制来用于透皮或局部外用给药。例如，本发明头皮或外用 剂型包括但不限于，眼科溶液、喷雾剂、气溶胶、膏剂、洗液、油膏、凝胶、溶液、乳剂、 悬浮液、或其他本领域公知的形式。见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21`版，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadephia(2005)；Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delive；y Systems，8th ed.，Lippincott，Williams &Wilkins，Philadelphia(2004).。透皮剂型包括“储槽型”和“基质型”贴剂，可贴在皮 肤上并穿戴一段时间以允许所需量的活性成分的渗透。

除了以上叙述的制剂外，组合物还可配制为储存制剂。这种长期有效的制剂可通过移植 (如皮下或肌肉内)给药，或通过肌肉内注射。因此，例如，复合物可用合适的聚合的或亲 脂的材料(如在可接受的油中的悬浮液)或离子交换树脂，或难溶解的衍生物，例如难溶解 的盐。

如果需要，组合外可存在于药包或分散器中，其中含有一个或多个含活性成分的单位计 形。药包例如可包含金属或塑料膜，如泡包。药包或分散器可带有说明书说明如何给药。

7.3含PMF的组合物的给药

本发明要给予个体的组合外的量以及给药频率可随着例如年龄、体重、给药的反应和过 去的医疗历史而改变。可从由体外或动物模型试验系统得到的剂量-反应曲线推断有效剂量。

一般，本发明方法给予个体的活性成分，即一种或多种PMF的量为约0.001μg/kg，约 0.005μg/kg，约0.01μg/kg，约0.05μg/kg，约0.1μg/kg，约0.5μg/kg，约 1μg/kg，约5μg/kg，约10μg/kg，约50μg/kg，约100μg/kg，约500μg/kg， 约1mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约25mg/kg，约50mg/kg或约75mg/kg，其 中单位指每个体体重(kg)微克(μg)活性成分。

在一些实施方式中，本发明组合外当给予个体，优选人时，所给药的组合外的PMF的量 为从约0.05mg，约0.1mg，约0.5mg，约1.0mg，约5mg，约10mg，约15mg，约20 mg，约25mg，约30mg，约35rng，约40mg，或约50mg，到约75mg，约100mg，约 200mg，约250mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约750mg， 约800mg，约900mg，约1g，约2g，约3g，或约5g每天.在一些实施方式中，所 给药的组合外中PMF组分的量为约50rng到约2g每天。

在一些实施方式中，本发明提供在个体中控制脂肪积聚的方法，方法是对有此需要的个 体给予按计划的给药，使得能充分控制脂肪的积聚。

在一些实施方式中，组合外可连续数天给予，如2天、3天或更多天，约2周，约3周， 约3周，约30天，约5周，约6周，约7-12周，或直到约一年或终身服用。

在一些实施方式中，组合物在为时一周到约8周的时间里每隔天一次给予个体，或3天 一次，4天一次，5天一次，或每周一次。

在一些实施方式中，组合物可偶尔给予，例如，当个体想进食高碳水化合物或高脂肪食 物是给予。

含PMF的组合物可以任何合适的途径给予，只要能保证在个体的循环中的PMF的生物利 用度。可以使用任何能提供有效量PMF组合物的的给药途径。特别是，如上述，可由制剂的 类型，如营养品或药物组合物来指示给药途径。

在一些实施方式中，本发明方法的组合物可通过以下途径给予：含服、经鼻、经口、胃 肠外、直肠、舌下、局部外用、或透皮给药。

7.4.组合方法

另一方面，本发明对有需要的个体提供控制脂肪积聚的方法，包含给予该个体含有一种 或多种PMF和第二药物(非含PMF的组合物)的组合物，以有效地控制脂肪的积聚。在一些 实施方式中，该第二药物促进瘦肌肉的发展。有效控制脂肪积聚或促进瘦肌肉发展的药物(非 含PMF的组合物)是本领域公知的，包括，例如但不限于，coleus forskohlii提取物、ginico biloba叶提取物、glalangal rhizome提取物、葡糖胺、葡萄籽提取物、绿茶提取物、海藻 酸镁、甲硫氨酸、泛酰巯基乙酸、钒等等。

在一些实施方式中，本发明要以联合方式给予的第二药物(非含PMF的组合物)是姜醇、 ECGC(epigallocatechin gallate)、红茶提取物、芹菜籽提取物、藤黄醇、枳子果提取物、 虎杖根提取物、或柠檬素。

在一些实施方式中，本发明要以联合的方式给予个体的第二药物(非含PMF的组合物) 是热量生成剂(如ECGC)、饱胀感启动子(如纤维素)、脂肪吸收障碍物(如壳聚糖)、去脂 肪体重启动子(如共轭亚油酸，CLA)或脂肪预防物。

在一些实施方式中，第二药物(非含PMF的组合物)同时给予个体。

在一些实施方式中，含PMF的组合物和第二药物(非含PMF的组合物)可先后给予个体。

在一些实施方式中，在接受手术除去体脂肪后给予含PMF的组合物以防止体重增加。除 去体脂肪的手术包括例如吸脂。

7.5.生物学分析

在应用到人体前，本发明所述方法所用的组合物的各个方面，包括药学的和营养学的组 合物，可在体外采用细胞培养系统，和/或动物模型，如啮齿类动物模型，常规地检测所需的 活性。例如，分析可包括细胞培养分析，在细胞培养分析中组织样品生长在培养基中，，曝露 于包含PMF的组合物或与其接触，观察这些组合物对组织样品的效果。典型地，前体脂肪细 胞、成熟脂肪细胞或脂肪细胞样细胞如3T3-L1细胞能用于这样的分析。

本发明所述方法所用的组合物可被检测它们抑制或诱导基因产物(如细胞蛋白质或RNA) 的表达和/或激活的能力，正如下面实施例部分中举例说明的。因为脂肪形成所需要的基因(至 少是某些基因)表达的暂时型式(temporal pattern)是公知的，那么为了评价组合物阻止 脂肪细胞内脂肪积聚的潜能，检测组合物抑制或诱导这些基因表达的能力是一适当的指标。 基因产物的表达的抑制或诱导或激活能通过本领域技术人员所公知的技术检测，包括ELISA、 流式细胞仪、Northern印迹分析、Western印迹分析、RT-PCR、激酶分析和电泳淌度迁移 分析(electrophoretic mobility shift assays).

本发明所述方法中所使用的包含PMF的组合物的毒性和/或有效性可通过细胞培养或实 验动物的标准程序来检测，例如测定LD50(整体50％致死剂量)和ED50(整体50％的治疗 有效剂量)。毒性和治疗有效的剂量比为治疗指数，可用LD50/ED50比表示。优选具有最大治 疗指数的包含PMF的组合物。

从细胞培养和动物研究得到的数据可用来描述包含PMF的组合物用于人体的剂量范围。 这些组合物的剂量优选设定在包括ED50具有极小毒性或无毒性的循环浓度范围。根据使用的 剂型和采用的给药途经，剂量可以在上述范围内变动。就任何本发明所述方法中所使用的组 合物而言，治疗有效剂量可从细胞培养分析初步评估。当在细胞培养确定剂量后，该剂量可 在配制在动物模型中以获得包含IC50(即能达到症状的半最大抑制的试验化合物的浓度)在 内的循环血浆浓度范围。这些信息可被用于更精确地确定在人体的使用剂量。血浆中的水平 可例如采用高效液相色谱(HPLC)和放免分析(RIA)来测定。预防的或治疗的组合物的药代 动力学可例如通过测量各种参数诸如峰值血浆水平(peak plasma level(Cmax))、曲线下面 积(AUC，通过绘制组合物血浆浓度与时间的图而测量，表示生物利用度)，化合物半衰期 (t1/2)、和最大浓度时间来测定。

8.实施例

下面内容提供制备包含PMF的组合物的方法和显示抗脂肪细胞新生的效果的研究结果。

在本文，试验中所用的3T3-L细胞株为本领域公知的研究人脂肪形成的模型。体外，在 胰岛素、地塞米松(DEX)，和甲基异丁基黄嘌呤(methylisobutylxanthine(MIX))联合处 理下，汇合的3T3-L细胞能分化，参见Student et al.(1980)J.Biol.Chem.255：4745-4750。 包括MIX，DEX和胰岛素的脂肪形成的混合物通常缩写为MDI。为了前体脂肪细胞分化为功能 型脂肪细胞，基因诱导是必需的。

8.1制备包含PMF的组合物

从夏橙和哈姆林橙获得橙固体(包括皮)，是橙汁工业的副产品。采取加压处理从橙皮压 榨油、通过离心使油澄清、冰冻(降温)以沉淀蜡状物而获得冷压处理的橙皮油。橙皮油包 括0.4％PMF组分，98％轻挥发性组分和2％残余物。通过减压蒸馏，橙皮油可浓缩约30倍， 它接着通过超高真空蒸馏来得到挥发性回收物(VR)，浓度增加到约50倍。用溶剂萃取接着 干燥萃取物进行对VR的分离工艺，产生粉末状的橙皮提取物。该橙皮提取物具有PMF组分， 占提取物的约70％(w/w)，以及非PMF组分。通常，1kg冷压油产生3克70％(w/w)橙皮提取物。 非PMF组分含腊质、不饱和脂肪酸和13-谷甾醇。在非PMF组分中没有检验出柠檬苦素。PMF 用反相HPLC和正相HPLC分析。

典型地，就正相HPLC而言，尺寸为4.6mm i.d.，x 25cm长的硅胶HPLC柱(MacMod Analytical Co.，Chadds Ford，PA)采用90％己烷/10％氯仿作为开始溶液。采用10％-90％ 氯仿梯度洗脱20分钟，接着90％氯仿洗脱20分钟。质谱分析法结合HPLC以鉴定各个PMF。 大气压化学电离质谱被用于测定分子量。标准来自佛罗里达柑橘系(Lakeland，FL)。橙皮提 取粉末包含多种甲氧基化黄酮类似物的混合物，包括：

5，6，7，3’，4’-五甲氧基黄酮(甜橙黄酮)；

5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮(川陈皮素)；

5，6，7，8，4’-五甲氧基黄酮(桔皮素)；

5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮(酸橙素)；

5-羟基-7，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7-双羟基-6，8，3’，4’-四甲氧基黄酮；

5，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮；

5，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

3，5，6，7，8，3’，4’-七甲氧基黄酮；

5-羟基-3，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；

5-羟基-6，7，8，4’-四甲氧基黄酮；

5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；

7-羟基-3，5，6，8，3’，4’-六甲氧基黄酮；和

7-羟基-3，5，6，3’，4’-五甲氧基黄酮中之一。

HPLC/MS被用于鉴定橙皮提取物中甲氧基化黄酮。PMF标准品来源于佛罗里达柑橘系 (Lakeland，FL)。

在进行下列研究之前，用DMSO将提取物稀释到适当的浓度。

8.2.细胞增殖/细胞毒性研究

如7.1节所描述的，制备包含70％PMF组分的PMF组合物(“70％OPE”)。采用检测活细 胞数量的色度法评估包含PMF组分的组合物抑制细胞增殖和/或所具有细胞毒性的能力。在这 种分析法中，相对于对照组，处理组中所观察到的减少的细胞计数为减少的细胞增殖或细胞 毒性的函数。

细胞制备：96孔平板的孔被植入5,000啮齿类3T3-L1细胞，细胞在橙皮提取物(20 μg/mL)或DMSO(对照)条件下生长24小时。在2个不同平板里，橙皮提取物被试验3次。 预留包含溶液和提取物(无细胞)的孔，作为用于检测提取物在比色测定里特异性吸收，即 背景。

分析：CELLTITERAQUEOUS ONE SOLUTION细胞增殖分析仪(Promega，Madison WI 按厂商建议操作。简而言之，比色法试剂直接加入到培养孔，孵育1-4小时。通过96孔板阅 读器记录450nm吸光率。

结果：20μg/mL橙皮提取物处理培养组的细胞数约为对照处理培养组的74％。采用浓度 低于20μg/mL橙皮提取物处理培养组的细胞增殖与为对照处理培养组相似(图1)。100μg/mL 或更大的橙皮提取物浓度表现细胞毒性。

8.3.脂肪细胞基因表达/细胞分化分析

如8.1节所描述而制备的70％OPE在脂肪细胞分化方面的效果采用细胞通过RT-PCR分析 来评价，以监测伴随脂肪细胞分化所公知的基因标记的相对水平。

油红0染色：油红0优先染色细胞内脂肪，细胞油红0染色后进行细胞光学显微镜检查。 简而言之，细胞被磷酸盐缓冲的食盐溶液(PBS)清洗2次，室温下用0.5％油红0溶液(60％ 异丙醇)染色15分钟，用脱色缓冲液清洗和移除。在光学显微镜(Nikon Corporation，Tokyo， Japan)下观察细胞，通过视觉评分来评定染色程度。

3T3-L1细胞处理：小鼠3T3-L1细胞(American Type Culture Collection，Manassas， VA)在潮湿的5％CO2大气条件下生长在包括10％FBS，100U/mi青霉素和100g/ml链霉 素DMEM(pH 7.4)中。对于分化试验，在6孔板里，200,000-250,000细胞被允许在生长溶 液里增殖2-3天，在橙皮提取物(20g/mL)或DMSO存在下，细胞接受标准分化诱导物质(100 nM insulin，1M dexamethasone and 250ILM MIX)。在第0(“生长控制”)、2、4、10天收 集细胞。

基因表达检测：采用RNEASY MINI试剂盒(Qiagen，Valencia CA)根据厂商说明书， 从收集的细胞抽取RNA。采用TAQMAN REVERSE TRANSCRIPTION试剂盒s(Applied Biosystems， Foster City CA)从1.5微克RNA制备cDNA。这些cDNA然后，采用GREEN PCR core reagents(Applied Biosystems)和合适引物在7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)被用于RT-PCR，根据厂商说明书，以确定脂肪细胞分化标记物(脂肪基因)的 表达水平，过氧化物酶体、增殖体-话化的受体(proliferator-activated receptor)‘y (PPAR’y)，CCAAT/增强子结合蛋白(enhancer binding protein)x(CEBPa)，adipoQ，ap2， HM-12，HM-21和gaiectin-12。获得的数据采用SDS2.1软件包(Applied Biosystems)分 析。尤其，RNA表达的分析采用以，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为归一剂(normalizer)的 对比Ct(MCt)法进行分析。

结果：图2表明第0天分化因子处理的对照细胞与第10天细胞分化为脂肪细胞的RNA 水平变化。这些细胞未采用试验提取物处理。对试验提取物(即橙皮)处理的细胞，以对应 天数的对照细胞里被测的RNA水平相对百分比计算RNA水平。例如，图3表示了第4、10天 试验提取物组的RNA水平的百分比变化。

如图3所示，橙皮提取物第4天抑制除1个脂肪基因外所有脂肪基因的表达，第10天 抑制所有脂肪基因的表达。视觉显微镜检表明全部时间点在这些细胞内脂肪积聚与对照细胞 比较极大减少。

进一步的用橙皮提取物进行的脂肪细胞基因表达/细胞分化检测确认这些结果。

8.4.HMGA2检测(分析)

高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)是适应高脂肪饮食而被诱 导的前体脂肪细胞特异性转录因子(Anand and Chada(2000)Nat.Genet.24：377-380)。缺 乏HMGA2的小鼠与正常小鼠相比脂肪减少了5-10％。抑制HMGA2表达的提取物同样会减少脂 肪组织形成。

小鼠3T3-L1按每孔种植200,000细胞种植在6孔板中，在包含PMF的橙皮提取物(20 μg/mL)或DMSO(对照)条件下生长。处理6小时后，收集细胞和按上述8.3节里基因表达检 测所述的操作抽提RNA以检测HMGA2表达。数据按对照处理的细胞归一化。如图4所述，与 对照细胞相比较，橙皮提取物具有减少处理细胞内HMGA2表达的效果。

8.5.体外脂肪积聚检测

这个实施例证实包含PMF的组合物在抑制脂肪细胞内脂肪积聚的效果。

包含PMF的组合物包括40％PMF组分(“40％OPE”)，70％PMF组分(“70％OPE”)，或 包含5，6，7，8，3’，4’-六甲氧基黄酮(川陈皮素)或5-羟基-6，7，8，3’，4’-五甲氧基黄酮 (酸橙素)单体化合物如上述从橙皮提取物制备。

在如上述8.3节所述的标准分化诱导物质的条件下，脂肪细胞(3T3-L1 cells)生长，从 而在无或存在不同浓度的包含PMF的组合物条件下，发生脂肪细胞分化和脂肪积聚到脂肪细 胞。油红0优先染色脂肪，油红0染色细胞后进行细胞光学显微镜检查，以检测脂肪积聚。 结果如表1所示，积聚的脂肪所观察的染色密度被表示依据标识从“+++++”表示最大染色密 度到“+”表示最小染色密度，“n.d.”表明没被检测的实验。

表1：脂肪细胞内的脂肪积聚

(表内文字：No treatment＝未处理；PMF-containing composition＝含PMF的组合 物；nobiletin＝川皮苷；auranetin＝酸橙黄酮)

这些结果证实在抑制脂肪细胞发育和/或脂肪细胞内脂肪积聚方面，包含PMF的组合物是 有效的。

8.6.体内研究

下面实施例证实引入包含PMF的组合物到动物膳食能有效地预防增重和因脂肪组织块的 减少而加速体重减少，而瘦体重不会减少。本实施例所用的雄性C57BL6/J小鼠已被表现出变 得是类似人的样肥胖的、血糖过多的、胰岛素过高的，是公认的人饮食导致的肥胖症的动物 模型。参见如Surwit et al.(1988)Diabetes 37：1163-1167；Frederichetal.(1995)Nat. Med.1：1311-1314；Parekhetal.(1998)Metabolism 47：1089-1896；El-Hasehimi et al. (2000)J.Cliii.Invest.105：1827-1832；Lin et al.(2000)mt.I Obes.Relat.Metab. Disord.24：639-646。

本实施例所用的包含PMF的组合物为如上面所述制备的70％OPE组合物。

小鼠和饮食：3周大的雄性C57BL6/J小鼠来源于杰克森实验室。喂养标准饮食适应一周 后，小鼠被随即分成4组：标准饮食组，标准饮食+70％OPE组，高脂肪饮食组，高脂肪饮食 +70％OPE组。标准饮食组被喂养研究饮食D12450B(10千卡％脂肪)(Van Heek et al.(1997) J.Cliii.Invest.99：385-90)。包含70％OPE的饮食通过研究饮食按配方生产，包含2g 70％OPE/1.055kgs标准饮食和2g 70％OPE/858g高脂肪饮食，分别地使70％OPE剂量与热卡 密度相配。在温控房间、14/10小时光黑循环的条件下，小鼠3只一笼被饲养。小鼠每周相 同时间称重，同时每笼食物消耗被检测。

小鼠在2个阶段体重增加，在第一个12周内大的体重增加，随之几周缩小的体重增加 (Winzell and Ahren(2004)Diabetes 53 Suppi.3：S215-S219)。因此，这些试验在第一个 高体重增加阶段进行，以最大化观察到处理组和未处理组间显著的差异。

去脂肪体重和％体脂肪：

通过PiXImus双能X-线吸收仪(DEXA)系统(GE Healthcare，Waukesha，WI)测试每实 验组5只小鼠，分析去脂肪体重和体脂肪百分比。饮食处理16或24周时，检测小鼠。对于 PiXImus检测，每组5只小鼠采用2.5g％阿佛丁(0.01微升/克体重)，依照厂商说明进行检 测。这种方法基于扫描区域组织导致的低能和高能X射线的微分衰减。能量衰减相关于组织 密度，通过检测器和关联软件，这种信息被用于结合组织校准影像，以评定机体组分。脂肪 块主要由脂肪组织构成。去脂肪体(Lean mass)主要由骨骼肌、血液和骨，以及器官、腱、 软骨和体液组成。

饮食处理后，动物通过异氟醚吸入麻醉。动物被颈脱位法处死，然后腹股沟、附睾、腹 膜后的脂肪垫被分割出并称重。肠系膜的脂肪库样品也被收集。称重后，如上所述从这些组 织里抽提RNA。

依照厂商说明书，采用Bruker mini-spec TD NMR分析仪(Bruker Optics，Billerica， MA)，对转换饮食组的小鼠进行尸检。

结果：为了研究食物消耗，12-18只小鼠的组以3只一笼为单独组，每周测量每笼老鼠 食物消耗量。小鼠被喂养标准饮食(SD)、标准饮食加包含PMF组合物(SD70％OPE)、高脂肪饮 食(HFD)或高脂肪饮食加包含PMF组合物(HFD70％OPE)。如上所述按配方制备饮食。热卡消耗 检测表明SD组和SD70％OPE组间热卡摄取不存在显著差异(Figure 5)。因此，70％OPE自身 不会通过不适口性或通过对动物的不良作用导致厌食。HFD组和SD组间存在较高的热卡摄取 趋势，但不具有统计学意义。因此，标准饮食和高脂肪饮食里70％OPE的添加不会导致任何显 著的厌食。

如图6所示，在7周龄时HFD组和SD组间体重增加的显著差异被表现出来(p＜0.05)并 延续到整个研究过程。在5周龄时，HFD70％OPE组的小鼠与HFD组小鼠比较表现体重增加显 著减少(p＜0.05)(Figure 6)。这种差异不是由于热卡摄取的减少(Figure 5)。这些结果表明 包含PMF的组合物能阻止高脂肪饮食个体的体重增加。

与HFD组小鼠比较，HFD70％OPE组小鼠的体重增加差异被研究确定是否HFD70％OPE组小 鼠减少的体重增加归功于在脂肪体重对去脂肪体重的减少。一组动物(n＝5每组)的脂肪体 重通过PIXImus扫描器双能X-线吸收分析(DEXA)被检测。每组被测的体脂肪百分比被提供 在图7。与HFD组小鼠比较，HFD70％OPE组小鼠的体脂肪百分比显著地减少。HFD70％OPE组和 SD组间体脂肪百分比不存在显著性差异。因此，高脂肪饮食里70％OPE的添加阻止高脂肪饮 食导致的体脂肪百分比增加。这些结果表明包含PMF的组合物通过阻止脂肪积聚大大地抑制 了归因于高脂肪饮食的体重增加。

虽然体重不存在显著性差异，在体脂肪百分比方面，SD70％OPE组动物与SD组动物比较 (Figure 6)的存在小且显著性减少(Figure 7)。这些结果符合包含PMF的组合物促进个体去 脂肪体重的进展的可能性。

为了分析70％OPE对个别脂肪垫的效果，每组2只动物被处死，然后腹股沟、附睾、腹膜 后的脂肪垫被分割出并称重，以评价任何差异。结果见图8。虽然每组数量不足多以能够进 行统计分析，但图象表明HFD70％OPE组动物里脂肪垫重量与HFD组动物比较极大减小，与 HFDWGO201，SD，and SD70％OPE组间差异小，这与体重和PIXImus检测一致。

血糖参数：已表明在某些情况下不能扩展脂肪体重的个体会发展成为II型糖尿病。参 见Danforth(2000)Nat.Genet.26：13。然而下述结果表明食用富含PMF的组合物的食物 的个体没有表现出更可能地发展成为糖尿病。

为了检测本实施例所用的小鼠发展成为II型糖尿病的可能性，进行HFD70％OPE组动物 肝脏大体检查，在外观的脂肪变形方面与被认为存在明显脂肪营养障碍症状的HFD组动物比 较，没有表现出任何增加。

另外，小鼠的血糖状态被检测，采用拜耳Ascencia血糖测量仪检测小鼠禁食血糖水平和 采用拜耳DCA 2000+HbAlc分析仪(Bayer HealthCare，Tarrytown，NY)测量糖基化血红蛋 白(HbAlc)。所有检测均在禁食后进行，所有样品通过尾静脉采血获得。

在SD组和HFD组间，没有观察到禁食血糖水平间的显著性差异(Figure 9A)。在SD70％OPE 组和HFD70％OPE组间，禁食血糖水平间存在显著性差异。既然血糖水平仅能反映动物当时血 糖状况的一种快照，HbAlc糖化需要被检测。糖基化血红蛋白的数量，作为占整个血红蛋白 百分比，直接涉及前面2个月期间平均血糖浓度。就HbAlc检测而言，除了显著减少HbAlc 的标注饮食加70％OPE给喂养的动物外，在组间任一动物间不存在显著性差异(Figure 9B)。 这表明仅与标准饮食比较，70％OPE可以事实上导致长期血糖控制的改善。

饮食转换：在大约19周龄时，评估饮食转换的插入(Bush et al.(2006)Endocrine 29：375-382)。标准饮食组的小鼠被改为标准饮食+70％OPE，反之亦然。同样，高脂肪饮食组 的小鼠被改为高脂肪饮食+70％OPE，反之亦然。在本实施例里，小鼠持续保持饮食19周，然 后被喂养不同的饮食8周。如上所述，测量食物消耗量和体重。

在起初的19周期间，SD组和SD70％OPE组在千卡消耗或体重增加方面没有显著地差异， 2组转换饮食也没有表现出效果。然而当HDF组小鼠转换为HFD70％OPE和HFD70％OPE组小鼠 转换为HFD时，观察到显著性差异。HFD70％OPE变为HFD的转换具有小鼠体重的效果与HFD 组小鼠比较是统计学上难以分辨的(Figure 10)。相反地，相对HDF组和HFD70％OPE组，HFD 组小鼠喂养HFD70％OPE的转换(HFD变为HFD70％OPE)导致显著的体重减少(Figure 10)。因此， 这些数据表明70％OPE不仅能阻止高脂肪饮食消费导致的体重增加，而且能逆转高脂肪饮食饲 养的动物的体重增加，甚至它们继续消费高脂肪饮食的时候。

按上面所述的操作采用PiXImus双能X-线吸收仪(DEXA)系统检测去脂肪体重和体脂肪 百分比，对动物进行检测以确定体重改变与脂肪体重百分比变化是否一致。转换为HFD的 HFD70％OPE组小鼠表现脂肪体重百分比增加，而转换为HFD70％OPE的HDF组小鼠表现脂肪体 重百分比适度减少(图11)。

HFD变为HFD70％OPE组里可见3种脂肪垫的减少和HFD70％OPE变为HFD组里可见3种脂 肪垫的增加，动物各部脂肪垫检测确认了PiXImus检测里所见结果(图12)。

总而言之，这种数据表明上下文里高脂肪饮食包含添加PMF的组合物导致体重增加的显 著性减少。此外，对于饮食导致的肥胖症，成体动物服用包含PMF的组合物，可导致体重显 著的减少。阻止体重增加和促进体重减少可能归功于脂肪组织体重的减少，不伴随去脂肪体 重的减少。重要地，脂肪的减少不伴随任何糖尿病迹象或血糖调控的损失。也需指出的，从 包含PMF高脂肪饮食转换为不含PMF高脂肪饮食的小鼠体重增加类似于喂养不含PMF高脂肪 饮食的个体，这表明包含PMF的组合物在重量阻止或减少方面的效果可通过从饮食中除去包 含PMF的组合物而被逆转。

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1.相关申请

本申请主张美国临时申请No.60/710,933，2005年8月23日提交，该临时申请以引用 的方式并入本申请中。