技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，尤其涉及大鸨食性分析方法，特别涉及一种通过粪便DNA分析大鸨食源植物的方法。
背景技术
[0002] 食性分析是野生动物保护生物学研究的重要课题之一，也是了解动物和栖息地关系的
基础，同时能为有效保护和管理野生动物提供科学
支撑。传统分析动物食性的方法包括对觅食行为的野外观察、胃内容物分析和粪便成分的显微鉴定，然而，这些方法具有损伤性、可操作性差和准确性低的缺点。如，野外观察可操作性差且结果粗放，而胃内容物分析对动物造成损伤甚至致死，已逐渐被野生动物保护学家摈弃。粪便成分的显微分析对食源组织的显微鉴定技术要求高，工作量大，而且对于显微组织形态学相近的食源
分辨率较低。近年来新兴的稳定同位素技术，在确定食物网结构和分析
能量流动方面具有一定优势，但却无法确定动物的具体食物组成和食物
质量。另外，稳定同位素技术在取样上更偏好于动物的组织，也会对动物造成损伤，不适用于珍稀濒危动物。
[0003] 分子粪便学(molecular scatology)是近年来生态学发展起来的一个新的研究领域和方法，已经解决了很多因传统方法限制而解决不了的问题，包括物种鉴定、性别确定、个体识别、遗传多样性、遗传结构、基因流等。然而，通过粪便DNA分析动物的食性，还属于研究比较薄弱的领域。采用分子粪便学方法，并结合DNA宏
条形码技术，可以从粪便中探查动物的食物种类和数量，促进动物食性分析和其为适应环境所采取的营养对策研究。
[0004] 动物食性一般可分为肉食性、植食性和杂食性。动物粪便中含有
摄食食物的残渣和碎片，但是，不同的动物种类，其食性存在较大差异，甚至同一物种，随着觅食地食物可获得性的不同其食性也会不同。因此，在以粪便DNA为模板时，就要根据动物的食性差异选择不同的DNA条形码进行分析。从粪便中提取的DNA存在一定程度的降解，长度过长的DNA条形码在粪便DNA中不易扩增。分类学家针对动物和植物不同的物种类群设计了相应的DNA条形码，但这些DNA条形码起初是用于物种分类研究，长度都较长，不适宜于粪便DNA的扩增。
[0005] 大鸨(Otis tarda)是鹤形目鸨科的大型地栖
鸟类，为草原生态的指示物种，属国家一级重点保护动物。大鸨分为指名亚种(O.t.tarda)和东方亚种(O.t.dybowskii)，指名亚种总数量约为45000-51000只，而东方亚种仅1500只左右(Alonso&Palacín,2010)，逾一半以上东方亚种在我国的东北部草原繁殖，冬季则主要在黄河中下游沿岸的湿地越冬(吴逸群等,2013)。研究和监测表明，由于农业开垦和偷猎，大鸨东方亚种种群数量呈持续下降趋势(Alonso&Palacín,2010)。越冬期，由于
气候和人为干扰，大鸨常常遭受食物短缺的胁迫；而在繁殖期，由于繁殖和育雏的需要，大鸨对食物数量需求较大，对食物质量要求较高。然而，还不清楚大鸨在各个生活史时期的食物种类及营养需求，导致保护部
门在保护野生大鸨种群和觅食地上缺乏科学指导，也是大鸨多年来人工繁育不成功的
瓶颈所在。因此，有必要开发一种有效且经济的大鸨食性分析方法，同时为其它动物的食性分析提供借鉴。
发明内容
[0006] 本发明一个目的是提供一种检测或辅助检测待测大鸨食源植物的方法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤A：
[0008] 1）用带有不同
碱基标签的trnL基因扩增引物对分别扩增多个待测大鸨粪便中的trnL基因
片段，得到多个添加不同碱基标签序列的待测大鸨粪便trnL基因片段；
[0009] 所述带有不同碱基标签的trnL基因扩增引物对由trnL基因扩增引物对和连接在该引物对各条引物末端的6个碱基标签组成；
[0010] 2）混合所述多个添加不同碱基标签序列的待测大鸨粪便trnL基因片段，得到混合片段，高通量测序所述混合片段，得到多个待测大鸨粪便trnL基因片段测序序列；
[0011] 3）将所述多个待测大鸨粪便trnL基因片段测序序列分别与本地植物叶绿体DNAtrnL全序列
数据库和公共trnL条形码数据库进行比对，根据测序序列与两种数据库中序列的同源性判断待测大鸨食源植物；
[0012] 所述本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库按照如下方法制备：采集大鸨栖息地所有潜在食源植物，用trnL通用引物分别对所有所述潜在食源植物进行PCR扩增，得到所有潜在食源植物的PCR扩增产物，测序，得到所有潜在食源植物对应的trnL序列，由所有潜在食源植物及其对应trnL序列构成本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库；
[0013] 所述公共trnL条形码数据库为从生物信息相关数据库中提取所有植物trnL序列中所述trnL基因扩增引物对对应的扩增片段，所述植物及其对应的扩增片段组成公共trnL条形码数据库。
[0014] 上述方法中，所述每个碱基标签在碱基顺序上的差异数大于3。
[0015] 上述方法中，所述根据测序序列与两种数据库中序列的同源性判断待测大鸨食源植物为：
[0016] 若待测大鸨粪便trnL基因片段某条测序序列与所述本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库或所述公共trnL条形码数据库某条序列一致性大于等于95%，则所述待测大鸨的食源植物含有或候选含有该条序列在数据库中所对应的植物物种，若待测大鸨粪便trnL基因片段某条测序序列与所述本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库或所述公共trnL条形码数据库某条序列一致性小于95%，则所述待测大鸨的食源植物不含有或候选不含有该条序列在数据库中所对应的植物物种。
[0017] 上述方法中，所述trnL基因扩增引物对由
序列表中序列77所示的单链DNA分子和序列78所示的单链DNA分子组成；
[0018] 或所述trnL通用引物由序列表中序列79所示的单链DNA分子和序列80所示的单链DNA分子组成；
[0019] 上述方法中，所述本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库为表1所示的数据库；具体由如下76种植物及其对应的trnL序列组成：
[0020] 沙参及其对应的序列1所示trnL；
[0021] 剪股颖及其对应的序列2所示trnL；
[0022] 蒙古韭及其对应的序列3所示trnL；
[0023] 点地梅及其对应的序列4所示trnL；
[0024] 知母及其对应的序列5所示trnL；
[0025] 茵陈蒿及其对应的序列6所示trnL；
[0026] 荩草及其对应的序列7所示trnL；
[0027] 毛秆野古草及其对应的序列8所示trnL；
[0028] 兴安天门冬及其对应的序列9所示trnL；
[0029] 糙叶黄耆及其对应的序列10所示trnL；
[0030] 射干及其对应的序列11所示trnL；
[0031] 扁秆荆三棱及其对应的序列12所示trnL；
[0032] 北柴胡及其对应的序列13所示trnL；
[0033] 虎尾草及其对应的序列14所示trnL；
[0034] 丝路蓟及其对应的序列15所示trnL；
[0035]
棉团
铁线莲及其对应的序列16所示trnL；
[0036] 达乌里芯苞及其对应的序列17所示trnL；
[0037] 徐长卿及其对应的序列18所示trnL；
[0038] 地梢瓜及其对应的序列19所示trnL；
[0039] 狗
牙根及其对应的序列20所示trnL；
[0040] 掌裂兰及其对应的序列21所示trnL；
[0041] 刺藜及其对应的序列22所示trnL；
[0042] 单鳞苞荸荠及其对应的序列23所示trnL；
[0043] 羊茅及其对应的序列24所示trnL；
[0044] 线叶菊及其对应的序列25所示trnL；
[0045] 两歧飘拂草及其对应的序列26所示trnL；
[0046] 蓬子菜及其对应的序列27所示trnL；
[0047] 海乳草及其对应的序列28所示trnL；
[0048] 大豆及其对应的序列29所示trnL；
[0049] 甘草及其对应的序列30所示trnL；
[0050] 草原石头花及其对应的序列31所示trnL；
[0051] 碱毛茛及其对应的序列32所示trnL；
[0052] 北芸香及其对应的序列33所示trnL；
[0053] 紫
大麦草及其对应的序列34所示trnL；
[0054] 大苞鸢尾及其对应的序列35所示trnL；
[0055] 白花
马蔺及其对应的序列36所示trnL；
[0056] 野鸢尾及其对应的序列37所示trnL；
[0057] 灯心草及其对应的序列38所示trnL；
[0058] 大丁草及其对应的序列39所示trnL；
[0059] 火绒草及其对应的序列40所示trnL；
[0060] 兴安胡枝子及其对应的序列41所示trnL；
[0061] 羊草及其对应的序列42所示trnL；
[0062] 星宿菜及其对应的序列43所示trnL；
[0063] 弹
刀子菜及其对应的序列44所示trnL；
[0064] 紫苜蓿及其对应的序列45所示trnL；
[0065] 砂珍棘豆及其对应的序列46所示trnL；
[0066] 地锦及其对应的序列47所示trnL；
[0067] 芦苇及其对应的序列48所示trnL；
[0068] 车前及其对应的序列49所示trnL；
[0069] 西伯利亚远志及其对应的序列50所示trnL；
[0070] 北千里光及其对应的序列51所示trnL；
[0071] 西伯利亚蓼及其对应的序列52所示trnL；
[0072] 蕨麻及其对应的序列53所示trnL；
[0073] 翻白草及其对应的序列54所示trnL；
[0074] 匍枝委陵菜及其对应的序列55所示trnL；
[0075] 莓叶委陵菜及其对应的序列56所示trnL；
[0076] 粉报春及其对应的序列57所示trnL；
[0077] 山杏及其对应的序列58所示trnL；
[0078] 碱茅及其对应的序列59所示trnL；
[0079] 早熟禾及其对应的序列60所示trnL；
[0080] 漏芦及其对应的序列61所示trnL；
[0081] 地榆及其对应的序列62所示trnL；
[0082] 蓝盆花及其对应的序列63所示trnL；
[0083] 黄芩及其对应的序列64所示trnL；
[0084] 金色狗尾草及其对应的序列65所示trnL；
[0085] 黄花刺茄及其对应的序列66所示trnL；
[0086] 大油芒及其对应的序列67所示trnL；
[0087] 狼毒及其对应的序列68所示trnL；
[0088] 狼针草及其对应的序列69所示trnL；
[0089] 瓣蕊唐松草及其对应的序列70所示trnL；
[0090] 百蕊草及其对应的序列71所示trnL；
[0091]
水麦冬及其对应的序列72所示trnL；
[0092] 女菀及其对应的序列73所示trnL；
[0093] 绿豆及其对应的序列74所示trnL；
[0094] 苍
耳及其对应的序列75所示trnL；
[0095] 玉蜀黍及其对应的序列76所示trnL。
[0096] 上述方法中，所述生物信息相关数据库为NCBI、EMBL和DDBJ或NCBI和EMBL；
[0097] 或所述从生物信息相关数据库中提取所有植物trnL序列中所述trnL基因扩增引物对对应的扩增片段为将生物信息相关数据库中的植物对应的trnL基因序列用ecoPCR程序扩增后的片段，
[0098] 所述ecoPCR程序扩增所用的引物为所述trnL基因扩增引物对；
[0099] 所述ecoPCR程序扩增的参数为：至多2个碱基错配，并且该差异不能发生在引物序列的末尾2个碱基，序列长度范围为10-150bp。
[0100]
实施例中，多个待测大鸨粪便为不大于36个待测大鸨粪便，具体为31个。
[0101] 本发明另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测大鸨食源植物的
试剂盒。
[0102] 本发明提供的试剂盒，包括上述trnL基因扩增引物对；
[0103] 或上述带有不同碱基标签的trnL基因扩增引物对。
[0104] 上述试剂盒还包括上述方法中的本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库。
[0105] 本发明第三个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测大鸨食源植物的产品。
[0106] 本发明提供的产品，其包括上述方法中的本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库。
[0107] 上述的试剂盒或上述的产品在检测或辅助检测待测大鸨食源植物种类和/或检测或辅助检测待测大鸨某种食源植物的相对数量中的应用。
[0108] 本发明第四个目的是提供检测或辅助检测待测大鸨某种食源植物的相对数量的方法。
[0109] 本发明提供的方法，包括上述步骤A，根据测序序列与两种数据库中序列的同源性判断待测大鸨食源植物，计算待测大鸨食源植物中某种食源植物测序序列数量占所有待测大鸨食源植物测序序列数量的百分比，得到大鸨食源植物中某种食源植物的相对数量。
[0110] 本发明方法结合粪便DNA和高通量测序技术，首次对大鸨的食性进行了精确全面的分析。开发了特异性高的本地植物叶绿体DNA trnL条形码数据库，设计了适宜于粪便DNA扩增和高通量
扩增子测序的trnL条形码引物，不仅适用于大鸨的食性分析，还可用于同域分布的其它植食性或杂食性野生动物的食性分析。本发明设计的引物标签技术，能够区分个体，且特别适用于高通量测序平台，大大降低了传统克隆测序实验所耗费的人
力和经费。更为重要的是，本发明不仅分析了动物摄食的植物种属，而且定量了摄取各种植物的相对数量，为研究动物的食性偏好和食谱研究提供了技术支撑，也促进了野生动物食性生态学研究的发展。
附图说明
[0111] 图1为按科分类阶元的大鸨食物组成。
[0112] 图2为按属分类阶元的大鸨食物组成。
具体实施方式
[0113] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0114] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0115] 实施例1、基于叶绿体DNA trnL条形码分析大鸨食源植物
[0116] （一）、建立本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库
[0117] 1、潜在食源植物的采集
[0118] 在大鸨活动地点或有大鸨活动痕迹（粪便、
羽毛、抓痕等）的地方，采集植物
叶片，并将植物新鲜叶片放入纸袋中，加入
硅胶，干燥保存。记录采集植物的科、属、种信息。
[0119] 2、植物DNA提取
[0120] 取叶片放入研钵中，液氮
研磨成粉末，采用广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒（货号：DL116-01，北京博迈德基因技术有限公司）提取植物基因组DNA。
[0121] 对提取的DNA进行琼脂糖
电泳，并使用紫外分光光度计测定浓度和纯度，对于OD260/OD280值介于1.8-2.0的DNA保存于-80℃
冰箱备用，对于DNA质量不佳的样品，重新提取，直至DNA质量合格。共计76份合格的植物DNA样品。
[0122] 3、植物叶绿体trnL全片段PCR扩增和测序
[0123] 植物叶绿体DNA的trnL通用引物对：
[0124] plant-F：5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’（序列79）
[0125] plant-R：5’-GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3’（序列80）。
[0126] 以植物DNA模板，分别进行PCR扩增。扩增采用如下25μl体系：Biomed 2×Taq PCR MasterMix（北京博迈德基因技术有限公司）12.5μl，plant-F和plant-R引物各0.5μl（正反向引物在该反应体系中的浓度均为0.2μM），植物DNA 2.5μl，去离子水补充至25μl。
[0127] PCR反应条件为：95℃预变性5min，然后进行30个循环（94℃变性30s，56.6℃
退火1min，72℃延伸1min），之后72℃延伸10min。
[0128] 将PCR产物送去测序（生工
生物工程(上海)股份有限公司），使用ABI Prism377测序仪进行双向测序，得到的76种植物对应的trnL序列；76种植物及其对应的trnL序列组成了本地植物叶绿体DNA trnL全序列数据库。
[0129] 表1为大鸨潜在食源植物叶绿体DNA trnL条形码数据库
[0130]
[0131]
[0132] （二）、公共trnL条形码数据库的建立
[0133] 由于NCBI,EMBL和DDBJ中已上传的植物叶绿体trnL序列作为公共数据库的数据量比较庞大，因此采用ecoPCR程序扩增，具体如下：
[0134] 使用正向引物trnL-F:5’-TCAGAGAAACCCYGGAA-3’,反向引物trnL-R：5’-AGAACAACTTCCAYTGAGTC-3’；
[0135] 参数设置为：最多允许2个碱基错配，并且该差异不能发生在引物序列的末尾2个碱基，序列长度范围为10-150bp。
[0136] 在NCBI和EMBL数据库中2016年7月1日之前上传的物种及其对应的trnL基因序列用ecoPCR程序扩增后的片段，组成公共trnL条形码数据库。
[0137] （三）、通过粪便DNA分析大鸨食源植物
[0138] 1、粪便采集
[0139] 在内蒙古图牧吉国家级自然保护区采集野生大鸨的粪便，采用冷冻方法保存。为避免重复采集，首先利用望远镜观察在夜宿地或觅食地活动的大鸨种群，待大鸨种群飞走后，采集相互距离超过2米的粪便，在野外采用移动冰盒保存，运回实验室采用-80℃冰箱保存。
[0140] 2、DNA的提取
[0141] 使用粪便DNA提取试剂盒(QIAGEN的QIAamp DNA Stool Mini Kit（货号:51504）)提取粪便DNA。对提取的粪便DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并使用微量紫外分光光度计测定浓度和纯度，对于OD260/OD280值介于1.8-2.0的DNA保存于-80℃冰箱备用，对于DNA质量不佳的样品，重新提取，直至DNA质量合格。共计31份合格粪便DNA样品。
[0142] 3、采用叶绿体trnL引物进行粪便DNA扩增
[0143] 3.1引物设计和加标签
[0144] 利用（一）建立的本地植物叶绿体DNA trnL序列数据库，使用引物设计
软件Primer Premier6.0进行引物设计。鉴于粪便DNA存在一定程度的降解，设计的引物扩增的PCR产物长度不宜过长，过长则会导致粪便中一些植物的片段无法扩增成功。但考虑到高通量扩增子测序的读长为150bp,所设计的引物产生的PCR产物长度也不宜过短，否则影响扩增子文库的构建和高通量测序的准确度和效率。
[0145] 兼顾以上原则，设计的植物叶绿体DNA trnL条形码引物为：
[0146] 正向引物trnL-F:5’-TCAGAGAAACCCYGGAA-3’（序列77）
[0147] 反向引物trnL-R：5’-AGAACAACTTCCAYTGAGTC-3’（序列78）。
[0148] 为了提高效率和节省成本，对正反向引物的5’端加上用于区分个体的标签；其目的是，在混合各个粪便DNA的PCR产物进行高通量扩增子测序后，能通过引物上的标签将各条序列归属到所对应的粪便样品上。实施例有31个粪便样本，用12条引物（6个正向序列和6个反向序列），一条正向和一条反向进行组合，可产生36种组合，即最多可以区分36个个体；如果有更多的粪便样品需要分析，可增加相应的标签长度和引物数量。
[0149] 因此，用于区分个体的标签为6碱基标签，在合成引物时，在各条引物的5’端加6碱基标签，每个标签至少确保在碱基顺序上的差异大于3，12条引物的具体序列如表2，引物合成在生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0150] 表2植物叶绿体DNA trnL条形码引物的5’端加6碱基标签信息表
[0151]
[0152] 3.2 PCR扩增
[0153] 以31份粪便DNA（编号GB1-GB31）为模板，分别用下述表3对应的引物组合扩增不同的样本，得到31份粪便DNA的PCR产物。
[0154] 上述扩增采用如下10μl体系：Biomed 2×Taq PCR MasterMix（北京博迈德基因技术有限公司产品）5μl，引物采用表3的组合，每个体系中正反向引物各0.3μl（正反向引物在该反应体系中的浓度均为0.3μM），粪便DNA 2.5μl，
牛血清
白蛋白（BSA，10mg/ml,Takara）0.1μl，去离子水补充至10μl。PCR反应条件为：95℃预变性15min，然后进行50个循环（94℃变性30s，56℃退火1.5min，72℃延伸30s），之后72℃延伸10min。
[0155] 表3为31份粪便进行PCR时使用的引物组合
[0156]
[0157]
[0158] 3.3高通量扩增子测序
[0159] 将31份粪便DNA的PCR产物各取5μl等量混合，共计155μl样品，送至苏州金维智生物科技有限公司。采用MiSeq高通量测序平台（Illumina公司）进行扩增子测序。测序步骤按照仪器
说明书操作。
[0160] 3.4数据分析和结果
[0161] 将高通量测序得到的原始reads，经过OBITools软件(http://metabarcoding.org/obitools)分析，采用illuminapairedend程序对reads进行正反向拼接，然后使用ngsfilter程序对引物和标签进行识别，并去除低质量或低频的reads，得到31个粪便DNA的PCR产物的纯序列。
[0162] 4、比对
[0163] 将31个粪便DNA的PCR产物的纯序列分别与（一）构建的本地植物叶绿体DNA trnL条形码数据库和（二）建立的公共trnL条形码数据库进行比对；在比对时，为增强比对的特异性，设定序列一致性
阈值为95%。
[0164] 若31个粪便DNA的PCR产物的纯序列中某条序列与本地数据库或公共数据库某条序列一致性大于等于95%，则判定来自粪便DNA的该条序列归属于数据库中所对应的植物物种，若31个粪便DNA的PCR产物的纯序列中某条序列与本地数据库或公共数据库某条序列一致性小于95%，则判定来自粪便DNA的该条序列不归属于两个数据库中任一种的植物物种。
[0165] 统计发现，以科分类阶元划分，大鸨的食物组成归入13科，豆科和禾本科占到大鸨采食植物的一半（图1）。以属分类阶元划分，发现大鸨的食物组成归入15属，以豇豆属最多（80.99%），玉蜀黍属次之（图2）。大鸨食物组成中包括51种植物，其中13种能够鉴定到种水平，分别为绿豆、玉蜀黍、大豆、翻白草、砂珍棘豆、播娘蒿、羊草、虎尾草、碱茅、泽漆、蒙古韭、紫苜蓿、薄叶皱叶委陵菜（表4）。
[0166] 根据Reads数（表4），计算待测大鸨食源植物中某种食源植物测序序列数量占所有待测大鸨食源植物测序序列数量的百分比，得到大鸨食源植物中某种食源植物的相对数量，发现豆科的绿豆占大鸨摄食量的80.987%，可判断，绿豆为大鸨的主要食物；其次为禾本科的玉蜀黍，占到8.239%，大豆占到3.774%。除此以外，另外48种植物占大鸨摄食量的7%。
[0167] 表4为大鸨食物种类和组成
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173] *NA表示未鉴定到该分类阶元，＆表示该类植物在所有大鸨粪便中被检测到的序列条数，﹟表示该类植物所占摄食总量的百分比
[0174] 实施例2、基于粪便DNA分析大鸨食性的方法验证
[0175] （一）、采集已知植物饲喂笼养大鸨并收集粪便
[0176] 在野外有大鸨活动或有大鸨活动痕迹（粪便、羽毛、抓痕等）的地方，采集8种植物的植物全株各10株，植物种类分别为蒙古韭（Androsace umbellata）、点地梅（Anemarrhena asphodeloides）、北柴胡（Bupleurum chinense）、羊草（Leymus chinensis）、虎尾草（Chloris virgata）、漏芦（Rhaponticum uniflorum）、蓝盆花（Scabiosa comosa）、翻白草（Potentilla discolor）。另外，在饲喂时还配以2种植物主食，绿豆（Vigna radiata）和玉蜀黍（Zea mays）。
[0177] 在给笼养大鸨饲喂之前，提前清除笼舍内陈旧的粪便、遗落的食物以及地面的
杂草，以免干扰后续分析。
选定6只日常进食情况良好的成年大鸨作为实验对象，在饲喂期间，给以足够且干净的水。第一天不给大鸨喂食，只提供水；第二天投喂选定食物后，不采集粪便，并将粪便清扫干净；第三天投喂后依然不采集粪便，并清扫笼舍内的粪便。这样做的目的是确保之前大鸨进食的食物全部消化排空，对后续分析不产生干扰。待第四天投喂后，密切观察大鸨的排便情况，待大鸨排便后，采集粪便并保存于
采样袋中，并标记大鸨个体的编号，直至采齐6只大鸨的粪便。采集的粪便保存于-80℃冰箱。
[0178] （二）通过粪便DNA分析大鸨的食源植物
[0179] 1、粪便DNA的提取
[0180] 使用粪便DNA提取试剂盒(QIAGEN的QIAamp DNA Stool Mini Kit（货号:51504）)提取粪便DNA。对提取的粪便DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并使用微量紫外分光光度计测定浓度和纯度，对于OD260/OD280值介于1.8-2.0的DNA保存于-80℃冰箱备用，对于DNA质量不佳的样品，重新提取，直至DNA质量合格。共计6份合格粪便DNA样品。
[0181] 2、采用叶绿体trnL引物进行粪便DNA扩增
[0182] 2.1引物设计和加标签
[0183] 利用设计的植物叶绿体DNA trnL条形码引物：正向引物trnL-F:
[0184] 5’-TCAGAGAAACCCYGGAA-3’ （序列77），反向引物trnL-R：5’-AGAACAACTTCCAYTGAGTC-3’ （序列78）。
[0185] 为了提高效率和节省成本，对正反向引物的5’端加上用于区分个体的标签。6条引物（3个正向序列和3个反向序列），一条正向和一条反向进行组合，可产生9种组合，即最多可以区分9个个体。在合成引物时，在各条引物的5’端加6碱基标签，6条引物的具体序列如表5，引物合成在生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0186] 表5
[0187]
[0188]
[0189] 2.2粪便DNA的PCR扩增
[0190] 以6份粪便DNA（编号CGB1-CGB6）为模板，分别用表5对应的引物组合扩增不同的样本，得到6份粪便DNA的PCR产物。
[0191] 上述扩增采用如下10μl体系：Biomed 2×Taq PCR MasterMix（北京博迈德基因技术有限公司产品）5μl，引物采用表5的组合，每个体系中正反向引物各0.3μl（正反向引物在该反应体系中的浓度均为0.3μM），粪便DNA 2.5μl，牛血清白蛋白（BSA，10mg/ml,Takara）0.1μl，去离子水补充至10μl。PCR反应条件为：95℃预变性15min，然后进行50个循环（94℃变性30s，56℃退火1.5min，72℃延伸30s），之后72℃延伸10min。
[0192] 2.3高通量扩增子测序
[0193] 将6份粪便DNA的PCR产物各取5μl等量混合，共计30μl样品，送至苏州金维智生物科技有限公司。采用MiSeq高通量测序平台（Illumina公司）进行扩增子测序。测序步骤按照仪器说明书操作。
[0194] 2.4数据分析和结果
[0195] 将高通量测序得到的原始reads，经过OBITools软件(http://metabarcoding.org/obitools)分析，采用illuminapairedend程序对reads进行正反向拼接，然后使用ngsfilter程序对引物和标签进行识别，并去除低质量或低频的reads，得到6个粪便DNA的PCR产物的纯序列。
[0196] 3、比对
[0197] 将6个粪便DNA的PCR产物的纯序列分别与实施例1中构建的本地植物叶绿体DNA trnL条形码数据库和实施例1提取的公共trnL条形码数据库进行比对；在比对时，为增强比对的特异性，设定序列一致性阈值为95%。
[0198] 若6个粪便DNA的PCR产物的纯序列中某条序列与本地数据库或公共数据库某条序列一致性大于等于95%，则判定来自粪便DNA的该条序列归属于数据库中所对应的植物物种，若6个粪便DNA的PCR产物的纯序列中某条序列与本地数据库或公共数据库某条序列一致性小于95%，则判定来自粪便DNA的该条序列不归属于两个数据库中任一种的植物物种。
[0199] 分析发现，从粪便DNA中检测出了蒙古韭（Androsace umbellata）、点地梅（Anemarrhena asphodeloides）、北柴胡（Bupleurum chinense）、羊草（Leymus chinensis）、虎尾草（Chloris virgata）、漏芦（Rhaponticum uniflorum）、蓝盆花（Scabiosa comosa）、翻白草（Potentilla discolor）、绿豆（Vigna radiata）和玉蜀黍（Zea mays）的叶绿体DNA的trnL片段，表明本发明的基于粪便DNA和高通量测序的方法能够准确地分析动物的食性，具有较高的可行性和灵敏性。
